JPH10511943A

JPH10511943A - Antigens, antibodies and diagnostic assays for Alzheimer's disease

Info

Publication number: JPH10511943A
Application number: JP8520499A
Authority: JP
Inventors: エイ．ガーンバリ、ホッセイン; デイヴィーズ、ピーター; ウォロツィン、ベンジャミン
Original assignee: アルバートアインシュタインカレッジオブメディシンオブイェシヴァユニヴァースティ
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 1998-11-17
Also published as: AU4523596A; KR987000993A; CA2208329A1; EP0796279A1; MX9704717A; AU711140B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、アルツハイマー病に関わる抗原およびその抗原に特異的な抗体に関する。本発明は、さらに、アルツハイマー関連抗原、この抗原に特異的な抗体、およびアルツハイマー病の恐れのある固体からのサンプルを含むアッセイを利用してアルツハイマー病を診断する方法に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to an antigen associated with Alzheimer's disease and an antibody specific to the antigen. The present invention further relates to a method for diagnosing Alzheimer's disease using an assay comprising an Alzheimer-related antigen, an antibody specific for this antigen, and a sample from a solid at risk for Alzheimer's disease.

Description

【発明の詳細な説明】アルツハイマー病のための抗原、抗体および診断アッセイこの出願は、現在放棄されている1986年９月30日付出願の米国出願06/913,494 の一部継続出願である1987年９月25日付出願の継続中の米国出願07/100,980の一部継続出願である現在放棄されている1990年２月26日付出願の米国出願07/485,1 49の継続出願である現在放棄されている1993年９月３日付出願の米国出願08/116 ,488の継続出願である1994年７月１日付出願の継続中の米国出願08/269,640の一部継続出願である1994年12月23日付出願の継続中の米国出願08/362,783の一部継続出願であり、これらの出願のすべてをここに参考として引用する。技術分野本発明は、アルツハイマー病に関する抗原、前記抗原に特異的な抗体、および前記抗原および前記抗体を利用してアルツハイマー病を診断する方法に関する。背景技術アルツハイマー病は６５歳を越えた人口の７％に影響を与える進行性神経退化疾患であり、知的機能の進行的損失により臨床的に特徴付けられ、大脳皮質からの神経単位の連続的損失により病理学的に特徴付けられる。より具体的には、この病理的欠陥は、通常、新皮質における神経炎性プラークを含む多くのアミロイド、およびコリン作動性神経単位のシナプス前部マーカーの損失に関係する。神経炎性プラークは、退化軸索および神経末端ならびに可能な星状細胞要素からなり、これらのプラークはしばしば中心コアを示す。アルツハイマー病のもう一つの病理学的特徴は、神経細線維の絡み(tangle)の進行である。神経細線維の絡みは、ねじれて絡みを形成する異常な特性を有する対螺旋フィラメント（paired helical filaments）からなる神経内塊（intraneu rinal mass）である。神経細線維の絡みは、幾つかの異なるタンパク質からなる。神経化学の研究は、神経伝達系がアルツハイマー病により影響を受けることを示している。最も一貫して強く影響される系は、メイネルトの核基底（Nucleus Basalis of Meynert）に位置するコリン作動性神経単位の系である。さらに、アルツハイマー病はソマトスタチン、サブスタンスＰおよび副腎皮質刺激ホルモン放出因子を低下させる。上記病理学的構造、神経化学変化、神経炎性プラークまたは神経細線維の絡みは、アルツハイマー病に特異的である。これらの欠陥は、普通の年齢の個体の脳においても発生し、グアムパーキンソン病、痴呆（Dementia Pugilistica）および進行性核上性麻痺のような他の病気に関わる。例えば、対螺旋フィラメント、すなわち絡みを形成し神経炎性プラークを満たす捻れフィラメントが、ピック病のような他の病気と関わる特定の絡みにおいても生じる。実際、免疫学的な研究は、対螺旋フィラメントのエピトープが、ピック体中に、すなわちピック病により影響を受けた脳の側頭皮質中の影響された神経線維中に見つかる球構造中に存在することを示している。さらに、アルツハイマ病患者の大脳皮質内の神経細線維絡みおよび神経炎性プラークの密度は、病気の段階と必ずしも関係しない。従って、今まで、アルツハイマー病の診断はきわめて困難であった。その病気の死亡前診断は主に排除により行われてきた。メディカル・リサーチ・レビュー（Medicinal Research Reviews）、第３巻、Ｎｏ．３、221〜236頁（1983年）におけるピーター・デビースによる「アルツハイマー病および老人性痴呆症の神経化学」と題する論文はアルツハイマー病について論じており、223頁には：「アルツハイマー病の診断の問題は、積極的な試験がないこと、すなわち臨床家は、発作、微細脈管病、脳腫瘍、甲状腺障害、薬剤反応、強度うつ病および高齢者において知的障害を引き起こしうる他の症状の宿主のような痴呆の他の原因を除外しなければならないことである。これらの問題の全てが症状の原因として除去された場合にのみ、アルツハイマー病の診断を受け入れるべきである。」と記載されている。アルツハイマー病の死後診断は、神経炎性プラークおよび絡みを視覚化するように染色された脳組織における神経炎性プラークおよび絡みの数の決定に基づいていた。しかしならが、神経組織病理学的研究に基づくそのような診断方法は、幾つかの脳部分の広い範囲の染色および顕微鏡試験を必要とする。さらに、正常個体、高齢個体または他の病気を有する個体においてもプラークおよび絡みが起こり得るので、脳組織についての診断を行うためのより決定的で信頼性のある方法が望まれる。グレナーらに賦与された米国特許第4,666,829号に開示されているように、アルツハイマー病に特異的な抗原の存在を確認するための試みが成されている。しかしながら、グレナーらにより記載された抗原はアツルハイマー病を有さない高齢の成人において存在する（ガンバリらのジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Journal of the American Medical Associatio n）、第263巻、2907〜2910頁（1990年）を参照されたい）。従って、アルツハイマー病を診断する方法の開発がなお望まれている。従って、本発明の目的はアルツハイマー病を診断する方法を提供することにある。本発明のもう一つの目的は、脳脊髄液を利用してアルツハイマー病を診断する方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、アルツハイマー病の診断において用いることのできる、アルツハイマー病に関係する抗原を提供することにある。本発明のもう一つの目的は、アルツハイマー病の診断において用いることのできる抗体を提供することにある。発明の開示本発明は、アルツハイマー病を有する個体において存在し、アルツハイマー病でない個体において実質的に存在しないアルツハイマー病に関係する抗原に特異的な抗体に関する。本発明は、アルツハイマー病の診断のための特異的な、感受性の高い単純なサンドイッチイムノアッセイを提供する。本発明の方法は、他の疾患の除去のプロセスに基づく診断を必要とする従来技術の欠点を克服する。すなわち、本発明はアルツハイマー病を有する個体において存在しアルツハイマー病を有さない個体において実質的に存在しないアルツハイマー病抗原に関する。本発明の抗原は幾つかのタンパク質からなり、その一部の分子量は約68,000 ドルトンである。さらに、本発明は、アルツハイマー病の診断マーカーである抗原の部分的に精製された標品に関する。本発明の抗原は、還元または非還元状態において約６の等電点を有し、親和ブルーカラム（affi-blue column）に結合し、0.01Ｍ燐酸ナトリウム、0.14Ｍ塩化ナトリウムおよび1mMフッ化フェニルメチルスルホニルのｐＨ6.8の溶液に少なくとも50％は可溶性であり、４℃の50％飽和硫酸アンモニウム中において沈殿する。アルツハイマー抗原は、アルツハイマーの患者からの脳脊髄液中でウエスタンブロット分析により検出することができるが、非痴呆患者からの脳脊髄液からは検出されない。ここに記載の方法において、3.5mlの脳脊髄液が利用されるが、この体積は容易に減らすことができた。本発明の方法で約0.1〜10 mlの体液の体積を用いることができる。本発明は、さらに、第１の抗体−抗原複合体が形成されるような、アルツハイマー病を有する個体において見つかる68,000ドルトンの抗原および関連するタンパク質とを含むタンパク質複合体の第１の抗原決定基に特異的な第１の抗体を、サンプルに接触させる工程；第１の複合体をサンプルから分離する工程；第２の抗体が第１の複合体に結合して第２の複合体を形成するように、第１の抗原決定基と同じであってもよい前記アルツハイマー抗原上の第２の抗原決定基に特異的な少なくとも一つの第２の抗体を、第１の複合体に接触させる工程；およびサンプルにおけるアルツハイマー病に特異的な抗原の存在を示す第２の複合体の存在を検出する工程を含んでなる、サンプル中におけるアルツハイマー病に特異的な抗原の存在を決定する方法に関する。本発明は、さらに、個体からの死亡前もしくは死後の脳組織または脳脊髄液をサンプルとして使用し、本発明のアルツハイマー抗原および抗体を利用してアルツハイマー病を診断するために前記方法を用いることに関する。患者からのサンプルは、脳組織または脳脊髄液に加えて、他の組織、血液、尿および血清を含む。本発明は、さらに、第１の抗体−抗原複合体が形成されるような、アルツハイマー病を有する個体において見つかる68,000ドルトンの抗原を含むタンパク質複合体の第１の抗原決定基に特異的な第１の抗体をサンプルに接触させる工程；得られる複合体をサンプルから分離する工程；第２の抗体が第１の複合体に結合するように、第１の抗原決定基と同じであってもよい68,000抗原を含むタンパク質複合体の第２の抗原決定基に特異的な検出し得る第２の抗体を複合体に接触させる工程；および複合体に結合した前記第２の抗体を検出し量を測定する工程を含んでなる、アルツハイマー病に特異的な抗原をサンプル中で検出し量を測定する方法に関する。前記の試みは、ＥＬＩＳＡによる脳脊髄液中の対螺旋フィラメント免疫反応性の検出に基づくアルツハイマー病の診断試験を設計するために行われた。これらの試験は、アルツハイマーサンプルと非痴呆対照サンプルとの重複故に制限的診断価値があるとわかった。アルツハイマー抗原の検出にウエスタンブロット分析プロトコールを用いることは、この困難性の多くを取り除く。ここに示すデータは、アルツハイマー抗原の脳脊髄液検出がアルツハイマーサンプルと非痴呆対照サンプルとを区別し得ることを示している。示された定量データは、脳脊髄液中におけるアルツハイマー抗原の検出が、アルツハイマー病におけるアルツハイマー抗原の選択的および定量的沈積故に、アルツハイマー病と、ピック病、多発脳梗塞性痴呆またはハンティングトン病のような他の痴呆症とを区別し得ることも示している。図面の簡単な説明前記簡単な記載、ならびに本発明のさらなる目的および特徴は、添付の図面と一緒に見ると、本発明の好ましく説明的である態様の以下の詳細な記載を参照にしてより詳しく理解される。図１は、本発明のアルツハイマー抗原の２次元ゲルを示す。図２は、アルツハイマー病の診断のための本発明のサンドイッチイムノアッセイ形態を示す。図３は、吸光度とμｇ IgG／ビーズとの関係を示す。図４は、アルツハイマー病脳ホモジネートと正常脳ホモジネートに対する滴定曲線を示す。図５Ａは、アルツハイマー抗原または各診断カテゴリーの濃度の全スケール分散グラムプロットグラフである：ＮＣ＝正常対照：ＮＤＣ＝神経病対照：ＡＤ＝アルツハイマー病：ＳＤＡＴ＝アルツハイマー型老人性痴呆：Ｄ／ＡＤ＝ＡＤ神経組織を有するダウン症候群：非−ＡＤ群はＮＣおよびＮＤＣを含み、ＡＤ群はＡＤ、ＳＤＡＴおよびＤ／ＡＤを含む。黒丸は６５歳以上の場合の値であり、白丸は６５歳未満の場合の値である。2.0ライン上の丸は2.0またはそれ以上（16まで）である。図５Ｂは、図５ＡのＹ軸10倍拡大図である。図６は、アルツハイマー抗原に対する本発明の種々のモノクローナル抗体の免疫反応性を示す。図７Ａ〜７Ｍは、種々のモノクローナル抗体を利用するアルツハイマー抗原のための脳アッセイを示し、一つのモノクローナル抗体が抗原の捕捉のために使用され、第２のモノクローナル抗体が検出の目的に使用される。図８Ａは、アルツハイマー病個体および正常個体の両方におけるアルツハイマー抗原の存在の決定のための脳脊髄液アッセイを示し、捕捉モノクローナル抗体はＴＧ５であり検出抗体はＭＣ15である。図８Ｂは、アルツハイマー病（ＡＤ）個体および正常（Ｎ）個体の両方におけるアルツハイマー抗原の存在の決定のための脳脊髄液アッセイを示し、捕捉モノクローナル抗体はＴＧ５またはＭＣ１であり検出抗体はＴＧ４またはＭＣ15である。図９は、アルツハイマー抗原の検出のための本発明のアッセイを示し、捕捉抗体は固相上にある。図１０は、アルツハイマー抗原の検出のための脳脊髄液アッセイを示し、捕捉抗体はＰＨＦ−１であり検出抗体はＴＧ３である。図１１は、脳脊髄液アッセイならびにモノクローナルおよびポリクローナルの両抗体を利用する種々の個体中のアルツハイマー抗原の水準を示す。発明の詳細な説明「アルツハイマー病を持つ個体」とは、該病気の臨床的徴候に罹った、侵された、またはそれを呈する個体または患者をいう。アルツハイマー病に関連する病理学病巣を記載するために本明細書で使用する種々の用語は以下の定義する。アルツハイマー病におけるある種の侵されたニューロンで見い出された大きな繊維状病巣は「神経繊維状絡み」（ＮＦＴ）という。これらの構造は、アルツハイマー抗原を含有する密に詰まった対螺旋フィラメント（ＰＨＦ）の大きなアレイよりなるが、多数の他のタンパク質種もこれらの構造に存在する。ＰＨＦのＮＦＴ形態は、本発明の可溶性アルツハイマー抗原を単離するために用いる溶媒条件において極めて溶解性である。可溶性アルツハイマー抗原は多くが異常軸索（時々、「神経網糸」という）に由来する。これらの異常軸索はアルツハイマー病における支配的病理よりなる。事実、平均的アルツハイマーケースの皮質におけるアルツハイマー抗原の９０％と多くがプラークまたは絡みよりもニューロンプロセス（異常軸索）で存在する(Wolozin，Ann．Neu rol.，22:521-526,1987)。アルツハイマー脳で見い出されている他の異常病巣はアミロイドプラークであり、時々「老人性プラーク」と呼ばれている。老人性プラークは現実には２つの区別されるタイプの構造であり、それは、アミロイドの中心コアを囲む変性ニューロン要素（ジストロフィー軸索）よりなるもので、アルツハイマーによって記載されている古典的なプラークであり、変性軸索無しのアミロイドの沈積よりなる「散漫（diffuse）」または「原始的（primitive）」なプラークである(Tagliaviniら，Neurosci., Lett．93:191-196，1988; Dickso nら，Am．J．Path．132:86-101,1988)。変性軸索を含有するプラークは今日「神経炎性プラーク」という。これらの構造における変性軸索はアルツハイマー抗原を含有し、本発明の抗体で染色される。原始的または散漫プラークはアルツハイマー抗原を含有せず、また、それらは本発明の抗体で免疫染色されない。散漫プラークは（８０歳を越える）非常に老齢な大部分の人の脳で大多数見い出されており、変性軸索の証拠無くして存在する場合に痴呆症に稀に関連しているに過ぎない(Daviesら，Neurology 38:1688-1693，1988; Delkaereら，Neurosci．Lett ，116:87-93，1990; Dicksonら，Neurobiol.，Aging 13:179-189，1991)。アルツハイマー患者の脳および脳脊髄流体（ＣＳＦ）で発見されたここに記載する抗原は、もし該抗原がここに記載する特性を有するならば、それが患者においてどこで見い出されたかとは無関係に、本明細書では「アルツハイマー抗原」という。１つのかかるアルツハイマー抗原はタンパク質であり、従って、該タンパク質の特性が議論において顕著な因子である場合はアルツハイマー抗原はここに「アルツハイマータンパク質」ともいう。免疫学的にアルツハイマー抗原と反応性である抗体はここに「アルツハイマー抗体」という。本発明は、アルツハイマー患者、すなわちアルツハイマー抗体に特異的な上昇した量で存在する抗原と実質的な免疫反応性であり得る抗体を提供する。また、本発明は、アルツハイマー抗体のアルツハイマー病を診断するための使用である。本発明の１つの態様によれば、アルッハイマー抗原は約68,000ダルトンの見掛け分子量を有する主要な種を持つタンパク質複合体であり、アルツハイマー病患者で見い出されているが、他の神経病に罹った患者を含めた非アルツハイマー病患者では非常に少ない量で存在する。本発明では、試料中のアルツハイマー病に特異的な抗原の上昇したレベルの存在を測定し、それにより、アルツハイマー病を診断する方法が提供される。該方法は、アルツハイマー病を有することが疑われる個体からの試料を、アルツハイマー抗原上の抗原決定基に特異的であって、該抗原に結合して第１の複合体を生成し得る第１抗体とを接触させることよりなる。次いで、得られた第１複合体を分離し、試料から回収し、該抗原上の第２抗原決定基に特異的な少なくとも１つの第２抗体と接触させる。第２抗原決定基は、抗原総体の多数エピトープ性質のため第１抗原決定基と同一であってもよい。第２抗体は、それが抗原に結合する場合は、第１および第２抗体に結合した抗原からなる第２複合体が形成されるように、第１複合体に存在する抗原に結合することができる。第２複合体の存在を検出し、それにより、試料中のアルッハイマーに特異的な抗原の存在および／またはレベルを測定し、所望により定量する。本発明のアッセイで用いる試料は、好ましくは、脳組織、死亡前または死後（ pre or post-mortem）脳脊髄液、尿および血液よりなる群から選択される。好ましい具体例において、第１および第２両抗体はモノクローナル抗体である。本発明の好ましいモノクローナル抗体はハイブリドーマＮｏ．ＨＢ９２０５から分泌されるＡＬＺ−５０であり、ブダペスト条約の下、１９８６年９月１７日にAmerican Type Culture Collection, Rockville，メリーランド州に寄託した。１９８６年９月２４日に生存が確認されている。ＡＬＺ−５０はこの分野においてアルツハイマー病の存在を検出するための標準的試薬となっている(例えば、Woodら，Histochemical Journal，21巻，11号， 659-662頁(1989);Itagakiら，Annals of Neurology，26巻，5号，685-689頁(198 9)：Beachら，Brain Research，501巻，1号，171-175頁(1989)；Loveら，Journa l of Neuropathology and Experimental Neurology，47巻，4号，393-405頁(198 8);Nukinaら，Neuroscience Letters，87巻，3 号，240-246頁(1898);およびHymanら，Brain Research, 450巻，392-397頁(1988 ))。アルツハイマー病に関連する本発明の抗原（アルツハイマー抗原）はいくつかのタンパク質の集合であり（図１参照）、主要なタンパク質種は還元性ＳＤＳゲル上で約68,000ダルトンの見掛け分子量を有する。それが最初に記載されて以来、アルツハイマー抗原はさらにＡ６８、ｔａｕ、過剰リン酸化ｔａｕ（Leeら，S cience 251:675-678，1991)、異常リン酸化ｔａｕ(Grundke-Iqbalら，Proc．Nat l．Acad．Sci．83:4913-4917，1986)、可溶性ＰＨＦ（GreenbergおよびDavies， Proc．Natl．Acad．Sci.，87:5827-5831，1990）、ＰＨＦｔａｕ(Greenbergら， J．Biol．Chem.，267;564-569，1992)、およびアルツハイマー病関連タンパク質（ＡＤＡＰ）(Ghanbariら， JAMA，263 2907-2910，1990)と呼ばれた。全ての用語はここにおけるアルツハイマー抗原に言及する場合は同等とみなされる。それはｔａｕおよびリン酸化ｔａｕを含有する。この抗原を用いてモノクローナル抗体を生起させることができ、これはアルツハイマー病のための診断アッセイで使用できる。本発明の診断アッセイにおいて、第１抗体を、例えばポリスチレンビーズのごとき適当な個体マトリックスな付着させることができる。試料を得て、適量の第１抗体と接触させて第１複合体を生成させる。該接触は、好ましくは、第１抗体を被覆したポリスチレンビーズのカラムに試料を添加することを含む。試料と第１抗体との接触で得られた複合体を、当業者に公知の溶離方法によって試料から分離する。分離した第１複合体を、抗原上の抗原決定基に特異的であって、複合体における抗原に結合できる少なくとも１つの第２抗体と接触させる。第２抗体が指向する抗原決定基は、抗原総体の多数のエピトープ性（すなわち、反復エピトープ）のために、第１抗体が指向したものと同一であってよい。かかる接触を行う条件は本明細書に記載され、当業者に公知である。本発明の第１および第２抗体は、それに同定可能な標識を付着させることによって検出できるようになる。好ましい具体例において、第２抗体を検出可能とする。該抗体は、好ましくは、検出可能な反応を触媒する適当な基質にコンジュゲートした酵素を抗体に付着させることによって検出可能となる。該酵素はホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼであってよい。抗体の検出の他の手段は、蛍光または放射性標識をそれに付着させることを含む。別法として、該抗体はそれに向けられたもう１つの抗体の使用によって検出でき、他の抗体は標識され、またはそれに結合した酵素を有する。第１および第２抗体に結合した抗原よりなる複合体の抗原に結合した検出可能な抗体の存在は、よく知られた技術を用いて容易に検出できる。かくして、もし検出可能抗体が、適当な基質にコンジュゲートした酵素に連結されると、検出可能な結合抗体の光学密度を定量的分光光度計を用いて測定する。検出可能抗体が蛍光的に標識されていれば、蛍光光度計を用いて蛍光放出を測定または検出できる。同様に、検出可能抗体が放射性標識されていれば、結合抗体は放射能検出技術を用いて検出できる。また、化学ルミネッセンス技術も使用できる。テスト試料につき前記した方法を用いて得られた結果を、対照試料につき該方法を用いて得られた結果と比較することによって、アルツハイマー病に特異的な抗原の存在を測定できる。アルツハイマー病に特異的な抗原の上昇した量はそれにより検出され、所望により定量できる。アルツハイマー病抗原を検出し測定する方法において、第１および第２抗体はモノクローナル抗体であってよい。別法として、第１または第２検出可能抗体はポリクローナル抗体であり得る。アルツハイマー病抗原を定性的にまたは定量的に測定する方法は、アルツハイマー病の診断で用いることができる。本発明の方法の利用は先行技術方法よりも有利である。何故ならば、本発明はアルツハイマー病抗原を検出するための簡便で、感度が良く、非常に特異的な方法であるからである。アルツハイマー抗原は集合形態で存在し、従って、多エピトープ性であるので、サンドイッチイムノアッセイでよく適合する。これは、可溶性であって、通常は抗体に対する１つのエピトープを有する交差反応タンパク質とは対照的である。さらに、該アッセイは０．５吸光度単位（ｒ＝０．９）まで直線的で、再現性があり（１０％未満のＣＶ）、感度が良く、かつ特異的である。予め処方した試薬および標準供給にて、該アッセイは簡便で迅速である。１２０のデータポイントが約４時間またはそれ以上で容易に生成され得る。脳脊髄液で使用するここに記載する方法は血液および尿に適用できる。以下のものは、アルツハイマー病を有する患者の血液または他の体液におけるアルツハイマー抗原の存在を検出するのに適すると考えられるもう１つのテスト手法である。該手法は、J．S．McDougalらによる「Immunoassay for the Detection and Quantitation of Infectious Human Retrovirus，Lymphadenopathy-Associated Virus(LAV)」Journal of Immunological Methods，76巻，171-183頁(1985)に開示されているＨＴＬＶ−IIIの検出で用いる手法に同様である。本発明の１つの好ましい具体例において、アルツハイマー抗体はＩｇＭクラスのものであり、しかしながら、ＩｇＧクラスのアルツハイマー抗体が得られても、アルツハイマー抗体なる用語には特に含まれる。Journal of Immunological M ethods,74巻、307-315頁(1984)中の「The Identification of Monoclonal Class Switch Varients by Sub Selection and an ELISA Assay」なる表題の論文にSpir aらによって記載されている方法を用い、ＩｇＭクラスのアルツハイマー抗体を用いてＩｇＧ₁クラスのアルツハイマー抗体を得た。ＩｇＧ₁クラスのアルツハイマー抗体を利用して行われたテストは、ＩｇＭクラスのアルツハイマー抗体と比較して、非特異的結合における実質的減少を示した。一般に、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりもより非特異的結合を示す。３つのアルツハイマー脳および３つの正常脳のホモジネートを用いて、２つのハイブリドーマからのＩｇＧ₁クラスのアルツハイマー抗体をＩｇＭアルツハイマー抗体と比較した。ＩｇＧ₁アルツハイマー抗体の１つはＩｇＭアルツハイマー抗体よりもかなり低い正常脳組織への結合を示した。他のＩｇＧ₁アルツハイマー抗体は正常組織との有意な反応性は示さなかった。本発明のもう１つの利点は、アルツハイマー抗体によって染色される脳の一部に対する放射性標識等のごとき標識を担持させるためのアルツハイマー抗体の使用である。しかる後、脳の「マップ」を公知方法を用いて標識から作成して、脳についてのさらなる情報を提供する。一般に、アルツハイマー抗体が適当な標識と結合し、それにより、アルツハイマー抗体が担体として作用するように常法を用いる。通常の技術を用い、結合させたアルッハイマー抗体および標識を脳に導入する。アルツハイマー抗体はアルツハイマー抗原の部位に標識を付着させる。しかる後、脳のマップを常法を用いて作成し、それにより、アルツハイマー抗原の存在および分布を示す。以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明は範囲または精神が実施例に記載された特別の化合物または手法に限定されるものではない。実施例１抗体の調製１．ＡＬＺ−５０モノクローナル抗体の生産は当該分野でよく知られており、Christian Stahli らによる「High Frequencies of Antigen-Specific hybridomas; Dependent on Immunization Perimeters and Prediction by Spleen Cell Analysis」Journal of Immunological Methods，32巻，297-304頁(1980)およびS．Fazekas de St．G rothおよびDofores Scheideggerによる「Production of Monoclonal Antibodies ; Strategy and Techniques」Journal of Immunization Methods，35巻，1-21頁 (1983)を含めた多くの論文に記載されている。さらに、手法および臨床的工程の記載は関連製品の供給業務に従事するMicrobiological Associatesのごとき会社から容易に入手できる。使用する手法は、アルツハイマー病を持つ４人の患者のオートプシーの間の採取された腹側前脳組織のホモジネートに対するモノクローナル抗体の生産を含む。得られた抗体を、免疫化学および免疫組織化学手法双方における正常患者からの組織とのアルツハイマー患者からの脳組織とを区別するそれらの能力に基づいてスクリーニングする。先行技術では酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）という公知の技術を用い、得られたモノクローナル抗体をアルツハイマー脳ホモジネートに結合するそれらの能力に従って最初にアッセイする。正常組織と比較してアルツハイマー脳のホモジネートへの結合において５０％を越える増加または減少を示す抗体をさらに実験する。１つの特別の抗体（ここにＡＬＺ−５０抗体、ＡＬＺ−５０という）はＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９２０５の下でAmerican Type Culture Coll eciton，Rockville,メリーランド州に寄託した。このモノクローナル抗体は後記表Ａに示したＴａｕ上の領域に結合する。ＡＬＺ−５０は、ここに記載する特定のアッセイ条件下で正常組織で見い出されたタンパク質と交差反応しない。２．他の抗体本実施例のパート１に記載したＡＬＺ−５０抗体を用いて、本発明のアルツハイマー抗原に特異的に他の抗体を得た。これは、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってなされた。大量の抗原を、ＡＬＺ−５０抗体を用い、アルツハイマー病のケースからの脳組織から調製した。この物質を用いてマウスを免疫化し、これらのマウスからの脾臓を用いて、アルツハイマー抗原と反応性のモノクローナル抗体を産生する新しい細胞系を得た。アルツハイマー病抗原を精製するために、ＡＬＺ−５０細胞系の培養体をスクリーニングしてＩｇＧ₁分泌変異体を単離した。これらのクラス−スイッチ変異体はＩｇＭスクリーニング細胞の培養で自然に生起する。１つの変異体をＰ４２と命名し、それはＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングおよび免疫細胞化学を用いると、ＡＬＺ−５０結合特性を保有していることが示された。プロテインＡカラム上のクロマトグラフィーによってＰ４２ＩｇＧ₁を精製し、製造業者のプロトコルに従ってAffi-ゲル１０(Biorad Laboratories)に付着させた。カラムはＰ４２ Affi-ゲル１０として調製した。アルツハイマー病のケースからの脳の抽出物を、脳ホモジネートの２７，０００ｇにおける単一遠心によって調製した。上清画分をＰ４２カラムに負荷し、カラムを負荷後に洗浄した。結合抗原を３Ｍチオシアン酸カリウムの溶液で溶出させ、溶出物をトリス−緩衝生理食塩水に対して透析した。次いで、マウスを、注射当たりマウスにつき１０ないし２０マイクログラムのＰ４２カラム上で精製した抗原タンパク質の腹腔内注射によって免疫した。標準的なプロトコルによって、ハイブリドーマ細胞の産生のために脾臓を摘出する前に、マウスを４または５回免疫化した。ＥＬＩＳＡおよび免疫細胞化学によって、ハイブリドーマを、特異的抗体の産生につきテストした。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティングおよび免疫細胞化学によりアルツハイマー病のケースからの脳組織と選択的反応性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを得た。得られたモノクローナル抗体は：ＴＧ３、ＴＧ４、ＴＧ５、ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ５、ＭＣ６、ＭＣ１５、ＭＣ１６およびＰＨＦ−１である。図６は、これらのモノクローナル抗体のいくつかの、６つの異なる精製アルツハイマー抗原調製物との反応性を示す。これらの抗体のいくつか（例えば、抗体ＭＣ１）はＡＬＺ−５０に対する特異性と非常に似ている。他の抗体はより高いアフィニティーで反応し、アルツハイマー抗原の断片を検出する（例えば、抗体ＭＣ６、ＭＣ１５、ＴＧ４およびＴＧ５）。アルツハイマー抗原についての本発明の抗体の特異性は以下の通りである。ある条件下で、ＡＬＺ−５０は正常および組換えｔａｕと反応する；しかしながら、同様の条件下での同一アッセイ配置において、アルツハイマー抗原に対するその反応性はより大きい。事実、本発明で記載したＥＬＩＳＡ配置のごとき他の修飾した条件下では、ＡＬＺ−５０はアルツハイマー抗原と反応するのみである。同様に、ＴＧ−３エピトープは、適当なリン酸化によって組換えｔａｕ上で生成する：アルツハイマー抗原に対するその反応性はホスホ組換えｔａｕに関するよりもかなり大きい。事実、本発明の抗体の多くの反応性はコンホメーション的に由来するｔａｕ分子上にエピトープを有する。いくつかは不連続であるエピトープを認識し（ＡＬＺ−５０、ＭＣＩ）、他方、他のものは連続的または不連続的であり、かつリン酸化依存的であるエピトープに結合する（ＴＧ−３、ＴＧ−４）。恐らくは、それらは、アルツハイマー抗原とかなり良好に反応する。何故ならば、異常タンパク質複合体におけるｔａｕタンパク質は、抗体認識および結合のために好ましいコンホメーションに「ロック」されているからである。これらの理由で、「正常脳タンパク質」との抗体の低い反応性は問題ではなく、発明アッセイでは干渉しない。何故ならば、抗体反応性における差異は、高度に反応性のアルツハイマー抗原の形成によるアルツハイマー病に存在するからである。エピトープマッピング手法アルツハイマー抗体のアルツハイマー抗原への結合の性質をエピトープマッピングによって測定した。ｔａｕはアルツハイマー抗原の主要成分であることが知られているので、アルツハイマー抗体の多くは組換えｔａｕまたはホスホ組換えｔａｕに結合するであろう。組換えタンパク質についてのアフィニティーは疑いもなくアルツハイマー抗原についての抗体アフィニティーよりも小さいが、有用な情報が抗体の相互作用の部位に関してなお得られる。ｈｔａｕ４０、ヒト腹側脳神経系ｔａｕの全長４４１−残基形態の欠失分析を通じて、アルツハイマー抗原エピトープを同定した。まず、全ｔａｕ分子にわたる４２内部欠失のライブラリーを、ｈｔａｕ４０ｃＤＮＡの制限および再結合を通じて創製した。突然変異体を細菌発現ベクターに入れ、イー・コリ(E．coli)に形質転換した。ｔａｕ欠失の得られたライブラリーを他の細菌発現ライブラリーのようにプロセッシングし(Helfm anら， Focus 6: 1-05,1984)、ここに記載するモノクローナル抗体で「プローブ」した。ホスホエピトープの同定のために、発現ライブラリーの個々のクローンを含有する細菌コロニーの膜結合溶解物を、固相リン酸化アッセイにおけるタンパク質キナーゼの粗製混合物と共にインキュベートした(CarmelおよびKuret，An al．Biochem．203:274-280，1992)。各モノクローナル抗体が各ｔａｕ欠失突然変異体と反応する能力を評価することによって、抗体結合に必須または貢献するｔａｕ分子の領域を同定した。ｔａｕの最初（Ｎ−末端）の１８アミノ酸を除去する欠失の結果、ＡＬＺ−５０およびＭＣ１の双方との反応性が完全に失われた。ｔａｕ配列の部位特異的突然変異を用いるより詳細な分析は、アミノ酸７、８および９（ＧＬＵ−ＰＨＥ− ＧＬＵ）が両抗体の結合に絶対的に必要であることを示した。抗体の結合に絶対的に必要なｔａｕ上の１つの部位は最初に１８アミノ酸のうちにあり、残基７、８および９の中心にあるようである。ｔａｕ配列の第２の一連の欠失もｔａｕのＡＬＺ−５０およびＭＣ１との反応性に完全に喪失を示す。アミノ酸３１２−３４２からの配列の喪失の結果となる欠失は、ｔａｕの両抗体との反応性を完全に排除する。かくして、ＡＬＺ−５０およびＭＣ１のＰＨＦにおけるｔａｕへの結合は、ｔａｕが最初の１８アミノ酸およびアミノ酸３１２−３４２からの配列を一緒にして折り畳まれることを要する。これらの配列は正常脳から調製したｔａｕにおいて相互に隣接しないので、これらの抗体とこのタンパク質との反応性はない。配列の示唆される配置を以下に示す。 MAEPRQEFEVMEDHAGTY aa 1- 18 VDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKI aa 312-342 このシリーズのｔａｕ欠失を用いて新しい抗体のもう１つを調べた。ＴＧ５反応性は、ｔａｕ配列２２０−２３５を失わせた構築体から喪失した。他の欠失は反応性を失わせず、ＴＧ５は以下に示す線状アミノ酸配列と反応することを示す。 TREPKKVAVVRTPPKS aa 220-235 同様の戦略を用いて、リン酸化によって形成され、ＰＨＦに存在するｔａｕ上のエピトープをマップした。このシリーズの実験において、ｔａｕ欠失および部位特異的突然変異体の集合を８つの精製プロテインキナーゼでリン酸化した。ＰＡＧＥによってリン酸化生成物を分析し、ＴＧ３、ＴＧ４、ＭＳ２、ＭＣ３、ＭＣ５、ＭＣ６およびＭＣ１５との結合につき調べた。ＭＣ２およびＭＣ３を除き全ての抗体で反応性が得られた。同一シリーズの欠失および部位特異的突然変異体での同様の実験により、抗体反応性に必要な配列の定義が可能となった。アミノ酸２２０−２３５からのｔａｕ配列の欠失を持つタンパク質のリン酸化は、ＴＧ３、ＴＧ４、ＭＣ５、ＭＣ６およびＭＣ１５との反応性が得られる結果とはならなかった。これは、ＴＧ５による非リン酸化形態において認識される同一の配列である。セリン２３５をアラニンに突然変異させるリン酸化構築体を用いるさらなる分析はＴＧ４、ＭＣ５、ＭＣ６およびＭＣ１５との反応性は生じなかったが、ＴＧ３反応性は生じた。他の証拠はＭＣ５およびＴＧ３反応性は、スレオニン２３１を突然変異させた場合とは対照的に生じ得なかったことを示唆する。このデータは表Ａにまとめる。モノクローナル抗体ＴＧ３を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７４４としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。このモノクローナル抗体は前記表Ａに示したｔａｕ上の領域に結合する。モノクローナル抗体ＴＧ４を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７４５としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。このモノクローナル抗体は前記表Ａに示したｔａｕ上の領域に結合する。モノクローナル抗体ＰＨＦ−１を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７４３としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。このモノクローナル抗体は前記表Ａに示したｔａｕ上の領域に結合する。モノクローナル抗体ＭＣ１６を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７４２としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。モノクローナル抗体ＭＣ６を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７４０としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。モノクローナル抗体ＭＣ１を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７３６としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。このモノクローナル抗体は前記表Ａに示したｔａｕ上の領域に結合する。モノクローナル抗体ＴＧ５を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７４６としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。モノクローナル抗体ＭＣ２を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７３７としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。このモノクローナル抗体は前記表Ａに示したｔａｕ上の領域に結合する。モノクローナル抗体ＭＣ３を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７３８としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。モノクローナル抗体ＭＣ５を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７３９としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。モノクローナル抗体ＭＣ１５を分泌するハイブリドーマは、ブダペスト条約下、１９９４年１０月２６日にAmerican Type Culture Collection，Rockvile，メリーランド州にＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１１７４１としてカタログ化され、１９９４年１１月４日に生存が確認されている。このモノクローナル抗体は前記表Ａに示したｔａｕ上の領域に結合する。３．ウサギ抗−ＡＬＺＩｇＧ多数回の異なる遠心工程および界面活性剤抽出によって、アルツハイマー病脳ホモジネートをアルツハイマー抗原につき富化させた。ウサギを高度に富化させたアルツハイマー抗原画分で免疫化させ、毎月のスケジュールに従って追加免疫（ブースター）注射した。ＥＬＩＳＡを用いて採血をスクリーニングし、そこでは、免疫原調製物を３７℃における強制空気によってウェル中で乾燥させた。所望の力価が達成された後、ウサギ血清をプロテイン−Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。これらのウサギの血清採血からのプロテイン−Ａ精製ＩｇＧを用いて後記するアッセイで用いるビーズを被覆した。実施例２アルツハイマー病抗原の単離および特徴付け先行技術で酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）という公知の技術を用い、アルツハイマー病抗原に特異的なモノクローナル抗体をアッセイして、アルツハイマー脳ホモジネートに結合するそれらの能力を測定した。脳ホモジネートは、Dounceホネゲナイザー中のガラス乳棒によって、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にホモジナイズしたアルツハイマー皮質２.５ｇを用いて調製した。本明細書で用いる「ＰＢＳ」とは、ｐＨ６.８の０.０１Ｍリン酸ナトリウムおよび０.１４Ｍ塩化ナチリウムの溶液をいう。脳ホモジネートは、約４℃にて、約１５,０００ｒｐｍの速度で２０分間、ベックマン（BECKMAN）JA-21遠心機（CENTRIFUGE）で遠心して約２７，２００ｇを得た。脳ホモジネートの上清を除去し、モレキュラーシーブSEPHAROSE 6B(Pharmacia)３５０ｍｌを含有するクロマトグラフィーカラムに負荷した。クロマトグラフィー手法で用いたキャリヤーはＰＢＳであり、１時間当たり６ｍｌの速度でクロマトグラフィーカラムを通した。３.１ｍｌずつの画分を収集した。アルツハイマー病抗原はボイド容量においてクロマトグラフィーカラムから大いに溶出する。ボイド容量における抗原の存在は、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）の使用によって測定した。各ボイド容量画分の５０マイクロリットルをテストした。各５０マイクロリットルを１：１００の比率にて水で希釈し、この希釈溶液５０マイクロリットルをＥＬＩＳＡのために９６−ウェルポリビニルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）上で乾燥した。抗原の各乾燥試料を、５パーセント（ｖ／ｗ）粉末化脱脂乾燥乳を含むＰＢＳのブロッキング溶液のウェル当たり２００マイクロリットルと合し、ＥＬＩＳＡのために室温にてウェル中で１時間インキュベートした。抗原につきテストすべき抗体をブロッキング溶液で１：５の比率に希釈した。希釈した抗体溶液の５０マイクロリットルを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。希釈した抗体溶液を除去し、ポリビニルマイクロタイタープレートをｐＨ７.４の０.０１Ｍトリス(Sigma)および０.１パーセントTWEEN-20 (National Diagnostic)の水性混合物で５回洗浄した。次いで、希釈した試料を、マウス免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗体(Kirkegaard & Perry)よりなる二次抗体と共に、室温にて１時間インキュベートした。しかる後、二次抗体を除去し、ポリビニルマイクロタイタープレートを、０.０１Ｍトリスおよび０.１パーセントTWEE N-20の水性混合物で５回洗浄した。２，２’−アジノージ’−３−エチル−ベンズチアゾリン溶液（ＡＢＴＳ）(Kirkegaard & Perry)の溶液と共に、試料を室温で３０分間インキュベートした。ウェル当たり５０マイクロリットルを使用した。続いて、ＥＬＩＳＡリーダーを４０５ｎｍフィルターを使用して光学密度を測定した。ＡＢＴＳでの発色は抗原に結合した抗体の存在を示す。抗体ＡＬＺ−５０は記載したアッセイ条件下でアルツハイマー病抗原につき特異的であることが判明した。以下の表１は、アルツハイマー病で亡くなった患者および正常個体双方の側頭皮質のプールからの抗原測定の結果を示す。１０のアルツハイマーケースおよび６の正常ケースを分析で用いた。アルツハイマーケースは臨床および神経病理学的特徴において典型的であった。脳ホモジネートは肺または心臓病で病院で亡くなった正常個体から調製した。これらの患者は死亡に先立ってボケておらず、神経学的または精神病学的病気の履歴を有していなかった。表１において、アルツハイマー病患者からの０.３３マイクログラムの側頭皮質ホモジネートは７５の光学密度を有したが、正常個体からの側頭皮質ホモジネートは１０にすぎない光学密度を有したことが分かる。従って、アルツハイマー病抗原は正常患者と比較して、アルツハイマー患者の側頭皮質で７ないし８倍大きい濃度である。表２にリストしたケースを用いてさらなる実験を行った。すべてのケースは標準的な技術によって診断した。死亡に先立って神経学的に損なわれておらず、オートプシーに際して異常な神経病理学的変化を呈しない個体のケースを正常と記載する。免疫細胞化学では、試料を使用までホネマリン中に固定した。生化学実験で用いた組織は使用まで−８０℃で貯蔵した。脳脊髄流体は痴呆症の評価を受けた９人の患者から腰椎穿刺によって得た。神経学的観察はＣＴスキャン、ＥＥＧ、ルーチン的血液化学および神経心理学テストを含むものであった。これらの個体はアルツハイマー病のため一次的変性痴呆症の診断を全て受けたものであった。試料は年齢が６０ないし７６歳の範囲の５人の女性および４人の男性から得た。非痴呆症個体からの試料は年齢が６０ないし９３歳の範囲の３人の男性および３人の女性から得た。使用した免疫化学的試薬はペルオキシダーゼをカップリングしたヤギ抗体（Biorad Labs.）、¹²⁵−ヨウ素をカップリングしたヤギ抗マウス抗体(Amersham Corp.)およびペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリンスルホネート）(ＡＢＴＳ，Biorad Labs.)である。アルツハイマー病抗原−抗体免疫反応性の量の定量は酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）を用いて行った。脳組織を１０容量のＰＢＳｐＨ６．８＋２ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル中でホモゲナイズした。試料に存在するタンパク質の濃度はBioradタンパク質アッセイによって測定した。ウェル当たり１００ｍｇのタンパク質を添加し、３つのファクターだけ組織の量を系列希釈して最終希釈点につきウェル当たり１００ｎｇのタンパク質を得ることによってホモジネートをポリビニルプレート上に乾燥した。次いで、試料をＰＢＳｐＨ７．４＋５％脱脂乾燥乳（ブロッキング溶液）と共に１時間インキュベートして非特異的結合を減少させ、次いで、室温にて、ブロッキング溶液に１：５希釈してアルツハイマー抗体ハイブリドーマ培地と共に１時間インキュベートした。前記した手法において、脳ホモジネートの試料を冷所にてアルツハイマー抗体と共に一晩インキュベートした。０.０１Ｍトリス＋０.０２％Tween-20中でプレートを５回洗浄することによって抗体を除去し、プレートを、ブロッキング溶液中の１：５００希釈したペルオキシダーゼ−コンジュゲートヤギ抗マウス抗体と共にインキュベートした。前記した最終洗浄に続き、試料をＡＢＴＳと共に３０分間インキュベートし、４０５ｎｍで光学密度を読み取ることによって抗体の存在を可視化した。ホルマリン中に固定した組織から切り出したビブラトーム（vibratome）切片（４０ミクロン厚み）を用いて免疫細胞化学を行った。該切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、０.２５％トリトンＸ−１００−３％過酸化水素中で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ洗浄の後、該切片をＥＬＩＳＡアッセイのために前記したごとくに処理した。０.１Ｍトリス、ｐＨ７.４中の０. ４５ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジンおよび０.４４ｍＭ過酸化水素との反応によってペルオキシダーゼを可視化した。ウェスタンブロット分析では、ＰＢＳ−２ｍＭＥＤＴＡ不溶性物質を５％ＳＤＳ−５％β−メルカプトエタノールに溶解させ、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分画した。タンパク質をニトロセルロースに移し、¹²⁵Ｉ−標識ヤギ抗−マウス免疫グロブリンを二次抗体として使用し、反応性のパターンをオートラジオグラフィーによって可視化した以外は前記したごとくにアルツハイマー抗体染色を行った。酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、各試料に存在する免疫反応性の量をまず測定した。結果は後記表２に示す。アルツハイマー組織に存在する免疫反応性の量は、皮質プラーク病理学（ＰＤ）または正常組織を持つグアムパーキンソン病（ＧＰＤ）、ピック病、パーキンソン病によって侵された組織で見い出されたものよりもはるかに大きかった。正規化すると、各病気における免疫反応性の量は、各々、１００、３.０、３.１、２.４および１.８である。アルツハイマー抗体の免疫細胞化学は表２のセクションＡおよびＢに記載した病気を表すケースで調べた。アルツハイマー抗体染色の劇的特性の１つは異常軸索の広範な染色である。目視的に観察すると、軸索染色は可視化染色のほとんどであった。ニューロンの染色はＧＰＤおよびハレルフォルデン−シュパッツ病（ＨＳＤ）で見い出され、ピック体の染色はピック病で見い出された。アルツハイマー病によって侵されたケースからの組織に存在する広範な軸索染色とは対照的に、ＧＰＤ、ＨＳＤまたはピック病に侵された組織は最小の軸索染色を呈した。ＰＤ皮質組織は、病理学的にはアルツハイマー組織と同様であるが、１つのケースにおけるプラークの少量の染色および他の２つのケースにおける染色無しを呈したにすぎなかった。プラークの染色が明らかであったＰＤケースにおいて、海馬組織は錐体層ニューロン染色を呈し、チオフラビンＳ染色は軸索プラークおよび神経繊維状絡みの双方の存在を明らかとした。これらの結果は、この個体がパーキンソン病およびアルツハイマー病双方に罹っていたらしいこと、およびプラークがアルツハイマー抗原を含有する軸索プラークであってことを示唆する。５２歳で死亡し、多数のプラークおよび絡みを脳皮質に有したダウン症候群のケースからの組織は、アルツハイマー病検体と同様に反応した。これは、老齢のダウン症候群個体がアルツハイマー病に侵されていたという仮説と一致する。表２にリストした他のいずれの病気によって侵された組織にも染色は見いだされなかった。組織が存在する少数の散漫アミロイドプラークを有していた場合でも、正常組織には染色は見い出されなかった。アルツハイマー脳におけるプラークの組成は、それらが本発明のアルツハイマー抗原と共にジストロフィー軸索を含有する性質において神経炎的である点で正常年齢脳におけるものと区別される。アルツハイマー病組織で観察された絡みの数はピック病のケースの下方側頭皮質に存在するピック体の数よりも少なく、ＧＰＤまたはＨＳＤ組織に存在するものよりも３倍大きかった。存在する免疫反応性の量は異なる病気の侵されたニューロンにおいてまたはピック体において異なっていなかった。従って、免疫反応性のレベルにおける差異は、アルツハイマー組織に存在する異常軸索の豊富に染色にためである。かくして、免疫細胞化学的染色の合計量はＥＬＩＳＡによって観察された免疫反応性の合計量と相関した。ピック病およびＧＰＤからのもののごとき他の組織における少量の免疫反応性はアルツハイマー病抗原の低レベル存在と対応する。これは、アルツハイマー抗体でのウェスタンブロット分析を用いて測定された。使用した組織に存在するアルツハイマータンパク質の量を最大化するために、試料を２ｍＭＥＤＴＡの存在下で調製し、これはアルツハイマータンパク質の溶解度を９０％まで低下させる。この低下した溶解度は、ＥＤＴＡを含めたプロテアーゼ阻害剤のカクテルの添加によってアルツハイマー抗原を安定化させる試みをなした時に発見された。アルツハイマー抗体反応性はＥＤＴＡ存在下で調製された上清画分からは目視的に存在しなかったが、ペレット中に定量的に回収された。２ｍＭＥＤＴＡのホモジネートへの添加は、かくして、抗原の便利な富化を提供する。アルツハイマー抗体でのウェスタンブロット分析によって、ＰＢＳ−２ｍＭＥＤＴＡ不溶性画分を調べた。結合の全てのタイプについてのブロットの感受性を最大化するために、大量のタンパク質をゲルに負荷し、アルツハイマー抗体およびＩ−１２５標識二次抗体と共に一晩インキュベートした。アルツハイマー病組織における免疫反応性は６８,０００−６２,０００ダルトンタンパク質ダブレットに対応する。加えて、わずかに大きな分子量バンドも弱い該ダブレット上方で観察された。正常組織は大量の低分子量免疫反応性を含んだ。これは大量に粗製物質の使用に由来する。これらのバンドは、部分的に精製した試料を調べた場合には出現せず、アルツハイマー病抗原は正常または他の神経病からの精製画分で検出された。低分子量の交差反応性タンパク質は一晩のインキュベーションでのＥＬＩＳＡによって測定した正常脳組織免疫反応性を説明する。正常組織からの調製物におけるイムノブロットの６８,０００ダルトン領域には反応性はなかった。ピック病ケースからの組織は、ほとんどが６２,０００ダルトンタンパク質および低分子量物質を含有した。６８,０００ダルトン領域において弱いバンドが観察された。ＧＰＤ組織は６２,０００ダルトンにおいて鋭い免疫反応性を与え、６８,０００ダルトンにおいて散漫な反応性を与えた。これらの結果は、ピック病およびＧＰＤにおける免疫細胞化学によって観察された痕跡レベルの免疫反応性が、６８,０００ダルトンポリペプチドを含有するアルツハイマータンパク質複合体（アルツハイマー抗原）である、アルツハイマー脳で観察されたものと同一のタンパク質を表すことを示唆する。アルツハイマー脳におけるこのタンパク質の上昇程度は、アルツハイマーの反応性が隣接するレーンにおける反応性を曖昧にするのを防ぐためアルツハイマーレーンにおける半分の量の組織の使用にも拘わらず明らかである。アルツハイマー組織におけるアルツハイマー抗原の豊富さの選択的上昇はアルツハイマー病についての診断テストにおいて開発された。この抗原の有用性は以下の実施例で示す。本発明のアルツハイマー病抗原はアルツハイマー病特異的抗体によって認識され、アルツハイマー病患者に大量に存在し、他の神経病に罹った患者を含めた非アルツハイマー病患者にはほんのわずかな量で存在する。アルツハイマー病抗原はＰＢＳに少なくとも約５０パーセント可溶性であり、SEPHACRYL S-400またはS EPHADE G-25またはSEPHAROSE 6Bのごときモレキュラーシーブカラムからボイド容量にて大いに溶出し、ボイド容量は少なくとも２×１０⁶ダルトンの分子量に対応する。これはアルツハイマー病抗原がいくつかのタンパク質の集合体であることを示す。本発明者らは、アルツハイマー病抗原をなすタンパク質のいくつかが約５３,０００、６２,０００、６８,０００および１０５,０００ダルトンの分子量を有することを発見した。さらに、アルツハイマー病抗原はｔａｕおよびリン酸化ｔａｕを含有し、Affi−ブルーカラムに強く結合し、水性０.５Ｍ塩化ナトリウムでは溶出されないが、水性２Ｍ塩化ナトリウムでは除去できる。アルツハイマー病抗原よりなる主要タンパク質の分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）での変性およびメルカプトエタノールでの還元の後には約６８ ,０００である。ＳＤＳでの変性後における非還元形態でのアルツハイマー抗原の見掛けの分子量は６８,０００ダルトンよりかなり大きく、約３００,０００ダルトンよりも大きい。非還元形態では、アルツハイマー病抗原は１０パーセントアクリルアミドゲルには侵入しないであろう。還元および非還元形態のアルツハイマー病抗原のｐＩは等電点電気泳動によって測定すると約６である。該抗原は４℃において５０パーセント飽和水性硫酸アンモニウム中で沈殿し、マグネシウム（Ｍｇ⁺⁺）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下で分子をリン酸化するキナーゼで共精製され、キナーゼ自体であると考えられる。アルツハイマー病抗原はニューロフィラメントでは共精製されない。以下にアルツハイマー抗原の特性のいくつかをまとめる。１．アルツハイマー抗原はアルツハイマー抗体によって認識される。２．アルツハイマー抗原はアルツハイマー患者に存在し、他の神経病に罹った患者を含めた非アルツハイマー患者には実質的に存在しない。３．アルツハイマー抗原はＰＢＳ中で少なくとも約５０パーセント可溶性である。４．アルツハイマー抗原はSEPHACRYL S-400またはSEPHADEX G-25またはSEPHAR OSE 6Bのごときモレキュラーシーブカラムから、少なくとも２×１０⁶ダルトンの分子量に対応するボイド容量にて大いに溶出する。これは、アルツハイマー抗原のサイズは天然タンパク質の集合した形態を表し得ることを示唆する。５．アルツハイマー抗原はAffi-ブルーカラムに強く結合し、水性０.５Ｍ塩化ナトリウムでは溶出されないが水性２Ｍ塩化ナチリウムでは除去できる。６．アルツハイマー抗体によって認識された１つのアルツハイマー抗原サブユニットの見掛け分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）での変性およびメルカプトエタノールでの還元の後には約６８,０００ダルトンである。７．ＳＤＳでの変性後における非還元形態のアルツハイマー抗体によって認識されるアルツハイマー抗原の見掛け分子量は６８,０００ダルトンよりもかなり大きく、約３００,０００ダルシンよりも大きい。非還元形態において、アルツハイマー抗原サブユニットは１０パーセントアクリルアミドゲルに侵入しないであろう。８．アルツハイマー抗原は４℃において５０パーセント飽和水性硫酸アンモニウム中で沈殿する。９．アルツハイマー抗原はマグネシウム（Ｍｇ⁺⁺）およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下で分子をリン酸化するタンパク質キナーゼで共精製される。１０．アルツハイマー抗原はニューロフィラメントで共精製されない。１１．アルツハイマー抗体はアルツハイマー患者の脳脊髄流体に存在する抗原と反応し、正常患者の脳脊髄流体には存在しない。１２．アルツハイマー抗体はアルツハイマー患者に存在する抗原と反応し、ハンチントン舞踏病、散漫ローリイ体病、クロイツフェルト−ヤコブ病、進行性核上性麻痺および多梗塞病を持つ患者にはほとんど存在しない。１３．アルツハイマー抗原の量はグアム−パーキンソン病痴呆症合併症およびピック病のケースで検出され得る。しかしながら、ニューロンプロセスにおけるアルツハイマー抗原の蓄積はアルツハイマー病のユニークな特徴のように見える。１４．水性ＰＢＳおよび２ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸溶液はアルツハイマー抗原につき約１０％の溶解度を有する。加えて、水性２ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸溶液はアルツハイマー抗原が脳組織から抽出されるのを妨げる。さらなる測定は、アルツハイマー抗原がアルツハイマー患者の基底核および海馬では同様に上昇されたことを示す。皮質、基底核および海馬は、アルツハイマー病をもつ患者の脳で軸索プラーク、異常軸索および神経繊維状絡み含むことが知られている。尾状核、視床および小脳のごとき、病気によってほとんどまたは余り侵されないことが知られている脳領域でなされたテストはほとんどまたはまったく反応性を示さなかった。かくして、本明細書に記載する手法はアルツハイマー病に密接に関連する抗原（アルツハイマー抗原）および該抗原を同定する抗体（アルツハイマー抗体）の同定を可能とする。実施例２Ａアルツハイマー抗原の単離：別法手法アルツハイマー患者からの試料中のアルツハイマー抗原の濃度は、アルツハイマー抗原の実験および検出を簡略化するために、少なくとも１０³倍、好ましくは少なくとも１０⁵倍増加させることができる。アルツハイマータンパク質の濃縮物は以下の手法を用いて得られる：アルツハイマー脳の一部を、６.８のｐＨを有するＰＢＳおよび１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルよりなる緩衝液の４倍容量中、４℃で３０秒間ホモゲナイズする。これは４ｍｌ当たり脳１グラムに相当する。ホモゲナイズ化は２,０００ｒｐｍで回転させる最小３ストロークのピストンを装備したテフロン−ガラス製のホモゲナイザー中で行う。脳ホモジネートを４℃、２７,２００ｇで２３分間遠心する。遠心後、上清を、SEPHACRYL -S-400(Pharmacia)を含有するクロマトグラフィーカラムに負荷し、ＰＢＳで溶出させる。アルツハイマー抗原はクロマトグラフィーカラムからボイド容量にて出現し、ＥＬＩＳＡを用いてモニターする。引き続いて、ボイド容量をAffi-ブルーカラム(Bio-Rad)にかける。該Affi-ブルーカラムを２０カラム容量のＰＢＳで洗浄する。アルツハイマータンパク質はAffi-ブルーカラムに結合したままである。２Ｍ水性塩化ナトリウムでアルツハイマータンパク質をAffi-ブルーカラムから溶出させる。すなわち、緩衝液中の塩化ナトリウムの濃度を溶出の間に０ .５Ｍから２Ｍに増加させる。アルツハイマー抗原の存在はＥＬＩＳＡを用いてモニターできる。SEPHADEX G -25(Pharmacia)よりなるクロマトグラフィーカラムを用い、緩衝液ＰＢＳで溶出させることによって、該塩化ナトリウムをアルツハイマー抗原から除去する。アルツハイマータンパク質はボイド容量にて大いに溶出する。アルツハイマータンパク質を含有するボイド容量をアルツハイマー抗体免疫アフィニティーカラムに負荷し、該カラムを少なくとも２０カラム容量のＰＢＳで洗浄する。アルツハイマー抗原を水性３ＭＫＳＣＮで溶出させる。溶出はアルツハイマータンパク質の存在につきモニターする。アルツハイマータンパク質を含む溶出した溶液をＰＢＳを使用するSEPHADEX G-25カラムを用いて脱塩する。ＰＢＳの代わりに、０. ００１Ｍリン酸ナトリウムおよび０.０１４Ｍ塩化ナトリウムを含有するｐＨ６. ８の緩衝溶液を用いて、アルツハイマー抗原のより濃厚な溶出を供することができる。１０倍高いアルツハイマー抗原のさらなる濃縮は、真空下で加熱することによって溶出した試料から水を除去することによって達成できる。得られた濃縮物は約１重量パーセントである。濃縮されたアルツハイマーおよび正常皮質の試料を、D.A．JohnsonおよびJ.W ．Yausterによる、Gene Analysis Techniques，１巻，3-8頁(1984)に開示されているウェスタンブロット技術を用いて調べた。アルツハイマー抗原として含有された主要な電気泳動種は約６８０００ダルトンの見掛け分子量を有することが判明した。SEPHAROSE 6B(Pharmacia)カラムからの正常脳ボイド容量画分の反応性は、アルツハイマーボイド容量画分のウェスタンブロットで使用したものの３倍多い量のタンパク質をポリアクリルアミドゲルに負荷することによってウェスタンブロットで検出された。正常脳ボイド容量についての主要バンドは５９,０００ダルトンの分子量および２４５,０００ダルトンにおけるダブレットを有していた。還元すると、アルツハイマー抗原は約６２,０００ないし約６８,０００ダルトンの分子量を有し、アルツハイマー病の徴候を示さない脳からの５９,０００ダルトンの分子量を有する抗原とは明らかに異なる。これらの結果は、０.０１Ｍトリス−緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）においては、アルツハイマー抗原は集合しており、またはより大きい複合体の一部であることを示す。約６８,０００ダルトンの分子量を持つサブユニットを有するいくつかのタンパク質はアルツハイマー抗原とは区別される。これらのタンパク質は２つのファミリーで存在し：細胞骨格ファミリーには、ニューロフィラメントおよび正常ｔａｕタンパク質があり、コリン作動性ファミリーには、コリンアセチルトランスフェラーゼがある。これらのタンパク質のいずれも正常脳と比較してアルツハイマー脳で上昇した濃度を示さない。もしアルツハイマータンパク質が約５９,０００ダルトンの分子量を有し、正常脳に見いだされているタンパク質に関連するならば、アルツハイマー抗原はニューロフィラメント、正常ｔａｕタンパク質、またはコリンアセチルトランスフェラーゼではないようである。さらなる実験を行って、いくつかの異なる対象：グアムパーキンソン病の２ケース、ピック病の２ケース、アルツハイマー病の６ケース、パーキンソン病と組み合わされたアルツハイマー病の２ケースおよび１０の神経学的に正常な対象の脳組織の試料を比較した。実験は脳組織の試料の免疫反応性および免疫化学についてなされた。まず、粗製脳ホモジネートについてのＥＬＩＳＡを用いて、各試料における免疫反応性の量を見い出した。脳組織の各試料につき、ＰＢＳおよび２ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸を用いて可溶性および不溶性部分に脳を分画し、約２７,０００ｇで約２５分間遠心することによって、粗製脳ホモジネートを調製した。上清を除去し、ペレットをＰＢＳ中にホモゲナイズした。各ペレットに存在するタンパク質の濃度をBio-Radタンパク質アッセイを用いて測定した。各試料につき希釈曲線を作成し、各試料における免疫反応性の量をＥＬＩＳＡを用いて測定して、各試料とアルツハイマー抗体との反応の存在を測定した。粗製脳ホモゲナイズしたについてのこれらの測定の結果は、有意量の免疫反応性がアルツハイマー病ケースでのみ見い出されることを示した。免疫反応性の量の比較は、免疫反応性が他の神経病で測定されたものよりも有意に上昇していることを示す。免疫細胞化学実験については、脳組織試料をテストを行うまでホルマリン中で固定した。グアムパーキンソン病、ピック病、アルツハイマー病、アルツハイマー病／パーキンソン病および正常対象からの脳組織につきアルツハイマー抗体を用いて免疫細胞化学実験を行った。アルツハイマー抗体は、アルツハイマー脳試料におけるニューロン軸索プラークおよび異常軸索を染色した。アルツハイマー抗体の特徴のうちの１つは、染色が劇的であって異常軸索について広範囲であることである。詳細に観察すると、軸索染色は目に見える染色のほとんどを占める。いくつかのニューロンの染色がグアムパーキンソン病脳組織で見い出され、ピック体の染色はピック脳組織で見い出された。グアムパーキンソン脳組織は軸索染色を呈さず、ピック脳組織はほとんど軸索染色を呈さなかった。アルツハイマー−パーキンソン皮質組織は、１つのケースで少量の染色された軸索プラークのみを呈し、２つの他のケースでは染色を呈さなかった以外は、アルツハイマー脳組織と病理学的に同様である。１つのケースからの海馬組織は錐体層ニューロン染色を示したが、ほとんど軸索染色はなかった。少数の軸索プラークが存在した場合でさえ、正常脳組織では染色は観察されない。免疫細胞化学染色の全量はＥＬＩＳＡによって観察された免疫反応性の全量によく相関する。免疫反応性のレベルの主要な差異は、アルツハイマー脳組織についての軸索（異常軸索）染色のためであった。実施例３正常およびアルツハイマー脳組織の抗体染色本発明のアルツハイマー病特異的抗体は、アルツハイマー病患者の脳脊髄流体に存在し、正常患者ならびにハンチントン舞踏病、散漫ローリイ体病、クロイツフェルト−ヤーコブ病、進行性核上性麻痺および多梗塞病を持つ患者では存在しないアルツハイマー抗原と反応する。ホルマリン固定脳組織についてのアルツハイマーＡＬＺ−５０抗体の免疫細胞化学は、該抗体がアルツハイマー脳における異常軸索成分につき高度に選択的であったことを示した。アルツハイマー抗原は細胞体および異常軸索に存在することが判明した。加えて、軸索プラークはアルツハイマー抗体によって強く染色された。染色はプラークに存在する軸索網に制限された。強く染色されたニューロンおよび軸索プラークはアルツハイマー海馬および皮質の全体で見い出された。対照的に、正常脳の染色は実質的になかった。この特異性のパターンはアルツハイマー患者からの４０の脳および正常対象からの１６の脳で観察された。実施例４ニューロンおよび神経繊維状絡みの抗体染色ニューロンの抗体染色と神経繊維状絡みの存在との間の関係は二重染色技術を用いて測定した。ホルマリン固定アルツハイマー組織からのvibratome切片はアルツハイマー抗体と反応し、マウス免疫グロブリンに対するペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗体の使用によって免疫反応性を可視化した。ペルオキシダーゼ反応は４−クロロナフトールの使用によって目に見えるようにした。４−クロロナフトールはペルオキシダーゼ基質であって、反応して生成物を生じ、これは水性溶液中で沈殿するが、有機溶媒に溶ける。組織切片を写真に撮り、４−クロロナフトールを脱水およびキシレン処理によって除去した。しかる後、プラークおよび絡みをチオフラビンＳ（これらの病巣の証明のための公知の感受性組織学的試薬）で染色し、該切片を再度写真に撮った。写真および染色パターンの検討により、多くのニューロンがアルツハイマー抗体およびチオフラビンＳの両者によって染色されることが示された。いくつかのニューロンはアルツハイマー抗体によって暗く染色され、神経繊維状絡みを含有しないようである。小さい割合のニューロンは絡みを含有し、チオフラビン陽性であるが、アルツハイマー病抗原に対しては陽性ではない。この方法によってアルツハイマー抗体によるプラークの染色も調べた。アルツハイマー抗体はチオフラビンよりもプラークを明らかとした。アルツハイマー抗体に陽性のプラークはジストロフィー軸索を含有し、よって、軸索プラークであった。実施例５アルツハイマー抗原および対螺旋フィラメントの抗体染色アルツハイマー抗原と不溶性の対となった螺旋フィラメント（ＰＨＦ）との間の区別は生化学実験によって測定した。アルツハイマー抗原は０.０１Ｍトリス −緩衝化生理食塩水（以下、ＴＢＳ）にかなり溶解し、ＴＢＳまたはドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＴＢＳ−ＳＤＳ）いずれにも溶解しない不溶性対螺旋フィラメントとは対照的に、５重量％のＴＢＳ−ＳＤＳを含有するＴＢＳに完全に溶解する。溶解性はアルツハイマー皮質ホネジネートをＴＢＳまたはＴＢＳ−ＳＤＳ中で２分間撹拌することによってテストした。次いで、脳ホネジネートを１０ ,０００ｇで１０分間遠心した。遠心からの上清およびペレットを分離し、ペレットを第１の例におけるごとくホネジネートし、遠心することによって２回洗浄した。上清およびペレットを水中にホモゲナイズし、種々の量の各試料をＥＬＩＳＡのためにポリビニルプレート上に乾燥した。量は５０マイクロリットル当たり１０、３および１マイクログラムであった。アルツハイマー抗原の存在はＥＬＩＳＡを用いて測定した。不溶性対螺旋フィラメントの反応性は、対螺旋フィラメントに対する公知の抗体を使用してモニターした。アルツハイマー抗体はＴＢＳ上清において反応性を示し、該反応性はＴＢＳ− ＳＤＳ上清中に定量的に回収され、他方、対螺旋フィラメント反応性はＴＢＳ− ＳＤＳ抽出後にペレットに止まった。従って、アルツハイマー抗体免疫反応性は可溶性であって、不溶性対螺旋フィラメント免疫反応性から分離されると結論できる。さらなるテストを行って、アルツハイマー抗原と不溶性対螺旋フィラメントとの間の相違を確立した。酵素実験によりアルツハイマー抗原と対螺旋フィラメントとの間の区別を確認した。アルツハイマー脳ホモジネートの一部をトリプシンで０、２０および６０分間処理し、一部をＥＬＩＳＡのためにポリビニルプレート上に乾燥するに先立って同様にアルカリ性ホスファターゼで処理した。ＥＬＩＳＡを用いて、処理に対するアルツハイマー抗原エピトープの感度を測定した。アルツハイマー抗原エピトープは不溶性対螺旋フィラメントとは対照的にトリプシンに対して大いに感受性である。これは、アルツハイマータンパク質が不溶性対螺旋フィラメントと区別されることを示す。最近、アルツハイマー抗原は、電子顕微鏡で観察した場合、可溶性対螺旋フィラメントからなることが示されている(VincentおよびDavies，Proc．Natl．Acad ．Sci., 89:2878-2882， 1992)。また、少なくとも部分的には、アルツハイマー抗原からなるが、不溶性ＰＨＦは前記した溶解条件下では容易に溶解しないであろう。アルツハイマー抗原はこれらの溶媒条件下で溶解するであろう。アルツハイマー抗原エピトープはホスファターゼ感受性ではないが、これはアルツハイマー抗原がリン酸化されないことを確立しない。神経繊維状絡みを同定するニューロフィラメントエピトープに対する多くの抗体は、ホスファターゼ処理後には反応しないことが知られている。加えて、これは、アルツハイマー抗原エピトープのリン酸化は、アルツハイマー抗原と正常脳抗原との間を区別するアルツハイマー抗体の能力を説明しないことを示唆する。実施例６モノクローナルおよびポリクローナル抗体を利用する脳組織抽出物アッセイ材料：ＡＬＺ−５０、ウサギ抗−ＡＬＺ−５０、カゼイン、Quantum，QwikWashシステム、反応プレート、反応チューブ、ＯＰＤ試薬、ゲンタマイシン硫酸、Nipase pt、硫酸試薬、１／４インチビーズおよびＴＤｘミクロ遠心機はAbbott Laborat oriesから入手し；ＨＲＰＯヤギ抗ＩｇＭコンジュゲートはFisher Scientificから入手し：マッチング乳棒および乳棒駆動機付きのミクロ遠心機チューブはKont esから入手し:プロテインＡはBioRadから入手し：ＢＳＡ、Tween 2およびＥＧＴＡはSigmaから入手した。組織調製：切断の間に裂けるのを防ぐために強固なコンシステンシーを有するまで、凍結脳検体を室温で解凍した。約５０ないし１５０ｍｇの皮質組織をミクロ遠心機チューブに入れた。前頭および側頭脳皮質組織は一致してより高いアルツハイマー抗原レベルを有していた。次いで、冷ホモゲナイゼーション緩衝液（０.１ｍＭトリス、ＥＧＴを含有する１５０ｍＭＮａＣｌ、ゲンタマイシン硫酸および防腐剤としてのNipasept）を組織１ｍｇ当たり４ｍＬで添加した。手動または機械的モーターで駆動するマッチング乳棒を用い、組織をミクロ遠心機チューブ中で約１分間ホモゲナイズした。ＴＤｘ遠心機または同等物中で１分間遠心することによって粒状物質をホモジネートから除去した。組織は調製を通じて４℃で加工した（−７０℃がホモジネートの長期保存に推奨される）。より特別には、以下の試薬を、アルツハイマー抗原を富化したアルツハイマー病脳ホモジネートの調製で用いた。［１０×］ホモジネート緩衝液ストック１００ｍＭトリス１．５ＭＮａＣｌ１０ｍＭＥＧＴＡｐＨ６．８ＴＢＳ−トリス緩衝化生理食塩水０.０１Ｍトリス０.９％ＮａＣｌｐＨ７.５１００ｍＭＰＭＳＦ／エタノール（プロテアーゼ阻害剤）脳ホモジネート混合物の全容量の１％加工すべき脳領域を同定し、単離した。組織を−８０℃で貯蔵し、−２０℃に一晩置いた。準備ができれば、組織を、切開を助けるためのバイオハザードフード中、室温にてわずかに解凍する。しかしながら、組織は全ての時点で氷上に維持した。次いで、切開した組織試料を正確に秤量し、氷に囲まれたポリエチレン容器に入れた。４容量（ｍｌ／ｇ）の冷ホモジネート緩衝液［１×］を組織試料に添加した。ＰＭＳＦを１：１００希釈で全容量に添加した（１ｍＭ最終濃度）。使用に先立ち、Polytronホモゲナイザーを、蒸留水、続いて、エタノールおよび最後の水すすぎの数回の別々の洗浄によって掃除した。装置ダイアル上５− ６に設定し、等間隔で１５−２０秒間の送風にて、Polytronを用いて組織および緩衝液をホモゲナイズした（より大きな試料の適当なホモゲナイゼーションはより長い送風またはより高いダイアル設定を要するであろう）。試料容器を氷で囲み、ホモゲナイゼーション加工の間はできるだけ冷たく保った。組織の完全なホモゲナイゼーションの後、１ｍｌの試料を採り、アッセイ用に保存した。残りを４℃で２０ないし２５分間、２０Ｋ×ｇで遠心した。得られた低速上清を分離し、容量を測定した。次いで、それを高速遠心管に移した。１ｍｌの低速上清を採り、アッセイのための保存した（低速ペレットはかなりの抗体反応性を含有し、冷ＴＢＳで元の容量まで再懸濁し、前記したごとく遠心することによって再抽出できる）。高速遠心管を４℃で１時間、１００Ｋ×ｇにて容量を記録しつつ回転させた。次いで、高速上清を吸引し、１ｍｌを採り、アッセイのために保存した。高速ペレットを注意深く選択した濃度にて、ＴＢＳに再懸濁した。典型的には、（３０×）ストック溶液をアルツハイマー脳皮質組織抽出物で使用した。小容量のこの濃縮されたペレットを採取し、−８０℃で貯蔵した。脳調製からの各工程の試料を抗体反応性およびタンパク質濃度のためにアッセイした。ビーズコーティング：ウサギの血清出血からのプロテインＡ精製ＩｇＧを用いてビーズを被覆した。室温にて２時間、トリス緩衝化生理食塩水（ｐＨ８.０）中でウサギ抗−ＡＬＺＩｇＧと共にインキュベートすることによって標準１／４インチポリスチレンビーズを被覆し、リン酸緩衝化生理食塩水中で４％ＢＳＡでブロックした。次いで、ビーズを洗浄し、ゼラチン／スクロースでオーバーコートし、乾燥し、室温に保存した。本発明のアッセイはアルツハイマー抗原を検出し、測定する。アルツハイマー抗原はビーズ上のポリクローナルＩｇＧによって効果的に捕捉される。検出抗体として使用したＡＬＺ−５０に続き、特異的に固定化抗原に結合させ、結合したＡＬＺ−５０を続いて、酵素コンジュゲーテッド抗−マウスＩｇＭ（例えば、ホースラディッシュペノオキシダーゼ連結ヤギ抗ＩｇＧおよび適当な基質）を用いることによって定量した。実験１図２はアッセイの配置を示す。死後試料（粒状物質を含まない組織脳ホモジネート）を試料緩衝液(ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、ｐＨ７.５、ゲンタマイシンおよび Nipasept含有)で希釈した（通常は５０ｍＬの試料ホモジネートおよび１５０ｍＬの試料緩衝液）。各試料を二連で行った。公知の陰性対照および試薬ブランク（試料の代わりのホモゲナイゼーション緩衝液）を各プレートに含ませた。１つのビーズを各ウェルに添加した後、該プレートを覆い、水浴中に浮かべることによって３７℃で３０分間インキュベートした。QwikWashシステムを用い、ビーズを蒸留水で２回洗浄し、次いで、３７℃で３０分間、約０.３５ｍｇ／ｍｌのＩｇＭ（０.１％カゼイン、０.５％Tween 20、ゲンタマイシンおよびNipaseptを含有するＰＢＳｐＨ７.５中）を含有するＡＬＺ−５０溶液２００ｍＬと共にインキュベートした。ビーズを再度洗浄し（２回）、１％ヤギ血清を含有するＡＬＺ−５０希釈緩衝液中に希釈したＨＲＰＯコンジュゲーテッドヤギ抗ミウスＩｇＭの２００ｍＬと共にインキュベートし、３７℃にて３０分間再度インキュベートした。ビーズを２回洗浄し、パッキングについての仕様に従って、反応テストチューブに移した。ビーズを含有する各チューブに、３００μＬのＯＰＤ溶液（仕様当たり調製）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。１ｍＬの１Ｎ硫酸を各チューブに添加することによって反応を停止させ、溶液を撹拌することによって混合した。各チューブの吸光度を、モードＯに設定し、蒸留水でブランクをとったQuantum分光光度計を用いて測定した。試料中のアルツハイマー抗原を検出するのにこのアッセイ手法を用いた。しかしながら、もしアルツハイマー抗原の測定が数種の試料間の活性の比較で望まれるのであれば、０.５またはそれ以上のバックグラウンド補正吸光度を生じる試料を系列希釈し、０.５下で最高の吸光度を供する希釈を使用することができ、適当な補正が希釈でなされるのを保証する。さらに、このアッセイは湿潤試料重量に対して吸光度値を正規化するが、単位タンパク質当たりのデータはアルツハイマー抗原測定で表すことができる。アッセイの最適化に関しては、室温が製造にルーチン的に使用されるので、ビーズ当たりの抗−ＡＬＺウサギＩｇＧ量、時間およびｐＨのみを最適化する。図３から分かるように、バックグラウンドは２ｍｇ／ビーズを越えるレベルで急速に増加する。しかしながら、４ｍｇ／ビーズでは、バックグラウンドは許容され、信号は最大に近づく。１％ヤギ血清をコンジュゲート溶液に添加すると、バックグラウンドをかなり低下させた。２時間を過ぎまでさらなる増加は観察されず、最適ｐＨは８.０であることが判明した。ブロッキング工程は、ＰＢＳ中の４％ＢＳＡ中での抗体被覆ビーズの３０分間のインキュベーションを含むものであった。検出抗体およびコンジュゲート濃度は標準的なチェッカーボード型の滴定によって最適化された。インキュベーションの温度および持続は、最短の可能な時間で許容される信号の再現性が得られるように選択した。特異性および直線性に関しては、図４は正常脳ホモジネートには有意な活性がないが、ＡＬＺ−ＥＩＡ活性がアルツハイマー病痴呆症（「ＡＤ」）脳ホモジネート力価であったことを示す。曲線の直線範囲は０.０５ないし０.５０である。以下の表３はアッセイの精度をまとめる。正常およびバックグラウンドについての信号は実質的に同一であることに注意すべきである。ＡＤ１はＡＤ脳ホモジネートのプールである。ＡＤ２はＡＤ脳検体からのホモジネートである。同様に正常１は非−ＡＤ脳ホモジネートのプールであって、正常２は１つの非−ＡＤ脳からのホモジネートである。バックグラウンドはホモゲナイゼーション緩衝液を脳ホモジネートの代わりに使用したアッセイ実行を表す。平均は吸光度単位で表される。データは２日間にわたって蓄積した。プレート当たりの実行の５連の合計およびプレートＣＶ内の平均を報告する。実験２アルツハイマー抗原の濃度は１１１ヒト脳からの側頭および前頭皮質の死後脳組織試料で測定した。試料を採取した各患者を臨床的に評価し（例えば、診断、年齢、性別および死後遅れ）、使用した全ての検体を生物化学的分析に先立って病理学的に評価した。それらは２７の正常対照（ＮＣ）、２８の神経学的対照（ＮＤＣ）、および５３のアルツハイマー病（ＡＤ）（そのうち７つはアルツハイマータイプの老人性痴呆症（ＳＤＡＴ）と示され、３つはアルツハイマー神経病理を持つ老齢のダウン症候群Ｄ／ＡＤと示された）であった。神経学的病気対照カテゴリーはパーキンソン病（ｎ＝１６）、多梗塞痴呆症（ｎ＝５）、ハンチントン舞踏病（ｎ＝２）、筋萎縮性側索硬化症（ｎ＝２）、ヴェルニッケ脳障害（ｎ＝１）、およびコルサコフ症候群（ｎ＝２）を含むものであった。ＡＤ群は以下のカテゴリー：ＡＤ、ＳＤＡＴおよびＤ／ＡＤ（ＡＤ神経障害を持つダウン）を含むものであり、非−ＡＤ群は以下のカテゴリー：ＮＣ（正常対照）およびＮＤＣを含むものであった。２０ないし２００ｍｇの湿潤重量の範囲である組織試料を４容量のホモゲナイゼーション緩衝液（ｐＨ＝６.８の０.０５ＭトリスＨＣｌ、１ｍＭＥＧＴＡおよび１５０ｍＭＮａＣｌ）と混合し、次いで、標準の１.５ｍｌ円錐形の蓋をしたチューブの内側でKontesモーター作動乳棒で穏やかにホモゲナイズした。ホモジネートを９５００×ｇで５分間遠心した。二連の上清５０ｍＬアリコット（１０ｍｇの湿潤組織に相当）をアッセイで用いた。各場合において、アルツハイマー抗原結果はタンパク質ｍｇ当たりの吸光度として、あるいは１０ｍｇ湿潤組織当たりの吸光度として表す。試料についての全ての吸光度の読みは、脳ホモジネートの代わりにホモゲナイゼーション緩衝液を使用した場合のアッセイの吸光度読みを差し引くことによって正味の吸光度に補正した。いずれの陰性の正味吸光度もゼロとして報告する。使用したQuantum分校光度計の上限は２.０吸光度であった。この上限を越える吸光度は２.０として報告した。系列希釈は、１６までに等しい吸光度が時々得られたことを示した。データはスチューデントのｔ−検定およびスペアマンのランク修正係数を用いて分析した。１１１ケースについての臨床データ、患者の情報、病理学的報告、およびアルツハイマー抗原アッセイ結果を後記表４にまとめる。一般に、ＡＤケースはＮＣケースよりも老齢であるが（７５.８歳−対−６０.７歳）、ＮＤＣケースはＡＤ群と匹敵した（６９.８歳−対−７５.８歳）。６５歳またはそれよりも老齢であるケースのみを考慮すると、平均年齢はＮＣ、ＮＤＣおよびＡＤカテゴリーについての各々７４.４、７６.７および７８.８歳と匹敵するようになる。Ｄ／ＡＤケースは５０歳よりも老齢であった（平均５３歳）。死後時間は１時間と短いのから９６時間と長い間で変化した；いくつかのケースは利用できるこの情報を有しなかった。病理学的報告は、ＡＤ群（ＡＤ、ＳＤＡＴおよびＤ／ＡＤカテゴリー）における検体が中程度ないし重症の範囲の、しかしほとんどは重症のプラークを含有したことを示した。非−ＡＤ群におけるプラークの重症度に関しては、ＮＣケースは最も少ないケースにおいて最も少ないプラークを有し、他方、ＮＤＣ検体はＮＣおよびＡＤの間の報告された密度を有した。一般に、プラークは性質において軸索性または散漫として分類されなかった。ＡＤ群における全てのケースは臨床的に痴呆症であり、他方、ＮＣカテゴリーにおけるケースはいずれも痴呆症を有するとは観察されなかった。ＮＤＣケースの大部分は痴呆症と分類された。アルツハイマー病群は有意なアルツハイマー抗原（タンパク質当たりまたは１０ｍｇの組織重量当たりで表す）を有しておらず、正常および他の神経学的病気群とは対照的である。正常脳群および他の神経学的病気の群は検出可能なアルツハイマー抗原を実質的に有していなかった。ＡＤカテゴリーにおけるアルツハイマー抗原濃度は１.３９のメジアンおよび０.０３ないし２.０吸光度／１０ｍｇ組織の範囲であった。Ｄ／ＡＤカテゴリーはＡＤに似ていたが、ＳＤＡＴカテゴリーは広い範囲のアルツハイマー抗原濃度を示した（０ないし０.６４）。ＮＣおよびＮＤＣカテゴリーにおけるアルツハイマー抗原レベルは有意には異ならなかった（スチューデントのｔ−検定、ｐ＞０.７９７）。対照的に、ＡＤ群（ｎ＝５６）におけるアルツハイマー抗原レベルは、スチューデントのｔ−検定を用いると非−ＡＤ群（ｎ＝５５）よりも高かった（ｐ＜０.０００５）。種々のカテゴリーにおけるアルツハイマー抗原濃度を６５歳以上ケースを用いて再計算すると、最大値は現実には低下した。ＡＤ群は総じて０.７７のメジアンを有し、１０ｍｇ組織当たり０.０ないし２.０吸光度の範囲であった。図５は、２つの異なる尺度での、ＡＤ／ＳＤＡＴ−対−正常および他の神経学の合わせた群についてのアルツハイマー抗原濃度の撒布図プロットを表す。正常脳の群および他の神経学的病苦の群は、アルツハイマー抗原濃度における相違の欠落（ダンネット検定、ｐ０.０５）のため、図５では一緒に表してある。０.１の吸光度値を正常範囲およびＡＤ範囲の間の経験的に誘導されたカッフオフとして用いた。全ての非−ＡＤケースについてのアルツハイマー抗原濃度はこのライン内にある一方、ＡＤ群における５６ケースのうちの４８ケースについてのアルツハイマー抗原濃度はこのラインを越える。ＡＤカテゴリーにおける３つのケースのみがＮＣおよびＮＤＣケースと重複した。合計２８ケースのうち１６ケースで痴呆症が観察されたにも拘わらず、ＮＤＣカテゴリーでアルツハイマー抗原レベルの増加がなかったのは注目に値する。また、Ｄ／ＡＤカテゴリーはＡＤに匹敵するアルツハイマー抗原レベルを有していた一方、ＳＤＡＴケースは正常範囲およびＡＤ範囲双方においてアルツハイマー抗原濃度を有していた。また、データは、フォーワード選択技術（診断、性別および病理学的知見につく束縛変数を使用）にての段階的多重回帰分析によって、およびＡＤ／ＳＤＡＴおよび他の神経学的病気群のアルツハイマー抗原レベルを正常群のレベルと比較する場合にはダンネット検定によって分析した。回帰分析は診断、年齢、性別、死後遅れおよび病理学的報告についての変数を考慮し、アルツハイマー抗原濃度の偏差を説明した（各アルツハイマー抗原濃度単位カテゴリーについての別の統計学的解析）。２つの独立した変数は吸光度／ｍｇタンパク質としておよび吸光度／１０ｍｇ湿潤組織として表したアルツハイマー抗原濃度であった。前者の変動の１５％および後者の３９％が診断カテゴリー単独によって説明された（ｐ＝０.０００１）。変動はさらに、各々、７および５％の程度まで神経繊維状絡みおよびプラークを考慮することによって説明された（ｐ０.０１）。最後に、年齢は、各変動に対して各々４および３％寄与するが、逆相関する（ｐ０.０５）ことが判明した。かくして、全修正係数（Ｒ２）は、各々、２６および４６％であることが判明した。アルツハイマー病は痴呆症、軸索プラークおよび老化に関連するが、痴呆症単独はアルツハイマー抗原濃度の増加に関連しなかった。というのは、アルツハイマー抗原についての正常範囲において２４の痴呆症ケース（１６ＮＤＣ、３ＡＤ、５ＳＤＡＴ）があったからである（表４および図５Ａおよび５Ｂ）。さらに、プラークはアルツハイマー抗原の存在に常には関連しなかった。というのは、それらのうちいくつかはアルツハイマー抗原を含有するジストロフィー軸索を欠く恐らくは散漫プラークだったからである。実際的には検出可能なアルツハイマー抗原レベルを有しなかったプラークに関する２９ケース（５ＮＣ、１６ＮＤＣ、３ＡＤ、５ＳＤＡＴ）があった（表４および図５Ａおよび５Ｂ参照）。年齢の関数としてのアルツハイマー抗原の濃度を調べるために、アルツハイマー抗原濃度に関するデータを６５歳以上ケースにつき再度計算した。この解析に基づくと、６５歳以上ケースにおけるアルツハイマー抗原の最大値は現実にはＮＣおよびＮＤＣカテゴリーにおけるよりも低く、ＡＤカテゴリーにおけるメジアンは６５歳以上ケースでは１.３９から０.８５に低下した（表４参照）。さらに、図５Ａおよび５Ｂにおいて、６５歳以上ケースについてのアルツハイマー抗原濃度は塗りつぶした丸で表し、６５歳未満ケースでは塗りつぶさない丸で表す。図には年齢に関連するパターンは出現していない。ＮＣおよびＮＤＣカテゴリー双方におけるアルツハイマー抗原免疫反応性の最大値は６５歳未満ケースに対応する（塗りつぶさない丸、図５Ａおよび５Ｂ）。スペアマン相関検定は、アルツハイマー抗原濃度が年齢と負の相関をする１５％（有意ではない）の確率を示した。最老齢のＮＤＣケースは多梗塞痴呆症を持つ９０歳の女性であり、中程度のプラークを示すが、アルツハイマー抗原濃度は０.０１吸光度単位／１０ｍｇ組織であり、他方、最も若いＡＤケースは４６歳であり、２.０を越えるアルツハイマー抗原濃度を有していた。データより、特許請求するイムノアッセイはＡＤ／ＳＤＡＴを正常および他の神経学的病気から区別することが明らかである。さらに、このデータに基づくと、臨床的痴呆症、プラークおよび年齢はそれ自体ＡＤ群における増加したアルツハイマー抗原濃度レベルに関係しないようである。かくして、このアッセイを用い、領域的変動ならびに病気の持続に対するアルツハイマー抗原濃度の関係を調べた。実施例７モノクローナル抗体を利用する脳組織抽出物アッセイ以下の診断アッセイは第１および第２抗体としてのモノクローナル抗体を使用する。第１抗体は捕捉抗体といい、第２抗体は検出抗体という。捕獲抗体および検出抗体の種々の組合せを利用した。図７Ａ−７Ｍに示すごとく、アルツハイマー病脳抽出物および正常脳抽出物は共に種々の抗体組合せで利用した。脳抽出物はここに記載するごとくに得た。図７Ａ−７Ｍについては、Ｙ軸は光学密度を表し、脳組織抽出物におけるアルツハイマー病抗原のレベルを示す。Ｘ軸はナノグラムで表したアッセイで用いた脳タンパク質の量を示す。行った全てのアッセイにおいて、正常脳では有意なレベルのアルツハイマー抗原は検出されなかった。しかしながら、アルツハイマー病脳につき行ったいずれのアッセイにおいても、アルツハイマー抗原が検出された。従って、本発明のモノクローナル抗体を種々の組合せで用いて、アルツハイマー抗原の存在を検出し、それによりアルツハイマー病を診断する感度が良く特異的なアッセイが得られる。実施例８脳脊髄流体におけるアルツハイマー抗原についての診断アッセイプロトコルＡ脳脊髄流体（ＣＳＦ）におけるアルツハイマー抗原の検出は修飾したフェスタンブロットプロトコルを用いて行った。等容量の飽和硫酸アンモニウム（ＳＡＳ）を添加し、４℃で３０分間インキュベートすることによってアルツハイマー病抗原を３.５ｍｌのＣＳＦから沈殿させた。次いで、溶液を５０００ｇで遠心し、ペレットを０.０１Ｍ硫酸ナトリウム４０ｍｌに溶解させ、ＰＢＳｐＨ７.４に一晩透析した。試料を５％ＳＤＳ−５％メルカプトエタノールに溶解させ、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分画し、ニトロセルロースに移した。ニトロセルロースをＰＢＳｐＨ７.４＋５％脱脂乾燥乳および１％ヒト血清中で１時間インキュベートした。アルツハイマー抗体との一晩のインキュベーション、続いての１％ヒト血清を含有するブロッキング溶液に希釈したペルオキシダーゼがカップリングしたヤギ抗マウス抗体との３時間のインキュベーションを行った。ペルオキシダーゼの存在は、０.１ＭトリスｐＨ４.５中、４−クロロ−１− ナフトール（０.２ｍｇ／ｍｌ）＋０.４４ｍＭ過酸化水素と反応させることによって可視化した。アルツハイマー抗原はＣＳＦ中で容易に検出された。調べた９つのＣＳＦ試料は推定アルツハイマー患者からの腰椎穿刺によって得られ、１つのＣＳＦ試料は、アルツハイマー病のその診断が神経病理学分析によって後に確認された故人となった患者からの大槽穿剌によって得られた。生存する患者からの９つの試料のうち８つおよび故人となった患者からの１つの試料は、特徴的な６８,０００ダルトンダブレットを示すウェスタンブロットパターンを生じた。また、６つの非痴呆症患者からの腰椎穿刺によってＣＳＦを得た。これらの試料は６８,０００ダルトンダブレットを示さなかった。加えて、アルツハイマー病の最初の臨床診断で死亡した１人の患者からのＣＳＦ試料を調べた。ＣＳＦのウェスタンブロット分析は６８,０００ダルトンダブレットを明らかにしなかった。神経病理学による引き続いての分析は軸索プラークまたは神経繊維状絡み病理を示さず、これは、該患者がアルツハイマー病で死亡したのではないことを示す。調べた全ての試料（推定アルツハイマー病および非痴呆症）は、痴呆症の存在と相関しなかった２０,０００−５０,０００ダルシン分子量範囲に種々の量のタンパク質を示した。よって、これらのより小さいタンパク質の染色は診断の価値がない。この試料は、アルツハイマー抗原の高度の蓄積および高度のアルツハイマー抗体免疫反応性がアルツハイマー病に特有であることを示す。ＥＬＩＳＡによる定量は、高アフィニティー結合に有利な条件下で、正常患者の脳におけるよりもアルツハイマー病患者の脳において５６倍以上のアルツハイマー抗体免疫反応性があること、およびピック病またはＧＰＤを持つケースからの脳におけるよりもアルツハイマーケースからの脳において３３倍以上のアルツハイマー抗体免疫反応性があることを示す。免疫細胞化学は、この増加した反応性は、ほとんどは、アルツハイマー病によつて侵された脳に存在する異常軸索の豊富な反応性の結果であることを示唆する。他の病気はほとんど異常軸索反応性を有しない。アルツハイマー病における軸索反応性の選択的増加はアルツハイマー抗体によるプラーク染色の特異性を説明する。アルツハイマー病においてのみ、アルツハイマー抗体免疫反応性は患部細胞体から軸索および軸索プラークに拡大する。他の神経学的病気または年齢が一致した対照と比較すると、異なる値が得られ、これは、アルツハイマー病脳試料におけるアルツハイマー抗原免疫反応性間の差異を示す。表１は７−８倍の差異を示し、他方、本実施例では、アルツハイマー病と対照の間の差異は平均して５６倍である一方で、ピック病およびＧＰＤと比較したアルツハイマー病の間の差異は３３倍高い。これらの矛盾には２つの理由がある。まず、異なるアッセイ配置の結果、使用した特異的アルツハイマー抗体および捕獲のメカニズムな応じて、より多いアルツハイマー抗原の捕獲となり得る（例えば、ドライ−ダウン直接アッセイ−対−真のデュアル抗体捕獲−検出プロトコル）。第２に、対照におけるアルツハイマー抗原の量はしばしばゼロである。低バックグラウンドが得られる良好な抗体またはアッセイ配置はアルツハイマー病と対照脳抽出物との間のより大きい差異をもたらすであろう。プロトコルＢアルツハイマー抗原は４℃において等容量の飽和水性硫酸アンモニウムとのインキュベーションによって脳脊髄流体３.５ｍｌから沈殿する。試料を４℃にて約２０,０００ｇの遠心管中、約２０分間回転させる。上清を除去し、ペレットをｐＨ６.８の水性０.０１Ｍリン酸ナトリウムの５０マイクロリットル中に砕く。ウェスタンブロット分析を用いて、アルツハイマー抗原を検出する。試料を１０パーセントＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動させる。アルツハイマー抗原を１２５ｍＡにて３時間でニトロセルロースに移し、緩衝液はｐＨ８.３の１９.２ｍＭグリシン、２.５ｍＭトリズマ塩基および２０パーセントのメタノールを含有する。ｐＨ７.４にて、５％ｖ／ｗ乾燥乳を含む０.０１ＮＴＢＳのブロッキング溶液で連続的処理を１時間行い、次いで、アルツハイマー抗体およびブロッキング溶液で１時間行う。しかる後、５分間の洗浄を行う。ホスファターゼまたはペリオキシダーゼがカップリングしたヤギ抗−マウス抗体およびブロッキング溶液＋１％ヒト血清を１時間用い、続いてさらに５分間洗浄する。商業的に入手可能なＢＣＩＰ／ＮＢＴ (Kirkegaard & Perry)または４−クロロナフトールの使用によって発色を達成する。発色は一晩行う。３人のアルツハイマー患者の脳脊髄流体についてのテストは各テストにつき陽性であった。神経学的に正常な個人からの脳脊髄流体について行ったテストはアルツハイマー抗原の存在を示さなかった。プロトコルＣモノクローナル抗体を利用する脳脊髄流体アッセイ免疫アフィニティークロマトグラフィーによってアルツハイマー病抗原を脳脊髄流体から濃縮した。ＡＬＺ−５０細胞の培養をスクリーニングしてＩｇＧ１分泌変異体を単離した。クラス−スイッチ変異体はＩｇＭ分泌細胞の培養で自然に生起した。該変異体をＰ４２と命名し、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよび免疫細胞化学を用い、ＡＬＺ−５０結合特性を保持することが示された。Ｐ４２ＩｇＧ１をブロテインＡカラム上のクロマトグラフィーによって精製し、製造業者のプロトコルに従ってAffi-ゲル１０(Biorad Laboratories)に付着させた。カラムはＰ４２ Affi-ゲル10上に調製した。アルツハイマー病のケースおよび非痴呆症個体からの脳脊髄流体をカラムに通して泳動させ、次いで、該カラムをトリス−緩衝化生理食塩水で洗浄した。結合した抗原を３Ｍチオシアン酸カリウムの溶液で溶出させた。アルツハイマー病のケースからの脳脊髄流体を用いた場合、少量のタンパク質（使用した流体１ｍｌ当たり１マイクログラム未満）が溶出物中で検出された。非痴呆症個体からの脳脊髄流体にてのカラムからは検出可能なタンパク質は溶出されなかった。モノクローナル抗体ＡＬＺ−５０、ＴＧ３を用いるウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイならびに非痴呆症個体からの脳脊髄流体を用いるカラムからの画分についての分析はいずれの免疫反応性タンパク質も明らかにしなかった。従って、脳脊髄流体は、本発明のアッセイで使用されるに先立って濃縮することができる。しかしながら、本発明のアッセイでそれを利用するに先立って脳脊髄流体を濃縮する必要はない。正常およびアルツハイマー個体双方からの脳脊髄流体を、ここに記載したごとくに、固体支持体上のアルツハイマー抗原の存在につきアッセイして、アルツハイマー病を診断した。モノクローナル抗体ＴＧ５を第１抗体として使用して、脳脊髄流体中のアルツハイマー抗原を捕獲した。モノクローナル抗体ＭＣ１５を使用して捕獲された抗原を検出した（図８Ａ）。脳脊髄流体は本アッセイで濃縮されなかった。図８Ｂは正常（Ｎ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）個体双方からの脳脊髄流体を利用するさらなるデータを示す。第１抗体、すなわち、脳脊髄流体中で見い出されたアルツハイマー抗原を捕獲するのに使用される抗体はモノクローナルＴＧ５またはＭＣ１であった。第２抗体、すなわち、捕獲された抗原を検出するのに使用される抗体はモノクローナルＴＧ４またはＭＣ１５であった。試料はオートプシーの時点で個体から得たものであり、これは各個体条件の正確な性質の診断を可能とした。試料番号３、４、１５および２２はアルツハイマー病を有した個体からのものであり、試料番号６、１２、１７および２０は正常個体から得たものであった。図８Ａに示すごとく、アルツハイマー病を有した個体からのものである試料のみが有意レベルの存在するアルツハイマー病抗原を有した。これは図８Ｂにも示される。また、固定化ＡＬＺ−５０を用いて、脳脊髄流体におけるアルツハイマー抗原の存在を検出し、これによりアルツハイマー病を診断することができる。また、この方法を用いて、ヒト脳の抽出物におけるアルツハイマー抗原を検出することができる（トリス方法における脳のホモゲナイゼーション）。図９に示すごとく、該アッセイはいくつかの固体相（すなわち、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ紙）から構成できる。図９のアッセイにおいては、第１抗体は、該紙に非共有結合した抗−ＦｃＩｇＧ特異的抗体である。次に、該紙上の非被覆部位を種々のブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン）でブロックする。次いで、捕獲抗体を添加し、試料を該紙に結合させる。次に、検出抗体を添加する。抗−μ鎖特異的ビオチン化抗体を添加し、アビジンＨＲＰコンジュゲートを添加する。使用する基質はＥＣＬ、ＡＢＴＳおよびＴＭＢを含めたいくつかのうちのいずれであってもよい。次いで、アルツハイマー抗原の存在を測定し、該抗原の存在はアルツハイマー病の陽性診断と相関する。本発明の好ましい具体例において、捕獲モノクローナル抗体はＩｇＧイソタイプのものであり、ＰＨＦ−１、ＴＧ５およびＭＣ１よりなる群から選択される。検出モノクローナル抗体はＩｇＭイソタイプのものであり、ＴＧ３、ＴＧ４およびＭＣ１５よりなる群から選択される。図１０はＣＳＦアッセイを示し、これは、アルツハイマー病抗原の存在を示し、ここに、該アッセイで使用した捕獲抗体はＰＨＦ−１であって、使用した検出抗体はＴＧ３である。プロトコルＤモノクローナルおよびポリクローナル抗体を利用する脳脊髄流体アッセイアルツハイマー抗原は、本発明のアッセイでポリクローナルおよびモノクローナル両抗体を利用して脳脊髄流体中で検出できる。ポリクローナル抗体を使用してアルツハイマー抗原を捕獲し、モノクローナル抗体ＰＨＦ−１を用いて結合した抗体を検出した。脳脊髄流体の濃縮は本アッセイでは使用しなかった。脳脊髄流体試料は記憶障害の診断および治療専門の診療所を訪れた個体から得た。ほぼ１４０試料をテストし、個体を臨床診断の許容された標準に従って群に分けた。個体は以下の群に分けた。ＡＤ−１：これらの個体はアルツハイマー病の診断ための最良に入手できる臨床基準に適合し、一般に、恐らくのＡＤと記載される。かかる診断が当業者によつてなされると、これらの患者の約９０％はアルツハイマー病を有するとオートプシーで見い出されるであろう。ＡＤ−２：これらの個体はアルツハイマー病の診断についての一般的に許容される基準の全てではないがほとんどに適合する。臨床的典型的でない特徴のため、それらは、可能的ＡＤと記載され、これらの個体の７５％ないし８５％はアルツハイマー病に罹っているとオートプシーで見い出されるであろう。ＰＣ：これらの個体は鬱病、躁病−鬱病病気または精神分裂病のごとき１つ以上の精神医学的障害に罹っていると診断された。ＮＣ：これらの個体は健康診断の時点で痴呆症ではないと診断され、正常対照と考えられる。この群における２つの個体は幾分増加したレベルの免疫反応性を有していた。両患者は認識機能がいくらか損なわれた老齢の婦人であった；しかしながら、この損傷は痴呆症の診断を保証するのに不十分あった。ＮＤＣ：この群の個体はアルツハイマー病以外の神経学的障害を有すると診断された。この群にはパーキンソン病、ハンチントン舞踏病または多梗塞痴呆症を持つ個体が含まれる。ＭＩＸ：この群の個体における臨床的診断は、１つ以上の神経学的疾患の存在を示唆し、アルツハイマー病、多梗塞痴呆症および／またはパーキンソン病の組合せを有する患者が大部分であった。図１１に示すごとく、恐らくのまたは可能的アルツハイマー病を持つ個体のほとんど大部分はアルツハイマー抗原との高レベルの抗体免疫反応性を有していた。対照的に、正常対照および他の病気を持つ個体は増大したレベルのアルツハイマー抗原免疫反応性を示さなかった。よって、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を本発明の脳脊髄流体アッセイで用いて、アルツハイマー抗原の存在を検出し、それによりアルツハイマー病の陽性的診断をすることができる。本明細書で引用した全ての書類、例えば、出版物および特許は引用してその全体を本明細書の一部とみなす。前記の本発明の記載、特徴および利点は本発明の理解を助けるために記載したのであって、以下の請求の範囲によって定義される本発明を限定する意図のものではなく、また、限定すると解釈されるべきでない。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Antigens and antibodies for Alzheimer's disease And diagnostic assays This application is a US application Ser. No. 06 / 913,494 filed Sep. 30, 1986, now abandoned. Of a pending US application 07 / 100,980 filed on September 25, 1987 US application 07 / 485,1 filed February 26, 1990, now abandoned US application 08/116 filed September 3, 1993, now abandoned, with 49 continuing applications US Patent Application Serial No. 08 / 269,640, filed July 1, 1994, Of the pending U.S. application 08 / 362,783, filed on December 23, 1994. It is a continuation application, and all of these applications are incorporated herein by reference. Technical field The present invention relates to an antigen relating to Alzheimer's disease, an antibody specific to the antigen, and The present invention relates to a method for diagnosing Alzheimer's disease using the antigen and the antibody. Background art Alzheimer's disease is a progressive neurodegeneration affecting 7% of the population over the age of 65 Disease, clinically characterized by progressive loss of intellectual function, from the cerebral cortex Nerve of Pathologically characterized by continuous loss of units. More specifically, this pathology Functional defects usually involve many amyloid, including neuritic plaques in the neocortex, and And loss of presynaptic markers of cholinergic neurons. Neuritis Plaque consists of degenerated axons and nerve endings and possible astrocyte elements. These plaques often show a central core. Another pathological feature of Alzheimer's disease is the neurofibrillary tangle. It is progress. Neurofibrillary tangles have an unusual property of twisting and forming tangles Intraneuronal mass consisting of paired helical filaments rinal mass). Neurofibrillary tangles are composed of several different proteins . Neurochemical research has shown that neurotransmitter systems are affected by Alzheimer's disease. Is shown. The most consistently strongly affected system is Meynert's nucleus Basalis of Meynert). In addition, Luzheimer's disease includes somatostatin, substance P and corticotropin Reduces release factor. Pathological structure, neurochemical changes, neuritic plaque or neurofibrillary tangles Is specific for Alzheimer's disease. These deficiencies are associated with normal age individuals' brains. In Guam Parkinson's disease, dementia (Dementia Pugilistica) and And other diseases such as progressive supranuclear palsy Related to. For example, a pair of helical filaments, ie, entangled and neuritic pullers The twisting filament that fills the loop is a specific entanglement associated with other diseases such as Pick's disease Also occurs in In fact, immunological studies have identified epitopes on helical filaments But effects in the pick body, i.e. in the temporal cortex of the brain affected by Pick's disease It shows that it is present in the sphere structure found in the isolated nerve fibers. In addition, Neurofibrillary tangles and neuritic plaque density in the cerebral cortex of patients with Ruzheimer's disease Is not necessarily related to the stage of the disease. Therefore, to date, the diagnosis of Alzheimer's disease has been extremely difficult. The disease The pre-mortem diagnosis of has been largely based on exclusion. Medical Research Review (Medicinal Research Reviews), volume 3, no. 3, pages 221-236 (1983) Of Alzheimer's disease and senile dementia A paper entitled Chemistry discusses Alzheimer's disease, and page 223 states: "The problem with diagnosing Alzheimer's disease is the lack of aggressive testing, Has seizures, microvascular disease, brain tumors, thyroid disorders, drug response, severe depression and elderly Other causes of dementia, such as a host of other symptoms that can cause intellectual disability in the elderly It must be excluded. All of these problems have been eliminated as the cause of the symptoms. A diagnosis of Alzheimer's disease should only be accepted if left. " It is described. Postmortem diagnosis of Alzheimer's disease will help visualize neuritic plaques and entanglements. Based on determination of the number of neuritic plaques and entanglements in bluntly stained brain tissue I was However, such a diagnostic method based on neurohistopathological studies, Requires extensive staining and microscopy of some brain parts. In addition, normal Plaques and entanglements also occur in individuals, elderly individuals or individuals with other diseases. More definitive and reliable for making a diagnosis on brain tissue A law is desired. As disclosed in U.S. Pat.No. 4,666,829 to Glenner et al. Attempts have been made to confirm the presence of an antigen specific for Ruzheimer's disease. I However, the antigens described by Glenner et al. Exists in young adults (Gambari et al., Journal of the American Medical Association (Journal of the American Medical Association) n), 263, 2907-2910 (1990)). Therefore, Alzhai There is still a need for a method of diagnosing Myr's disease. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for diagnosing Alzheimer's disease. You. Another object of the present invention is to diagnose Alzheimer's disease using cerebrospinal fluid It is to provide a method. A further object of the present invention is to diagnose Alzheimer's disease. To provide antigens related to Alzheimer's disease that can be used in is there. Another object of the invention is to use it in the diagnosis of Alzheimer's disease. To provide antibodies that can be used. Disclosure of the invention The invention resides in an individual having Alzheimer's disease, Specific for antigens associated with Alzheimer's disease that are substantially absent in non-human individuals Antibody. The present invention relates to specific, susceptible for the diagnosis of Alzheimer's disease. Provide a simple and highly sensitive sandwich immunoassay. The method of the present invention Overcoming the shortcomings of the prior art that require a diagnosis based on the process of disease elimination. That is, the present invention exists in individuals with Alzheimer's disease and Alzheimer's disease antigen substantially absent in individuals without Marr's disease You. The antigen of the present invention is composed of several proteins, some of which have a molecular weight of about 68,000. Dalton. In addition, the present invention provides a method for the partial purification of antigens, It relates to the manufactured standard. The antigen of the present invention has about 6 in reduced or non-reduced state. It has an isoelectric point and binds to an affinity blue column (affi-blue column). Of thorium, 0.14 M sodium chloride and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride pH 6.8 solution At least 50% soluble in 50% saturated ammonium sulfate at 4 ° C. Settles. Alzheimer's antigen is found in cerebrospinal fluid from patients with Alzheimer's It can be detected by blot analysis, but not from cerebrospinal fluid from non-demented patients. Not detected. In the method described herein, 3.5 ml of cerebrospinal fluid is utilized, This volume could be easily reduced. About 0.1 to 10 ml of body fluid by the method of the present invention The product can be used. The present invention further provides an Alzheimer's disease such that a first antibody-antigen complex is formed. 68,000 dalton antigen and associated tan found in individuals with Merr disease A first antibody specific for a first antigenic determinant of a protein complex comprising Contacting the sample; separating the first complex from the sample; A first antigen determination so that the antibody binds to the first complex to form a second complex; Specific for a second antigenic determinant on said Alzheimer antigen which may be the same Contacting at least one second antibody with the first complex; Presence of a second complex indicating the presence of an Alzheimer's disease specific antigen in the pull Detecting Alzheimer's disease specific in the sample A method for determining the presence of an antigen. The present invention further provides for the pre-mortem or post-mortem brain tissue or cerebrospinal fluid from an individual. Use as a sample Diagnosis of Alzheimer's Disease Using Alzheimer's Antigen and Antibody It relates to using said method. The sample from the patient is brain tissue or cerebrospinal fluid In addition to other tissues, blood, urine and serum. The present invention further provides an Alzheimer's disease such that a first antibody-antigen complex is formed. A protein complex containing 68,000 daltons of antigen is found in individuals with Contacting a sample with a first antibody specific for a first antigenic determinant of the combination; Separating the desired complex from the sample; the second antibody binds to the first complex A protein comprising the 68,000 antigen, which may be the same as the first antigenic determinant, Contacting the complex with a second detectable antibody specific for a second antigenic determinant of the complex Detecting the second antibody bound to the complex and measuring the amount. Detects and measures the amount of antigen specific to Alzheimer's disease in a sample About the method. The above-mentioned attempt was made to detect helical filament immunoreactivity in cerebrospinal fluid by ELISA. Was performed to design a diagnostic test for Alzheimer's disease based on the detection of these Studies are limited due to overlap between Alzheimer's and non-demented control samples I found it worthwhile. Western blot analysis for detection of Alzheimer's antigen Using a protocol removes much of this difficulty. Data shown here Indicates that cerebrospinal fluid detection of Alzheimer antigen is To distinguish it from the sample It shows that you get. The quantitative data shown is for Alzheimer's disease in cerebrospinal fluid. Detection of Alzheimer's antigen is the selective and selective Alzheimer's disease, Pick's disease, multiple cerebral infarction dementia or It also shows that it can be distinguished from other dementias such as Lyntonton's disease. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES The foregoing summary, as well as further objects and features of the invention, will be set forth in the accompanying drawings. Taken together, see the following detailed description of the preferred illustrative embodiments of the invention. To be understood in more detail. FIG. 1 shows a two-dimensional gel of the Alzheimer's antigen of the present invention. FIG. 2 shows the sandwich immunoassay of the present invention for the diagnosis of Alzheimer's disease. A form is shown. FIG. 3 shows the relationship between absorbance and μg IgG / bead. FIG. 4 shows titrations against Alzheimer's disease brain homogenate and normal brain homogenate. The curve is shown. FIG. 5A shows the Alzheimer antigen or the concentration of each diagnostic category on all scales. It is a scattergram plot graph: NC = normal control: NDC = neuropathy control: AD = Alzheimer's disease: SDAT = Alzheimer's senile dementia: D / AD = AD god Down syndrome with transtissue: non-AD group includes NC and NDC, AD group AD, SDAT And D / AD. Closed circles are the values for those aged 65 and over, open circles are under 65 Is the value for Circles on the 2.0 line are 2.0 or more (up to 16). FIG. 5B is a 10-fold enlarged view of the Y axis in FIG. 5A. FIG. 6 shows the immunization of various monoclonal antibodies of the invention against Alzheimer's antigen. Show epidemic reactivity. Figures 7A-7M show the Alzheimer's antigen utilizing various monoclonal antibodies. Shows a brain assay for one monoclonal antibody used for antigen capture The second monoclonal antibody is used for detection purposes. FIG. 8A shows Alzheimer's disease in both Alzheimer's disease and normal individuals. -Shows cerebrospinal fluid assay for determination of presence of antigen, capture monoclonal antibody Is TG5 and the detection antibody is MC15. FIG. 8B shows the results for both Alzheimer's disease (AD) and normal (N) individuals. Shows a cerebrospinal fluid assay for the determination of the presence of Alzheimer's antigen The clonal antibody is TG5 or MC1, and the detection antibody is TG4 or MC15. You. FIG. 9 shows the assay of the present invention for the detection of Alzheimer's antigen, with capture anti- The body is on a solid phase. FIG. 10 shows a cerebrospinal fluid assay for the detection of Alzheimer's antigen and capture The antibody is PHF-1 and the detection antibody is TG3. FIG. 11 shows cerebrospinal fluid assay and monoclonal Of Alzheimer's antigen in various individuals using both polyclonal and polyclonal antibodies Indicates the level. Detailed description of the invention An “individual with Alzheimer's disease” is an affected individual who has clinical signs of the disease. Or an individual or patient exhibiting the same. Used herein to describe pathological lesions associated with Alzheimer's disease Various terms are defined below. Certain infectious diseases in Alzheimer's disease The large fibrous lesion found in Aron is called "neural fibrous entanglement" (NFT) . These structures represent a tightly packed helical filament containing Alzheimer's antigen. Consist of large arrays of proteins (PHFs), but many other protein species also Exists in the structure. The NFT form of PHF binds the soluble Alzheimer's antigen of the invention. Very soluble in the solvent conditions used for isolation. Soluble Alzhai Mer antigens are mostly derived from abnormal axons (sometimes called "neural reticulum"). these Abnormal axons consist of the predominant pathology in Alzheimer's disease. In fact, the average Alz As much as 90% of Alzheimer's antigens in the cortex of the Hymer case Or exist in neuronal processes (abnormal axons) rather than entanglements (Wolozin, Ann. Neu. rol.,twenty two: 521-526,1987). Another abnormal lesion found in the Alzheimer brain Amyloid plaque, sometimes called "senile plaque." Geriatric Lark is actually two distinct types of structures, which are the amyloid It consists of degenerative neuron elements (dystrophic axons) surrounding the central core. Classic plaque described by Ruzheimer, without degenerated axons "Diffuse" or "primitive" consisting of amyloid deposits Plaque (Tagliavini et al., Neurosci., Lett.93: 191-196, 1988; Dickso n et al., Am. J. Path.132: 86-101,1988). Plaques containing degenerative axons are today known as "God It is referred to as "trans-inflammatory plaque." Degenerative axons in these structures are Alzheimer antigens And stained with the antibody of the present invention. Primitive or diffuse plaque is Alzhai Contains no mer antigens and they are not immunostained with the antibodies of the invention. Distraction Lark is found in the brains of most very old people (over 80) And is rarely associated with dementia when present without evidence of degenerative axons (Davies et al., Neurology38: 1688-1693, 1988; Delkaere et al., Neurosci. Lett ,116: 87-93, 1990; Dickson et al., Neurobiol., Aging13: 179-189, 1991). Described here found in brain and cerebrospinal fluid (CSF) in Alzheimer's patients The antigen to be administered to the patient if the antigen has the properties described herein. Irrespective of where it was found, the term "Alzheimer antigen" is used herein. That. One such Alzheimer Antigens are proteins, and therefore their properties are a significant factor in the discussion. If it is a child, the Alzheimer antigen is also referred to here as the "Alzheimer protein". Say. Antibodies that are immunologically reactive with Alzheimer's "Mer antibody". The present invention is directed to Alzheimer's patients, ie, elevations specific to Alzheimer's antibodies. Antibodies that can be substantially immunoreactive with the antigen present in a defined amount. Also, The present invention is the use of an Alzheimer's antibody for diagnosing Alzheimer's disease. . According to one embodiment of the present invention, the Alheimer's antigen has an apparent weight of about 68,000 daltons. Is a protein complex with a major species with high molecular weight, Non-Alzheimer's disease found in the elderly, including patients with other neurological diseases It is present in very small amounts in patients. The present invention provides for the determination of elevated levels of an Alzheimer's disease-specific antigen in a sample. A method for diagnosing Alzheimer's disease. The person The method comprises the steps of obtaining a sample from an individual suspected of having Alzheimer's disease. Specific for an antigenic determinant on a mer antigen and binds to the antigen to form a first complex Contacting with a first antibody that can be formed. Next, the obtained first complex is Separating and recovering from the sample, at least one specific for a second antigenic determinant on the antigen Of the second antibody. The second antigenic determinant is a multiple epitope of the whole antigen For quality, it may be the same as the first antigenic determinant. The second antibody binds to the antigen If so, a second complex consisting of the antigens bound to the first and second antibodies is formed. As such, it can bind to an antigen present in the first complex. Existence of the second complex The presence of the Alheimer-specific antigen in the sample and The level is measured and quantified if desired. The sample used in the assay of the present invention is preferably brain tissue, pre-mortem or post-mortem ( pre or post-mortem) selected from the group consisting of cerebrospinal fluid, urine and blood. In a preferred embodiment, both the first and second antibodies are monoclonal antibodies . The preferred monoclonal antibody of the present invention is hybridoma No. HB9205 ALZ-50 secreted by the Budapest Treaty, September 17, 1986 Deposited with American Type Culture Collection, Rockville, MD . Survival was confirmed on September 24, 1986. ALZ-50 is a standard in this field for detecting the presence of Alzheimer's disease. (Eg, Wood et al., Histochemical Journal, Vol. 21, No. 11, 659-662 (1989); Itagaki et al., Annals of Neurology, 26, 5, 685-689 (198 9): Beach et al., Brain Research, 501, No. 1, pp. 171-175 (1989); Love et al., Journa l of Neuropathology and Experimental Neurology, 47, 4, 393-405 (198 8); Nukina et al., Neuroscience Letters, 87, 3 240-246 (1898); and Hyman et al., Brain Research, 450, 392-397 (1988). )). Some antigens of the present invention (Alzheimer antigen) related to Alzheimer's disease (See FIG. 1), and the major protein species is reducing SDS Has an apparent molecular weight of about 68,000 daltons on Since it was first listed , Alzheimer's antigens are also A68, tau, hyperphosphorylated tau (Lee et al., S cience251: 675-678, 1991), abnormal phosphorylated tau (Grundke-Iqbal et al., Proc. Nat. l. Acad. Sci.83: 4913-4917,1986), soluble PHF (Greenberg and Davies, Proc. Natl. Acad. Sci.,87: 5827-5831, 1990), PHFtau (Greenberg et al., J. Biol. Chem.,267; 564-569,1992), and Alzheimer's disease-related proteins (ADAP) (Ghanbari et al., JAMA,263 2907-2910, 1990). For all The terms are considered equivalent when referring to the Alzheimer antigen herein. It Contains tau and phosphorylated tau. Using this antigen, a monoclonal antibody Body, which can be used in diagnostic assays for Alzheimer's disease. Can be used. In the diagnostic assay of the present invention, the first antibody is used, for example, such as polystyrene beads. Sometimes a suitable solid matrix can be attached. Obtain a sample and add an appropriate amount of Contact with one antibody to form a first complex. The contact is preferably performed with a first antibody Of polystyrene beads coated with Adding the sample to the system. The complex obtained by contacting the sample with the first antibody is separated by an elution method known to those skilled in the art. To separate from the sample. The separated first complex is specific for an antigenic determinant on the antigen, and In contact with at least one second antibody capable of binding the antigen. The second antibody is directed Antigenic determinants are responsible for the large number of epitopes (ie, repetitive epitopes) For the first antibody may be the same as the one directed. Conditions for making such contact Are described herein and are known to those skilled in the art. The first and second antibodies of the present invention can be prepared by attaching an identifiable label thereto. Can be detected. In a preferred embodiment, the second antibody is made detectable. You. The antibody is preferably conjugated to a suitable substrate that catalyzes a detectable reaction. The attached enzyme can be detected by attaching it to the antibody. The enzyme is a hose Radish peroxidase, beta-galactosidase or alkaline phos It can be fatase. Other means of antibody detection include fluorescent or radioactive labels. Including attaching to it. Alternatively, the antibody may be Antibodies can be detected by the use of antibodies, other antibodies are labeled or enzymes Having. Detectable bound to antigen of complex comprising antigen bound to first and second antibodies The presence of such antibodies can be easily detected using well-known techniques. Thus, if Detectable When an active antibody is linked to an enzyme conjugated to a suitable substrate, The optical density of the combined antibody is measured using a quantitative spectrophotometer. Detectable antibody is fluorescent If labeled, the fluorescence emission can be measured or detected using a fluorimeter. same Similarly, if the detectable antibody is radiolabeled, the bound antibody can be detected using radioactive detection techniques. Can be detected. Also, chemiluminescence technology can be used. About test sample The results obtained using the method described above may be obtained using the method on a control sample. The presence of antigens specific for Alzheimer's disease by comparing the results it can. An elevated amount of an antigen specific for Alzheimer's disease is thereby detected, It can be quantified if desired. In the method for detecting and measuring an Alzheimer's disease antigen, the first and second antibodies are It may be a monoclonal antibody. Alternatively, the first or second detectable antibody is It can be a polyclonal antibody. Methods for qualitatively or quantitatively measuring Alzheimer's disease antigen It can be used in the diagnosis of Myr's disease. The use of the method of the present invention is better than prior art methods. It is advantageous. Because the present invention provides a convenient method for detecting Alzheimer's disease antigen This is because the method has good sensitivity and is very specific. Alzheimer's antigen Because they exist in an aggregated form and are therefore multi-epitope, they It fits well in essays. It is soluble and usually has one effect on the antibody. Exchange with pitope In contrast to the differentially reactive protein. In addition, the assay uses 0.5 absorbance units ( r = 0.9) linear, reproducible (CV less than 10%), sensitive, And specific. The assay is simple, with pre-formulated reagents and standard supplies. Be quick. 120 data points are easily generated in about 4 hours or more Can be The methods described herein for use with cerebrospinal fluid are applicable to blood and urine. below What is Alzha in the blood or other body fluids of patients with Alzheimer's disease Another test method that may be suitable for detecting the presence of You. The technique is described in S. `` Immunoassay for the Detection and Quantitation of Infectious Human Retrovirus, Lymphadenopathy-Associated Virus (LAV) "Journal of Immunological Methods, Vol. 76, pp. 171-183 (1985). This is similar to the technique used for the detection of HTLV-III shown. In one preferred embodiment of the invention, the Alzheimer's antibody is of the IgM class. However, even if an IgG class Alzheimer antibody is obtained, And the term Alzheimer's antibody are specifically included. Journal of Immunological M ethods, 74, pp. 307-315 (1984), `` The Identification of Monoclonal Class Switch Varients by Sub Selection and an ELISA Assay Using the method described by A et al., an Alzheimer antibody of the IgM class was IgG using₁class Of Alzheimer's antibody was obtained. IgG₁Tests performed using the class of Alzheimer's antibodies were IgM Shows a substantial reduction in non-specific binding compared to Ras Alzheimer antibodies Was. Generally, IgM antibodies show more non-specific binding than IgG antibodies. Three a Two hybrids were obtained using homogenates of Ruzheimer's brain and three normal brains. From IgG₁Class of Alzheimer antibodies as IgM Alzheimer antibodies Compared. IgG₁One of the Alzheimer antibodies is from IgM Alzheimer antibody Also showed significantly lower binding to normal brain tissue. Other IgG₁Alzheimer's antibody No significant reactivity with normal tissues was shown. Another advantage of the present invention is that parts of the brain stained by Alzheimer's antibodies Use of Alzheimer's antibodies to carry labels such as radioactive It is for. Thereafter, a “map” of the brain is created from the label using a known method, Provide further information about Generally, Alzheimer's antibodies are labeled appropriately. And thereby allow the Alzheimer's antibody to act as a carrier in a conventional manner. Used. The bound Alheimer's antibody and label are transferred to the brain using standard techniques. Enter. The Alzheimer antibody attaches a label to the site of the Alzheimer antigen. Thereafter, a map of the brain was prepared using a standard method, whereby the Alzheimer's antigen Shows the presence and distribution of The present invention is further described by the following examples. The invention is limited in scope or spirit to the particular compounds or techniques described in the examples. Not something. Example 1 Preparation of antibodies 1. ALZ-50 The production of monoclonal antibodies is well known in the art and is described by Christian Stahli `` High Frequencies of Antigen-Specific hybridomas; Dependent on Immunization Perimeters and Prediction by Spleen Cell Analysis '' Journal of Immunological Methods, 32, 297-304 (1980) and S.M. Fazekas de St. G `` Production of Monoclonal Antibodies by roth and Dofores Scheidegger ; Strategy and Techniques ”Journal of Immunization Methods, 35, 1-21 (1983). In addition, methods and clinical processes This is a company like Microbiological Associates engaged in the supply of related products Easily available from. The technique used was a collection during autopsy of four patients with Alzheimer's disease. Includes production of monoclonal antibodies to homogenates of harvested ventral forebrain tissue . Antibodies obtained from normal patients by both immunochemical and immunohistochemical techniques Tissue based on their ability to distinguish from brain tissue from Alzheimer's patients Screening. In the prior art, a known technique called enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is used. Conjugated monoclonal antibody to Alzheimer's brain homogenate Assay first according to their ability to Alzhai compared to normal tissue Antibodies exhibiting more than 50% increase or decrease in binding of mer brain to homogenate Experiment further with the body. One special antibody (here ALZ-50 antibody, ALZ-5 0) is an American Type Culture Collage under ATCC accession number HB9205. Deposited with eciton, Rockville, Maryland. This monoclonal antibody is described below. It binds to the region on Tau shown in Table A. ALZ-50 is a specific Does not cross-react with proteins found in normal tissues under the following assay conditions. 2. Other antibodies Using the ALZ-50 antibody described in Part 1 of this Example, Other antibodies were obtained specifically for the immersion antigen. This is immuno-affinity chromatog Made by Raffy. A large amount of antigen was prepared using ALZ-50 antibody. Prepared from brain tissue from a case of Immer's disease. Immunize mice with this substance Then, spleens from these mice were used to synthesize monoclonals reactive with Alzheimer's antigen. A new cell line producing lonal antibodies was obtained. To purify the Alzheimer's disease antigen, a culture of the ALZ-50 cell line is screened. Leaning and IgG₁Secreted mutants were isolated. These class-switch mutations The body is Ig Occurs naturally in cultures of M screening cells. One variant was named P42 Using ELISA, Western blotting and immunocytochemistry , ALZ-50 binding properties. On protein A column P42 IgG by chromatography₁Purify the manufacturer's protocol Affi-Gel 10 (Biorad Laboratories). Column is P42 Prepared as Affi-Gel 10. Brain extract from Alzheimer's disease case Was prepared by single centrifugation of the brain homogenate at 27,000 g. Supernatant Fractions were loaded on a P42 column and the column was washed after loading. 3M thione binding antigen Elute with a solution of potassium cyanate and elute with Tris-buffered saline Dialyzed. The mice were then injected with 10-20 micrograms per mouse per injection. Immunization was performed by intraperitoneal injection of the purified antigen protein on a P42 column. standard Prior to removing the spleen for production of hybridoma cells The mice were immunized 4 or 5 times. By ELISA and immunocytochemistry Hybridomas were tested for the production of specific antibodies. ELISA, waste cloth Tan blotting and immunocytochemistry from Alzheimer's disease cases Hybridomas secreting monoclonal antibodies with selective reactivity with brain tissue Obtained. The resulting monoclonal antibodies are: TG3, TG4, TG5, MC1, MC2, MC3, MC5, MC6, MC15, MC16 and PHF-1. Figure 6 , Some of these monoclonal antibodies, six different purified Alzheimers 4 shows reactivity with an antigen preparation. Some of these antibodies (eg, antibody MC1) Is very similar to the specificity for ALZ-50. Other antibodies have higher affinity React with a tee to detect a fragment of the Alzheimer's antigen (for example, antibody MC6, MC15, TG4 and TG5). The specificity of the antibody of the present invention for Alzheimer's antigen is as follows. Ah Under certain conditions, ALZ-50 reacts with normal and recombinant tau; In the same assay configuration under similar conditions Is more reactive. In fact, other modifications such as the ELISA arrangement described in the present invention. Under decorated conditions, ALZ-50 only reacts with Alzheimer's antigen. Similarly, the TG-3 epitope was generated on recombinant tau by appropriate phosphorylation. The reactivity to Alzheimer's antigen is related to phospho recombinant tau. Is also quite large. In fact, many of the antibodies of the present invention It has an epitope on the tau molecule from which it is derived. Epitoe some are discontinuous (ALZ-50, MCI), while others are continuous or discontinuous And phosphorylation-dependent (TG-3, TG-4). Perhaps they are Alz Reacts fairly well with the Hymer antigen. Because the abnormal protein complex Tau protein is a preferred conformation for antibody recognition and binding Because they are "locked" to For these reasons, "normal brain proteins" The low reactivity of the antibody with is not a problem and does not interfere with the inventive assay. Because For example, differences in antibody reactivity can be attributed to the formation of highly reactive Alzheimer antigens. This is because it is present in Alzheimer's disease. Epitope mapping method The nature of the binding of Alzheimer's antibody to Alzheimer's antigen It was measured by ringing. It is known that tau is a major component of Alzheimer's antigen. Most of the Alzheimer's antibodies are recombinant tau or phospho recombinant. will bind to tau. Suspected affinity for recombinant protein Less than antibody affinity for Alzheimer antigen but useful Information is still available regarding the site of interaction of the antibody. htau40, deletion analysis of full length 441-residue form of human ventral cerebral nervous system tau Throughout, the Alzheimer antigen epitope was identified. First, all tau molecules A library of 42 internal deletions was obtained by restriction and recombination of htau40 cDNA. Created through. Mutant bacteria The cells were placed in an expression vector and transformed into E. coli. Obtaining tau deletion The resulting library is processed like other bacterial expression libraries (Helfm an et. Focus6: 1-05,1984). "did. Individual clones of the expression library for identification of phosphoepitope Membrane-bound lysates of bacterial colonies containing Incubated with a crude mixture of protein kinase (Carmel and Kuret, An. al. Biochem.203: 274-280, 1992). Each monoclonal antibody suddenly deleted each tau Essential or contributes to antibody binding by assessing its ability to react with the variant The region of the tau molecule was identified. Deletion to remove the first (N-terminal) 18 amino acids of tau resulted in ALZ-5 Reactivity with both 0 and MC1 was completely lost. Site-specific protrusion of tau sequence A more detailed analysis using mutations was performed for amino acids 7, 8 and 9 (GLU-PHE- GLU) was absolutely required for binding of both antibodies. Absolute for antibody binding One site on tau that is primarily required is initially within 18 amino acids, and residues 7, It seems to be in the center of 8 and 9. A second series of deletions of the tau sequence also reacted with tau with ALZ-50 and MC1 Complete loss of gender. Loss of sequence from amino acids 312-342 results The deletion completely eliminates the reactivity of tau with both antibodies. Thus, The binding of ALZ-50 and MC1 to tau in the PHF indicates that tau is the first Folds together the sequence from 18 amino acids and amino acids 312-342 I need to do that. These sequences are adjacent to each other in tau prepared from normal brain Therefore, there is no reactivity between these antibodies and this protein. Suggested sequence The arrangement is shown below. MAEPRQEFEVMEDHAGTY aa 1-18 VDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKDRVQSKI aa 312-342 Another new antibody was tested using this series of tau deletions. TG5 anti Responsiveness was lost from constructs that lost tau sequences 220-235. Other deletions Shown that TG5 reacts with the following linear amino acid sequence without losing reactivity. . TREPKKVAVVRTPPKS aa 220-235 Using a similar strategy, on tau formed by phosphorylation and present in PHFs Were mapped. In this series of experiments, tau deletions and A collection of site-specific mutants was phosphorylated on eight purified protein kinases. P The phosphorylation products were analyzed by AGE and TG3, TG4, MS2, MC3, M C5, MC6 And binding to MC15. For all antibodies except MC2 and MC3 Reactivity was obtained. Similar in deletion and site-specific mutants of the same series Experiments have allowed the definition of sequences required for antibody reactivity. Phosphorylation of proteins with deletion of the tau sequence from amino acids 220-235 Is the result of obtaining reactivity with TG3, TG4, MC5, MC6 and MC15 Did not become. This is the same as that recognized in the non-phosphorylated form by TG5. An array. Using a phosphorylation construct that mutates serine 235 to alanine Some further analysis indicates that no reactivity with TG4, MC5, MC6 and MC15 occurred. However, TG3 reactivity occurred. Other evidence indicates that MC5 and TG3 reactivity Suggests that it could not occur as opposed to mutating leonin 231 You. This data is summarized in Table A. Hybridomas that secrete the monoclonal antibody TG3 are under the Budapest Treaty. On October 26, 1994, American Type Culture Collection, Rockvile, Merri ATCC no. Cataloged as HB11744, 1994 Survival was confirmed on November 4, 2008. This monoclonal antibody is shown in Table A above. To the region on the tau. Hybridomas that secrete the monoclonal antibody TG4 are under the Budapest Treaty. On October 26, 1994, American Type Culture Collection, Rockvile, Merri ATCC no. Cataloged as HB11745, 1994 Survival was confirmed on November 4, 2008. This monoclonal antibody is shown in Table A above. To the region on the tau. Hybridomas secreting the monoclonal antibody PHF-1 are subject to the Budapest Treaty Below, October 26, 1994, American Type Culture Collection, Rockvile, ATCC No. in Maryland. Cataloged as HB11743, 19 Survival was confirmed on November 4, 1994. This monoclonal antibody is described in Table A above. Is bound to the region on tau shown in FIG. Hybridomas secreting the monoclonal antibody MC16 are under the Budapest Treaty. , American Type Culture Collection, Rockvile, October 26, 1994 ATCC No. in Leland Cataro as HB11742 And survived on November 4, 1994. A hybridoma that secretes the monoclonal antibody MC6 is known under the Budapest Treaty. On October 26, 1994, American Type Culture Collection, Rockvile, Merri ATCC no. Cataloged as HB11740, 1994 Survival was confirmed on November 4, 2008. The hybridoma secreting the monoclonal antibody MC1 is under the Budapest Treaty. On October 26, 1994, American Type Culture Collection, Rockvile, Merri ATCC no. Cataloged as HB11736, 1994 Survival was confirmed on November 4, 2008. This monoclonal antibody is shown in Table A above. To the region on the tau. Hybridomas secreting the monoclonal antibody TG5 have been established under the Budapest Treaty. On October 26, 1994, American Type Culture Collection, Rockvile, Merri ATCC no. Cataloged as HB11746, 1994 Survival was confirmed on November 4, 2008. Hybridomas that secrete the monoclonal antibody MC2 are under the Budapest Treaty On October 26, 1994, American Type Culture Collection, Rockvile, Merri ATCC no. Cataloged as HB11737, 1994 Survival was confirmed on November 4, 2008. This monoclonal antibody is shown in Table A above. On tau Bind to the region. Hybridomas that secrete the monoclonal antibody MC3 are under the Budapest Treaty On October 26, 1994, American Type Culture Collection, Rockvile, Merri ATCC no. Cataloged as HB11738, 1994 Survival was confirmed on November 4, 2008. A hybridoma that secretes the monoclonal antibody MC5 is known under the Budapest Treaty. On October 26, 1994, American Type Culture Collection, Rockvile, Merri ATCC no. Cataloged as HB11739, 1994 Survival was confirmed on November 4, 2008. Hybridomas secreting the monoclonal antibody MC15 are under the Budapest Treaty. , American Type Culture Collection, Rockvile, October 26, 1994 ATCC No. in Leland Cataloged as HB11741, 199 Survival was confirmed on November 4, 2010. This monoclonal antibody is listed in Table A above. It binds to the region on tau shown. 3.Rabbit anti-ALZ IgG Many different centrifugation steps and detergent extraction can lead to Alzheimer's disease brain Homogenates were enriched for Alzheimer's antigen. Rabbits are highly enriched Immunized with the Alzheimer's antigen fraction and boosted according to the monthly schedule. (Booster) injected. Screening blood draws using ELISA, where Is an immunogenic The product was dried in the wells by forced air at 37 ° C. The desired titer is reached After formation, rabbit serum was subjected to protein-A affinity chromatography. Therefore, it was purified. These are described below using protein-A purified IgG from serum bleeds of these rabbits. The beads used in the assay were coated. Example 2 Isolation and characterization of Alzheimer's disease antigen Known technology known in the prior art as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Assay a monoclonal antibody specific for Alzheimer's disease antigen, Their ability to bind to Alzheimer brain homogenates was measured. Brain homogene The plate was made up to 1 mM phenyl fluoride with a glass pestle in a Dounce honeygenizer. In 10 ml of phosphate buffered saline (PBS) containing methylsulfonyl, It was prepared using 2.5 g of the modified Alzheimer cortex. As used herein “PBS” is 0.01M sodium phosphate and 0.14M salt at pH 6.8. Refers to a solution of sodium chloride. Brain homogenate is about 15,000 r at about 4 ° C. 20 minutes at pm speed with a BECKMAN JA-21 centrifuge (CENTRIFUGE) About 27,200 g were obtained with great care. Remove brain homogenate supernatant and remove Sieve SEPHAROSE 6B (Pharmacia) 350ml Was loaded onto a chromatography column containing Use with chromatographic techniques The carrier used was PBS, which was chromatographed at a rate of 6 ml per hour. -Passed through the column. 3.1 ml fractions were collected. Alzheimer's disease antigen is large from the chromatography column in void volume Elutes. The presence of antigen in the void volume is determined by enzyme-linked immunosorbent It was determined by using the assay method (ELISA). 50 My of each void volume fraction Chloliter was tested. 50 microliters each in water at a ratio of 1: 100 And dilute 50 microliters of this diluted solution into a 96-well for ELISA. It was dried on a rupolyvinyl microtiter plate (NUNC). Each of the antigens Dry samples were blocked with PBS containing 5 percent (v / w) powdered skim dry milk. Combine with 200 microliters per well of the buffer solution and place at room temperature for ELISA. For 1 hour in the wells. Antibodies to be tested for antigen were diluted 1: 5 in blocking solution. Add 50 microliters of the diluted antibody solution to each well and incubate at room temperature for 1 hour. Incubated. Remove the diluted antibody solution and remove the polyvinyl microtiter The rate was adjusted to 0.01 M Tris (Sigma) at pH 7.4 and 0.1 percent TWEEN-20. (National Diagnostic) 5 times with aqueous mixture. Then the diluted sample , Peroxida against mouse immunoglobulin Conjugate with a secondary antibody consisting of goat antibody (Kirkegaard & Perry) And incubated for 1 hour at room temperature. Thereafter, the secondary antibody is removed, and the Microtiter plates with 0.01M Tris and 0.1% TWEE Washed 5 times with an aqueous mixture of N-20. 2,2'-azinodi'-3-ethyl-ben The sample was allowed to stand at room temperature with a solution of a thithiazoline solution (ABTS) For 30 minutes. 50 microliters used per well . Subsequently, the optical density was measured using an ELISA reader using a 405 nm filter. Specified. Color development at the ABTS indicates the presence of the antibody bound to the antigen. Antibody ALZ-50 is specific for Alzheimer's disease antigen under the assay conditions described. It turned out to be anomalous. Table 1 below shows patients who died of Alzheimer's disease Figure 3 shows the results of antigen measurements from temporal cortex pools of both normal and normal individuals. Ten of a Ruzheimer cases and 6 normal cases were used in the analysis. Alzheimer's Market Were typical in clinical and neuropathological features. Brain homogenate is lung Alternatively, it was prepared from a normal individual who died in a hospital for heart disease. These patients die No prior blurring and no history of neurological or psychiatric illness Was. In Table 1, 0.33 micrograms of temporal scalp from Alzheimer's disease patient The homogenate had an optical density of 75, whereas the temporal cortex homogenate from a normal individual It can be seen that the sheet had an optical density of only 10. Therefore, Alzheimer's Disease antigen is 7-8 times larger in temporal cortex of Alzheimer's patients compared to normal patients It is a threshold concentration. Further experiments were performed using the cases listed in Table 2. All cases are marked Diagnosed by standard techniques. Not neurologically impaired prior to death, A case of an individual who does not show abnormal neuropathological changes during Put on. For immunocytochemistry, samples were fixed in honemarin until use. Biochemical fruit The tissues used in the experiments were stored at -80 ° C until use. Cerebrospinal fluid is evaluated for dementia Obtained by lumbar puncture from 9 patients. Neurological observation is CT scan, EE G, including routine blood chemistry and neuropsychological tests. these Individual has primary degenerative dementia due to Alzheimer's disease All had been diagnosed. The samples consisted of five individuals ranging in age from 60 to 76 years. Obtained from women and four men. Samples from non-demented individuals ranged in age from 60 to 9 Obtained from three men and three women ranging in age of three. The immunochemical reagents used Goat antibody coupled to peroxidase (Biorad Labs.),¹²⁵-Iodine Goat anti-mouse antibody (Amersham Corp.) and peroxidase Substrate 2,2'-azino-di (3-ethylbenzthiazoline sulfonate) (AB TS, Biorad Labs.). Quantification of the amount of Alzheimer's disease antigen-antibody immunoreactivity is determined by enzyme-linked immunosorbent. The assay was performed using an ELISA method. Brain tissue was prepared with 10 volumes of PBS pH Homogenization in 6.8 + 2 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride I knew it. The concentration of protein present in the sample is determined by the Biorad protein assay. Was measured. Add 100 mg protein per well, three factors -Serially dilute the amount of tissue and add 100 ng of tan per well per final dilution point. The homogenate was dried on a polyvinyl plate by obtaining the protein. Next Then, the sample was mixed with PBS pH 7.4 + 5% nonfat dry milk (blocking solution). Incubate for 1 hour to reduce non-specific binding, then block at room temperature. 1: 5 dilution in King's solution and 1 hour with Alzheimer's antibody hybridoma medium For a while. The method described above In, a sample of brain homogenate was incubated overnight with Alzheimer's antibody in a cold place. Cubbed. Wash plate 5 times in 0.01 M Tris + 0.02% Tween-20 And remove the plate by adding 1: 500 in blocking solution. Incubate with diluted peroxidase-conjugated goat anti-mouse antibody I was vate. Following the final wash described above, samples were incubated with ABTS for 30 minutes. And visualize the presence of the antibody by reading the optical density at 405 nm. Was. Vibratome section cut from tissue fixed in formalin (40 micron thickness) was used for immunocytochemistry. Phosphate buffer physiology Wash twice in saline (PBS), 0.25% Triton X-100-3% peroxide Incubated in hydrogen for 30 minutes. After washing with PBS, the sections were Treated as described above for the assay. 0.1 M in 0.1 M Tris, pH 7.4. Reaction with 45 mg / ml diaminobenzidine and 0.44 mM hydrogen peroxide To visualize the peroxidase. In Western blot analysis, PBS-2 mM EDTA-insoluble substance was added to 5% S DS-5% dissolved in β-mercaptoethanol, 10% SDS-polyacryl Fractionated on an amide gel. Transfer the protein to nitrocellulose,¹²⁵I-sign Using anti-mouse immunoglobulin as a secondary antibody, the reactivity pattern was Tradography Alzheimer antibody staining was performed as described above, except visualized by . Present in each sample using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) The amount of immunoreactivity was first determined. The results are shown in Table 2 below. The amount of immunoreactivity present in Alzheimer's tissue is determined by cortical plaque pathology (PD ) Or Guam Parkinson's disease (GPD) with normal tissue, Pick's disease, Parkin It was much larger than that found in tissues affected by Son's disease. Correct Normalized, the amount of immunoreactivity in each disease is 100, 3.0, 3.1, 2.4 and 1.8. The immunocytochemistry of Alzheimer's antibodies is described in Table 2, sections A and B. Investigated in cases representing illness. One of the dramatic characteristics of Alzheimer antibody staining is the abnormal axis Extensive staining of the cord. Axon staining shows that most of the visualization stains Met. Neuronal staining was determined by GPD and Harel-Folden-Spatz disease ( HSD), and pick body staining was found in Pick's disease. Alzhai In contrast to extensive axonal staining present in tissues from cases affected by Myr disease In addition, tissues affected by GPD, HSD or Pick's disease exhibited minimal axonal staining. PD cortical tissue is pathologically similar to Alzheimer's tissue, but with one case. A small amount of plaque staining on the plaque and no staining in the other two cases I just did. In PD cases where plaque staining was apparent, Horse tissue shows pyramidal neuron staining, and Thioflavin S staining shows axonal plaque and staining. And the presence of both neurofibrillary tangles. These results indicate that the individual -Both Kinson's disease and Alzheimer's disease And plaques containing Alzheimer's antigen It suggests that it is a plaque. Down's syndrome, who died at the age of 52 and had numerous plaques and entanglements in the cerebral cortex Tissue from the case reacted similarly to the Alzheimer's disease specimen. This is an old age This is consistent with the hypothesis that Down syndrome individuals were affected by Alzheimer's disease. table No staining is found in tissues affected by any of the other diseases listed in 2. won. Even if the tissue had a small number of diffuse amyloid plaques present, No staining was found in normal tissues. Plaque in Alzheimer's brain The composition is that they contain dystrophic axons with the Alzheimer's antigen of the invention Are distinguished from those in normal-aged brain in that they are neuritic in nature. The number of entanglements observed in Alzheimer's disease tissue is the lower temporal scalp in cases of Pick's disease Less than the number of picks present in the quality and in the GPD or HSD tissue 3 times larger than The amount of immunoreactivity present depends on the affected ロン or in the pick body. Therefore, the immune response Differences in gender levels are associated with the abundance of abnormal axons present in Alzheimer's tissue. It is for color. Thus, the total amount of immunocytochemical staining was determined by ELISA. Correlated with the total amount of immunoreactivity observed. Low levels of immunoreactivity in other tissues such as those from Pick's disease and GPD Corresponds to the presence of low levels of Alzheimer's disease antigen. This is Alzheimer's It was measured using Western blot analysis in the body. Accounts that exist in the organization used To maximize the amount of Ruzheimer's protein, samples should be stored in 2 mM EDTA. Which reduces the solubility of Alzheimer's protein by 90% You. This reduced solubility is associated with a cocktail of protease inhibitors, including EDTA. It was discovered when attempts were made to stabilize Alzheimer's antigen by addition. Alzheimer antibody reactivity is visual from supernatant fraction prepared in the presence of EDTA But was quantitatively recovered in the pellet. 2 mM EDTA Addition to the modinate thus provides a convenient enrichment of the antigen. By Western blot analysis with Alzheimer's antibody, PBS-2 mM The EDTA-insoluble fraction was examined. Blot sensitivity for all types of binding Load a large amount of protein onto the gel to maximize Alzheimer's antibody and And I-125 labeled secondary antibody overnight. Alzheimer's disease The immunoreactivity in the tissue was 68,000-62,000 dalton protein doublet. Corresponding to the unit. In addition, a slightly larger molecular weight band is also weak above the doublet. Was observed. Normal tissues contained large amounts of low molecular weight immunoreactivity. This is a lot From the use of crude materials. Check these bands for partially purified samples Does not appear in the case of Alzheimer's disease antigen, and purified from normal or other neurological diseases. Detected in fractions. Low-molecular-weight cross-reactive proteins can be incubated overnight Figure 4 illustrates normal brain tissue immunoreactivity as measured by ELISA in a cell. In the 68,000 dalton region of the immunoblot in preparations from normal tissue Was not reactive. Most tissue from Pick's disease cases was 62,000 da Luton protein and low molecular weight material. In the 68,000 dalton area A weak band was observed. GPD organization sharp at 62,000 daltons And a diffuse reactivity at 68,000 daltons. This These results were observed by immunocytochemistry in Pick's disease and GPD Trace levels of immunoreactivity were observed with an alkaloid containing 68,000 dalton polypeptide. Alzheimer's brain, which is a Zheimer protein complex (Alzheimer antigen) Suggest that it represents the same protein as that observed in. Alzheimer brain The degree of elevation of this protein in Half in Alzheimer's Lane to prevent ambiguity in reactivity This is evident despite the use of small amounts of tissue. The selective increase in Alzheimer antigen abundance in Alzheimer tissues Diagnosis of Tuheimer's disease Developed at the strike. The utility of this antigen is shown in the examples below. The Alzheimer's disease antigen of the present invention is recognized by an Alzheimer's disease-specific antibody. Abundant in Alzheimer's disease patients, including patients with other neurological disorders. It is present in only small amounts in Alzheimer's disease patients. Alzheimer's disease antigen Is at least about 50 percent soluble in PBS and contains SEPHACRYL S-400 or S Voids from molecular sieve columns such as EPHADE G-25 or SEPHAROSE 6B Large elution by volume, void volume at least 2 × 10⁶Dalton molecular weight Corresponding. This is an assembly of several proteins where the Alzheimer's disease antigen is Indicates that The present inventors have identified some of the proteins that make up Alzheimer's disease antigen. Of about 53,000, 62,000, 68,000 and 105,000 daltons Was found to have child mass. In addition, Alzheimer's disease antigens are tau and Oxidized tau, strongly binds to an Affi-Blue column, and is aqueous 0.5M sodium chloride. It is not eluted with thorium, but can be removed with aqueous 2M sodium chloride. The molecular weight of the major protein consisting of Alzheimer's disease antigen is About 68% after denaturation with lium (SDS) and reduction with mercaptoethanol. , 000. Alzheimer antigen in non-reduced form after denaturation with SDS Has an apparent molecular weight significantly greater than 68,000 daltons, about 300,000 daltons. Larger than Luton No. In the non-reduced form, Alzheimer's disease antigen is 10% acrylamide Will not invade. The pI of reduced and non-reduced forms of Alzheimer's disease antigen is determined by isoelectric focusing. It is about 6 when measured. The antigen is 50% saturated aqueous sulfate at 4 ° C. Precipitated in ammonium, magnesium (Mg)⁺⁺) And adenosine triphosphate (A Co-purified with a kinase that phosphorylates the molecule in the presence of It is thought that. Alzheimer's disease antigen is co-purified in neurofilament Absent. The following summarizes some of the characteristics of Alzheimer's antigens. 1. Alzheimer antigens are recognized by Alzheimer antibodies. 2. Alzheimer's antigen is present in Alzheimer's patients and suffers from other neurological diseases It is substantially absent in non-Alzheimer patients, including patients. 3. Alzheimer's antigen is at least about 50 percent soluble in PBS You. 4. Alzheimer antigen is SEPHACRYL S-400 or SEPHADEX G-25 or SEPHAR At least 2 × 10 from a molecular sieve column such as OSE 6B⁶Dalton Elutes significantly at the void volume corresponding to the molecular weight of This is Alzheimer's It suggests that the original size may represent the aggregated form of the native protein. 5. Alzheimer's antigen binds strongly to the Affi-Blue column and is aqueous 0.5M chloride. It is not eluted with sodium but can be removed with aqueous 2M sodium chloride. 6. One Alzheimer antigen subunit recognized by an Alzheimer antibody The apparent molecular weight of the knit is determined by denaturation with sodium dodecyl sulfate (SDS) and It is about 68,000 daltons after reduction with rucaptoethanol. 7. Recognized by non-reduced form of Alzheimer antibody after denaturation with SDS Alzheimer antigens have apparent molecular weights significantly greater than 68,000 daltons Large, greater than about 300,000 dalsin. In the non-reduced form, Alz Hymer antigen subunit does not penetrate 10% acrylamide gel There will be. 8. Alzheimer's antigen is 50% saturated aqueous ammonium sulfate at 4 ° C. Precipitate in the solution. 9. Alzheimer's antigen is magnesium (Mg⁺⁺) And adenosine triphosphate Co-purified with a protein kinase that phosphorylates the molecule in the presence of (ATP). 10. Alzheimer's antigen is not co-purified with neurofilament. 11. Alzheimer's antibody is an antigen present in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's patients And is not present in the cerebrospinal fluid of normal patients. 12. Alzheimer's antibodies are present in Alzheimer's patients Reacts with present antigens, Huntington's chorea, diffuse Laurie disease, Creutzfell Almost present in patients with Toyakob disease, progressive supranuclear palsy and polyinfarct disease Absent. 13. The amount of Alzheimer's antigen may be associated with Guam-Parkinson's disease dementia complications and It can be detected in cases of Pick's disease. However, in the neuron process Alzheimer antigen accumulation appears to be a unique feature of Alzheimer's disease . 14． Aqueous PBS and 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid solution were It has about 10% solubility per mer antigen. In addition, aqueous 2 mM ethylene diamine The tetratetraacetic acid solution prevents Alzheimer's antigen from being extracted from brain tissue. Further measurements indicate that Alzheimer's antigen is present in Alzheimer's Horses indicate that they were also raised. Cortex, basal ganglia and hippocampus are Alzheimer's Axonal plaque, abnormal axons, and neurofibrillary tangles in the brain of patients with disease Are known. Most or not, depending on the disease, such as the caudate nucleus, thalamus and cerebellum Tests performed on areas of the brain that are known to be less affected It did not show any reactivity. Thus, the approach described herein is Alzheim's Antigen closely related to Marr's disease (Alzheimer antigen) and anti-antigen identifying the antigen Body (Alzheimer's antibody). Example 2A Alzheimer's antigen isolation: an alternative approach The concentration of Alzheimer's antigen in a sample from an Alzheimer's patient To simplify experimentation and detection of the mer antigen, at least 10^ThreeDouble, preferably Is at least 10^FiveCan be doubled. Alzheimer protein concentration Condensate is obtained using the following procedure: A portion of the Alzheimer's brain is converted to a pH of 6.8. Of a buffer consisting of PBS and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride Homogenize in 4 volumes at 4 ° C. for 30 seconds. This is 1 gram of brain per 4 ml Is equivalent to Homogenization is a minimum of 3 strokes rotating at 2,000 rpm In a Teflon-glass homogenizer equipped with the following pistons: Brain homogen The nitrate is centrifuged at 27,200 g for 23 minutes at 4 ° C. After centrifugation, separate the supernatant with SEPHACRYL -S-400 (Pharmacia) loaded onto a chromatography column and dissolved in PBS. Let out. Alzheimer's antigen from the chromatography column in void volume Appears and is monitored using ELISA. Subsequently, Affi- Apply to Ro-column (Bio-Rad). The Affi-Blue column was replaced with 20 column volumes of PBS. Wash with. Alzheimer's protein remains bound to the Affi-Blue column is there. Affi-blue colouration of Alzheimer's protein with 2M aqueous sodium chloride Elute from the system. That is, the concentration of sodium chloride in the buffer was reduced to 0 during elution. From 5M to 2M increase. The presence of the Alzheimer's antigen can be monitored using an ELISA. SEPHADEX G Elution with buffer PBS using a chromatography column consisting of -25 (Pharmacia) By doing so, the sodium chloride is removed from the Alzheimer's antigen. A Ruzheimer proteins elute significantly at void volume. Alzheimertan Transfer volume of void containing protein to Alzheimer antibody immunoaffinity column Load and wash the column with at least 20 column volumes of PBS. Alzhai The mer antigen is eluted with aqueous 3M KSCN. Elution is Alzheimer's protein Monitor for the presence of The eluted solution containing Alzheimer's protein is called P Demineralize using a SEPHADEX G-25 column using BS. Instead of PBS, PH 6.0 containing 001 M sodium phosphate and 0.014 M sodium chloride. Using a buffer solution of 8, a more concentrated elution of the Alzheimer antigen can be provided. Wear. Further enrichment of the 10-fold higher Alzheimer's antigen requires heating under vacuum By removing water from the eluted sample. The resulting concentration The object is about 1 weight percent. Samples of the enriched Alzheimer's and normal cortex were obtained from D.A. Johnson and J.W . Yauster, Gene Analysis Techniques, Vol. 1, pp. 3-8 (1984). Were examined using a Western blot technique. Alzheimer anti The major electrophoretic species contained as the starting material has an apparent molecular weight of about 68,000 daltons. Was found to have. Normal brain void volume from SEPHAROSE 6B (Pharmacia) column Reactivity of high fraction is used for Western blot of Alzheimer void volume fraction Load 3 times more amount of protein on polyacrylamide gel Therefore, it was detected by Western blot. Leading van for normal brain void volume Has a molecular weight of 59,000 daltons and a doublet at 245,000 daltons. Had a Upon reduction, Alzheimer's antigen is about 62,000 to about Brain with a molecular weight of 68,000 daltons and no indication of Alzheimer's disease It is distinctly different from their antigen having a molecular weight of 59,000 daltons. these The results show that in 0.01M Tris-buffered saline (TBS), Alzha It indicates that the immersion antigen is assembled or is part of a larger complex. Some tandems with subunits having a molecular weight of about 68,000 daltons Parkin is distinguished from Alzheimer's antigen. These proteins are two Present in Millie: The cytoskeletal family includes neurofilament and normal t au protein, and the cholinergic family includes choline acetyltrans There is ferase. All of these proteins are compared to Alzheimer's It does not show elevated concentrations in the mer brain. If Alzheimer's protein is about 59,0 00 dalton molecular weight Alzheimer's, if it is associated with a protein found in normal brain Antigen may be neurofilament, normal tau protein, or choline acetyl It does not appear to be a transferase. In further experiments, several different subjects: two of Guam Parkinson's disease And 2 cases of Pick's disease, 6 cases of Alzheimer's disease, and Parkinson's disease Two cases of combined Alzheimer's disease and 10 neurologically normal subjects Samples of brain tissue were compared. The experiments examined the immunoreactivity and immunochemistry of brain tissue samples. It was done. First, each test was performed using ELISA for crude brain homogenate. The amount of immunoreactivity in the sample was found. For each sample of brain tissue, PBS and Fractionation of brain into soluble and insoluble parts using 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid And centrifuged at about 27,000 g for about 25 minutes to obtain a crude brain homogenate. Was prepared. The supernatant was removed and the pellet was homogenized in PBS. Each peret The concentration of protein present in the protein was determined using the Bio-Rad protein assay . A dilution curve was prepared for each sample, and the amount of immunoreactivity in each sample was determined by ELISA. Was used to determine the presence of a reaction between each sample and the Alzheimer's antibody. Coarse The results of these measurements for brain homogenization indicate that a significant amount of It was found only in Alzheimer's disease cases. Immunoreactive Amount Ratio The comparison is immune Indicates that responsivity is significantly increased over that measured in other neurological disorders. For immunocytochemistry experiments, brain tissue samples should be in formalin until tested. Fixed. Guam Parkinson's disease, Pick's disease, Alzheimer's disease, Alzheimer's disease Alzheimer's antibody for brain tissue from normal subjects / Parkinson's disease and normal subjects Was used to perform immunocytochemistry experiments. Alzheimer's antibody Neuronal axon plaques and abnormal axons in the preparation were stained. Alzheimer One of the characteristics of the antibody is that staining is dramatic and extensive for abnormal axons That is. When viewed closely, axonal staining accounts for most of the visible staining . Some neuronal staining was found in Guam Parkinson's disease brain tissue, Pick body staining was found in pick brain tissue. Guam Parkinson brain tissue axon There was no staining, and pick brain tissue showed little axonal staining. Alzheimer's --- Parkinson's cortical tissue, in one case, contains a small amount of stained axonal plaque. Alzheimer's brain, except that in the other two cases there was no staining. Pathologically similar to tissue. Hippocampal tissue from one case is pyramidal neurons Although there was staining, there was little axon staining. There were a few axonal plaques Even in such cases, no staining is observed in normal brain tissue. The total amount of immunocytochemical staining is E Correlates well with the total amount of immunoreactivity observed by LISA. Immunoreactivity Be The primary difference was that axonal (abnormal axon) staining for Alzheimer's brain tissue It was me. Example 3 Antibody staining of normal and Alzheimer brain tissue The Alzheimer's disease-specific antibody of the present invention is used for cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease patients. And normal patients, as well as Huntington's disease, diffuse Laurie disease, and Creutz It is present in patients with Felt-Jakob disease, progressive supranuclear palsy and polyinfarct disease. Reacts with no Alzheimer's antigen. Immune cells of Alzheimer's ALZ-50 antibody on formalin-fixed brain tissue Chemistry indicates that the antibody is highly selective for abnormal axon components in the Alzheimer's brain. It was shown that there was. Alzheimer antigens are present on cell bodies and abnormal axons It turned out. In addition, axonal plaques were strongly stained by Alzheimer's antibodies. Was. Staining was restricted to the axonal network present in plaques. Strongly stained neuro And axonal plaques were found throughout the Alzheimer's hippocampus and cortex. In contrast, there was virtually no staining of normal brain. This pattern of specificity is It was observed in 40 brains from Immer patients and 16 brains from normal subjects. Example 4 Antibody staining of neurons and neurofibrillary tangles The relationship between antibody staining of neurons and the presence of neurofibrillary tangles requires a double staining technique It measured using. Vibratome sections from formalin-fixed Alzheimer's tissue Reacts with Ruzheimer's antibody and peroxidase against mouse immunoglobulin Immunoreactivity was visualized by using conjugated goat antibodies. Peroxida The reaction was made visible by use of 4-chloronaphthol. 4-ku Loronaphthol is a peroxidase substrate that reacts to produce a product, Precipitates in aqueous solutions but is soluble in organic solvents. Take a photograph of the tissue section and Loronaphthol was removed by dehydration and xylene treatment. After a while, puller And entanglement with Thioflavin S (known sensitive tissues for demonstration of these lesions) And the sections were again photographed. Inspection of photographs and staining patterns As a result, many neurons showed both Alzheimer's antibody and Thioflavin S Staining. Some neurons are Alzheimer's It is darkly stained by the body and does not appear to contain nerve fibrous tangles. Small percentage Neurons contain entanglement and are thioflavin-positive, but are resistant to Alzheimer's disease Not positive for the original. By this method, the puller with Alzheimer's antibody The staining of the gel was also examined. Alzheimer's antibody reveals more plaque than thioflavin And Plaques positive for Alzheimer's antibodies contain dystrophic axons, Therefore, it was an axonal plaque. Example 5 Alzheimer's antigen and Antibody staining of helical filaments Between the Alzheimer antigen and the insoluble paired helical filament (PHF) Was determined by biochemical experiments. Alzheimer's antigen is 0.01M Tris -Considerably soluble in buffered saline (hereinafter TBS), TBS or dodecyl sulfate; Insoluble vs. helical filter that does not dissolve in any of sodium salt (hereinafter, TBS-SDS) In contrast to lament, it is completely soluble in TBS containing 5% by weight of TBS-SDS. Understand. Solubility was determined by converting Alzheimer's cortex honinate to TBS or TBS-SD. Tested by stirring in S for 2 minutes. Then, brain honinate was added to 10 Centrifuged at 2,000 g for 10 minutes. Separate the supernatant and pellet from the centrifuge and pellet Wash the kit twice as in the first example and wash twice by centrifugation. did. The supernatant and pellet are homogenized in water and various amounts of each sample are Dried on polyvinyl plate for SA. The volume was 50 microliters 10, 3 and 1 microgram. The presence of Alzheimer's antigen is EL It was measured using ISA. The reactivity of the insoluble versus helical filament is Were monitored using known antibodies to the Alzheimer's antibody is TB S supernatant showed reactivity, and the reactivity was TBS- It was quantitatively recovered in the SDS supernatant, whereas the reactivity against helical filaments was TBS- After SDS extraction, it stopped at the pellet. Thus, Alzheimer antibody immunoreactivity is Concludes that it is soluble and separates from insoluble versus helical filament immunoreactivity Wear. Further testing was performed with Alzheimer antigen and insoluble versus helical filament The difference between established. Alzheimer antigens and helical filaments by enzyme experiments Confirmed the distinction between Trypsin a part of Alzheimer's brain homogenate For 0, 20 and 60 minutes and aliquots for polyvinyl play for ELISA Prior to drying on the plate, the cells were similarly treated with alkaline phosphatase. ELI SA was used to determine the sensitivity of Alzheimer antigen epitopes to treatment. Alzheimer antigen epitopes are triplicated as opposed to insoluble versus helical filaments Very sensitive to syn. This is because Alzheimer's protein is insoluble It shows that it is distinguished from twin spiral filaments. Recently, Alzheimer's antigens have been shown to be soluble versus helical Lament (Vincent and Davies, Proc. Natl. Acad . Sci.,89: 2878-2882, 1992). Also, at least in part, Alzheimer's -Insoluble PHF does not readily dissolve under the above-mentioned dissolution conditions There will be. Alzheimer's antigen will dissolve under these solvent conditions. Alzheimer antigen epitopes are not phosphatase sensitive, It does not establish that the Ruzheimer antigen is not phosphorylated. Identify neurofibrillary tangles Many antibodies directed against a neurofilament epitope It is known that it does not react after treatment. In addition, this is the Alzheimer antigen Phosphorylation of epitopes is an indicator that distinguishes between Alzheimer and normal brain antigens. Suggests that it does not account for the ability of the Ruzheimer antibody. Example 6 Monoclonal and polyclonal antibodies Brain tissue extract assay used material: ALZ-50, rabbit anti-ALZ-50, casein, Quantum, QwikWash system System, reaction plate, reaction tube, OPD reagent, gentamicin sulfate, Nipase pt, sulfuric acid reagent, 1/4 inch beads and TDx microcentrifuge are from Abbott Laborat HRPO goat anti-IgM conjugate from Fisher Scientific Obtained from: Microcentrifuge tubes with matching pestle and pestle drive are available from Kont es: Protein A from BioRad: BSA, Tween 2 and EGT A was obtained from Sigma. Tissue preparation: Robust consistency to prevent tearing during cutting Frozen brain specimens were thawed at room temperature until they had a sheet. About 50 to 150 mg of skin The quality tissue was placed in a microcentrifuge tube. Frontal and temporal cortical tissues are consistent It had higher Alzheimer antigen levels. Then, cold homogenization Buffer (0.1 mM Tris, 150 mM NaCl containing EGT, Tamycin sulfate and Nipasept as a preservative were added at 4 mL per 1 mg of tissue. Added. Use a matching pestle driven by a manual or mechanical motor to mix tissue Homogenized in a microcentrifuge tube for about 1 minute. TDx centrifuge or equivalent Particulate matter was removed from the homogenate by centrifugation in the tube for 1 minute. Organization Processed at 4 ° C throughout preparation (-70 ° C is recommended for long term storage of homogenate) ). More specifically, the following reagents were used in Alzheimer's antigen-enriched Alzheimer's Used in the preparation of diseased brain homogenate. [10x] Homogenate buffer stock 100 mM Tris 1.5M NaCl 10 mM EGTA pH 6.8 TBS-Tris buffered saline 0.01M Tris 0.9% NaCl pH 7.5 100 mM PMSF / ethanol (Pro Thease inhibitor) 1% of total volume of brain homogenate mixture Brain regions to be processed were identified and isolated. Store tissue at -80 ° C and reach -20 ° C Left overnight. When ready, resect the tissue with a biohazard hood to help Thaw slightly at room temperature in a batch. However, tissues should be kept on ice at all times. I carried it. The dissected tissue sample was then accurately weighed and placed in polyethylene surrounded by ice. Put in container. Four volumes (ml / g) of cold homogenate buffer [1 ×] were applied to a tissue sample. Was added. PMSF was added at a 1: 100 dilution to all volumes (1 mM final concentration) . Prior to use, add Polytron homogenizer to distilled water, followed by ethanol and And cleaned by several separate washes of the last water rinse. 5- on the device dial The tissue and tissue were set using a Polytron with a constant air flow of 15-20 seconds, set at 6. Buffer homogenized (appropriate homogenization of larger samples is not Longer airflow or higher dial settings). Surround the sample container with ice And kept as cold as possible during the homogenization process. After complete homogenization of the tissue, a 1 ml sample was taken for assay. saved. The rest was centrifuged at 4K for 20-25 minutes at 20K xg. Got The low speed supernatant was separated and the volume was measured. It was then transferred to a high speed centrifuge tube. 1m 1 l of the low speed supernatant was taken and saved for the assay (the low speed pellet was Reactive, resuspend in cold TBS to original volume and centrifuge as above. And can be re-extracted). High-speed centrifuge tube at 4K for 1 hour at 100K xg Was rotated while recording. Next, aspirate the high-speed supernatant, take 1 ml, and assay. Saved for. Resuspend high-speed pellet in TBS at carefully selected concentration did. Typically, a (30 ×) stock solution is extracted from an Alzheimer's brain cortical tissue extract. Used in. A small volume of this concentrated pellet was collected and stored at -80C. Samples from each step from brain preparation were assayed for antibody reactivity and protein concentration. I did. Bead coating: Beads were coated with protein A purified IgG from rabbit serum bleeds. Rabbit anti-ALZ in Tris-buffered saline (pH 8.0) for 2 hours at room temperature Standard 1/4 inch polystyrene by incubating with IgG Beads were coated and blocked with 4% BSA in phosphate buffered saline. Next Wash beads, overcoat with gelatin / sucrose, dry, room temperature Saved. The assays of the invention detect and measure Alzheimer's antigen. Alzheimer The antigen is effectively captured by the polyclonal IgG on the beads. Detection antibody Following the ALZ-50 used as a ALZ-50 is followed by enzyme-conjugated anti-mouse IgM (e.g. -Sladish penooxidase linked goat anti-IgG and a suitable substrate). Quantified by Experiment 1 FIG. 2 shows the arrangement of the assay. Postmortem sample (tissue brain homogenate without particulate matter) ) With sample buffer (1% BSA in PBS, pH 7.5, gentamicin and Nipasept) (usually 50 mL of sample homogenate and 150 m L of sample buffer). Each sample was run in duplicate. Known negative controls and reagent blanks (Homogenization buffer instead of sample) was included in each plate. One After adding the beads to each well, And incubated at 37 ° C. for 30 minutes by floating in a water bath . Using the QwikWash system, wash the beads twice with distilled water and then at 37 ° C. for 3 times. 0 minutes, approximately 0.35 mg / ml IgM (0.1% casein, 0.5% Tween 20, A containing gentamicin and Nipasept in PBS pH 7.5) Incubated with 200 mL of LZ-50 solution. Wash the beads again (2 Times) HRPO solution diluted in ALZ-50 dilution buffer containing 1% goat serum Incubate with 200 mL of conjugated goat anti-Mius IgM, Incubated again at 7 ° C. for 30 minutes. Wash the beads twice for packing Transferred to reaction test tube according to specifications. Each tube containing beads Add 300 μL OPD solution (prepared per specification) to the tube and allow to stand at room temperature for 30 minutes Incubated. Add 1 mL of 1N sulfuric acid to each tube to remove The reaction was stopped and the solution was mixed by stirring. The absorbance of each tube is Set to mode O and measure using a Quantum spectrophotometer blanked with distilled water did. This assay procedure was used to detect Alzheimer's antigen in the sample. Only However, if measurement of Alzheimer's antigen is desired in comparing the activity between several samples If possible, test for a background corrected absorbance of 0.5 or higher. The dilutions can be used to serially dilute the material and provide the highest absorbance under 0.5, Appropriate correction is dilution Guaranteed to be done at In addition, the assay uses absorbance versus wet sample weight. Values are normalized, but data per unit protein is Can be represented. For assay optimization, room temperature is routinely used for production, Only optimize the amount of anti-ALZ rabbit IgG per dose, time and pH. Figure 3, the background is rapid at levels above 2 mg / bead To increase. However, at 4 mg / bead, the background was acceptable , The signal approaches maximum. When 1% goat serum is added to the conjugate solution, Background was significantly reduced. No further increase is observed until after 2 hours The optimum pH was found to be 8.0. The blocking step consists of 4 steps in PBS. % Incubation of the antibody-coated beads in 30% BSA. Was. Standard checkerboard titration for detection antibody and conjugate concentration Optimized by Incubation temperature and duration are the shortest possible The choice was made to obtain acceptable signal reproducibility over time. With respect to specificity and linearity, FIG. 4 shows that significant activity was observed for normal brain homogenate. Alzheimer's disease dementia (“AD”) brain homogen It shows that the titer was The linear range of the curve is between 0.05 and 0.50. Table 3 below summarizes the accuracy of the assay. Normal and background It should be noted that all signals are substantially identical. AD1 is a pool of AD brain homogenates. AD2 is homozygous from AD brain specimen Zinate. Similarly, normal 1 is a pool of non-AD brain homogenates, Always 2 is a homogenate from one non-AD brain. Background is homoge Represents an assay run using the Nation Buffer instead of brain homogenate . Means are expressed in absorbance units. Data accumulated over two days. plate Report the sum of the 5 runs per run and the mean within the plate CV. Experiment 2 Alzheimer antigen concentration is temporal from 111 human brains And in postmortem brain tissue samples of the frontal cortex. Each patient from whom the sample was taken Assess (eg, diagnosis, age, gender, and post-mortem delay) and produce all samples It was evaluated pathologically prior to physical chemistry analysis. They consist of 27 normal controls (NC) , 28 neurological controls (NDC), and 53 Alzheimer's disease (AD) Seven of them are shown as Alzheimer's type senile dementia (SDAT) and 3 Is designated as aged Down syndrome D / AD with Alzheimer's neuropathology) Was. Neurological disease control categories are Parkinson's disease (n = 16) Disease (n = 5), Huntington's chorea (n = 2), amyotrophic lateral sclerosis (n = 2) , Wernicke encephalopathy (n = 1), and Korsakoff syndrome (n = 2) It was. The AD group consists of the following categories: AD, SDAT and D / AD (AD Non-AD group includes the following categories: N C (normal control) and NDC. Tissue samples in the range of 20-200 mg wet weight are added to 4 volumes of homogenizer. A buffer solution (0.05 M Tris HCl, pH = 6.8, 1 mM EGTA, And 150 mM NaCl), and then cover with a standard 1.5 ml conical lid. The tube was gently homogenized with a Kontes motor operated pestle inside the tube. E The mozinate was centrifuged at 9500 xg for 5 minutes. Duplicate 50 mL aliquots of supernatant ( (Corresponding to 10 mg of wet tissue) was used in the assay. In each case, the Alzheimer antigen result is the absorbance per mg of protein. Or as absorbance per 10 mg wet tissue. Everything about the sample Absorbance readings were taken using homogenization buffer instead of brain homogenate. Corrected to net absorbance by subtracting assay absorbance reading when used did. Report any negative net absorbance as zero. Quantum branch school used The upper limit of the photometer was 2.0 absorbance. Absorbance exceeding this upper limit is reported as 2.0. I told. Serial dilutions showed that absorbances equal to 16 were sometimes obtained. De The data were analyzed using the Student's t-test and Spearman's rank correction factor. Was analyzed. Clinical data, patient information, pathological reports, and The results of the Tuheimer antigen assay are summarized in Table 4 below. Generally, AD cases are NC Older than cases (75.8 years vs. 60.7 years), NDC cases are AD Comparable to the group (69.8 years vs. 75.8 years). 65 years old or older Considering only those cases, the average ages for NC, NDC and AD categories At the age of 74.4, 76.7 and 78.8, respectively. D / AD The case was older than 50 years (average 53 years). The time after death is as short as one hour To 96 hours; some cases have this information available. Did not. The pathological reports were from the AD group (AD, SDAT and D / AD categories). ー) Specimens range from moderate to severe, but mostly contain severe plaques. Has been shown. For plaque severity in the non-AD group, NC Have the least plaque in the fewest cases, while the NDC sample Had the reported density between NC and AD. In general, plaques are And was not classified as axonal or diffuse. All cases in the AD group Clinically dementia, whereas all cases in the NC category are dementia Was not observed. The majority of NDC cases were classified as dementia. Alzheimer's disease group showed significant Alzheimer's antigen (per protein or 1 (Expressed per 0 mg tissue weight) and normal and other neurological diseases In contrast to the group. Normal brain group and other neurological disease groups are detectable Alz It had substantially no Hymer antigen. Alzhai in AD category Mer antigen concentration was 1.39 median and 0.03-2.0 absorbance / 10 mg The scope of the organization. The D / AD category was similar to AD, but the SDAT category Lee showed a wide range of Alzheimer antigen concentrations (0 to 0.64). NC And Alzheimer antigen levels in the NDC category are significantly different (Student's t-test, p> 0.797). In contrast, the AD group (n = 56) Alzheimer's antigen level using Student's t-test Was higher than the non-AD group (n = 55) (p <0.0005). Various mosquitoes Recalculate Alzheimer's antigen concentration in categorical cases using cases older than 65 years Then, the maximum actually dropped. The AD group has a median of 0.77 overall, The absorbance ranged from 0.0 to 2.0 absorbance per 10 mg tissue. FIG. 5 shows AD / SDAT versus normal and other neurology on two different scales. 2 shows a scatter plot plot of Alzheimer antigen concentration for the combined group of. normal Groups of brain and other neurologically ill patients have differences in Alzheimer antigen concentrations. Missing (Dannet test, p0.05) Therefore, they are shown together in FIG. 0.1 absorbance value in normal range and AD range Used as an empirically derived cuff-off during For all non-AD cases Alzheimer's antigen concentration is within this line while 56% in the AD group. Alzheimer antigen concentration for 48 of the cases exceeded this line. I can. Only 3 cases in AD category overlap with NC and NDC cases Duplicate. Despite the fact that dementia was observed in 16 cases out of a total of 28 cases, It is noteworthy that there was no increase in Alzheimer antigen levels in the NDC category You. In addition, the D / AD category has Alzheimer antigen levels comparable to AD. On the other hand, the SDAT case had Alzha in both the normal range and the AD range. It had an immersion antigen concentration. In addition, the data are based on forward selection techniques (diagnosis, gender and pathological findings). Multiple step-wise regression analysis) and AD / SDAT Of Alzheimer's antigen levels in normal and other neurological disease groups with those in normal group If so, analysis was performed by the Dunnett test. Regression analysis includes diagnosis, age, gender, Alzheimer antigen concentration, taking into account variables for postmortem delay and pathological reporting (Alternative statistics for each Alzheimer antigen concentration unit category were explained.) Statistical analysis). The two independent variables are absorbance / mg protein and absorbance Alzheimer's expressed as degree / 10 mg wet tissue Antigen concentration. Fifteen percent of the former variation and 39% of the latter alone Explained by Germany (p = 0.0001). The variability is also 7 and 5 respectively. Explained by considering neurofibrillary tangles and plaque to the extent of% (P0.01). Finally, age contributes 4 and 3% respectively to each change, , And inverse correlation (p0.05). Thus, the total correction factor (R2) is , Respectively, were found to be 26 and 46%. Alzheimer's disease is associated with dementia, axonal plaque and aging, but only with dementia. Germany was not associated with an increase in Alzheimer antigen concentration. Because Alzhai 24 dementia cases (16NDC, 3AD) in the normal range for , 5SDAT) (Table 4 and FIGS. 5A and 5B). further, Plaques were not always associated with the presence of Alzheimer's antigen. Because, Some of them lack dystrophic axons containing Alzheimer's antigen Probably because it was a diffuse plaque. Alzheimer's actually detectable 29 cases for plaques that did not have antigen levels (5NC, 16NDC, 3AD, 5SDAT) (see Table 4 and FIGS. 5A and 5B). To determine the concentration of Alzheimer's antigen as a function of age, -Data on antigen concentration were recalculated for cases over 65. In this analysis Of the Alzheimer's antigen in cases 65 and older Large values are actually lower than in the NC and NDC categories, Median declined from 1.39 to 0.85 for those aged 65 and over (Table 4). In addition, FIGS. 5A and 5B show the case for the case of 65 years or older. The Ruzheimer antigen concentration is represented by a filled circle, and in cases under 65, it is filled. It is represented by a circle. No age-related patterns appear in the figure. NC and Maximum Alzheimer antigen immunoreactivity in both NDC categories is 65 years Corresponds to less than cases (solid circles, FIGS. 5A and 5B). Spearman phase A correlation test showed that Alzheimer antigen concentration was negatively correlated with age at 15% (not significant). I). The oldest NDC case is a 90-year-old woman with multi-infarct dementia And shows moderate plaque, but the Alzheimer antigen concentration is 0.01 absorbance. Unit / 10 mg tissue, whereas the youngest AD case is 46 years old and 2.0 Had an Alzheimer's antigen concentration of more than From the data, the claimed immunoassay shows AD / SDAT to be normal and other It is clear to distinguish from neurological diseases. Furthermore, based on this data , Clinical dementia, plaque and age per se increased in the AD group It does not appear to be related to Hymer antigen concentration levels. Thus, using this assay The relationship of Alzheimer's antigen concentration to regional variability and disease persistence. Solid. Example 7 Brain tissue extract assay using monoclonal antibodies The following diagnostic assays use monoclonal antibodies as first and second antibodies I do. The first antibody is called a capture antibody and the second antibody is called a detection antibody. Capture antibody and Various combinations of detection antibodies were utilized. As shown in FIGS. 7A-7M, Alzheimer's disease -Both diseased brain extract and normal brain extract were used in various antibody combinations. Brain extract Was obtained as described herein. For FIGS. 7A-7M, the Y-axis represents the optical density and the altitude in the brain tissue extract. 2 shows the level of a Tuheimer's disease antigen. X-axis used in assay in nanograms Shows the amount of brain protein. In all assays performed, significant levels of Alzheimer's anti- No original was detected. However, any studies performed on Alzheimer's disease brain Alzheimer's antigen was also detected in the assay. Therefore, the module of the present invention Noclonal antibodies can be used in various combinations to detect the presence of Alzheimer's antigen. This provides a sensitive and specific assay for diagnosing Alzheimer's disease You. Example 8 Diagnosis for Alzheimer's antigen in cerebrospinal fluid Assay Protocol A Detection of Alzheimer Antigen in Cerebrospinal Fluid (CSF) Modified Festa This was performed using the blot protocol. Equal volume of saturated ammonium sulfate (SAS ) And incubate at 4 ° C. for 30 minutes to obtain Alzheimer's disease Antigen was precipitated from 3.5 ml of CSF. The solution was then centrifuged at 5000 g The pellet was dissolved in 40 ml of 0.01 M sodium sulfate and PBS pH 7.4. Dialysis overnight. The sample was dissolved in 5% SDS-5% mercaptoethanol, and 1 It was fractionated on a 0% SDS-polyacrylamide gel and transferred to nitrocellulose. D Trocellulose in PBS pH 7.4 + 5% skim dry milk and 1% human serum Incubated for 1 hour. Overnight incubation with Alzheimer's antibody , Followed by peroxidizer diluted in blocking solution containing 1% human serum Incubation with goat anti-mouse antibody coupled with ze for 3 hours Was. The presence of peroxidase was determined in 4-chloro-1- in 0.1 M Tris pH 4.5. By reacting with naphthol (0.2 mg / ml) + 0.44 mM hydrogen peroxide Was visualized. Alzheimer's antigen was easily detected in CSF. 9 CSF samples examined Was obtained by lumbar puncture from a putative Alzheimer's patient and one CSF sample , Its diagnosis of Alzheimer's disease will be later by neuropathological analysis Obtained by cisternal puncture from a confirmed deceased patient. Surviving patient Eight of these nine samples and one sample from the deceased patient were characteristic Generated a western blot pattern showing a unique 68,000 dalton doublet . In addition, CSF was obtained by lumbar puncture from six non-demented patients. These trials The charge did not show a 68,000 dalton doublet. In addition, Alzheimer's CSF samples from one patient who died at the first clinical diagnosis of the disease were examined. CSF's Western blot analysis does not reveal 68,000 dalton doublet Was. Subsequent analysis by neuropathology indicates axonal plaque or neurofibrillary tangles This does not indicate that the patient did not die from Alzheimer's disease. You. All samples examined (presumed Alzheimer's disease and non-dementia) have the presence of dementia Various amounts of protein in the 20,000-50,000 dulcine molecular weight range that did not correlate with Showed protein. Therefore, staining of these smaller proteins is of diagnostic value There is no. This sample has a high accumulation of Alzheimer antigen and a high Alzheimer anti- Figure 4 shows that somatic immunoreactivity is unique to Alzheimer's disease. Determined by ELISA The amount is higher than in normal patient brain under conditions that favor high affinity binding. Alzheimer's antibody immunoreactivity is more than 56 times higher in the brain of patients with Ruzheimer's disease There is And Alzheimer than in the brain from cases with Pick's disease or GPD 33 times more Alzheimer antibody immunoreactivity in the brain from the case Is shown. Immunocytochemistry indicates that this increased reactivity is mostly due to Alzheimer's Demonstrated as a result of abundant reactivity of abnormal axons present in the brain affected by the disease Hinting. Other diseases have little abnormal axonal reactivity. Alzheimer's disease Increase in axonal reactivity in plaque staining is specific to Alzheimer's antibody Will be described. Only in Alzheimer's disease, Alzheimer antibody immunoreactivity is It spreads from the affected cell body to axons and axonal plaques. Different values are obtained when compared to other neurological diseases or age-matched controls. This is the difference between Alzheimer antigen immunoreactivity in Alzheimer's disease brain samples. Show the difference. Table 1 shows a 7-8 fold difference, while in this example Alzheimer's -The difference between disease and control is 56 times on average, while Pick disease and GPD The difference between the compared Alzheimer's diseases is 33 times higher. There are two reasons for these contradictions. There is a reason. First, as a result of the different assay configurations, the specific Alzheimer anti- Depending on the body and the mechanism of capture, more Alzheimer antigens may be captured. (Eg, dry-down direct assay vs. true dual antibody capture-detection) protocol). Second, the amount of Alzheimer's antigen in controls is often zero. is there. Good antibodies or assays with low background A configuration results in greater differences between Alzheimer's disease and control brain extracts There will be. Protocol B Alzheimer's antigen is incubated with an equal volume of saturated aqueous ammonium sulfate at 4 ° C. Precipitate from 3.5 ml of cerebrospinal fluid by incubation. Sample at 4 ° C Spin in a 20,000 g centrifuge tube for about 20 minutes. Remove supernatant and pellet Into 50 microliters of aqueous 0.01M sodium phosphate pH 6.8 . Alzheimer's antigen is detected using Western blot analysis. Sample 1 Run on a 0 percent SDS-PAGE gel. 125 Alzheimer's antigen Transfer to nitrocellulose in 3 hours at mA, buffer 19.2 mM pH 8.3. Lysine, contains 2.5 mM Trizma base and 20 percent methanol . Blocking solution of 0.01N TBS containing 5% v / w dry milk at pH 7.4 Solution for 1 hour, followed by Alzheimer antibody and blocking Perform with solution for 1 hour. Thereafter, washing is performed for 5 minutes. Phosphatase or peroxidase The coupled goat anti-mouse antibody and blocking solution + 1% human serum Use for an hour, followed by an additional 5 minutes of washing. Commercially available BCIP / NBT (Kirkegaard & Perry) or 4-chloronaphthol to achieve color development You. Color development is performed overnight. About the cerebrospinal fluid of three Alzheimer patients All tests were positive for each test. Cerebrospinal cord from a neurologically normal individual Tests performed on the fluid did not show the presence of Alzheimer's antigen. Protocol C Cerebrospinal fluid assay using monoclonal antibodies Alzheimer's disease antigens are converted to cerebral spine by immunoaffinity chromatography. Concentrated from pith fluid. A culture of ALZ-50 cells was screened for IgG1 A lactation mutant was isolated. Class-switch mutants are naturally found in cultures of IgM secreting cells. Occurred. The mutant was named P42 and was analyzed by ELISA, Western blot and Using immunocytochemistry, it was shown to retain ALZ-50 binding properties. P42 IgG1 was purified by chromatography on a protein A column and was Attached to Affi-Gel 10 (Biorad Laboratories) according to the manufacturer's protocol. Columns were prepared on P42 Affi-Gel 10. Alzheimer's disease cases and Cerebrospinal fluid from a non-demented individual is run through a column, and then the column is Washed with Tris-buffered saline. The bound antigen was washed with 3M potassium thiocyanate. Eluted with a solution of Fields using cerebrospinal fluid from the case of Alzheimer's disease Small amount of protein (less than 1 microgram / ml of fluid used) Detected in excreta. Detectable from column with cerebrospinal fluid from non-demented individuals No functional protein was eluted. Western blot using monoclonal antibody ALZ-50, TG3 and ELISA assay and column using cerebrospinal fluid from non-demented individuals Analysis of this fraction did not reveal any immunoreactive proteins. Therefore, cerebrospinal fluid should be concentrated prior to being used in the assay of the present invention. Can be. However, prior to utilizing it in the assays of the present invention, There is no need to concentrate the fluid. Cerebrospinal fluid from both normal and Alzheimer individuals was analyzed as described herein. In particular, assaying for the presence of Alzheimer's antigen on a solid support Diagnosed with Immer's disease. Using the monoclonal antibody TG5 as the first antibody, Alzheimer antigen in spinal fluid was captured. Using monoclonal antibody MC15 To detect the captured antigen (FIG. 8A). Cerebrospinal fluid is enriched in this assay Was not. FIG. 8B shows from both normal (N) and Alzheimer's disease (AD) individuals. 4 shows additional data utilizing cerebrospinal fluid of the present invention. Primary antibody, ie cerebrospinal flow The antibodies used to capture Alzheimer antigens found in the body are monoclonal antibodies. Lonal TG5 or MC1. The second antibody, ie, the captured antigen The antibody used to detect was monoclonal TG4 or MC15. Samples were obtained from the individual at the time of autopsy, which Diagnosis of certain properties was made possible. Trial Charges 3, 4, 15 and 22 are from individuals with Alzheimer's disease. Sample numbers 6, 12, 17 and 20 were obtained from normal individuals. FIG. As shown in A, only samples from individuals with Alzheimer's disease Had significant levels of Alzheimer's disease antigen present. This is also shown in FIG. 8B . In addition, Alzheimer's antigen in cerebrospinal fluid was immobilized using immobilized ALZ-50. Is detected, whereby Alzheimer's disease can be diagnosed. Also, Using this method to detect Alzheimer's antigen in human brain extracts (Homogenization of brain in Tris method). As shown in FIG. In some cases, the assay uses several solid phases (ie, nitrocellulose or PVDF). Paper). In the assay of FIG. 9, the first antibody is non-covalently attached to the paper. Combined anti-Fc IgG specific antibodies. Next, the uncoated portion on the paper was Block with a blocking agent (eg, BSA, casein, gelatin). Next Then, a capture antibody is added and the sample is allowed to bind to the paper. Next, a detection antibody is added. Add anti-μ chain specific biotinylated antibody and add avidin HRP conjugate I do. Substrates used are of several, including ECL, ABTS and TMB. Any of them may be used. Then, the presence of the Alzheimer's antigen was measured, Presence correlates with a positive diagnosis of Alzheimer's disease. In a preferred embodiment of the invention, the capture monoclonal antibody is an IgG isotype. And selected from the group consisting of PHF-1, TG5 and MC1. The detection monoclonal antibodies were of the IgM isotype, TG3, TG4 and And MC15. FIG. 10 shows the CSF assay, which comprises Indicates the presence of an Alzheimer's disease antigen, wherein the capture antibody used in the assay Is PHF-1 and the detection antibody used is TG3. Protocol D Cerebrospinal fluid assay using monoclonal and polyclonal antibodies Alzheimer's antigens are polyclonal and monoclonal in assays of the invention. It can be detected in cerebrospinal fluid using both antibodies. Use polyclonal antibodies To capture Alzheimer's antigen and bind using monoclonal antibody PHF-1 Antibodies were detected. Cerebrospinal fluid concentration was not used in this assay. Cerebral spinal cord Fluid samples were obtained from individuals who visited clinics specializing in the diagnosis and treatment of memory impairment. Almost 140 samples were tested and individuals were grouped according to accepted standards of clinical diagnosis. Individuals were divided into the following groups. AD-1: These individuals are the best available sources for the diagnosis of Alzheimer's disease. Meets floor standards and is generally described as probably AD. Such diagnosis is made by one of ordinary skill in the art. Tetsuna About 90% of these patients have Alzheimer's disease Will be found at AD-2: These individuals are generally acceptable for the diagnosis of Alzheimer's disease Meets most, but not all, of the criteria. Due to non-clinical typical features , They are described as possible AD, and 75% to 85% of these individuals Autopsy may be found to have Zuheimer's disease. PC: These individuals have one or more of the following: depression, manic-depression illness or schizophrenia She was diagnosed with the above psychiatric disorder. NC: These individuals were diagnosed as having no dementia at the time of the physical examination, and normal controls it is conceivable that. Two individuals in this group have a somewhat increased level of immunoreactivity. Had. Both patients were elderly women with some impaired cognitive function; However, this damage was insufficient to warrant a diagnosis of dementia. NDC: Individuals in this group are diagnosed with neurological disorders other than Alzheimer's disease Was done. This group has Parkinson's disease, Huntington's chorea or multi-infarct dementia. Includes individuals with MIX: Clinical diagnosis in this group of individuals indicates the presence of one or more neurological disorders A set of Alzheimer's disease, multi-infarct dementia and / or Parkinson's disease Most patients had matching. As shown in FIG. 11, most individuals with likely or possible Alzheimer's disease Almost most had high levels of antibody immunoreactivity with Alzheimer's antigen . In contrast, normal controls and individuals with other diseases have increased levels of Alzheimer's disease. No mer antigen immunoreactivity was shown. Therefore, polyclonal and monochrome Null antibodies are used in the cerebrospinal fluid assays of the invention to detect the presence of Alzheimer's antigen. Detection, thereby making a positive diagnosis of Alzheimer's disease. All documents, such as publications and patents, cited herein are incorporated by reference in their entirety. The body is considered part of the specification. The foregoing description, features, and advantages of the invention have been set forth to facilitate understanding of the invention. Which is intended to limit the invention as defined by the following claims. And should not be construed as limiting.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デイヴィーズ、ピーターアメリカ合衆国 10580 ニューヨーク州ライクレアモントアヴェニュー 40 (72)発明者ウォロツィン、ベンジャミンアメリカ合衆国 21044−3649 メリーランド州コランビアブリドルラインテラス 10760──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI G01N 33/53 C12N 5/00 B 33/577 15/00 C (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK , ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN , TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), AL, AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK , EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, N , NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, VN. Avenue 40 (72) Inventor Wolozin, Benjamin United States 21044-3649 Corumbia, Maryland Bridle Line Terrace 10760

Claims

[Claims] 1. Immunological response to antigens found in brain tissue of individuals with Alzheimer's disease Antibodies having specificity. 2. Anti-proteins containing proteins with major polypeptide species with a molecular weight of about 68,000 daltons An antibody that is immunologically reactive with the original. 3. A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB9205, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11744, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11745, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11742, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11740, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11736, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11746, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11737, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11738, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11739, and Hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11741 A hybridoma cell line selected from the group consisting of: 4. A monoclonal antibody produced by the hybridoma cell line of claim 3. body. 5. (A) homogenizing a sample of cortical brain tissue in Tris homogenization buffer; And (B) removing particulate matter from the homogenate of step (a) The immunological reactivity with the antibody according to claim 4, which is obtained by a method comprising A protein preparation containing an antigen having 6. (A) homogenizing a sample of cortical brain tissue in Tris homogenization buffer; And (B) removing particulate matter from the homogenate of step (a) -Homogenized antibodies obtained by a method comprising: Antibodies. 7. a having Alzheimer's disease such that a first antibody-antigen complex is formed Immunologically reactive with the first antigenic determinant found in the brain tissue of certain individuals Contacting the antibody with a sample obtained from the individual; and c Step of measuring the amount of the complex A method for determining Alzheimer's disease in an individual comprising: 8. A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB9205, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11744, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11745, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11742, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11740, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11736, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11746, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11737, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11738, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11739, and Hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11741 A hybridoma cell line selected from the group consisting of The method of claim 7, wherein the antibody is secreted. 9. Claims wherein the sample is selected from cerebrospinal fluid, brain tissue extract, urine and blood 9. The method according to 8. 10. 26. The method of claim 25, wherein the antibody is attached to a solid matrix. 11. Have Alzheimer's disease so that a second antibody-antigen complex is formed A second immunologically reactive second antigenic determinant found in the brain tissue of the individual; 11. The method of claim 10, further comprising the step of contacting the second complex with the first antibody. . 12. The first antigenic determinant may be the same or different from the first antigenic determinant. 2. The method according to 1. 13. A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB9205, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11744, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11745, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11742, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11740, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11736, Hybridoma cells recognized as ATCC No. HB11746 system, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11737, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11738, A hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11739, and Hybridoma cell line recognized as ATCC No. HB11741 Wherein the antibody is secreted by a hybridoma cell line selected from the group consisting of: 12. The method according to 11. 14． It has an isoelectric point of about 6 in the reduced or non-reduced state, Bound, labeled with 0.01 M sodium phosphate, 0.14 M sodium chloride and 1 mM phenyl At least 50% soluble in a pH 6.8 solution of sulfonyl fluoride, The antigen comprising the major polypeptide species precipitated in 5% saturated ammonium sulfate A partially purified preparation, which is a diagnostic marker for Alzheimer's disease, comprising: 15. Soluble versus helical filaments containing tau and phosphorylated tau? A purified Alzheimer antigen complex comprising: 16. The antigen has an isoelectric point of about 6 in a reduced or non-reduced state, Attached to the column, 0.01 M sodium phosphate, 0.14 M sodium chloride and 1 mM At least 50% in a pH 6.8 solution of nil-labeled sulfonyl fluoride Major polypeptides that are soluble and precipitate in 50% saturated ammonium sulfate at 4 ° C 16. The purified Alzheimer's antigen according to claim 15, comprising a Tide species.