JPH10507161A

JPH10507161A - シグナルタンパク質およびシグナルペプチドの段階的修飾、ならびにスーパーアゴニストおよびスーパーアンタゴニスト

Info

Publication number: JPH10507161A
Application number: JP8508637A
Authority: JP
Inventors: ビクタースミツト，; ウイレムフツペス，
Original assignee: フアーマ・キー・ベー・ブイ
Priority date: 1994-08-31
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 1998-07-14
Also published as: ES2208691T3; CA2198919A1; EP0796276A1; AU3266895A; NL1000332C1; US20020150551A1; DE69531955T2; EP0796276B1; WO1996006860A3; DE69531955D1; WO1996006860A2

Abstract

(57)【要約】本発明はシグナルタンパク質類およびシグナルペプチド類の特異的な段階的修飾に関係する。その位置が推定された修飾と、プロテアーゼ処理および質量分析法の新規の形態とのある組み合わせにより、当該タンパク質もしくはペプチドの非常に特異的な修飾が達成されることができる。これは生物学的活性、好ましくは強化された活性、拮抗的活性および／もしくは細胞阻害活性におけるある望まれる変化の導入を可能にする。拮抗的活性もしくは細胞阻害活性は、化学的修飾、すなわち、ヒトインターロイキン３の触媒中心および／もしくは亜鉛結合中心内部もしくは付近に配置されたヒスチジン残基に対して特異的なあるアルキル化により現実化されることができた。当業者はまた、阻害剤および／もしくはアンタゴニストを、好ましくは分子生物学的修飾、化学的修飾および／もしくは好ましくはヨード酢酸によるアルキル化により創製するために、この発明を容易に使用することもできる。好ましくはこれらの修飾はヒスチジン（His）残基、他の触媒残基および／もしくは亜鉛結合残基に対し向けられる。付加的な結果およびデータから、本発明はまた他のシグナル物質類にも容易に応用されることができることが推論される可能性がある。当該結果はまた、遺伝子治療もまた包含するＤＮＡ構築物類によっても良好に成し遂げられることができる。かように、提示される方法、得られる物質およびその使用は本発明において具現化される。

Description

【発明の詳細な説明】シグナルタンパク質およびシグナルペプチドの段階的修飾、ならびにスーパーアゴニストおよびスーパーアンタゴニスト発明の科学的分野：この発明は生物学的に活性のタンパク質類およびペプチド類の化学修飾技術の領域に基づく。さらに具体的には、優れた性質または新規のもしくは対向する活性さえ有する性質をもつタンパク質もしくはペプチドを得るための化学修飾の使用に関する。加えて、本発明はまた、急性骨髄性白血病細胞の非常に効果的な阻害剤につながる、段階的化学修飾、ある生物学的原理すなわちシグナルペプチド類の触媒活性およびその成功した排除を用いることによる、構造−機能分析のためのある新規の方法に関する。限定するものでないが、例示すると、われわれはヒトＩＬ−３、すなわち修飾後にもまた本質的な治療的価値を有するタンパク質、の化学修飾を示す。この特許の記述もまた、本発明の治療上の分野内の特定の例を含有する。応用の分野：本発明にとり重要な、２つの可能な応用の分野がある。すなわち、優れた性質をもつＩＬ−３（スーパーアゴニスト）についての分野、または、対向する性質もしくは新規の性質をもつＩＬ−３（アンタゴニスト）についての分野である。この特許では、スーパーアゴニストは、例えば低下した抗原性および／もしくはより大きな生物学的活性および／もしくはより大きな安定性をもつＩＬ−３が開示される。ＩＬ−３スーパーアゴニストの可能な応用は：・骨髄移植のための誘導的治療の後もしくは偶発的放射の後のような骨髄除去(a blative)治療後の血球減少期の短縮。・例えば白血病の化学療法のための、あるＩＬ−３レセプターのある細胞の同調させた細胞周期の誘導。・寄生虫感染、結核、真菌感染症およびある種のウイルス感染症のような疾患の治療のための、細胞の数およびその活性化の双方に対するＩＬ−３依存性の子孫の強化の誘導。・例えば火傷の傷および非同種皮膚移植での、リンパ球を除く核を含有する細胞への骨髄の選択的生長。シグナル物質のアンタゴニスト（対向活性もしくは細胞阻害活性のある）、より具体的にはＩＬ−３の応用のいくつかの、しかしすべてではない例は：・骨髄移植における骨髄細胞の阻害および／もしくは中和。・自己免疫疾患、癌、ならびに鎌状赤血球貧血およびサラセミアのような造血器官の疾患における骨髄抑制。・ＩＬ−３レセプターをもつ細胞を伴うあらゆる種類の癌、さらに具体的には急性骨髄性白血病もしくは慢性骨髄性白血病のほぼすべての形態、Ｂ細胞リンパ球腫瘍またはＩＬ−３により刺激される癌の他の形態、例えばある種の卵細胞腫瘍、を治癒するための治療。・ＩＬ−３レセプターを含有するリンパ球細胞の抑制もしくは排除による、関節炎、リウマチ性関節炎および中枢神経系の疾患のような自己免疫疾患における当該組織に対する自己寛容の誘導。これはまた、好酸性顆粒球のようなエフェクター細胞の損なわれた創製および排除にもつながる可能性がある。最終的に、これらの細胞との直接の相互作用が存在する可能性があり、かように好酸球性症候群の直接の治癒を可能にする。これはまた、寄生虫感染および例えば医薬品に対する過敏性反応の急性期においても非常に重要である。・例えばエフェクター細胞を殺すかもしくはその数を減らすことによる、好酸球性の胃炎および腸炎のような好酸球性症候群、筋膜炎、肉芽腫症、静脈洞炎、肺炎、喘息、チャーグ−シュトラウス症候群ならびに他の脈管炎を治癒すること、ならびにショック症候群の治療。・アレルギーの治療のための、リンパ球細胞および／もしくは好酸性顆粒球のようなエフェクター細胞のような、ＩＬ−３レセプターのある細胞の除去もしくは抑制。これらの場合においては、アレルギーの抑制および抗原に対する寛容の誘導の双方が起こり得る。・ＩＬ−３の作用が関与する他のアレルギー反応。・ＩＬ−３に媒介される接着により促進される転移を防止するための治療。・例えば血流中に増殖因子の過剰量の出現がある急性期を抑制することによる感染性疾患の治療。・Ｂ細胞およびＢ細胞の抗体産生（宿主の細胞性抵抗に対してＨＩＶウイルスを保護する）の抑制によるＨＩＶ感染症および／もしくはエイズの治療。これらの応用のひとつもしくはそれ以上はまた、他のインターロイキン類１〜８、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）およびγＩＮＦ（インターフェロン）のような他の増殖因子についても挙げることができる。これらの増殖因子類もまたこの発明による修飾に関する良好な候補である。これにより「ＩＬ− ３」は他のシグナル物質により取って代わられることになる。様々な疾患における様々な物質の相互作用の様態は物質ごとに異なる可能性があるため、いくつかの相乗効果もまた予期することができる。従ってこれらもまた本発明において具現化される。最後に、以下の応用が付加されるかもしくは特定されうる：・ＩＬ−１で促進される黒色腫の転移および肺癌の形態を抑制するためのＩＬ− １の阻害・アルツハイマー病を抑制するためのＩＬ−１の阻害・毛細血管漏出症候群を抑制するためのＩＬ−２の阻害・歯周炎を抑制するためのＩＬ−２の阻害・歯周炎を抑制するためのＩＬ−４の阻害・ＩＬ−４で刺激される、例えばマウスにおける放射線白血病ウイルスのようなウイルス類を抑制するためのＩＬ−４の阻害・ＩＬ−５で促進される気道感染症を抑制するためのＩＬ−５の阻害・リウマチ性関節炎を抑制するためのＩＬ−６の阻害・ミコバクテリウム属の感染症を抑制するためのＩＬ−１０の阻害インビボの実施例で、あるエイズウイルス感染症を効果的に抑制する可能性が存在することが示される。この抑制は抗体産生Ｂ細胞の抑制により達成されることができる抗体レベルの低減に基づく。これがエイズの効果的な抑制につながる可能性があるという事実は、以下の原因に帰することができる。すなわち、（１）ＨＩＶウイルスは、好ましくは抗体とのオプソニン効果により組織球細胞（マクロファージ様細胞）に感染する。マクロファージの向性および持続感染のためのこれらの組織球細胞の感染の必要性は、AIDS Res．and Human Retroviruses 9 : 669(19 93)および引用文献に記述される。抗体レベルの低減により感染のこの形態は抑制されることができる。（２）抗体は細胞性免疫に対しＨＩＶおよび／もしくはＨＩＶ感染細胞を保護することができる。これは、インビトロ中和抗体の非常に高いレベルおよび立証される細胞性抵抗にもかかわらず、ＨＩＶ感染の無症候期における不完全な包括的抵抗を説明する。実施例において立証されるように、抗体レベルの低下は、ウイルスおよびウイルスが感染した細胞に対する効果的な細胞性免疫、ならびにウイルスの排除さえもたらすことができる。従って、例えばアンタゴニスト類でのＢ細胞の阻害は、ＨＩＶ感染の治癒につながることができる。修飾されたシグナルペプチド類もまた分子生物学により創製することができることが認知できるため、これらの変異タンパク質、ＤＮＡ構築物およびそれらの使用もまた本発明の範囲内にあると考慮されている。この結果、そうしたペプチド類および／もしくはタンパク質類のコードを含有する構築物での遺伝子治療を包含することができる。遺伝子治療における使用は、スーパーアゴニストもしくはアンタゴニストを産生しかつ排出する細胞をもたらすことができる。従って、実施例のひとつにおいては、低減された安定性をもつある増殖因子を構築する可能性についての詳細もまた存する。これはとりわけ拮抗作用と組み合わせて用いられることができ、従って、それによりアンタゴニストの崩壊の高い速度が非常に局限される環境への作用を含有することができる、選択的投与をもたらす。これは固形癌に対する遺伝子治療においてとりわけ興味深い。こうした細胞が腫瘍の中もしくは付近に存在する場合は、とくにこの腫瘍は最大限の影響に曝されることを経験するであろう。産生されるシグナルペプチドの付加的な不安定性が存在する場合は、そのペプチドの影響は非常に局在化することができ、従ってより少ない副作用の予期につながる。実施例のひとつにおいては、低下された安定性をもつあるシグナルペプチドを創製することが可能であることが立証される。こうしたペプチド類もまた、欠失および／もしくは置換変異体で創製することができることから、こうした遺伝子治療的応用および遺伝子治療のための構築物もまた本発明の応用の分野内にあると考慮されている。この特許の記述はまた、化学修飾、プロテアーゼ処理および質量分析法の使用についても詳述する。これはあらゆるペプチドもしくはタンパク質のあらゆる修飾に応用することができるが、但し、例えばプロテアーゼで特異的に断片化することができる。本記述の定量的構造−機能分析の部分は、段階的化学修飾、プロテアーゼ処理およびレーザーディソープション質量分析法と生物学的アッセイとの組み合わせの成功した使用を含有する。従って、修飾される、とりわけ断片化されることができ、かつ生物学的に活性であるいかなるペプチドおよび／もしくはタンパク質へのこの分析の応用もまた、本発明の範囲内にあると考慮される。電子スプレー質量分析法のような他の質量分析技術を使用することもまた可能である。電子スプレー質量分析法は例えばエキソプロテアーゼ処理の後にはとりわけ適する。最後に、本発明の記述はまた、とくに触媒活性およびその後の効力のための、荷電が１価以上の金属イオン、なるべくなら亜鉛イオンの重要性もまた開示する。従って、（局所の）金属イオン濃度を操作することにより増殖因子の活性に影響を与えることが可能である。金属イオン濃度の効力には通常の最適条件が存在するため、この最適条件よりも低いもしくは超えたいかなる濃度も増殖因子の効力の低減につながる可能性がある。これは増殖因子の効力の操作を可能にする。この方法において、間接的な治療効果もまた金属イオン、好ましくは亜鉛イオンで達成することができる。これはwr ath'sのような皮膚疾患の治療において軟膏の形態で用いることができる。その上、肺の罹患(lung-affects)の治療のための吸入スプレーの使用も可能である。発明の背景：ヒトインターロイキン−３：糖タンパク質としてＴ細胞から最初に単離されたインターロイキン−３は、骨髄細胞に作用することが立証されている。他の増殖因子が存在するかしないかのいずれかで、これらの骨髄細胞から様々なな血球細胞の形成を誘導することが示されている。ヒトＩＬ−３は1987年にドーサーズ(Dorssers)らにより最初にクローニングされた。彼らはヒトｃＤＮＡライブラリーおよびマウスＤＮＡのプローブとのハイブリッド形成を使用した（ジーン(Gene)、55: 115(1987)）。ヒトインターロイキン−３の構造−機能相関：ヒトインターロイキン−３の構造−機能相関に関連するいくつかの論文が発表されている（ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J．Biol．Chem .)、266: 21310(1991)、J．Clin．Invest．90:1879(1992)、ジャーナルオブイムノロジー(J．Immunol.)、146: 83(1991)、EMBO J.、10: 2125(1991)、プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(P roc．Natl．Acad．Sci．USA)、89: 11842(1992)）。その研究では、彼らは全員とも欠失および置換変異体の創製ような分子生物学的技術を使用した。置換変異体が使用された場合には、その選択は他の種（マウス、アカゲザル、テナガザル）とのＩＬ−３のアミノ酸の相同性に基づくか、または極性もしくは構造の計画的な変更に基づいた。欠失変異体では、当該タンパク質は、生物学的重要性についてタンパク質の一部の除去により入念に検討された。変異タンパク質（ミューテイン）の精製に関する実際的な問題のため、これらの変異タンパク質は主要な構造変化について調べられていない。これは大きな問題である、というのは、これらの構造変化は通常起こるものであるからである。記述されるように、ときにはそれらは故意にさえ導入される。結果として、生物学的活性への様々なアミノ酸の関与に関するいかなる言明も、最大の制限とともにのみなされる可能性がある。本発明は異なるアプローチを有する。天然のＩＬ−３が出発材料として用いられる。段階的で徐々に増大する修飾を使用することにより、特別の特異性が化学反応の際に導入される。生物学的活性における最初の変化と同時に起こる修飾は、特異的プロテアーゼおよび質量分析法の新規の形態で簡単にその起原が突き止めることができる。結果として、重要なアミノ酸残基が迅速に位置推定することができ、かつ、最小限の変化（および従って最大限の調節）が，望まれる性質の導入もしくは変化において達成することができる。修飾された材料を精製する必要はなく、また、従って精製の間の損失における問題もない。これは重ねて二次構造の容易な証明を可能にする。従って、この発明は分子生物学的技術と比較するとひとつの改善である。なぜならそのアプローチはより都合がよく、よりよく証明が可能であり、かつ分子生物学的アプローチより迅速であるからである。修飾された増殖因子：スーパーアンタゴニスト類：多様な増殖因子に関する多くの構造−機能研究の試みにおいて、ミューテインが改善された活性を有することが見出されてきた。例えば、欧州特許第131816号明細書において、記述される最終目標は、改善された生物学的活性および／もしくはより少ない副作用をもつβ−インターフェロンを得ることである。化学修飾の様々な例もまた利用し得る。例えば欧州特許第236987号明細書は、身体からの除去において改善された動態をもつ、毒性がより小さくかつ免疫原性のより小さい物質を得るためのＩＬ−２の修飾を記述する。欧州特許第442724号明細書は、より長い半減期および強化された生物学的活性のある生成物であるＰＥＧ化されたＩＬ−６を記述する。国際公開願第88/01511号は、それにより強化された溶解性が達成されるＩＬ−２のスクシニル化を記述する。これらの特許出願のいずれにおいても、試行錯誤のアプローチの他にいかなる修飾戦略も存在しない。試行錯誤のアプローチでは、分子上に１個もしくは数個の修飾を得るために無作為の穏やかな修飾が使用される。加えて、精製においては実質的な損失が起こる可能性があり、これはまた、望まれるタンパク質の10％の収量のみが得られたＩＬ− ６のＰＥＧ化の事例でもある。修飾の位置推定はこれらの発明のいずれにおいてもなされなかった。本発明においてはほとんど損失はなく、また、修飾の位置推定が良好に実施することができる。加えて、段階的な化学修飾が、実施例１および２において立証されるように、当該分子中の１個の場所で特異的に１個の残基を修飾することを可能にさえする。ほとんどの修飾は不可逆的な試薬で実施されるにもかかわらず、可逆的な試薬もまた使用することができる。これはまた他の残基の非常に特異的な修飾も可能にする。アンタゴニスト類：欧州特許出願公開第413383号においては、ヒトＩＬ−３変異体の拮抗作用が言及されている。しかしながら、この場合においては、そのレセプター結合能力と比較して残存する生物学的活性の関係に関連する。かように、天然のＩＬ−３の活性の事実上の抑制は示されなかった。特許出願第PCT/US93/11197号および同第PCT/US93/11198号においては、すべての種類のＩＬ−３変異体が特許請求されているが、しかし、この場合においてもまた、事実上の阻害活性の支持となるものはない。加えて、最も活性の低い変異体もまた最良の阻害剤でもあることは起こりそうもない。なぜなら、構造的なゆがみの可能性は触媒活性の特異的な排除の可能性よりもっと大きいからである。ウシ成長ホルモン（エンドクリノロジー(Endocrinology)、130: 2284(1992)）、マウスインターロイキン−２（EMBO J.、11: 3905(1992)）、ヒト肝細胞増殖因子（バイオケミストリー(Biochemistry)、31: 9555(1995)）、ＩＬ−１（Scan d．J．Immunol.、36: 27(1992)）およびＬＩ−４（J．Exp．Med.、178: 2213(19 93)）のレセプターに対する他の事実上のアンタゴニスト類が存在する。これらの発表すべてにおいて、いかなる修飾戦略も記述されなかった。当該アンタゴニスト類はすべて構造−機能分析研究の副産物であった。加えて、意義のある阻害を得るために必要とされた阻害剤の濃度は、平均して、天然の増殖因子の濃度より100倍も大きかった。これらは、これらのアンタゴニスト類の臨床的価値に有害である濃度である。増殖因子のあるアンタゴニストを創製するための唯一の戦略がヒト成長ホルモンに対して使用されている（サイエンス(Science)、256: 1677(1992)）。これは当該ホルモンの２個のレセプター結合部位のひとつの崩壊に基づいた。この場合においてもまた、レセプター結合活性においてファクター(factor)50の減少が存在し、従って、増殖因子に比較して問題をはらむ過剰の阻害剤が要求された。しかしながら、本発明で、ことによると強化されたレセプター結合活性さえもつ、臨床的に応用し得る阻害を得ることが可能である。これは、増殖因子それ自身が、レセプター結合後にいくらかの触媒活性を発揮するという仮説で説明されることができる。この仮説は、ＩＬ−３が触媒作用のある１個の亜鉛イオンを含有するという事実により支持された（Biochem．Biophys．Res．Commun.、187: 8 59(1992)）。当該増殖因子が完全な触媒中心を含有することは必要ではない。当該触媒中心が増殖因子とレセプターとの結合においてのみ完成されるということは非常によくありそうなことである。従って、関連する化学修飾は、そうした亜鉛結合および／もしくは触媒ならびにレセプター結合能力のゆがみのないこれに直接もしくは間接的に関連する残基に対して可能な限り特異的に向けられる。当該出発材料は、タンパク質もしくはペプチドを含有するいかなる物質であることができる。しかしながら、亜鉛イオンは変性に対して保護できるため、当該分子を可逆的に変性し、かつ、キレート剤を添加してこの亜鉛を当該分子から除去することが必要になるかも知れない。実例として、しかし本発明の制限としてではなく、ヨード酢酸でのＩＬ−３の修飾が記述される。関連するpＨにおいて、この修飾はHis（ヒスチジン）残基のアルキル化を指示される。当該方法は、しかしながら、当業者により他の試薬ででもまた容易に実行することができる。同じことが、触媒活性および／もしくは亜鉛結合に関係する他のアミノ酸の修飾についても言明することができる。これらの残基類もまた、他の化学的方法もしくは分子生物学的方法、例えば欠失もしくは置換変異体を使用することにより容易に修飾することができる。加えて、これはＩＬ−３のみに制限されない。すなわち、サイトカイン・スーパーファミリー、例えば、インターロイキン−２〜７、エリスロポエチンおよびＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）の多様なレセプター間には大きな相同性がある。それに加えて、特異的亜鉛結合はまたＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＳＣＦおよびγＩＮＦ（インターフェロン）についても見出されている。本発明がさらにもっと多くのシグナルペプチドおよび／もしくはタンパク質に応用することができることもまた考えられる。というのは、例えば、インスリン、ヒト成長ホルモンおよびプロラクチンもまた特異的な亜鉛結合性の性質を有するからである。加えて、ある種の細胞系については、ＩＬ −３が例えばインスリンで置き換えることができることが見出されている。最後に、ある増殖因子のアルキル化もまた、アンタゴニストもしくは細胞阻害剤の創製において他のメカニズムを有する可能性がある。従って、一般的に、好ましくはヨード酢酸でのアルキル化もまた、本発明における別個のアプローチのひとつとみなされることになる。従って、上で言及される応用および／もしくは修飾される物質および／もしくはＤＮＡ構築物ならびにそれらの使用すべては、本発明の範囲内で具現化される。エイズに対する治療：すでに論じられたように、本発明はことによるとエイズに対する戦いに応用することができる。それは、現在の可能性よりも、エイズと戦うためのより良好な方法を提供するはずである。クサタリー(Csatary)らの米国特許第52157 45号において、エイズに対する免疫療法のための非特異的方法が記述される。この場合においては、トリのパラミクソウイルスおよび／もしくはトリのロタウイルスの非特異的ウイルス感染症のある手段が、ＣＤ４陽性細胞の数を増加するために使用される。これはたかだかその疾患の延期につながる可能性がある。なぜなら、新規に形成されるＣＤ４陽性細胞は短時間の後ＨＩＶにより感染されるであろうからである。対照的に、われわれの発明はレトロウイルス類に対する効果的な細胞性免疫応答につながる。ベルゾフスキー(Bersofsky)らの米国特許第508 1226号においては、ある治療法がレトロウイルスに対する特異的免疫応答に向けられる。この場合は、例えばＨＩＶの糖タンパク質160／120複合体に対する抗体が創製される。本発明に対応するわれわれの研究においては、このアプローチはＨＩＶの保護、およびそれにより疾患を促進しさえする組織球内でのその組込みにつながった。結果として、この方法は効力を立証できなかった。この理由のため、米国特許第5256767号はエンベロープのないあるウイルスサブユニットワクチンを記述する。この方法の欠点は、しかしながら、脂肪親和性の核の部分はＭＨＣと関連させてみるとたかだか非常に低い濃度で発現する可能性があり、そして従って十分な保護を提供しないという事実である。不活性化されたウイルスに基づくワクチン類は２個の前述の特許の難点を併せ持つ。上述される問題と対照的に、われわれはわれわれの実施例７においてＨＴＬＶIIIB（エイズリサーチアンドレファレンスリージェントプログラムカタログ(AIDS Research and Reference Reagent Program Catalog)、ＮＩＨパブリケーション(NIH Publication)No．91-1536、ベセスダ(Bethesda) 、メリーランド州(MD)、ＵＳＡ）が低い抗体濃度でインビボで排除されることを記述する。オリゴクローナル群のＨＴＬＶIIIBから、それが正常な環境において持続するレトロウイルス感染症を引き起こすことが知られている。これはまた、注射針の事故を介してのジョン・ムーア(John Moore)のグループ内での同僚のＨＴＬＶIIIBの感染によっても立証された（AIDS Res．Hum．Retrovir.、6: 307(1 990)およびJ．Clin．Invest.、91: 1987(1992)）。対照的に、われわれの実施例からは、これらのウイルスは抗体濃度が低い場合に排除される可能性があることが推論されうる。Ｂ細胞の創製および次に起こるこれらのＢ細胞による抗体の産生は、様々な増殖因子（例えばＩＬ−１〜７およびＩＬ−11）により促進される。従って、エイズに対する治療もまた、これらの増殖因子のアンタゴニストを使用することにより達成される可能性があるということは論理的である。かように、エイズの治療もまた本発明の応用のひとつであると考慮される。実施例：実施例１：ある強化された生物学的活性もしくはある変化された安定性をもつＩＬ−３を得るための無水酢酸でのＩＬ−３の段階的化学修飾材料および方法：化学修飾：酢酸、ジオキサン、塩酸リジンおよびＭＥＳはシグマ(Sigma)製、修飾剤はフルカ(Fluka)製であった。緩衝液：酢酸／水酸化ナトリウムをpＨ5.0での修飾に使用し、ＭＥＳ／水酸化ナトリウムをpＨ5.5、6.0および6.5での修飾に使用した。pＨ7.0ではリン酸二水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。10倍濃度のストック溶液を調製し、そして直接0.22ミクロンのフィルターを通して濾過した。反応混合物は50mM緩衝液、２mg/mlのhＩＬ−３および３mMの無水酢酸もしくは無水コハク酸を別々に含有した。10倍濃度のストック溶液は実験の日に新規に調製した。hＩＬ−３の修飾は30℃にて一夜実行した。修飾後、ＩＬ−３が分解されていないことをＳＤＳ−電気泳動により決定した。生物学的活性試験：ＭＯ−７細胞はＩ．Ｐ．トウ(I．P．Touw)博士（ロッテルダム・エラスムス大学(Erasmus University of Rotterdam)、オランダ）より恵与された。ＲＰＭＩ培地はギブコ(Gibco)（ペーズリー(Paisley)、ＵＫ）製、補充した仔ウシ血清はハイクローン(Hyclone)（ローガン(Logan)、ユタ州(Utah)、ＵＳＡ）製であった。細胞培養培地は10％仔ウシ血清を含むＲＰＭＩから成った。細胞の正常の組織培養の間に100ng/mlのＩＬ−３もまた添加した。最初に、細胞培養培地中に、10μg/mlから１ng/mlまでに及ぶ連続的な３倍希釈液から成る10倍ストック溶液を調製した。十分に混合した後、ストック溶液の 25μlを225μlの細胞培養培地に添加し、その後37℃にてインキュベーションした。６日目の組織培養系として、最終濃度として２×10⁵個/mlのＭＯ７細胞を使用し、また、10日目の培養系として４ ×10³個/mlのＭＯ７細胞を使用した。組織培養の後、トリチウムラベルしたチミジンの一夜の取り込みを使用して生物学的活性を決定した。最低２個の独立の増殖−反応曲線から、最大限の促進の50％をもたらす濃度の平均（および範囲）の決定をした。修飾された物質の相対活性を、修飾されたＩＬ−３および天然のＩＬ−３それぞれのこれらの50％濃度の比率（[ＩＬ−３_modified]50%／[ＩＬ−３_native ]50％）として決定した。６日目の天然のＩＬ−３についての標準活性は1 .0百万単位/mgタンパク質（ｎ＝10、標準偏差(n-1)＝20％）であった。10日目では0.2百万単位/mgタンパク質（ｎ＝10、標準偏差(n-1)＝30％）であった。結果：分子の基の平均数、特異性および修飾の場所に関するより正確な特徴づけについてのすべての結果は、この特許の記述において後に記述される。生物学的試験の結果は第１表に示される。この表から、pＨ6.5およびpＨ7.0での修飾後の６日目と10日目の間の相対活性に大きな差異があると結論されることができる。従って、これが安定性が大きく低下した物質の創製を立証すると仮定されることができる。pＨ５では生物学的活性の強化があるとみられる。さらなる局面は実施例５および６において論じられる。実施例２：ある強化された活性もしくは安定性をもつ改善されたＩＬ−３の創製のための無水コハク酸でのＩＬ−３の段階的化学修飾化学修飾：酢酸、ジオキサン、塩酸リジンおよびＭＥＳはシグマ製、修飾剤はフルカ製であった。緩衝液：酢酸／水酸化ナトリウムをpＨ5.0での修飾に使用し、ＭＥＳ／水酸化ナトリウムをpＨ5.5、6.0および6.5での修飾に使用した。pＨ7.0ではリン酸二水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液を使用した。10倍濃度のストック溶液を調製し、そして直接0.22ミクロンのフィルターを通して濾過した。反応混合物は50mM緩衝液、２mg/mlのhＩＬ−３および３mMの無水酢酸もしくは無水コハク酸を別々に含有した。10倍濃度のストック溶液は実験の日に新規に調製した。hＩＬ−３の修飾は30℃にて一夜実行した。修飾後、ＩＬ−３が分解されていないことをＳＤＳ−電気泳動により決定した。結果：分子の基の平均数、特異性および修飾の場所に関してより正確な特徴づけについてのすべての結果は、この特許の記述において後に記述される。生物学的試験の結果は（実施例１において実行されるように）第２表に示される。第２表から、pＨ５におけるサクシニル化が活性の大きな強化をもたらし、かつ、pＨ≧６でのサクシニル化が低下した活性をもたらすと結論されることができる。実施例３タンパク質もしくはペプチドのアンタゴニストの創製のための生物学的に活性なペプチドもしくはタンパク質を化学的に修飾するための方法材料および方法：尿素、ＥＤＴＡ、ＭＥＳおよび水酸化ナトリウムはシグマ製、ヨード酢酸ナトリウムはフルカ製であった。緩衝液：ＭＥＳ／水酸化ナトリウムをpＨ6.0での修飾に用いた。10倍濃度のストック溶液を８Ｍ尿素中で調製し、そしてその後0.22ミクロンのフィルターで直接フィルター滅菌した。反応混合物は50mM緩衝液、5.5M尿素および50mMＥＤＴＡを含有した。これらの試薬から、８Ｍ尿素中の10倍濃度のストック溶液を実験の日に新規に調製した。１．hＩＬ−３の穏やかな(moderate)化学修飾：ヨード酢酸を３、10および30mMの濃度で添加した。ＩＬ−３の濃度は２mg/ml であった。修飾は37℃にて24、48および72時間の間実行し、その後非変性電気泳動により検討した。２日後かつ30mMのヨード酢酸では、修飾した材料からのバンドのひどい乱れ（当該分子のひどい変性の表示）なしに最大限の修飾が存在した。この場合には出発材料の２％未満が残された。この場合においてはタンパク質のひどい変性なしに最小限の生物学的活性の期待があったため、この試料をさらなる実験に使用した。その後、ＳＤＳ電気泳動を、修飾後に当該分子の分解がないことが見出されることを立証するのに使用した。２．部分的化学修飾：修飾されたＩＬ−３の阻害能力を至適化するために、部分的修飾もまた実行した。この目的のために、１mg/mlのＩＬ−３を、10、30および100mMのヨード酢酸とともに37℃にて18時間修飾した。非変性電気泳動およびクマシー(Coomasie)染色の後、100mMでの試料が、ゲル中のバンドの過度の乱れなしに最大の修飾を与え、出発材料のおよそ５％がまだ存在した。この試料のみが活性試験において阻害活性を示したため、この試料をさらなる実験に使用した。３．活性および阻害試験：活性試験は実施例１において記述されるように実行した。対照およびアルキル化されたＩＬ−３の双方についての増殖反応曲線（ｎ≧２）を、1000から１ng/m lまでに及ぶ10倍の連続希釈液により作成した。アルキル化されたＩＬ−３の阻害活性は、対照のＩＬ−３と同じ力価測定、しかし今回は３ng/mlのアルキル化されたＩＬ−３の存在下で実行することにより試験した。最大のレセプター結合能力を決定するために、部分的に修飾されたＩＬ−３を、３ng/mlの天然のＩＬ−３の存在下に連続的な７倍希釈液中で滴定した。滴定範囲は15μg/mlから0.1ng/mlであり、また、力価測定は、いかなる飢餓現象も除外するため、4000個/mlのＭＯ７細胞上のみで実行した。結果：第１図において、修飾されたＩＬ−３は係数10〜100で対照のＩＬ−３を阻害することができることが示される。加えて、３ng/mlの修飾されたＩＬ−３は30 〜100ng/mlの対照のＩＬ−３のチミジンの取り込みの80〜90％について抑制することができる。従って、修飾されたＩＬ−３は阻害活性を有するのみでなく、強化されたレセプター結合能力もまた有する。これは、部分的に修飾されたＩＬ− ３の滴定において確認される（第２図）。すなわち、部分的に修飾されたＩＬ− ３はただ0.1ngで３ng/mlの天然のＩＬ−３のほぼ50％阻害のために十分である。実施例４：変化した安定性および／もしくは活性をもつ修飾されたＩＬ−３の創製のためのＩＬ−３の段階的な酵素的エクソプロテアーゼ処理の方法材料および方法：エクソプロテアーゼ処理は、ベーリンガー(Boehringer)製のカテプシンＣおよびカルボキシペプチダーゼＹで実行した。ＩＬ−３の１mg/mlを当該プロテアーゼの存在下に37℃にて18時間インキュベートした。カテプシンＣを1/2ないし1/1 28mg/mlの範囲の連続的な２倍希釈液中に添加した。他の反応条件は製造元により記述されるとおりであった。生物学的活性は実施例１において記述されるように測定した。結果：当該アプローチは第３表における結果につながる。生物学的活性における変化につながらなかった修飾は示されない。この表から、1/40および1/20の濃度でのカルボキシペプチダーゼＹでの処理は、10日目におけるよりも６日目でより低い相対活性をもつ物質をもたらすと結論することができる。従って、これは、天然のＩＬ−３に比較してより高い安定性をもつ物質を指す。当該表からまた、カテプシンＣは６日目で活性を大きく強化するがしかし10日目ではしないとも結論することもできる。従って、これもまたより低下した安定性をもつ物質である。実施例５：プロテアーゼ処理および質量分析法の組み合わせによるペプチドもしくはタンパク質中の修飾の位置推定材料および方法：プロテアーゼ処理：修飾された残基の位置推定のために、修飾された材料を適切な緩衝液に対し透析し、そしてその後グルタミン酸エンドペプチダーゼもしくはリシルエンドペプチダーゼにより、製造元（ベーリンガーマンハイム(Boehrin ger Mannheim)、ドイツ）により記述されるように断片化した。インキュベーションは、37℃、２mg/mlのhＩＬ−３、かつプロテアーゼに対するタンパク質の比が30にて一夜であった。レーザーディソープション質量分析法（ＬＤＭＳ）：前処理：ミリＱ水中の2,5-ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ、Ｍi＝154.12；10g/l）の溶液は各実験の前に新たに作成した。修飾された（もしくは未修飾の）ＩＬ−３溶液およびその分解物の双方を0.1mg/mlに希釈した。これらの希釈した溶液からの 0.5μlをターゲット上で0.5μlのＤＨＢ溶液と混合した。その後、ターゲットを室温にて緩やかな空気の流れ中で風乾した。質量分析法：マトリックス補助(assisted)レーザーディソープション質量分析を、パルス窒素レーザー（337nm、パルス幅３n秒）を装備したフィネガンＭＡＴヴィジョン (Finnegan MAT Vision)200 レーザーディソープション質量分析計上で実行した。試料はイオン化閾値（106〜107W/cm²）のすぐ上で励起した。加速電圧は6.5kV であった。イオンは電子増幅のため変換ダイノードまで−10kVで後加速した。標準の正確さは約0.05％であったが、これは実験条件により0.1〜0.2％にまで低下する可能性がある。結果：ＬＤＭＳのシグナルはより大きな分子量にもかかわらずなお十分であるため、すべての修飾の位置を決定することを可能にした。２個の実施例が示される：１．リシルエンドペプチダーゼ処理およびＬＤＭＳによる無水コハク酸（pＨ5.0 ）での修飾の位置推定： pＨ5.0での無水コハク酸修飾およびそれに続くリシルエンドペプチダーゼ分解で、１個のピークが1085dから1185dまでシフトし、1108d（1085+Na+からの23）のピークもまた1208dにシフトした。プロテアーゼの特異性およびアミノ酸配列に基づけば、この1085dのピークはAla¹−Lys¹⁰にのみ対応することができる。Ly s¹⁰の修飾はこのアミノ酸での切断を障害するとみられるため、いかなるAla¹−L ys¹⁰断片も全く存在しないとみられる。従って、修飾されたアミン残基はアミノ末端のAla¹である。２．その後にＬＤＭＳを行うグルタミン酸エンドペプチダーゼ処理およびその後にＬＤＭＳを行うリシルエンドペプチダーゼ処理の双方による無水酢酸でのLys² ⁸ の修飾の検出： pＨ７での無水酢酸修飾およびそれに続くグルタミン酸エンドペプチダーゼ分解で、1598dのピークが1640dにシフトした。このシフトは１個のアセチル基の質量にちょうど対応する。この場合もまたアミノ酸配列がIle²³−Asp³⁶への位置推定を可能にした。Lys²⁸はこの断片中の唯一のアミン残基であるため、これが修飾された残基であると推論することができる。これは、5815dの断片が現れたリシルエンドペプチダーゼ分解により確認された。この断片は、Lys²⁸が修飾される残基である場合にのみ説明することができ、かようにその残基の後ろの切断を障害する。他の修飾を同様の方法で分析し、表４をもたらす。当該表は双方の修飾がタンパク質上の同じターゲット残基を有することを示す。唯一の例外は、無水酢酸がpＨ≧5.5でわずかにより高い修飾の程度を有することであり、また、pＨ７では、Lys¹⁰は、無水コハク酸で修飾された材料のLys¹⁰と対照的に、部分的に修飾された。第４表はまた、Lys¹¹⁶がpＨ＝７では少なくとも部分的に保護されることを示す。そのpＨではリン酸緩衝液が使用されたため、リン酸基がその場所に結合しており、かつ、それによってLys¹¹⁶を修飾に対し遮蔽するという可能性が現れる。この仮説を試験するため、hＩＬ−３をＭＥＳおよびリン酸塩から成る50mMの緩衝作用のある物質において修飾した。無水酢酸（別々に１、２および３mM）を、双方の緩衝液の緩衝作用の範囲内に十分にあるpＨ6.8での修飾のために使用した。10mMもしくはそれ以上のリン酸塩の存在下では、１個の残基すなわちLys¹¹⁶ の保護が存在した。１mMより低いリン酸塩濃度ではこの保護は存在しなかった。 10mMは生理学的なリン酸塩濃度であるため、現行の位置推定法は生物学的に意義のあるリン酸結合の立証および位置推定を可能にするものと仮定することができる。従って、あるアンタゴニストもしくは細胞増殖阻害剤が、このリン酸結合のゆがみにより創製することができることは十分に考えられる。従って、これもまた本発明の範囲内と考慮されることになる。残基Lys²⁸およびLys⁶⁶もまたリン酸塩によるわずかな保護を有したこともまた言明することができる。これは三次元構造における近接を示唆する。かように、この方法においてはそれは構造に関する情報さえも提供することができる。最後に、当該段階的化学修飾が、ある特異性が達成することができるような最小限の程度で実行することができることもまた言明されうる。その特異性はいくつかのタイプの残基に限定されず、アミン残基のみに限定されないが、しかし、完全な分子の１個のアミン残基、すなわちAl a¹にさえ限定される。従って、この特異性もまた請求に包含される。実施例６：段階的化学修飾、プロテアーゼ処理およびレーザーディソープション質量分析法を使用する定量的構造−機能分析研究材料および方法：ＱＳＲＳ（定量的構造−機能分析研究）戦略：この実施例はhＩＬ−３上のリシンの修飾で立証された。当該戦略は５段階から成り、その最初の段階は当該タンパク質の段階的化学修飾に関係する。三次元構造における様々な残基の微小環境は知られていないにもかかわらず、差異はアミノ酸配列のみに基づき予期することができる。より大きな差異さえ三次元構造において予期することができる。われわれはhＩＬ−３上のアシル化反応（段階１）を検討した。これらの反応は荷電していないリシン残基上でのみ起こり、修飾反応のpＨの段階的な増大により段階的な修飾を可能にする。第二段階は修飾反応のモニタリングである。至適条件が達成されうるような十分な数の起こり得る条件を研究するために、穏やかでかつ感受性の方法が必要とされる。この方法は非変性電気泳動である（エレクトロフォレシス(Electrophor esis)、15: 251(1994)）。しかしながら、電子スプレー質量分析法も適切な代替を形成する。これは第３図：pＨ５〜７でスクシニル化されたＩＬ−３の電子スプレー質量分析法、において立証される。とりわけ双方の組み合わせがアミン残基上の完全な特異性の立証を可能にする。第三段階は全体の構造の完全状態の確認である。円二色性スペクトル法をこの目的のために使用することができる（エレクトロフォレシス(E lectrophoresis)、15: 251(1994)）。この方法により小さな差異は認識できないにもかかわらず、変性のような本質的な構造変化が明確に検出される。第四段階は修飾された残基の特徴づけおよび位置推定であり、そのために以下の技術が使用された。すなわち、特異的プロテアーゼでの非変性分解、電気泳動、電子スプレー質量分析法、およびＬＤＭＳである。反応特異性は非変性電気泳動および電子スプレー質量分析法の組み合わせにより決定された。位置推定は、先の実施例において記述されるように、エンドプロテアーゼ類およびＬＤＭＳで実行した。第五のそして最終の段階は当該タンパク質の多様な修飾された形態の生物学的活性の試験である。この活性測定の後、位置推定された様々な残基の現実の関与を推論することができる。結果化学修飾、構造確認および反応のモニタリング： hＩＬ−３の化学修飾およびそのモニタリングは先に記述されるように無水コハク酸もしくは無水酢酸を用いて実行した。それに続いて、円二色性により、７より高いpＨでの無水コハク酸修飾は全体的な構造変化（変性）をもたらすことが見出された。従って、pＨ７もしくはそれより低いpＨでの修飾のみがさらなる検討に対して使用された。修飾の特徴づけおよび位置推定：先の実施例を参照。当該タンパク質の多様な修飾された形態の活性試験および生物学的に重要な残基の位置推定：生物学的活性のための試験の方法および結果の双方は実施例１および２において記述される。これらの結果および修飾された残基の位置推定の結果（第１表および第２表ならびに先の実施例）を組み合わせたものは、いくつかの残基の関与についての言明を可能にする。この結果、重要な変化はpＨ５での未修飾体から修飾体へであり、これは活性における強化を伴う。他の重要な変化はp Ｈ６からpＨ6.5へ（活性−係数２で減少）および6.5から７へ（係数２での活性増大）である。 pＨ５での無水コハク酸修飾は、１個の基すなわちアミノ末端（Ala¹）のみの修飾を伴うため、この基が何らかの制限もしくは調節作用を有するものと結論付けることができる。活性における増大もまた欠失変異体での構造−機能研究において見出されている（ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(J．Bi ol．Chem.)、266: 21310(1991)、プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)、89: 11842( 1992)）が、しかし、決してひとり最初の残基に指定されなかった。 pＨ６とpＨ6.5の間の差異にはより複雑なパターンが存在する。すなわち、無水酢酸については、係数２〜４の活性における減少は、Lys²⁸での基の45％から7 0％、Lys⁶⁶については基の20％から50％、また、Lys¹⁰⁰については基の40％から 65％への修飾を伴った。最終的に、Lys¹¹⁶上では基の40％から80％への修飾が起きた。これは未修飾基の60％から20％への減少、すなわち係数３の差異である。この差異は活性の低下とまさしく相関するため、Lys¹¹⁶は生物学的活性についての最良の候補である。これはpＨ７での係数３で低下した修飾（pＨ6.5との比較において）により確認され、これは活性における係数３の増大を伴う。従って、Lys¹¹⁶は生物学的活性について重要である。これは無水コハク酸での修飾によりすべて確認された。この場合は、pＨ７で修飾された材料についてはpＨ6.5で修飾された材料に比較し、修飾における低下はなかった。この現象に付随するどちらの活性の強化もなかった。かように、残基Lys¹¹⁶およびアミノ末端が生物学的に意義があることが立証されており、一方でアミノ末端が阻害性もしくは調節する影響を有するとみられるが、Lys¹¹⁶は生物学的活性に重要であるとみられる。加えて、Lys¹¹⁶はまたリン酸塩によっても保護され、これはその残基によるリン酸結合を示唆する。この基はまたインターロイキンの生物学的活性に重要であるため、このことはリン酸結合がＩＬ−３の作用の様態に重要であることを示唆し、また、この過程がＩＬ− ３にとって重要なものである場合は他のペプチド類およびタンパク質類にとってもまた重要である可能性がある。要約すると、この方法は生物学的に重要な残基の位置推定を可能にし、また、立証されるリン酸結合もまた、ことによると重要な生理学的過程の確立および位置推定を可能にしている。従って、本発明はまた、あるタンパク質もしくはペプチドのリン酸結合の操作により、新規の、好ましくは拮抗的活性を導入するための当該タンパク質もしくはペプチドの修飾も具現化する。実施例７：抗体の低下したレベルが効果的なインビボでの細胞性抵抗につながる。材料および方法：当該試験系は４週齢のヒトキメラ「Ｘ連結免疫不全」マウスから成り、このキメラは全身照射（ＴＢＩ）によるコンディショニングおよび体重１グラムあたり４百万個のヒト末梢血リンパ球の移植で導入した。ＣＢＡ／ＮマウスのＴＢＩは９Gyのガンマ線であった。これらのマウスもまた、静脈内の0.5百万の自己骨髄細胞の形態で血液支持処理を受けた。匹敵する照射、ヒト血液の処理および移植はヨーロピアンジャーナルオブイムノロジー(Eur ．J．Immunol.)、22: 197(1992)に記述される。当該マウスに毎日10,000I.U.のヒトインターロイキン−２（ユーロシータス(Eur ocetus)、アムステルフェン(Amstelveen)、ベネルクス）を復腔内に注入した。感染は、「感染中心試験」すなわちＩＣＴにおいてなお感染性である、最低限用量の10倍の用量で、ヒト細胞の移植の１時間後に復腔内に行った。条件を整えた(conditioned)ＣＢＡ／Ｎマウスに、抗ＨＩＶ−１ GP13（ＣＤ４結合部位に対する）モノクローナル抗体もしくはＶ₃ループに向けられる抗ＨＴＬＶ_IIIB F58H3モノクローナル抗体250μgを復腔内に前投与した。ＩＣＴはＣＢ１５細胞で２回(in duplo)実行した（プロシーディングスオブナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ(Proc．Natl．Acad．Sci ．USA)、89: 3116(1992)）。一孔あたり1000個の細胞を植え、そして５〜７日後にＨＩＶ p24タンパク質（オルガノンテクニカ(Organon Technica)、オス(Os s)、オランダ）についてＥＬＩＳＡ法を実行した。動物を殺すの(sacrifice)は、常に、このように抗体の産生が開始される(eloping)、移植後２週間以内であった（未発表データ）。マウスを殺す日に、細胞を腹膜腔からヘパリン（オルガノンテクニカ、オス、オランダ）を含有する培地で洗い流した。これらの細胞上でＩＣＴをＣＢ１５細胞および培養培地１mlあたり100I.U.のヒトインターロイキン−２の存在下で実行した。滴定は、連続する５倍希釈液中で2.5百万から０までの滴定範囲で２回実行した。５〜７日後、ＥＬＩＳＡ試験を培養培地の上清中のＨＩＶ p24タンパク質に対し実行した。ＣＤ４⁺細胞の存在の対照として、ＦＡＣＳcan分析を、ヨーロピアンジャーナルオブイムノロジー(Eur．J．Immunol.)、22: 197(1992) において記述されるように実行した。結果：当該結果は第５表に示される：当該表はＨＴＬＶ_IIIBがこれらの環境下で最初の５日間残存することを示す。しかしながら、移植の８日後にはヒトＣＤ４⁺細胞の豊富な存在下においてさえ排除されてきているようにみられる。これは、移植されたヒトＴ細胞がウイルスを排除したことを指す。しかしながら、特異的抗ＨＩＶ−１抗体のいずれかがキメラマウスに投与される場合は、当該ウイルスは持続するのであり（第５表）、ＨＩＶ感染の存続が抗体により引き起こされることを立証する。これから、ＨＩＶに感染したヒトにおける抗体レベルの低下は、Ｔ細胞が当該ウイルスを排除することを可能にすることができ、これにより感染の治癒を提供すると推論することができる。これらの抗体レベルはＢ細胞の抑制により低下されうる。従って、このＢ細胞の抑制は、増殖因子のアンタゴニストに対する応用のひとつの興味深い分野である。別個にもまた使用されることができる、ＨＩＶ感染の抑制のための他の可能性もまた存在する。すなわち、１．抗体レベルの低下をもたらすプラスマフェレーシス。通常の臨床診療は血漿の完全な置換である。例えば重症筋無力症に対するひとつの実験的治療は血漿のいわゆる選択的回復である。この場合には、患者の血漿は患者に戻す前に有害な抗体を除いて精製される。このインビトロでの選択はまた、ＨＩＶ反応性の、なるべくならＨＩＶエンベロープ反応性の抗体に対し使用することができる。２．Ｂ細胞の数を低下するための白血球搬出法。ＨＩＶ反応性であるＢ細胞を除去するために好まれる。白血球はＨＩＶ感染者から完全に除去することができる。白血球搬出のこの形態は他の疾患に対するルーチンの臨床診療である。ＨＩＶ感染者に対しては、しかしながら、記述されたことはない。あるいは、Ｂ細胞を含まない白血球の選択的な返還は非常に容易に行うことができる。選択はまた、Ｔ細胞もしくはそれの亜集団の陽性選択からも成る。３．抗体のインビボでの枯渇。本発明はまた、選択的と同様非選択的な免疫複合体の形成によるインビボでの枯渇も包含する。非選択的除去は好ましくは抗体特異的抗体によりなされる。選択的除去は好ましくはウイルス、不活性化されたウイルス、ウイルスサブユニットおよび／またはウイルス様のもしくは同一のタンパク質もしくはペプチドによりなされる。これらの物質は好ましくは身体からの除去を促進する物質に結合される。４．Ｂ細胞のインビボでの枯渇。このインビボでの枯渇はＢ細胞特異的抗体、なるべくならＢ細胞アポトーシス誘発抗体での非選択的除去を通して実行されることができる。これはまた、好ましくはＣＤ１９／ＣＤ３反応性の複合体の複特異的抗体でも実行されることができる。これはＢ細胞腫瘍の患者に対してのユトレヒトアカデミック病院（ユトレヒト、オランダ）における第Ｉ相臨床試験においてすでに使用されている。この治療はＢ細胞の数の非常に重要な枯渇をもたらす（私信：Ｆ．Ａ．ファン・ホーテン(F．A．van Houten)、ユトレヒトアカデミック病院、オランダ）。Ｂ細胞の選択的除去は好ましくはウイルス、不活性化されたウイルス、ウイルスウイルスサブユニットおよび／またはウイルス様のもしくは同一のタンパク質もしくはペプチドにより、あるいは抗体によりなされる。好ましくは、これらの物質はＢ細胞の枯渇を促進する物質に結合される。５．抗体のインビボでの産生を抑制する他の方法。１例はトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の使用である。ＨＩＶおよび他のウイルスは宿主ゲノム中にプロウイルスとして組み込まれる。従って長期間、潜在状態全体においてこれらの細胞内に存在することができる。従って、この発明において、こうしたプロウイルスを、好ましくは宿主へのＩＬ−２の投与により活性化することが好まれる。ＨＩＶは組織球細胞内において存続し、また、これらは宿主免疫系による認識を逃れるとみられるウイルスの低濃度をもたらすことができる。従って、少なくともこれらの細胞の寿命の間は治療を延期することが好まれる。加えて、受動免疫療法を、好ましくはＨＩＶに非感染である患者の免疫グロブリンで同時に実行することが好ましい。従って、この受動免疫療法は本発明の範囲内に考慮されることになる。この発明はＨＩＶのようなレトロウイルスの限られた知識に基づいた様式において記述されるにもかかわらず、いくつかの修飾は本発明の範囲から逸脱することなくなされることができることが明らかである。

【手続補正書】【提出日】１９９７年３月７日【補正内容】［請求の範囲］『１．強化された生物学的活性、強化された安定性、抑制された抗原性、獲得された拮抗的もしくは細胞阻害的な活性、の性質のひとつもしくはそれ以上の導入のための、インターロイキン類、造血増殖因子類、ペプチドホルモン類もしくはタンパク質ホルモン類、シグナルペプチド類もしくはシグナルタンパク質類のようなヒトレセプター類から選択される生物学的に活性のタンパク質類もしくはペプチド類の定量的構造−機能分析調査方法であって、ａ）当該タンパク質もしくは当該ペプチドの段階的化学修飾、その後、ｂ）非変性電気泳動および／もしくは電子スプレー質量分析法のような穏やかでかつ感度のよい方法での修飾反応のモニタリングであり、かつ、前述のモニタリングが場合によっては、例えば円二色性スペクトル測定法の使用により全体的な構造の完全性を確認することをさらに含むものであり、ｃ）プロテアーゼ処理、ｄ）質量分析法、およびｅ）修飾された生成物の生物学的活性のアッセイ、および場合によっては修飾された生成物の安定性のアッセイであって、前述のタンパク質類もしくはペプチド類が好ましくはインターロイキン１〜８、インターロイキン１０、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、インスリン、プロラクチンおよびγＩＦＮ（インターフェロン）、より好ましくはサイトカインスーパーファミリーから選択されるＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチンもしくはインターロイキン２〜７から選択されるあるインターロイキンから選択されるもの、を使用する、選択されたアミノ酸の特異的化学修飾を応用する工程を含んでなる方法。２．特異的プロテアーゼでの特異的分解および質量分析法が修飾されたアミノ酸の特徴づけおよび位置決定のために実施される請求の範囲１に記載の方法。３．特異的エンドプロテアーゼでの特異的分解およびＬＤＭＳが修飾されたアミノ酸の特徴づけおよび位置決定のために実施され、前記エンドプロテアーゼが、例えばグルタミン酸エンドペプチダーゼもしくはリシルエンドペプチダーゼである請求の範囲１もしくは２に記載の方法。４．修飾が特異的エクソプロテアーゼでの特異的分解により実施され、かつ、電子スプレー質量分析法が修飾されたアミノ酸の特徴づけおよび位置決定のために実施され、適当であるのは当該エクソプロテアーゼがＮ末端エクソプロテアーゼ、例えばカテプシンＣもしくはＣ末端エクソプロテアーゼ、例えばカルボキシペプチダーゼＹである請求の範囲１〜３のいずれかに記載の方法。５．修飾が化学修飾であり、前記修飾がアルキル化であり、そして／または前記修飾が、例えばヨード酢酸によるアセチル化もしくは無水コハク酸によるスクシニル化のようなアシル化であり、前記修飾が、適当であるのは、徐々に変化する条件下での修飾であって、ここで、好ましくは0.5pＨ単位の段階における5.0と7 .0の間のpＨ、および／もしくは時間もしくは試薬濃度が変化する条件のひとつもしくはそれ以上で変化する請求の範囲１〜３のいずれかに記載の方法。６．修飾が好ましくは無水酢酸と組み合わせてリン酸緩衝液の存在下に実施される請求の範囲５に記載の方法。７．拮抗的および／もしくは細胞阻害的な活性の導入のための先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載であって、修飾が触媒活性に関係するひとつもしくはそれ以上の残基に特異性を有する、例えばその中の修飾が部分的もしくは完全な触媒中心の内部もしくは近傍にあり、前記修飾が好ましくは触媒活性を変化し、適当であるのは、前記残基があるヒスチジン残基である方法。８．修飾が金属結合中心、好ましくは亜鉛結合中心の内部もしくは極めて近傍にあり、適当であるのは、記載残基がヒスチジン残基である先行する請求の範囲のいずれかに記載の方法。９．修飾が基質を可逆的に変性し、かつ、例えば尿素およびＥＤＴＡの存在下に金属イオンを除去するためのキレート剤を添加することにより実施され、前記尿素が好ましくは５Mより大きな濃度を有しかつ前記ＥＤＴＡが好ましくは50mMの濃度を有する先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載の方法。１０．修飾がひとつのタイプのアミノ酸、例えばあるアミン残基に特異的であり、そして／もしくは当該ペプチドもしくはタンパク質中の１個のアミン残基にのみ特異的でさえあって、前記１個のアミンが例えばＮ末端にある先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載の方法。１１．基質がヒトインターロイキン−３であり、好ましくはAla¹、His²⁶、Lys²⁸ 、Lys⁶⁶、His⁹⁵、His⁹⁸、Lys¹⁰⁰もしくはLys¹¹⁶の残基のひとつもしくはそれ以上においてのみ修飾されているヒトインターロイキン３を提供する先行する請求の範囲のいずれかに記載の方法。１２．拮抗的および／もしくは細胞阻害的な活性の導入のための先行する請求の範囲のいずれかに記載の方法であって、リン酸結合の崩壊する工程を含んでなる方法。１３．修飾されたあるシグナル物質、好ましくは強化された生物学的活性、拮抗活性および／もしくは細胞阻害活性のあるタンパク質ホルモン、ペプチドホルモン、増殖因子、造血増殖因子、インターフェロン、インターロイキンおよび／もしくはコロニー刺激因子であって、修飾が好ましくは当該触媒活性が変えられるように部分的もしくは完全な触媒中心の内部もしくは近傍にあり、前記修飾がさらに好ましくは金属結合中心の内部もしくは近傍にある物質。１４．好ましくは成長ホルモン、プロラクチンおよびインスリンから選択され、ＩＬ−３レセプターと同じ（サイトカイン）スーパーファミリー、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＩＦＮγから選択され、より好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、成長ホルモン、プロラクチンおよびインスリンから選択され、前記修飾された物質が強化された生物学的活性、拮抗活性および／もしくは細胞阻害活性を有するものであり、そして前記修飾が、金属結合性の性質が変えられるように、好ましくは亜鉛結合中心の内部もしくは近傍にある、亜鉛結合性シグナルペプチドである修飾されたシグナル物質。１５．前記金属のイオンが触媒中心の内部もしくは近傍にあり、好ましくは前記金属のイオンが未修飾物質において触媒機能を有する請求の範囲１４に記載の物質。１６．先行する物質の請求の範囲１３〜１５のひとつもしくはそれ以上に記載されたような物質であって、アンタゴニストを産生するための修飾が化学修飾、好ましくはアルキル化もしくはアシル化または欠失変異体および／もしくは置換変異体のような分子生物学的修飾であり、最も好ましくは前記修飾がアルキル化である物質。１７．先行する物質の請求の範囲１３〜１６のひとつもしくはそれ以上に記載されたような物質であって、修飾が金属イオンの結合に関係するアミノ酸、好ましくはヒスチジン残基に存在する物質。１８．先行する物質の請求の範囲１３〜１７のひとつもしくはそれ以上に記載されたような物質であって、レセプターに対する当該シグナル物質の親和性が係数 10を超えて減少しておらず、好ましくは同じに保持しているかまたは好ましくは増大している物質。１９．有意な阻害のために必要とされる物質の濃度が臨床応用に適している、すなわち天然の物質の濃度より100倍の高さを超えず、前記物質が場合によっては増大したレセプター結合能をさらに有する先行する物質の請求の範囲１３〜１８のいずれかに記載の物質。２０．インターロイキン３、好ましくはヒトインターロイキン３であって、最も好ましくはAla¹、His²⁶、Lys²⁸、Lys⁶⁶、His⁹⁵、His⁹⁸、Lys¹⁰⁰もしくはLys¹¹⁶ の残基のひとつもしくはそれ以上のみで修飾されている先行する物質の請求の範囲１３〜１９のいずれかに記載の物質。２１．当該物質、修飾されたＩＬ−３の0.1ngが３ng/mlの天然のＩＬ−３のほぼ 50％を阻害し、当該物質、修飾されたＩＬ−３の３ng/mlが30〜100ng/mlの対照のＩＬ−３のチミジンの取り込みの80〜90％を抑制し、当該物質、修飾されたＩＬ−３が係数10〜100で対照のＩＬ−３を阻害する、特徴の少なくとも１つを有する請求の範囲２０に記載の物質。２２．低下した安定性および増大した拮抗活性、例えばアセチル化したＩＬ−３、低下した安定性および増大した作動活性、例えばＮ末端をプロテアーゼ処理したＩＬ−３、例えばカテプシンＣで処理したＩＬ−３、増大した安定性および拮抗活性、例えばスクシニル化したＩＬ−３、作動活性と組み合わさった増大した安定性、例えばＣ末端をプロテアーゼ処理したＩＬ−３、例えばカルボキシペプチダーゼＹで処理したＩＬ−３、の特徴の組み合わせの１つを獲得している先行する物質の請求の範囲１３〜２１のひとつもしくはそれ以上に記載されたような物質。２３．場合によっては他のシグナルタンパク質類およびシグナルペプチド類と組み合わさった、先行する物質の請求の範囲１３〜２２のひとつもしくはそれ以上に記載の修飾された物質（混合した形態においておよび化学的に結合した形態においての双方）を含有する、臨床応用のための調製物。２４．請求の範囲１〜１２のいずれかに記載された方法の段階を実施することを含んでなる請求の範囲１３〜２２のいずれかに記載の物質の調製方法。２５．ＨＩＶ感染症の阻害、抑制および／もしくは治癒方法であって、抗体レベルが、Ｂ細胞による抗体産生の抑制、Ｂ細胞の創製および／もしくは成熟の抑制、好ましくは前記Ｂ細胞が抗ＨＩＶ抗体産生Ｂ細胞、好ましくは抗ＨＩＶコート抗体産生Ｂ細胞であり、プラスマフェレーシス、部分的もしくは完全な血漿回復もしくは血清の選択的返還、抗体、好ましくはＨＩＶ反応性抗体、好ましくはＨＩＶエンベロープ反応性抗体のインビトロでの除去、好ましくは抗体、好ましくはＨＩＶに対する抗体、好ましくはＨＩＶエンベロープに対する抗体、でのインビボでの枯渇、白血球搬出法、のいずれかにより低下されている方法。２６．請求の範囲１９に記載されたような調製物の適用および／もしくは方法の請求の範囲１〜１２のいずれかに記載された方法により得ることができる物質の適用を含んでなる請求の範囲２５に記載の方法。２７．好ましくはＣＤ１９／ＣＤ３および／もしくはＣＤ２０／ＣＤ３の複合体に対して向けられる二特異性抗体の適用を含んでなる請求の範囲２５もしくは２６に従った方法。２８．Ｂ細胞アポトーシス誘導物質の適用、好ましくはＡＰＯ−１の適用および／もしくはＢ細胞の抗体産生の阻害剤としてのＴＧＦ−βの適用を含んでなる先行する方法の請求の範囲２５〜２７のいずれかに記載の方法。２９．請求の範囲１９に記載された調製物および／もしくは請求の範囲１〜１２のいずれかに記載の方法の段階のいずれかに従って得ることができる物質の適用を含んでなる幹細胞複製の促進のための方法。３０．請求の範囲１３〜２２に記載の物質をコードする核酸構築物を治療されるべき患者への適用する工程を含んでなり、前記治療が、例えばＨＩＶ感染症に向けられる遺伝子治療法。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＤＹＦＣ０７Ｋ 14/52 37/24 ＡＢＡＣ１２Ｎ 15/09 37/36 Ｇ０１Ｎ 33/566 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．好ましくは以下の特徴、すなわち強化された生物学的活性、強化された安定性、抑制された抗原性、獲得された拮抗的活性もしくは細胞阻害活性のひとつもしくはそれ以上の導入のためのヒトインターロイキン−３の化学修飾方法。２．前記修飾が好ましくは段階的に変動する条件下での段階的化学修飾であり、その修飾の中で以下の条件、すなわち好ましくは0.5pＨ単位の段階における5.0 と7.0の間のpＨおよび／もしくは時間もしくは試薬濃度のひとつもしくはそれ以上が変動する請求の範囲１の方法。３．基質がヒトＩＬ−３ではないが、しかし、好ましくは、他のインターロイキン類、造血増殖因子類、ペプチドホルモン類もしくはタンパク質ホルモン類、シグナルペプチド類もしくはシグナルタンパク質類、生物学的に活性のタンパク質類もしくはペプチド類であるヒトのタンパク質もしくはペプチドのひとつもしくはそれ以上である先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上の方法。４．抗原性が、当該タンパク質もしくはペプチド中の抗原応答を誘導するアミノ酸の起こり得る相互作用を遮蔽することにより低下される先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上の方法。５．安定性が、好ましくはプロテアーゼのための結合場所を形成するアミノ酸の起こり得る相互作用の遮蔽のために変えられる先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上の方法。６．ペプチドもしくはタンパク質のレセプター結合が、このレセプター結合を低減させる残基の遮蔽により強化される先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上の方法。７．ペプチドもしくはタンパク質のレセプター結合が、新規の化学的相互作用、好ましくは１個の荷電、好ましくは１個のマイナスの荷電の導入により強化される先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上の方法。８．修飾が数個のタイプのアミノ酸、ひとつのタイプのアミノ酸例えばアミン残基、および／もしくは当該ペプチドもしくはタンパク質中の１個のアミン残基、例えばＮ末端に対してさえ特異的である先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上の方法。９．修飾が触媒活性に関与するひとつもしくはそれ以上の残基、好ましくはヒスチジン残基に特異性を有する先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上の方法。１０．修飾が、拮抗的および／もしくは細胞阻害的な活性の導入のために、触媒活性に関与するひとつもしくはそれ以上の残基、好ましくはヒスチジン残基に特異性を有する先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上の方法。１１．リン酸塩結合の破壊による拮抗的および／もしくは細胞阻害的な活性の導入のためのタンパク質類およびペプチド類の化学的もしくは非化学的修飾のための方法。１２．段階的化学修飾および可逆的な試薬を使用する、あるペプチドもしくはタンパク質上の選択されたアミノ酸の特異的化学修飾のための方法。１３．荷電における変化を決定するための非変性電気泳動、プロテアーゼ処理および質量分析法、好ましくはレーザーディソープション質量分析法による化学的に修飾されたアミノ酸の位置を推定するための方法。１４．好ましくは段階的様式における化学修飾、非変性電気泳動、活性試験および先の請求の範囲において記述されるような修飾された残基の位置推定による、あるタンパク質もしくはペプチド上の生物学的に重要な残基の位置を推定するための方法。１５．修飾が、あるタンパク質もしくはペプチド上の生物学的活性に関与する残基の位置を推定するための先に記述される方法を使用することによる非常に特異的なある様式において実行されうる先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において記述されるような生物学的に活性のタンパク質類もしくはペプチド類の段階的化学修飾の方法。１６．Ala¹、His²⁶、Lys²⁸、Lys⁶⁶、His⁹⁵、His⁹⁸、Lys¹⁰⁰もしくはLys¹¹⁶の残基のうちひとつもしくはそれ以上においてのみ修飾されているヒトインターロイキン−３。１７．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に従って調製される修飾された１個のペプチドもしくはタンパク質（混合した形態においておよび化学的に結合した形態においての双方）を含有する調製物。１８．前記修飾が部分的もしくは完全な触媒中心内もしくはその近接にある、修飾されたシグナル物質、好ましくはタンパク質ホルモン、ペプチドホルモン、増殖因子、造血増殖因子、インターフェロン、インターロイキンおよび／もしくはコロニー刺激因子。１９．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、触媒活性が変更される物質。２０．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、修飾が１個の金属結合中心、好ましくは１個の亜鉛結合中心の内部もしくはその近接にある物質。２１．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、金属イオンが触媒中心内部もしくはその近接にある物質。２２．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、金属イオンが未修飾の物質において触媒機能を有する物質。２３．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、金属結合の性質が変えられた物質。２４．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、シグナル物質のレセプターに対する親和性が係数10を超えては変えられておらず、同じままであるかもしくは増大されてさえいる物質。２５．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、強化された生物学的活性、拮抗的活性および／もしくは細胞阻害活性が得られた物質。２６．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、修飾が１個のアミノ酸の修飾である物質であって、この修飾が化学修飾、好ましくはアルキル化および／もしくはアシル化または欠失変異体および／もしくは置換変異体のような分子生物学的修飾である物質。２７．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、修飾されたアミノ酸が１個の金属イオンの結合好ましくは１個のヒスチジン残基に関与する物質。２８．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、シグナルペプチドが亜鉛結合性のシグナルペプチド、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、成長ホルモン、プロラクチンおよび／もしくはインスリンのひとつもしくはそれ以上である物質。２９．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、シグナルペプチドがＩＬ−３レセプターのような同じ（サイトカイン）スーパーファミリーからのレセプターをもつ増殖因子、好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦおよび／もしくはエリスロポエチンである物質。３０．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、当該物質が安定性における変化、好ましくは強化された安定性を獲得した物質。３１．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような物質であって、当該物質が低下した安定性を、好ましくはある拮抗的活性と組み合わせて獲得した物質。３２．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるようなタンパク質類および／もしくはペプチド類に対する遺伝子コードを含有するＤＮＡ構築物類。３３．ひとつもしくはそれ以上の物質を含有するいずれかの調製物であって（混合した形態においておよび化学的に結合した形態においての双方）、先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されているか、または先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に従って調製される、調製物。３４．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるようないずれかの調製物の使用。３５．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるようないずれかの調製物の、好ましくはこの特許の記述における出願の分野において記述されるようなひとつもしくはそれ以上の用途のための使用。３６．Ｂ細胞による抗体産生の抑制および／またはＢ細胞の創製および／もしくは成熟の抑制、好ましくは先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記載されるような調製物による、ＨＩＶ感染の阻害、抑制および／もしくは治癒。３７．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、抗体のレベルが、好ましくはプラスマフェレーシス、部分的もしくは完全な血漿の回復または血清の選択的返還により低下された方法および／もしくは生成物。３８．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、選択がインビトロで、好ましくは抗体、好ましくはＨＩＶ反応性の抗体、好ましくはＨＩＶエンベロープ反応性の抗体、の除去により実行される方法および／もしくは生成物。３９．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、白血球搬出が実行される方法および／もしくは生成物。４０．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、Ｂ細胞、好ましくは抗ＨＩＶ抗体産生Ｂ細胞、好ましくは抗ＨＩＶコート抗体産生Ｂ細胞の数を低下させることが達成される方法および／もしくは生成物。４１．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、インビボでの枯渇が、好ましくは抗体、好ましくはＨＩＶに対する抗体、好ましくはＨＩＶエンベロープに対する抗体に含められる(included with)方法および／もしくは生成物。４３．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、抗体のインビボでの枯渇が例えば他の抗体により達成される方法および／もしくは生成物。４４．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、好ましくは複合体ＣＤ１９／ＣＤ３および／もしくはＣＤ２０／ＣＤ３に対し向けられる複特異性抗体の使用が存在する方法および／もしくは生成物。４５．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において記述されるような方法および／もしくは生成物であって、Ｂ細胞アポトーシス誘発物質類、好ましくはＡＰＯ−１の使用が存在する方法および／もしくは生成物。４６．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、好ましくはＴＧＦ−βによるＢ細胞の抗体産生の他の阻害の使用が存在する方法および／もしくは生成物。４７．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、ＨＩＶ感染患者のプロウイルスの活性化が、好ましくは増殖因子、好ましくはサイトカイン類、好ましくはＩＬ−２の投与により、実行される方法および／もしくは生成物。４８．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、好ましくはＨＩＶに非感染の患者の免疫グロブリンでの受動免疫療法が含まれる方法および／もしくは生成物。４９．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において、またはそれらのひとつもしくはそれ以上を組み合わせて記述されるような方法および／もしくは生成物であって、先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に記述されるような効果および／もしくは結果および／もしくは応用のひとつもしくはそれ以上を得るための金属イオン、好ましくは亜鉛イオン、の使用が存在する方法および／もしくは生成物。５０．先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上において記述されるようなひとつもしくはそれ以上の方法を含有するいずれかの治療。５１．幹細胞の複製の促進を包含する、先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に従ったいずれかの調製物の使用。５２．他のシグナルタンパク質類およびシグナルペプチド類と組み合わせての、先行する請求の範囲のひとつもしくはそれ以上に従ったいずれかの調製物の使用。５３．相乗効果をもたらすかもしくはもたらさないかのいずれかの、先行する請求の範囲の２つもしくはそれ以上のいかなる考え得る組み合わせ。