JPH10510240A - 老化の不都合な影響を改善するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 カイネチンを含めた６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが、哺乳動物細胞の成長速度または全増殖能を有意に高めることなく、普通は哺乳動物細胞の老化に伴って起こる形態学的変化を遅延させることにより、哺乳動物細胞に対して老化が及ぼす不都合な影響を改善しうることが見出された。従って、培養およびインビボにおける細胞に対して老化が及ぼす不都合な影響に対抗する方法であって、それらの細胞に老化が及ぼす不都合な影響を改善する量のカイネチンまたは他の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを投与することよりなる方法が提供される。その方法を実施するための組成物も提供される。本発明の好ましい用途には、培養における哺乳動物細胞の健康の維持、ならびにカイネチンを含有するローション、軟膏またはクリームをヒトの皮膚に適用することにより、皮膚の健康および若さを維持することが含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】 老化の不都合な影響を改善するための方法および組成物 技術分野 本発明は、哺乳動物細胞において細胞の成長速度または全増殖能（ｔｏｔａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｃａｐａｃｉｔｙ）を高めることなく老化の不 都合な影響を改善するための方法および組成物に関するものである。 より詳細には、本発明は培養またはインビボにおけるヒトの皮膚の細胞を含め た哺乳動物細胞に対して老化が及ぼす不都合な影響に対抗するために、既知の化 合物であるカイネチン、および他の６−（置換アミノ）プリン系サイトカインを 使用する方法、ならびにそれらの方法を実施するための組成物に関するものであ る。 発明の背景 細胞の老化過程を阻止することは、とらえ所がないが、生物科学の永続的な目 標である。老化過程を阻止することは、多数の重要な実際上の結果を伴うであろ う。たとえば細胞が若い細胞の特性を保持するならば、培養細胞による有用な産 物の産生が改善されるであろう。またヒトの皮膚その他の器官における細胞の老 仕を阻上することは、それに伴って構造および機能の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔ ｙ）が保存されるので、著しく有用であろう。皮膚の場合、細胞老化の不都合な 影響を改善することによって、美的完全性も有利に保存されるであろう。 若い細胞と老化した細胞とを区別する多数の属性が確認されている。たとえば 若い哺乳動物細胞−−ヒトの線維芽細胞を含む−−は標準培養において健康かつ 清浄に見え；規則的で長く、薄い紡錘形の形態をもち；培養基質上でコンフルエ ントになるのに伴い並列して密に充填され；互いに重なり合って増殖することが なく；１個以外の核をもつことは稀であり；かつ培地中に細胞屑を生じることは ほとんどない。これに対し老いた線維芽細胞は多数の老化関連症候、たとえば偏 平で不規則な形態、異常に大きな大きさ、希薄な増殖、培養基質の単位面積当た り低い細胞収率、有意頻度の多核細胞、トリプシン処理が困難なこと、および培 地中における細胞屑の生成速度が高いことなどを示す。若い細胞を老いた細胞か ら区別する特徴的な形態、および老いた細胞に見られる高水準の自己蛍光は、若 い細胞を老いた細胞と区別する種々の生理学的および生化学的特徴を反映してお り、これには成長因子への依存度が高いことならびに若い細胞におけるＤＮＡお よび蛋白質合成の速度が高いことが含まれる。 若い細胞を老いた細胞と区別する形態学的、生理学的および生化学的特徴は、 大部分が培養におけるヒトを含めた哺乳動物の細胞（通常は線維芽細胞）の研究 から確認されたものである。これらの研究において培養細胞の″年齢″は、初代 培養（組織から調製したもの）から、この初代培養に由来する、またはその子孫 である当該培養までに起こった細胞数倍増の回数により測定される。 しかし培養細胞の研究において見出された、若い細胞を老いた細胞と区別する 特徴は、生存哺乳動物においてインビボで見られる細胞にも該当し、これらの細 胞は培養線維芽細胞と多くの特徴、たとえば類似の生化学的特徴および厳重な成 長制御（すなわち厳重な増殖制御）を共有する。皮膚の真皮層（ｄｅｒｍｉｓ） および胃腸管内壁の上皮の下にある結合組織層の線維芽細胞は、培養における線 維芽細胞に見られるものと類似する老化の特徴を示す細胞の例である。 普通は厳重な増殖制御下で定期的に分裂する、生存哺乳動物の組織内にあるこ のような線維芽細胞の″年齢″の尺度は、これらの細胞とその哺乳動物のほぼ誕 生の時点におけるそれらの祖先との間で起こった細胞分裂の回数である。細胞分 裂は定期的に起こるので、一般にその哺乳動物の暦年齢、および細胞と誕生時の それらの祖先との間の細胞分裂により測定したその細胞の年齢の間には、相関関 係がある。 培養における線維芽細胞の他の特徴は、細胞の″全増殖能″である。これは培 養体がそれの″老化した″細胞の死（成長および分裂の停止）のため培養体の成 長が停止するまでに培養体が行いうる細胞数倍増の全回数により測定される。ヒ ト線維芽細胞培養体に関しては、この全増殖能は一般に初代培養につき倍増回数 約４５−６０である。当技術分野で理解されているように、培養体の成長の停止 は極めて速やかに起こると思われ、成長速度（倍増時間の逆数により判定）は若 い細胞に特徴的なほぼ正常値からわずか数回の倍増でゼロにまで低下する。正常 な線維芽細胞、すなわち細胞が不死または″癌化″状態にトランスフォームされ ていないものの培養においては、″全増殖能″はそれが由来する初代培養から培 養体を隔てる倍増回数の関数として低下する。正常な培養細胞の″全増殖能″に 関連する他の用語は、細胞の″寿命（ｌｉｆｅ ｅｘｐｅｃｔａｎｃｙ，ｌｉｆ ｅ ｓｐａｎ）″である。正常細胞の″寿命″はそれらの細胞が存在する培養体 が由来する初代培養の″全増殖能″である。 正常な線維芽細胞、特にヒト由来のものが培養において狭い範囲に制限された （数回以内の倍増）全増殖能をもつという事実は、それらの細胞が置かれている 厳重な増殖制御を明示するものである。正常な状態では全増殖能が制限されてい る細胞が、時にトランスフォームしてこの制限を失う場合がある。このような細 胞の培養体は、時には継代に対する明らかな制限なしに反復継代することができ る。このような細胞は不死であると言われる。不死は癌細胞の特徴である。癌細 胞はほとんど、または全く増殖制御されない。 生存哺乳動物のインビボにおける細胞、たとえば皮膚の真皮および腸管上皮の 下にある結合組織層の線維芽細胞の全増殖能の測定は、特定の倍増回数に関して その哺乳動物種に特徴的な狭い範囲に制限されている（たとえば上記のようにヒ トに関しては４５−６０回；ネズミに関しては約１０回）培養状態の線維芽細胞 の場合のように簡単には測定できない。しかし生存哺乳動物におけるこれらの細 胞は、細胞が正常である場合は分裂する能力が制限されており、厳重な増殖制御 下にあることは明らかである。 たとえは成人の真皮からの正常細胞を用いて樹立された初代培養における線維 芽細胞は、ヒトの胎児または新生児からの正常細胞を用いて樹立された初代培養 における線維芽細胞より全増殖能が低いことが知られている。事実、多数のヒト 供与体に関する研究から、正常な真皮層細胞を用いて樹立された初代培養におけ る線維芽細胞は、培養において供与体の年齢に反比例した全増殖能をもつことが 明らかである。 不死または″癌化″状態にトランスフォームされた培養細胞に特徴的な全増殖 能制限喪失に伴って、しばしば増殖速度−−これを本明細書においては″成長速 度″と呼ぶ−−が異常に上昇する。増殖速度、すなわち成長速度は、細胞が分裂 する速度の尺度である。 同様に、インビホにおける癌細胞を特徴づける厳重な増殖制限喪失に伴って、 しばしば細胞の成長速度が異常に上昇する。 インビボにおいて老化する細胞の″若い″表現型を保存する従来の試みに際し ては、常に細胞の成長速度が上昇した。ところが細胞の成長速度の上昇−−これ は必然的に細胞分裂の速度を上昇させる−−は、細胞が不死または癌化状態にト ランスフォームする危険性を増大させることが認められた。 同様に培養細胞の全増殖能をその正常な限界を越えて人為的に高める処理は、 不死または癌化状態へのトランスフォーメーションの危険性を増大させることが 認められた。 細胞の厳重な増殖制限に干渉することにより、または成長速度もしくは全増殖 能に対する制限もしくは両者に干渉することによりトランスフォーメーションを 引き起こす危険性は、恐らく遺伝子発現の制御に関する細胞のゲノムまたは生化 学的メカニズムに対してこれらの干渉が及ぼす作用によるものであろう。 さらに少なくとも培養細胞に関しては、成長速度または全増殖能を高める処理 、たとえば上皮および血小板由来の成長因子、インシュリン、グルココルチコイ ド、朝鮮人参（オタネニンジン、Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）エキス、および ジベレリン植物ホルモンは、一般に処理がほとんど必要ない″若い″細胞のみの ″若い″表現型の保存に有効である。それらの正常な寿命の少なくとも約８０− ９０％を終えた″老いた″細胞は、これらの物質を高濃度で（それらの寿命の約 半分以下を終えた″若い″細胞について有効な濃度よりはるかに高い）用いたと してもほとんど（たとえ反応した場合でも）反応しない。 インビボまたはインビトロで老化が細胞に及ぼす不都合な作用を改善するため に用いられる、また細胞の成長速度または全増殖能を高める組成物はいずれも、 正常な状態では厳重な増殖制御下にある細胞を含む組織（すなわち皮膚、腸管壁 ）に対してその組成物を用いる限りは少なくとも慎重に考慮されなければならな い。 本発明以前には、細胞の成長速度または全増殖能を有害なほど高める可能性な しに、形態学的、生理学的および生化学的特性に対して老化が及ぼす不都合な作 用を改善する組成物は得られていない。 本発明にとって、特にヒトの皮膚の真皮における、ならびに他の哺乳動物の外 皮およびヒトその他の動物の胃腸管内壁の上皮の下にある対応する結合組織層に おける線維芽細胞の役割を理解することが適切である。線維芽細胞は、皮膚の構 造的、機能的および美的完全性、ならびに上皮で覆われたこれら以外の表面組織 の構造的、機能的および美的完全性の維持に必要な多数の成分を合成する。これ らの成分には下記のものが含まれる：コラーゲンおよびエラスチン、これらは皮 膚および他の表面組織の三次元構造に関与する線維性蛋白質である；フィブロネ クチン、すなわち細胞の固定および細胞形態の維持に関与する蛋白質；ならびに 上皮および基底細胞層ならびにそれらの下にある結合組織層の維持に必須である 多数の蛋白性成長因子。皮膚その他の表面組織の健康の維持において線維芽細胞 による蛋白質合成が重要な役割を果たしているので、また得られた証拠が線維芽 細胞の蛋白質生合成活性は年齢と共に著しく低下することを示しているので（た とえば培養状態の胎児由来ヒト線維芽細胞の寿命の約７０％の時点におけるコラ ーゲン合成速度は、寿命の２０％以下の時点におけるそれらの線維芽細胞の合成 速度の約５０％にすぎない）、それらの線維芽細胞の全増殖能または成長速度に 影響を及ぼすことなく、蛋白質合成に対する老化の不都合な作用を改善する方法 および組成物は特に有利であろう。 本発明は、式Ｉ： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素４、５もしくは６個のｎ −アルキル、（シクロヘキシル）メチル、３，３−ジメチルアリルまたは３−ヒ ドロキシメチル−３−メチルアリルである）の６−（置換アミノ）プリンサイト カイニン−−カイネチンおよびその６−アミノプリン同族体を含む−−に関する ものである。 サイトカイニンは、オーキシン（他の群の植物ホルモン）ならびにビタミン、 無機塩類および糖を含有する標準培地中で植物組織の外植体における細胞分裂を 促進するそれらの能力により規定される１群の植物ホルモンである。 サイトカイニン、特にカイネチン（６−フルフリル−アミノプリン）、ゼアチ ン（６−（３−ヒドロキシメチル−３−メチルアリル）−アミノプリン）、また は６−（３，３−ジメチルアリル）−アミノプリン）が塩基部分であるリボヌク レオチドは特定の植物および動物細胞においてある種類のトランスファ−ＲＮＡ の成分として同定された。 カイネチンはコムギ胚芽抽出物の特定のＲＮＡ結合性蛋白質とコンプレックス を形成することが知られており、植物において蛋白質合成を促進することが示唆 されている。スピリンおよびアジュコーツィン（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａｊｔｋｈｏｚ ｈｉｎ），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９８５年４月， ｐ．１６２。 さらにカイネチンは、カイネチンを培地に添加する通常の培養法によって、蛋 白質に富む酵母の調製に用いられている。東ドイツ特許第１４８，８８９号明細 書（１９８１）（ダーウェント・ワールド・パテント・インデックス・アブスト ラクト）。カイネチンは微生物培養の成長を増進させることも報告されている。 Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，第１０版，見出し５１４８（メルク・アンド・コ，米 国ニュージャージ々州ローウェイ、１９８３）。 最後に特開昭６０−１９７０９号公報（１９８５年）には、１％を越えないカ イネチンおよび２０％を越えない未解明の紫根エキスからなる組成物が示され、 これはヒトの皮膚における細胞分裂を促進し、これにより皮膚の老化を防止する と述べられている。 発明の概要 意外にも哺乳動物細胞を種々の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンに 暴露すると、普通は細胞の老化に伴って起こる年齢に関連した形態学的変化の開 始を遅延させ、さらには逆行させることにより、それらの細胞に対して老化が及 ぼす不都合な作用を改善すること、およびこの暴露は細胞の成長速度または全増 殖能を高めることなしにこの改善効果を及ぼすことが、今回見出された。 この知見に基づいて、培養およびインビボ、たとえばヒトの皮膚における細胞 を含めた哺乳動物細胞に対して老化が及ぼす不都合な作用を改善−−逆行を含む −−するための新規な組成物および方法が提供される。 たとえば本方法および組成物は特に、普通は老化を伴うヒトの皮膚の構造的、 機能的および美的完全性の劣化を遅延および逆行させる用途に有用である。 先に述べたように、哺乳動物細胞の生化学的、生理学的または形態学的特性に 対して老化が及ぼす不都合な作用を改善するためにこれまで用いられた組成物は すべて、細胞の成長速度または全増殖能をも、望ましくないほど高める。 発明の詳細な記述 １観点においては、本発明は哺乳動物細胞に対して老化が及ぼす不都合な作用 を改善する方法であって、該細胞にそれらの細胞に対する不都合な作用を改善す るのに有効な濃度のサイトカイニン、すなわち６−（置換アミノ）プリンを含む 組成物を投与することよりなる方法に関するものである。 他の観点においては、本発明は哺乳動物細胞に対して老化が及ぼす不都合な作 用を改善する組成物であって、それらの細胞に対する不都合な作用を改善するの に有効な濃度のサイトカイニン、すなわち６−（置換アミノ）プリンを含む組成 物に関するものである。 本発明の方法および組成物において老化が及ぼす不都合な作用を改善するのに 有効な化合物として使用しうる６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンには 、カイネチン、ゼアチン、６−（３，３−ジメチルアリル）アミノプリン、６− （ベンジル）アミノプリン、６−（フェニル）アミノプリン、６−（ｎ−アルキ ル）アミノプリン（ここでｎ−アルキル基は４、５または６個の炭素原子を含む ）、 および６−（シクロヘキシル）メチルアミノプリンが含まれる。極めて好ましい ものはカイネチン（６−（フルフリル）アミノプリン）である。 本発明の方法および組成物により処置しうる哺乳動物細胞には、ヒト細胞、な らびに培養細胞および生存動物におけるインビボ細胞が含まれる。 細胞は、培養の場合いかなる組織に由来するものであってもよく、インビポの 場合いかなる組織の部分であってもよい。本発明の方法および組成物は、好まし くはヒトのインビボにおける組織内の線維芽細胞、たとえばヒトの皮膚の真皮、 およびヒトの小腸または胃の内壁の上皮の下にある結合組織層の線維芽細胞につ き適用される。極めて好ましい用途はヒトの皮膚の細胞に対するものである。 従って本発明はさらに、老化に普通に伴う皮膚および胃腸管内壁上皮の構造的 および機能的完全性ならびに皮膚の美的完全性の崩壊を遅延（または逆行）させ るための方法およびそれを実施するための組成物に関するものである。 本発明の方法および組成物は、意外にも有利なほど低い６−（置換アミノ）プ リン系サイトカイニン濃度で有効である。濃度は一般に組織培養培地中において １０^-6−５×１０^-4Ｍである。これらの濃度においてサイトカイニンは明らかに 哺乳動物細胞に対して毒作用をもたない。 意外にも、また特に有利には、本発明方法は本方法により処置された細胞の成 長速度または全増殖能に有意の影響を及ぼすことがない。本発明の方法および組 成物は、処置された細胞におけるＤＮＡ合成の速度または量に影響を及ぼさない 。老化する細胞の″若い″表現型を保存または再生するための他の組成物とは異 なり、本発明の組成物および方法はインビボでの多くの細胞、たとえば表皮およ び他の上皮の線維芽細胞および特定の細胞が正常に機能するために維持しなけれ ばならない厳重な増殖制御に影響を及ぼさない。 哺乳動物細胞に対して″老化が及ぼす不都合な作用を改善する″とは、培養ま たはインビボにおける正常な哺乳動物細胞において″老化″に伴って普通に起こ る前記の形態学的変化の発現を遅延または逆行させることを意味する。 本発明方法を実施するに際して哺乳動物細胞が暴露される組成物が、細胞に対 して老化が及ぼす不都合な作用を改善するのに有効な量の６−（置換アミノ）プ リン系サイトカイニンを含有するか否かは、当業者が確認しうる。老化に伴う形 態学的変化は、培養物から取り出した細胞、組織から生検により採取した細胞な どの鏡検によって当業者が容易に認識しうる。 培養における哺乳動物細胞は遺伝子工学的処理を行うことなく組織から直接に 、増殖させてもよく、または目的産物を産生させるために既知の各種遺伝子工学 的技術のいずれかにより遺伝学的に修飾されてもよく、また当技術分野で理解さ れているように診断、治療その他の用途に用いる有用な蛋白質、たとえばリンホ カインまたはホルモンを製造するために利用しうるが、これらの場合、老化が及 ぼす不都合な作用を本発明の組成物および方法により改善することによって、細 胞はそれらの細胞の実際の状態より″若い“状態に有利に維持される。実際に、 多数回継代培養され、老化細胞に特徴的な形態学的特徴を呈している哺乳動物細 胞の培地に有効量の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを添加すると、 それらの形態学的特徴がより若い細胞のものへ逆行する。 インビボにおける哺乳動物細胞、たとえばヒトの皮膚の真皮または胃腸管内壁 の上皮の下にある結合組織層の線維芽細胞の機能的完全性を保存し、または老化 が及ぼす不都合な作用を逆行させる場合にはその完全性を改善するに際して、特 にヒトの皮膚の美的完全性を保存するに際して、本発明の組成物および方法がも たらす利点は明らかであり、先に述べたとおりである。 本発明組成物は、老化が及ぼす不都合な作用を改善するのに有効な量の６−（ 置換アミノ）プリン系サイトカイニンを本発明により投与する細胞の性質および その環境に応じて、多数の形態のうちのいずれかをとることができる。 培地に装入または懸濁した培養細胞については、本発明組成物は約１０^-6Ｍ（ すなわち１μＭ）−約５×１０^-4Ｍの６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニ ンを補充した哺乳動物細胞用培地である。式Ｉの好ましいサイトカイニン： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素４、５もしくは６個のｎ −アルキル、（シクロヘキシル）メチル（−ＣＨ₂（Ｃ₆Ｈ₁₁））、３−ヒドロキ ＣＨ₂ＯＨ シメチル−３−メチルアリル（−ＣＨ₂ＣＨ＝Ｃ ）または３，３−ジ ＣＨ₃ メチルアリル（−ＣＨ₂ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ₃）₂）である）については、培地中の濃 度範囲は０．２−１００ｐｐｍである。極めて好ましいサイトカイニンであるカ イネチンについては、好ましい濃度範囲は培地中において約２５−約２５０μＭ （すなわち約５−約５０ｐｐｍ）である。 培養細胞の場合、老化が及ぼす不都合な作用を改善するのに有効な量の６−（ 置換アミノ）プリン系サイトカイニンを投与する本発明方法は、本発明組成物で ある培地に細胞を単に装入、増殖させることにより実施しうる。 本発明方法は、インビボにおける哺乳動物細胞、たとえばヒトの皮膚の真皮ま たはヒトの胃腸管内壁の上皮の下にある結合組織層の線維芽細胞（または他の活 性細胞、たとえばケラチン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ））については、そ れらの細胞を老化が及ぼす不都合な作用を改善するのに有効な量の６−（置換ア ミノ）プリン系サイトカイニンに暴露することにより実施される。 一般にこれらの暴露は、本発明では老化が細胞に及ぼす不都合な作用を改善す るために望まれる期間にわたって定期的に反復されるであろう。暴露の頻度は下 記に依存する：関与する細胞、細胞が位置する場所（たとえば６−（置換アミノ ）プリン系サイトカイニンを含有しない組成物による反復フラッシが起こる胃腸 管内の細胞は皮膚の細胞より頻繁な暴露を必要とする）、ならびに活性細胞、た とえば結合組織層の線維芽細胞に対して老化が及ぼす不都合な作用を改善するの に有効な濃度において結合組織層（胃腸管内壁の上皮の下にある）へ透過するた めに有効な濃度範囲（一般に約１０−約１０００ｐｐｍ）の６−（置換アミノ） プリン系サイトカイニンの濃度。 胃腸管内壁の上皮の下にある結合組織層については、本発明方法は下記により 実施される：経口用として生理学的に許容しうるものであり、胃腸管内壁の上皮 の下にある結合組織層を透過するのに有効な濃度範囲（一般に約１０−約１００ ０ｐｐｍ）の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを含む液剤、懸濁剤ま たはトニックである本発明組成物を、該結合組織層内の活性細胞、たとえば線維 芽細胞に対して老化が及ぼす不都合な作用を改善するのに有効な濃度になるまで 摂取させる。 ヒトの皮膚の線維芽細胞（または他の活性細胞、たとえばケラチン細胞）につ いては、本発明方法は下記により実施される：皮膚の外表に適用するものとして 生理学的に許容しうるものであり、適切なビヒクル中における有効な濃度、すな わち皮膚の真皮を透過するのに有効な濃度の６−（置換アミノ）プリン系サイト カイニンを含むクリーム、軟膏、ローション、ゲル剤、液剤、香水、固形剤など である本発明組成物を、該真皮内の活性細胞（たとえば線維芽細胞）に対して老 化が及ぼす不都合な作用を改善するのに有効な濃度において適用する。 ヒトの皮膚につき使用するための本発明組成物は、６−（置換アミノ）プリン 系サイトカイニン、好ましくは前記式Ｉのいずれかを有効な濃度範囲、一般に約 ０．５−約５００ｐｐｍにおいて、クリーム、軟膏、ローション、ゲル剤、液剤 もしくは固形基剤または当技術分野で無毒性であることが知られており、かつ皮 膚科学的に許容しうるビヒクル中に用いて調製される。ヒトの皮膚につき用いる ための本発明組成物中に溶解、懸濁、分散などされる６−（置換アミノ）プリン 系サイトカイニンの濃度（または重量分率）は、皮膚の活性細胞、たとえば線維 芽細胞に約０．２−約１００ｐｐｍにおいて付与される濃度であろう。一般に皮 膚を水和するのを補助する皮膚軟化性または潤滑性ビヒクルの方が、皮膚を乾燥 させる揮発性ビヒクル、たとえばエタノールより好ましい。 ヒトの皮膚につき用いるための本発明組成物を調製するのに適した基剤または ビヒクルの例は、ペトロラタム、ペトロラタム＋揮発性シリコーン、ラノリン、 コールドクリーム（米国薬局方）、および親水軟膏（米国薬局方）である。好ま しい本発明組成物は約１０−約１００ｐｐｍのカイネチンを適切な軟膏またはク リームの基剤と共に含有する。 許容しうるビヒクルの選択は、６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを 投与する方法によって大部分が決定される。それらの方法には局所投与が含まれ る。局所投与に適した薬剤学的および皮膚科学的に許容しうるビヒクルには、ロ ーション、クリーム、液剤、ゲル剤、テープなどに用いるのに適したものが含ま れる。一般にビヒクルは有機性のものまたは水性エマルジョンであり、６−（置 換アミノ）プリン系サイトカイニンをそれに分散、懸濁または溶解しうるもので ある。ビヒクルには薬剤学的に許容しうる皮膚軟化剤、皮膚浸透促進剤、着色剤 、香料、乳化剤、増粘剤および溶剤が含まれてもよい。それらの形態についての 詳細をさらに以下に示す： １．ローション ローションは、有効量の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニン（皮膚の 活性細胞、たとえば線維芽細胞に約０．２−約１００ｐｐｍの６−（置換アミノ ）プリン系サイトカイニンを付与するのに有効な量）；１−５０％、好ましくは ３−１５％の皮膚軟化剤からなり；残部は水、Ｃ₂もしくはＣ₃アルコール、また は水とアルコールの混合物である。数種の皮膚軟化剤が知られている。それらの 皮膚軟化剤は下記のものである： ａ．炭化水素系油およびろう。その例は鉱油、ペトロラタム、パラフィン、セ レシン、オゾケライト、微晶ろう、ポリエチレンおよびパーヒドロスクアレンで ある。 ｂ．シリコーン油、たとえばジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシ ロキサン、水溶性およびアルコール可溶性のシリコーン−グリコールコポリマー 。 ｃ．トリグリセリド系油脂、たとえば植物、動物および海洋源から得られるも の。その例にはヒマシ油、紅花油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、タラ 肝油、アーモンド油、アボカド油、パーム油、ゴマ油、および大豆油が含まれる （ただしこれらに限定されない）。 ｄ．アセトグリセリドエステル、たとえばアセチル化モノグリセリド。 ｅ．エトキシル化グリセリド、たとえばエトキシル化グリセリルモノステアレ ート。 ｆ．１０−２０個の炭素原子を含む脂肪酸のアルキルエステル。本発明におい ては脂肪酸のメチル、イソプロピルおよびブチルエステルが有用である。その例 には下記のものが含まれる（ただしこれらに限定されない）：ヘキシルラウレー ト、イソヘキシルラウレート、イソヘキシルパルミテート、イソプロピルパルミ テート、イソプロピルミリステート、デシルオレエート、イソデシルオレエート 、ヘキサデシルステアレート、デシルステアレート、イソプロピルイソステアレ ート、ジイソプロピルアジペート、ジイソヘキシルアジペート、ジヘキシルデシ ルアジペート、ジイソプロピルセバケート、ラウリルラクテート、ミリスチルラ クテートおよびセチルラクテート。 ｇ．１０−２０個の炭素原子を含む脂肪酸のアルケニルエステル。その例には 下記のものが含まれる（ただしこれらに限定されない）：オレイルミリステート 、オレイルステアレートおよびオレイルオレエート。 ｈ．９−２２個の炭素原子を含む脂肪酸。適切な例には下記のものが含まれる （ただしこれらに限定されない）：ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、 パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸、オ レイン酸、リノレイン酸、リシノール酸、アラキドン酸、ベヘン酸およびエルカ 酸。 ｉ．１０−２２個の炭素原子を含む脂肪アルコール。ラウリル、ミリスチル、 セチル、ヘキサデシル、ステアリル、イソステアリル、ヒドロキシステアリル、 オレイル、リシノレイル、ベヘニル、エルシルおよび２−オクチルドデシルアル コールが満足すべき脂肪アルコールの例である。 ｊ．脂肪アルコールエーテル。１０−２０個の炭素原子を含むエトキシル化脂 肪アルコールには、１−５０個のエチレンオキシド基もしくは１−５０個のプロ ピレンオキシド基またはそれらの混合物が結合したラウリル、セチル、ステアリ ル、イソステアリル、オレイルおよびコレステロールアルコールが含まれる（た だしこれらに限定されない）。 ｋ．エーテルエステル、たとえばエトキシル化脂肪アルコールの脂肪酸エステ ル。 ｌ．ラノリンおよび誘導体。ラノリン、ラノリン油、ラノリンろう、ラノリン アルコール、ラノリン脂肪酸、イソプロピルラノレート、エトキシル化ラノリン 、エトキシル化ラノリンアルコール、エトキシル化コレステロール、プロポキシ ル化ラノリンアルコール、アセチル化ラノリン、アセチル化ラノリンアルコール 、ラノリンアルコールリノレエート、ラノリンアルコールリシノレエート、ラノ リンアルコールリシノレエートのアセテート、エトキシル化アルコール−エステ ルのアセテート、ラノリンの水添分解物、エトキシル化水素添加ラノリン、エト キシル化ソルビトールラノリン、ならびに液状および半固形ラノリン吸収基剤が 、ラノリンから誘導された皮膚軟化剤の例である。 ｍ．多価アルコールおよびポリエーテル誘導体。プロピレングリコール、ジプ ロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（分子量２０００−４０００） 、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシプロピレン ポリオキシエチレングリコール、グリセリン、エトキシル化グリセリン、プロポ キシル化グリセリン、ソルビトール、エトキシル化ソルビトール、ヒドロキシプ ロピルソルビトール、ポリエチレングリコール（分子量２００−６０００）、メ トキシポリエチレングリコール３５０、５５０、７５０、２０００、５０００、 ポリ［エチレンオキシド］ホモポリマー（分子量１００，０００−５，０００， ０００）、ポリアルキレングリコールおよび誘導体、ヘキシレングリコール、（ ２−メチル−２，４−ペンタンジオール）、１，３−ブチレングリコール、１， ２，６−ヘキサントリオール、米国薬局方エトヘキサジオール（２−エチル−１ ，３−ヘキサンジオール）、Ｃ₁₅−Ｃ₁₈ビシナルグリコール、ならびにトリメチ ロールプロパンのポリオキシプロピレン誘導体がその例である。 ｎ．多価アルコールエステル。エチレングリコール モノ−およびジ脂肪酸エ ステル、ジエチレングリコール モノ−およびジ脂肪酸エステル、ポリエチレン グリコール（分子量２００−６０００）モノ−およびジ脂肪酸エステル、プロピ レングリコール モノ−およびジ脂肪酸エステル、ポリプロピレングリコール２ ０００モノオレエート、ポリプロピレングリコール２０００モノステアレート、 エトキシル化プロピレングリコールモノステアレート、グリセリル モノ−およ びジ脂肪酸エステル、ポリグリセロール ポリ脂肪酸エステル、エトキシル化グ リセリルモノステアレート、１，３−ブチレングリコールモノステアレート、１ ，３−ブチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレンポリオール脂肪 酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、およびポリオキシエチレンソルビタン 脂肪酸エステルが、満足すべき多価アルコールエステルの例である。 ｏ．ろうエステル、たとえば密ろう、鯨ろう（スパームアセチ）、ミリスチル ミリステートおよびステアリルステアレート。 ｐ．密ろう誘導体、たとえばポリオキシエチレンソルビトール密ろう。これら は密ろうと種々のエチレンオキシド含量のエトキシル化ソルビトールが反応して エーテル−エステル混合物を形成したものである。 ｑ．植物ろう。カルナウバろう、およびカンデリラろうが含まれる（ただしこ れらに限定されない）。 ｒ．リン脂質、たとえばレシチンおよび誘導体。 ｓ．ステロール類。コレステロールおよびコレステロール脂肪酸エステルがそ の例である。 ｔ．アミド、たとえば脂肪酸アミド、エトキシル化脂肪酸アミド、および固形 脂肪酸アルカノールアミド。 ローションは、さらに好ましくは１−１０％、より好ましくは２−５％の乳化 剤を含む。乳化剤はノニオン、アニオンまたはカチオンのいずれであってもよい 。満足すべきノニオン乳化剤の例には下記のものが含まれる（ただしこれらに限 定されない）：１０−２０個の炭素原子を含む脂肪アルコール、２−２０モルの エチレンオキシドまたはプロピレンオキシドと縮合した１０−２０個の炭素原子 を含む脂肪アルコール、２−２０モルのエチレンオキシドと縮合した６−１２個 の炭素原子をアルキル鎖中に含むアルキルフェノール、エチレンオキシドのモノ −およびジ脂肪酸エステル、エチレングリコールのモノ−およびジ脂肪酸エステ ル（脂肪酸部分が１０−２０個の炭素原子を含む）、ジエチレングリコール、分 子量２００−６０００のポリエチレングリコール、分子量２００−３０００のプ ロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ソルビタン、ポリオキシエチ レンソルビトール、ポリオキシエチレンソルビタンおよび親水性ろうエステル。 適 切なアニオン乳化剤の例には下記のものが含まれる（ただしこれらに限定されな い）：脂肪酸石鹸、たとえばナトリウム−、カリウム−およびトリエタノールア ミン石鹸（脂肪酸部分が１０−２０個の炭素原子を含む）。他の適切なアニオン 乳化剤の例には下記のものが含まれる（ただしこれらに限定されない）：アルカ リ金属−、アンモニウム−または置換アンモニウムアルキルスルフェート、アル キルアリールスルホネート、およびアルキルエトキシエーテルスルホネート（１ ０−３０個の炭素原子をアルキル部分に含む）。アルキルエトキシエーテルスル ホネートは１−５０個のエチレンオキシド単位を含む。満足すべきカチオン乳化 剤には、第四アンモニウム、モルホリニウムおよびピリジニウム化合物が含まれ る。この前の節に述べた皮膚軟化剤のいくつかは乳化性をももつ。それらの皮膚 軟化剤を含有するローションを調製した場合、追加の乳化剤は不必要であるが、 それが組成物中に含有されてもよい。 ローションの残部は水またはＣ₂もしくはＣ₃アルコール、あるいは水とアルコ ールの混合物である。ローションは単にすべての成分を一緒に混合することによ って調製される。好ましくは６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを混合 物に溶解する。 通常の任意成分が含有されてもよい。それらの添加剤の１種は、組成物の１− １０％の量の増粘剤である。適切な増粘剤の例には下記のものが含まれる（ただ しこれらに限定されない）：架橋カルボキシポリメチレンポリマー、エチルセル ロース、ポリエチレングリコール、トラガントゴム、カラヤゴム、キサンタンゴ ムおよびベントナイト、ヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピル セルロース。 ２．クリーム クリームは、有効量の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニン（たとえば 約０．２−約１００ｐｐｍの６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを皮膚 の活性細胞、たとえば線維芽細胞に付与するのに有効な量）；５−５０％、好ま しくは１０−２５％の皮膚軟化剤からなり、残部は水である。前記の皮膚軟化剤 をクリーム組成物にも使用しうる。所望によりクリーム剤形は前記の適切な乳化 剤を含有する。乳化剤が含有される場合、それは組成物中に３−５０％、好まし くは５−２０％の量で含有される。 ３．液剤 液剤の剤形は、有効量の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニン（たとえ ば約０．２−約１００ｐｐｍの６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを皮 膚の活性細胞、たとえば線維芽細胞に付与するのに有効な量）からなり；残部は 水、適切な有機溶剤、または水とそれらの有機溶剤の組み合わせである。溶剤ま たは溶剤系の一部として適切な有機物質は下記のものである：プロピレングリコ ール、ポリエチレングリコール（分子量２００−６００）、ポリプロピレングリ コール（分子量４２５−２０２５）、グリセリン、ソルビトールエステル、１， ２，６−ヘキサントリオール、エタノール、イソプロパノール、酒石酸ジエチル 、ブタンジオールおよびそれらの混合物である。それらの溶剤系は水を含有して もよい。 液剤状のこれらの組成物は皮膚にそのまま適用することができ、またはエアゾ ール剤に調製し、スプレーとして皮膚に適用することができる。エアゾール組成 物はさらに２５−８０％、好ましくは３０−５０％の適切な噴射剤を含む。それ らの噴射剤の例は塩素化、フッ素化および塩素化フッ素化された低分子量炭化水 素である。亜酸化窒素、二酸化炭素、ブタンおよびプロパンも噴射剤ガスとして 用いられる。これらの噴射剤は当技術分野で理解されているように、容器内容物 を噴射させるのに適切な量および圧力下で用いられる。 ４．ゲル剤 ゲル組成物は、前記の液剤組成物に適切な増粘剤を混合するだけで調製しうる 。適切な増粘剤の例はローションに関して先に述べた。 ゲル状組成物は、有効量の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニン（たと えば約０．２−約１００ｐｐｍの６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを 皮膚の活性細胞、たとえば線維芽細胞に付与するのに有効な量）；５−７５％、 好ましくは１０−５０％の前記有機溶剤；０．５−２０％、好ましくは１−１０ ％の増粘剤からなり；残部は水である。 ５．固形剤 固形剤の形の組成物は唇または他の身体部分に適用するためのスティック型組 成物として用いられる。それらの組成物は、有効量の６−（置換アミノ）プリン 系サイトカイニン（たとえば約０．２−約１００ｐｐｍの６−（置換アミノ）プ リン系サイトカイニンを皮膚の活性細胞、たとえば線維芽細胞に付与するのに有 効な量）；５０−９８％、好ましくは６０−９０％の前記皮膚軟化剤からなる。 この組成物はさらに１−２０％、好ましくは５−１５％の適切な増粘剤、ならび に所望により乳化剤および水を含有しうる。ローションに関して前述した増粘剤 が固形剤の組成物に適当に使用される。 ヒトの顔の皮膚に適用するのに適した本発明組成物の例は、１０部（重量）の グリセリンモノステアレート、１０部のセチルアルコール、３０部の鯨ろう、１ ０部のツウィーン２０（ソルビタンモノステアレートのポリオキシアルキレン誘 導体）、１０部のスパン２０（ソルビタンモノラウレート）、１２.５部のグリ セリン、および１００部の水を混合することにより調製された基剤中における、 １０−１００ｐｐｍのカイネチンからなる。カイネチンの代わりに用いられる、 老化が及ぼす不都合な作用を改善するのに有効な成分の例は、ゼアチン、６−（ ３，３−ジメチルアリル）アミノプリン、６−ベンジルアミノプリン、またはカ イネチンと６−（ｎ−ヘキシル）アミノプリンもしくは６−ベンジルアミノプリ ンとの組み合わせである。 他の成分、たとえば保存剤（たとえばメチル−パラベンまたはエチル−パラベ ン）、香料、色素など、皮膚に適用する組成物に望ましい安定性、芳香もしくは 色、または他の望ましい特性、たとえば太陽からの化学線からの遮蔽性を付与す ることが知られている成分を、本発明のこれらの局所用組成物中に用いることも できる。 本発明組成物は、老化が及ぼす不都合な作用を改善するのに有効な６−（置換 アミノ）プリン系サイトカイニン以外の成分をも含有しうる。しかしこれらのサ イトカイニンを単独で用いることの利点の１つである、処置された細胞の成長速 度および全増殖能が著しい影響を受けないという点は、処置された細胞の成長速 度もしくは全増殖能またはこれらの双方を高める前記他の成分を用いた場合には 希薄になりやすい。従って本発明の好ましい組成物は、老化が及ぼす不都合な作 用を改善するのに有効な唯一の成分として６−（置換アミノ）プリン系サイトカ イニンを含むであろう。 ヒトの皮膚に用いるための本発明組成物は、好ましくは本発明方法により処置 したい領域の皮膚に１日１回適用されるであろう。 本発明方法は、前記のようにヒトの皮膚の処置に適した本発明組成物を不特定 期間、すなわちその者が本発明の方法および組成物によって付与される、皮膚の 老化による不都合な作用の改善を得たいと望む期間中、好ましくは毎日適用する ことにより、ヒトの皮膚に適用される。その者の年齢、その組成物を適用する皮 膚の状態、および組成物中の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンの濃度 （または重量分率）に応じて、皮膚の基底細胞層の線維芽細胞において蛋白質合 成速度低下の遅延、および老化に関連した形態学的変化の遅延が皮膚の表面に見 えるようになるまで、本発明組成物の１日１回適用が少なくとも約１カ月間、最 高で少なくとも約１年間は必要であろう。本発明方法の適用を停止すると、本方 法により改善された老化作用はいつかは再び起こるであろう。 本発明を以下の実施例により説明する。 実施例Ｉ 短期細胞増殖に対するカイネチンの作用 正常な二倍体ヒト胚性皮膚線維芽細胞であるＫＩＳと表示される株の短期増殖 に対するカイネチンの作用を、当技術分野で″１工程成長曲線″実験として知ら れている方法により調べた。このために、１０％ウシ胎仔血清、抗生物質および グルタミンを補充したダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）を入れた数個 の培養フラスコに同数のＫＩＳ細胞（１０⁵個）を添加した。培地中において最 終濃度４０μＭ、８０μＭおよび２００μＭのカイネチンを得るために、緩衝塩 類溶液（ハンク氏緩衝液）中に調製したカイネチン原液を種々の容量でフラスコ に添加した。次いで培養物を３７℃で５％ＣＯ₂の雰囲気中においてインキュベ ートした。実験はすべて３重試験法により行われた。 種々の用量のカイネチンで処理された細胞の付着頻度を測定するために、各用 量からの培養フラスコ１組を、接種の６時間後に培養フラスコの底表に付着した 細胞の数を計数するために用いた。これは、まず細胞をトリプシン処理によりは ずし、それらを新鮮な培地に再懸濁し、コールターカウンターによりそれらの数 を計数することにより行われた。 カイネチン処理または非処理細胞の成長速度または増殖速度を推定するために 、上記の各組において２４時間毎に細胞数を測定した。すべての細胞がコンフル エント状態になり、細胞数がそれ以上増加しなくなるまでこれを続けた（通常は ８−１０日間）。下記の結果が得られた。 １．光学顕微鏡下での細胞の鏡検により判定されるように、正常なヒト細胞は 種々の用量のカイネチンで処理した際に不都合な形態学的影響を示さない。 ２．カイネチンはヒト細胞に対して明らかな毒作用を示さなかった。処理細胞 と非処理細胞との間で細胞付着度、培地中における細胞残屑、および培養基質の 単位面積当たりの細胞数に差がなかったからである。 ３．カイネチン処理ヒト細胞および非処理ヒト細胞は双方とも同じ成長速度を 示し、同時にコンフルエント状態に達した。これは、カイネチンが培養に際して 成長速度を増大させなかったことの明瞭な証拠である。これを支持する他の証拠 を実施例ＩＩに示す。 実施例ＩＩ カイネチンが長期成長速度および全増殖能に及ぼす影響 カイネチンがＫＩＳ細胞の長期成長速度および全増殖能に及ぼす影響を、当技 術分野で″寿命曲線（ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ ｃｕｒｖｅ）″実験として知られて いる方法により調べた。このために、少なくとも１６個の平行したＫＩＳ細胞培 養物を培地中４０μＭのカイネチンの存在下で、同数の非処理培養物と共に維持 した。実験はすべて集団倍増水準（ＰＤＬ）６から出発した。これは予めインビ トロで測定した正常な寿命見込みの約１２％である（すなわち細胞の全増殖能は 約ＰＤＬ＝５０である）。 細胞培養、トリプシン処理および細胞数測定の方法は実施例Ｉの場合と同様で あった。ただし長期実験のためには、培養物がコンフルエント状態になる毎に連 続継代培養した。４−５週間にわたって培地を毎週交換したにもかかわらずすべ ての細胞がコンフルエント状態になるのを停止するまで、この連続継代培養を続 けた。カイネチン処理および非処理により達成された正確なＰＤＬ数を推定する ために、平行して実験した１６個の培養物のうち少なくとも４個のコンフルエン ト培養フラスコ内の細胞を、若い場合は分割比１：４、それらの成長が老化のた め低下し始めている場合は１：２に小分割した。培養物が細胞接種とコンフルエ ント到達の間に行ったＰＤＬ数は ｌｏｇＮ／ｌｏｇ２ により判定された；式 中のＮはコンフルエント培養物中の細胞数をそのフラスコに最初に接種した細胞 数で割ったものである。最後に、各培養物につきインビトロにおけるそれらの寿 命の終了時に累積ＰＤＬを計算した。 累積ＰＤＬに関しては、培地中にカイネチンが連続的に存在する、または存在 しない状態で培養したヒト細胞の寿命には、差がなかった。この一連の実験にお いて、両タイプの培養物とも４７−４９の最大ＰＤＬを達成した。これは、培地 中のカイネチンの存在によって細胞の全増殖能が有意には変化しなかったことを 意味する。 しかし暦の上ではカイネチン処理細胞（２１７日）は対照（１９６日）より長 く生存するように見えた。これは、それらの寿命の終了時に（すなわち、もはや コンフルエントを達成し得ない時点で）、カイネチン処理細胞の方が少なくとも ２週間ははるかに健康に見える状態を維持し、培地中へ有意数の死細胞を脱落さ せることがなかったためである。 成長速度については、時間の関数としての集団倍増回数の曲線の傾斜はカイネ チン処理および非処理の両方につき実験的に区別し得なかった。従ってカイネチ ン処理培養と非処理の対照培養の成長速度には有意差がなかった。カイネチンは 培養状態のヒト細胞の正常な寿命（すなわち全増殖能）に対して、遺伝的に決定 されている固有の制限を有意に変更しなかった。 ＤＮＡ合成および成長速度 カイネチンを含めたサイトカイニンは、植物において細胞分裂の最終段階、す なわち細胞質分裂の完了を助成することが知られている。これは、サイトカイニ ンの存在下で細胞が癌化状態にトランスフォームされる危険性を高める様式でサ イトカイニンが哺乳動物細胞におけるＤＮＡ合成に影響を及ぼす可能性のあるこ とを示唆していた。 従って培養状態のヒト細胞のＤＮＡ合成に対するカイネチンの作用を調べるた めに、核飛跡オートラジオグラフィー法、および酸不溶性物質中における³Ｈ− チミジン取り込み法を利用して研究を行った。 オートラジオグラフィー用のために、ＫＩＳ細胞を種々の濃度のカイネチンの 存在下で（４０−２００μＭ）、またはその不在下で、滅菌ガラスカバースリッ プ上において増殖させた。種々の処理期間後に（³Ｈ）チミジン（１マイクロキ ュリー／ｍｌ）を、短期間（２時間）−−その期間の細胞周期数を測定するため に−−、または長期間（２４−４８時間）−−細胞周期のＳ期に進入しうる培養 細胞数を推定するために−−培養物に添加した。標識期間が終了した時点で、細 胞を標準法によりオートラジオグラフィー用として処理した。露光、現像および 染色処理の完了後に、顕微鏡により各スライド内に少なくとも５００個の細胞が 計数された。周期性−細胞（放射性チミジンを吸収し、それらの新たに合成され たＤＮＡ内へ取り込んで、オートラジオグラフィー的に黒色の核を形成した細胞 ）、および非周期性−細胞の％を、こうして測定した。カイネチン処理および非 処理 細胞は、２時間およびより長期間（２４−４８時間）の標識後に、実験的に区別 し得ない％の周期性および非周期性−細胞を含むことが認められた。 同様に９０分間または７２時間の標識後に、カイネチン処理および非処理ＫＩ Ｓ細胞による³Ｈ−チミジン取り込みの推定値−−シンチレーション計数管によ り測定した、細胞１０⁶個当たりの酸不溶性物質からのｄｐｍによる−−は、カ イネチン処理によるＤＮＡ合成の促進を示さなかった。 実施例Ｉに示したように、多数の独立した実験がカイネチンはヒト細胞の培養 において追加の細胞増殖を誘発しないことを示した。本実施例の実験は、カイネ チンがＤＮＡ合成を促進するか、または細胞を対照細胞がその周期に進入するよ り早期に新たな細胞周期へ押しやることはないことを示す。従ってカイネチンは ヒト細胞の細胞成長速度を変更しない。 実施例ＩＩＩ カイネチンが細胞形態に及ぼす影響 連続継代培養に際し細胞の形態が老化に関連して変化することは、老化の研究 に携わる細胞生物学者に周知の現象である。培養における若いヒト線維芽細胞は 、薄く、長い紡錘形であり、コンフルエントになるにつれ整列して密に充填され る。寿命の９０％以上を終えた老いた細胞は、大きさが著しく大きく、著しく偏 平であり、不規則な形状をもち、著しく液胞性となり、多数の、いわゆる″残余 小体（ｒｅｓｉｄｕａｌ ｂｏｄｙ）″を含み、これは蛍光顕微鏡下で観察する と紫外線で励起された際に強い自己蛍光を示す。 ４０μＭのカイネチンの存在下で増殖させたＫＩＳ細胞および不在下で増殖さ せたものを形態学的にＰＤＬ＝４４で比較した。カイネチン処理細胞は、老いた 細胞に典型的な形態をもたなかった。カイネチン処理細胞は若い（たとえばＰＤ Ｌ＝１４）細胞より大きさが有意に大きくはないのに対し、非処理細胞は有意に 大きかった。カイネチン処理細胞は、大部分が紡錘形の外観を維持した；それら は不規則に位置していなかった；またそれらはカイネチン処理しなかったものほ ど多数の液胞および残余小体を含まなかった。このように寿命の終末期において すらある程度若い外観を劇的に維持したことは、カイネチンが１０^-6−１０^-4Ｍ のオーダーの濃度で老化に関連した症候の開始を遅延させうる明らかな証拠であ る。 他の１組の実験において、既に老いた（たとえばＰＤＬ４０以上）細胞を、培 地に種々の濃度のカイネチンを添加した際にある程度若い外観へ形態学的に逆行 させうることが見出された。逆行の程度は、カイネチン暴露以前に到達していた 老齢の程度（若い細胞ほど逆行が著しい）、培地に添加するカイネチンの濃度、 およびカイネチンが存在する期間に依存する。寿命の８０％以上を終えたＫＩＳ 細胞（ＰＤＬ４０以上）は、培地中に２００μＭのカイネチンを用いた場合、２ −３週間後にＰＤＬ＝３０−３５の細胞の外観を呈し始めた。 培地からカイネチンを除去したのちに″老いた″形態を再生する速度は依然と して確実でないが、実験によればカイネチンを培地に導入したのちに若い形態へ 逆行する速度よりはるかに遅いことが示される。 細胞の収率および大きさ 培養における細胞老化の１パラメーターは、培養が老齢に近づいた際の細胞収 率（すなわちコンフルエント層内の細胞数）の低下である。これは主として細胞 が年齢と共に次第に大きくなるという事実によるものである。従って培養フラス コの面積が同一のままである場合、細胞が周期的継代培養と共にそれらの寿命の 終末に近づくとフラスコ当たりの細胞数は減少する。１組のＫＩＳ細胞培養物を 、培地中にカイネチンを用いずに周期的に継代培養した。他の１組のＫＩＳ細胞 培養物を同様に処理し、ただし培地中に４０μＭのカイネチンを含有させた。非 処理細胞については、細胞収率はＰＤＬ＝４３までは２５ｃｍ²当たり約１．５ ×１０⁶にほぼ一定に維持され、次いでＰＤＬ＝４８において２５ｃｍ²当たり約 ３．５×１０⁵に低下し、ここで成長は停止した。処理細胞については、細胞収 率はＰＤＬ＝４８まで２５ｃｍ²当たり約１．５×１０⁶にほぼ一定に維持され、 次いでＰＤＬ＝４９において２５ｃｍ²当たり約７×１０⁵に低下し、ここで成長 は停止した。このようにカイネチン処理細胞について寿命の終末期においてすら ″若い″細胞に特徴的な細胞収率が維持されたことは、ヒト細胞においてカイネ チン処理によりある種の老化症候の開始を遅延させることに関して著しく有意で ある。 以上、本発明をある程度詳細に記載したが、当業者には前記のとおり本発明の 精神の範囲内において修正および変更をなしうることは自明であろう。これらの 修正および変更も以下の請求の範囲に包含されるものとする。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９１年１２月１９日 【補正内容】 請求の範囲 １．（訂正） 老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善する方法であ って、哺乳動物細胞を有効濃度の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを 含有する組成物と接触させ、その際この濃度は老化が該細胞に及ぼす不都合な影 響を改善するのに十分なものであり、これにより該細胞の細胞老化に付随する特 徴の発現速度が逆行または遅延し、かつこの接触後の細胞の成長速度および全増 殖能は接触前と実質的に同じである方法。 ２．（訂正） 細胞が生存人体内の細胞である、請求の範囲第１項に記載の方 法。 ３．（訂正） 細胞が皮膚の線維芽細胞であり、組成物が皮膚の表面に適用す るためのスキンローション、軟膏またはクリームとして処方された、請求の範囲 第２項に記載の方法。 ４．（訂正） ６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メチ ル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選ばれる）である、 請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．（訂正） 式Ｉの化合物がフルフリルアデニンである、請求の範囲第４項 に記載の方法。 ６．（訂正） 化合物の濃度が約１０−約１００ｐｐｍである、請求の範囲第 ５項に記載の方法。 ７．（訂正） 細胞が細胞培養における線維芽細胞であり、組成物が培地であ る、請求の範囲第１項に記載の方法。 ８．細胞がヒト細胞である、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．（訂正） ６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メチ ル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選ばれる）である、 請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．（訂正） 式Ｉの化合物がフルフリルアデニンである、請求の範囲第９ 項に記載の方法。 １１．（訂正） 化合物の濃度が約５−約５０ｐｐｍである、請求の範囲第１ ０項に記載の方法。 １２．（訂正） 老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善するための 組成物であって、約０．５−約５００ｐｐｍの６−（置換アミノ）プリン系サイ トカイニンを含み、皮膚の表面に局所適用するために処方された組成物。 １３．（削除）。 １４．（訂正） ヒト細胞に適した、請求の範囲第１２項に記載の組成物。 １５．（訂正） ６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物 ： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メチ ル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選ばれる）である、 請求の範囲第１４項に記載の組成物。 １６．（訂正） 化合物がフルフリルアデニンである、請求の範囲第１５項に 記載の方法。 １７．（訂正） 化合物の濃度が約５−約５０ｐｐｍである、請求の範囲第１ ６項に記載の組成物。 １８．（訂正） 老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善するための 、有効濃度の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを生理学的に許容しう るキャリヤー中に含む、経口摂取用として処方された組成物であって、その際こ の濃度は胃腸管の結合組織層を透過し、これにより老化が該細胞に及ぼす不都合 な影響を改善するのに十分なものである組成物。 １９．（訂正） スキンローション、軟膏またはクリームとして処方された、 請求の範囲第１２項に記載の組成物。 ２０．（訂正） ６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物 ： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メチ ル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選ばれる）である、 請求の範囲第１９項に記載の組成物。 ２１．（訂正） 式Ｉの化合物がフルフリルアデニンである、請求の範囲第２ ０項に記載の組成物。 ２２．化合物の濃度が約１０−約１００ｐｐｍである、請求の範囲第２１項に 記載の組成物。 ２３．老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善するための、哺乳動物 細胞を有効濃度の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを含有する組成物 と接触させることよりなる方法であって、その際： 該細胞は正常な二倍体細胞であり； 該濃度は老化が該細胞に及ぼす不都合な影響を改善するのに十分なものであり 、これにより該細胞の細胞老化に付随する特徴の発現速度が逆行または遅延し、 かつこの接触後の細胞の成長速度および全増殖能は接触前と実質的に同じである 方法。 ２４．有効濃度が約０．５−約５００ｐｐｍである、請求の範囲第２３項に記 載の方法。 ２５．有効濃度が約１０−約１０００ｐｐｍである、請求の範囲第２３項に記 載の方法。 ２６．６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが組成物中において、老化 が及ぼす不都合な影響を改善する唯一の成分である、請求の範囲第２３項に記載 の方法。 ２７．濃度が約０．２−約２００ｐｐｍである、請求の範囲第１２項に記載の 組成物。 ２８．６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メチ ル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選ばれる）である、 請求の範囲第１８項に記載の組成物。 ２９．式Ｉの化合物がフルフリルアデニンである、請求の範囲第２８項に記載 の組成物。 ３０．濃度が約１０−約１０００ｐｐｍである、請求の範囲第１８項に記載の 組成物。 ３１．６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが組成物中において、老化 が及ぼす不都合な影響を改善する唯一の成分である、請求の範囲第１２項に記載 の組成物。 ３２．６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが組成物中において、老化 が及ぼず不都合な影響を改善する唯一の成分である、請求の範囲第１８項に記載 の組成物。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９２年１２月７日 【補正内容】 請求の範囲 １．（訂正） 老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善する方法であ って、哺乳動物細胞を有効濃度の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを 含有する組成物と接触させ、その際この濃度は老化が該細胞に及ぼす不都合な影 響を改善するのに十分なものであり、これにより該細胞の細胞老化に付随する特 徴の発現速度が逆行または遅延し、かつこの接触後の細胞の成長速度および全増 殖能は接触前と実質的に同じである方法。 ２．（訂正） 細胞が生存人体内の細胞である、請求の範囲第１項に記載の方 法。 ３．（訂正） 細胞が皮膚の線維芽細胞であり、組成物が皮膚の表面に適用す るためのスキンローション、軟膏またはクリームとして処方された、請求の範囲 第２項に記載の方法。 ４．（訂正） ６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メチ ル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選ばれる）である、 請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．（訂正） 式Ｉの化合物がフルフリルアデニンである、請求の範囲第４項 に記載の方法。 ６．（訂正） 化合物の濃度が約１０−１００ｐｐｍである、請求の範囲第５ 項に記載の方法。 ７．（訂正） 細胞が細胞培養における線維芽細胞であり、組成物が培地であ る、請求の範囲第１項に記載の方法。 ８．細胞がヒト細胞である、請求の範囲第７項に記載の方法。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９３年７月２３日 【補正内容】 請求の範囲 ９．（訂正） ６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、および（３−ヒドロキシメチル−３ −メチル）アリルよりなる群から選ばれる）である、請求の範囲第８項に記載の 方法。 １０．（訂正） 式Ｉの化合物がフルフリルアデニンである、請求の範囲第９ 項に記載の方法。 １１．（訂正） 化合物の濃度が約５−５０ｐｐｍである、請求の範囲第１０ 項に記載の方法。 １２．（２回訂正） 老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善するた めの組成物であって、約０．５−約５００ｐｐｍの６−（置換アミノ）プリン系 サイトカイニンを含み、皮膚の表面に局所適用するために処方されており；６− （置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉ： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、および（３−ヒドロキシメチル−３ −メチル）アリルよりなる群から選ばれる）を有する組成物。 １３．（削除）。 １４．（訂正） ヒト細胞に適した、請求の範囲第１−２項に記載の組成物。 １５．（削除）。 １６．（訂正） 式Ｉの化合物がフルフリルアデニンである、請求の範囲第１ ５項に記載の方法。 １７．（訂正） 化合物の濃度が約５− ５０ｐｐｍである、請求の範囲第１ ６項に記載の紹成物。 １８．（２回訂正） 老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善するた めの、有効濃度の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを生理学的に許容 しうるキャリヤー中に含む、経口摂取用として処方された組成物であって、その 際この濃度は胃腸管の結合組織層を透過し、これにより老化が該細胞に及ぼす不 都合な影響を改善するのに十分なものであり；６−（置換アミノ）プリン系サイ トカイニンが式Ｉ： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、および（３−ヒドロキシメチル−３ −メチル）アリルよりなる群から選ばれる）を有し；濃度が約１０− １０００ ｐｐｍである組成物。 １９．（訂正） スキンローション、軟膏またはクリームとして処方された、 請求の範囲第１２項に記載の組成物。 ２０．（訂正） ６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物 ： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、および（３−ヒトロキシメチル−３ −メチル）アリルよりなる群から選ばれる）である、請求の範囲第１９項に記載 の組成物。 ２１．（訂正） 式Ｉの化合物がフルフリルアデニンである、請求の範囲第２ ０項に記載の組成物。 ２２．化合物の濃度が約１０−１００ｐｐｍである、請求の範囲第２１項に記 載の組成物。 ２３．老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善するための、哺乳動物 細胞を有効濃度の６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを含有する組成物 と接触させることよりなる方法であって、その際： 該細胞は正常な二倍体細胞であり； 該濃度は老化が該細胞に及ぼす不都合な影響を改善するのに十分なものであり 、これにより該細胞の細胞老化に付随する特徴の発現速度が逆行または遅延し、 かつこの接触後の細胞の成長速度および全増殖能は接触前と実質的に同じである 方法。 ２４．有効濃度が約０．５−約５００ｐｐｍである、請求の範囲第２３項に記 載の方法。 ２５．有効濃度が約１０−約１０００ｐｐｍである、請求の範囲第２３項に記 載の方法。 ２６．６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが組成物中において、老化 が及ぼす不都合な影響を改善する唯一の成分である、請求の範囲第２３項に記載 の方法。 ２７．濃度が約０．２−約２００ｐｐｍである、請求の範囲第１２項に記載の 組成物。 ２８．（削除）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善する方法であって、該細 胞に約０．２−約２００ｐｐｍの６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを 含む組成物を投与することよりなる方法。 ２．細胞が生存人体内の細胞である、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．細胞が皮膚の線維芽細胞であり、組成物が皮膚の表面に投与されるスキン ローション、軟膏またはクリームである、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンンジル、炭素原子４、５または６個 のｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メ チル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選はれる）である 、請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．式Ｉの化合物がカイネチンである、請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．スキンローション、軟膏またはクリーム中のカイネチンの濃度が約１０− 約１００ｐｐｍである、請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．細胞が細胞培養における線維芽細胞であり、組成物が培地である、請求の 範囲第１項に記載の方法。 ８．細胞がヒト細胞である、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メチ ル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選ばれる）である、 請求の範囲第８項に記載の方法。 １０．式Ｉの化合物がカイネチンである、請求の範囲第９項に記載の方法。 １１．培地中のカイネチンの濃度が約５−約５０ｐｐｍである、請求の範囲第 １０項に記載の方法。 １２．老化が哺乳動物細胞に及ぼす不都合な影響を改善するための、約０．２ −約２００ｐｐｍの６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンを含む組成物。 １３．線維芽細胞を培養するための培地である、請求の範囲第１２項に記載の 組成物。 １４．ヒト細胞に適した、請求の範囲第１３項に記載の組成物。 １５．６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メチ ル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選ばれる）である、 請求の範囲第１４項に記載の組成物。 １６．化合物がカイネチンである、請求の範囲第１５項に記載の組成物。 １７．カイネチンの濃度が約５−約５０ｐｐｍである、請求の範囲第１６項に 記載の組成物。 １８．ヒトによる経口摂取またはヒトの皮膚への適用のために許容しうる、請 求の範囲第１２項に記載の組成物。 １９．スキンローション、軟膏またはクリームである、請求の範囲第１８項に 記載の組成物。 ２０．６−（置換アミノ）プリン系サイトカイニンが式Ｉの化合物： （式中のＲ₁はフルフリル、フェニル、ベンジル、炭素原子４、５または６個の ｎ−アルキル、（シクロヘキシル）メチル、（３−ヒドロキシメチル−３−メチ ル）アリル、および３，３−ジメチルアリルよりなる群から選ばれる）である、 請求の範囲第１８項に記載の組成物。 ２１．式Ｉの化合物がカイネチンである、請求の範囲第２０項に記載の組成物 。 ２２．カイネチンの濃度が約１０−約１００ｐｐｍである、請求の範囲第２１ 項に記載の組成物。