JPH10508760A - ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトｃ−ｒａｆをコードする核酸を標的とし、ｒａｆ発現を阻害しうるオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドの２’位にメトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃）修飾を含む。本発明のオリゴヌクレオチドを用いてヒトｒａｆの発現を阻害する方法もまた提供される。本発明はさらに、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、細胞の過増殖を阻害する方法および異常な増殖性状態を処置する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節序論 本出願は、米国特許出願第０８／２５０，８５６号（１９９４年５月３１日出 願）の一部継続出願である。技術分野 本発明は、異常細胞増殖および腫瘍形成への関与が示唆されてきた天然に存在 する細胞性遺伝子であるｒａｆ遺伝子の発現を調節するための組成物および方法 に関する。本発明はまた、細胞の過増殖を阻害するための方法にも関している； これらの方法は診断的にまたは治療的に使用しうる。さらに、本発明はｒａｆ遺 伝子の発現に付随する病状の処置にも関する。発明の背景 直接的にまたは間接的に細胞の増殖および分化を制御する細胞性遺伝子の変化 は、癌の主原因と考えられている。ｒａｆ遺伝子ファミリーはＡ−、Ｂ−および Ｃ−ｒａｆ（ｒａｆ−１とも呼ばれる）と称される三つの高度に保存された遺伝 子を含む。ｒａｆ遺伝子は細胞増殖を制御する信号伝達過程において重要な制御 的役割を果たしていると考えられているプロテインキナーゼをコードする。すべ ての肺癌細胞株の６０％はｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡおよび蛋白質を通常ではない高 レベルで発現していることが報告されているため、ｃ−ｒａｆ蛋白質の発現は異 常な細胞増殖に何らかの役割を果たしていると考えられている。Ｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｅ．Ｐ．Ｒｅｄｄｙ， Ａ．Ｍ Ｓｋａｌｋａ ａｎｄ Ｔ．Ｃｕｒｒａｎ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅ ｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８，ｐ ｐ．２１３−２５３。 オリゴヌクレオチドは動物およびヒトの疾患状態の処置において治療用成分と して用いられてきた。例えば、この分野の研究者は現在、ウイルス性、真菌性お よび代謝疾患に示唆される遺伝子の発現を調節しうるアンチセンス、トリプレッ クスおよび他のオリゴヌクレオチド組成物を同定している。 例えば、１９９２年８月４日に発行された米国特許第５，１３５，９１７号は ヒトインターロイキン−１レセプター発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレ オチドを提供している。Ｇａｗｉｒｔｚらの名前で１９９２年３月２４日に発行 された米国特許第５，０９８，８９０号はｃ−ｍｙｂ癌遺伝子と相補的なアンチ センスオリゴヌクレオチドおよびある種の癌状態のアンチセンスオリゴヌクレオ チド治療に関している。１９９２年２月１１日に発行された米国特許第５，０８ ７，６１７号はアンチセンスオリゴヌクレオチドによる癌患者の処置法を提供し ている。１９９２年１１月２４日に発行された米国特許第５，１６６，１９５号 はＨＩＶのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供している。１９９１年４月２日に発 行された米国特許第５,００４,８１０号は単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５ ｍ ＲＮＡにハイブリダイズして複製を阻害しうるオリゴマーを提供している。１９ ９３年３月１６日に発行された米国特許第５，１９４，４２８号はインフルエン ザウイルスに対して抗ウイルス活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを 提供している。１９８９年２月２１日に発行された米国特許第４，８０６，４６ ３号はアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＨＴＬＶ−III複製の阻害にそれ らを用いる方法を提供している。１９９４年２月１５日に発行された米国特許第 ５，２８６，７１７号（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）は癌遺伝子に相補的な混合 結合オリゴヌクレオチドホスホロチオエートに関している。米国特許第５，２７ ６，０１９号および第５，２６４，４２３号（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）は細 胞における外来性核酸の複製阻害に使用されるホスホロチオエートオリゴヌクレ オチド類似体に関している。アンチセンスオリゴヌクレオチドは安全にヒトへ投 与され、ウイルスおよび細胞性遺伝子産物の両方を標的とするいくつかのアンチ センスオリゴヌクレオチド薬剤の臨床応用が現在進行中である。ホスホロチオエ ートオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ２９２２はＡＩＤＳ患者のサイトメガロウイ ルス網膜炎に対して有効であることが示されている。ＢｉｏＷｏｒｌｄ Ｔｏｄ ａｙ 、１９９４年４月２９日、ｐ３。従って、オリゴヌクレオチドは有用な治療 手段であり、細胞および動物（特にヒト）の処置のための治療計画において有用 であろうことは確立されている。 遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害はｒａｆ遺伝子の役割の理 解における有用な道具であることが証明されている。ヒトｃ−ｒａｆの最初の６ つのコドンに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、インター ロイキン−２（ＩＬ−２）に対するＴ細胞のマイトジェン応答にｃ−ｒａｆを必 要とすることが示された。オリゴヌクレオチドで処理した細胞はほとんど全部の ｃ−ｒａｆ蛋白質の消失およびＩＬ−２に対する増殖応答の実質的な減少を示し た。Ｒｉｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３，２ ３，３１４６−３１５０。Ｒａｐｐらはプロモーターの下流にアンチセンス配向 したｒａｆ遺伝子を含む発現ベクター、および細胞でアンチセンスｒａｆ遺伝子 または突然変異したｒａｆ遺伝子を発現させることによるｒａｆ発現阻害の方法 を開示している。ＷＯ出願９３／０４１７０。マウスｃ−ｒａｆのコドン１−６ に相補的なアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いてラット肝癌細 胞株Ｈ４IIＥにおけるＤＮＡ合成のインシュリン刺激を回避した。Ｔｏｒｎｋｖ ｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９４，２６９，１３９１ ９−１３９２１。ＷＯ出願９３／０６２４８号は、ｃ−ｒａｆ遺伝子領域を増幅 し、および突然変異の証拠についてそれを分析することを特徴とする、癌を発生 する危険性が大きい個体の同定法および癌にかかった患者の予後および適当な処 置を決定するための方法を開示している。 Ｄｅｎｎｅｒらはｒａｆ遺伝子にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレ オチド、およびそれらを使用する方法を開示している。ＷＯ９４／１５６４５。 ヒトおよびラットｒａｆ配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが開示さ れている。 Ｉｎｖｅｒｓｅｎらはｒａｓ−活性化癌細胞を殺すことができるｒａｆに相補 的なヘテロ型アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｒａｆ−活性化癌細胞を殺 す方法を開示している。多数のオリゴヌクレオチド配列が開示されているが、そ のどれもが実際にはアンチセンスオリゴヌクレオチド配列ではない。 ｒａｆ遺伝子発現を阻害するための改良された組成物および方法が長く待ち望 まれている。発明の概要 本発明はヒトｒａｆをコードする核酸を標的とし、かつｒａｆ発現を阻害しう るオリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの ヌクレオチド上の２’位においてメトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣ Ｈ₃）修飾を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、診断および治療の両方に有 用であると考えられ、本発明の方法において特に有用であると考えられる。 本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、ヒトｒａｆの発現、特 にｒａｆの異常発現を阻害する方法を含む。これらの方法は、ｒａｆ発現および 過増殖が関連しているため、治療および診断の両方に有用であると考えられる。 これらの方法はまた、例えば種々の細胞機能および生理学的過程および状態にお けるｒａｆ発現の役割を検出および決定するための、およびｒａｆ発現に付随す る状態を診断するための道具としても有用である。 本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドを用いる細胞の過増殖を阻害する 方法も提供する。これらの方法は、例えば、ｒａｆに付随する細胞過増殖の診断 に有用であると考えられる。異常な増殖的状態の処置法もまた提供される。これ らの方法は本発明のオリゴヌクレオチドを使用する。これらの方法は、治療的に および臨床的研究および診断の道具としても有用であると考えられる。図面の簡単な説明 図１は、ヌードマウスにおけるＡ５４９肺腫瘍異種移植片の増殖に対するＩＳ ＩＳ５１３２（図１Ａ）およびスクランブル化対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ １０３５３（図１Ｂ）の効果を示す折れ線グラフである。ＩＳＩＳ５１３２はす べての用量で（０．００６ｍｇ／ｋｇ；０．０６ｍｇ／ｋｇ；０．６ｍｇ／ｋｇ ；および６．０ｍｇ／ｋｇ）用量応答的に腫瘍サイズを減少させた。スクランブ ル化ｒａｆオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１０３５３はいずれの用量でも効果を 示さなかった（図１Ｂ）。 図２は、ヌードマウスにおけるＡ５４９肺腫瘍異種移植片の増殖に対するＩＳ ＩＳ５１３２および同一の配列の２’メトキシエトキシ体（２’−Ｏ−ＣＨ₂Ｃ Ｈ₂ＯＣＨ₃）、ＣＧＰ６９８４５の効果を示す折れ線グラフである。ＩＳＩＳ５ １３２はすべての用量で（０．００６ｍｇ／ｋｇ；０．０６ｍｇ／ｋｇ；０．６ ｍｇ／ｋｇ；および６．０ｍｇ／ｋｇ）用量応答的に腫瘍サイズを減少させた。 メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃）オリゴヌクレオチド、ＣＧ Ｐ６９８４５（ＩＳＩＳ１０７５４としても知られている）は、最も高い用量に おいてＩＳＩＳ５１３２よりさらに高い阻害効果を有していた。発明の詳細な説明 悪性腫瘍は、癌細胞の特性である増殖制御の消失を引き起こす一連の段階的進 行性変化を経て発育する。即ち、連続的非制御増殖、周りの組織を侵襲する能力 および異なる器官部位へ転移する能力。注意深く制御されたインビトロでの研究 から、正常および新生物性細胞の増殖を特徴付ける因子を定義する手がかりが得 られ、細胞増殖および分化を制御する特定の蛋白質の同定が導かれた。ｒａｆ遺 伝子はＡ−、Ｂ−およびｃ−ｒａｆと名付けられた関連する蛋白質をコードする 遺伝子ファミリーの一員である。ｒａｆ遺伝子は高度に保存されたセリン−トレ オニンー特異的プロテインキナーゼをコードする。これらの酵素は異なるように 発現される；最も十分に特徴付けられているｃ−ｒａｆは試験されたすべての器 官およびすべての細胞株で発現されている。Ａ−およびＢ−ｒａｆは各々尿性器 および脳組織で発現されている。ｃ−ｒａｆプロテインキナーゼ活性および細胞 内分布はリン酸化を通してマイトジェンにより制御される。上皮増殖因子、酸性 線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン、顆粒球−マクロファ ージコロニー刺激因子、インターロイキン−２、インターロイキン−３およびエ リトロポイエチンを含む種々の増殖因子は、ｃ−ｒａｆのリン酸化を誘導するこ とが示されている。従って、ｃ−ｒａｆは多数の増殖因子をそれらの正味の効果 （細胞増殖）と結合させ、正常細胞信号伝達経路において基本的な役割を果たし ていると考えられている。 ある種の異常増殖状態はｒａｆ発現に付随すると考えられており、従ってｒａ ｆ発現の阻害に応答すると考えられている。ｒａｆ蛋白質発現の異常な高レベル はまた形質転換および異常な細胞増殖にも関係することが示唆されている。これ らの異常な増殖状態はｒａｆ発現の阻害に応答的であると考えられている。異常 な増殖状態の例は、癌、腫瘍、過生、肺線維症、脈管形成、乾癬、アテローム、 および血管形成術後の狭窄または再狭窄のような血管内の平滑筋増殖のような過 増殖障害である。ｒａｆがその一部となっている細胞信号伝達経路もまた、例え ば、組織移植片拒否反応、エンドトキシンショックおよび糸球体腎炎のようなＴ 細胞増殖（Ｔ細胞活性化および増殖）により特徴付けられる炎症性障害と関係す ることが示唆されている。 ｒａｆ遺伝子発現の除去または減少が異常な細胞増殖を停止または逆転させる ことが観察された。このことはｒａｆ発現のレベルが異常に高くはない場合にお いても観察された。ｒａｆ遺伝子の発現を調節しうる物質の組成物を提供するこ とが非常に待望されている。細胞、組織および動物におけるｒａｆ遺伝子の検出 法を提供することが非常に待望されている。また、異常なｒａｆ遺伝子発現に付 随する異常な増殖状態の診断および治療の方法を提供することも待望されている 。さらに、ｒａｆ遺伝子の検出および研究のためのキットおよび試薬も待望され ている。ここで”異常な”ｒａｆ遺伝子発現とは、ｒａｆ蛋白質の発現のレベル が異常に高いこと、または異常な増殖状況または状態におけるｒａｆ発現のレベ ルとして定義される。 本発明はｒａｆをコードする核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを用いる。 オリゴヌクレオチドとそれがハイブリダイズするその相補的核酸標的との間のこ の関係は通常”アンチセンス”と称されている。本発明の文脈において、選択さ れた核酸標的へのオリゴヌクレオチドの”標的化”は多段階過程である。この過 程は通常、その機能が調節されるべき核酸配列を同定することから始まる。それ は例えば、その発現が特定の疾病状態に付随する細胞性遺伝子（または遺伝子か ら作られるｍＲＮＡ）または感染作因からの外来性核酸であろう。本発明におい て、標的はｒａｆをコードする核酸である；別の表現では、ｒａｆ遺伝子または ｒａｆ遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。標的化過程にはまた、所望の効果 （遺伝子発現の調節）が得られるように、オリゴヌクレオチドとの相互作用を起 こす核酸配列内の一つまたは複数の部位の決定が含まれる。一つまたは複数の部 位が同定されたら、標的に十分相補的な（即ち、十分な特異性で十分よくハイブ リダイズし、所望の調節が得られる）オリゴヌクレオチドが選択される。 本発明の文脈において、”調節”とは阻害または刺激を意味している。ｒａｆ 遺伝子発現の阻害は現在のところ調節の好適な形である。この調節は例えば、本 出願の実施例に教示されるように、ｍＲＮＡ発現のノーザンブロットアッセイま たは蛋白質発現のウェスタンブロットアッセイのような本分野では日常的な方法 により測定しうる。本出願の実施例に教示されるように、細胞増殖または腫瘍細 胞増殖に対する効果も測定可能である。本発明の文脈において、”ハイブリダイ ゼーション”とは、通常相対する核酸鎖または核酸鎖の二つの領域の相補的塩基 間の水素結合（ワトソンークリック塩基対形成としても知られている）を意味し ている。グアニンおよびシトシンは相補的塩基の例であり、それらの間で三つの 水素結合が形成されることが知られている。アデニンおよびチミンは相補的塩基 の例であり、それらの間で二つの水素結合が形成される。”特異的にハイブリダ イズ可能”および”相補的”とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチ ドとの間で安定かつ特異的な結合が起こるように十分な程度の相補性を示すのに 使用される術語である。特異的にハイブリダイズ可能であるためには、オリゴヌ クレオチドはその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないことが理解さ れるであろう。標的へのオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な機能を妨 害して有用性の消失を起こす場合、および特異的結合が望まれる条件下、即ち、 インビボアッセイまたは治療的処置の場合には生理的条件下、またはインビトロ アッセイの場合にはアッセイが実施される条件下で、非標的配列へのオリゴヌク レオチドの非特異的結合を避けるために十分な程度の相補性がある場合、オリゴ ヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。 本発明においては、ｃ−ｒａｆをコードするｍＲＮＡを標的とするオリゴヌク レオチドが提供される。本発明に従うと、ｍＲＮＡは三文字遺伝コードを用いて 蛋白質をコードするための情報を運ぶコード領域のみを含むだけでなく、５’− 非翻訳領域、３’−非翻訳領域、５’キャップ領域、イントロン領域およびイン トロン／エクソンまたはスプライス連結リボヌクレオチドとして知られているよ うな領域を形成する付随するリボヌクレオチドを含むことを当業者は理解するで あろう。従って、これらの付随するリボヌクレオチド並びにコードリボヌクレオ チドの全部または一部を標的とするオリゴヌクレオチドを処方することができる 。妨害されるべきメッセンジャーＲＮＡの機能には、蛋白質翻訳の部位へのＲＮ Ａのトランスロケーション、ＲＮＡからの実際の蛋白質の翻訳、ＲＮＡのスプラ イシングまたは成熟およびおそらくはＲＮＡにより行われているであろう独立し た触媒活性のような生存のためのすべての機能が含まれる。ＲＮＡ機能のそのよ う な妨害の全体的な効果はｒａｆ蛋白質発現の妨害を起こすことである。 本発明はｒａｆ遺伝子発現調節のためのオリゴヌクレオチドを提供する。その ようなオリゴヌクレオチドはｃ−ｒａｆをコードする核酸を標的とする。 本発明の文脈において、述語”オリゴヌクレオチド”とは、天然に存在する塩 基、糖および糖間（主鎖）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマ ーのオリゴマーまたはポリマーを意味している。述語”オリゴヌクレオチド”は また、同様に機能する天然に存在しないモノマー、またはそれらの一部を含むオ リゴマーも含まれる。修飾は、１つまたはそれ以上の塩基、糖または主鎖結合、 またはこれらの組み合わせの上に行うことができ、このような修飾は当該技術分 野でよく知られている。修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、促進さ れた細胞取り込みおよびヌクレアーゼ存在下での増加した安定性等の性質のため 天然型よりもしばしば好適である。 オリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明の文 脈において”キメラオリゴヌクレオチド”または”キメラ”とは、各々少なくと も一つのヌクレオチドから作られた二つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を 含むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、一 つまたはそれ以上の有利な性質（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞内への 取り込みの増加、ＲＮＡ標的に対する結合親和性の増加）を与える少なくとも一 つの修飾されたヌクレオチド領域およびＲＮａｓｅＨ切断のための基質である領 域を含む。一つの好適な態様において、キメラオリゴヌクレオチドは、標的結合 親和性を増加させるために修飾された少なくとも一つの領域、および通常はＲＮ ａｓｅＨのための基質として働く領域を含む。その標的（この場合、ｒａｆをコ ードする核酸）に対するオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチドと 標的が解離する温度であるオリゴヌクレオチド／標的対のＴｍを測定することに より日常的に決定される；解離は分光学的に検出される。Ｔｍが高いほど標的に 対するオリゴヌクレオチドの親和性は強い。そのような修飾はオリゴヌクレオチ ド内に日常的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは与えられた標的に対 し、２’−デオキシオリゴヌクレオチドより高いＴｍ（即ちより強い標的結合親 和性）を有していることが示された。そのような増加した親和性の効果はｒａｆ 遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を非常に増強することである 。ＲＮａｓｅＨはＲＮＡ：ＤＮＡデュープレックスのＲＮＡ鎖を切断する細胞性 エンドヌクレアーゼである；従ってこの酵素の活性化はＲＮＡ標的の切断を生じ 、このことによりアンチセンス阻害の効率を非常に促進しうる。ＲＮＡ標的の切 断はゲル電気泳動により日常的に示すことができる。別の好適な態様において、 ヌクレアーゼ耐性を増強するためにキメラオリゴヌクレオチドも修飾される。細 胞は核酸を分解しうる種々のエキソ−およびエンド−ヌクレアーゼを含む。多数 のヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾が、これらを取り込んだオリゴヌクレオ チドを天然のオリゴヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に対してより耐性とする ことが示されている。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを細胞抽出物ま たは単離ヌクレアーゼ溶液とともにインキュベートし、通常はゲル電気泳動によ り、時間に関して残存する無傷のオリゴヌクレオチドの程度を測定することによ り日常的に測定される。ヌクレアーゼ耐性を増強するように修飾されているオリ ゴヌクレオチドは非修飾オリゴヌクレオチドより長く無傷のままで残る。ヌクレ アーゼ耐性を増強または与えるための種々のオリゴヌクレオチド修飾が示されて いる。いくつかの場合、標的結合親和性を増強させるオリゴヌクレオチド修飾は また、独立してヌクレアーゼ耐性を増強しうる。 本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチド上の２’位に おいてメトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃）修飾を含む。この修 飾は、オリゴヌクレオチドのその標的に対する親和性およびオリゴヌクレオチド のヌクレアーゼ耐性の両方を増加させることが示されている。本発明に従うオリ ゴヌクレオチドは好適には約８から約５０ヌクレオチドの長さである。本発明の 文脈においては、８から５０個のモノマーを有する上記のような天然に存在しな いオリゴマーを含むことが理解されるであろう。 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドはよく知られた固相合成技術に より都合よく日常的に作製することができる。Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９５，７８，４８６−５０４。そのような合成のため の装置はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかの会社から販売 されている。そのような合成のために他の手段を用いてもよい；オリゴヌクレオ チドの実際の合成は日常的に仕事をする人の手腕の範囲内である。ホスホロチオ エートおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを製造するため に同様の技術を使用することもよく知られている。また、蛍光標識、ビオチニル 化または他のコンジュゲート化されたオリゴヌクレオチドを合成するために、同 様の技術およびビオチン、フルオレセイン、アクリジンまたはソラーレン修飾ア ミダイトおよび／または制御細孔ガラス（ＣＰＧ）（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）のような市販品として入手可能な修飾アミダイト およびＣＰＧ産物の使用もよく知られている。 ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡの一部を標的とするある種のオリゴヌクレオチドがｒａ ｆ発現の阻害および細胞過増殖の妨害に特に有用であることが見いだされた。ア ンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるｃ−ｒａｆ発現の阻害のための方法も同 様に細胞過増殖の妨害に有用である。本発明の方法においては、組織または細胞 をオリゴヌクレオチドと接触させる。本発明の文脈において、組織または細胞を 一つまたは複数のオリゴヌクレオチドと”接触”させるとは、インビトロまたは エクスビボで細胞懸濁液または組織試料へオリゴヌクレオチドを加えるか（通常 は液体担体中で）、または動物内の細胞または組織にオリゴヌクレオチドを投与 することを意味している。 治療のため、細胞の過増殖を阻害する方法および異常な増殖性状態を処置する 方法が提供される。治療組成物の処方および続いての投与は本分野の技術範囲で あると考えられる。一般に、治療のためには、本発明に従ったオリゴヌクレオチ ドを、医薬として受容可能な担体中、特定の疾患の性質、その重態度および患者 の全体の状態に依存して変化するであろう用量および期間、そのような治療が必 要と思われる患者に投与する。本発明の医薬組成物は、局所または全身処置が望 まれるか、または処置される領域に依存して多くの方法で投与されるであろう。 局所（目、膣、直腸、鼻孔内を含む）、経口または例えば、静脈内滴注、静脈注 射または皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射による非経口で投与されるであろう。 局所投与のための処方には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、 座剤、スプレー、水剤および散剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水性、 粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましいであろう。被覆 コンドーム、グローブなどもまた有用である。 経口投与のための組成物には散剤または顆粒剤、懸濁剤または水または非水媒 質溶液剤、カプセル剤、サッシェ剤または錠剤が含まれる。増粘剤、芳香剤、希 釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤も望ましいであろう。 非経口投与のための処方には無菌水溶液が含まれ、それは緩衝剤、希釈剤およ び他の適当な添加物を含んでいてもよい。 そのような医薬担体に加えて、オリゴヌクレオチドの取り込みを容易にするた めにカチオン性脂質が処方に含まれていてもよい。取り込みを容易にするそのよ うな組成物の一つはリポフェクチン（ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）である 。 投与用量は処置されるべき状態の重度および応答度に依存し、処置進行は治療 が達成されるかまたは疾患状態の軽減が達成されるまで数日から数カ月続く。至 適投与計画は体内の薬剤蓄積の測定から計算しうる。当業者は容易に至適投与量 、投与法および繰り返し頻度を決定しうる。至適投与量は個々のオリゴヌクレオ チドの相対的有効性に依存して変化するであろうが、一般的にはインビトロおよ びインビボの動物実験からのＥＣ５０に基づいて計算しうる。例えば、化合物の 分子量（オリゴヌクレオチド配列および化学構造から導かれる）およびＩＣ５０ のような有効量（実験的に求められる）が与えられると、ｍｇ／ｋｇでの投与量 が日常的に計算される。 本発明はまた、癌、乾癬または血管狭窄またはアテロームのような過増殖性疾 患を有すると疑われる患者からの組織または他の試料における異常増殖状態の診 断にも適している。細胞増殖を阻害する本発明のオリゴヌクレオチドの能力は、 そのような状態を診断するために用いられる。多くのアッセイが本発明を用いて 計画できるが、そのようなアッセイは一般にそのような阻害を検出および通常は 定量化しうるように選択された条件下で組織試料を本発明のオリゴヌクレオチド と接触させることを含んでいるであろう。同様に、本発明は有効な処置計画が設 計しうるように、他の病因を有する腫瘍からｒａｆ付随性腫瘍を区別するために 使用しうる。 本発明のオリゴヌクレオチドはまた研究目的にも使用されるであろう。従って 、オリゴヌクレオチドにより示される特異的ハイブリダイゼーションは、アッセ イ、 精製、細胞生成物の調製および当業者により認められるであろう他の方法論で使 用されるであろう。 本発明のオリゴヌクレオチドはまたｒａｆ発現の検出および診断に有用である 。例えば、ポリヌクレオチドキナーゼによる５’末端の³²Ｐ標識により放射性標 識オリゴヌクレオチドを製造しうる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１ ９８９，第２巻，ｐ１０．５９。次に、放射性標識オリゴヌクレオチドをｒａｆ 発現が疑われる組織または細胞試料と接触させ、試料を洗浄して非結合オリゴヌ クレオチドを除去する。試料に残存している放射活性は結合されたオリゴヌクレ オチドを示しており（それはｒａｆの存在を示している）、シンチレーションカ ウンターまたは他の通常の手段により定量しうる。放射性標識オリゴを用いて組 織のオートラジオグラフィーを実施し、研究、診断または治療の目的でｒａｆ発 現の局在化、分布または量を決定することができる。そのような研究においては 、組織切片を放射性標識オリゴヌクレオチドで処理し、上記のように洗浄し、次 にルーチンオートラジオグラフィー法に従って写真乳化剤へ暴露する。現像する と乳化剤はｒａｆを発現している範囲に銀粒子のイメージを与える。銀粒子の定 量によりｒａｆ発現を検出することができる。 ｒａｆ発現の蛍光検出のための類似のアッセイは、放射性標識の代わりにフル オレセインまたは他の蛍光性標識とコンジュゲートさせた本発明のオリゴヌクレ オチドを用いて開発することができる。そのようなコンジュゲートは、蛍光標識 アミダイトまたはＣＰＧ（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉ ｎｇ ＶＡから入手可能なフルオレセイン標識アミダイトおよびＣＰＧ。Ｇｌｅ ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡの１９９３年のＤＮＡ研究用製 品カタログｐ．２１を参照されたい）を使用した固相合成の間に日常的に製造さ れる。 各々のこれらのアッセイの様式は本分野では既知である。当業者は本発明の教 示に従って容易にこれらの既知のアッセイをｒａｆ発現の検出に適用でき、ｒａ ｆ発現を検出する新規かつ有用な手段が提供される。配列番号１を有するオリゴヌクレオチドによるｃ−ｒａｆ発現の阻害 ヒトｃ−ｒａｆを標的とするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチド は、Ｇｅｎｂａｎｋ ｃ−ｒａｆ配列ＨＵＭＲＡＦＲ（Ｇｅｎｂａｎｋリストｘ ０３４８４）を用いて設計し、合成し、ノーザンブロットアッセイを用いてＴ２ ４膀胱癌細胞でのｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現の阻害について試験した。ｃ−ｒａ ｆの３’ＵＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ５１３２（ＴＣＣＣＧ ＣＣＴＧＴ ＧＡＣＡＴＧＣＡＴＴ；配列番号１）は、９０％を越える阻害を示 した。 配列番号１を有し、両側を２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃修飾を有する６ヌク レオチドによりフランクされた８ヌクレオチドのデオキシヌクレオチド中央領域 を有する２つのオリゴヌクレオチドを合成した。これらの化合物は、一方のＩＳ ＩＳＩ０７５５（ＣＩＢＡ１４４０としても知られている）が均一なホスホロチ オエート主鎖を有するのに対し、他方のＩＳＩＳ１０７５４（ＣＩＢＡ１４３９ またはＣＧＰ６９８４５としても知られている）が中央領域（主鎖結合７−１４ ）にホスホロチオエート主鎖を有し残りの（フランキング）領域にホスホジエス テル主鎖を有する点において異なる。これらのオリゴヌクレオチドがＴ２４細胞 においてｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現を阻害する能力について試験した。ＩＣ₅₀（ ５０％阻害を与えるオリゴヌクレオチド濃度）を計算し、これらのオリゴヌクレ オチドの相補物に対する親和性を示すＴｍのデータとともに表１に示す。ＩＳＩ Ｓ１０７５５およびＩＳＩＳ１０７５４の両方とも、ＩＣ₅₀が非常に低いため好 ましい。 ｒａｆに対するＩＳＩＳ５１３２の特異性 ｒａｆ ｍＲＮＡに対するＩＳＩＳ５１３２の特異性は、このオリゴヌクレオ チドがＴ２４細胞においてＨａ−ｒａｓ ｍＲＮＡならびにｃ−ｒａｆ ｍＲＮ Ａを阻害する能力について試験するノーザンブロットアッセイにより示された。 Ｈａ−ｒａｓは形質転換および腫瘍発生への関与が示唆されている細胞性癌遺伝 子である。ＩＳＩＳ５１３２はＨａ−ｒａｓ ｍＲＮＡレベルに影響を与えるこ となくｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡをほとんど完全になくすことが示された。キメラオリゴヌクレオチド 配列番号：１を有するキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴ ヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドの二つの領域により隣接され る６，８または１０デオキシヌクレオチドの中心”ギャップ”領域を有していた 。主鎖は一様にホスホロチオエートであった。ノーザンブロット分析において、 これらのオリゴヌクレオチドの三つすべて（ＩＳＩＳ６７２０，６−デオキシギ ャップ；ＩＳＩＳ６７１７，８−デオキシギャップ；ＩＳＩＳ６７２９，１０− デオキシギャップ）は、Ｔ２４細胞におけるｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現の７０％ を超える阻害を示した。８−デオキシギャップ化合物（６７１７）は９０％を超 える阻害を示した。２’−Ｏ−プロピルまたは２’フルオロ修飾ヌクレオチドの いずれかにより隣接される８−デオキシヌクレオチドギャップを有する配列番号 １のオリゴヌクレオチドもまた活性であることが認められた。癌細胞増殖の阻害 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ５１３２（配列番号：１）が Ｔ２４膀胱癌細胞増殖を阻害することが示された。細胞をリポフェクチン（オリ ゴヌクレオチド取り込みを増加させるカチオン性脂質）とともに種々の濃度のオ リゴヌクレオチドで処理した。表２に示すように細胞増殖の用量依存性阻害が示 され、ここで”なし”は非処理対照（オリゴヌクレオチドなし）を示し、”対照 ”は陰性対照オリゴヌクレオチドで処理したことを示している。結果は非処理対 照と比較したパーセント阻害として示されている。 Ｔ２４ヒト膀胱癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５１３２の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトＴ２４膀胱癌腫移植片を確立させ、ＩＳＩＳ５ １３２および関連しない対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを２５ｍｇ ／ｋｇの用量で週に３回腹腔内に投与することにより処理した。この予備的研究 において、ＩＳＩＳ５１３２は１１日後対照と比較して３５％腫瘍増殖を阻害し た。オリゴヌクレオチド処理腫瘍は研究期間を通して対照腫瘍より小さかった。ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５１３２の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌腫移植片を確立させ、 ＩＳＩＳ５１３２および関連しない対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド を０．６ｍｇ／ｋｇまたは６．０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回静脈内に投与する ことにより処理した。ＩＳＩＳ５１３２は２７日後（研究の終了日）対照と比較 して約８０％腫瘍増殖を阻害した。 ＩＳＩＳ５１３２はまた、ヌードマウス中のＭＤＡ−ＭＢ２３１移植片に対し 腹腔内に投与しても有効であった。オリゴヌクレオチドは１日１回０．６ｍｇ／ ｋｇまたは６．０ｍｇ／ｋｇで投与した。２７日後（研究の終了日）、腫瘍体積 は対照と比較して５７％（０．６ｍｇ／ｋｇ）または６４％（６．０ｍｇ／ｋｇ ）阻害された。ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍におけるｃ−ｒａｆ ＲＮＡレベルに対するＩＳＩＳ５ １３２の効果 ＲＮＡをＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍移植片から単離し、ノーザンブロットを実施 してｒａｆ ＲＮＡレベルに対するオリゴヌクレオチドの効果を評価した。ＩＳ ＩＳ５１３２は２７日後に、静脈内投与の場合は６７％および腹腔内投与の場合 は３９％、ｒａｆ ＲＮＡレベルを減少させた（いずれも６ｍｇ／ｋｇ）。Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５１３２の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトＣｏｌｏ２０５結腸癌腫移植片を確立させ、Ｉ ＳＩＳ５１３２および関連しない対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを 、６．０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回静脈内に投与することにより処理した。こ の研究において、ＩＳＩＳ５１３２は２５日後に対照と比較して４０％以上腫瘍 増殖を阻害した。Ａ５４９ヒト肺腺癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５１３２の効果 皮下ヒトＡ５４９肺腺癌異種移植片をオスＢａｌｂ／ｃヌードマウスで確立さ せ、０．００６から６．０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量での静脈内注射による毎日の 投与によりＩＳＩＳ５１３２および対照オリゴヌクレオチドで処理した。図１に 示されるように、ＩＳＩＳ５１３２はすべての用量で用量応答的に腫瘍サイズを 減少させた。スクランブル化ｒａｆオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１０３５３はど の用量でも効果はなかった。Ａ５４９ヒト肺腺癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５１３２およびＣＧＰ６９８４５の効 果 皮下ヒトＡ５４９肺腺癌異種移植片をオスＢａｌｂ／ｃヌードマウスで確立さ せ、０．００６から６．０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量での静脈内注射による毎日の 投与によりＩＳＩＳ５１３２（配列番号１）または配列番号１のメトキシエトキ シ（２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃）体（ＣＧＰ６９８４５）で処理した。図２ に示されるように、ＩＳＩＳ５１３２はすべての用量で用量応答的に腫瘍サイズ を減少させた。メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃）オリゴヌク レオチド（ＣＧＰ６９８４５）は、より低い用量でＩＳＩＳ５１３２と同様の効 果を有しており、６．０ｍｇ／ｋｇではＩＳＩＳ５１３２より高い阻害効果を有 していた。Ａ５４９腫瘍細胞におけるｃ−ｒａｆ ＲＮＡレベルに対するＩＳＩＳ５１３２ の効果 Ａ５４９腫瘍移植片からＲＮＡを単離し、ノーザンブロットを実施してｒａｆ ＲＮＡレベルに対するオリゴヌクレオチドの効果を評価した。ＩＳＩＳ５１３２ は、オリゴ処理から８時間後に始まってｒａｆ ＲＮＡレベルを段々と減少させ た。実験を１３日目で終了させた時、ＲＮＡレベルはまだ減少しつつあり、対照 の約１５％のレベルに達していた。ラットおよびマウスｃ−ｒａｆを標的とするオリゴヌクレオチドの同定 ｒａｆキナーゼにより媒介されると考えられている多くの状態は、ヒトにおけ る研究を実施することができない。例えば、組織移植片拒否反応はｒａｆ発現を 妨害することにより改善されるように見える状態である；しかし、明らかにこの ことはヒト移植患者ではなく動物で評価されねばならない。別のそのような例は 再狭窄である。しかしながら、これらの状態はここで使用したラットおよびマウ スモデルのような動物モデルでは試験可能である。これらのデータは、ｃ−ｒａ ｆを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの療法的有用性の追加の証拠を 提供する。 ラットおよびマウス細胞でｃ−ｒａｆ発現を阻害するためのオリゴヌクレオチ ド配列が同定された。ラットおよびマウスｃ−ｒａｆ遺伝子は高度に相同的な領 域を有している；ヒトｃ−ｒａｆを標的とするオリゴヌクレオチドの評価から得 られた情報を用いて、ラットおよびマウス両方のｃ−ｒａｆｍＲＮＡ配列を標的 とする一連のオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。これらのオリゴヌクレオ チドをノーザンブロット分析を用いてマウスｂＥＮＤ細胞およびラットＡ−１０ 細胞での活性についてスクリーニングした。２つのオリゴヌクレオチド、ＩＳＩ Ｓ１１０６１およびＩＳＩＳ１０７０７は、４００ｎＭの用量で、マウスｂＥＮ Ｄ細胞において、ｃ−ｒａｆ ＲＮＡレベルを９０％より大きく阻害することが 認められた。これらの２つのオリゴヌクレオチドは、２００ｎＭの用量で、ラッ トＡ−１０細胞においてｒａｆ ＲＮＡレベルをほぼ完全に阻害した。ＩＳＩＳ １０７０７のＩＣ５０は、マウスｂＥＮＤ細胞において１７０ｎＭであり、ラッ トＡ−１０細胞において８５ｎＭであることが見いだされた。ＩＳＩＳ１１０６ １のＩＣ５０は、マウスｂＥＮＤ細胞において８５ｎＭであり、ラットＡ−１０ 細胞において３０ｎＭであると判定された。マウスにおける内在性ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現に対するＩＳＩＳ１１０６１の 効果 マウスに３日間毎日ＩＳＩＳ１１０６１（５０ｍｇ／ｋｇ）または対照オリゴ ヌクレオチドまたは対照塩溶液を腹腔内に注射した。動物を殺し、器官をノーザ ンブロット分析によりｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現について分析した。ＩＳＩＳ１ １０６１は肝臓のｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡのレベルを約７０％減少させることが観 察された。対照オリゴヌクレオチドはｃ−ｒａｆ発現には何の影響も与えなかっ た。ＩＳＩＳ１１０６１の効果はｃ−ｒａｆに特異的であった；Ａ−ｒａｆおよ びＧ３ＰＤＨ ＲＮＡレベルはオリゴヌクレオチド処理により影響を受けなかっ た。ｃ−ｒａｆに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマウス心臓同種移植モデ ルにおいて生存を延長させる 同種移植拒否反応を防止するｃ−ｒａｆアンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳ ＩＳ１１０６１の治療的効果を決定するため、マウス血管新生化異所性心臓移植 モデルにおける活性についてこのオリゴヌクレオチドを試験した。本質的にはＩ ｓｏｂｅ ｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９１，８４，１２４６− １２５５により記載されているように、一次血管新生化移植片としてＣ５７ＢＩ １０マウスからの心臓をＣ３Ｈマウスの腹部腔内へ移植した。オリゴヌクレオチ ドを７日間アルゼットポンプを通して連続的に静脈内投与した。非処理マウスの 平均同種移植片生存時間は７．８３±０．７５日であった（７、７、８、８、８ 、９日）。２０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ１１０６１で７日間 処理したマウスの同種移植片はすべて少なくとも１１日生存していた（２０ｍｇ ／ｋｇでは１１、１１、１２日、および４０ｍｇ／ｋｇでは＞１１、＞１１、＞ １１日）。 ラットで行われた試験的研究では、Ｌｅｗiｓラットからの心臓をＡＣＩラッ トの腹部腔内へ移植した。ラットにアルゼットポンプを通して２０ｍｇ／ｋｇの ＩＳＩＳ１１０６１を７日間投与した。非処理ラットの平均同種移植片生存時間 は８．８６±０．６９日であった（８、８、９、９、９、９、１０日）。オリゴ ヌクレオチド処理ラットの平均同種移植片生存時間は１５．３±１．１５日であ った（１４、１６、１６日）。平滑筋細胞増殖に対するｃ−ｒａｆを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチ ドの効果 平滑筋細胞増殖は、例えば血管形成術後のアテロームおよび再狭窄のような血 管狭窄の原因である。Ａ−１０ラット平滑筋細胞の増殖に対するＩＳＩＳ１１０ ６１の効果を決定するために実験を行った。培養細胞をＩＳＩＳ１１０６１（リ ポフェクチンを加えて）を添加して、または添加せずに増殖させ、ウシ胎児血清 で刺激後２４時間および４８時間に細胞増殖を測定した。ＩＳＩＳ１１０６１(５ ００ｎＭ)は用量応答的に血清刺激細胞増殖を阻害することが観察され、２４時 間および４８時間後の最大阻害は各々４６％および７５％であった。この化合物 について２００ｎＭのＩＣ５０値が得られた。非相関対照オリゴヌクレオチドは ５００ｎＭの用量まで影響を与えなかった。ラットにおける再狭窄に対するｃ−ｒａｆを標的とするアンチセンスオリゴヌク レオチドの効果 血管形成術再狭窄のラット頚動脈障害モデルは開発されており、ｃ−ｍｙｃ癌 遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの再狭窄に対する効果を評 価するために使用されてきた。Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉ．Ｉ ｎｖｅｓｔ ．１９９４，９３，８２０−８２８。このモデルを用いて再狭窄に対 するラットｃ−ｒａｆを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（特にＩＳ ＩＳ１１０６１）の効果を評価することができる。バルーンカテーテルによる頚 動脈損傷に続いて、オリゴヌクレオチドを静脈内注射、アルゼットポンプを通し た連続的静脈内投与またはＢｅｎｎｅｔｔらにより記載されているようなプルロ ニックゲルマトリックスでの頚動脈への直接投与により投与する。回復後、ラッ トを殺し、頚動脈を顕微鏡により調べて、ルミナール切片に対する処理の効果を 決定する。 本発明は以下の実施例によりさらに例示されるが、それらは例示のためだけで あり、本発明を特定の態様に制限することを意図しているものではない。 実施例実施例１ オリゴヌクレオチドの合成および特性付け 非修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドはヨウ素による酸化を行う標準ホスホルアミ ダイト化学を用いて自動化ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ モデル３８０Ｂ）で合成した。β−シアノエチルジイソプロピル ホスホル アミダイトはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ，ＣＡ）から購入した。ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドについては、 標準酸化ボトルをホスファイト結合の段階的チオ化のために０．２Ｍ Ｈ−１， ２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキシドのアセトニトリル溶液で 置き換えた。チオ化サイクル待ち時間は６８秒に増加し、続いてキャッピング工 程を行った。２’−Ｏ−メチル ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドは２ ’−Ｏ−メチル β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホルアミダイト（Ｃｈ ｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ）および非修飾オリゴヌクレオチドのた めの標準サイクル（ただし、テトラゾールおよび塩基のパルス運搬後の待ち時間 を３６０秒に延長した）を用いて合成した。合成の開始に使用した３’−塩基は ２’−デオキシリボヌクレオチドであった。２’−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオ チドはこの工程をわずかに変更して製造した。 ２’−フルオロ ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは５’−ジメトキシ トリチル−３’−ホスホルアミダイトを用いて合成し、１９９０年１月１１日に 出願された米国特許出願第４６３，３５８号および１９９０年８月１３日に出願 された第５６６，９７７号（これらは本出願と同一の譲渡人に譲渡されており、 ここに引例として包含されている）に開示されているように製造した。２’−フ ルオロ オリゴヌクレオチドはホスホルアミダイト化学を用い、および標準ＤＮ Ａ合成プロトコールをわずかに変更して製造された：脱保護は室温でメタノール 性アンモニアを用いて達成された。 メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃）オリゴヌクレオチドは、 Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９５，７８，４８６ −５０４の方法にしたがって合成した。 制御細孔ガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し 、濃水酸化アンモニウム中５５℃で１８時間脱保護した後、オリゴヌクレオチド を２．５容量のエタノールで０．５Ｍ ＮａＣｌから二度沈澱させて精製した。 分 析ゲル電気泳動は２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリスーホウ酸緩 衝液、ｐＨ７．０で実施した。オリゴデオキシヌクレオチドおよびそれらのホス ホロチオエート類似体は完全長物質の８０％を超えることが電気泳動から判断さ れた。実施例２ ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現阻害のノーザンブロット分析 ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃ ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）から得た。細胞は１０％熱不 活性化ウシ胎児血清および各々５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイ シンを補給したＬ−グルタミンを含むマッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）で増殖させた。細胞は１００ｍｍプレートに 播種した。それらが７０％コンフルエントに達したとき、オリゴヌクレオチドで 処理した。プレートを１０ｍｌの前もって温めたＰＢＳおよび２．５μｌのＤＯ ＴＭＡを含む５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ還元血清培地で洗浄した。次にリポフェ クチンを含むオリゴヌクレオチドを所望の濃度まで添加した。処理して４時間後 、培地をマッコイ培地に置き換えた。オリゴヌクレオチド処理後２４から７２時 間後に細胞を集め、標準ＣｓＣｌ精製法を用いてＲＮＡを単離した。Ｋｉｎｇｓ ｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，(Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ． Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉ ｄｍａｎ ａｎｄ Ｋ.Ｓｔｒａｈｌ,ｅｄｓ),Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ。全ＲＮＡはＣｓＣｌクッション上での細胞溶解物の遠心分離に より単離した。ＲＮＡ試料は１．２％アガロースーホルムアルデヒド ゲルを通 して電気泳動し，１２−１４時間以上かけてキャピラリー拡散によりハイブリダ イゼーション膜に移した。ＲＮＡはＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内でＵＶ光へ暴露することにより膜と架橋さ せ、ランダムープライム化³²Ｐ−標識ｃ−ｒａｆ ｃＤＮＡプローブ（ＡＴＣＣ から得られた）または対照としてＧ３ＰＤＨプローブとハイブリダイズさせた。 ＲＮＡはＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ ｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量した。実施例３ Ｔ２４細胞におけるｃ−ｒａｆキナーゼ蛋白質発現の特異的阻害 Ｔ２４細胞をＴ＝０およびＴ＝２４時間目にオリゴヌクレオチド(２００ｎＭ) およびリポフェクチンで処理した。蛋白質抽出物をＴ＝４８時間に調製し、アク リルアミドで電気泳動し、ｃ−ｒａｆ（ＵＢＩ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ ）またはＡ−ｒａｆ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）に対するポリクローナル抗体を用いるウェスタンブ ロットにより分析した。放射性標識第二抗体を使用し、ｒａｆ蛋白質はＰｈｏｓ ｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖ ａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量した。実施例４ 細胞増殖のアンチセンス阻害 第０日にＴ２４細胞を種々の濃度のオリゴヌクレオチドおよびリポフェクチン で２時間処理した（５０ｎＭオリゴヌクレオチドおよび２μｇ／ｍｌリポフェク チン；１００ｎＭオリゴヌクレオチドおよび２μｇ／ｍｌリポフェクチン；２５ ０ｎＭオリゴヌクレオチドおよび６μｇ／ｍｌリポフェクチンまたは５００ｎＭ オリゴヌクレオチドおよび１０μｇ／ｍｌリポフェクチン）。第１日に細胞を所 望のオリゴヌクレオチド濃度で２時間、２回目の処理を行った。第２日に細胞を 計数した。実施例５ ヌードマウスにおけるＴ２４ヒト膀胱癌腫瘍異種移植片に対するＩＳ ＩＳ５１３２の効果 ５ｘ１０⁶のＴ２４細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に移植した。オリゴヌ クレオチド（塩溶液に懸濁したＩＳＩＳ５１３２および非相関対照ホスホロチオ エートオリゴヌクレオチド）を腫瘍細胞接種４日後から週に３回投与した。塩溶 液のみの対照もまた実施した。オリゴヌクレオチドは腹腔内注射により与えた。 オリゴヌクレオチド用量は２５ｍｇ／ｋｇであった。処理から１１、１５および １８日目に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。実施例６ ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌腫瘍異種移植片に 対するＩＳＩＳ５１３２の効果 ５ｘ１０⁶のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に移植 した。オリゴヌクレオチド（塩溶液に懸濁したＩＳＩＳ５１３２および非相関対 照ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）を腫瘍細胞接種１０日後から毎日１ 回投与した。塩溶液のみの対照もまた実施された。オリゴヌクレオチドは０．６ ｍｇ／ｋｇまたは６．０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射により与えた。腫瘍細胞 接種の１０、１３、１６、２０、２３および２７日後に腫瘍サイズを測定し、腫 瘍体積を計算した。 腹腔内オリゴヌクレオチド投与においては、オリゴヌクレオチドを腫瘍細胞接 種１０日後から毎日１回投与した。塩溶液のみの対照もまた実施された。オリゴ ヌクレオチドは０．６ｍｇ／ｋｇまたは６．０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射に より与えた。腫瘍細胞接種の１０、１３、１６、２０、２３および２７日後に腫 瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。実施例７ ヌードマウスにおけるＣｏｌｏ２０５ヒト結腸癌腫瘍異種移植片に対 するＩＳＩＳ５１３２の効果 ５ｘ１０⁶のＣｏｌｏ２０５細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に移植した 。オリゴヌクレオチド（塩溶液に懸濁したＩＳＩＳ５１３２および非相関対照ホ スホロチオエートオリゴヌクレオチド）を腫瘍細胞接種５日後から毎日１回投与 した。塩溶液のみの対照もまた実施された。オリゴヌクレオチドは静脈内注射に より与えた。オリゴヌクレオチド用量は６ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍細胞接種の ５、８、１１、１４、１８、２２および２５日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体 積を計算した。実施例８ ヌードマウスにおける異種移植片を用いたｒａｆ付随腫瘍のための診 断アッセイ 本アッセイを用いて、ｒａｆ発現により生じる腫瘍を診断し他の腫瘍と区別す る。腫瘍のバイオプシ試料を処理して（例えば、コラゲナーゼまたはトリプシン または他の常法により）、腫瘍の塊を解離させた。５ｘ１０⁶の脛瘍細胞を２匹 またはそれ以上のヌードマウスの右内側腿の皮下に移植した。塩溶液に懸濁した アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＩＳＩＳ５１３２）を腫瘍細胞接種 ４日後から週に３回１匹またはそれ以上のマウスに投与した。対照マウスには塩 溶液のみを投与した。オリゴヌクレオチド用量は２５ｍｇ／ｋｇであった。処理 の１１日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。オリゴヌクレオチド処 理 マウスの腫瘍体積を対照マウスのものと比較した。処理マウスのｒａｆ付随腫瘍 の体積は対照マウスより測定可能なほど小さかった。ｒａｆ発現以外の原因で生 じる腫瘍はｒａｆを標的とするオリゴヌクレオチドに応答しないと予測され、し たがってオリゴヌクレオチド処理および対照マウスの腫瘍容量は等しい。実施例９ ｒａｆ発現の検出 オリゴヌクレオチドを合成後、ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端を³²Ｐで 放射性標識した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，第２巻，ｐ ｇ．１１．３１−１１．３２。放射性標識オリゴヌクレオチドを特異的ハイブリ ダイゼーションを起こすことができる条件下、腫瘍バイオプシ試料または乾癖が 疑われる皮膚試料のようなｒａｆ発現が疑われる組織または細胞試料と接触させ 、試料を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去した。試料に残存する放射活 性は結合オリゴヌクレオチドを示し、シンチレーションカウンターまたは他の通 常手段を用いて定量した。本発明の放射標識オリゴヌクレオチドはまたオートラ ジオグラフィーでも使用される。組織切片を放射性標識オリゴヌクレオチドで処 理し、上記のように洗浄した後、標準オートラジオグラフィー法に従って写真用 感光乳剤を暴露した。乳剤を現像するとｒａｆを発現している領域の銀粒子のイ メージが得られた。ｒａｆ発現の程度は銀粒子を定量することにより決定された 。 ｒａｆ発現の蛍光検出のための類似のアッセイは、フルオレセインまたは他の 蛍光標識で標識された本発明のオリゴヌクレオチドを使用した。標識化ＤＮＡオ リゴヌクレオチドはヨウ素による酸化を行う標準ホスホルアミダイト化学を用い て自動化ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル３８０ Ｂ）で合成した。β−シアノエチルジイソプロピル ホスホルアミダイトはＡｐ ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入 した。フルオレセイン−標識アミダイトはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅ ｒｌｉｎｇ ＶＡ）から購入された。オリゴヌクレオチドおよび生物試料のイン キュベーションは放射性標識オリゴヌクレオチドで記載したように実施したが、 ｒａｆ発現を示す蛍光を検出するためにはシンチレーションカウンターの代わり に蛍光光度計または蛍光顕微鏡を使用した。実施例１０：Ａ５４９異種移植片 ５ｘ１０⁶のＡ５４９細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に移植した。塩溶液 に懸濁したオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ５１３２およびＣＧＰ６９８４５；Ｉ ＳＩＳ１０７５４としても知られる）を、０．００６から６．０ｍｇ／ｋｇの範 囲の用量で毎日１回静脈内に注射することにより投与した。生じた腫瘍は９、１ ２、１７および２１日後に測定し、腫瘍容量を計算した。実施例１１：内因性ｃ−ｒａｆ発現に対するオリゴヌクレオチドの効果 マウスを第１、２および３日に５０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチド用量で腹 腔内注射することにより処理した。第４日に動物を殺し、ノーザンブロット分析 によるｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡアッセイのために器官を除去した。４群の動物を用 いた：１）オリゴヌクレオチド処理なし（塩溶液）；２）陰性対照オリゴヌクレ オチドＩＳＩＳ１０８２（単純ヘルペスウイルスを標的とする）；３）陰性対照 オリゴヌクレオチド４１８９（マウス蛋白質キナーゼＣ−αを標的とする）；４ ）げっし類ｃ−ｒａｆを標的とするＩＳＩＳ１１０６１。実施例１２：心臓同種移植片モデル 本質的にＩｓｏｂｅ ｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９１，８４ ，１２４６−１２５５により記載されているように、一次血管新生化移植片とし て心臓をラットまたはマウス（ドナーとは異なる種）の腹部腔内へ移植した。オ リゴヌクレオチドは７日間アルゼットポンプを通して連続的に静脈内投与した。 心臓同種移植片の生存は腹部腔の第二の心拍の存在を聞くことによりモニターし た。実施例１３：ラットＡ−１０平滑筋細胞を用いる増殖アッセイ Ａ１０細胞を１０％ウシ胎児血清を加えたダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭ ＥＭ）を含む９６−ウェルプレートに入れ、２４時間放置して付着させた。更に ２４時間０．２％透析ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭで細胞を静止させた。静止 の最後の４時間の間に、細胞を無血清培地に溶解したＩＳＩＳ１１０６１＋リポ フェクチン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）で処理した。次に 、培地を除いて新鮮な培地に交換し、細胞を１０％ウシ胎児血清で刺激した。次 にプレートをインキュベーター内に置き、血清刺激の２４および４８時間後にＭ Ｔ Ｓのホルマザンへの変換により細胞増殖を評価した（Ｐｒｏｍｅｇａ 細胞増殖 キット）。対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１０８２（単純ヘルペスウイルスを 標的とする非相関オリゴヌクレオチド）もまた試験した。実施例１４：ラット頚動脈再狭窄モデル このモデルはＢｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４ ，９３，８２０−８２８により記載されている。ラット頚動脈のバルン カテーテル拡張により動脈内膜過形成を誘導した。ラットを麻酔し、２０ｍｌの 塩溶液で膨張させたバルン塞栓切除術カテーテルを通過させることにより総頚動 脈損傷を誘導した。オリゴヌクレオチドはプルロニックゲル溶液として動脈壁の 外膜表面に適用した。オリゴヌクレオチドは４℃で０．２５％プルロニックゲル 溶液（Ｆ１２７、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．）に所望の用量で溶解した。１００μｌ のゲル溶液を損傷直後の総頚動脈の末端３分の１に適用した。対照ラットは対照 オリゴヌクレオチドを含むゲルまたはオリゴヌクレオチドを含まないゲルで同様 に処理した。首の傷を縫合し、動物を回復させた。１４日後にラットを殺してし ゃ血し、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドで潅流して頚動脈をそ のまま固定し、切り出して顕微鏡用に調製した。動脈の断面積を計算した。 プルロニックゲル投与法と別の方法では、ラットをオリゴヌクレオチドの静脈 注射または連続的静脈内注入（アルゼットポンプを通して）により処理する。

【手続補正書】 【提出日】１９９７年１２月２５日 【補正内容】 請求の範囲 １．配列番号１および少なくとも１つの２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃修飾を有 するアンチセンスオリゴヌクレオチド。 ２．請求項１記載のオリゴヌクレオチドを含む、ヒトｒａｆの発現を阻害するた めの組成物。 ３．前記ヒトｒａｆの発現が異常な発現である、請求項２記載の組成物。 ４．請求項１記載のオリゴヌクレオチドを含む、細胞の過増殖を阻害するための 組成物。 ５．請求項１記載のオリゴヌクレオチドを含む、異常な増殖性状態を処置するた めの組成物。 ６．状態が過増殖性疾患である、請求項５記載の組成物。 ７．過増殖性疾患が癌、再狭窄、乾癬またはＴ−細胞の活性化および成長により 特徴づけられる疾患である、請求項６記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マルティーン，ピエール スイス国チェーハー−4310 ラインフェル デン，メイゼンヴェック 38 (72)発明者 アルトマン，カール−ハインツ スイス国チェーハー−4153 ライナッヒ, タネンヴェック ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１および少なくとも１つの２’−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃修飾を有 するアンチセンスオリゴヌクレオチド。 ２．ヒトｒａｆの発現を阻害する方法であって、ヒトｒａｆを発現する組織また は細胞を、請求項１記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。 ３．前記ヒトｒａｆの発現が異常な発現である、請求項２記載の方法。 ４．細胞の過増殖を阻害する方法であって、過増殖細胞を請求項１記載のオリゴ ヌクレオチドと接触させることを含む方法。 ５．異常な増殖性状態を処置する方法であって、異常な増殖性状態を有すると疑 われる患者、または前記患者の細胞、組織もしくは体液を、請求項１記載のオリ ゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。 ６．状態が過増殖性疾患である、請求項５記載の方法。 ７．過増殖性疾患が癌、再狭窄、乾癬またはＴ−細胞の活性化および成長により 特徴づけられる疾患である、請求項６記載の方法。