JPH10507903A

JPH10507903A - クローン化レプトスピラ外膜タンパク質

Info

Publication number: JPH10507903A
Application number: JP7530553A
Authority: JP
Inventors: エイ．ハーケ，デイヴィッド
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティーオブカリフォルニア
Priority date: 1994-05-25
Filing date: 1995-05-25
Publication date: 1998-08-04
Also published as: US6309641B1; AU2654495A; US20020142420A1; WO1995032220A1; CA2190999A1; AU707320B2; EP0760823A1; US5643754A; EP0760823A4; US5824321A

Abstract

(57)【要約】レプトスピラ(Leptospira)属細菌由来の63 Kd 外膜タンパク質を含有する、この微生物によって引き起こされるレプトスピラ症のワクチンとして免疫学的に使用可能な抗原調製物が提供される。上記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびこのタンパク質に結合する、レプトスピラ症の診断に有用な抗体もまた本発明により提供される。

Description

【発明の詳細な説明】クローン化レプトスピラ外膜タンパク質本発明は米国退役軍人管理局研究諮問グループによる政府の援助、および国立衛生研究所より授与された補助金第AI-21352、AI-29733およびAI-12601を受けて行なわれた。政府は本発明に一定の権利を有する。発明の背景１．発明の分野本発明は抗原調製物に関するもので、具体的には動物に防御的免疫応答を誘導するために用いられるレプトスピラ(Leptospira)属細菌外膜タンパク質（ＯｍｐＬ２）に関する。このようなタンパク質は、この微生物によって引き起こされるレプトスピラ症に対するワクチンとして免疫学的に使用することができる。または、このタンパク質、このタンパク質の抗体、あるいはこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出することにより、レプトスピラ症の診断を行なうことができる。２．関連技術の説明レプトスピラ症は、哺乳動物の殆どの種に感染することができるレプトスピラ属の病原性菌株によって引き起こされる、広汎な人獣共通伝染病である。現在、レプトスピラ属には６つの病原性の種と３つの非病原性の種が存在する。感染は、感染動物との直接接触により、または汚染された土あるいは水との間接的接触により起こる。家畜においては、この病気は流産、死産、不妊、乳生産低下、および死亡により経済的損害を引き起こす。有毒なレプトスピラは環境の中で長期間生存する能力、ならびに野性動物および家畜により持続的に感染し放出される能力の両方を有するため、レプトスピラ症を防除しようとする努力は阻まれてきた。現在入手可能なレプトスピラ症ワクチンは短期免疫をもたらすが、病原性レプトスピラの170の血清型の多くに対し交差防御を提供するものではない(Thiermannら，J．Am．Vet．Med．Assoc．184: 722，1984)。これらのワクチンは、無傷な菌体の顕微鏡的凝集反応によって確認される血清反応性をもたらす、不活性化した全菌体またはアウターエンベロープ（outer envelope）調製物よりなる。幾つかの証拠がリポ多糖様物質(LLS)がある程度の防御を付与するのではないかと示唆しているが、これらワクチン調製物における防御的免疫原の性質は決定的に解明されてはいない。レプトスピラ症の疾病発生は、梅毒〔梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum) により起こる〕およびライム(Lyme)ボレリア症〔ボレリア・ブルグドルフェリ(B orrelia burgdorferi)により起こる〕を含むスピロヘータ性疾病のそれに非常に似ている。梅毒およびライムボレリア症は両方とも、疾病の初期における広汎な散在性（中枢神経系への侵入を含む）によって特徴づけられる。レプトスピラは他の病原性スピロヘータと共にこの能力を共有しており、髄膜炎はレプトスピラ症に共通した発現である。スピロヘータ性感染の他の特徴は、三期梅毒および慢性ライム関節炎の症例に発現するように、宿主中で慢性的に持続する能力である。レプトスピラの外膜タンパク質（ＯＭＰ）を同定しようと試みた以前の研究は、以下のような問題により成功しなかった。すなわち、1)表面に露出しているタンパク質を同定するのに用いられた技法が、恐らくもろいレプトスピラ外膜タンパク質に損傷を与え、その結果、表面下構造の露出をもたらした。2)同定された推定上の表面に露出しているタンパク質は、レプトスピラの内鞭毛(endoflagell a)に対応する35〜36 kDのダブレット(Kelsonら，J．Med．Microbiol．26: 47，1 988)を含んでいたが、これはスピロヘータの表面下構造である。3)細胞における生来の位置にかかわりなく非選択的にタンパク質を可溶化するSDSの使用、である。 Nunes-Edwardsら(Infect．Immun．48:492，1985)は、レプトスピラＯＭＰを同定する努力において、ＳＤＳの使用に基づく放射線免疫沈降および細胞の分画化法の使用を導入した。彼らの放射線免疫沈降に使用されたレプトスピラは、抗体の添加に先立ち、高速遠心(20,000xg)にかけられた。このような高い遠心力は、レプトスピラ外膜の機械的破壊を引き起こす。Niikuraら(Zbl．Bakt．Hyg．A．2 66:453，1987)は、あらかじめラクトペルオキシダーゼ触媒表面放射性ヨウ素化により標識したレプトスピラ・インテロガンス(L．interogans)コペンハーゲニ( cohennhageni)血清型の毒性および無毒性菌株のSDS可溶化抽出物を免疫沈降させた。これらの試験は両方ともレプトスピラ内鞭毛に一致する35〜36 kDのダブレットを沈降させたので、同定された他のタンパク質も表面に位置するのではなく、表面下に位置するのではないかという懸念が持たれた。 Jostら(J．Med．Microbiol．27:143)は、レプトスピラのアウターエンベロープ調製物中に存在する35 kDプロテイナーゼＫ感受性抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を特徴づけた。しかし、このモノクローナル抗体の結合を免疫電子顕微鏡法により検証するためには、レプトスピラ外膜を破壊しなければならなかった。Dohertyら(J．Med．Microbiol．28:143)は、SDSを用いて作成したL.インテロガンスの外膜調製物中に存在する２つのレプトスピラタンパク質をクローン化したが、これらのタンパク質が外膜の構成要素である、または表面に露出している、ということを確証する証拠を提供しなかった。レプトスピラおよび梅毒トレポネーマのＯＭＰの同定に関する不成功に終わった研究は、スピロヘータ外膜の脆さ、およびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)等のイオン性デタージェントが外膜選択性を欠くこと、を考慮することの重要性を示した(Cunninghamら，J．Bacteriol．170:5789，1988; Pennら，J．Gen．Microbi ol．131:2349，1985; Stammら，Infect．Immun．55:2255，1987)。外膜タンパク質は、細菌性の疾病発生において重大な役割を果たすので、非常に重要である。レプトスピラによる疾病発生に関与する外膜タンパク質の同定は、レプトスピラ外膜および疾病発生における外膜の関与を理解するだけでなく、他のスピロヘータ外膜タンパク質および疾病発生におけるそれらの役割を理解する上で意義深い。発明の概略本発明は、レプトスピラ属の病原性菌株に関連するレプトスピラ外膜タンパク質としてのＯｍｐＬ２の同定に基づくものである。スピロヘータ外膜の脆さ、および外膜タンパク質は少量しか存在しないという事実により、本発明に至るまで膜全体にまたがるスピロヘータ外膜タンパク質の決定的な報告はなかった。本発明はレプトスピラ由来の63 kD 外膜タンパク質およびこのタンパク質をコードする遺伝子を記述する。推定されるアミノ酸配列は典型的なリーダーペプチダーゼＩ開裂を有し、これは内膜を越える輸送を暗示している。この63 kDタンパク質はレプトスピラ外膜タンパク質としてＯｍｐＬ２と名付けられた。この免疫原性ポリペプチドは、病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘導し、またレプトスピラ症の診断のための標的を提供するのに有用である。図面の簡単な説明図１は、ＯｍｐＬ２のＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列を示す（配列番号：１および２）。図２は、ＯｍｐＬ２とKadner，R.(Molecular Microbiology，4:2027，1990)によって同定された７つの相同性領域に関する８つのTonB-依存性外膜タンパク質（配列番号：３〜１０）の間のアミノ酸比較を示す。図３は、ＯｍｐＬ２のトポロジー的モデルを示す。膜全体にまたがるβ構造が長方形の中に互い違いの列に並べて示されている。疎水性の、膜に面した残基は列の右側に示してある。発明の詳細な説明本発明は、病原性レプトスピラ属種の外膜タンパク質由来の、単離された免疫原性ポリペプチドを提供する。また、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列も本発明に含まれる。上記外膜タンパク質は、最初レプトスピラ・アルストニ(Leptospira alstoni)から単離された、ＯｍｐＬ２と名付けられた 63 kD タンパク質で、これはレプトスピラの病原に関連した、細胞外に輸送されるタンパク質である。この免疫原性ポリペプチドは、病原性レプトスピラに対する免疫応答を誘導するための医薬組成物に有用である。本発明は、組換えＤＮＡ技法を用いたレプトスピラ外膜タンパク質のポリペプチド部分の製造方法を含む。L.アルストニＯｍｐＬ２外膜タンパク質の遺伝子をプラスミドベクター中にクローン化し、次にこのベクターを用いて大腸菌を形質転換する。ＯｍｐＬ２遺伝子が大腸菌中で発現されると、産生されたポリペプチドはSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定すると約63 kD の分子量を有する。最近、細胞外に輸送されるレプトスピラタンパク質をコードする遺伝子の研究方法が、TnphoA転位の基礎をなす概念に基づいて開発された(Boquetら，J．Bact eriol．169:1663，1987; Hoffmanら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．82:5107, 1985; Manoilら，Science 233:1403，1986; Manoilら，J．Bacteriol．172:515 ，1990)。この方法における系は、シグナル配列を欠くアルカリフォスファターゼ(AP)遺伝子を含有する、pMGと称するphoA発現ベクターを、漏れやすい外膜を有する大腸菌変異株KS330(Strauchら，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85:1575 ，1988)と共に用いて、毒性決定基として機能しうるシグナルペプチドの輸送依存性タンパク質をコードする遺伝子を同定する。輸送されるタンパク質をコードする遺伝子のスクリーニングは、青いハローを持つコロニーを同定することにより実施される。この系の有用性は、梅毒トレポネーマ(Blancoら，Mol．Microbio l．5:2405，1991)およびレプトスピラ・アルストニの両方について確認された。この系では、両微生物由来のシグナルペプチド含有タンパク質が大腸菌中に輸送されることが示された。このような方法が、本発明のＯｍｐＬ２遺伝子の同定に使用された。配列分析は、ＯｍｐＬ２構造遺伝子が540アミノ酸から成るタンパク質をコードする1740塩基からなることを示した（配列番号：１および２）。内膜を越えて輸送されるタンパク質について予想されるように、推定されるアミノ酸配列は24 残基のシグナルペプチドで始まっている。ＯｍｐＬ２配列は、外膜タンパク質膜貫通セグメント(segment)と合致する24個の両親媒性β構造を含有している。このことは、外膜タンパク質に典型的な大きな表面に露出したループおよび短い細胞周辺腔(periplasmic)ループを有するトポロジー的モデルを提案することを可能とする。ＯｍｐＬ２配列と公知の外膜タンパク質配列の比較は、TonB-依存性外膜タンパク質に相同性を有する領域を示した。TonB-依存性タンパク質は、グラム陰性細菌の外膜にリガンド特異的チャンネルを形成する。配列の７つの領域がすべてのTonB-依存性外膜タンパク質において保存されていることが判明した(Kadner， R.J.，Molecular Microbiology，4:2027-2033，1990)。GAPプログラム(Devereux ，J．ら，Nucl．Acids Res.，12:387-395，1984)を用いた配列比較は、ＯｍｐＬ２配列が上記の保存された７つの領域の全てにおいて相同的であることを示した。ＯｍｐＬ２外膜タンパク質の細菌遺伝子は、病原性レプトスピラの任意の菌株から引き出すことができるように思われる。好ましくは、このタンパク質はレプトスピラ・アルストニ菌株ＲＭ５２(National Leptospirosis Reference Labora tory，Ames，Iowa)に由来する。レプトスピラ・アルストニは、以前レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)のファミリー中に一緒に分類されていた病原性レプトスピラに対する最も新しい名称である。レプトスピラ・インテロガンスは、例えばATCC(Rockville，MD)より入手可能である。本発明はレプトスピラＯｍｐＬ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドは、上記タンパク質をコードするＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。ＯｍｐＬ２の全部または一部をコードする全てのポリヌクレオチドもまた、それらが天然ＯｍｐＬ２のまたは全長ＯｍｐＬ２の機能（抗体を誘導またはこれと結合する能力、等）を示すかぎり、本発明に含まれる。このようなポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドおよび意図的に操作された（例えば、突然変異させた）ポリヌクレオチドの両方を含む。本発明のＤＮＡ配列は幾つかの方法によって得ることができる。例えば、当分野の技術で周知のハイブリダイゼーション手順を用いてＤＮＡを単離することができる。これらの方法は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、１）共有のヌクレオチド配列を検出するための、ゲノムライブラリーへのプローブのハイブリダイゼーション、および２）共有の構造的特徴を検出するための、発現ライブラリーの抗体スクリーニングである。ハイブリダイゼーション手順は、各プローブが変性２本鎖ＤＮＡの混合物を含むハイブリダイゼーションサンプル中の特定ＤＮＡ配列の潜在的に完全な相補体である標識化混合合成オリゴヌクレオチドプローブを用いた、組換えクローンのスクリーニングにとって有用である。このようなスクリーニングのためには、ハイブリダイゼーションは好ましくは一本鎖ＤＮＡまたは変性２本鎖ＤＮＡを用いて実施される。非特異的結合を回避するためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、標的ＤＮＡをプローブ混合物中に存在する完全な相補体である唯一のプローブにハイブリダイズさせることにより、特定ＤＮＡクローンのオートラジオグラフィー的可視化を可能とすることができる(Wallaceら，Nucleic Acid Research，9:879，1981)。または、ＯｍｐＬ２に対する抗体を用いて、少なくとも１つのエピトープを有するＯｍｐＬ２ペプチドに関して発現ライブラリーを間接的にスクリーニングすることができる。このような抗体は、ポリクローナル的またはモノクローナル的に誘導して、ＯｍｐＬ２ＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用することができる。一般的には、λgt11ライブラリーを構築し、Huynhら(DNA Clogin g：A Practical Approach，D.M．Glover編，1:49，1985)の方法にしたがって免疫学的にスクリーニングする。ＯｍｐＬ２をコードする特定ＤＮＡ配列の開発は以下の方法によっても得ることができる。すなわち、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、および２）興味のあるポリペプチドに必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の化学的製造である。ＯｍｐＬ２をコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主細胞へのＤＮＡトランスファーによりin vitroで発現させることができる。「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」とは、その中でベクターが増殖でき、そしてそのＤＮＡが発現される細胞である。この用語は、上記宿主細胞の任意の子孫をも含む。複製の際に突然変異が起こる可能性があるので、全ての子孫が必ずしも親細胞と同一ではないことが理解される。しかし、上記の用語を用いるとき、そのような子孫はこの用語に含まれる。本発明に用いる「宿主細胞」という用語は、原核細胞のみならず、酵母、糸状菌、等の真核細胞ならびに植物および動物細胞をも含むものである。「原核細胞」という用語は、レプトスピラ外膜タンパク質発現のための遺伝子によって形質転換することのできるすべての細菌を含むものとする。原核細胞宿主は、大腸菌、ネズミチフス菌および枯草菌、等のグラム陰性およびグラム陽性細菌を含む。当業者に周知の任意の技法を用いて、ＯｍｐＬ２タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を使って宿主を形質転換することができる。特に好ましいのは、原核細胞形質転換用のＯｍｐＬ２コード配列を含有するプラスミドの使用である。宿主が大腸菌等の原核細胞の場合、ＤＮＡ取り込みが可能なコンピテント細胞は、指数増殖期の後に集めて、次いでCaCl₂法により周知の手順で処理した細胞から調製することができる。または、MgCl₂あるいはRbClを用いることができる。形質転換は、宿主細胞のプロトプラストを形成してから実施することもできる。本発明においては、ＯｍｐＬ２配列を組換え発現ベクターに挿入することが可能である。「組換え発現ベクター」という用語は、ＯｍｐＬ２遺伝子配列の挿入または組み込みによって操作された、当分野の技術で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の伝達体を言う。このような発現ベクターは、宿主における挿入遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する。典型的には、発現ベクターは複製起点、プロモーターおよび形質転換細胞の表現型選択を可能とする特定の遺伝子を含有する。形質転換された原核細胞を公知の手段により培養して、最適な細胞増殖を達成することができる。外来遺伝子を酵母中に発現させるための種々のシャトルベクターが報告されている(Heinemannら，Nature，340: 205，1989; Roseら，Gene，60:237，1987)。宿主中で発現および複製が可能な生物学的に機能的なＤＮＡベクターが公知である。このようなベクターは、本発明のＤＮＡ配列を組み込むために使用される。融合した、機能しうる形で連結された遺伝子を調製し、それらを細菌中で発現させる方法は公知であり、例えば、参照のためにここに組み入れる米国特許第4, 366,246号に示されている。そこに記述されている遺伝子構築体および方法を、原核細胞宿主におけるレプトスピラＯｍｐＬ２の発現のために利用することができる。本発明に使用可能なプロモーターの例は、rec A、trp、lac、tacおよびバクテリオファージλp_Rまたはp_Lである。本発明に使用可能なプラスミドの例は、Mani atisら(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratories，1982)にリストされている。本発明において提供される抗体は、ＯｍｐＬ２タンパク質に免疫反応する。異なるエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体より実質的になる抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は、タンパク質の抗原含有断片から当分野の技術で周知の方法(Kohlerら，Nature，256:495，1975; Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel ら編、1989)。本発明において使用する「抗体」という用語は、完全な分子および、抗原決定基に結合可能なFab，F(ab')₂およびFv等のその断片を含む。これらの抗体断片は、その抗原または受容体に選択的に結合する多少の能力を保持しており、以下のように定義される: （１）Fab-抗原分子の一価の抗原結合断片を含有するこの断片は、全抗体を酵素パパインで消化し、１本の完全なＬ鎖および１本のＨ鎖の一部を生じさせることにより作成できる；（２）Fab'- 抗体分子のこの断片は、全抗体をペプシンで処理し、次いで還元し、１本の完全なＬ鎖およびＨ鎖の一部を生じさせることにより得られる；抗体分子１個につき２個のFab'断片が得られる; （３）F(ab')₂- 抗体のこの断片は、全抗体を酵素ペプシンで処理し、次に還元をしないことにより、得ることができる; F(ab')₂は２個のジスルフィド結合により結びついている２つのFab'断片よりなる二量体である。（４）Fv - ２本の鎖として発現される、Ｌ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を含有する遺伝子的に操作された断片と定義される; および（５）１本鎖抗体（「ＳＣＡ」）- 適切なポリペプチドリンカーによって遺伝子的に融合した１本鎖分子として連結されたＬ鎖の可変部およびＨ鎖の可変部を含有する、遺伝子的に操作された分子と定義される。これらの断片を作成する方法は当分野で公知である(例えば、参照としてここに組み入れているHarlowおよびLane，Antibodies: A Loboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988参照)。本発明において使用する「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する、抗原上の任意の抗原決定基を意味する。抗原決定基は通常化学的に活性な表面グループの分子（アミノ酸または糖側鎖、等）からなり、また通常は特異的な三次元的構造特徴ならびに特異的な電荷特徴を有する。本発明のＯｍｐＬ２ポリペプチドに結合する抗体は、免疫感作抗原として興味のある小さいペプチドを含有する完全なポリペプチドまたはその断片を用いて調製することができる。動物を免疫感作するのに用いられる配列番号：２のポリプチドまたはペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡまたは化学的合成物から引き出すことができる。そして、このポリペプチドまたはペプチドは所望であればキャリアータンパク質に連結することができる。ペプチドに化学的に結合される、このような一般的に用いられるキャリアーは、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイドである。次に、結合ペプチドを用いて動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫感作する。所望であれば、例えば、それに対して抗体を作成したポリペプチドまたはペプチドを結合したマトリックスに結合させ、溶出することによって、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体をさらに精製することができる。当業者は、免疫学の技術に共通した、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮のための種々の技法を知っているであろう（例えば、参照としてここに組み入れている Coliganら，Unit 9，Current protocols in Immunology，W iley Interscience，1991 参照）。抗-イディオタイプ技術を用いてエピトープを模倣したモノクローナル抗体を作成することもまた可能である。例えば、一次モノクローナル抗体に対して作成された抗-イディオタイプモノクローナル抗体は、超可変部に結合ドメインを有する。これは一次モノクローナル抗体によって結合されるエピトープに「良く似たもの(image)」である。ＯｍｐＬ２一次アミノ酸配列の些細な修飾は、本明細書に記述するＯｍｐＬ２タンパク質に較べて、実質的に同等の機能を有するタンパク質をもたらす可能性がある。このような修飾は、部位特異的突然変異誘発などの故意のものでも、または自然発生的なものでもよい。このような修飾によってもたらされる全てのタンパク質は、ＯｍｐＬ２機能が存在する限り本発明に含まれる。ＯｍｐＬ２一次アミノ酸配列の修飾はまた、同類変異を含む。本明細書に使用する「同類変異(conservative variation)」という用語は、アミノ酸残基を他の生物学的に類似の残基で置換することを示す。同類変異の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン等の疎水性の残基を別の疎水性残基に置換すること、またはアルギニンをリシンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、またはグルタミンをアスパラギンに、等の極性基を他の極性基に置換することを含む。「同類変異」という用語は、もし置換ポリペプチドに対して作成された抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応するのであれば、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することをも含む。微生物によって発現された本発明のタンパク質またはその断片の単離および精製は、分取クロマトグラフィーおよびモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用する免疫学的分離を含む、通常の手段によって実施することができる。本発明は、当業者に周知の上記の方法によって変更された、または周知の他の方法によって変更された、任意の宿主に及ぶ。これらの方法とは、例えば、溶原性ファージを用いた遺伝子物質のトランスファー、およびその結果、原核細胞におけるＯｍｐＬ２タンパク質のレプトスピラ遺伝子の発現、である。ＯｍｐＬ２タンパク質をコードするレプトスピラ遺伝子によって形質転換された原核細胞は、動物（例えばウサギ）の免疫感作に使用可能なポリペプチドの生産に特に有用である。１つの態様において、本発明は製薬上許容されるキャリアー中に免疫学的有効量のＯｍｐＬ２を含む、動物に病原性レプトスピラへの免疫応答を誘導するのに有用な医薬組成物を提供する。本発明の記述にあたって使用される「免疫学的有効量」という用語は、動物にレプトスピラへの免疫応答の創出を誘導するのに必要なレプトスピラ抗原の量を示すものとする。本発明のＯｍｐＬ２外膜タンパク質は、動物の免疫系を感作して、一つの結果として、レプトスピラ感染の影響を改善する免疫応答を生じさせるのに特に有用である。ＯｍｐＬ２外膜タンパク質は、注射、急速注入、鼻咽頭吸収、皮膚吸収によって非経口的に、および経口的に投与することができる。非経口投与のための製薬上許容されるキャリアー調製物は、無菌または水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶剤の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステル類があげられる。皮膚浸透性を高め、抗原の吸収を促進するため、閉鎖包帯用のキャリヤーを用いることができる。経口投与用の液体剤形は、一般的に液体剤形を含有するリポソーム溶液からなる。リポソームを懸濁するための適切な形態は、当分野の技術で一般的に用いられる不活性な希釈剤（例えば精製水）を含有するエマルジョン、懸濁液、溶液、シロップおよびエリキシルである。不活性な希釈剤の他に、上記組成物はアジュバント、湿潤剤、乳化および懸濁剤、および甘味剤、香味剤および芳香剤等を含むことができる。本発明のＯｍｐＬ２タンパク質を含有する抗原調製物は、アジュバントを含むこともできる。アジュバントとは、特定の免疫応答を非特異的に増大させるために使用可能な物質をいう。通常、アジュバントと抗原は免疫系に提示する前に混合されるか、または別々に提示されるが、感作される動物の同一部位に投与される。アジュバントは組成に基づいて数個のグループに大まかに分類される。これらのグループは、オイルアジュバント（例えば、フロイント完全および不完全アジュバント）、鉱物塩〔例えば、AIK(SO₄)₂，AINa(SO₄)₂，AINH₄(SO₄)₂，シリカ、アルミナ、AI(OH₃)，Ca₃(PO₄)₂，カオリンおよび炭素〕、ポリヌクレオチド（例えば、ポリICおよびポリAU酸）および特定の天然物質〔例えば、結核菌(Mycob acterium tuberculosis)由来のワックスＤ、およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)、百日咳菌(Bordetella pertussis)およびブルセラ属(Brucella)のメンバーに見いだされる物質〕を含む。別な態様において、病原性レプトスピラへの免疫応答を動物に誘導する方法が提供される。多重免疫感作法が用いられる場合は、免疫感作のタイミングに関して多数の異なる技法が存在する。本発明の抗原調製物を２回以上用いて、免疫感作された動物の免疫応答の発現レベルおよび多様性を増大させることが可能である。典型的には、複数の免疫感作が行なわれる場合は、それらは２〜４週間間隔を置いて実施される。レプトスピラへの免疫応答が望まれる対象には、ブタ、ウシおよびヒトが含まれる。一般に動物に投与されるＯｍｐＬ２タンパク質の投与量は、年齢、状態、性別、および、もしかかっていれば疾病の程度、等の因子ならびに当業者が調節可能な他の変数によって変わる。本発明の抗原調製物は、１日１回または複数回の投与として与えることができる。そして、１投与量あたりのレプトスピラＯｍｐＬ２抗原は約10μg から約10 00μg、より好ましくは約50μg から約700μg、最も好ましくは約50μg から約3 00μgの範囲で変わりうる。免疫療法に用いる場合、本発明のモノクローナル抗体は標識しなくても、または治療剤を用いて標識してもよい。これらの治療剤は、本発明のモノクローナル抗体に直接または間接的に結合させることができる。間接結合の一例は、スペーサー部分を用いることによるものである。そして、これらのスペーサー部分は不溶性でも可溶性でもよく(Dienerら，Science，231:148，1986)、また標的部位においてモノクローナル抗体分子から薬物の放出が可能となるように選択することができる。本発明のモノクローナル抗体に結合させることのできる治療剤の例は、薬物、放射性同位元素、レクチンおよび毒素である。本発明の標識化または非標識化モノクローナル抗体は、上記のような治療剤と組み合わせて用いることができる。特に好ましいのは、本発明のモノクローナル抗体および免疫モジュレーターおよび他の生物学的応答調節剤を含む治療組成物である。本発明のモノクローナル抗体をここに記述するような種々の治療剤と組み合わせて用いる場合、モノクローナル抗体および治療剤の投与は通常実質的に同時期に行なわれる。「実質的に同時期」という表現は、モノクローナル抗体および治療剤が時間的にほどよく近接して投与されることを意味する。通常、モノクローナル抗体の前に治療剤を投与することが好ましい。例えば、モノクローナル抗体を投与する１〜６日前に治療剤を投与することができる。治療剤の投与は、例えば疾病の性質、患者の状態、および治療剤の半減期等の因子により、毎日、または任意の間隔を置いて投与することができる。本発明のモノクローナル抗体の投与量範囲は、レプトスピラ症の発現症状が改善されるという望ましい効果をもたらすほど十分大きい。投与量は、望まれない交差反応、アナフィラキシー反応、等の好ましくない副作用を引き起こすほど大きくてはならない。一般に、投与量は被験者の年齢、状態、性別および疾病の程度により異なり、当業者により決定されうるものである。投与量は１日に１回または数回の投与で、１日から数日間、約0.1 mg/kgから約2000 mg/kg、好ましくは約0.1 mg/kgから約500 mg/kgである。一般に、本発明のモノクローナル抗体を治療剤と結合させて投与する場合は、in vivo診断イメージングに用いられる投与量に匹敵する低い投与量を用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、注射によって、または時間をかけた徐々の注入によって、非経口的に投与することができる。本発明のモノクローナル抗体は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内、または経皮的に、単独でまたはエフェクター細胞と組み合わせて投与することができる。非経口投与用の調製物は、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶剤の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステル類があげられる。水性キャリヤーは、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝化媒質を含む。非経口投与用賦形剤は、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、水分、栄養補給物および電解質補給物（リンガーブドウ糖に基づくもの等）を含む乳酸加リンガー静注用賦形剤、等を含む。上記調製物には、防腐剤および他の添加物（例えば殺菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性ガス等）も存在してよい。さらなる態様において、本発明は被験者における病原性レプトスピラ関連疾患の検出方法を提供する。この方法は、細胞成分をその細胞成分と結合する試薬と接触させることからなる。この細胞成分はＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸でありうる。または、この成分はタンパク質でありうる。この細胞成分が核酸である場合、試薬は核酸プローブまたはＰＣＲプライマーである。細胞成分がタンパク質である場合、試薬は抗体プローブである。プローブは、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート化剤または酵素、等を用いて検出可能に標識される。当業者は、抗体へ結合させるための他の適切な標識を知ってるか、または通常の実験により突き止めることができるであろう。本発明の目的のため、ＯｍｐＬ２に特異的な抗体または核酸プローブを用いて、体液または組織中のＯｍｐＬ２ポリペプチド（抗体を使用）またはポリヌクレオチド（核酸プローブを使用）の存在を検出することができる。検出可能な量のＯｍｐＬ２抗原またはポリヌクレオチドを含有する任意のサンプルが使用できる。本発明の好ましいサンプルは、血液、尿、脳脊髄液、または内皮起源の組織である。細胞成分が核酸である場合、レプトスピラ特異的プローブに結合させる前に、核酸を増幅する必要があるかもしれない。好ましくはポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）が用いられるが、リガーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）、連結活性化転写(ligated activated transcription)（ＬＡＴ）および核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）等の他の核酸増幅手段も用いることができる。より増大した感受性をもたらしうる別の技法は、抗体を低分子量ハプテンに結合することからなる。次に、第２反応により、これらのハプテンを特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、または特異的抗ハプテン抗体と反応できるジニトロフェニル、ピリドキサール、フルオレセイン、等のハプテンを用いるのが一般的である。または、ＯｍｐＬ２ポリペプチドを用いて、サンプル中に存在するＯｍｐＬ２ポリペプチドに対する抗体を検出することができる。本発明のＯｍｐＬ２は、液相で用いられる、または固相キャリアーに結合して用いられるイムノアッセイでの使用に特に適している。さらに、これらのアッセイに用いられるＯｍｐＬ２は、種々の方法で検出可能に標識することができる。本発明のＯｍｐＬ２を使用することのできるイムノアッセイの例は、直接または間接様式による、競合または非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノメトリック(immunometric)アッセイ）およびウエスタンブロットアッセイである。本発明のＯｍｐＬ２に結合した抗体の検出は、生理的サンプルを用いた免疫組織化学的アッセイを含む、フォワード、リバースまたは同時モードで進行するイムノアッセイを用いて実施することができる。使用されるＯｍｐＬ２の濃度はイムノアッセイの種類および使用された検出可能な標識の性質により、変わる。しかし、用いられたイムノアッセイの種類に関係なく、用いられたＯｍｐＬ２の濃度は当業者が通常の実験を行なうことにより容易に測定できる。本発明のＯｍｐＬ２は、多数の異なるキャリアーに結合させて、このポリペプチドに特異的に反応する抗体の存在を検出することができる。周知のキャリアーの例は、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱を含む。キャリアーの性質は、本発明の目的のためには可溶性でも不溶性でもよい。当業者はＯｍｐＬ２を結合するための他の適切なキャリアーを知っているか、または通常の実験により突き止めることができるであろう。当業者に公知の多数の異なる標識および標識化の方法が存在する。本発明に使用可能な標識の種類の例は、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物を含む。本発明のＯｍｐＬ２に結合する抗体は、種々の体液および組織に存在する可能性がある。検出可能な量のＯｍｐＬ２に対する抗体を含有する任意のサンプルが使用できる。通常、サンプルは尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清、等の液体、または組織、糞便、等の固体もしくは半固体である。ＯｍｐＬ２に向けられた本発明のモノクローナル抗体もまた、抗原のin vivo 検出に有用である。検出可能に標識されたモノクローナル抗体が診断的に有効な量で投与される。「診断的に有効な」という表現は、検出可能に標識されたモノクローナル抗体が、レプトスピラＯｍｐＬ２抗原（該抗体はこれに特異的である）の検出を可能とするのに十分な量で投与されることを意味する。投与される検出可能に標識されたモノクローナル抗体の濃度は、ＯｍｐＬ２を有する細胞、体液、または組織への結合が、バックグラウンドと比較して検出可能であるほど十分でなければならない。さらに、最良の標的対バックグラウンドシグナル比を与えるために、検出可能に標識されたモノクローナル抗体が循環系から迅速に除去されることが望ましい。概して、in vivo 診断のための検出可能に標識されたモノクローナル抗体の投与量は、被験者の年齢、性別および疾病の程度、等の因子により変わる。モノクローナル抗体の投与量は約0.001 mg/m²から約500 mg/m²まで、好ましくは約0.1 mg/m²から約200 mg/m²まで、最も好ましくは約0.1 mg/m²から約10 mg/m²まで変わりうる。このような投与量は、例えば複数回の注射を行なうかどうか、および当業者に公知の他の因子によって変わりうる。 In vivo 診断イメージングのためには、利用可能な検出器具の種類は特定の放射性同位元素を選択する上で重大な因子である。選択された放射性同位元素は、与えられた種類の器具にとって検出可能な種類の崩壊を有するものでなければならない。In vivo 診断のために放射性同位元素を選択する上でもう１つ重要な因子は、放射性同位元素の半減期が標的による最大取り込みの時期になお検出可能であるほど長く、かつ宿主への有害な放射が最小限となるほど短いことである。理想的には、in vivoイメージングに用いられる放射性同位元素は粒子放出を欠くが、140-250の重要な領域(key range)で通常のγ線カメラによって容易に検出されうる多数の光子を生じるものである。 In vivo 診断のため、放射性同位元素を免疫グロブリンに直接的または中間官能基を用いて間接的に結合することができる。金属イオンとして存在する放射性同位元素を免疫グロブリンに結合するために頻繁に用いられる中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の二官能キレート化剤および類似の分子である。本発明のモノクローナル抗体に結合させることのできる金属イオンの典型的な例は、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶ ⁷ Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒおよび²⁰¹Ｔｌである。本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）等を用いたin vivo 診断のため常磁性同位元素を用いて標識することも可能である。一般に、診断イメージングを可視化するための通常の方法のうち任意のものが使用できる。通常、カメライメージングにはガンマ線および陽電子放出性の放射性同位元素が用いられ、ＭＲＩには常磁性同位元素が用いられる。このような技法に特に有用な元素は、¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵² Ｃｒおよび⁵⁶Ｆｅを含む。本発明のモノクローナル抗体を用いて、レプトスピラ関連疾患の改善の経過をモニターすることができる。したがって、種々の体液または組織に存在するレプトスピラＯｍｐＬ２ポリペプチドまたはＯｍｐＬ２ポリペプチドに対する抗体の増加または減少を測定することにより、疾患の改善を目指した特定の治療法が有効であるかどうかを決定することができるであろう。本発明の方法に用いられる材料は、キットの作成に理想的に適っている。このようなキットは、バイアル、チューブ、等の１つまたはそれ以上の容器手段を厳重に幽閉して収納するために小さく区切られたしたキャリアー手段からなることができる。容器手段のそれぞれは、本発明の方法で使用されるべき別個の要素のうちの１つを含む。例えば、容器手段の１つは、抗体等のＯｍｐＬ２結合試薬を含むことができる。第２の容器はさらにＯｍｐＬ２ポリペプチドを含むことができる。これらの構成要素は所望により液体形態または凍結乾燥形態で存在することができる。以下の実施例は本発明を説明するためのもので、限定するものではない。それらは使用してよい典型的な手順であるが、当業者に公知の他の手段も使用することができる。実施例以下の実施例では、重要なレプトスピラ外膜タンパク質としてのＯｍｐＬ２の同定について記載する。ｏｍｐＬ２遺伝子をクローニングし、配列決定した方法を記載する。配列分析及び相同性の研究を示し、ＯｍｐＬ２が病原性レプトスピラの外膜タンパク質であり、従って優れたワクチン候補であることを更に示唆する。実施例１ｏｍｐＬ２のクローニングｐＭＧ発現ベクターと大腸菌ＫＳ３３０を用いたブルー−ハローコロニーのスクリーニングによる輸出レプトスピラタンパク質をコードする遺伝子の同定のための方法を用いてｏｍｐＬ２遺伝子をクローニングした（Blancoら，Molecular Microbiology，5:2405，1991; Giladiら，J．Bacteriol.,175:4129，1993）。ｐＭＧベクターは、TnphoAのように、膜貫通配列またはシグナルペプチドをコードする遺伝子を同定する上で有用なphoA発現ベクターである。このクローニング系は、StrauchとBeckwithによって記載された“ブルーハロー”アッセイ（Proc．N atl．Acad．Sci.，USA 85:1576,1988）で最初に使われた株である大腸菌ＫＳ３３０にｐＭＧ組み換え体をトランスフォームすることによって、外膜及び周辺のアルカリ性フォスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質と内膜ＡＰ融合タンパク質との区別を容易にするために修正した。ＫＳ３３０のリポタンパク質変異株Ippー 5508では高分子を漏出する外膜が得られ、またそのdegP4変異株ではＡＰ融合タンパク質の周辺でのタンパク分解が非常に減少する。大腸菌周辺タンパク質であるβ−ラクタマーゼ、ＯｍｐＡとＭＯＭＰとＴｐ９、梅毒トレポネーマＡＰ組み換え体等の、切断可能なシグナルペプチドを有するｐＭＧＡＰ融合体は、ＫＳ３３０の漏出性外膜タンパク質を通して拡散し、ブルーハロー（Giladiら、上記）で青いコロニーを形成するのが示された。対照的に、リーダーペプチダーゼ、ＳｅｃＹ、テトラサイクリン耐性遺伝子産物等の大腸菌タンパク質由来の内膜ＡＰ融合体は、ブルーハローなしで青いコロニーを形成する。pMG/KS330r-のクローニング及びスクリーニング法では、切断可能なシグナルペプチドを有するタンパク質をコードする遺伝子を同定でき、従って潜在的発病因子をコードする遺伝子の同定に有用である。大腸菌の株はルリア−ベルタニ（Luria-Bertani）培地で３７℃で増殖させた。全ての制限エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡ−修飾酵素はメーカーの説明書に従って使用した（Bethesda Research Laboratories，Inc.，Gaithersburg，MD，またはBoehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN）。Ｌ．アルストニＲＭ５２株（National Leptospirosis Reference Laboratory, Ames，Iowa）のゲノムＤＮＡは、Yelton,D.B.とN.W.Charonの方法（Gene，28:1 47，1984）で調製した。ゲノムＤＮＡをSau3Aで部分分解して平均約３．０ｋｂの大きさにし、BamHI-分解ｐＭＧとつないでKS330r-にトランスフォームした。X P-IPTG-含有プレート（Giladiら、上記）でおよそ80,000個の組み換えクローンをスクリーニングし、IPTGなしのＸＰプレートで約10.000個のクローンをスクリーニングして、２２６個の青いコロニーを得た。青いコロニーを作るクローンを副次培養し、高濃度のIPTG上にスポットし、高濃度のＸＰプレートで青いコロニーを得、そのうち６６個でブルーハロー形成が示された。L2.086と名付けるブルーハローを示すクローンの一つを更に研究するために選んだ。このクローンはｐＭＧ中に２３７ｂｐの挿入断片を含有していた。クローンは、図１（１）に示すように、（核酸配列及び推定アミノ酸配列から決定して）リーダー配列及びリーダーペプチダーゼＩの切断部位を有することから、外膜タンパク質として同定された。ｏｍｐＬ２遺伝子の残りは３．０ｋｂのEcoRI断片にクローニングした。Ｌ．アルストニ由来のＤＮＡのライブラリーをλZapIIベクター系（Stratagene，San Diego，CA）で作成した。EcoRIで分解した後、ＤＮＡ断片をファージベクターにつないだ。メーカーの勧めに従ってライブラリーを包装し、プレートに蒔いた。およそ10,000個のプラークをつくり、フィルターに二重に移し、先に記載されたように（Maniatisら，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，1982）処理した。L2.086挿入断片に基づいて、記載のように（Man iatisら，上記）オリゴヌクレオチドプローブを放射標識し、プラークハイブリダイゼーションのために用いた。陽性の組み換えpBluescriptSK(-)クローンをメーカーの説明書に従ってin vivoでの切除によって回収した。実施例２ＯｍｐＬ２の配列分析 L2.086挿入断片の配列を、Sangerらの記載したジデオキシヌクレオチド鎖終結法（Proc．Natl．Acad．Sci．USA，74:5463，1977）及び［α−³⁵Ｓ］−ｄＡＴＰ（Giladiら、上記参照）を用いてｐＭＧ中で決定した。ｏｍｐＬ２遺伝子の残りは、二本鎖の鋳型の配列決定のためにUCLA，Dept．of Microbiology & Immuno logyで合成された標準的なＭ１３プライマーと慣用されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定した。配列決定のための反応は、Pharmacia Biotech, Inc.の記載したDeazaＴ７シークエンシングキットプロトコール及び［α−³⁵Ｓ］−ｄＡＴＰ（比活性1,000Ci/mmol）を用いて双方の鎖で実施した。ＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列はＤＮＡ Strider 1.0（Marck,C.，Nucl．Acids Res.16:1 829，1988）を用いて解析した。タンパク質の相同性探索は、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（Genetics Computer Group:GCG,Inc.）で見いだされたProfilesearch及びFASTAプログラムpackage，ver.7.0（Devereuxら，Nu cl．Acids Res.12:387,1984）で実施した。分子量６３ｋＤａと想定される５４０個のアミノ酸のポリペプチドをコードする１７４０ｂｐの読み取り枠を同定した（図１）。−３５及び−１０の推定プロモーター領域と同様、ＡＴＧ開始コドンの上流にシャイン・ダルガルノリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を同定した。ＴＡＡ停止コドンは星印で示す。FASTA及びP rofileSearchプログラムを用いたデータベース探索では顕著なアミノ酸の相同性を見ることはできなかった。しかしながら、二次構造解析では多くの両親媒性β −シート領域が予想され、外膜タンパク質の貫膜セグメントと一致する。特に注目すべきものは、外膜タンパク質でよく保存されている特徴であるカルボキシ末端のフェニルアラニンである（Struyve，M.ら，J．Mol．Biol.,218:141-148，19 91）。ＯｍｐＬ２配列を外膜タンパク質として知られるものと比較して、TonB-依存性の外膜タンパク質に相同の領域があることがわかった。TonB-依存性タンパク質はグラム陰性菌の外膜にリガンド特異的なチャンネルを形成する。全てのTonB -依存性外膜タンパク質で７個整列した配列が保存されているのが見いだされた（Kadner,R.J.，Molecular Microbiology,4:2027-2033，1990）。ＧＡＰプログラム（Devereux,J.ら，Nucl．Acids Res.，12:387-395，1984）を用いた配列比較では、ＯｍｐＬ２配列は７個全ての保存領域で相同性があると証明された（図２）。ＯｍｐＬ２と８種のTonB-依存性外膜タンパク質のペプチドの並び方は、７個の相同領域全てにおいてKadner（上記）によって同定された。ドメイン１は TonBと外膜レセプターとの直接の相互作用に関する“TonBボックス”である。ＯｍｐＬ２は、ＴＢＰ１（Ｎ．ゴノルホエア(N.gonorrhoeae)トランスフェリン結合タンパク質１）；ＢｔｕＢ（大腸菌ビタミンＢ₁₂レセプター）；Ｃｉｒ（大腸菌コリシンＩレセプター）；ＩｕｔＡ（大腸菌アエロバクチンレセプター）；ＦｈｕＡ（大腸菌フェリクロムレセプター）；ＰｕｐＡ（Ｐ．プチダ(P.putida)シュドバクチンレセプター）；ＩｒｇＡ（Ｖ．クロレラ(V.chlolerae)鉄−調節外膜タンパク質）；ＦｏｘＡ（Ｙ．エンテロコリティカ(Y.enterocolitica)フェリオキサミンレセプター）と相同性がある。星印は９種のタンパク質全てで完全に同一である位置を示す。ＯｍｐＬ２がDayhoff.のMutation Matrix（In M.O.Dayh off(ed.),タンパク質の配列と構造図説(Atlas of protein sequence and Struct ure)，Vol.5，Suppl.3，National Biomedical Research Fdn.，Washington,D.C. )で予想された他の８種のタンパク質の全て（｜）、半分（：）または２５％（．）と機能的に類似のアミノ酸である位置を示す。これらのセグメントの最初は、次の一致した配列：Thr-X-Y-Valで特徴付けられるTonBボックスとして知られる。ＯｍｐＬ２のTonBボックスではスレオニンが保持されているが、イソロイシンをバリンに保存的に置換している。この位置での置換は、TonB-依存性外膜タンパク質として知られるものの間では例がない（u nprecidented）が、スピロヘータは真菌の進化で最も深い枝の一つを占めており、ＯｍｐＬ２は同定された最初のスピロヘータTonB-依存性外膜タンパク質であろう。突然変異誘発研究では、TonB-依存性外膜タンパク質とTonBとの相互作用は、TonBボックス内でのアミノ酸置換に対して、非変異のバリンの位置においても、高い耐性があることが証明されている（Gudmundsdottir,A.ら，Journal of Bacteriology,171:6526-6533，1989）。実施例３ＯｍｐＬ２の位相幾何学モノクローナル抗体及び欠失突然変異誘発を用い、大腸菌TonB-依存性外膜タンパク質ＦｅｐＡの位相幾何学が研究された（Rutz，J.M.ら，Science,258:471ー 474,1992）。Ｙ．エンテロコリカ（Y.enterocolica）のTonB-依存性外膜タンパク質ＦｏｘＡの位相幾何学も提示された（Baumler，A.J.ら，Molecular Microbi ology，6:1309-1321，1992）。ＯｍｐＬ２配列には貫膜セグメントに一致する両親媒性β−シートが２４個含まれ、外膜タンパク質に典型的な大きな表面が露出したループと短い周辺ループを有する位相幾何学モデルを提示することが可能になる（図３）。膜−貫通β−シートは整列の右側の疎水性の膜に面した残基と共に、長方形の中に互い違いに整列しているように示される。実施例４鉄欠乏時のｏｍｐＬ２の発現鉄欠乏培地（鉄キレート剤ジピリジル５０μＭを含有するボブミナー(Invirog en，N.Y.)）で成長させたとき、ＯｍｐＬ２はＬ．アルストニによって大量に製造されることが研究によって示される。ｏｍｐＬ２遺伝子の上流のプロモーター領域に潜在的な鉄結合部位があり、このことからも鉄制限条件下でｏｍｐＬ２の発現が起こることが示される。これは、Ton-B依存性の外膜タンパク質のほとんどに共通の性質として、レプトスピラが宿主内にある場合にＯｍｐＬ２の発現が起こることを示唆している。宿主内に入るときに細菌の病原体によって製造される外膜タンパク質は理想的なワクチン候補であろう。実施例５サザンブロット及びノーザンブロット解析サザンブロット解析はManiatisら（上記）が先に記載したようにして実施する。ｏｍｐＬ２からのプローブは５’末端を［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（5,000Ci/mmol； Amersham Corp.，Arlington Heights，IL）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し、次いでバイオスピン６カラム（Bio-rad Laboratories，Hercules，CA）で精製する。種々のレプトスピラ種由来のＤＮＡを含有する膜を１×１０⁶cpm/m lのハイブリダイゼーション緩衝液と３７℃で一晩ハイブリダイズさせる。ノーザンブロット解析では、先に記載した方法（Maniatisら、上記）によってＬ．アルストニから全細胞ＲＮＡを単離する。ＲＮＡおよそ１５μｇを１．５％のアガロースーホルムアルデヒドゲル中を二重に電気泳動させ、ニトロセルロースに移す。ランダムプライマーＤＮＡ標識系（ＢＲＬ）を用いて［α−³²Ｐ］ｄＡＴＰで放射標識したｏｍｐＬ２遺伝子のＰＣＲで形成したＤＮＡ断片でフィルターを調べる。ハイブリダイゼーションは先に記載したように行う（Maniatisら、上記）。実施例６ｐＲＣＥＴ発現ベクターへのｏｍｐＬ２遺伝子のクローニングｏｍｐＬ２遺伝子を含有するpBluescriptプラスミドをHincII及びClaIで分解した。得られたＯｍｐＬ２タンパク質のカルボキシ末端側の半分をコードするＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で単離し、PvuIII及びCsp451で消化したpRSE T(Invirogen，San Diego，CA)とつないだ。得られた構築物、pRSET-ompL2はＯｍｐＬ２のアミノ末端にＨｉｓ６結合部を有する４１個のアミノ酸を含有する融合タンパク質をコードする。６個のヒスチジンは、大腸菌のタンパク質を排除するためにニッケル樹脂カラムで融合タンパク質をｐＨ−依存性のアフィニティー精製することができるようにする。ｐＲＳＥＴ融合タンパク質はＴ７プロモーターの調節下にある。pRSET-ompL2を大腸菌ＤＨ５αにトランスフォームした後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、Sigma）の存在下でミリグラム単位のHis6-OmpL2融合タンパク質が生成する。実施例７精製ＯｍｐＬ２によるウサギの免疫化 His6-OmpL2融合タンパク質をSDS-PAGEで他の不溶性物質と分離する。約５０μ ｇのタンパク質を含有するHis6-OmpL2のバンドをアクリルアミドゲルから切り取り、乾燥し、粉状に粉砕し、フロインド完全アジュバントと混合してニュージーランド白色雄ウサギの皮下及び筋肉内に接種する。更に別のHis6-OmpL2融合タンパク質を６Ｍグアニジンに溶解し、ニッケル樹脂カラムで精製し、１０ｍＭTris 、ｐＨ８．０中で透析する。二次免疫は、フロインド不完全アジュバント中の精製His6-OmpL2融合タンパク質約５０μｇを用い、一次免疫の６週間後に行う。ウサギは二次免疫の後二週間飼育する。追加免疫後の抗血清はSDS-PAGEで分離したＬ．アルストニ全体の免疫ブロット上の６３ｋＤａの抗原と反応するだろう。ＴＸ−１１４で分画したＬ．アルストニの免疫ブロットでは、生物全体及びデタージェント層で６３ｋＤａのＯｍｐＬ２抗原との反応性が見られるが、水層または不溶性のペレットでは（反応性が）見られない。実施例８免疫電子顕微鏡法による表面局在局在研究のための非常に特異的な免疫学的試薬が得られたので、免疫電子顕微鏡法の予備実験を行うことができる。Ｌ．アルストニ１０⁷個の懸濁液２０μｌを熱不活化抗−ＯｍｐＬ２抗血清または同じウサギの免疫前の血清０．５ｍｌに添加し、混合しながら１時間インキュベートする。カコジレート緩衝剤１００ｍＭ、ｐＨ７．０中０．７５％グルタルアルデヒド２５０μｌの添加で細菌を３０分間固定する。細菌を洗浄し、電子顕微鏡の格子内に置き、タンパク質Ｇ−金コロイド（１０ｎｍの粒子）で調べる。実施例９ｐＴｔｒｃ９９Ａ発現ベクターによるＯｍｐＬ２の発現 His6融合タンパク質は精製によく適しているが、His6結合部を有する更に４１個のアミノ酸のバックグラウンドの反応性のため、免疫ブロット研究には適当でない。ウサギの一匹の免疫前の血清はHis6-OmpL2融合タンパク質と反応するが、天然のＯｍｐＬ２とは反応しない。pRCET-ompL2ベクターからゲル電気泳動でBgl II-HindII断片を単離し、NcoIリンカー十量体で調整した読み枠であったpTrc99A 発現ベクター（Pharmacia）中にクローニングする。大腸菌ＤＨ５αにトランスフォームされたpTrc99A-ompL2構築物は成熟ＯｍｐＬ２タンパク質全体と、ベクターから供給される最初のメチオニン及び更に５個のアミノ酸のみを発現する。元のpTrc99Aベクターを含有する大腸菌ＤＨ５αは陰性対照として働く。細菌のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースに移し、種々の病原性レプトスピラ株で免疫されたウサギの抗血清（Arnold Kaufmann博士,Center for Disea se Control，Atlantaから供給される抗血清）で調べる。ＯｍｐＬ２の反応性はＬ．インテロガンス、serovars icterohaemorrhagiae、pomona、及びbratislava 、Ｌ．アルストニ、serovars grippotyphosa及びMozdok、Ｌ．サンタロサイ（L. santarosai）、serovars bakeri及びcanalzonae、及びＬ．ウェイリー、serovar celledoniに対する抗血清で報告されているものと似ている。ＯｍｐＬ２は発現するだけでなく、病原性レプトスピラの中で抗原性が保たれているように思われ、この性質から（ＯｍｐＬ２が）優れたワクチン候補となる。以上は発明の範囲を説明することを意味するが、制限することを意味するものではない。事実、当業者はここに教示したことに基づいて、過度の実験をすることなく更に他の態様を容易に考え、作り出すことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｆ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．ＯｍｐＬ２のアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチド。２．ポリペプチドが約６３ｋＤの分子量を有する請求項１のポリペプチド。３．ポリペプチドが図１のアミノ酸配列を本質的に有する請求項１のポリペプチド。４．ＯｍｐＬ２がレプトスピラアルストニ（Leptospira alstoni）由来のものである請求項１のポリペプチド。５．ＯｍｐＬ２がgrippotyphosa及びMozdokからなる群から選ばれるレプトスピラアルストニのserovar由来のものである請求項４のポリペプチド。６．ＯｍｐＬ２がレプトスピラインテロガンス（Leptospira interrogans）由来のものである請求項１のポリペプチド。７．ＯｍｐＬ２がicterohaemorrhagiae,pomona及びbratislavaからなる群から選ばれるレプトスピラインテロガンスのserovar由来のものである請求項６のポリペプチド。８．請求項１のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列。９．ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項８のポリヌクレオチド配列。１０．ｏｍｐＬ２配列がａ．ＴがＵであってもよい図１のヌクレオチド配列；ｂ．図１のヌクレオチド配列に相補的な核酸配列；及びｃ．長さが少なくとも１５塩基であり、図１のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡに選択的にハイブリダイズするａ．またはｂ．の断片からなる群から選ばれる請求項８のポリヌクレオチド。１１．ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項８のポリヌクレオチド配列。１２．請求項８のポリヌクレオチドを含有する組み換え発現ベクター。１３．ベクターがプラスミドである請求項１２の発現ベクター。１４．ポリヌクレオチド配列がＬ．アルストニ由来のものである請求項１２のベクター。１５．請求項１２の発現ベクターでトランスフォームした宿主細胞。１６．細胞が原核生物である請求項１５の宿主細胞。１７．大腸菌である請求項１６の原核生物。１８．細胞が真核生物である請求項１５の宿主細胞。１９．ａ．請求項８のポリヌクレオチドで宿主をトランスフォームし；そしてｂ．宿主内でポリヌクレオチドを発現させることを含む、ＯｍｐＬ２ポリペプチドの製造方法。２０．更にＯｍｐＬ２ポリペプチドを単離することを含む請求項１９の方法。２１．宿主が原核生物である請求項１９の方法。２２．製薬上許容し得る担体中に免疫原として有効量のＯｍｐＬ２を含有する、動物体内で病原性レプトスピラに対する免疫応答を引き起こすために有用な医薬組成物。２３．製薬上許容し得る担体にアジュバントが含まれる請求項２２の医薬組成物。２４．動物を請求項２２の組成物で免疫することを含む、動物体内で病原性レプトスピラに対する免疫応答を引き起こす方法。２５．製薬上許容し得る担体中でＯｍｐＬ２に結合する免疫原として有効量の抗体を含有する、動物体内で病原性レプトスピラに対する免疫応答を引き起こすために有用な医薬組成物。２６．ＯｍｐＬ２に結合する抗体。２７．抗体がポリクローナルである請求項２６の抗体。２８．抗体がモノクローナルである請求項２６の抗体。２９．試料中の病原性特異的細胞成分を病原性特異的細胞成分と結合する試薬と接触させ、試薬の細胞成分への結合を検出することを含む、試料中の病原性レプトスピラの検出方法。３０．病原性特異的細胞成分がＯｍｐＬ２ポリペプチドをコードする核酸である請求項２９の方法。３１．核酸がＤＮＡである請求項３０の方法。３２．核酸がＲＮＡである請求項３０の方法。３３．病原性特異的細胞成分がＯｍｐＬ２ポリペプチドである請求項２９の方法。３４．試薬がプローブである請求項２９の方法。３５．プローブが核酸である請求項３４の方法。３６．プローブが抗体である請求項３４の方法。３７．抗体がポリクローナルである請求項３６の方法。３８．抗体がモノクローナルである請求項３６の方法。３９．プローブが検出可能に標識されている請求項３４の方法。４０．標識が放射性同位体、生物発光化合物、化学発光化合物、螢光化合物、金属のキレート剤、あるいは酵素からなる群から選ばれる請求項３９の方法。４１．試料がヒト、ブタ、ウシからなる群から選ばれる動物由来である請求項２９の方法。４２．抗体がＯｍｐＬ２ポリペプチドに結合できる条件下で試料をＯｍｐＬ２ポリペプチドと接触させ、抗体のＯｍｐＬ２ポリペプチドへの結合を検出することを含む、試料中のＯｍｐＬ２ポリペプチドに対する抗体の検出方法。４３．ＯｍｐＬ２ポリペプチドが検出可能に標識されている請求項４２の方法。４４．ＯｍｐＬ２結合試薬を含有する第一の容器を含有する１つまたはそれ以上の容器を密閉して有するように仕切られた担体手段を含有する、ＯｍｐＬ２ポリペプチドの検出のために有用なキット。４５．試薬が抗体である請求項４４のキット。４６．抗体がヒトのものである請求項４５のキット。４７．抗体がモノクローナルである請求項４５のキット。４８．ＯｍｐＬ２ポリヌクレオチド結合試薬を含有する第一の容器を含有する１つまたはそれ以上の容器を密閉して有するように仕切られた担体手段を含有する、ＯｍｐＬ２ポリヌクレオチドの検出のために有用なキット。４９．結合試薬が核酸である請求項４８のキット。５０．ＯｍｐＬ２ポリペプチドを含有する容器を含有する１つまたはそれ以上の容器を密閉して有するように仕切られた担体手段を含有する、ＯｍｐＬ２ポリペプチドに対する抗体の検出のために有用なキット。