JPH10508689A - 唾液の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 唾液の性質を変化させる段階からなる、唾液の流れ特性の向上方法。好ましくは、上記方法は、瀘過段階および／または唾液のｐＨ／イオン強度の変更、さらには界面活性剤の添加を伴う。

Description

【発明の詳細な説明】 唾液の分析方法 本発明は、唾液の処理方法に関するものである。特に、本発明はヘリコバクタ ー ピロリ(H．pylori)に対する抗原の存在に関する診断試験に使用される唾液 の処理方法に関するものである。 唾液は、口腔内の様々な腺由来の分泌物の複雑な混合物である。多くの構成成 分の中には、様々な酵素、免疫グロブリン及びムチンが細胞破壊片や細菌叢の宿 主と共にある。特に、ムチンは唾液の粘弾性に応答し、保護及び抗細菌特性を有 する潤滑剤として作用する。これらの糖タンパク質の粘弾性は合成中に得られる タンパク質及び炭水化物組成物に依存するが、唾液の他の成分との相互作用の程 度によっても影響を受ける。例えば、脂質は、唾液の粘弾性にかなり貢献する。 免疫グロブリンを含む唾液は、様々な病気の診断に使用することができる。特 に、病原体によって産生される抗原に特異的なＩｇＧの検出は感染または最近の 保菌者(recent contact)を示す。このような感染の一例としては、ヘリコバクタ ー ピロリ(H．pylori)によって引き起こされるものがある。ヘリコバクター ピロリ（H.pylori）の感染の診断は、顕微鏡、微生物の培養若しくは胃粘膜の生 検におけるウレアーゼの検出、尿素呼気試験によってまたはＥＬＩＳＡによって 検出される血清中の特異的抗体の存在によってなされる。ヘリコバクター ピロ リ(H．pylori)は、胃粘膜に感染し、胃の分泌物の粘液中に検出されるＩｇＡ抗 体反応を誘発すると考えられる。 しかしながら、粘液分泌物中で見付かった主なヘリコバクター ピロリ(H．py lori)に特異的な抗体はＩｇＧクラスであり、ＩｇＡではないことが発見された 。ＡＵ−Ａ−９０６７６７６号には、哺乳動物におけるヘリコバクター ピロリ (H．pylori)微生物による感染の検出手段となる、ヘリコバクター ピロリ(H．p ylori) 抗原に特異的な粘液分泌物のＩｇＧの検出方法が記載される。相当する文献とし ては、ウィット(Witt)ら、フロンティアーズ イン ムコサル イムノロジー(F rontiers in Mucosal Immunology)、１巻、頁６９３〜６９６（１９９１年）が ある。 ヘリコバクター ピロリ(H．pylori) （カンピロバクター ピロリ(Campylob acter pylori)）陽性患者の唾液中のＩｇＧ抗体の存在は、アメリカン ガスト ロエンテロロジカル アソシエーション(American Gastroenterological Associ ation)の年次総会の会報でいくらか注意を引いた。１９８９年の会報でこのよう な抗体の存在がチン(Czinn)らによって開示された後、ラーセン(Larsen)らが、 １９９１年５月の会報で唾液中のＩｇＧレベルは抗生物質による治療期間中の治 療の応答の実用的な非侵襲性のマーカーであると結論付けた。１９９２年４月の 会報では、ランデス(Landes)らは、先の観察結果を確認し、ヘリコバクター ピ ロリ(Helicobacter pylori)に対する唾液のＩｇＧの測定は、特に他の試験が実 用的でない広範なまたは小児の集団において、ヘリコバクター ピロリ(H．pylo ri)陽性患者を検出するための簡単な非侵襲性の試験であることを観察した。 ＷＯ−Ａ−９３２２６８２号は、ヘリコバクター ピロリ(H．pylori)に関す る簡便で信頼性の高いインビトロ試験法を開示する。この試験は、試験される哺 乳動物の粘液分泌物中のＩｇＧ抗体と反応する抗原調製物を利用するものである 。 しかしながら、このような診断方法における唾液の使用もまた問題を伴う。こ れらの診断方法は、唾液サンプルを膜若しくはパッドに結合した抗原、または他 の同様の材料と接触させるものであることが多い。したがって、このような装置 では唾液の流動性(flow-through)が試験の必須要素である。また、実用的な流動 時間が正確で有意義な結果を得るのに必須である。しかしながら、唾液の複雑な 性質、特に微粒子及びムチンの存在のため、個々の唾液サンプルの流動性は、患 者内及び患者間でかなり変動する。 唾液中に存在する微粒子は、表面に簡単に沈着することにより膜に結合し、流 れ時間(flow time)を減少させる。ムチンは、粘弾性を有するため、ゲル様マト リッ クスを膜上に沈着させ、これにより液体の流れが抑制されるであろう。唾液の流 動時間は抗原へのＩｇＧの正確な結合に対する必要性と均衡がとれていなければ ならず、これは、流動時間は早すぎてはならず、また、試験が実用的であるため の必要性、即ち、流動時間は遅すぎてもいけないことを意味する。抗原が結合す る膜またはパッドの表面への微粒子やムチンの結合により、流動時間がかなり抑 制されてしまう。 膜へのムチン及び微粒子の沈着に関連する他の問題は、シグナルの発達に関す るものである。シグナルの発達の一つの好ましい方法は、沈着物によってトラッ プされるＩｇＧ−コロイド金複合体を利用するものである。この方法では、偽陽 性結果が生じるため、最悪の場合には、複合体が自由に通過できず、全膜が複合 体と結合してしまう。 理論的には、ムチンを除去することは可能である。しかしながら、必要な試薬 及び固相媒質では、このような方法は商業的に使用できない。したがって、他の より経済的な方法が沈着を抑制するのに、即ち、流動時間を向上させるのに必要 である。 現在、唾液は、唾液を綿パッド上に収集した後、緩衝液中に抽出し、多孔性の プラスチックフィルターで濾過するオムニサル（商標）(Omnisal^R)として既知の システムを用いて処理できる。しかしながら、このようにして製造される液体は 依然として流れ特性が良くない。 驚くべきことに、唾液サンプルの性質、例えば、粘弾性、を変化させることに よって、流動時間が向上でき、これによりより正確で感受性の高い試験が得られ ることが発見された。これは、例えば、唾液中に存在するムチンを除去する必要 がなく、その性質を変えるのみである。 したがって、本発明は、唾液サンプルの性質を変化させる段階からなる、唾液 の流れ特性の向上方法を提供するものである。特に、本発明は唾液の粘弾性を変 えることに関する。 本発明の好ましい実施態様では、唾液の性質を、上記効果を達成する瀘過媒質 に 唾液を通すことによって変化させる。好ましい瀘過媒質としては、木炭、ＤＥＡ Ｅ−セファロース及びセライト（商標）(Celite^R)等の珪藻土が挙げられ、珪藻 土が特に好ましい。瀘過媒質は微粒子を除去する。高分子量の凝集物や脂質を除 去する、機械的な剪断応力はムチンのポリマー構造を破壊することにより、流れ 特性を向上させる。 存在するムチンは、上記方法によっては除去されないが、そのポリマー構造が 変化することにより流れ特性が向上する。 本発明の第二の実施態様によると、唾液サンプルの性質は、界面活性剤の添加 及び唾液サンプルのイオン強度および／またはｐＨを調節することにより操作で きる。これは、唾液サンプルを適当な緩衝溶液中に通過させることにより達成で きる。当然、唾液の性質がこのようにして調製される際には、粒状物質を除去す る別の瀘過段階を含むことも有用である。 したがって、本発明の特に好ましい実施態様によると、唾液サンプルを、唾液 の性質を変える瀘過媒質に通すだけでなく、適当な緩衝溶液に通過させることに よってそのｐＨおよび／またはイオン強度を調節し、界面活性剤を添加する。 本発明の方法は、唾液中に見付かる特異的な抗体に関する迅速な診断試験に特 に使用できる。したがって、さらなる概念によると、本発明は、唾液の性質、例 えば、粘弾性を変えることにより流れ特性を改善する段階からなる唾液のサンプ ルにおける抗体の検出方法を提供するものである。本明細書中に記載されている とおり、上記は瀘過および／または緩衝液による操作によって達成できる。 好ましくは、試験は、ヘリコバクター ピロリ(H．pylori)に特異的な抗体、 通常、ＩｇＧの検出を目的とするものである。 このような診断方法は、一般的に、抗原が結合する膜またはパッドからなる診 断キットを用いて行われる。したがって、さらなる概念によると、本発明は、唾 液サンプルの性質、例えば、粘弾性を変化させる手段からなり、上記手段が瀘過 材料および／または緩衝溶液の形態で提供され、上記形態のいずれかまたは双方 が試験領 域に使用される前に唾液サンプルの流れ特性を変化できる、唾液のサンプルにお ける抗体の検出用キットを提供するものである。 本発明を、下記実施例を参照しながら説明するが、下記実施例により本発明が 制限されるものではない。 実施例は以下の図面を参照する： 図１は、セライト（商標）(Cel1te^R)による瀘過段階を含むまたは含まない場 合の唾液の流れ時間を示すものである； 図２は、セライト（商標）(Celite^R)による瀘過段階を含むまたは含まない場 合のＩｇＧ−金複合体の流れ時間を示すものである。実施例 唾液サンプルは、オムニサル（商標）(Omnisal^R)（サリヴァ ダイアグノステ ィック システムズ インコーポレイテッド(Saliva Diagnostic Systems，Inc. )、１１７１９ エヌイー ９５ス ストリート、バンクーバー、ダブリューエ ー９８６８２(11719 NE 95th Street，Vancouver,WA 98682)、アメリカ）の唾液 収集及び処理システムを用いて多くのヒトから集めた。しかしながら、唾液を下 記緩衝液中に抽出した：０．５％（ｖ／ｖ）ツィーン６０、１２５ｍＭ ＮａＣ ｌ、１０ｍＭ アジ化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡを含む２０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０。 唾液をオムニサル（商標）(Omnisal^R)のフィルターでまたはセライト（商標） （Celite^R）で濾過することにより緩衝液中に抽出した。次に、このようにして 得られた溶液１ｍｌを、抗原がスポットされた膜を含むヘリサル（商標）(Helis al^R)ラピッドテストカード(rapid test card)上に置き、流動時間を記録した。 また、唾液後、１ｍｌのＩｇＧ−金複合体を加え、流動時間を記録した。結果を 下記に示す。結果 ディスカッション 図１及び２は上記データをグラフで示すものである。下記点が明らかである： ｉ）唾液サンプル自体及びＩｇＧ−金複合体の流れ時間は双方とも処理段階の 結果、減少する； ｉｉ）加えて、双方の場合における流れ時間はサンプル間で非常に変動が少ない 。 また、上記したように処理されたサンプルは、ＩｇＧ−金のトラップにより背 景の色がかなり抑制され、偽陽性の数が非常に減少する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ (72)発明者 スミス，クリストファー，ジョン イギリス国，クルウィド エルエル17 ０ ティイー，ルアルト，トレマイアーチオン レイン，イスフライン （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 唾液を木炭、ＤＥＡＥ−セファロースまたは珪藻土である瀘過媒質に通 過させることにより唾液の性質を変化させる段階からなる、唾液の流れ特性の向 上方法。 ２． 唾液の粘弾性を変化させる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３． 該瀘過媒質がセライト（商標）である、請求の範囲第２項に記載の方法 。 ４． 唾液のｐＨおよび／またはイオン強度を操作し、界面活性剤を添加する 段階からなる、唾液の流れ特性の向上方法。 ５． 該唾液サンプルに請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の瀘過 段階をも施す、請求の範囲第４項に記載の方法。 ６． 請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法を用いて、唾液の 性質を変えてその流れ特性を向上させることからなる、唾液サンプルにおける抗 体の検出方法。 ７． 該抗体がヘリコバクター ピロリ(H．pylori)に特異的な抗体である、 請求の範囲第６項に記載の方法。 ８． 該ヘリコバクター ピロリ(H．pylori)に特異的な抗体がＩｇＧである 、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９． 唾液の性質を変えてその流れ特性を向上させることを目的として、木炭 、ＤＥＡＥ−セファロースまたは珪藻土である瀘過媒質からなる、唾液サンプル における抗体の検出用キット。 １０． 該瀘過媒質がセライト（商標）である、請求の範囲第９項に記載のキッ ト。 １１． 該キットがさらに緩衝液および／または界面活性剤からなる、請求の範 囲第９項または第１０項に記載のキット。