JPH10507931A - 植物において不稔性を維持するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 植物において不稔性を維持する方法を開示する。本方法は、選択薬剤に対する耐性を付与する耐性遺伝子に遺伝的に結合される不稔性遺伝子での親植物株の遺伝的な形質転換、トランスジェニック親植物株を増強する工程、および増強されたトランスジェニック親株の種子を耐性遺伝子が付与する耐性に対する選択薬剤を含む組成物でコートする工程を包含する。この耐性遺伝子は、誘導可能な遺伝子の制御下であり得るか、あるいは、構造プロモーターまたは組織特異的（種子特異的を包含する）プロモーターの制御下であり得る。

Description

【発明の詳細な説明】 植物において不稔性を維持するための方法 発明の分野 本発明は、植物において不稔性遺伝子を維持するための方法、およびこの方法 を用いて生産された植物に関する。 発明の背景 植物育種の目的は、一品種の親株またはハイブリッドの種々の所望の特性を有 する親株を組み合わせることである。農作物においては、これらの特性は、病害 および昆虫に対する抵抗性、熱および渇水に対する耐性、作物の成熟までにかか る時間の短縮、より多い収量、ならびにより良い作物学的品質を包含し得る。多 くの作物を機械的に収穫することにおいて、発芽および苗立ちの確立、生長速度 、成熟度、ならびに果実のサイズのような植物の特徴の均一性は重要である。 農作物は、植物の受粉方法を利用する技術により育種される。植物は、１つの 花からの花粉が同じ植物の同じまたは別の花に移される場合、自家受粉である。 植物は、花粉が異なる植物の花からもたらされる場合、交差受粉（cross-pollin ated）である。 アブラナ属においては、植物は、通常、自家不稔性であり、そして交差受粉の みであり得る。ダイズおよび綿のような自家受粉種において、雄性器官および雌 性器官は解剖学的に並置している。自然受粉の間、既知の花の雄性生殖器官は同 じ花の雌性生殖器官に受粉する。 メイズ植物（Zea mays L.）は、それらが自家受粉および交差受粉の両方の技 術により育種され得るという独特の様相を示す。メイズは、同じ植物において、 雄穂に位置する雄花および雌穂に位置する雌花を有する。メイズは、自家受粉ま たは交差受粉し得る。メイズにおいては、風が花粉を雄穂から初期雌穂の先端か ら突出する毛までまきあげる場合に、自然受粉は起こる。 植物において稔性を制御する信頼の高い方法は、改良植物育種およびハイブリ ッド生産についての機会を提供する。特に、雄性稔性の制御は、ハイブリッドの 商業的生産に有意に関連する。これは、特に、ハイブリッドとして唯一販売され る作物種（例えば、サトウモロコシおよびメイズ）の開発に有効である。これら の両方は、雄性不稔性系のいくつかの種において歴史的に信頼されている。さら に、このような方法は、ダイズ、ヒマワリ、カノラ、コムギ、および過去におい てハイブリダイゼーションに影響を受けなかった他の植物のような作物において 有用である。 メイズハイブリッドの生産は、実質的な同型接合性同系交配株の開発、これら 株の交配、および交配物の評価を必要とする。株育種および再生選択は、集団か ら同系交配株を開発するために使用される２つの育種方法である。育種プログラ ムは、２種以上の同系交配株または種々の広範な供給源の所望の特性を、自家受 粉および所望の表現型の選択により開発される新規の同系交配株由来の育種プー ルに組み込む。ハイブリッドメイズ品種は、このような同系交配株の２種の交配 であり、それらのそれぞれが、一方または一方の相補物が欠く１つ以上の所望の 特徴を有し得る。新規の同系交配物は他の同系交配株と交配され、そしてこれら の交配物由来のハイブリッドは商業可能性を有することを決定するために評価さ れる。第１世代のハイブリッド後代はＦ₁と称される。ハイブリッドの開発にお いて、Ｆ₁ハイブリッド植物のみが探索されている。Ｆ₁ハイブリッドは、その同 系交配の親よりもよく育つ。このハイブリッドの生長力、すなわち雑種強勢は、 増強された植物的生長および増大された収量を包含する、多くの様式で示され得 る。これらの雑種強勢の提示は、商業的な立場から特に重要である；増大された 収量は、コーン種子企業および農夫の両方に特に重要であり、そして高収量ハイ ブリッドコーン株はコーン種子産業界においてえり抜きの商業産物になっている 。 ハイブリッドメイズ種子は、代表的には、手作業の雄穂除去を含む雄性不稔性 系により生産される。メイズの２つの同系交配種が交互に帯状に畑で栽培され、 そして花粉を有する雄穂が同系交配物の１方（雌性）から除去される。外来性の メイズ花粉の供給源からの十分な単離により、雄穂を除去された同系交配物の雌 穂が他（雄性）の同系交配物からの花粉によってのみ稔性になり、そして得られ る種子は、それゆえ、ハイブリッドであり、ハイブリッド植物を形成する。 手作業による雄穂除去プロセスは非常に信頼性があるが、残念なことに、それ はまた、特定の重要な時期の内に実施しなければならない非常に過酷な労働プロ セスである。そして労働者が不足するかまたは確保されなければ、雄穂除去の重 要な時期は損なわれ得る。さらに、雌性植物は、場合によって、嵐により吹き飛 ばされ、そして雄穂除去を回避する。さらに、環境因子は、手作業の雄穂の完全 な除去後に、植物に第２の雄穂の形成を引き起こし得る。あるいは、雄穂除去者 が植物の雄穂を完全に除去しないか、若芽が雌性植物を形成し得るか、または雄 穂が輪生の最中に落穂し得る。いずれの場合においても、このような雌性植物は 十分に落粉し、そしていくつかの雌性植物は自家受粉される。このことは、生産 することを目的とするハイブリッド種子に加わって採集される雌性同系交配物の 種子をもたらす。同系交配株は、一般に、商業的販売が意図されないため、ハイ ブリッドの商業的収量を有さない点で著しく不都合であり、そして同系交配物は 、代表的には、法的に保護されない限り公的に利用可能なように作成されない。 あるいは、雌性同系交配物は、機械的に雄穂を除去され得る。機械的雄穂除去 は、手作業の雄穂除去とほぼ同様に信頼性があるだけでなく、より早くそして低 コストである。しかし、多くの雄穂除去機械は、手作業の雄穂除去より植物に損 害を与え、そして機械的雄穂除去後の最終的な作業の仕上げは常にどんな場合に おいても手作業の雄穂除去を必要とする。従って、現在、雄穂除去の様式は十分 に満足するものではなく、そして生産コストをさらに削減し、かつハイブリッド 種子の生産における自家受粉を排除する代替法についての必要性が存在し続けて いる。 面倒な雄穂除去プロセスは、細胞質雄性不稔性（CMS）同系交配物の使用によ り回避され得る。CMS同系交配の植物は、核ゲノムではなく、細胞質ゲノムから もたらされる因子の結果として雄性不稔性である。従って、この特徴は、メイズ 植物の雌性親を介して独占的に受け継がれる。なぜなら、雌性のみが細胞質に稔 性種子を提供するからである。CMS植物は、雄性不稔性ではない別の同系交配物 からの花粉により稔性化される。第２の同系交配物からの花粉は、ハイブリッド 植物の雄性稔性をもたらす遺伝子に寄与し得るかまたはしなくてもよい。通常、 雄穂除去された正常なメイズからの種子および同じハイブリッドのCMSがもたら した種子は、ハイブリッド植物が生長するときに、適切な花粉量が稔性のために 利用され得ることを確実にするように混合されなければならない。 CMSには他の欠点が存在し得る。１つは、CMSの特異変異体の特定の作物病に対 する罹病性との従来観察された関連性である。この問題は、ハイブリッドメイズ の生産において特定のCMS変異体の使用の実質的な放棄をもたらしたが、他のCMS 系は現在も使用されている。 核雄性不稔性として知られる遺伝的雄性不稔性の１つのタイプである不稔性の 他の形態が、Brarらの米国特許第4,654,465号および同第4,727,219号に記載され る。しかし、この遺伝的雄性不稔性の形態は、ゲノム内の別の位置の複数の変異 遺伝子の維持を必要とし、そして遺伝子を追跡し、かつ系の使用を簡便にする複 合マーカー系を必要とする。Pattersonはまた、効果的であるが複雑である染色 体トランス移動（translocation）を含む核雄性不稔性系を記載した。米国特許 第3,861,709号および同第3,710,511号を参照のこと。 多くの他の試みが、これらの欠点を改善するためになされてきた。例えば、Fa bijanskiらは、植物に雄性不稔性を引き起こすいくつかの方法を開発した（EPO 89/3010153.8（公開番号329,308）およびPCT出願第PCT/CA90/00037号（WO 90/08 828として公開）を参照のこと）。１つの方法は、雄性組織に特異的なプロモー ターに結合した細胞傷害性物質をコードする遺伝子を植物に送達することを包含 する。別の方法は、稔性に重要である遺伝子が同定され、そして稔性遺伝子にア ンチセンスである遺伝子が植物に挿入されるアンチセンス系を包含する。Marian iらもまた、雄性組織特異的プロモーターに加えていくつかの細胞傷害性をコー ドする遺伝子配列を示し、そしてアンチセンス系について述べている。EP 89/40 1,194を参照のこと。さらに他の系は、雄性稔性に重要な別の遺伝子の発現を阻 害する「リプレッサー」遺伝子を使用している。PCT/GB90/00102（WO90/08829と して公開）。 雄性稔性系について進められている本発明の他の局面は、雄性稔性に影響する 遺伝子の同定に関する。このような遺伝子は、種々の系において雄性稔性を制御 するために使用され得る。以前に、雄性稔性遺伝子は、トランスポゾン誘導性雄 性不稔性変異体によりArabidopis thalianaにおいて同定され、そしてその遺伝 子は、次いで、クローン化されている。Aartsら、「Arabidopsisにおける雄性不 稔性遺伝子のトランスポゾンのタグ化」、Nature、363：715-717(1993年６月24 日)。別の重要な雄性稔性遺伝子は、係属中の米国特許出願第07/537,183号の一 部継続出願である、係属中の米国特許出願第08/013,739号に開示されている。Al bertsenら、Am．J．Botany 80：16(1983)もまた参照のこと。 雄性不稔性を達成するために使用される系に関係なく、上記のように、雄性不 稔性は商業的ハイブリッドの生産において非常に重要である。商業的生産の分野 において、非不稔性化雄性の存在は被害の大きな結果をもたらし得る。なぜなら 、意図されない交配および／または自家受粉種子が生じ、そして結果的に「汚染 物」（この内容においては、生産されることが意図されるハイブリッドの種子以 外の遺伝的修飾を有する種子である）が存在する。 一旦トランスジェニック雄性不稔性親株が生産されると、メイズ同系交配物の 後代において、それは雄性不稔性遺伝子の維持のためのストラテジーの開発、お よび雄性稔性の除去に重要になる。これは、商業的な種子生産においての利用の ために必須である。例えば、１つのストラテジーは、雄性不稔性遺伝子とBar除 草剤耐性遺伝子とを結合し、そして外部交配（outcrossing）によるヘテロ接合 体としてのこの特性を維持することである。これから得られる外部交配後代は、 不稔性：稔性（１：１）に分離する。この様式で、稔性植物は適切な除草剤のス プレー適用により除去され得る：例えば、Basta^TMである。 いくつかの制限がこのアプローチに関連する。除草剤の散布はそれ自身が潜在 的に危険な実施であり、そして散布に必要とされる特別の装置のコストは、しば しば、非常に高い。また、いくつかの除草剤は、特に、生存する植物の健康に破 壊的な影響を有し得、そしていくつかの場合において潜在的に長い期間の影響を 有し得る。例えば、グリホセートは、分裂組織中に移動し、そして蓄積されるこ とが知られ、そしてこれは稔性にネガティブに影響し得る。さらに、このアプロ ーチの著しい制限は除草剤の漂流であり、これはハイブリッド種子生産において 非トランスジェニック雄性親を枯死させる。しかし、当業者は、これらは除草剤 の問題というよりも散布もしくは適用の問題、または全植物の処理の問題である ことを認識する。漂流を回避する除草剤適用のための別の方法は、この問題を軽 減する。 真菌に対する防御および機械的強度の維持のための種子のコーティングが、Mc Newらにより発表された米国特許第4,438,593号に記載されている。接着剤を用い てCaptan^TMまたはホスフィノトリシン誘導体で種子をコートすることがまた、Mc Newらの特許、ならびに米国特許第5,145,777号（Goodmanら）およびカナダ特許 第1,251,653A号に記載されている。除草剤耐性をもたらすための植物の遺伝的な 形質転換は、作物科学の分野において周知である（例えば、米国特許第4,975,37 4号を参照のこと）。さらに、米国特許第5,369,022号は、除草剤に対する遺伝的 に与えられた耐性を組み込むことと、作物の種子を解毒量のその除草剤に対する 化学的な毒性緩和剤で処理することとを組み合わせることによる、除草剤による 損傷からの作物の保護を改善するための方法を開示している。しかし、不稔性植 物を維持するための、種子コーティング、遺伝的に誘導された耐性、および遺伝 的な形質転換の新規の組み合わせは、上記で概説した問題の多くを有する後代に おいて不稔性遺伝子を維持する独特の方法を提供する。 発明の要旨 本発明は、植物において不稔性を維持するための方法を提供する。この方法は 、トランスジェニック親植物株の発生を包含する。この植物株は、例えば、除草 剤、抗生物質、4-メチルトリプトファン（4-methyltryptohan）（4-mT）などの ような基質などの選択薬剤に対して耐性を付与する遺伝子に遺伝的に結合された 不稔性遺伝子を包含する。トランスジェニック親植物株は、通常の植物育種方法 により増強され、そして増強したトランスジェニック親植物株の種子は耐性遺伝 子が付与する耐性に対する選択薬剤を含む組成物でコートされる。本発明の実施 において有用な不稔性遺伝子は、例えば、pAN::Tox遺伝子、damメチラーゼ遺伝 子、ACCシンターゼ遺伝子などを包含する。 本発明は、不稔性遺伝子が、選択薬剤（例えば、除草剤、抗生物質、またはい くつかの他の適切な薬剤（例えば、4-mTのような毒性基質））に対する耐性を付 与する遺伝子に遺伝的に結合されていることを示す。この耐性遺伝子は構造プロ モーターの制御下であり得るか、あるいは種子特異的プロモーターの制御下であ り得るか、あるいは誘導遺伝子の制御下であり得る。この誘導遺伝子は、例えば 、ホルモンに誘導される遺伝子であるか、または別の非ホルモン化学基質（例え ば、非ホルモンタンパク質、化学的「毒性緩和剤」、または化学リガンドのいく つかの他の形態）に誘導される遺伝子である。本発明の方法のこの実施態様によ れば、親株の種子は、遺伝的に付与された耐性に対する選択薬剤ならびに耐性を 誘導する化学薬品の両方の有効量を含む混合物によりコートされる。さらなる別 の実施態様において、耐性遺伝子は種子特異的プロモーターの制御下であり得る 。これらの実施態様の特定の利点は、耐性遺伝子の発現が種子の発育の時期に制 限され得るという事実に関する。従って、これらの実施態様は、政府の調節管理 下にある遺伝子の発現を制限または限定することにおいて特定の利点を有する。 特に、本発明のこれらの実施態様（特に種子特異的プロモーターの使用に関する 実施態様）は、種子の耐性遺伝子の発現を制限すること、およびヒマワリ、サト ウモロコシ、およびカノラのような作物、耐性が野生種中に外部交配され得る作 物における耐性に関連する潜在的な通常の問題を回避することの利点を有する。 これらの実施態様は、植物の生涯を通して植物全体で耐性遺伝子を推定的に発現 し得る植物を生じる種子を売買する必要性を避けるさらなる利点を提供する。 本発明の方法の目的は系を提供することである。それによって選択薬剤（例え ば、除草剤）の植物種子への適用が、野生型の植物の死および耐性植物の生存を もたらす。そして、スプレー適用または一般（植物全般）の環境的な適用の他の 形態が回避され、そして野生型の雄性稔性植物の死および耐性植物の生存が、発 育の初期、および特定の実施態様において選択される時期で達成され得る。 本発明の方法の一般的な利点は、田畑の植物に潜在的に危険な化学薬品を適用 する必要性の回避であり、それによって環境で使用されるおよび導入されるこの ような化学薬品の量が減少される。本発明のさらなる利点は、本方法が、ダイズ のような自家受粉品種、およびサトウモロコシのような手作業の雄穂除去の影響 を受けにくい品種において、ハイブリッドの発育を促進することである。 さらに、本発明は、コートされたトランスジェニック種子をまくこと、それか ら成熟したトランスジェニック雄性不稔性植物に生長させること、成熟した雄性 不稔性植物を稔性化すること、および稔性化されたこれらの植物の種子を採集す ることをさらに予期する。本発明は、さらに、本発明の方法により生産された種 子に関する。 図面の簡単な説明 図１は、pPHP610プラスミドのプラスミドマップを示す。 発明の詳細な説明 トランスジェニック親植物株は、当該分野で公知のいくつかの方法（例えば、 マイクロプロジェクタイルボンバードメント(microprojectile bombardment)、 マイクロインジェクション、アグロバクテリウム媒介法、エレクトロポレーショ ンなどを含む）を用いて作製され得る。一般には、GlickおよびThompson、Metho ds in Plant Molecular Biology and Biotechnology、CRC Press、1993を参照の こと。当業者に公知のように、形質転換方法および条件の選択は、本発明の方法 に供される植物種に依存して変化する。 不稔性を付与する任意の遺伝子構築物が、本発明の方法に適用され得る。例え ば、本発明の方法の好ましい実施態様において、不稔性を付与する構築物は、pA N::tox構築物である。不稔性を付与するために有用な他の遺伝子が、当該分野で 記載されており（上記の参考文献を参照のこと）、例えば、damメチラーゼおよ びACCシンターゼを含む。本明細書中で用いられる「不稔性遺伝子」は、活性を 促進、または不稔性を付与する遺伝子を意味し、そして異種遺伝子（例えば、バ ルナーゼ遺伝子、damメチラーゼ遺伝子など）を含有し得るか、または稔性遺伝 子に対してアンチセンスである遺伝子を構成し得る。 本発明はまた、選択薬剤に対する耐性を付与する、遺伝的に不稔性遺伝子に結 合している耐性遺伝子の使用を含む。「遺伝的に結合している」は、本明細書中 で、２つの遺伝子間の直接または間接のいずれかの結合を意味し、その２つの遺 伝子は、形質転換中に同一の形質転換事象において植物細胞内に送達され、そし て親の種子がこれらの機能的結合を維持する遺伝子を増幅する間のような様式で 受容植物の遺伝的物質に組み込まれる。 本発明の方法は、不稔性遺伝子と耐性遺伝子（例えば、除草剤耐性もしくは抗 生物質耐性のための遺伝子、または毒素もしくは別の選択基質を代謝し得るよう に代謝を変化する遺伝子）との遺伝的な結合に関する。耐性遺伝子は、対応する 選択薬剤に対する耐性：除草剤耐性遺伝子は除草剤に対する耐性；抗生物質耐性 遺伝子は抗生物質に対する耐性；および他の化学薬品耐性遺伝子はそれらのそれ ぞれの化学薬剤に対する耐性（例えば、４-mTに対する耐性を付与するトリプト ファンデカルボキシラーゼのための遺伝子）を付与する。本発明の方法の１つの 実施態様において、不稔性遺伝子は、除草剤耐性を付与する遺伝子に遺伝的に結 合している。耐性は、アミノ酸合成インヒビター、光合成インヒビター、脂質イ ンヒビター、生長調節因子、細胞膜破壊因子、色素インヒビター、幼植物生長イ ンヒビターなどを包含するいくつかのグループの除草剤に対して付与され得、そ して本発明の方法に適用し得る特異的な除草剤の例としては、イミダゾリノン、 スルホニルウレア、トリアゾロピリミジン、グリホセート、セトキシジン、フェ ノキサプロップ、グルホシネート（例えば、ビアラホス）、トリアジン、ブロモ キシニルなどが挙げられる。例えば、Holt，J.S.、除草剤耐性のメカニズムおよ び作物学的局面、Ann．Rev．Plant Physiol．Plant Mol．Biol．44: 203-29，19 93；Wilminkら、単子葉植物の形質転換のための選択薬剤およびマーカー遺伝子 、Plant Mol．Biol．Rept．11，1993；Gunsolus、化学薬品系図、Soybean Diges t，April，1993を参照のこと。本発明の特異的な実施態様において、市販されて いる除草剤Basta^TMが使用される。本発明の方法のこの実施態様において使用す るために適切な遺伝子は、例えば、Bar、PAT、aroA、Epsps、corl-l、bxn、およ びpsbAを含む。 本発明の別の実施態様において、不稔性遺伝子は、抗生物質耐性を付与する遺 伝子に遺伝的に結合している。本発明の実施において有用な抗生物質は、例えば 、アミノグリコシド抗生物質（例えばカナマイシン、ゲンタマイシン、G418、ネ オマイシン、パロマイシ、およびハイグロマイシン）を含み、そして本発明のこ の実施態様の実施において有用な遺伝子は、例えば、NPT II，E．coliのTn5に由 来するaphA2遺伝子、およびE．coli由来のpht-aphlV遺伝子を含む。Wilminkら（ 前出）を参照のこと。Bowen，B.A.、植物遺伝子転移のためのマーカー、Transge nic Plants，第１巻、Engineering and Utilization，1993；Everettら、ヒマワ リ （Helianthus annus L.）の遺伝子操作、Bio/Technology 5: 1201-1204(1987)； Bidneyら、Plant Mol．Biol．18: 301-313(1992)もまた参照のこと。 本発明のなお別の実施態様において、不稔性遺伝子は、特定の化学薬品（例え ば植物に対して毒性である）に対する耐性を付与する耐性遺伝子に結合している 。一例は、４-mTに対する耐性を付与するトリプトファンデカルボキシラーゼの 遺伝子である。Goodijinら、植物細胞における新規の選択マーカーとしてのキメ ラトリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子、Plant Mol．Biol．22: 907-912， 1993を参照のこと。Bowen（前出）もまた参照のこと。 本発明の１つの実施態様において、耐性遺伝子は、構造プロモーターの制御下 に存在する。本発明の別の実施態様において、耐性遺伝子は、特定の化学薬品に より誘導されるプロモーター（誘導プロモーター）の制御下に存在する。例えば 、耐性遺伝子は、ホルモン（例えば、タンパク質ホルモンまたはステロイドホル モン）により、または化学的な「毒性緩和剤」により誘導され得る。本発明の実 施において効果的なステロイドホルモンの例は、エストロゲン、グルココルチコ イド(glucocorticids)、などである。例えば、Gronemeyer、エストロゲンおよび プロゲステロンレセプターによる転写活性化、Ann．Rev．Genet．35: 89-123，1 991を参照のこと。GlickおよびThompson（上記）、特に誘導プロモーターの論議 についてのGraberおよびCrosby、植物形質転換のためのベクター、（89〜119頁 ）もまた参照のこと。他の化学薬剤の論議については、HersheyおよびStoner、 コーンにおいて置換ベンゼンスルホンアミドにより誘導されるRNA種のcDNAクロ ーンの単離および特徴付け、Plant Mol．Biol．17: 679-690を参照のこと。「毒 性緩和剤」の論議については、米国特許第5,364,780号もまた参照のこと。これ らの後者の別の実施態様において、種子が特定の選択薬剤とともに誘導遺伝子が 応答する特異的な化学薬品を含有する混合物でコートされることは、当業者に明 らかである。あるいは、組織特異的、またはより詳細には種子特異的発現が遺伝 的に提供され得る。GlickおよびThompson（前出）。 一旦適切なトランスジェニック親株が形成されると、本発明の方法は、植物の 品種改良業界において周知である方法を用いた親株の増産を含む。一旦親株が十 分に増産されると、増産した株の種子は、植物の品種改良業界で周知であり、か つ承認された方法により回収され得る。 増産したトランスジェニック親株から回収された種子は、任意の従来の方法で コートされ得る。例えば、本発明の１つの特異的な実施態様において、Captan^TM （N-トリクロロメチルチオ-4-シクロヘキセン-1,2-ジカルボキシイミド[活性成 分]、ジプロピレングリコール[接着剤]、およびポリオキシ(polyox)(WSRN10)[接 着剤](最終濃度42.5％のCaptan^TM、54.5％のジプロピレングリコール、および３ ％のポリオキシ)）の10％活性成分作用溶液の等量を、市販処方物のBasta^TM（20 ％ホスフィノトリシン[DL-ホモアラニン-4-イル-(メチル)-ホスフィン酸；Droge ら、Planta 187: 142-151，1992を参照のこと]、活性成分）と１：１(vol/vol) の比で混合する。混合物は、任意の簡便な方法で種子に適用され得る。コーティ ングは、連続的な処理工程が現在は好まれるが、連続的な処理（Captan^TM、次い で選択薬剤、そして適用可能な場合にはインデューサー）または同時の処理のい ずれかにおいて行われ得る。あるいは、処方は、当業者により容易に理解される ；例えば、Captan^TM作用溶液とメチオニンスルホキシイミン(MSO)との１：１(vo l/vol)混合物が使用され得る。あるいは、種々の結合因子および別の選択薬剤の 処方物は、増大した濃度の結合因子および／または選択薬剤を含有するコーティ ング混合物でコートした種子の発芽についてスクリーニングすることにより効力 を日常的にスクリーニングされ得る。そして類似のスクリーニングプロセスが、 誘導系を使用して、本発明の実施のための付加的な別の化学的リガンドを含有す るコーティングのために簡便に行われ得る。 コートした種子を乾燥させた後、これらを植物型に対して適切に播き、耐性不 稔性種子を発芽させ、そして生長させる。次いで、ハイブリッド植物生産を、植 物の品種改良業界で周知の方法に従って行い得る。 以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、本発明の範囲を限定す ることを意図しない。 実施例１ 幼植物の生存における種子のコーティングの効果 本実施例は、野生型の種子およびトランスジェニック種子の幼植物の生存にお ける種子のコーティングの効果を決定するために行った実験の結果を示す。 材料および方法 種子をトランスジェニックTO植物品種および野生型Hi-II植物から得た。特に 記載しない限り、種子を、自家受粉したTO子孫がBar遺伝子を有する／有さない ことを示すPCR分析のために砕いた。次いで種子を、Captan^TM（種子の生産に用 いられる標準的な10％活性成分作用溶液）とBasta^TMの市販処方物（20％活性成 分）との１：１混合物中に浸した。同様の種子のコーティングを、Captan^TMとメ チオニンスルホキシイミン（20％水溶液）との１：１混合物を用いて行った。次 いで、種子を空気乾燥し、Captan^TMに特徴的なピンク色にした。Bar陽性種子を 、Bar陰性種子とは区別した温室の鉢に播いた。後の実験において、PCRのために 砕き、Basta^TM-Captan^TMでコーティングした種子を温室の鉢に播き、そして生存 している植物からPCR分析のための葉材料を回収した。 野生型のメイズの種子をBasta^TM-Captan^TMでコーティングまたは未処理のまま のいずれかにし、そして別の鉢に播いた。13個の種子を除き、全ての未処理の種 子が発芽し、そして幼植物を形成した。しかし、Basta^TM-処理した種子は、発芽 および幼植物に発育し得なかった。これらの結果は、Basta^TMの種子表面への適 用が、この除草剤の致死量を適用する有効な方法であることを示唆した。 次いで、この除草剤の適用方法をトランスジェニック種子を用いて繰り返した 。Basta^TMまたはMSO処理する前に、砕いたトランスジェニックT1種子をPCRし、 どれがBar陰性およびBar陽性であるか決定した。２回目の種子のコーティング実 験からの結果を、表１に列挙する。Bar陰性であった種子は存在して幼植物を形 成しなかったが、Basta^TMまたはMSOコートしたBar陽性種子はそれぞれ80％およ び53％で植物体まで生育した。Bar陰性種子は生存可能で、そして発芽して根を 形成したが、枝の形成はしなかった。MSO処理したBar陰性種子でも同じであるこ とが明らかであった。 種子へのBasta^TMまたはMSOのコーティングの利点を以下に示す：第１に、これ は迅速な方法であり、これにより何千もの種子を数分間で処理し得る。第２に、 この技術は、種子の処理としてのCaptan^TMの現行の使用に完全に適合する。第３ に、この方法は、例えば、高価な装置の必要性、除草剤の吹き溜まり、および上 記の他の問題のような、スプレーに関連する問題を軽減する。第４に、この方法 は、重要な問題に対して化学的精密さと簡潔さを備え、かつ新規の解決法である 。 表１に示すように、Basta^TMで処理したBar陽性種子の85％が生存し得ることと 比較して、MSOで処理したBar陽性種子は約半分しか生存し得ない。この実際の理 由はいまだ解明されていない；理論により限定されることを意図しないが、その 理由は、過剰のMSOが種子の表面に適用されたこと、そしてより低いレベルがBar 陽性形質転換後代のより好ましい生存性をもたらしたことであり得る。 実施例２ 除草剤コーティング生長チャンバー(chamber)試験および実地試験 ４つの別々の系統バックグラウンドにおける除草剤耐性特性の発現について試 験するために、生長チャンバーで予備実験を行った。本研究の第２部は、1994年 の生長期の間、２つの場所（Dysart，IAおよびJohnston，IA）において行われた 実地特性であった。実地試験は、USDA Enviromental Release Permit #94-056-0 5Nに掩護された。 材料および方法 １）予備生長チャンバー試験 この予備試験のための処理は、４つの遺伝型と除草剤コーティングの３つの割 合との階乗の組み合わせであった。種子を、種々の選良した雌性の同系交配した 親（同系交配株Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）の交配により２つのトランスジェニック（ 35S::BAR）T1集団から得た。５月６日に、個々のバッチ（１バッチあたり30種子 ）を0.08mlのCaptan^TMで処理した。Captan^TMの適用の直後に、各バッチを、Bast a^TM（Hoechst）として知られる20％活性成分濃度のグルホシネート含有除草剤の 溶液の０、0.012ml、または0.60ml（「ゼロ」、「低い」、および「高い」）の いずれかで処理した。Hans-Ulrich Hegeにより製造された回転処理機(「HEGE11 」)を使用し、Captan^TMおよびBasta^TM処理に適用した。 ３つのプラスチックボックスのそれぞれを、２kgの空気乾燥した土で満たした 。５月６日に、各ボックスに３列（１列あたり15種子）の単一の遺伝子型を播い た。列は、Basta^TMのゼロ、低い、または高い割合のいずれかを示す。乾燥した 土をペーパータオルで覆い、次いで500mlの水道水をタオルの上に注いだ。水が 土に吸収されたあとでタオルを除去した。ボックスを蓋でシールし、次いで暗く 、22℃に設定した温度制御チャンバーに置いた。５月17日に発芽数を記録した。 黄化した幼植物を未処理のコントロールと比較した外観に基づいて正常または異 常のいずれかに分類した。発芽した幼植物に由来する組織を回収し、そしてサザ ンプロフィールデータを作成するために使用した（以下の実施例３）。 II．実地試験 実験のための処理は、４つの遺伝型と除草剤コーティングの６つの割合との階 乗の組み合わせであった。各遺伝型が、全プロットであり、そして単一の列（長 さ17.5フィート）の各除草剤コーティングの割合がサブプロットであった。完全 な実験を、ランダム化した完全なブロックデザインとして各位置において３つの 複製物を用いて計画した。種子を、実施例１の選良した雌性の同系交配した親（ 同系交配株Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）の交配により２つのトランスジェニック（35 S::Bar）T1集団から得た。５月18日に、小さいバッチ（１バッチあたり325種子 ）を、0.86mlのCaptan^TMスラリーで処理した。翌日、個々のバッチの種子を０、 1.30、2.06、3.90、5.20、または6.50mlのいずれかのBastaで処理した。HEGE11 を、Captan^TMおよびBasta^TM処理を適用するために使用した。Basta^TMの適用の １日後、全ての種子をタルク粉末でコートし、種子が播かれる間にともにくっつ くことを防いだ。 従来の耕作法を使用して、各位置で良好な種子床を準備した。二重の除草剤を 、Dysartにおいて播種前の種子制御のために混合した。種子を、従来のプッシュ プランター(push planter)を用いて手作業で２〜５cmの深さに播いた（１列あた り28種子）。播いた日は、Johnstonについては５月27日、およびDysartについて は６月１日であった。Pounce^TMを、Johnstonにおいて６月３日にネキリムシの制 御のために適用した。実験中に発生する雑草を、手で除草した。 Johnstonの６月７日、およびDysartの６月17日の各サブプロットについての発 芽データを記録した。Johnstonの６月21日〜24日、およびDysartの６月27日〜28 日の間に、実験の各植物体に、植物に非常に近接した地面に立てた小さいプラス チックの支柱の上に記録した同定番号を与えた。同時に、小さな葉のパンチ(pun ch)を植物体の上方の葉から取り出し、次いで標識したプラスチックバイアル中 に置いた。バイアルの標識は、実地での植物体の同定番号に対応する。葉のパン チをさらなるPCR分析のために冷凍庫内に保存した。 ７月６日に、両方の位置における全てのプロットに、CO₂充填バックパック(ba ck pack)スプレー機を用いてBasta^TMをスプレーした。Basta^TMの適用割合は、１ エーカーあたりキャリア容量30ガロンの水を用いて、１エーカーあたり6.4パイ ントであった。３つのノズルは、除草剤を植物の上部および両側に向けた。適用 範囲は非常に広く、そして天候状態は温暖であり、かつ乾燥していた。 Basta^TMに対して感受性であった植物体の同定番号を、Johnstonでは７月11日 およびDysartでは７月12日に記録した。Basta^TMに対する感受性は明らかであっ た；植物体は黄色であり、そして壊死組織の領域を有した。耐性植物は、いくつ かの葉に限られた程度の斑が入ることを除いて、正常であった。理論により限定 されることを意図しないが、この効果は、おそらく除草剤中の非活性成分により 引き起こされ、そしてこれは感受性植物体において観察される一般的な衰退より も著しくひどくはない。データを回収してすぐに、全ての植物体を土の表面で切 り落とし、次いで残留物を土の中に耕した。植物が再生または落粉し得ないこと を保証するためにプロットをモニターした。 結果および考察 予備生長チャンバー研究において、発芽は、Basta^TMでコーティングしなかっ た種子ではほぼ100％であった；これらの幼植物は正常であるように見えた（表 ２）。Basta^TMの適用は、発芽率を低下させた。Basta^TMの低い割合においては、 発芽した幼植物のいくつかは、コントロールと比較して非常に遅く、そして異常 に見えた。本発明者らは、これらの異常な植物体が除草剤損傷を示した非形質転 換分離集団であると仮定した。これより少ない異常な幼植物が、高い割合で生じ た。なぜなら、非形質転換分離集団は確実に除草剤により十分に枯死させられた からである。振り返ってみると、この試験は、暗所よりも明所において行われる べきであった。なぜなら、除草剤は、明所でより大きな植物毒性を示すはずであ るからである。 実地試験の結果を簡単にまとめると、本発明者らは、Basta^TMを用いた種子の 処理が、Basta^TM感受性植物の発芽を完全に排除することを観察した（表３）。B asta^TM感受性分離集団の制御は、種子に適用した最も低い割合のBasta^TMにおい てさえ得られた。この結論は、葉に適用した除草剤に対して感受性を示した植物 のみが種子上にBasta^TMを有さなかったコントロールプロットに存在したという 事実に基づく（表４）。種子の処理の結果得られた苗立ち率の減少は、除草剤耐 性特性について予想される分離割合と一致した。明確な結果に基づいて、実験の 間に回収されたリーフディスクの任意のPCR分析が必要ではないことが決定され た。 実施例３ 生長チャンバー発芽のサザン分析 ４つのメイズの集団を、Bar遺伝子を含有するプラスミドpPHP610（Pioneer Hi -Bred International，Inc.）を用いてマイクロパーティクルボンバードメント により形質転換した。種子を、Captan^TMコーティングのみ（Basta^TMを添加せず ）、0.12mlのBasta^TMを加えたCaptan^TM、または0.60mlのBasta^TMを加えたCaptan^TM を用いてコートした。植物を発芽させ、そしてDNAを生存している植物体から 抽出し、そしてサザン分析を行った。 サザン分析の１つの形態において、推定の形質転換DNAを、プラスミド内で１ 度切断することが予想される制限酵素で消化した。これを「組み込み分析」と呼 び、そしてpPHP610プラスミドについては、EcoRIを選択した。サザン分析の別の 形態において、消化を提供するためにEcoRI/NotIを選択した。この消化において 送達されたプラスミドDNAは２度切断され、そして消化は、可能な限り多くの植 物転写単位(「PTU」)を有する既知のサイズのフラグメントをもたらす。「組み 込み分析」は、植物ゲノムのそれぞれ異なる組み込み部位についての異なるサイ ズのハイブリダイズするバンドを理論的に提供するように設計される。「PTU」 分析は、特異的なフラグメントのサイズでのハイブリダイゼーションをもたらす 。異なるサイズのハイブリダイゼーションフラグメントの存在は、複雑な組み込 み事象（例えば、PTU領域の混在、欠失、または挿入）を示唆する。 サザンの結果を、Bar遺伝子の存在または欠如について分析した。barコード領 域をこの分析の全てに用い、そしてプローブのために、pPHP610由来の567bpのBa mHl/HpaIフラグメントを鋳型とした。ネガティブコントロールとして、10μgの 非形質転換Hi-II（B73×A188のF2）DNAを使用した。ポジティブコントロールと して、１コピー／ゲノムおよび５コピー／ゲノムと等量のpPHP610 HI-IIのプラ スミドDNAを、10μg非形質転換Hi-II DNAに加えた。 組み込み分析は、特定の株においては幾分複雑な組み込みを伴う、選良した株 全般の単一の形質転換事象を示した。これらの株は、３つのPTU（その１つはイ ンタクトを示したような）を含む３つの別々の組み込み部位を有するようであっ た。Bar遺伝子を有さなかった１つの植物だけが、Basta^TMでコートした種子から 発芽し、そしてこれは驚くことではなかった。なぜなら、この植物は、やや最適 な条件（暗所）下で発芽させ、生育させたBasta^TMおよびCaptan^TMでコーティン グした種子に由来するからであった。 実施例４ 種子のコーティングによるレポーター遺伝子のリガンド誘導 野生型花粉でBar遺伝子を駆動する適切なホルモン依存性レセプターおよびホ ルモン応答性エレメントを含有する、外部交配トランスジェニックTOメイズ植物 により誘導される種子を供給材料として使用する。得られる種子を以下の化学薬 品の組み合わせに従ってコートする： １）コートしないコントロール ２）Basta^TMのみでコートする ３）ホルモンのみでコートする ４）Basta^TMおよびホルモンでコートする コートした種子を温室で播き、そして発芽を計数する。予想される結果は、コ ートしないコントロール種子、およびホルモンのみでコートした種子からの100 ％近くの発芽である。Basta^TMのみでコートした種子からは発芽が予想されず、B asta^TMおよびホルモンでコートした種子からは50％の発芽が予想される。 実施例５ 種子のコーティングによるレポーター遺伝子の毒性緩和剤誘導 野生型花粉でBar遺伝子を駆動するIN2-1またはIN2-2に由来するDNAプロモータ ー配列を含有するメイズ植物の外部交配により誘導される種子を、供給材料とす る。得られるヘテロ接合体種子を以下の化学薬品の組み合わせによりコートする ： １）コートしないコントロール ２）Basta^TMのみでコートする ３）2-CBSU毒性緩和剤のみでコートする ４）Basta^TMおよび2-CBSUの両方でコートする Basta^TMを実施例２に記載するように適用し、2-CBSUを、2000g/haに等しくな るまでの割合で適用する。コートした種子を温室で播き、そして発芽を計数する 。予想される結果は、コートしないコントロール種子、および2-CBSU毒性緩和剤 のみでコートした種子からの100％近くの発芽である。Basta^TMのみでコートした 種子からは発芽が予想されず、Basta^TMおよび2-CBSU毒性緩和剤の両方でコート した種子からは50％の発芽が予想される。 実施例６ 耐性の種子特異的発現 種子コーティング系を種子の時期を越えるともはや耐性を発現しない植物を形 成する種子において使用することが所望される例が存在する。例えば、作物植物 のいくつかの種は、耐性の誘導について乏しい選択性を有し得る。なぜなら、こ れらは、雑草のような種と外部交配するからである。種子のコーティング処理は 、種子において、そして可能であれば幼植物および／または根において発現する 耐性遺伝子を必要とするが、他の組織（例えば、若い植物または生長した植物の 葉）の生長の他の時期で植物において発現する耐性遺伝子を必要としない。 種子および／または幼植物の発現を制限するプロモーターが存在する。これら は、発芽において粒状タンパク質で発現する遺伝子（例えば、オオムギのa-アミ ラーゼ遺伝子Amy32b(Whitter，R.F.，Dean，D.A.，およびRogers，J.C．1987，N ucleic Acids Res．6: 2515-2535)）；種子の成熟のかなり後期まで種子の発達 する胚において発現する遺伝子（例えば、メイズのグロブリン遺伝子glb1(Belan ger，F.C.およびKriz，A.L．1991，Genetics 129: 863-872)）；および種子の成 熟の間の胚および発芽の間の幼植物の両方において発現する遺伝子（例えば、Br assica napus のマレイン酸シンターゼ遺伝子 MS-A(Comai，L.，Matsudaira，K.L .，Heupel，R.C.，Dietrich，R.A.,およびHarada，J.J．1992，Plant Physiol． 98: 53-61)、または成熟している種子の胚において活性であり、そして幼植物に おいてABA誘導性である小麦のEm遺伝子(Marcotte，W.R．Jr.，Russell，S.H.， およびQuantrano，R.S．1989，Plant Cell 1: 969-976)）に由来するプロモータ ーを含む。 発芽している種子の粒状タンパク質中で活性であるプロモーターは、化学薬品 種子コーティングが種子に入るため、それを不活性にするために必要とされる発 現を提供する。いくつかの化学的な選択薬剤が粒状タンパク質中の耐性遺伝子産 物による不活性化を伴わずに種子に浸透し得る事象において、種子成熟の間の胚 発達後期に発現するプロモーターは、発芽する前の胚において耐性遺伝子産物の 供給源を提供するので、胚の生長は、プロモーターが耐性遺伝子産物を生成する 前に選択薬剤に曝すことによって起こり得ない。発芽中の幼植物における耐性遺 伝子の発現は、土壌中の残留選択薬剤、および粒状タンパク質中の耐性遺伝子産 物により不活性化される任意の選択薬剤から保護するために不可欠であり得る。 土壌中の任意の残留する化学的な選択薬剤から幼植物を保護するための別の選択 可能な物質は、根特異的プロモーターにより駆動される耐性遺伝子（例えば、小 麦のペルオキシダーゼ遺伝子 POX1(Hertig，C.，Rebmann，G.，Bull，Jr.，Mauc h，F.，およびDudler，R．1991，Plant Molec．Biol．16: 171-174)）である。 上記で概説したストラテジーは、単一の発現パターン、または別々の耐性トラ ンスジーンの異なる発現パターンの組み合わせにより合理的に達成され得るだけ でなく、必要な組織特異性の全てを付与する１つのプロモーターまたは複数のプ ロモーターを伴う１つの耐性トランスジーンがまた、開発され得る。これは、１ つ以上の上記の特異性を有するプロモーター、異なる発現パターンを伴うプロモ ーターの組み合わせ、または上記の異なる個々の特性を有する２つ以上のプロモ ーターに由来するハイブリッドプロモーターであり得る。特定のアプローチに関 わらず、種子のコーティング系は、発芽し、そして生存するが、幼植物の時期を 越えるともはや耐性を発現しない植物を形成する種子に用いられ得る。 実施例７ NPT II遺伝子の使用 種子を、NPT II遺伝子を発現するいくつかの野生型およびトランスジェニック 植物（例えば、コーン、サトウモロコシ、ダイズ、カノラ、ヒマワリ、小麦、お よび他の穀物または双子葉植物）から得た。トランスジェニック植物を、酵素、 もしくはNPT II遺伝子の発現についてのelisaアッセイ、NPT IIの構造遺伝子のP CR分析、および／またはNPT IIのサザン分析に基づいて同定した。個々のトラン スジェニック植物および野生型植物を自家受粉させ、分析のためにTO種子を生じ させる。代表的には、NPT II遺伝子の存在または欠如を、個々の植物の種子破片 のPCRによって確認する。種子を、Captan溶液（10％活性溶液）と、水溶液中で2 5mg/lから1000mg/lの濃度に変化するの種々のレベルのカナマイシン（100および 400のレベルが好ましい）との組み合わせに浸す。吸引濾過および簡単な種子コ ーティングの両方を各植物由来の種子で行う。NPT II陽性と同定された種子およ びNPT II陰性と同定された種子（野生型）を播き、そして続く発芽を温室条件下 で土壌混合物中にて試みる。 同様の試験を、野生型植物、およびNPT IIを発現することが知られ、野生型植 物を用いて受粉させたトランスジェニック植物で行い得る。各植物由来の種子を 上記のようにコートし、そして種子を温室条件下に播く。野生型植物は、発芽も アルビノ植物への生長もしないことを示すことが予想される。野生型植物と受粉 したトランスジェック植物由来の種子は、半分は正常に発芽し、そして残りの半 分は発芽しないかまたはアルビノである、1:1の比と一致する分離比であること が予想される。得られた緑化植物のPCR分析は、全ての場合において遺伝子の存 在について陽性であることが予想される。 他の試験において、カナマイシンを既に同定された幼植物に25mg/l〜1000mg/l で変化するレベルでスプレーする。野生型植物は、発芽しないか、またはアルビ ノ遺伝子型もしくはスプレーした時点に存在する葉の葉緑素の欠失を示すが、NP T II遺伝子を有するこれらの幼植物は、緑色を維持する。 本明細書中で引用される全ての特許および他の刊行物の開示は、本明細書中で 参考として援用される。上記の発明は理解を明確にする目的のために詳細に記載 されているが、一定の改変を添付の請求の範囲の範囲内において実施し得ること が当業者に明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ (72)発明者 コラック， スティーブン ジェイ. アメリカ合衆国 アイオワ 50265， ウ エスト デス モニー，ストーンブリッジ ロード 3600 (72)発明者 ピアース， ドロシー エイ. アメリカ合衆国 アイオワ 50322， ア ーバンデイル，ハモンツリー アベニュー 9124 (72)発明者 アルバートセン， マーク アメリカ合衆国 アイオワ 50265， ウ エスト デス モニー，エス． 60ティー エイチ ストリート 1930

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物において不稔性を維持するための方法であって、該方法が、トランスジ ェニック親植物株を形成する工程、ここで、該トランスジェニック親植物株が選 択薬剤に耐性を付与する耐性遺伝子に遺伝的に結合している不稔性遺伝子を含み 、該トランスジェニック親植物株を増強する工程、および該増強されたトランス ジェニック親植物株の種子を耐性遺伝子が付与する耐性に対する選択薬剤を含む 組成物でコートする工程、を包含する、方法。 ２．前記不稔性遺伝子が、p.AN::Tox、damメチラーゼ、またはバルナーゼからな る群より選択される、請求項１に記載の方法。 ３．前記耐性遺伝子が、除草剤に対して耐性を付与する、請求項１に記載の方法 。 ４．前記除草剤耐性遺伝子が、アミノ酸合成インヒビター、光合成インヒビター 、脂質インヒビター、生長調節因子、細胞膜破壊因子、色素インヒビター、およ び幼植物生長インヒビターからなる群より選択される除草剤を含む選択薬剤に対 する耐性を付与する、請求項３に記載の方法。 ５．前記除草剤耐性遺伝子が、イミダゾリノン、スルホニルウレア、トリアゾロ ピリミジン、グリホセート、セトキシジン、フェノキサプロップ、グルホシネー ト、トリアジン、およびブロモキシニルからなる群より選択される除草剤を含む 選択薬剤に対する耐性を付与する、請求項４に記載の方法。 ６．前記除草剤耐性遺伝子が、Bar、PAT、aroA、Epsps，Corl-l、bxn、およびps bAからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。 ７．前記耐性遺伝子が抗生物質に対する耐性を付与する、請求項１に記載の方法 。 ８．前記抗生物質耐性遺伝子が、アミノグリコシド抗生物質を含む選択薬剤に対 する耐性を付与する、請求項７に記載の方法。 ９．前記抗生物質耐性遺伝子が、カナマイシン、ゲンタマイシン、G418、ネオマ イシン、パロマイシン、およびハイグロマイシンからなる群より選択されるアミ ノグリコシド抗生物質を含む選択薬剤に対する耐性を付与する、請求項８に記載 の方法。 １０．前記抗生物質耐性遺伝子が、NPT II遺伝子、aphA2遺伝子、およびhpt-aph IV遺伝子からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。 １１．前記耐性遺伝子が、除草剤または抗生物質以外の毒性化学薬品を含む選択 薬剤に対する耐性を付与する、請求項１に記載の方法。 １２．前記毒性化学薬品が毒性代謝産物を含む、請求項１１に記載の方法。 １３．前記毒性代謝産物が4-メチルトリプトファンである、請求項１２に記載の 方法。 １４．前記耐性遺伝子がトリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子である、請求 項１１に記載の方法。 １５．前記トランスジェニック親植物株が耐性遺伝子に結合した構造プロモータ ーをさらに含む、請求項１に記載の方法。 １６．前記構造プロモーターが、CaMV 19S、CaMV 35S、２重にしたCaMV 35S、AL S、MAS、およびユビキチンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法 。 １７．前記トランスジェニック親植物株が、耐性遺伝子の発現を制御する化学的 に誘導可能な遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の方法。 １８．前記化学的に誘導可能な遺伝子がホルモンにより誘導される、請求項１７ に記載の方法。 １９．前記ホルモンがステロイドホルモンである、請求項１８に記載の方法。 ２０．前記化学的に誘導可能な遺伝子が非ホルモン化学薬品により誘導される、 請求項１７に記載の方法。 ２１．前記非ホルモン化学薬品が毒性緩和剤である、請求項２０に記載の方法。 ２２．前記トランスジェニック親植物株が少なくとも１つの組織特異的プロモー ターをさらに含む、請求項１に記載の方法。 ２３．前記組織特異的プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項２ ２に記載の方法。 ２４．前記増強されたトランスジェニック親植物株の種子が、前記化学的に誘導 可能な遺伝子を誘導する前記化学薬品の有効量をさらに含む組成物でコートされ ている、請求項１７に記載の方法。 ２５．前記化学的に誘導可能な遺伝子を誘導する前記化学薬品が、ホルモンおよ び毒性緩和剤からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。 ２６．コートされた種子をまく工程、成熟した植物に生長させる工程、該成熟し た植物を稔性化する工程、および該成熟した植物の種子を採集する工程をさらに 包含する、請求項１または２４に記載の方法。 ２７．請求項２６に記載の方法により形成された成熟した植物。 ２８．請求項２７に記載の前記成熟した植物により生産される植物種子。 ２９．植物において雄性不稔性を維持するための方法であって、該方法が、トラ ンスジェニック親植物株を形成する工程、ここで、該トランスジェニック親植物 株が選択薬剤に耐性を付与する耐性遺伝子に遺伝的に結合している雄性不稔性遺 伝子を含み、該耐性遺伝子は化学的に誘導可能な遺伝子の制御下にあり、該トラ ンスジェニック親植物株を増強する工程、および該増強されたトランスジェニッ ク親植物株の種子を耐性遺伝子が付与する耐性に対する選択薬剤および該化学的 に誘導可能な遺伝子が感受性である化学薬品の有効量を含む組成物でコートする 工程、を包含する、方法。 ３０．植物において雄性不稔性を維持するための方法であって、該方法が、トラ ンスジェニック親植物株を形成する工程、ここで、該トランスジェニック親植物 株が選択薬剤に耐性を付与する耐性遺伝子に遺伝的に結合している雄性不稔性遺 伝子を含み、該耐性遺伝子は種子特異的プロモーターの制御下にあり、該トラン スジェニック親植物株を増強する工程、および該増強されたトランスジェニック 親植物株の種子を耐性遺伝子が付与する耐性に対する選択薬剤の有効量を含む組 成物でコートする工程、を包含する、方法。