JPH10510702A

JPH10510702A - ヒトおよび非ヒト霊長類の多能性幹、前駆および成熟骨髄細胞の維持、増殖および分化のための系

Info

Publication number: JPH10510702A
Application number: JP8517803A
Authority: JP
Inventors: モスカ，ジョセフ，ディー．; ガートナー，スザンヌ; ケスラー，スティーブン; ルッサ，ヴァンスラ; ホール，エリック; コーシャル，スメシュ
Original assignee: モスカ，ジョセフ，ディー．; ガートナー，スザンヌ; ケスラー，スティーブン; ルッサ，ヴァンスラ; ホール，エリック; コーシャル，スメシュ
Priority date: 1994-12-09
Filing date: 1995-12-08
Publication date: 1998-10-20
Also published as: WO1996017627A2; AU4419396A; CA2207216A1; EP0796110A2; WO1996017627A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトまたは非ヒト霊長類のＣＤ34+ 細胞などの多能性幹細胞のマウスへの移植方法に関する。この方法は、放射線照射を受けたマウスに、ＣＤ34+細胞などの増殖を支えるサイトカインを発現する、無限増殖性のヒトまたは非ヒト霊長類の骨髄ストロマ細胞を投与し、そして順次にまたは同時に精製ヒトまたは非ヒト霊長類のＣＤ34+ 細胞を投与することを含む。ストロマ細胞およびＣＤ34+ 細胞は腹腔内または静脈内注射によって投与することができる。本発明はヒトＣＤ34+ 細胞に関する遺伝子治療プロトコルを評価するのに使用することができ、また骨髄移植中などに放射線照射を受けた患者の治療における用途をも有する。本発明はまたヒト造血作用の研究のための動物モデルをも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトおよび非ヒト霊長類の多能性幹、前駆および成熟骨髄細胞の維持、増殖および分化のための系発明の背景発明の分野本発明は、ヒトの疾病状態の研究用として、マウスでヒト微細環境を作成するための、ヒトの無限増殖性の細胞系の使用に関する。このヒト微細環境中において、ヒトおよび非ヒト霊長類の多能性幹細胞を維持し分化させることができる。特に、本発明は、ヒトおよび非ヒト霊長類のＣＤ34+ 幹細胞の移植、維持および分化を支持するのに必要な、ヒトサイトカインを供給するヒト微細環境を形成させるための、マウス中へのヒト無限増殖性のストロマ細胞系（Lof(11-10)など）の注入に関する。こうしたヒト微細環境は、ヒトの造血の研究のための有益な動物モデルを提供する。先行技術の説明生物医学の研究は、ヒトにおける各種の疾病状態の理解を深めるために、動物モデルに大きく依存している。研究者は、動物モデルを使用して、疾病状態の理解を深め、これらを疾病の過程と関連させることを目的としている。動物モデルは、アスピリンおよび金属の代謝の安全性からバクテリアおよびウイルスの感染に至るまでの広範囲のあらゆるヒト疾病の研究に使用されて、成功してきている。例えば、マウスは、アルツハイマー病（Wiら、Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tsa Chih （China） 12:622,1992）、ブドウ球菌感染症（Bel'skiiら、Zh.Mikr obiol ．Epidemiol.Immunobiol.(USSR) 3:16,1989）、脳障害（Rossら、Neurotox icology 9:581,1988）、強直症（Mahowaldら、Arthritis Rheum.31:1390,1988）、自己免疫（Robertsら、J.Comp.Pathol.(England) 100:391,1989）、全身性狼瘡（Mendlovic ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2260,1988）、癲癇（Kingら、E pilepsia 30:257,1989）、インスリン依存性糖尿病（Gottliebら、Diabetes Car e 11:29,1988）、膠原病（Rosenberg N.L.,Arthritis Rheum.31:806,1988）、および銅代謝（Shiraishi ら、Biol.Neonate （Switzerland）54:173,1988）の研究のために使用されてきた。ラットもまた、嚢胞性線維症（Hunsinger ら、Med.Hy potheses(England) 28:81,1989）、骨粗鬆症（Yamazakiら、J.Bone Miner Res.4 :13,1989）、ならびに肥満および高血圧症（Crandallら、J.Appl.Physiol ．64:1 094,1988）の研究のための動物モデルとして利用されて成功している。齧歯類以外の動物種もまたヒトの疾病の研究のために使用されて成功している。ブタは、E.coli感染症（Sarmiento ら、Am.J.Vet.Res.49:1154,1988）、アセトアミノフェノン（Henne-Bruns ら、Res.Exp.Med.(Germany)188:463,1988）、喘息（Karol M.H.,Bull.Eur.Physiopathol.Respir.(England)23:571,1987）、およびヘルペスウイルス感染症（Hsiungら、Antiviral Res.(Netherlands)12:239, 1989）を研究するために使用され、また一方ヒツジは歯周炎（Ismaiel ら、J.Pe riodontol. 60:279,1989）および慢性静脈疾患（Jessupら、J.Vasc.Surg.8:569,1 988）の研究に利用された。慢性亜脱臼（De Boer ら、J.Manipulative Physiol. Ther. 11:366,1988）および呼吸困難症候群（Lachmann B.,Dev.Pharmacol.Ther ． (Switzerland) 13:164,1989）が成体および胎児ウサギにおいて研究され、一方高シュウ酸尿症（Danpure ら、J.Inherit.Metab.Dis.(Netherlands)12:403,1989）がネコにおいて研究された。関節炎がラット（Bartholdら、Ann.NY Acad.Sci.53 9:264,1988）およびアカゲザル（Pritzkerら、PR Health Sci.J.(Puerto Rico)8 :99,1989）の両方において研究された。ＨＩＶ感染症はチンパンジー、テナガザル、マウス、ウサギ、ヒヒおよびアカゲザルなどの動物モデルを使用して真剣に研究されてきた（Spertzel R.O.,Antiviral Res.(Netherlands)12:223,1987）。しかし、好適な動物モデルが利用できない場合、疾病およびその治療の研究は強く妨げられかねない。特に、ヒトの造血の研究は、造血細胞の研究のための動物モデルがないために、支障をきたしてきた。この好適な動物モデルがないことは、ヒトの疾病に関する遺伝子治療の出現にともなって、今日特に切実である。現在のところ、ある遺伝子治療を評価するために利用し得る唯一の方法は臨床治験であるが、これは費用がかかり、複雑で時間を要する試みである。したがって、遺伝物質をヒトの多能性幹細胞に導入する研究のための動物モデルはこの分野にとって大きな前進をもたらすと思われる。造血、すなわち成熟血液細胞の形成には多重系列の分化の複雑な図式が含まれる（Metcalf,Nature 339:27-30,1989）。骨髄中で、多能性幹細胞が増殖し、前駆細胞に分化して、その後これが各種の型の成熟血液細胞になる（Gordonら、Bo ne Marrow Transplant 4:335,1989；Dexterら、Ann.Rev.Cell Biol.3:423,1987 ）。実際に、ＣＤ34造血細胞表面抗原の存在によって同定される多能性幹細胞は、分化して全造血系の細胞となることができる（Sprangruide ら、Science 241: 58,1988）。造血細胞の起源であるヒト骨髄細胞の増殖および分化の研究のため、重度の複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスを基礎とする、２つの動物モデルが開発された。しかし、これらの両者のモデルには、障害および欠点があって、有用性には限界がある。John Dick によって確立された第１の系では、ヒト骨髄を移植したＳＣＩＤマウスに、全身投与によって、ヒトサイトカインを供給する（Lapidot ら、Science 255:1137-1141(1992)）。（Dickら、Sem.Immunol.3:367-378(1991)も参照されたい。）この系では精製した組み換えサイトカインを一週間に３回注入する必要があるので、非常に経費がかかる。 Jim McCuneによって開発された第２の系は、ＳＣＩＤマウスへのヒト胎児組織の外科的移植を含む（McCuneら、Science 241:1632-1639(1988)；およびKaneshi ma ら、Nature 348:561-562(1990)）。McCuneの系においては、ヒト胎児肝、ヒト胎児胸腺および／またはヒト胎児リンパ節がＳＣＩＤマウスに移植される。これらのマウスは成熟ヒトＴ細胞およびＢ細胞の分化を支持する。McCuneの系は、ヒト胎児骨を移植したＳＣＩＤマウス中での活性なヒト造血の持続にも成功している（Kyoizumiら、Blood 79:1704-1711(1992)）。しかし、このMcCuneの系において各マウスに実施する必要がある外科的手順は時間がかかり、費用もかさむ。その上、胎児組織の有用性には限界があり、その使用については、この試みを論争の余地あるものとしている。発明の要約したがって、各種の提案された遺伝子治療法がある欠陥を効果的に矯正するかどうかを試験することによってこの治療法を評価するための、前臨床アッセイとして使用することができる動物モデルを提供することが、本発明の１つの目的である。ヒト骨髄細胞の増殖および分化を研究するための、低コストで直接的かつ用途の広い方法を提供することが本発明の別の目的である。無限増殖性のヒト細胞系を使用して、マウス中にヒト微細環境を提供することが、さらに別の本発明の目的である。図面および以下の本発明の記載から、本発明のその他の各種の目的および利点が明らかとなるであろう。これらの目的を達成するため、本発明は、マウスにヒトまたは非ヒト霊長類の幹細胞を移植して、造血細胞の研究のために有用な動物モデルを作成する方法に関する。一実施態様において、細胞は全造血細胞に分化する能力を有する原始幹細胞である。好ましい態様において、幹細胞はＣＤ34+ である。特定の態様において、この方法には、マウスへの致死量または非致死量の放射線を照射する工程；幹細胞の増殖を支持するサイトカインを発現する無限増殖性のヒトまたは非ヒト霊長類の骨髄ストロマ細胞を被照射マウスに対して投与する工程；および精製したヒトまたは非ヒト霊長類の幹細胞を被照射マウスへ投与する工程が含まれる。別の態様において、本発明はＨＩＶなどの感染因子に対する遺伝子治療プロトコルの有効性を試験するための方法に関する。この方法には、第１および第２のマウスに致死量または非致死量の放射線を照射する工程；ＣＤ34+ 幹細胞の増殖を支持するサイトカインを発現する無限増殖性のヒトまたは非ヒト霊長類の骨髄ストロマ細胞を被照射マウスに投与する工程；第１グループのヒトＣＤ34+ 幹細胞中への提案された治療用遺伝子セグメントを導入する工程；この遺伝子セグメントを発現する第１グループのＣＤ34+ 幹細胞から細胞を精製する工程；第２グループのヒトＣＤ34+ 幹細胞中へ対照用遺伝子セグメントを導入する工程；遺伝子セグメントを発現する精製されたＣＤ34+ 幹細胞を第１の被照射マウスへ投与する工程および対照細胞の第２の被照射マウスへ投与する工程；両方の被照射マウスをレトロウイルスでチャレンジする工程；および２種のマウスからのヒトＣＤ34+ 幹細胞の生存を比較する工程、が含まれる。さらに別の態様において、本発明はヒトの造血の研究のための動物モデルに関する。このモデルには、無限増殖性のヒトまたは非ヒト霊長類の骨髄ストロマ細胞の存在下で、ヒトまたは非ヒト霊長類のＣＤ34+ 幹細胞が移植された齧歯類が含まれる。好ましい態様において、この齧歯類はＳＣＩＤマウスなどのマウスである。図面の簡単な説明図１は、ヒトストロマ細胞系 Lof(11-10)におけるサイトカインｍＲＮＡ転写物の相対発現率を示す。図２は、致死量の照射を受け、ヒトストロマ細胞系 Lof(11-10)で再構成された、ＳＣＩＤマウスの生存率を示す。図３は、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、ＳＣＩＤマウス中の Lof(11-10)の検出を示す。図４は、逆転写酵素（ＲＴ）依存性ＲＮＡＰＣＲによる、ＳＣＩＤマウスの骨髄コンパートメント中のヒトおよびサルＣＤ34+ 由来細胞の検出を示す。レーン１−４は、腹腔内注射（i.p.）による１×10⁷のLof(11-10)細胞に加えて、静脈内注射（i.v.）による３×10⁵のヒトＣＤ34+ 細胞を投与されたマウスを示す。レーン５は、１×10⁷のLof(11-10)細胞 i.v. に加えて２×10⁵のサルＣＤ34+ 細胞 i.v. を投与されたマウスを示す。レーン６−８は、１×10⁷のLof(11-10) 細胞 i.p. に加えて２×10⁵のサルＣＤ34+ 細胞 i.v. を投与されたマウスを示す。発明の詳細な説明本発明は、ヒトまたは非ヒト霊長類の多能性幹細胞を齧歯類に移植する方法に関する。発明者らは、重度の複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスを使用して、ヒトまたは非ヒト霊長類の多能性ＣＤ34+ 幹細胞をＳＣＩＤマウス中に移植する方法を開発した。本方法の開発のためにはマウスを利用したが、いかなる齧歯類でも使用することができる。好ましい齧歯類としてＳＣＩＤマウスが含まれる。これらのマウスは、マウスによる成熟Ｔ細胞およびＢ細胞の産生を妨げる突然変異ｓｃｉｄ遺伝子を有している。これらのマウス中で、その他の全造血系は正常に産生される。多能性幹細胞は機能面から、そして表現型から定義することができる。機能面では、多能性幹細胞は多重系列の分化および自己再生能を有する造血細胞である。多能性幹細胞は細胞表面のマーカーによって表現型で定義することもできる。例えば、ヒト幹細胞は、ＣＤ34+ 、ＣＤ38- 、ＨＬＡ−ＤＲ- 、ＴＨＹ+ およびＲｈ123- として特徴づけられてきた。本方法において、ヒトおよび非ヒト霊長類の多能性幹細胞が齧歯類、好ましくはマウスに移植される。ヒトおよび非ヒト霊長類の幹細胞がマウス中で維持され分化することを目的として、この細胞を移植するために、最初にマウスに致死量または非致死量の放射線を照射する。例えば、各マウスを200 または400 ラドのガンマ線を照射して被曝させることができる。照射後、マウスに幹細胞の増殖を支持する無限増殖性の細胞を１用量与える。一つの態様において、支持し得る細胞はサイトカインを発現する無限増殖性の骨髄幹細胞である。最後に、精製したヒトまたは非ヒト霊長類のＣＤ34+ 細胞をマウスに１回注入する。齧歯類に移植する細胞は、好ましくは、骨髄、末梢血液または臍帯血から得ることができるＣＤ34+ 幹細胞である。これらの細胞は、当業界で公知の方法を使用して、ヒトまたは非ヒト霊長類の骨髄または血液から単離することができる。この移植方法に有用なその他の細胞として、限定するわけではないが、胎児肝および胎児胸腺が含まれる。後に投与されるＣＤ34+ 幹細胞などの原始造血細胞が付着することができる基体をマウス内に提供するために、無限増殖性の骨髄ストロマ細胞を被照射マウスに投与する。これらのストロマ細胞は、細胞の増殖および分化のために必要なサイトカインを産生することによって、こうした細胞の養育をも行なう。無限増殖性の骨髄ストロマ細胞は、マウス内で、幹細胞の移植、分化および自己再生が生じ得る微細環境として働く。無限増殖性のストロマ細胞は好ましくはヒトサイトカインを産生する。好適な無限増殖性の骨髄ストロマ細胞として、限定するわけではないが、Lof(11-10)細胞系が含まれる。このLof(11-10)細胞系は、天然にヒトサイトカインを産生し、したがってin vitroでＣＤ34+ 細胞の増殖を支持することができるので、好ましい。Lof(11-10)細胞系は、ＩＬ-1α、ＩＬ-1β、ＩＬ-6、ＩＬ-8、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびＳＣＦ（幹細胞因子）を産生する。その上、これらの細胞は、トランスフォームされた細胞ではないＳＶ40ラージＴ細胞抗原を使用して無限増殖性化され、マウスに投与したとき腫瘍を形成しない。本発明で利用する無限増殖性の骨髄幹細胞は、Lof(11-10)細胞系のように、所望のサイトカインを天然に産生するものもある。また、当業界で公知の標準的な方法を使用して、所望のサイトカインまたは所望のその他の支持成分を産生するように、骨髄幹細胞を遺伝学的に操作することができる。例えば、Lof(11-10)細胞は、ＩＬ-3、さらにＳＣＦ、ＩＬ-7またはＩＬ-2などのヒトサイトカインをさらに産生するように改変することが可能である。無限増殖性の骨髄ストロマ細胞および精製ＣＤ34+ 細胞は、ＣＤ34+ 細胞の移植を促進するのに十分な量で投与する。好ましくは、各齧歯類に0.1-5.0×10⁷個の骨髄ストロマ細胞を投与し、より好ましくは、各齧歯類に0.1，0.5，1.0，または5.0×10⁷個の細胞を与える。好ましくは、各齧歯類に0.1-5.0×10⁵個のＣＤ 34+ 細胞を与える。より好ましくは、各齧歯類に0.1，0.5，1.0，または5.0×10⁵ 個の用量のＣＤ34+ 細胞を与える。これらの２つの細胞集団は、マウスに対して同時にまたは順次投与することができる。好ましくは、最初に無限増殖性の骨髄ストロマ細胞を腹腔内（i.p.）投与し、次に精製ＣＤ34+ を静脈内（i.v.）投与する。例えば、無限増殖性の骨髄ストロマ細胞投与の約10日後、好ましくは無限増殖性の骨髄ストロマ細胞投与の 2-7日後に、精製ＣＤ34+ 細胞を投与することができる。本発明は、マウス動物モデルにヒトおよび非ヒト霊長類のＣＤ34+ 細胞を移植するための、低コストで直接的で、そして用途の広い系である。無限増殖性の骨髄ストロマ細胞を細胞培養液中で増殖させることが可能であるため、この方法は比較的低コストである。例えば、Lof(11-10)細胞はT225フラスコ当たり 1×10⁷ 個まで増殖させることができ、これはマウス１匹に導入するのに十分な細胞数である。無限増殖性の骨髄ストロマ細胞の注入は実施が容易であり、そしてこれによってマウス中にヒトサイトカインの持続的な供給が提供される点において、この方法は直接的である。最後に、この方法は用途が広い。無限増殖性の骨髄ストロマ細胞が、その他のヒト成長因子、表面受容体および／またはサイトカイン遺伝子を発現するようにすることができる。本発明にしたがって、ＣＤ34+ 細胞などのヒト幹細胞を移植したマウスは、ヒト血液細胞の全系列を産生する。移植されたＣＤ34+ 細胞は増殖して、ヒトＴ細胞およびヒトＢ細胞を含む全血液細胞系に分化することができ、それによって、マウス中にヒト造血微細環境を樹立することができる。このヒト造血に関する動物モデルはいくつかの用途を有する。例えば、本発明のマウスは in vivoでの感染性疾患の研究のためのモデルとして使用することができる。このモデルはまた、in vivo での抗ウイルス活性に関する化合物のスクリーニングのために使用することもできる。このマウスモデルは、造血増殖因子、免疫モジュレーターおよび／または免疫毒素に関するアッセイのために使用することもできる。最後に、ヒトＣＤ34+ 細胞を移植したマウスは、ヒトモノクローナル抗体およびヒト細胞溶解性Ｔ細胞クローンを製造するのに使用することができる。本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）などの感染性因子に対する遺伝子治療プロトコルの有効性を試験するための方法にも関する。この試験方法において、推定上の治療用遺伝物質をヒトＣＤ34+ 細胞に導入し、その後このＣＤ34+ を齧歯類に移植して、この遺伝物質の導入によってin vivo でのＣＤ34+ 細胞およびその子孫の生存が延長されるかどうかを判定する。例えば、上記のようなマウス中に、遺伝学的に操作したＣＤ 34+ 細胞を移植する。その後このマウスを感染性因子でチャレンジし、ＣＤ34+ 細胞およびその子孫の生存を判定する。例をあげると、ＡＩＤＳの原因となる因子であるＨＩＶに対するある遺伝子治療プロトコルの有効性を判定するのに、本試験方法を使用することができる。ＨＩＶ感染に対して有効な遺伝子治療プロトコルならば、in vivo で細胞にＨＩＶに対する抵抗性を付与するはずである。ある特定の遺伝子治療プロトコルを使用して、in vivo で細胞にＨＩＶ感染に対する抵抗性を付与することができる場合、さらに研究を進めてＡＩＤＳ患者におけるこの分子の介在の治療上の効果を最適化が保証されるはずである。本発明の方法において、提案された抗ＨＩＶ遺伝子をヒトＣＤ34+ 細胞中に導入し、続いてこの遺伝子を発現している細胞を精製する。提案された抗ＨＩＶ遺伝子のＣＤ34+ 細胞中への導入は、ウイルス仲介ベクター系などの当業界で標準的な手法によって実施することができる。ＣＤ34+ 発現細胞の精製は、薬物の選択性または抗ＨＩＶ遺伝子と同時に導入された遺伝子の表面発現などの当業界における手法によって容易に実施することができる。ヒトＣＤ34+ 細胞の別個のアリコートに対照遺伝子を導入する。対照遺伝子としては、例えば、提案された抗ＨＩＶ遺伝子の発現を妨げるようなフレームシフトがある、提案された抗ＨＩＶ遺伝子が含まれる。致死量または非致死量の放射線照射を受け、ＣＤ34+ 細胞の増殖を支持するサイトカインを発現する無限増殖性のヒト骨髄ストロマ細胞の１用量を与えられたマウスの１または２集団を使用して、提案された抗ＨＩＶ遺伝子および対照抗ＨＩＶ遺伝子の効果を分析することができる。２つのマウス集団を使用する場合、１集団に提案された抗ＨＩＶ遺伝子を発現するヒトＣＤ34+ 細胞を投与し、他方の集団にヒトＣＤ34+ 対照細胞を与える。その後マウスをＨＩＶでチャレンジする。提案された抗ＨＩＶ遺伝子を発現するヒトＣＤ34+ 細胞およびその子孫の半減期および生存をＣＤ34+ 対照細胞と比較する。各ベクターに特異的なプライマーを用いた、脾臓および骨髄由来の細胞の限界希釈ＰＣＲなどの当業界で周知の手法を使用して、これらの２つの集団を識別することができる。このようにして、残存する細胞の数を時間の関数として測定し、各ベクターで形質導入された細胞の半減期を評価することができる。本系は、自己再生および終生の発現の能力がある、真性幹細胞への治療用遺伝子の効果的な導入についてのアッセイのために使用することもできる。これは、ＣＤ34+ 細胞の注入の14日後のＳＣＩＤ中で増殖しているヒト脾臓コロニーのＰＣＲ分析によって判定することができる。これらのコロニーは最も速くアッセイし得る多能性幹細胞由来の細胞である。この細胞集団中への効果的な治療用遺伝子の導入は、レシピエント患者における１回の遺伝子治療を保証するものとなる。ＣＤ34+ 細胞のわずか0.1−1パーセントが真性多能性幹細胞であり、残り99パーセントのＣＤ34+ 細胞は各種の血液系列になることが約束された前駆細胞であるから、このことは重要である。したがって、ＣＤ34+ 集団中での治療用遺伝子の発現は、この治療用遺伝子が幹細胞中にあることを必ずしも意味するものではない。血液中の成熟細胞中での治療用遺伝子の発現は有用なはずだが、これらの成熟細胞の寿命には限界がある。多能性で自己再生する幹細胞中に治療用遺伝子を導入することによって、約束された前駆細胞の持続的な供給が保証され、それによって治療用遺伝子で補強された、血液中の成熟細胞の持続的な供給が保証される。例を示すと、ＨＩＶの場合、抗ＨＩＶ遺伝子がＨＩＶ感染患者の成熟Ｔ細胞および単球細胞中に存在するはずであり、ＡＩＤＳウイルスを有しているにもかかわらず、個体が正常な生活をおくることが可能になるであろう。現在のところ、幹細胞中への治療用遺伝子の導入に関する機能的アッセイは存在せず、霊長類における治験または骨髄移植の結果を待たなければならない。ＳＣＩＤ脾臓内のヒト細胞についての本発明の脾臓コロニーアッセイの使用は、抗ウイルス遺伝子で補強された、約束された前駆細胞および成熟細胞の持続的供給を保証する、ヒト幹細胞中への治療用遺伝子の導入に関してアッセイするための方法の開発を大きく促進するであろう。本発明はさらに、放射線に被曝した患者を治療して回復時間を減少させるための方法に関する。放射線照射は、白血病を含む各種の型のガンの治療のために、および骨髄移植を実施している患者の処置のために、一般的に使用されている。患者が骨髄移植のために放射線を照射する時、前駆細胞（血液中で成熟細胞の起源となる）およびストロマ細胞（幹および前駆細胞が再生し、増殖し、そして分化するように育てる）を含めて、彼らのすべての骨髄が破壊される。全身の照射と患者の中に“新しく”導入された骨髄細胞の増殖／分化の間隙の時間（１−２ヵ月）が骨髄移植において最も決定的な時間である。この時が、患者が拒絶反応（宿主対移植片疾患）または日和見感染（不全な免疫系による）を最も起こしやすい時期である。サイトカイン療法は全身の照射と新しい細胞の増殖／分化の間の時期に使用するのが有望であることが示され、幹および前駆細胞の増殖に必要なサイトカインを供給するためには機能的なストロマ層の確立が重要であることを示唆している。“新しく”導入された骨髄細胞は、結局はそれ自身のストロマ層を確立することになる。しかし、in vitroで増殖させ、“新しい”骨髄とともに導入される、ストロマ細胞系の導入は、この不安定な間隙期を減少させるかも知れない。このストロマ細胞はLof(11-10)細胞系を樹立するのに使用したものと同様の手順によって、患者自身の骨髄またはドナーから得ることができる。本発明の好ましい態様を説明するために、以下の実施例に限定されるものではないがこれらの実施例においては、ＳＣＩＤマウスをヒトおよびサルＣＤ34+ 細胞で再構成するために、無限増殖性のヒトストロマ細胞系 Lof(11-10)を使用した。しかし、この論述はサイトカインを産生し得るヒト細胞を用いたいかなるマウスの再構成にも一般的に適用されるものと理解されるべきである。実施例実施例１： Lof(11-10) 細胞は in vitro でＣＤ34+ 細胞の増殖を支持するサイトカインを産生する Lof(11-10)は、S.W.Gartner によって記載されているように（クローン化されたＳＶ40初期領域ＤＮＡでのトランスフェクション後にトランスフォームしたヒト骨髄ストロマ由来の細胞系の樹立および特性決定（1984）（Ph.D．論文、Stan ford University））、ＳＶ40ラージＴ抗原（ｐＳＶ３ｇｔ）を含有するプラスミドのトランスフェクションによって、ヒト骨髄から樹立されたヒト無限増殖性のストロマ細胞系である。Lof(11-10)細胞が細胞増殖を支持するために必要とされるサイトカインを産生するかどうかを判定するため、Lof(11-10)細胞をＴ162 組織培養フラスコで10日間増殖させた。その後、逆転写酵素（ＲＴ）依存性ＲＮＡＰＣＲ分析を使用して、Lof(11-10)培養物中のサイトカインｍＲＮＡ転写物の発現を検出した。簡単に述べると、培養したLof(11-10)細胞からＲＮＡzol B ＲＮＡ単離用溶媒（Tel-Test）を使用して、製造元の使用説明書にしたがって、全ＲＮＡを単離した。精製したＲＮＡ 10μgを、5 mMのＭｇＣｌ₂を含む0.1 M の酢酸ナトリウム5 0 μl反応液中で、ＲＮase を含まないＤＮase 100 ユニットとともに、37 ℃で 30分インキュベートし、続いてフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。ＤＮase で処理した 5μg のＲＮＡサンプルを、0.1 mg/mlのランダムプライマーおよび600 ユニットのモロニーマウス白血病ウイルスＲＴ（Bethesda Research Laboratories）を用いたプライマー伸長によって、ｃＤＮＡに変換した。ＲＮＡおよびランダムプライマーを70℃で10分加熱し、続いて氷上で急冷した。その後混合物を、50 mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ 8.3）、40 mM ＫＣｌ、６ mMＭｇＣｌ₂、10 mM ＤＴＴおよび 750μM ｄＮＴＰを含有する40μ lの反応容量中で、37℃で１時間インキュベートした。ＰＣＲ増幅の前に、90℃ で 5分加熱することによって、ＲＴ反応を停止させた。逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換したＤＮase 処理ＲＮＡ、およびしなかったＤＮase 処理ＲＮＡのアリコートを、逆転写ｃＤＮＡ 2μl 、10 mM Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ（ｐＨ 8.3）、50 mM ＫＣｌ、2 mMＭｇＣｌ₂、200 mM ｄＮＴＰおよび Taq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer/Cetus）1.5 ユニットを含有する 50 μ l の反応容量中で28サイクル、0.5 μM の配列特異的プライマーの対を用いて増幅させた。使用した特異的プライマーの対は以下のものである：ＰＣＲプロファイルは、変性、アニーリング、伸張反応のそれぞれについて、 94℃で１分、60℃で１分、および72℃で３分で構成される。このＰＣＲプロファイルの開始前に、サンプルを94℃で３分インキュベートし、28回のＰＣＲサイクルの後に、72℃で20分の最終伸張時間を与えた。増幅生成物を、0.5μg/mlの臭化エチジウムの存在下で 1.2％アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、以下の配列を有する³²Ｐ末端標識オリゴデオキシリボヌクレオチドでプローブした。プローブの配列は、増幅のために使用したプライマーの内部で、これに重複しない領域を示すものとした。ImageQuant ソフトウェア（Molecular Dynamics）を備えたPhosphorlmagerスキャナー（Sunnyvale,CA）を使用して、ナイロン膜から直接ハイブリダイゼーションシグナルを定量した。図１に示す結果は、Lof(11-10)細胞がＣＤ34+ 幹細胞などの細胞の増殖を支持する、ＩＬ-1β、ＩＬ-8、Ｍ−ＣＳＦおよびβ−ＡＣＴＩＮなどのサイトカインを産生することを表している。タンパク質合成阻害剤の存在下では、短命なｍＲＮＡ様ＩＬ-6、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなどとともにその他のサイトカインもまた発現される。ＥＬＩＳＡイムノアッセイを使用して、Lof(11-10)細胞、5637細胞（ヒト膀胱原発ガン）およびＧＣＴ細胞（ヒト線維性組織球腫(histicytoma)）によるサイトカインの発現を定量した。5637およびＧＣＴ細胞系は American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,MD から入手することができる。簡単に述べると、R & D Systems(Minneapolis,MN)のＥＬＩＳＡキットを使用して、製造元の使用説明書にしたがって、培養上清についてサイトカインの測定を実施した。ＥＬＩＳＡの結果を下記表１に示す。実施例２： Lof(11-10) 細胞は in vitro でＣＤ34+ 前駆細胞を支持する最初に、ストロマフィーダー層としてLof(11-10)細胞を使用して、ストロマ依存性の長期骨髄培養を樹立する試みを行なった。しかし、Lof(11-10)細胞の急速な増殖はこれらの培養物から栄養素を枯渇させ、そのため共存培養系中でのＣＤ 34+ 造血前駆細胞の増殖および分化を阻害した。この問題を回避するため、親株の Lof(11-10)培養物からの20％馴化培地を含有する14日目の造血メチルセルロース培養物を、ＣＤ34+ 細胞の増殖ならびにＣＦＵ−Ｍ，ＣＦＵ−ＧおよびＣＦＵ−ＧＭコロニーと名付けた細胞集団への分化を支援するために使用した。in v itro アッセイにおいて標準品を使用して、コロニーの成長を検出した。Lof(11- 10)細胞は、5637またはＧＣＴ細胞系のいずれかから得られた馴化培地と同様に、コロニー形成を支援した（表２および３）。5637およびＧＣＴ系は両者とも、そのトランスフォームした表現型のために腫瘍形成の原因となるので、ＳＣＩＤマウスに使用することができない。Lof(11-10)細胞は無限増殖性の化されており、マウスで腫瘍を形成することはない。実施例３： Lof(11-10) 細胞によるＳＣＩＤマウスの再構成ＳＣＩＤマウスを再構成する目的は、原始ヒトＣＤ34+ 造血細胞が付着するための基体を提供し、またヒトサイトカインの産生によってヒトＣＤ34+ 細胞を養育する微細環境を樹立することであった。ＳＣＩＤマウスを再構成するため、各マウスに200 ラド（非致死量）または 400ラド（致死量）のガンマ線を照射した。その中でＣＤ34+ 細胞が再増殖するための内部空間を提供するためにマウスに放射線を照射した。照射の４時間後に、上記のようにして得られた5×10⁷個のLo f(11-10)細胞をマウスに腹腔内注入（i.p.）した。対照として、Lof(11-10)細胞を含まない Iscove 培地を２匹のＳＣＩＤマウスに注入した。 Lof(11-10)細胞の注入の５−７日後、各マウスに 3〜5 ×10⁵個の精製ヒトＣＤ34+ 細胞または 2〜5 ×10⁵個の精製サルＣＤ34+ 細胞を静脈内（i.v.）注入した。骨髄由来のＣＤ34+ 細胞は、インフォームドコンセントを行なった健康なドナーから、局所麻酔下で後部腸骨稜より得た。簡単に述べると、抗凝血剤としてＥＤＴＡを含有する20 ml 注射器中に骨髄を吸引した。骨髄細胞をＰＢＳで１：２に希釈し、フィコールハイパック密度勾配遠心に供した。間期の単核細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、高親和性ＣＤ34モノクローナル抗体Ｋ6.1を連結させた磁性粒子を使用して、さらに精製した。このモノクローナル抗体Ｋ6.1は、SP-2/ 0-AG14 形質細胞腫細胞（(ATCC)，Rockville,MD）と生きているＫＧ-1a 細胞（A TCC,Rockville,MD）で免疫しておいたBALB/cByJ マウスからの脾細胞（Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME）を融合させることによって製造した。磁気選別の後、細胞から粒子を化学的に解離させて、この細胞をＣＤ34陽性細胞とした（Kirs henbaum ら、J.Immunol.14:1410,1991）。２つの細胞集団の注入の間の時間間隔は、ＣＤ34+ 細胞の導入の前にLof(11-1 0)細胞を移植を可能にするためであった。初めにＳＣＩＤマウスをLof(11-10)細胞で再構成することによって、ＣＤ34+ の造血多能性幹、前駆および血液系列前駆細胞を育成するために必要なヒトサイトカインが供給された。その上、Lof(11 -10)細胞は再構成中のＣＤ34+ 細胞にとっての細胞の“ホーミング”および初期の付着（１−10日目）のための基体として作用した。最初の実験において、ＳＣＩＤマウスを 400ラドで照射した。Lof(11-10)細胞を含まない培地を注入したマウス（ｎ＝２）は７日目に死亡したが、lof(11-10) 細胞を注入されたマウス（ｎ＝５）は照射後50日目まで生存した（図２参照）。このことは、Lof(11-10)細胞がマウスを再構成し、マウスを致死量の放射線照射から一時的に保護した結果、マウスの生存が６倍に増加したことを示唆している。ＳＣＩＤマウス中のLof(11-10)細胞の存在は、ＤＮＡＰＣＲを使用して確認した。簡単に述べると、対照またはLof(11-10)細胞を注入したマウスの脾臓および骨髄の両方からＤＮＡを精製した。アリコート（1μg）を、10 mM Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ（ｐＨ 8.3）、50 mM ＫＣｌ、２ mMＭｇＣｌ₂、200 mM ｄＮＴＰおよびT aq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer/Cetus）1.5 ユニットを含有する 50 μl の反応容量中で28サイクル、Ｔ−抗原またはマウスリボソーム 28S遺伝子に対する0.5 μM の配列特異的プライマー対によって増幅させた。使用した特異的プライマー対は以下のものである：ＰＣＲプロファイルは、変性、アニーリング、伸張反応のそれぞれについて、 94℃で１分、60℃で１分、および72℃で３分で構成される。増幅生成物を、0.5μg/mlの臭化エチジウムの存在下で 1.2％アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、それぞれＴ−抗原またはマウス 28S遺伝子に対する、³²Ｐ末端標識オリゴデオキシリボヌクレオチドでプローブした。使用したプローブは以下のものである：プローブの配列は、増幅のために使用したプライマーの内部でこれに重複しない領域を示すものとした。ImageQuant ソフトウェア（Molecular Dynamics）を備えた Phosphorlmager スキャナー（Sunnyvale,CA）を使用して、ナイロン膜から直接ハイブリダイゼーションシグナルを定量した。このＤＮＡＰＣＲ実験の結果を図３に示す。循環ヒトＩＬ-6の存在は、Lof(11-10)細胞が機能してそれらが保持するヒトサイトカインを発現していることを表している。ヒトＩＬ-6の測定は、動物の血液から得られた血漿について、ＥＬＩＳＡ分析によって行なった（表４）。注入されたLof(11-10)細胞から発現されたヒトサイトカインが循環しており、これが静脈内注入されたヒトＣＤ34+ 細胞の移植を支持する能力があることの別の証拠が、メチルセルロースコロニー形成によって測定される、マウスの骨髄前駆細胞に対するこれらの影響によって示される（表５）。放射線照射はメチルセルロースアッセイにおけるコロニーの数を減少させるが、Lof(11-10)細胞を接種された動物は放射線照射されてもコロニー形成の回復を示し、Lof(11-10)細胞が、マウスの前駆細胞 P20への放射線照射の悪影響を逆転させることができる放射線保護性のサイトカインを発現していることを示唆している。 Lof(11-10)細胞がヒトおよび霊長類のＣＤ34+ 細胞を支持することの究極の証明は、この動物への二次的な静脈内注射の結果、３週間後にマウス骨髄内にＣＤ 34+ が存在するようになるという事実から得られる（図４）。ＳＣＩＤマウスの脾臓および骨髄コンパートメントについて、Lof(11-10)またはＣＤ34+ の移植がこれらのコンパートメント内で生じたかどうかを分析した。被照射マウスに腹腔内注入したLof(11-10)細胞が脾臓に移動したことがわかった（図３）。このマウスの骨髄内で検出されたＣＤ34+ 細胞は、これらがクラス２陽性で、逆転写酵素依存性ＲＮＡＰＣＲによって、ＨＬＡ−ＤＲアルファ転写物を発現するという事実によって示されたように、ヒトＣＤ34+ 由来であった。Lof(11-1 0)細胞はクラス１陽性であるがクラス２陰性である。骨髄中で観察されたＰＣＲシグナルがＣＤ34+ 由来のものであることの別の証拠は、これらの調製物中にＤＮＡ−ＰＣＲによってＳＶ40Ｔ抗原が検出されなかったことから得られる。逆転写酵素依存性ＲＮＡＰＣＲを使用して、各種の細胞表面受容体の発現に続いて、骨髄内でのＣＤ34+ 細胞の分化の状態がさらに特性決定されるであろう。＊＊＊＊＊これまでに示したすべての刊行物はその全部を参照として本明細書中に取り込まれている。上述の発明を明確にし、そして理解する目的でかなり詳細に記載してきたが、当業者がこの開示を読むことによって、この発明の真の範囲から離れることなく、形式および詳細の各種の変更をすることができるものと認められよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人ラルッサ，ヴァンスアメリカ合衆国 21045 メリーランド州, コロンビア，リトルフォックスイズラン 6125 (71)出願人ホール，エリックアメリカ合衆国 09835−0007 エイイー, エフピーオー，ボックス 106，ピーエスシー 452，ナムル−３ (71)出願人コーシャル，スメシュアメリカ合衆国 20832 メリーランド州, オルネイ，フィドルリーフテラス 18603 (72)発明者モスカ，ジョセフ，ディー. アメリカ合衆国 21042 メリーランド州, エリコットシティー，ブルーバローライド 4201 (72)発明者ガートナー，スザンヌアメリカ合衆国 20878 メリーランド州, ノースポトマック，エヴァーメイコート 12305 (72)発明者ケスラー，スティーブンアメリカ合衆国 94002 カリフォルニア州，ベルモント，ヴァレービューアベニュー 1713 (72)発明者ラルッサ，ヴァンスアメリカ合衆国 21045 メリーランド州, コロンビア，リトルフォックスイズラン 6125 (72)発明者ホール，エリックアメリカ合衆国 09835−0007 エイイー, エフピーオー，ボックス 106，ピーエスシー 452，ナムル−３ (72)発明者コーシャル，スメシュアメリカ合衆国 20832 メリーランド州, オルネイ，フィドルリーフテラス 18603

Claims

【特許請求の範囲】１．i）致死量または非致死量の放射線をマウスに照射する工程と、 ii）被照射マウスに無限増殖性のヒトまたは非ヒト霊長類の骨髄ストロマ細胞を投与する工程と、 iii）被照射マウスに精製したヒトまたは非ヒト霊長類の幹細胞を投与する工程と、を含む、マウスへのヒトまたは非ヒト霊長類の幹細胞の移植方法。２．無限増殖性の骨髄ストロマ細胞および精製幹細胞を、同時にまたは順次投与する、請求項１記載の方法。３．最初に該無限増殖性の骨髄ストロマ細胞を投与し、次に該精製幹細胞を投与する工程を含む、請求項２記載の方法。４．該無限増殖性の骨髄ストロマ細胞の投与の約10日後に、該精製幹細胞を投与する、請求項３記載の方法。５．該無限増殖性の骨髄ストロマ細胞の投与の２−７日後に、該精製幹細胞を投与する、請求項４記載の方法。６．無限増殖性の骨髄ストロマ細胞を腹腔内注入によって投与する、請求項１記載の方法。７．精製幹細胞を静脈内注入によって投与する、請求項１記載の方法。８．精製幹細胞が精製ＣＤ34+ 幹細胞である、請求項１記載の方法。９．マウスが免疫抑制される、請求項１記載の方法。 10．マウスがＳＣＩＤマウスである、請求項９記載の方法。 11．無限増殖性の骨髄ストロマ細胞がＳＶ40ラージＴ抗原でトランスフェクションされている、請求項１記載の方法。 12．無限増殖性の骨髄ストロマ細胞がLof(11-10)細胞である、請求項11記載の方法。 13．i）致死量または非致死量の放射線を第１および第２のマウスに照射する工程と、 ii）被照射マウスに、ＣＤ34+ 幹細胞の増殖を支持するサイトカインを発現する、無限増殖性のヒトまたは非ヒト霊長類の骨髄ストロマ細胞を投与する工程と、 iii）提案された治療用遺伝子セグメントを第１グループのヒトＣＤ34+ 幹細胞中に導入する工程と、 iv）この遺伝子セグメントを発現する第１グループのＣＤ34+ 幹細胞からの細胞を精製する工程と、 v）対照遺伝子セグメントを第２グループのヒトＣＤ34+ 幹細胞中に導入する工程と、 vi）工程(iv)の精製細胞を第１の被照射マウスに投与し、工程(v)の細胞を第２の被照射マウスに投与する工程と、 vii）第１および第２の被照射マウスをレトロウイルスでチャレンジする工程と、そして、 viii）第１および第２のマウスからのヒトＣＤ34+ 幹細胞の生存を比較する工程と、を含む、レトロウイルスに対する遺伝子治療プロトコルの有効性を試験する方法。 14．レトロウイルスがＨＩＶである、請求項13記載の方法。 15．第１および第２のマウスがＳＣＩＤマウスである、請求項13記載の方法。 16．無限増殖性のヒトまたは非ヒト霊長類の骨髄ストロマ細胞の存在下で、ヒトまたは非ヒト霊長類のＣＤ34+ 幹細胞が移植された齧歯類からなる、ヒトの造血の研究のための動物モデル。 17．齧歯類がマウスである、請求項16記載の動物モデル。 18．マウスが免疫抑制されている、請求項17記載の動物モデル。 19．マウスがＳＣＩＤマウスである、請求項18記載の動物モデル。 20．無限増殖性の骨髄ストロマ細胞がＳＶ40ラージＴ抗原でトランスフェクションされている、請求項16記載の動物モデル。 21．無限増殖性の骨髄ストロマ細胞がLof(11-10)細胞である、請求項20記載の動物モデル。