JPH10510994A - オリゴヌクレオチドを固形支持物質に固定する方法および支持体に結合したオリゴヌクレオチドを用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、オリゴヌクレオチドを支持物質に直接固定する方法を提供する。本方法は、オリゴヌクレオチド溶液と固形支持物質とを接触させ、支持物質上でオリゴヌクレオチド溶液を乾燥する工程を含んで成る。オリゴヌクレオチド及びそれが固定されている固形支持物質は、固定されたオリゴヌクレオチドに相補的である核酸配列を固定する捕捉試薬として用いることができる。このように、直接固定されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション能力が保持される。また、供試サンプル中の核酸配列の存在または量を測定する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチドを固形支持物質に固定する方法および 支持体に結合したオリゴヌクレオチドを用いる方法 これは、１９９４年９月２２日に出願された同時係属中の米国特許出願番号０ ８／３１１，４６２の一部継続出願である。発明の分野 本発明は、オリゴヌクレオチドに関する。特に、本発明は、短いオリゴヌクレ オチドの支持物質への固定に関する。発明の背景 ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−３２０−３０８に記載されているリガーゼ連鎖 反応法（ＬＣＲ）、ＥＰ−Ａ−４３９−１８２に記載されているギャップリガー ゼ連鎖反応法（ＧＬＣＲ）、ならびに米国特許番号４，６８３，２０２および４ ，６８３，１９５に記載されているポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）のような 増幅反応法は、当業界で周知である。このような核酸増幅法は、例えば、供試サ ンプル中の感染生体を検出する分析法を構築する有用な臨床診断手段になってき ている。また、増幅反応法は、研究および開発分野ならびに法医学分野にも有用 性を見出した。 核酸増幅技法は、典型的には、標的核酸配列のコピーを発生させ、標的配列の コピーの存在または量を、免疫学的分析技法を用いて検出することができる。例 えば、標的配列のコピーは、例えば、標的配列のコピーと特異的にハイブリダイ ズするオリゴヌクレオチド（捕捉オリゴヌクレオチドと可変的に称する）で被覆 した微粒子の懸濁液のような実質的に固形の支持物質から成る゛捕捉試薬゛と接触 させることができる。この方法で、標的または増幅反応の生成物を、標的配列の コピーと捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより捕捉試薬に 固定することができる。いったん標的配列を捕捉試薬に固定したならば、これら は、例えば、洗浄または濾過によるように反応混合物から固形支持物を分離する ことにより余分のリアクタントから容易に分離することができる。捕捉試薬に固 定したであろう増幅配列の存在または量は、捕捉された標的配列と゛複合物゛とを 接触させることにより検出することができる。複合物は、捕捉試薬に固定される 増幅した標的配列とやはり特異的に結合する特異的結合対構成員に結合している 検出可能な部分から成ることができる。検出可能な部分の存在を検出することに より、標的配列の存在または量を測定することができる。 支持物質にオリゴヌクレオチドを固定する公知の１つの方法は、化学的架橋剤 を用いる。典型的には、架橋剤は、支持物質とオリゴヌクレオチドを共有結合さ せてオリゴヌクレオチドを支持物質に結合させる結合手を形成する。例えば、米 国特許第４，９４８，８８２は、オリゴヌクレオチドを固形支持物質に共有結合 させるのに用いることのできる化合物を開示している。しかしながら、オリゴヌ クレオチドを支持物質に化学的に架橋することは、通常、オリゴヌクレオチドを 構成する塩基対の修飾を必要とする時間のかかる方法である。 Saiki，R．K．等，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，86:6230-6234(1989)に述べ られているオリゴヌクレオチドを支持物質に固定する別の方法は、゛尾部゛の使用 を含む。尾部は、典型的には鎖長約１５塩基対以上であるオリゴヌクレオチドの 延長部分である。オリゴヌクレオチドの尾部は、固形支持物質に優先的に結合し 、架橋剤と同様に、オリゴヌクレオチドを支持物質から自由にしてハイブリダイ ゼーションのために利用可能にする。残念なことには、それ自体核酸である尾部 は、核酸配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を時々妨 害する。 オリゴヌクレオチドを支持材料に固定する前述の方法により明らかなように、 約５から約５０塩基対を有する比較的短いオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレ オチドのハイブリダイゼーション能力を損なうことなく固形支持物質に直接結合 させることができないことが認められてきた。よって、オリゴヌクレオチドを支 持物質に結合させる公知の方法は、オリゴヌクレオチドが支持物質に間接的に結 合させる。間接的結合により、オリゴヌクレオチドそれ自体は支持物質に結合せ ず、理論的には、別の核酸配列に自由にハイブリダイズする。発明の概要 本出願は、オリゴヌクレオチドを支持物質に直接且つ非共有的に固定する方法 を述べている。本方法によれば、オリゴヌクレオチドの支持物質への固定は、迅 速且つオリゴヌクレオチドを構成する塩基に対して化学的修飾することなく達成 される。重要なことは、直接固定されたオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼー ション能力が損なわれていない。オリゴヌクレオチド及びそれらが固定されてい る支持物質は、支持物質に結合したオリゴヌクレオチドに相補的である核酸配列 を固定する捕捉試薬として用いることができる。 この方法は、オリゴヌクレオチドの溶液と固形支持物質とを接触させ、支持物 質上でオリゴヌクレオチド溶液を乾燥させる工程を含んで成る。溶液中のオリゴ ヌクレオチドは、鎖長約５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの範囲であって よい。更に、支持物質に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオ チドを修飾することにより増強することができることを見い出した。この方法は 、更に、焼成工程および／または被覆工程を含んで成ってもよい。 固形支持物質及びその上に固定されたオリゴヌクレオチドと複合物とを接触さ せ、固定されたオリゴヌクレオチドの存在または量の指標としての測定可能なシ グナルを検出することにより支持物に結合したオリゴヌクレオチドの存在または 量を検出することができる。 別の態様によれば、固形支持物質及びその上に固定されたオリゴヌクレオチド は、複合物と接触させることができ、測定可能なシグナルを、複合物の存在また は量の指標として検出することができる。 更に別の態様によれば、支持物結合オリゴヌクレオチドは、固定されたオリゴ ヌクレオチドに相補的である核酸配列を含有 すると思われる供試標本と接触させてハイブリダイゼーション複合体を形成する ことができる。ハイブリダイゼーション複合体は、次いで、複合物と接触させる ことができ、測定可能なシグナルを、供試標本中の相補的核酸配列の存在または 量の指標として検出することができる。図面の簡単な説明 図１は、全内反射（total internal reflectance，ＴＩＲ）の原理を具体的に 示す。 図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、それぞれ、導波管（waveguide）装置の透視図、 側面図および断面図である。図２Ｃは、図２Ｂの線Ｃ−Ｃのみをとった断面を拡 大したものである。 図３、４Ａ−４Ｄ、５Ａ−５Ｂ、６Ａ−６Ｃ、および７Ａ−７Ｂは、本明細書 で教示した支持物質に固定されたオリゴヌクレオチドを含んで成る捕捉試薬を用 いる分析で得られた結果を示す写真である。これらの写真のデータの詳細は、実 施例１から実施例４に示す。発明の詳細な説明 以前の教示にもかかわらず、驚くべきことに、約５ヌクレオチドから約５０ヌ クレオチドを含んで成るオリゴヌクレオチド が、固定されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション能力を損なうこと なく固形支持物質に直接且つ非共有結合させることができることを見出した。オ リゴヌクレオチドが固形物表面に直接付着するメカニズムは完全には分かってい ないが、オリゴヌクレオチドが固形物表面に直接結合することは、オリゴヌクレ オチドが吸着と同様の方法で支持物質に固定されることを意味する。更に、オリ ゴヌクレオチドの固形物表面への直接結合は、架橋剤、尾部または固定化に影響 する更なる核酸配列を必要としない。重要なことには、本明細書で教示したよう にオリゴヌクレオチドが固形物表面に直接結合する場合、オリゴヌクレオチドは 、相補的核酸配列と特異的に対を形成し又はハイブリダイズすることである。 本明細書で示したように固定されているオリゴヌクレオチドは、例えば、２’ −デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ− ＷＯ９３／２５７０６に記載のような）等のような相補的核酸配列を、オリゴヌ クレオチドが固定されている支持物質に捕捉又はどちらかといえば固定するのに 用いることができる。一旦相補的配列が、固定されたオリゴヌクレオチドとハイ ブリダイズしたならば、その存在 は、当業界で周知の方法論を用いて検出することができる。 例えば、その上に直接固定されたオリゴヌクレオチドを有する固形支持物を含 んで成る捕捉試薬を、供試サンプルと接触させることができる。供試サンプルは 、固定されたオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることのできる核 酸配列を含有すると思われるどのような液体であってもよい。捕捉試薬と供試サ ンプルは、供試サンプル中にあるとすれば核酸とオリゴヌクレオチドがハイブリ ダイズしそれによりハイブリダイゼーション複合体を形成するのを可能にするの に好適な時間および条件下で接触させることができる。ハイブリダイゼーション 複合体は、あるとすれば、複合物がハイブリダイゼーション複合体と特異的に結 合するのを可能にするのに十分な時間および条件下で複合物と接触させることが できる。次いで、供試サンプル中に存在したかもしれない核酸配列の存在または 量の指標としてのシグナルを検出することができる。 本明細書で示したような固定されたオリゴヌクレオチドは、゛一工程゛分析形式 に用いることもできる。このような形式によれば、固定されたオリゴヌクレオチ ドに相補的である核酸を含有すると思われる供試サンプルを、複合物が供試サン プル 中に存在するかもしれない核酸配列と結合し複合物／核酸複合体を形成するのを 可能にするのに好適な時間および条件下、複合物と接触させることができる。あ るいは、供試サンプル中に存在するかもしれない核酸は、検出可能な部分を含ん でいてもよい。核酸配列は、例えば、標識されたヌクレオチドが標的配列に取り 込まれるニックトランスレーションによって、検出可能な部分で標識しまたは検 出可能部分と複合物を形成させることができる。検出可能な部分を含む複合物／ 核酸複合体または核酸は、次いで、支持物結合オリゴヌクレオチドと接触させて 複合物／核酸／オリゴヌクレオチド複合体または核酸／オリゴヌクレオチド複合 体を形成させることができる。次いで、供試サンプル中に存在する核酸配列の存 在または量の指標としてシグナルを検出することができる。 好ましい態様において、供試サンプル中のオリゴヌクレオチドの存在を迅速に 検出する方法を提供する。この態様によれば、オリゴヌクレオチドを含有すると 思われる試料を、支持物質と接触させることができ、供試サンプル中に存在する かもしれないオリゴヌクレオチドを、本明細書で示したように支持物質に固定す ることができる。次いで、複合物が固定されたオリゴヌ クレオチドと結合するのを可能にする時間および条件下、複合物を、固定された オリゴヌクレオチドと接触させることができる。次いで、供試サンプル中に存在 したかもしれないオリゴヌクレオチドの存在または量の指標としてのシグナルを 検出することができる。 本明細書で示したように固定されているオリゴヌクレオチドが、例えば、供試 サンプル、複合物／核酸複合体または複合物と接触する時間は、重要ではない。 しかしながら、このような接触時間は、例えば、３０分未満の最小限に保つのが 好ましく、更に好ましくは１５分未満、最も好ましくは１０分未満である。 複合物が、特異的結合対構成員に結合した検出可能な部分を含むであろうこと は、当業者等に理解されよう。検出可能な部分としては、シグナルと可変的に呼 ばれる検出可能且つ測定可能な物理的または化学的特性を有するいずれかの化合 物または従来の検出可能な化学的基を挙げることができる。このような検出可能 な基は、酵素および酵素の基質、補欠分類族または補酵素のような酵素的に活性 な群；スピンラベル；蛍光発光体および発蛍光団のような蛍光分子；発色団およ び色原体；発光物質、化学発光物質および生体発光物質のような発光分子；燐光 体分子；ビオチンおよびアビジンのような特異的に結合可能なリガンド；電気活 性物質；放射性同位元素；トキシン類；薬物類；ハプテン類；ポリサッカライド 類；ポリペプチド類；リポソーム類；着色または蛍光粒子；着色または蛍光微粒 子；セレンコロイドまたは金コロイドのようなコロイド粒子等であってもよいが 、これらに制限されるわけではない。更に、検出可能な部分は、例えば、参照に より本明細書に含めるものとする１９９３年７月１３日に出願された同一人に所 有され共に係属中の米国特許出願番号０９１，１４９に述べられているもののよ うなポリマーに固定された複数の発蛍光団を含むことができる。検出可能な部分 に伴っている検出可能な物理的または化学的特性は、可視的にまたは外的手段に より検出することができる。特異的結合構成員は、周知の用語であり、通常、結 合対、即ち、化学的または物理的手段を介して分子の一方が他方の分子に特異的 に結合する２つの異なる分子の構成員を意味する。抗原と抗体の特異的結合対に 加え、他の特異的結合対としては、アビジンとビオチン、抗体とハプテン、相補 的ヌクレオチド配列またはＤＮＡ、ＲＮＡもしくはＰＮＡのような相補的核酸配 列、酵素の補因子または基質と酵素、ペプチド配列とこの配列 または全蛋白質に特異的な抗体、染料と蛋白質結合剤、ペプチドと特異的蛋白質 結合剤（例えば、リボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチドおよびリボヌクレアーゼＳ− 蛋白質）等が挙げられるが、これらに制限されるわけではない。更に、結合対と しては、もとの結合構成員の類似体、例えば、分析物−類似体である構成員また は組換え技法もしくは分子工学により作成された結合構成員を挙げることができ る。従って、ＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡの特異的結合構成員である。結合構 成員が、免疫反応物である場合、これは、例えば、モノクローナルまたはポリク ローナル抗体、組換え蛋白質または組換え抗体、キメラ抗体、これらの混合物ま たは断片であってもよい。検出可能な部分は、特異的結合構成員の特異的結合特 性または検出可能な部分の検出可能な特性を破壊しないいずれかの化学的手段お よび／または物理的手段を介して特異的結合対構成員に結合することができる。 好ましくは、本明細書で提供する方法を用いてガラスの表面にオリゴヌクレオ チドを固定し、これを、次いで、参照により本明細書に含めるものとする゛Light Scattering Optical Waveguide Method for Detecting Specific Binding Even と題した１９９４年９月２２日に出願され同一人に所有され共に係属中の米国特 許出願番号０８／３１１，４６２に教示されているような導波管形式に用いる。 免疫分析またはハイブリダイゼーションのタイプフォーマットに用いる導波管装 置の能力は、当業界で公知であり図１に関して説明される全内反射（ＴＩＲ）と 呼ばれる現象に基づいている。より密な媒体１２（即ち、より高い屈折率Ｎ₁を 有する）中を移動し、より密な媒体とより疎の媒体１６(即ち、より低い屈折率 Ｎ₂を有する)間の境界面１４にぶつかる光１０が、臨界角が等式： θ_C＝アークサイン（Ｎ₂／Ｎ₁） により定義される臨界角θ_Cより大き い角度θ_Rで境界面にぶつかるならば、これは、より密な培体１２内で完全に反 射するという原理によりＴＩＲは作動する。これらの条件下で、゛減衰波゛として 知られる電磁波形が生じる。図１に示すように、より密な媒体中の光に関連した 電場は、境界面に垂直に立つシヌソイド１８を形成する。減衰波は、より疎の媒 体１６を透過するが、そのエネルギーＥは、２０で示すように境界面からの距離 Ｚの関数として指数関数的に消散する。゛透過の深度゛（ｄ_p−図１の２２で示し た）として知られるパラメーターは、減衰波のエネルギーが境 界面で０．３６８倍のエネルギー値に下がった境界面からの距離として定義され る。［Ｅ＝（ｅ^-1）・Ｅ₀の深度としてｄ_pを定義するSutherland等，J ．Immunol ．Meth. ，74:253-265(1984)参照］。透過の深度は、次のように計算する： 透過の深度を増加させる傾向のある因子は：入射角θ_Rの増加；２つの媒体の 屈折のぴったり合った指数（即ち、Ｎ₂／Ｎ₁−＞１）；および波長λの増加であ る。例えば、石英ＴＩＲ要素（Ｎ₁＝１．４６）を水性媒体（Ｎ₂＝１．３４）中 に置く場合、臨界角θ_Cは６６°（＝アークサイン０．９１７８）である。５０ ０ｎｍの光が境界面にθ_R＝７０°（即ち、臨界角より大きい）で衝撃を与える 場合、ｄ_pは約２７０ｎｍである。 また、ＴＩＲは、散乱全内反射（゛ＳＴＩＲ゛）と呼ばれる技法で光散乱検出と 関連して用いられてきた。例えば、Schutt等による米国特許４，９７９，８２１ および５，０１７，００９ならびにＷＯ ９４／００７６３（Akzo N.V.）参照。 この技法によれば、光のビームが適切な角度でＴＩＲ要素の表面を横切って走破 し、光のエネルギーは、減衰波を除いて完全に反射さ れる。透過の深度内にて特異的に結合した赤血球、コロイド金またはラテックス のような粒子は、光を散乱し、散乱光は光検出装置により検出される。 図２Ａ−２Ｃは、平面導波管要素３２および平行の平面プレート３４を含む導 波管装置３０を具体的に説明する。従って、導波管要素は、平行な表面３６およ び３８ならびに光を受け取る末端４０を有する。同様に、プレート３４は、平行 な表面４２及び４４を有する。導波管要素３２およびプレート３４は、この要素 の表面３８およびプレートの表面４２が狭い溝４６の境界を定めるように一定の 間隔を保った平行な様式で共に保たれる。この要素およびプレートは、要素とプ レートの端に沿って配置した二重の粘着テープから成る接着部品４８を含む適当 な部品により共に保持することができる。溝４６は、好ましくは、それを介した 流体試料の毛管移動を可能にするように比較的小さい。例えば、高さは、約１ｍ ｍ未満、好ましくは約０．１ｍｍ未満であるべきである。 要素３２は、ポリカーボネート、アクリル樹脂またはポリスチレンのようなプ ラスチック、ガラス、石英のような光学的に透明な材料で製造すべきである。全 内反射を達成するためには、 当業界で知られていることではあるが、導波管の屈折率は、試料流体の屈折率よ り大きい必要がある。水溶液試料では、屈折率ｎは約１．３３であることから、 導波管は、代表的には、１．３５より大きい屈折率、通常約１．５以上を有する 。導波管は、１枚のプラスチックまたはガラスであってもよく、例えば、標準ガ ラス顕微鏡スライドまたはカバースリップを用いることができる。 プレート３４は、同様の材料で作成することができる。図２Ａおよび２Ｂから 分かるように、導波管要素３２の光を受ける末端４０は、光源５４に由来する迷 光の作用を最小限にするためにマスク５２の狭いスリット５０内に配置する。迷 光の最小限化は、光吸収物質の使用によっても改善される。 投射光線を発生する光源５４は、可視、紫外、および近赤外スペクトルにおけ るエネルギーを含む電磁エネルギー源であってもよい。従って、゛光゛とは、かな り広く解釈され、検出が可視的になされる場合を除いて可視範囲に限定されない 。非可視的波長は、当業界で周知のように、特定の波長のために最適化した検出 器により検出される。光は、単色であっても多色であっても視準化されていても 視準化されていなくても偏光であっ ても偏光でなくてもよい。好ましい光源としては、レーザ、発光ダイオード、閃 光電球、アーク灯、白熱電球および蛍光放電灯が挙げられる。導波管要素を照射 するのに用いる光源は、低ワット数のヘリウム−ネオンレーザであってもよい。 下記の実施例１で述べるもののような携帯用の使い捨て用には、光源は、ポケッ ト用懐中電灯に用いるような、電池によって電気が供給される小さな白熱電球で あってもよい。好ましくは、光源は、光源の強度を変化させるためのポテンシオ メーター部品を含む。あるいは、フィルターおよび／またはレンズを用いて強度 を適切な水準に調整することができる。 検出装置を用いて、光散乱標識（ＬＳＬ）により生じた光散乱を測定すること ができる。図２Ａで最も良く分かるように、ＬＳＬは、例えば、固定されたオリ ゴヌクレオチドと同種のＤＮＡ配列間のそれのような特異的に結合する構成員間 の相互作用を介して導波管要素３２の表面３８に固定することができる。ＬＳＬ は、入射光を弾力的に、即ち、実質的に光のエネルギーを吸収することなく散乱 させる、分子または物質、しばしば粒子である。代表的ＬＳＬとしては、コロイ ド金またはセレンのようなコロイド金属および非金属標識；赤血球；およびラ テックス、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、ポリカーボネートまたは同 様の材料でできた着色したプラスチック粒子が挙げられる。このような特定の標 識のサイズは、１０ｎｍから１０μｍ、代表的には５０から５００ｎｍ、好まし くは７０から２００ｎｍの範囲である。粒子が大きいほど光散乱効果が大きいが 、これは、結合したおよびバルク液中粒子の両方に当てはまることから、バック グラウンドも粒子サイズと共に増加する。適切な粒子ＬＳＬは、Bangs Laborato ries,Inc.,Carmel,IN，USAから入手可能である。 器具および視覚的検出手段を用いて、ＬＳＬにより生じた光散乱度を測定する ことができる。全導波管を横切る光散乱事象は、観察者の目および頭脳により又 は、コンピューターを用いてデジタル化され処理される画像を形成するＣＣＤカ メラを含む光検出装置により、実質的に同時に測定することができる。 前述したように、本発明による、オリゴヌクレオチドの支持物質への固定は、 支持物質とオリゴヌクレオチド溶液とを接触させ、支持物質上で溶液を乾燥させ て成る。 オリゴヌクレオチドを固定することのできる支持物質または固形支持物は、当 業界で周知であり、それとしては実質的に不 溶性である材料が含まれる。多孔性材料を固形支持物とすることができ、それと しては、例えば、紙；ナイロン；およびセルロースならびにニトロセルロースの ようなセルロース誘導体を挙げることができる。滑らかな重合および非重合材料 も好適な支持材料であり、それとしては、例えば、ポリカーボネート、ポリスチ レンおよびポリプロピレンのようなプラスチックおよび誘導プラスチック；磁性 または非磁性金属；石英およびガラスが挙げられるがこれらに限定されるわけで はない。好ましくは、石英、ガラスまたはニトロセルロースを支持材料として用 いる。固形支持物は、それらに限定されるわけではないが、試験管、マイクロタ イターウェル、シート、フィルム、ストリップ、ビーズ、微粒子、チップ、スラ イド、カバースリップ等を含む当業者等に周知の多数の形状で用いることができ る。 本発明によるオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡの配列を意 味することは当然のことである。支持物質に固定されるオリゴヌクレオチドの鎖 長は、主として当業者の選択の問題であり、典型的には、例えば、捕捉しようと するＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡの相補的配列の鎖長に基づく。固定されるオリ ゴヌクレオチドの鎖長は、典型的には、約５から 約５０塩基であるが、好ましくは、固定されるオリゴヌクレオチドの鎖長は、約 ５から約３０塩基、更に典型的には約１０から約２５塩基である。 オリゴヌクレオチドの合成は、自動化された合成装置を用いかなり慣例的であ る。所望であれば、自動化された合成装置は、末端アミンまたは他の基が修飾さ れたオリゴヌクレオチドを製造することができる。カップリング化学の有用な概 説は、Goodchild，Bioconjugate Chemistry，1 (3):165-187（1990）に見い出さ れる。 修飾されたオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比べて固形 支持物に対する親和性が大きい。オリゴヌクレオチドを修飾する方法論は、周知 であり、アミン類のような化学基または、オリゴヌクレオチドに対するフルオレ セインのようなハプテン類の付加が挙げられる。このような修飾は、支持物質と オリゴヌクレオチド間の共有結合を与えないが、それでもなお、支持物質に対す るオリゴヌクレオチドの親和性を増加させることが分かっている。修飾は、オリ ゴヌクレオチドの３´または５´末端になされる場合、特に効果的である。 固形支持物と接触するオリゴヌクレオチド溶液は、溶液中オ リゴヌクレオチドを含んで成ることができる。溶液中のオリゴヌクレオチドの濃 度は、主として当業者の選択の問題であり、典型的には、固定化したオリゴヌク レオチドをどのように用いるかに基づく。通常、オリゴヌクレオチド溶液は、約 １μＭから約１ｍＭ、好ましくは約２０μＭから約２５０μＭのオリゴヌクレオ チド濃度を有する。しかしながら、前述したように、修飾したオリゴヌクレオチ ドは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比べて固形支持物に対する親和性が大きい ことが分かっている。よって、修飾したオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴ ヌクレオチドと比べて低い濃度範囲で用いることができる。 オリゴヌクレオチド溶液のｐＨは、約６．５から約８．０、好ましくは約７． ０から約７．５であってよい。更に、オリゴヌクレオチド溶液は、好ましくは食 塩水であり、このような溶液の塩化ナトリウム濃度は、大きく変えることができ るが、典型的には約７５ｍＭから２Ｍ、好ましくは約１００ｍＭから約１Ｍ、最 も好ましくは約１２０ｍＭから約５００ｍＭである。 任意に緩衝システムをオリゴヌクレオチド溶液中に含むことができる。緩衝シ ステムは、周知であり、通常、溶液の水素イオン濃度の変化に抵抗する化合物の 水溶液を含んで成る。緩衝 システムの例としては、例えば、酢酸、硼酸、燐酸、フタル酸、クエン酸、炭酸 等のような弱酸または塩基とその塩溶液が挙げられるが、これらに限定されるわ けではない。好ましくは、緩 酸ナトリウム、または燐酸ナトリウム、更に好ましくは約１０ は燐酸ナトリウム、最も好ましくは約１０ｍＭから約１７５ｍ 含んで成る。 固形支持物上に供する又は゛スポットする゛オリゴヌクレオチド溶液の量は、例 えば、捕捉した配列または共役物の検出を可能にするのに十分な相補的配列を捕 捉するには十分大きい必要がある。これは、部分的には、捕捉オリゴヌクレオチ ドを固定する支持物質の密度に依存する。例えば、直径１５０μｍほどの小さい 面積を用いることができる。支持物質上の多数の部位がオリゴヌクレオチド溶液 でスポットされる場合、このような小さい面積が好ましい。サイズの実際的な下 限は、直径約１μｍである。可視的検出には、拡大することなく検出するのに十 分大きい面積、例えば、少なくとも約１から約５０ｍｍ²； １ｃｍ²までの大きさ又はそれより大きめが望まれる。製造コストおよび使用者 の利便により要求されるようなものを除きサイズの上限はない。 一旦オリゴヌクレオチド溶液が固形支持物と接触したならば、蒸発が好ましい 乾燥方法であり、室温（約２５℃）で行うことができる。所望である場合、相補 的配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの能力を著しく阻害し ない限り、蒸発は、高温で行うことができる。 オリコヌクレオチドを固形支持物に固定する方法は、更に、支持物質及びその 上のオリゴヌクレオチド溶液を「焼成（baking）して成る。焼成は、固相および オリゴヌクレオチド溶液残分を約６０℃から約９５℃、好ましくは約７０℃から ８０℃の温度に供することを含むことができる。焼成時間は重要ではなく、好ま しくは約１５分から約９０分間継続する。例えば、ニトロセルロースのような多 孔性支持物質を用いる場合、焼成は、特に好ましい。 多孔性支持物質を用いる場合、被覆工程を、本明細書で提供される方法に任意 に用いることができるが、滑らかな重合または非重合支持物を導波管フォーマッ トに用いる場合、上塗り工 程は特に好ましい。上塗りは、典型的には、支持物質と流体試料中に存在するか もしれない相補的配列間の非特異的相互作用を防止するように支持物質を処理し て成る。オリゴヌクレオチド溶液が支持物質上で乾燥する前に被覆または防止物 質を供することが好ましい。好適な防止物質は、カゼイン、ゼイン、ウシ血清ア ルブミン（ＢＳＡ）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１Ｘ から５Ｘのデンハルトの溶液（１Ｘデンハルト液は０．０２％Ficoll、０．０２ ％ポリビニルピロリドンおよび０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡである）である。他の 防止剤としては洗剤および長鎖の水溶性ポリマーを挙げることができる。 カゼインは、好ましい防止物質であることが分かっており、Sigma Chemical， St Louis，MOから入手可能である。カゼインは、゛メター可溶性゛蛋白質（例えば 、参照により本明細書に含める Ching 等による米国特許５，１２０，６４３参 照）として知られている蛋白質の系に属し、好ましくは処理してより可溶性にす る。このような処理には、酸またはアルカリ処理が含まれ、完全な蛋白質の切断 および／または部分的加水分解を行うと考えられる。カゼインは、約２３，６０ ０（ウシβ−カゼイ ン）の分子量を有する乳蛋白質であるが、本明細書で用いるような゛カゼイン゛ま たは゛アルカリ処理した゛カゼインは、両方とも、米国特許５，１２０，６４３の 実施例１に記載されたようなアルカリ処理による部分的に加水分解した混合物を 指す。このように処理したカゼインの電気泳動ゲル（２０％ポリアクリルアミド ＴＢＥ）は、このマーカーの下の拡散したバンドにより示されるように、主とし て１５，０００未満の分子量を有する断片の混合物を示す。 実施例実施例１． ＤＮＡハイブリダイゼーション分析 Ａ． ＤＮＡ導波管作成 嚢胞性線維症を引き起こすヒト遺伝的突然変異の検出用ＤＮＡ導波管を、ガラ ス基質１ｃｍ平方から作成した。オリゴヌクレオチドを、反応性表面において複 数の捕捉部位を提供するガラスに固定した。特に、ＣＡＴ０１からＣＡＴ０９（ 配列番号１−９）と命名した９種の異なるオリゴヌクレオチドを、導波管のガラ ス表面に供してＣＡＴ＃が標準押しボタン式電話上の同じ番号により占められる 位置に相当するように３ｘ３配列パターンを形成させた。ＤＮＡスポットは、直 径約２ｍｍで 約２ｍｍ離した。ＣＡＴ０１からＣＡＴ０９（配列番号１−９）の配列および突 然変異部位を、表１．１に示す。 ヒト遺伝的突然変異は、標準表記により示される。例えば、△Ｆ５０８は、嚢 胞性線維症トランスメンブラン コンダクタンス調節ポリペプチドの５０８の位 置での３個の塩基対の欠失を指す（J．Zielenski等，Genomics 10:214-228，199 1）。゛ＷＴ゛は、この位置での野生型または正常な配列を示す。ＤＮＡ溶液は、S ynthecell(Columbia，MD)により調製されており、１：２０でＰＢＳ（燐酸緩衝 食塩水、ｐＨ７．４）緩衝液中に希釈し、直径約１ｍｍのドリル・ビットの丸い 刃先を用いて導波管のガラス表面に供した。ＤＮＡを、きれいなガラスの表面ま たは予 め０．０５％カゼインで被覆したガラスの表面に固定したが、ハイブリダイゼー ションの結果は、区別がつかなかった。導波管のガラス表面に供したＤＮＡの最 終濃度は、ＣＡＴ０２の１４μＭの高い値からＣＡＴ０８の０．９μＭの低い値 の範囲であり、Synthecellから受け取った出発物質の濃度との比較により測定し た。適用後、ＤＮＡ溶液は、室温で、または約３５％から８０％の相対湿度の湿 気の日には、乾燥するまで（約１０分）５０−７０℃にセットしたインキュベー ター中でチップ上で乾燥した。この手順により、上記の３ｘ３配列に９個の゛ス ポット゛またはハイブリダイゼーション捕捉部位を形成した。別のガラスのカバ ースリップが、複合物溶液を保持する溝を作り出した。２つのカバースリップは 、オフセットに重ねられ、約１６ｍｍの幅および約７５μｍの厚さ（両面テープ の厚さ）の溝を形成するように両面テープ（Arcare 7710B、Adhesives Research inc.，Glen Rock，Penn）により一緒に保持された。溝は、約２５μｌの容量を 有していた。 Ｂ． ハイブリダイゼーション ＤＮＡ導波管の性能を評価するために、３´末端にビオチン標識を有する９種 の更なるオリゴヌクレオチドＣＡＴ２１Ｂか らＣＡＴ２９Ｂ（配列番号１０−１８）を、Synthecellにより合成した。試験用 ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を表１．２に示す。 オリゴヌクレオチドを、ＣＡＴ０１（配列番号１）に相補的であるＣＡＴ２１ Ｂ（配列番号１０）、ＣＡＴ０２（配列番号２）に相補的であるＣＡＴ２２Ｂ（ 配列番号１１）、その他およびＣＡＴ０９（配列番号９）に相補的であるＣＡＴ ２９（配列番号１８）であるように設計し命名した。濃度は、ＣＡＴ２５Ｂ（配 列番号１４）の４７３μＭの高いものからＣＡＴ２７Ｂ（配列番号１６）の１５ １μＭの低いものまで変化した。９種の各ＤＮＡ試料１μｌを１ｍｌのハイブリ ダイゼーション 緩衝液（１％カゼイン、１０ｍＭのトリスｐＨ７．４、１５ｍＭのＮａＣｌ）中 に希釈し、異なるものを９個の各異なるＤＮＡ導波管に供し、室温（約２３℃） で約５分間インキュベートした。ＤＮＡ導波管の表面を洗浄瓶を用いてＰＢＳで 洗浄し、次いで、ハイブリダイゼーションの検出までＰＢＳ下で保管した。 Ｃ． ハイブリダイゼーションの検出 導波管を、１５０ワットの白熱電球から成る光源で約２ｍｍのスリットの隙間 から照射した。導波管の２ｍｍ厚さの光を受ける末端に光がさしこむように導波 管を光源に挿入した（図２Ａ参照）。導波管を、マスクに対して約４５°でスリ ット内に挿入した。 ９種の異なるビオチン標識したＤＮＡのハイブリダイゼーションを、セレン抗 −ビオチン複合物から散乱する光により導波管で検出した。５４６ｎｍの吸収最 大波長で３２ Ｏ.Ｄ.濃度を有する、Yost等による米国特許第４，９５４，４５ ２に述べられているようなコロイドセレン粒子を用いて複合物を製造した。２． ５μｌの抗−ビオチン抗体(ポリクローナル ラビット抗−ビオチン抗体、ＰＢＳ 中の１．１３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ ７．４−参照により本明細書に含めるものとする米国出願番号０８／１９６，８ ８５に相当する Mushahwar 等によるＥＰ０ １６０ ９００ Ｂ１参照)のセレン コロイド１ｍｌへの添加、続いて３０μｌのウシ血清アルブミン（２０％ｗ／ｖ 溶液になるように水に溶解した粉末ＢＳＡ）の添加によりセレン複合物を調製し た。５０μｌの複合物溶液をＤＮＡ導波管の表面に供し、光を導波管側に向けて 種々のＤＮＡ捕捉部位へのセレンの結合を観察した。陽性のハイブリダイゼーシ ョンが、１分以内に多数の部位で観察された。ＤＮＡ導波管をＰＢＳで洗浄して 余分なセレン共役物を取り除き、照射して導波管が光散乱を引き起こすのを達成 させ、画像化した。この可視的シグナルを、標準８ビットＣＣＤ（荷電結合素子 ）カメラ(Cohu model 4815 Cohu，Inc.，San Diego，CA)を用いて記録した。画 像のデジタル表示を、Compac DeskPro 386/20e(Compaq Computer Corporation ，Houston，TX)のフレームグラバー(Imaging Technology Incorporated,PC VISI ON plus Frame Grabber Board;Woburn,Mass)を用いて行った。デジタル化した画 像データファイルを、変換し、画像が３００ｄｐｉ解像度プリンター上でプリン トされるPublishers PaintBrushソフトウェア(ZSoft Corp., Atlanta，Georgia)に持ち込んだ。プリントした画像を図３として示す。 ＤＮＡハイブリダイゼーションの全パターンを、導波管を用いて単一画像測定 で検出し、導波管に供したオリゴのＤＮＡ配列の決定を可能にした。ＣＡＴ２１ Ｂ（配列番号１０）およびＣＡＴ２２Ｂ（配列番号１１）（図４の初めの２つの フレーム）の場合、それぞれＣＡＴ０１（配列番号１）およびＣＡＴ０２（配列 番号２）以外のＤＮＡ捕捉部位とこれらのオリゴヌクレオチドに無視して良い配 列相同性があることから、ハイブリダイゼーションパターンは、比較的単純であ った。しかしながら、ＣＡＴ２３Ｂ−ＣＡＴ２９Ｂ（配列番号１２−１８）の場 合、顕著な配列相同性は、より複雑な結合パターンに帰する。実施例２． ニトロセルロースに直接固定されたオリゴヌクレオチドの検出 Ａ． オリゴヌクレオチドのニトロセルロースへの固定 合成オリゴヌクレオチドを、従来の方法論を用いてハプテン化し、その結果で きた配列を下記表２．１に示す。これらのオリゴヌクレオチドを、次いで、個別 に２０Ｘ ＳＳＣ緩衝液（３Ｍ塩化ナトリウム、３４２ｍＭのクエン酸ナトリウ ム、 ｐＨ７．０）中に希釈（１：１）して３種の各オリゴヌクレオチドの１５０μＭ 溶液を得た。 各オリゴヌクレオチド溶液の約０．３μｌを、Schleicher & Schuell; Keene ，NHから入手可能な０．４５μｍおよび０．５μｍニトロセルロースの個々の０ ．４ｃｍｘ５ｃｍ片のおよそ真ん中にスポットした。オリゴヌクレオチドをニト ロセルロースに供した後、ニトロセルロース片を、８０℃のオーブンで２０分間 加熱した。 Ｂ． 固定したオリゴヌクレオチドの検出 ラビット抗−ビオチンセレンコロイド複合物を、このコロイドをポリクローナ ル抗体に加える前に蒸留水中に１：１で希釈した（５４６ｎｍの最大波長でＯＤ １５が得られる）ことを除いては実施例１におけるように調製した。その結果で きた複合 ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）に溶解した３％カゼイン中に１：３で希釈した。 その上にオリゴヌクレオチドが固定された各ニトロセルロース片の一方の端に３ ０μｌの希釈複合物を供した。かすかな赤い点が現れる時点で観察を行う前に、 複合物を、ニトロセルロースの縦に沿って移動させた（約２分）。約５分後、オ リゴヌクレオチドが固定されている区域の全てのニトロセルロース片上で赤い点 が観察された。実施例３． ニトロセルロースに直接固定したオリゴヌクレオチドを用いたオリ ゴヌクレオチド捕捉 Ａ． オリゴヌクレオチドの固定 この実施例では、オリゴヌクレオチドをニトロセルロースに固定し、相補的な 一本鎖ＤＮＡ配列または二重鎖ＤＮＡ配列（Genosys，Woodlands，TX; およびSy nthecell，Columbia，MDから得られる）を捕捉するのに用いた。二重鎖ＤＮＡの １本の鎖は、固定したオリゴヌクレオチドに相補的な配列から成る。ニトロセル ロース片に固定したオリゴヌクレオチドは、表３．１に見ることができる。 オリゴヌクレオチドの１５０μＭ溶液を５μｍニトロセルロース(Schleicher & Schuell)の約０．４ｃｍｘ５ｃｍ片上にスポットすることによりオリゴヌクレ オチドを固定した。固定手順は、オリゴヌクレオチド溶液をニトロセルロース片 に供した後これらの片を７５℃で加熱したことを除いては実施例２で上記した手 順と同じである。 Ｂ． 固定したオリゴヌクレオチドとそれらの同種物とのハイブリダイゼーショ ン 初め、同種オリゴヌクレオチドと相補的オリゴヌクレオチドから成る二重鎖配 列（その両方を、以後、ランニングオリゴヌクレオチドと称する）は、１００μ Ｍから５００μＭの濃度であった。ランニングオリゴヌクレオチドを、１０ｍＭ のトリス、１５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４に溶解した１％カゼイン中に希釈し た。ランニングオリゴヌクレオチドの配列は、表３．２ に見ることができる。 ３０μｌのランニングオリゴヌクレオチドをニトロセルロース片の一方の端に 供し、このオリゴヌクレオチドを、固定したオリゴヌクレオチドを含む領域を通 り越して移動させる（約５分）ことによりハイブリダイゼーションを成し遂げた 。ランニングオリゴヌクレオチドと固定したオリゴヌクレオチドとのハイブリダ イゼーションの検出は、２つの方法の１つで成し遂げた。一方の方法は、片を紫 外線下に置き、固定したオリゴヌクレオチドの位置を蛍光シグナルにより観察す ることを含んだ。他方の方法は、ランニングオリゴヌクレオチドと混合したセレ ンコロイド複合物とニトロセルロース片の端とを接触させ、固定したオリゴヌク レオチドの位置を通り越して複合物を移動させ、固定したオリゴヌクレオチドの 位置を可視的シグナルにより観察することを含んだ。固定したオリゴヌクレオチ ドの領域 のシグナルは、ランニングオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび 従って固定したオリゴヌクレオチドの元の位置での存在を示した。セレンコロイ ド複合物は、セレンコロイドおよび、ランニングオリゴヌクレオチドに結合した 標識に特異的な抗体から成る。複合物を、抗−フルオレセイン抗体および抗−ビ オチン抗体を用い上記実施例２のように調製した。 図４は、固定した配列番号１の位置を通り越して配列番号２３が移動した後の ニトロセルロース片の紫外線ランプ下での写真である。図４（ａ）は、１００ｎ Ｍ濃度の配列番号２３をランニングオリゴヌクレオチドとして用いた場合、固定 したオリゴヌクレオチドの位置で生じた蛍光シグナルを具体的に示す。図４（ｂ ）は、１μＭ濃度の配列番号２３をランニングオリゴヌクレオチドとして用いた 場合、固定したオリゴヌクレオチドの位置で生じた蛍光シグナルを具体的に示す 。図４（ｃ）は、１．６μＭ濃度の配列番号２３をランニングオリゴヌクレオチ ドとして用いた場合、固定したオリゴヌクレオチドの位置で生じた蛍光シグナル を具体的に示す。図４（ｄ）は、３．３μＭ濃度の配列番号２３をランニングオ リゴヌクレオチドとして用いた場合、固定したオリゴヌクレオチドの位置で生じ た蛍光シ グナルを具体的に示す。図４（ａ）−（ｄ）で観察されるシグナルにより具体的 に示されるように、ランニングオリゴヌクレオチドは、固定したオリゴヌクレオ チドと初めに供された領域でハイブリダイズした。 図５は、配列番号２２をニトロセルロースに固定し、２０μＭ濃度で配列番号 ２４（一本鎖ＤＮＡ）および２０μＭ濃度で配列番号２５（二重鎖ＤＮＡ）を、 ランニングオリゴヌクレオチドとしてランニング緩衝液（１０ｍＭトリス、１５ ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に１：３０希釈で用いた別の一工程フォーマッ トから得た結果を具体的に示す。セレンコロイド抗−フルオレセイン複合物（実 施例２で調製したような）を用いてハイブリダイゼーションを可視的に検出した 。図５（ａ）は、配列番号２４およびセレンコロイド共役物が、配列番号２２が 固定されている位置を通り越して移動した後の結果を示す。同様に、図５（ｂ） は、配列番号２５およびセレンコロイド複合物が、配列番号２２が固定されてい る位置を通り越して移動した後の結果を示す。図５（ａ）および５（ｂ）により 具体的に示されるように、一本鎖ＤＮＡ（配列番号２２）のハイブリダイゼーシ ョンは検出したが、二重鎖ＤＮＡ（配列番号２５）の ハイブリダイゼーションは検出しなかった。 図６は、配列番号１を３片のニトロセルロース片に固定し、種々の濃度の配列 番号２６をランニングオリゴヌクレオチドとして用いた場合に得られた結果を具 体的に示す。図６（ａ）は、ランニングオリゴヌクレオチドをニトロセルロース 片の端に１００ｎＭ濃度で供した場合に得られた結果を具体的に示す。図６（ｂ ）は、ランニングオリゴヌクレオチドをニトロセルロース片の端に１ｎＭ濃度で 供した場合に得られた結果を具体的に示す。図６（ｃ）は、ランニングオリゴヌ クレオチドをニトロセルロース片の端に０．１ｎＭ濃度で供した場合に得られた 結果を具体的に示す。ランニングオリゴヌクレオチドと固定したオリゴヌクレオ チドとのハイブリダイゼーションを、上記のようにセレンコロイド抗−ビオチン 複合物（実施例２で調製したような）を用いて可視的に検出した。図６（ａ）− ６（ｃ）により示されるように、配列番号１を初めに固定した領域で観察される シグナルにより示されるようなハイブリダイゼーションが３片すべてに起こった 。実施例４． ガラスに直接固定したＤＮＡ＆ＰＮＡを用いたオリゴヌクレオチド の捕捉 Ａ． オリゴヌクレオチドおよびＰＮＡをガラスに直接固定 オリゴヌクレオチドを、コーニング(Corning)から入手した２２ｍｍｘ２２ｍ ｍのガラスのカバースリップに固定し、同種オリゴヌクレオチドを捕捉するのに 用いた。配列番号２７は、ガラスのカバースリップに固定されたＤＮＡオリゴヌ クレオチドであり、配列番号２８は、ガラスのカバースリップに固定されたＰＮ Ａオリゴヌクレオチドであった。配列番号２７を、従来の自動化技法を用いて合 成し、下記の表４．１に掲げる。配列番号２８を、Millipore(Bedford，MA)から 購入し、下記の表４．２に掲げる。 オリゴヌクレオチド配列の２種の希釈物を調製した。ＰＮＡを、燐酸緩衝食塩 水（ＰＢＳ）中に希釈して４４μＭおよび１１μＭの濃度のＰＮＡを含有する溶 液を得た。ＤＮＡを、ＰＢＳで希釈して３７μＭおよび１４μＭの濃度のオリゴ ヌクレオチドを含有する溶液を得た。１μｌの各希釈物を、次いで、ガラスのカ バースリップ上に分配した。カバースリップを６０℃で２０分間加熱する前にＰ ＮＡおよびＤＮＡ溶液を室温でカバースリップ上で乾燥させた。カバースリップ を加熱した後、室温に冷まし、ＨＰＬＣ水に溶解したアルカリ処理したカゼイン の０．０５％溶液で被覆した。被覆を１分間継続し、余分なカゼインをＨＰＬＣ 水でカバースリップからすすぎ落とした。カバースリップ上の残存液を、強制通 風で乾燥した。 Ｂ． 光学的導波管の製造 両面テープを用い、オリゴヌクレオチド配列をスポットしたカバースリップに 二番目の２２ｍｍｘ２２ｍｍのガラスのカバースリップを固定した（僅かに中央 から離して）。この２つのカバースリップの間に形成された溝は、約０．７５μ ｍの深さであり、約２５μｌの液体試薬を保持した。この方法で２つの導波管を 製造した。 Ｃ． ハイブリダイゼーションおよび検出 配列番号２７（ＤＮＡ）および配列番号２８（ＰＮＡ）に相補的であるＤＮＡ 配列(Genosys)を試料オリゴヌクレオチドとして用いた。この試料オリゴヌクレ オチドを、配列番号２９と命名し、下記表４．３に掲げる。 配列番号２９の別々の希釈物を、異なる濃度の燐酸ナトリウムを含有する緩衝 液中に調製した。配列番号２９を、１．５ｍＭ燐酸緩衝液および１５０ｍＭの燐 酸緩衝液中で１７０ｎＭになるように希釈した。導波管の溝を満たすのに十分な 量の各希釈物を、次いで、上記で作成した２つの導波管に分配した。導波管を、 次いで、湿度１００％の湿った部屋で室温で５分間インキュベートした。インキ ュベーション後、導波管の液体を実施例１で上記のように調製した抗−ビオチン セレンコロイド複合物で置き換え、この複合物を蒸留水中の１０％アルカリ処 理カゼインで１：１に希釈した。置換直後、導波管を、実施例１のように１５０ ワットの光源に挿入した。 図７は、導波管を光源に挿入した際に得られた結果を具体的に表す。図７（ａ ）は、種々の濃度の配列番号２７および配列番号２８の固定に用いたスポットパ ターンを示す凡例である。図７（ｂ）は、１．５ｍＭの燐酸緩衝液に希釈した場 合の配列番号２９の導波管結果を示す。図７（ｂ）により示されるように、シグ ナルは、４４μＭのＰＮＡをスポットした区画で最も強い。図７（ｃ）は、１５ ０ｍＭの燐酸緩衝液に希釈した場合の配列番号２９の導波管結果を示す。図７（ ｃ）により示されるように、シグナルは、４４μＭのＰＮＡをスポットした区画 で再び最も強いが、ＤＮＡスポットの結合親和性は、１．５ｍＭ希釈物より大き い。 上記の実施例は、本発明のいくつかの特定の態様を説明しているが、本発明は 、これらの特定の実施例に限定されるものではない。むしろ、保護されるべき本 発明は、添付した特許請求の範囲により明らかにされる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．オリゴヌクレオチドを支持物質に非共有的に固定する方法であって、 （ａ）当該オリゴヌクレオチド溶液と固形支持物質とを接触させる工程、当該 オリゴヌクレオチドは５ヌクレオチドから３０ヌクレオチドを含んでなり；およ び （ｂ）当該固形支持物質上で当該溶液を乾燥させる工程、を含んで成る前記方 法。 ２．当該溶液が１μＭから約１ｍＭのオリゴヌクレオチド濃度を有する、請求 項１の方法。 ３．当該溶液が、更に、６．５から８．０のｐＨ、７５ｍＭから２Ｍの塩化ナ トリウムおよび緩衝システムを含んで成る、請求項１の方法。 クエン酸ナトリウムまたは燐酸ナトリウムを含んで成る、請求項３の方法。 ５．当該乾燥後、当該方法が、更に、当該固形支持物質を６０℃から９５℃の 温度で加熱することを含む、請求項１の方 法。 ６．当該オリゴヌクレオチドが、更に、５´末端または３´末端でアミン基を 含む、請求項１の方法。 ７．当該オリゴヌクレオチドが、ペプチド核酸である、請求項１の方法。 ８．工程（ｂ）後、本方法が、更に、 （ｉ）当該固形支持物質と複合物とを接触させ；および （ｉｉ）当該オリゴヌクレオチドの存在または量の指標としての測定可能なシ グナルを検出して成る、請求項１の方法。 ９．工程（ｂ）後、本方法が、更に、 （ｉ）当該固形支持物質と複合物とを接触させ；および （ｉｉ）当該複合物の存在または量の指標としての測定可能なシグナルを検出 して成る、請求項１の方法。 １０．工程（ｂ）後、本方法が、更に、 （ｉ）当該固形支持物と、当該オリゴヌクレオチドに相補的である核酸配列を 含有すると思われる供試サンプルとを接触させてハイブリダイゼーション複合体 を形成させ； （ｉｉ）当該複合体と複合物とを接触させ；および （ｉｉｉ）当該核酸配列の存在または量の指標としての測定可能なシグナルを 検出して成る、請求項１の方法。