JPH10503649A

JPH10503649A - ポリヌクレオチド・ヘルペスウイルス・ワクチン

Info

Publication number: JPH10503649A
Application number: JP8505831A
Authority: JP
Inventors: アームストロング，マーシー・イー; キース，ロバート・デイ; ルイス，ジヨン・エイ; リウ，マーガレツト・エイ; マクレメンツ，ウイリアム・エル
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1994-07-22
Filing date: 1995-07-18
Publication date: 1998-04-07
Also published as: ZA956106B; CA2195099A1; HRP950412A2; WO1996003510A1; CO4410257A1; YU49995A; AU3101295A; IL114576A0; EP0772680A1; AU708460B2

Abstract

(57)【要約】コード化された蛋白質を生体内において哺乳動物筋肉細胞中で発現させるため、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）蛋白質をコードする遺伝子を真核性発現ベクターにクローン化した。ポリヌクレオチドワクチン又はＰＮＶと呼ばれるこれらのＤＮＡ構築物を動物の筋肉中に注射することにより、それらの動物を免疫した。ＤＮＡ力価測定において、≧０．５μｇの（１）ＰＮＶの単一免疫により免疫後１０週で＞９０％の血清転換が得られたことが見出された。免疫抗血清は細胞培養物中でＨＳＶ−２及びＨＳＶ−１の両者を中和した。動物にＨＳＶ−２を抗原投与した場合、ＰＮＶワクチン接種の後、致死的感染からの有意（ｐ＜．００１）の保護が達成された。

Description

【発明の詳細な説明】ポリヌクレオチド・ヘルペスウイルス・ワクチン発明の背景ウイルス、特には複数の血清型又は高変異率を有するものであって、それに対する中和及び防御免疫応答が誘発し得るウイルスに対するワクチンの開発の主な障害は、異なるウイルス単離体又は株の間のウイルス性外部蛋白質の多様性である。マウス及びヒトにおける細胞毒性Ｔリンパ球類（ＣＴＬ類）は保存されている内部ウイルス性蛋白質に由来するエピトープを認識することが可能であり［Ｊ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２，１７８５（１９８５）；Ａ．Ｒ．Ｍ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ４４，９５９（１９８６）；Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７，７１９（１９８６）；Ｊ．Ｂａｓｔｉｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５，１５０８（１９８７）；Ａ．Ｒ．Ｍ．ＴｏｗｎｓｅｎｄａｎｄＨ．Ｂｏｄｍｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，６０１（１９８９）］、かつウイルスに対する免疫応答に重要であると考えられる［Ｙ．−Ｌ．ＬｉｎａｎｄＢ．Ａ．Ａｓｋｏｎａｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５４，２２５（１９８１）；Ｉ．Ｇａｒｄｎｅｒｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，６８（１９７４）；Ｋ．Ｌ．ＹａｐａｎｄＧ．Ｌ．Ａｄａ，Ｎａｔｕｒｅ２７３，２３８（１９７８）；Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌｅｔａｌ．，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９，１３（１９８３）；Ｐ．Ｍ．ＴａｙｌｏｒａｎｄＢ．Ａ．Ａｓｋｏｎａｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８，４１７（１９８６）］ため、異なるウイルス株に対する異種防御を供与することが可能なＣＴＬワクチンの開発に努力が向けられている。ＣＴＬ類は、それらのＴ細胞受容体がＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩ分子に関連するウイルス性ペプチドを認識する場合に、ウイルス感染細胞を殺すことが知られている。これらのペプチドは、ウイルス内部でのこの蛋白質の位置又は機能に関わらず、内在的に合成されるウイルス性蛋白質から誘導され得る。保存されたウイルス性蛋白質に由来するエピトープを認識することにより、ＣＴＬ類は異種防御を供与することが可能である。多くの感染症誘発因子は、それら自身、この疾患誘発因子及びその副生物に結合して殺し、無害にし、又はこれが殺され、もしくは無害にされることを招き得る防御抗体を誘発する。これらの疾患からの回復は、通常、その感染性因子の高度に抗原性の成分に対して生じた防御抗体により、長期間持続する免疫を生じる。防御抗体はヒト及び他の多くの動物の自然防御機構の一部であり、他の組織及び体液の他に血液中に見出される。疾患を引き起こすことなく感染性因子及び／又はそれらの副生物に対する防御抗体を誘発することが、ほとんどのワクチンの第１の機能である。ＣＴＬ応答を生成させようとするほとんどの努力は、複製ベクターを用いて細胞内で蛋白抗原を生成させる［Ｊ．Ｒ．Ｂｅｎｎｉｎｋｅｔａｌ．，前出書３１１，５７８（１９８４）；Ｊ．Ｒ．ＢｅｎｎｉｎｋａｎｄＪ．Ｗ．Ｙｅｗｄｅｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３，１５３（１９９０）；Ｃ．Ｋ．Ｓｔｏｖｅｒｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５１，４５６（１９９１）；Ａ．ＡｌｄｏｖｉｎｉａｎｄＲ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ３５１，４７９（１９９１）；Ｒ．Ｓｃｈａｆｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，５３（１９９２）；Ｃ．Ｓ．Ｈａｈｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９，２６７９（１９９２］か、あるいは細胞質ゾル内へのペプチドの導入に焦点が合わせられている［Ｆ．Ｒ．ＣａｒｂｏｎｅａｎｄＭ．Ｊ．Ｂｅｖａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９，６０３（１９８９）；Ｋ．Ｄｅｒｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４２，５６１（１９８９）；Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．，前出書３４４，８７３（１９９０）；Ｄ．Ｓ．Ｃｏｌｌｉｎｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８，３３３６（１９９２）；Ｍ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎｅｔａｌ．，前出書１４８，２３５７（１９９２）］。これらのアプローチの両者とも、それらのワクチンとしての有用性を低下させることがあるという制限を有する。レトロウイルスベクターは、組換えウイルスの複製する能力を維持しながら融合蛋白質として発現し得るポリペプチドのサイズ及び構造に対する制限を有し［Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８，１（１９９２）］、ワクチニアのようなベクターの引き続く免疫化についての有効性は、ワクチニアに対する免疫応答によって十分に発揮され得ない［Ｅ．Ｌ．Ｃｏｏｎｅｙｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３３７，５６７（１９９１）］。また、ウイルス性ベクター及び変性病原体には、ヒトにおけるそれらの使用を妨げることがあるという固有のリスクがある［Ｒ．Ｒ．Ｒｅｄｆｉｅｌｄｅｔａｌ．，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１６，６７３（１９８７）；Ｌ．Ｍａｓｃｏｌａｅｔａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１４９，１５９６（１９８９）］。さらに、提示させようとするペプチドエピトープの選択は個々のＭＨＣ抗原の構造に依存し、したがって、ペプチドワクチンは異種交配ポピュレーションにおけるＭＨＣハプロタイプの多様性により有効性が制限されることがある。Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．，及びＲｅｓｈｅｆ，Ｌ．［ＰＮＡＳ８３，９５５１−９５５５（１９８６）］は、マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）経路で導入されたＣａＣｌ₂沈殿ＤＮＡが発現し得ることを示した。ＤＮＡ発現ベクターのマウスへの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射は、筋肉細胞によるＤＮＡの取り込みとこのＤＮＡによってコードされる蛋白質の発現を生じることが示されている［Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７，１４６５（１９９０）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５２，８１５（１９９１）］。これらのプラスミドはエピゾーム状に維持され、複製しないことが示された。続いて、ラット、魚類及び霊長類の骨格筋、並びにラットの心筋にｉ．ｍ．注射した後の持続性発現が観察されている［Ｈ．Ｌｉｎｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８２，２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２９０，７３（１９９１）；Ｓ．Ｊｉａｏｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３，２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６５（１９９２）］。核酸を治療薬として用いる技術がＷＯ９０／１１０９２（１９９０年１０月４日）に報告されており、ここでは、裸のポリヌクレオチドが脊椎動物のワクチン接種に用いられた。近年、腫瘍を除去するためのＣＴＬ類の活性化における、抗原提示細胞表面上のエピトープのＢ７及び主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）提示の協働的な役割が評価された［Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１，１１１７−１１１９，１９９３］。ひとたび抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面上のＭＨＣ分子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）にエピトープを渡すと、同じＡＰＣ表面上で発現するＢ７はＣＴＬＡ−４又はＣＤ２８に結合することにより第２信号として作用する。その結果はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の急速な分裂であり、このＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞に増殖するように信号を送り、ＡＰＣを殺す。免疫化を筋肉内で行うことはこの方法の成功に不可欠なものではない。例えば、Ｔａｎｇら［Ｎａｔｕｒｅ，３５６，１５２−１５４（１９９２）］は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡで微小突起状にコートした金をマウス皮膚内に導入することによりマウスに抗−ＢＧＨ抗体が生成することを開示した。Ｆｕｒｔｈら［ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０５，３６５−３６８（１９９２）］は、生きている動物の皮膚、筋肉、脂肪及び乳房組織の形質導入にジェット・インジェクターが利用可能であることを示した。様々な核酸導入方法が近年評価された［Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２７５−１２８１（１９８９）］。Ｒｏｂｉｎｓｏｎら［ＡｂｓｔｒａｃｔｓｏｆＰａｐｅｒｓＰｒｅｓｅｎｔｅｄａｔｔｈｅ１９９２ｍｅｅｔｉｎｇｏｎＭｏｄｅｒｎＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＮｅｗＶａｃｃｉｎｅｓ，ＩｎｃｌｕｄｉｎｇＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆＡＩＤＳ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ｐ９２］も参照のこと。ここでは、ニワトリへの鳥インフルエンザＤＮＡのｉｍ、ｉｐ、及びｉｖ投与が致死的抗原投与に対する防御を提供すると主張されている。ＤＮＡ：カチオン性リポソーム複合体の静脈内注射がクローン化導入遺伝子の全身性発現を生じることがＺｈｕら［Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１，２０９−２１１（１９９３年７月９日）；ＷＯ９３／２４６４０、１９９３年１２月９日も参照］によって示された。近年、Ｕｌｍｅｒら［Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９，１７４５−１７４９，（１９９３）］は、インフルエンザウイルス蛋白質をコードするＤＮＡを注入することによるインフルエンザウイルス感染に対する異種防御について報告した。Ｗａｎｇら［Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ９０，４１５６−４１６０（１９９３年５月）］は、クローン化ゲノム（非スプライス）ＨＩＶ遺伝子の筋肉内接種による、マウスにおけるＨＩＶに対する免疫応答の誘発について報告した。しかしながら、達成される免疫応答のレベルは非常に低く、かつこのシステムはマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターの一部並びにシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター及びターミネーターの一部を用いていた。ＳＶ４０は、おそらくホスト細胞ＤＮＡに組込まれることにより、細胞を形質転換することが知られている。このため、Ｗａｎｇらによって記述されるシステムは、本発明の目的の１つである、ヒトへの投与には全く不適当である。ＷＯ９３／１７７０６はウイルスに対して動物をワクチン接種する方法を説明しており、ここでは、担体粒子が遺伝子構築物でコートされ、コートされた粒子が動物細胞内に加速化された。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対するサブユニットワクチンの開発についての最近の努力は、ウイルス性抗原；特にはウイルス性糖蛋白質の新規発現及び提示に焦点が当てられている。［検討のためには、Ｂｕｒｋｅ，Ｒ．Ｌ．，１９９３，Ｓｅｍ．ＩｎＶｉｒｏｌ．，４，ｐｐ．１８７−１９７を参照］酵母（Ｋｉｎｏ．，Ｙ．Ｃ．ｅｔａｌ．，１９８９，Ｖａｃｃｉｎｅ，７，ｐｐ．１５５−１６０）、昆虫細胞（Ｇｈｉａｓｉ，Ｈ．ｅｔａｌ．，１９９１，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１２１，ｐｐ．１６３−１７８）、及び哺乳動物細胞（Ｂｕｒｋｅ，Ｒ．Ｌ．，１９９１，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３，Ｓ９０６−Ｓ９１１；Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．，１９９０，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，３１，ｐｐ．５９−６１）を含む様々なシステムによって発現される組換えＨＳＶ糖蛋白質が、動物モデルにおいて防御免疫を誘発することが示されている。チャイニーズハムスター卵巣細胞において生成される組換えＨＳＶ− ２糖蛋白Ｄ（ｇＤ）の臨床試験は、このワクチンが未経験（ｎａｉｖｅ）個体に抗体応答を誘発し、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２血清陽性個体の両者において以前から存在する応答を刺激することを示している（Ｓｔｒａｕｓ，Ｓ．Ｅ．ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６７，ｐｐ．１０４５− １０５２）。サブユニットワクチンへの代わりのアプローチは、ＨＳＶ抗原の搬送に生きているウイルスベクターを用いることである。ｇＤ（Ａｕｒｅｌｉａｎ，Ｌ．ｅｔａｌ．，１９９１，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３，Ｓ９２４−Ｓ９３０；Ｒｏｏｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔａｌ．，１９９１，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１３，Ｓ８９８−Ｓ９０３；Ｗａｃｈｓｍａｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｖａｃｃｉｎｅ，１０，ｐｐ．４４７−４５４）、ｇＢ（前出のＲｏｏｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ら）、ｇＬおよびｇＨ（Ｂｒｏｗｎｅ，Ｈ．ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７４，ｐｐ．２８１３−２８１７）を発現するワクシニア−ＨＳＶ組換え体は、ＨＳＶ抗原投与から動物をうまく防御する。ＨＳＶｇＢを発現する組換えアデノウイルスの感染によるワクチン接種は、マウスに防御免疫応答を誘発する。（前出のＧｈｉａｓｉ，Ｈ．；ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｍ．Ｒ．，１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６９，ｐｐ．２４４−２４７）。未変性蛋白質（Ｌｏｎｇ，Ｄ．ｅｔａｌ．，１９８４，ＩＮｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４３，ｐｐ．７６１−７６４）、組換えにより発現する蛋白質（前出のＢｕｒｋｅ，Ｒ．Ｌ．；Ｓｔａｎｂｅｒｒｙ，Ｌ．Ｒ．ｅｔａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５，ｐｐ．９１４−９２０；前出のＳｔｒａｕｓ，Ｓ．Ｅ．）、ｇＤから誘導されるペプチド（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５６，ｐｐ．１０１４−１０２７）での免疫化により誘発されるか、又は受動的に伝達された（Ｄｉｘ，Ｒ．Ｄ．ｅｔａｌ．，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，３４，ｐｐ．１９２−１９９；Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｍ．Ｈ．ｅｔａｌ．，１９９３，ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙａｎｄＶｉｓｕａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，３４，ｐｐ．２４６０−２４６８）抗−ｇＤ抗体がＨＳＶ感染を防御し得ることが文書化されている。Ｗｏｌｆｆら（前出）による研究は、レポーター遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡの筋肉内注射が、注射視野内及びその近傍で、筋細胞中でのこの遺伝子の発現を生じることを初めて示した。最近の報告は、インフルエンザＡ血球凝集素をコードするプラスミドを注入することによる、インフルエンザに対するマウスの免疫化の成功を示した（前出のＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ｅｔａｌ．；Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ｅｔａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９，ｐｐ．１７４５−１７４９）。ヘルペスウイルスへのＤＮＡ免疫化の最初の利用が報告されている（Ｃｏｘｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，ｐｐ．５６６４−５６６７）。ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）糖蛋白ｇＩＶをコードするプラスミドの注入は、マウス及び子ウシに抗 −ｇＩＶ抗体を生じる。ＢＨＶ−１での鼻内抗原投与に際して、免疫化子ウシは症状の減少を示し、対照よりもウイルスが実質的に少なかった。マウス（前出のＬｏｎｇ，Ｄ．ら）及びモルモット（前出のＳｔａｎｂｅｒｒｙ，Ｌ．Ｒ．ら；Ｓｔａｎｂｅｒｒｙ．Ｌ．Ｒ．ｅｔａｌ．，１９８９，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ．Ｒｅｓ．，１１，ｐｐ．２０３−２１４）において防御免疫応答を誘発するＨＳＶ糖蛋白質Ｄの能力は文書化されている。発明の要約ＨＳＶ疾患の予防におけるＤＮＡ免疫化の効力を試験するため、ＨＳＶ−２蛋白質をコードするＤＮＡ配列を真核発現ベクターにクローン化した。このＤＮＡ構築は、動物に注入されたときに、免疫応答を誘発する。免疫された動物を、ｇＤ遺伝子（又は他のＨＳＶ−２遺伝子）を用いる直接ＤＮＡ免疫化が疾患からそれらの動物を保護するかしないかを評価するため、ＨＳＶに感染させた。したがって、ＤＮＡ構築体及びＲＮＡ転写体を含む、注入もしくは他の方法により動物組織内に直接導入された際にヒト単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）蛋白質の生体内発現を誘発することが可能な核酸が開示される。これらの核酸の注入は、引き続くＨＳＶ抗原投与に対して防御的なＨＳＶ−特異抗体の生成の他に、ＨＳＶ抗原に特異的な細胞毒性Ｔリンパ球類（ＣＲＬ類）を生じる免疫応答を誘発し得る。これらの核酸は、感染を予防し、及び／又はＨＳＶ−関連疾患を改善することが可能な、ＨＳＶに対する免疫を誘発するワクチンとして有用である。図面の簡単な説明図１．パネルＡ、Ｂ、及びＣＡ．Ｖ１Ｊ：ｇＤ−形質導入細胞によるＨＳＶｇＤ発現のウェスタンブロット分析が示される；１．擬似（ｍｏｃｋ）感染Ｖｅｒｏ細胞；２．ＨＳＶ−２１８６感染Ｖｅｒｏ細胞（ｍｏｉ＝１）；３．ＨＳＶ−２Ｃｕｒｔｉｓ感染Ｖｅｒｏ細胞（ｍｏｉ＝１）；４．Ｖ１Ｊ：ｇＤが形質導入されたＲＤ細胞５．擬似形質導入ＲＤ細胞。Ｂ．Ｖ１ＪＮＳ：ｇＢ−形質導入細胞によるＨＳＶｇＢ発現のウェスタンブロット分析が示される。Ｃ．Ｖ１Ｊ：ＩＣＰ２７−形質導入細胞によるＨＳＶＩＣＰ２７発現のウェスタンブロット分析が示される。図２．パネルＡ、Ｂ、及びＣＡ．ＨＳＶＰＮＶ免疫化（Ｂ−６．２５μｇ用量のＶ１Ｊ：ｇＤ、Ｃ−５０ μｇ用量のＶ１Ｊ：ｇＤ）及び擬似（ｓｈａｍ）免疫化（Ａ）動物からの血清を用いる、１．ＨＳＶ−１ＫＯＳ；２．ＨＳＶ−２１８６；３．ＨＳＶ−２Ｃｕｒｔｉｓ；４．擬似感染に感染したＢＨＫ細胞の溶解物についてのウェスタンブロット分析が示される。Ｂ．ＨＳＶＰＮＶｇＢ免疫化動物からの血清を用いるウェスタンブロット分析が示される。図３．ワクチンの一回注射を受けたＨＳＶＰＮＶ免疫化動物についてのＥＬＩＳＡ生成グループＧＭＴデータが示される；血清は免疫後第４、第７及び第１０週に得た。図４．２００μｇ；１００μｇ；５０μｇ；２５μｇ；１２．５μｇ；６．２５μｇ；３．１３μｇ；１．５６μｇ；０．７８μｇのＶ１Ｊ：ｇＤ又は生理食塩水のみを２回注射した後のＨＳＶ−２抗原投与動物の生存。２００μｇ；１００μｇ；２５μｇ；１２．５μｇ；６．２５μｇ；及び３．１３ μｇ群の動物は全てが生存したため、それらは全て単一の記号で表される。図５．５０μｇ；１６．７μｇ；５．０μｇ；１．６７μｇ；０．５μｇ；０．１６７μｇ；０．０５μｇ；０．０１７μｇ；０．００５μｇのＶ１Ｊ：ｇＤ又は生理食塩水のみを１回注射した後のＨＳＶ−２抗原投与動物の生存。図６．ＨＳＶ抗原投与した後の、Ｖ１ＪＮＳ：ｇＢで免疫した動物の生存が示される。図７．ＨＳＶ抗原投与した後の、Ｖ１Ｊ：ｇＣで免疫した動物の生存が示される。図８．ＨＳＶ−２感染モルモットにおける生存の結果、死亡までの平均日数、麻痺、及び膣内ウイルス力価が示される。図９．モルモット膣内病変スコアが示される。発明の詳細な説明本発明は、ヒトのような哺乳動物を含む脊椎動物生体内に直接導入された場合に、その動物内においてコード化された蛋白質の発現を誘発するポリヌクレオチドを提供する。ここで用いられる場合、ポリヌクレオチドは、生きている脊椎動物細胞に導入された際に、その細胞機構をポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコードされる翻訳生成物の生成に向けることが可能なように必須調節要素を含む核酸である。本発明の一態様において、このポリヌクレオチドは、転写プロモーターに作動可能に結合するＨＳＶ遺伝子を含むポリデオキシリボ核酸である。本発明の別の態様において、ポリヌクレオチドワクチンは、真核細胞機構（リボゾーム、ｔＲＮＡ及び他の翻訳因子）によって容易に翻訳される、ＨＳＶ遺伝子をコードするポリリボ核酸を含む。このポリヌクレオチドによってコードされる蛋白質が、ＨＳＶに関連する蛋白質のように、病的状態にある場合を除いて通常動物内に生じないもの（すなわち、異種蛋白質）である場合に、動物の免疫系が活性化されて防御免疫応答が始まる。これらの外来性蛋白質は動物自身の組織によって生成されるため、発現した蛋白質は主要組織適合性システム（ＭＨＣ）によって真正ＨＳＶ感染が生じた場合と同様の様式で処理される。その結果は、この開示に示されるように、ＨＳＶに対する免疫応答の誘発である。コード化された蛋白質に対する免疫応答を生成するためのポリヌクレオチドを、ここでは、ポリヌクレオチドワクチン又はＰＮＶと呼ぶ。この明細書から当業者が理解することができる本発明の多くの態様が存在する。例えば、異なる転写プロモーター、ターミネーター、担体ベクター又は特定の遺伝子配列を成功裏に用いることができる。本発明は、哺乳動物組織に導入された際に、生体内においてポリヌクレオチドの発現を誘発し、それによりコード化された蛋白質を生成するポリヌクレオチドの使用方法を提供する。コード化された蛋白質のアミノ酸配列を変更する、蛋白質をコードするヌクレオチド配列の変種又は派生物を生成させることが可能であることは当業者には容易に認められる。変更が加えられた発現蛋白質は変更が加えられたアミノ酸配列を有するものの、依然としてウイルス性蛋白質と反応する抗体を誘発することが可能であり、機能的に等価物であると考えることができる。加えて、完全長蛋白質の一部をコードする完全長遺伝子の断片を構築することも可能である。これらの断片は、ウイルス性蛋白質と反応する抗体を誘発する蛋白質又はペプチドをコードすることが可能であり、機能的に等価物であると考えることができる。本発明の一態様において、ＨＳＶ遺伝子生成物をコードする遺伝子が発現ベクターに組み込まれる。このベクターは、真核ＲＮＡポリメラーゼによって認識される転写プロモーター、及び転写ターミネーターをＨＳＶ遺伝子をコードする配列の末端に有する。強力免疫グロブリンのような多くの他の公知プロモーター、又は他の真核細胞遺伝子プロモーターのいかなるものをも用い得ることを当業者は認識するであろうが、好ましい態様においては、このプロモーターはイントロンＡ配列を有するサイトメガロウイルス・プロモーター（ＣＭＶ−ｉｎｔＡ）である。好ましい転写ターミネーターはウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネーターである。ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＧＨターミネーターの組み合わせが好ましい。加えて、原核細胞中でのポリヌクレオチドの調製を助けるため、抗生物質耐性マーカーが、適切な原核性プロモーターの転写制御の下で、任意に、発現ベクターに含められる。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子又は他の適切な抗生物質耐性マーカーのいかなるものをも用いることができる。本発明の好ましい態様において、抗生物質耐性遺伝子はネオマイシン耐性のための遺伝子生成物をコードする。さらに、原核生物中での成長によるポリヌクレオチドの高レベル生成を助けるため、原核性複製起点を有し、かつ高コピー数のものであることがベクターにとって有利である。多くの市販原核性クローニングベクターのいかなるものもこれらの要素を提供する。本発明の好ましい態様において、これらの機能性はｐＵＣシリーズとして知られる市販ベクターによって提供される。しかしながら、非必須ＤＮＡ配列は除去することが望ましいことがある。例えば、ｐＵＣのｌａｃＺ及びｌａｃＩコーディング配列は除去してもよい。また、これらのベクターは真核細胞中では複製不可能であることが望ましい。これは、ポリヌクレオチドワクチン配列がレシピエントのゲノムに組込まれるリスクを最小にする。別の態様において、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端繰り返し（ＬＴＲ）がプロモーターとして用いられる発現ベクターｐｎＲＳＶが用いられる。さらに別の態様においては、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨ転写ターミネーターがクローン化されている変異ｐＢＲ３２２ベクターであるＶ１が用いられる。本発明の好ましい態様においては、Ｖ１及びｐＵＣ１９の要素が組み合わされてＶ１Ｊと命名される発現ベクターが生成されている。Ｖ１Ｊ又は他の望ましい発現ベクターに、ｇＤのようなＨＳＶ遺伝子、又はｇＢ、ｇＣ、ｇＬ、ｇＨ及びＩＣＰ２７のような抗−ＨＳＶ免疫応答（抗体及び／又はＣＴＬ類）を誘発し得る他のＨＳＶ遺伝子がクローン化される。別の態様において、アンピシリン耐性遺伝子がＶ１Ｊから取り除かれてネオマイシン耐性遺伝子に置き換えられ、Ｖ１Ｊ−ｎｅｏを生じる。このＶ１Ｊ−ｎｅｏには、本発明による使用のために多くの異なるＨＳＶ遺伝子のいかなるものもクローン化することが可能である。さらに別の態様においては、ベクターはＶ１Ｊｎｓである。これは、ユニークＳｆｉｌ制限部位がＶ１Ｊ−ｎｅｏの２１１４位で単一Ｋｐｎｌ部位内に加工されていることを除いて、Ｖ１Ｊｎｅｏと同じものである。ヒトゲノムＤＮＡにおけるＳｆｉｌ部位の出現率は非常に低い（１００，０００塩基当たり約１部位）。このため、このベクターは、単に抽出されたゲノムＤＮＡをＳｆｉｌ消化することにより、ホストＤＮＡへの発現ベクターの組込みについての徹底的な監視を可能にする。さらなる態様においては、ベクターはＶ１Ｒである。このベクターにおいては、非常にコンパクトなベクターを生成するため、可能な限り多くの非必須ＤＮＡが“トリムされ”ている。このベクターは、望ましくない配列がコード化され、かつ特定のウイルス遺伝子をコードする構築物が周辺組織に導入される際に細胞による取り込みが最適化されることをほとんど懸念することなく、使用しようとするより大きな挿入を可能にする。前述のベクター変性の生成及び開発手順に用いられる方法は、当業者に公知の方法に従って達成することができる。この研究から、当業者は、本発明の用途の一つが、他のパラメータに加えてＨＳＶ配列多様性とＨＳＶ中和の血清学との相関を作成し得るように、生体外に加えて生体内において、試験及び分析するシステムを提供することであることを認識するであろう。これらのウイルス遺伝子の単離及びクローニングは、当業者に公知の方法により達成することができる。本発明は、さらに、ワクチン生成のためのＨＳＶ株及び配列の系統的な同定方法を提供する。ＨＳＶ株の主要単離体からの遺伝子の組み込みは、ウイルスの臨床的な単離体に対する免疫応答を誘発する免疫原を提供し、それ故、この分野においていまだ満たされていない要求を満たす。さらに、毒性単離体が変化した場合には、この免疫原は必要に応じて新しい配列を反映するように変性させることが可能である。本発明の一態様において、ＨＳＶ蛋白質をコードする遺伝子は転写プロモーターに直接結合される。組織特異的プロモーター又はエンハンサー、例えば、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）エンハンサーエレメントの使用が、特定の組織型へのポリヌクレオチドの発現を制限するのに望ましい。例えば、筋細胞は、分裂しない末梢分化細胞である。染色体への外来遺伝子の組込みは、細胞分裂及び蛋白合成の両者を必要とするように思われる。したがって、筋細胞のような非分裂細胞への限定蛋白発現が好ましい。しかしながら、ＣＭＶプロモーターの使用は、ＰＮＶが導入される多くの組織において発現を達成するのに適している。ＰＮＶ構築概要ＨＳＶ及び他の遺伝子は、好ましくは、ポリヌクレオチドワクチン接種に特異的に最適化されている発現ベクターにライゲートされている。要素には、ここに記述されるように、転写プロモーター、免疫原性エピトープ、及び免疫増強又は免疫調節遺伝子をコードするさらなるシストロンが、それら自身のプロモーター、転写ターミネーター、細菌性複製起点及び抗生物質耐性遺伝子と共に含まれる。任意に、このベクターは、多シストロン性ｍＲＮＡの発現のための内部リボゾーム・エントリー部位（ＩＲＥＳ）を有していてもよい。当業者は、ＤＮＡ相対物によってコードされる多シストロン性ｍＲＮＡを生成するため生体外において転写されたＲＮＡが本発明の範囲内にあることを理解するであろう。この目的のためには、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターのような強力なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを転写プロモーターとして用い、直線化ＤＮＡテンプレートを用いてラン・オン転写を行うことが望ましい。これらの方法は当該技術分野において周知である。引き続くウイルス抗原投与に対するポリヌクレオチドＨＳＶ免疫原の防御効力は、本発明のＤＮＡを用いる免疫により示される。これは、感染性因子が含まれず、ウイルス粒子の組立てを必要とすることがなく、かつ決定基の選択が許容されるため有利である。さらに、ウイルス遺伝子生成物の配列が様々なＨＳＶ株の間で保存され得るため、引き続く他のＨＳＶ株による抗原投与に対する防御が得られる。ｇＤをコードするＤＮＡ発現ベクターの注入は、引き続くウイルス抗原投与に対する重要な防御免疫を生じ得る。特に、ｇＤ−特異的抗体及びＣＴＬが生成し得る。保存蛋白質に向けられる免疫応答は、この変動蛋白質の抗原性シフト及びドリフトにもかかわらず、有効であり得る。ＨＳＶ遺伝子生成物の各々が様々なＨＳＶ株の間である程度の保存性を示し、かつ免疫応答が細胞内発現及びＭＨＣプロセッシングに応じて生じ得るため、多くの異なるＨＳＶｇＤＰＮＶ構築物が交叉反応性免疫応答を生じ得ることが予想される。本発明は、自己複製因子又はアジュバントを必要とすることなく、異種防御免疫を誘発する手段を提供する。ウイルス性蛋白質及びヒト成長ホルモンＤＮＡを注入した後の発現蛋白質に対する高力価抗体の生成［Ｔａｎｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５６，１５２，１９９２］は、これが、保存抗原を標的とする細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンとは別に、又はこれとの組み合わせで抗体ベースのワクチンを作製する容易かつ高度に有効な手段であることを示している。ＤＮＡ構築物の生成及び精製のたやすさは、都合のよいことに、伝統的な蛋白精製に匹敵し、これが組み合わせワクチンの生成を容易にする。このため、例えばｇＤ及び非ＨＳＶ遺伝子をも含む他のＨＳＶ遺伝子のいかなるものをもコードする多重複合体を調製し、混合し、かつ共投与することが可能である。加えて、蛋白発現がＤＮＡ注入に続いて維持され［Ｈ．Ｌｉｎｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８２，２２１７（１９９０）；Ｒ．Ｎ．Ｋｉｔｓｉｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８８，４１３８（１９９１）；Ｅ．Ｈａｎｓｅｎｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２９０，７３（１９９１）：Ｓ．Ｊｉａｏｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３，２１（１９９２）；Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆｅｔａｌ．，ＨｕｍａｎＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３６３（１９９２）］、Ｂ−及びＴ−細胞メモリーの持続性が増強され［Ｄ．ＧｒａｙａｎｄＰ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，９６９（１９９１）；Ｓ．Ｏｅｈｅｎｅｔａｌ．，前出書１７６，１２７３（１９９２）］、それにより長期間生存するホルモン及び細胞介在免疫を生じる。ワクチン・レシピエントに導入しようとする発現可能なＤＮＡ又は転写されたＲＮＡの量は、用いられる転写及び翻訳プロモーターの強度に依存する。免疫応答の強さは、蛋白発現のレベル及び発現遺伝子生成物の免疫原性に依存し得る。一般には、約１ｎｇないし５ｍｇ、好ましくは約１０μｇないし３００ μｇの有効用量が筋肉組織に直接投与される。皮下注射、皮膚内導入、皮膚を通しての押圧、及び腹腔内、静脈内、又は吸入送達のような他の投与様式も適切である。追加免疫ワクチン接種を提供することも意図されている。ＨＳＶポリヌクレオチド免疫原を用いてのワクチン接種に続いて、ｇＤ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＧ、及びｇＨ遺伝子生成物のようなＨＳＶ蛋白質免疫原で追加免疫することも意図されている。本発明のＰＮＶの非経口投与と同時の、又はこれに続いての、インターロイキン−１２蛋白質の非経口投与、例えば、静脈内、筋肉内、皮下もしくは他の手段の投与も有利であり得る。ポリヌクレオチドは裸、すなわち、いかなる蛋白質、アジュバント又はレシピエントの免疫系に影響を及ぼす他の因子とも結合していなくともよい。この場合、生理学的に許容し得る溶液、例えば、これらに限定されるものではないが、無菌生理食塩水又は無菌緩衝生理食塩水中にあることがこのポリヌクレオチドにとって望ましい。あるいは、このＤＮＡはレシチンリポソーム又は当該技術分野において公知のリポソームのようなリポソームにＤＮＡ−リポソーム混合物として会合していてもよく、あるいはこのＤＮＡは免疫応答を高めるため蛋白質又は他の担体のような当該技術分野において公知のアジュバントと会合していてもよい。また、ＤＮＡの細胞による取り込みを助ける因子、例えば、これに限定されるものではないが、カルシウムイオンを用いることもできる。これらの因子は、ここでは一般に、形質導入促進因子及び薬学的に許容し得る担体と呼ばれる。ポリヌクレオチドでコートされた微小突起をコートする技術は当該技術分野において公知であり、本発明に関しても有用である。ヒトでの使用が意図されるＤＮＡについては、最終ＤＮＡ生成物が薬学的に許容し得る担体又はバッファ溶液中にあることが望ましい。薬学的に許容し得る担体又はバッファ溶液は当該技術分野において公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓのような様々なテキストに記述されるものが含まれる。別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドであって、生体内における真核細胞へのこのポリヌクレオチドの導入に際して、発現して遺伝子生成物を生成することが可能な連続核酸配列を含むポリヌクレオチドである。このコード化された遺伝子生成物は、好ましくは、免疫刺激物又は免疫応答を生じることが可能な抗原のいずれかとして作用する。したがって、この態様における核酸配列は、ヒト単純ヘルペスウイルス免疫原性エピトープ、及び任意に、サイトカイン又は蛋白質のＢ７ファミリーの一員のようなＴ細胞共同刺激要素をコードする。遺伝子生成物よりもその遺伝子で免疫することには幾つかの利点がある。その第１は比較的簡潔であり、それにより未変性またはほぼ未変性の抗原を免疫系に供与することが可能となることである。細菌、酵母又は哺乳動物細胞中でさえも、そこで組換えにより発現する哺乳動物蛋白質は、しばしば、適当な抗原性を保証するためのさらなる処理を必要とする。ＤＮＡ免疫の第２の利点は、ＭＨＣクラスＩ経路に入り、細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発する免疫原の潜在能力である。インフルエンザＡ核蛋白質（ＮＰ）をコードするＤＮＡでのマウスの免疫化は、ｆｌｕの異種株での抗原投与に対してマウスを保護する、ＮＰに対するＣＤ８＋応答を誘発する（前出のＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら；前出のＵｌｍｅｒ，Ｊ．ら）。細胞介在免疫がＨＳＶ感染の制御において重要である証拠がある［検討のためには、Ｎａｓｈ，Ａ．Ａ．ｅｔａｌ．，１９８５，Ｉｎ：ＴｈｅＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．４，Ｐｌｅｎｕｍ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ａｎｄＳｃｈｍｉｄｔ，Ｄ．Ｓ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｉｎ：Ｒｏｕｓｅ（ｅｄ．），ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓＩｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＡｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７９，ＨｅｒｐｅｓＳｉｍｐｌｅｘＶｉｒｕｓ；Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＣｏｎｔｒｏｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎを参照］。ＨＳＶ血清陽性患者から単離されるＨＳＶＣＴＬの大部分はＣＤ４＋型である（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｄ．Ｓ．ｅｔａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０，ｐｐ．３６１０−３６１６；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，Ｔ．ｅｔａｌ．，１９８６，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６６，ｐｐ．５０７−５１５）が、ｇＤに特異的なものを含むＣＤ８＋クローンが単離されている。（Ｔｏｒｐｅｙ，Ｄ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，ｐＰ．１３２５−１３３２；Ｙａｓｕｋａｗａ，Ｍ．ｅｔａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，ｐｐ．２０５１−２０５７；Ｚａｒｌｉｎｇ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３６，ｐｐ．４６６９−４６７３）マウスにおいて、細胞移植及び除去実験は、幾つかのＣＤ８＋ＣＴＬが感染に対して防御すること示唆している。（Ｂｏｎｎｅｕａ，Ｒ．Ｈ．ｅｔａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，ｐｐ．１４８０−１４８４；Ｎａｓｈ，Ａ．Ａ．ｅｔａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６８，ｐｐ．８２５−８３３）組換えウイルスベクターでの感染によるｇＤでの免疫化（Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｅ．ｅｔａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ．１９３−１９７；Ｗａｃｈｓｍａｎ，Ｍ．Ｌ．ｅｔａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５，ｐｐ．１１８８−１１９７；Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．ｅｔａｌ．，１９９３，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１，ｐｐ．１１９１−１１９８）は、ＨＳＶ感染からマウスを保護する。ＤＮＡのような生きているウイルスベクターは、免疫原のＭＨＣクラスＩ提示の能力を有する。しかしながら、マウスの免疫にＨＳＶｇＤ−ワクシニア組換え体による感染を用いる最近の研究により、抗原投与による防御がＬ３Ｔ４＋細胞の遅延型過敏機能に依存することが見出された。（Ｗａｃｈｓｍａｎ，Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９２，Ｖａｃｃｉｎｅ，１０，ｐｐ．４４７−４５４）ＨＳＶ感染マウスからｇＤ−特異的ＣＤ８＋細胞が単離されているものの、限定感染におけるそれらの役割は知られていない。（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４５，ｐｐ．７０２−７１０）。Ｋｏｅｌｌｅらの研究は、ヒト線維芽細胞及びケラチン細胞のＨＳＶ感染がそれらをＣＤ８＋ＣＴＬに認識不可能にすることを示唆している（Ｋｏｅｌｌｅ，Ｄ．Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１，ｐｐ．９６１−９６８）。自然ＨＳＶ感染において、ＣＤ８＋細胞一般の役割、特にはｇＤに対するＣＤ８＋応答の役割は解明されていない。ＤＮＡ免疫化はホルモン及び細胞介在免疫応答の両者を誘発することが可能であるため、その最も大きな利点は、多数のウイルス遺伝子をそれらのワクチン能力について調査する比較的簡単な方法を提供することである。ＨＳＶ−２糖蛋白Ｂ及びＣを発現するプラスミドも中和抗体を誘発し、致死的抗原投与からマウスを保護する。しかしながら、ＣＴＬ応答を生じ、かつＩＣＰ２７−ワクシニア組換えウイルスでの感染により免疫されたマウスに幾らかの防御を付与することが知られるＩＣＰ２７（Ｂａｎｋｓ，Ｔ．Ａ．ｅｔａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５，ｐｐ．３１８５−３１９１）は、マウスがＰＮＶＩＣＰ２７単独でワクチン接種されている場合には、致死的ＨＳＶ抗原投与に対する防御を付与しない。しかしながら、ＩＣＰ２７をコードするＤＮＡは多重ＨＳＶ遺伝子含有ＰＮＶの一成分として有用であり、本発明がＩＣＰ２７を多価ＨＳＶＰＮＶの成分として含むことが意図されている。また、ＤＮＡ注入による免疫化は、上に論じられるように、多成分サブユニットワクチンを容易に組み立てることを可能にする。近年、多重インフルエンザ遺伝子を用いる同時免疫化が報告されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９４，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，印刷中）。その生成物が免疫系の異なるアームを活性化する遺伝子をＨＳＶワクチンに含めることによっても、引き続くウイルス抗原投与に対する完全な防御が提供され得る。以下の実施例は本発明を説明するために提示されるが、本発明をそれらに限定するものではない。実施例１ワクチン製造のためのベクターＡ）Ｖ１発現ベクターＶ１をｐＣＭＶＩＥ−ＡＫＩ−ＤＨＦＲ［Ｙ．Ｗｈａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，１７９６（１９８７）］から構築した。ＡＫＩ及びＤＨＦＲ遺伝子は、このベクターをＥｃｏＲＩで切断し、自己ライゲートさせることにより除去した。このベクターはＣＭＶプロモーター内にイントロンＡを有していないので、内部ＳａｃＩ部位［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，３９７９（１９９１）における番号付けで１８５５］が削除されたＰＣＲ断片として付加した。ＰＣＲ反応に用いられたテンプレートは、ｈＣＭＶ−ＩＥ１エンハンサー／プロモーター及びイントロンＡを含むｐＣＭＶ６ａ１２０［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎｅｔａｌ．，前出書を参照］に由来するＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ断片を、ｐＢＬ３のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位内にライゲートしてｐＣＭＶＩｎｔＢＬを生成させることにより作製されたｐＣＭＶｉｎｔＡ−Ｌｕｘであった。ＲＳＶ−Ｌｕｘ［Ｊ．Ｒ．ｄｅＷｅｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７，７２５，１９８７］に由来する１８８１塩基対のルシフェラーゼ遺伝子断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩクレノウ充填）を、クレノウ充填及びホスファターゼ処理されたｐＣＭＶＩｎｔＢＬのＳａｌＩ部位にクローン化した。イントロンＡまで伸びるプライマーは：５’プライマー、配列番号１：５’−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧ−３’；３’プライマー、配列番号２：５’−ＧＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧ−３’ 。ＳａｃＩ部位の除去に用いられたプライマーは：センスプライマー、配列番号３：５’−ＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧＧＧＣＴＣＧＣＡＣ−３’ 及びアンチセンスプライマー、配列番号４：５’−ＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＡＣ−３’。このＰＣＲ断片をＳａｃＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、同じ酵素で切断されているベクターに挿入した。Ｂ）Ｖ１Ｊ発現ベクターＶ１Ｊを作製する目的は、それらをより限定化されたコンテクストに置き、よりコンパクトなベクターを作製し、かつプラスミド精製収率を改善するために、ベクターＶ１からプロモーター及び転写ターミネーター要素を除去することであった。Ｖ１ＪはベクターＶ１及び市販のプラスミドｐＵＣ１８から誘導される。Ｖ１をＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、２つのＤＮＡ断片を生成した。ＣＭＶｉｎｔＡプロモーター及び異種遺伝子の発現を制御するウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写ターミネーター要素を有する、これらの断片のうちの小さい方をアガロース電気泳動ゲルにより精製した。次いで、別の“平滑末端化”ＤＮＡ断片へのライゲーションを容易にするために、このＤＮＡ断片の末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いて“平滑化”した。発現ベクターの“バックボーン”を提供するためｐＵＣ１８を選択した。これは高収率のプラスミドを生成することが知られており、配列及び機能によりよく特徴付けられており、サイズが小さい。ＨａｅＩＩ制限酵素を用いる部分的消化により全ｌａｃオペロンをこのベクターから除去した。残りのプラスミドをアガロース電気泳動ゲルにより精製し、子ウシ腸内アルカリホスファターゼで処理されたＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化して、上述のＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨ要素にライゲートした。ｐＵＣバックボーン内でプロモーター要素のとり得る２つの方向のいずれかを示すプラスミドが得られた。これらのプラスミドの１つが大腸菌中でＤＮＡを非常に高い収量で生成し、それをＶ１Ｊとした。このベクターの構造が接合領域の配列分析により確認され、続いて、これによりＶ１に匹敵する、もしくはより高い異種遺伝子の発現が得られることが示された。Ｃ）Ｖ１Ｊｎｅｏ発現ベクターアンピシリンは大スケールの発酵に望ましいものではあり得ないため、Ｖ１Ｊを有する細菌の抗生物質選択に用いられたａｍｐ^r遺伝子を除去することが必要であった。Ｖ１Ｊの、ｐＵＣバックボーンに由来するａｍｐ^r遺伝子をＳｓｐＩ及びＥａｍ１１０５Ｉ制限酵素を用いる消化により除去した。残りのプラスミドをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、子ウシ腸内アルカリホスファターゼで処理した。トランスポゾン９０３から誘導され、ｐＵＣ４Ｋプラスミド内に含まれる市販のｋａｎ^r遺伝子をｐｓｔＩ制限酵素を用いて切除し、アガロースゲル電気泳動で精製して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。この断片をＶ１Ｊバックボーンにライゲートし、ｋａｎ^r遺伝子をいずれかの方向で有するプラスミドを誘導した。これらはＶ１Ｊｎｅｏ＃１及び＃３と呼ばれた。これらのプラスミドの各々を、制限酵素消化分析、接合領域のＤＮＡ配列決定により確認し、その各々がＶ１Ｊと同量のプラスミドを生成することが示された。これらのＶ１Ｊｎｅｏベクターは、異種遺伝子生成物の発現もＶ１Ｊに匹敵した。Ｖ１Ｊにおけるａｍｐ^r遺伝子と同じ方向でｋａｎ^r遺伝子を有するＶ１Ｊｎｅｏ＃３が発現構築物として選択された。以後、これをＶ１Ｊｎｅｏと呼ぶ。Ｄ）Ｖ１Ｊｎｓ発現ベクター組込みの研究を容易にするため、Ｖ１ＪｎｅｏにＳｆｉＩ部位を加えた。このベクターのＢＧＨ配列内のＫｐｎＩ部位に、市販の１３塩基対ＳｆｉＩリンカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）を加えた。Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎＩで直線化し、ゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化して、平滑末端ＳｆｉＩリンカーに結合した。制限マッピングによりクローン性単離体を選択し、リンカー中を配列決定することにより確認した。この新規ベクターはＶ１Ｊｎｓと呼ばれた。Ｖ１Ｊｎｓ（ＳｆｉＩを有する）における異種遺伝子の発現はＶ１Ｊｎｅｏ（ＫｐｎＩを有する）における同じ遺伝子の発現に匹敵した。Ｅ）Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ分泌及び／又は膜蛋白質の異種リーダーペプチド配列を提供するため、ヒト組織特異的プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔＰＡ）リーダーを含むようにＶ１Ｊｎｓを変性した。２種類の合成相補的オリゴマーをアニールした後、ＢｇｌＩＩ消化されているＶ１Ｊｎにライゲートした。センス及びアンチセンスオリゴマーは、５’−ＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＡ−３’、配列番号５：及び５’−ＧＡＴＣＴＣＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＴ−３’、配列番号６である。センスオリゴマーにおいて、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列には下線が付されている。これらのオリゴマーは、ＢｇｌＩＩ開裂配列へのライゲーションに適合する張り出し塩基を有する。ライゲーション後、下流ＢｇｌＩＩを続くライゲーションのために保持しながら、上流ＢｇｌＩＩ部位を破壊した。全ｔＰＡリーダー配列に加えて両接合部位をＤＮＡ配列決定により確認した。加えて、コンセンサス最適化ベクターＶ１Ｊｎｓ（＝ＳｆｉＩ部位を有するＶ１Ｊｎｅｏ）に合わせるため、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでＫｐｎＩ部位を平滑末端化し、次いでＳｆｉＩリンカー（カタログ＃１１３８、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）でライゲートすることにより、Ｖ１Ｊｎ−ｔＰＡのＢＧＨターミネーター領域内のＫｐｎＩ部位にＳｆｉＩ制限部位を配置した。この変性は、制限消化及びアガロースゲル電気泳動により確認した。Ｆ）ｐＧＥＭ−３−Ｘ−ＩＲＥＳ−Ｂ７（ここでＸ＝あらゆる抗原性遺伝子）免疫原をコードする遺伝子と免疫刺激性蛋白質をコードする遺伝子との協調発現を提供するジシストロン性ワクチン構築物の例として、ネズミＢ７遺伝子を（ＡＴＣＣから入手した）Ｂリンパ腫細胞系ＣＨ１からＰＣＲ増幅した。Ｂ７は、主要組織適合性複合体Ｉ及びＩＩのコンテクストにおいて、抗原による必須共同刺激Ｔ細胞活性化を提供する蛋白質ファミリーの一員である。ＣＨ１細胞は、それらが構成的に活性化された表現型を有し、かつＢ７がＢ細胞及びマクロファージのような活性化抗原提示細胞によって優先的に発現するため、Ｂ７ｍＲＮＡの良好な源を提供する。これらの細胞をｃＡＭＰ又はＩＬ −４を用いて生体外でさらに刺激し、標準グアニジニウム・チオシアネート法を用いてｍＲＮＡを調製した。このｍＲＮＡを用い、ＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）及びＢ７翻訳オープン・リーディング・フレームの下流に位置するＢ７に特異的なプライミングオリゴマー（５’−ＧＴＡＣＣＴＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＡＴＡＡＴＡＣＣＡＴＧ−３’、配列番号７）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。以下のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマー：それぞれ、５’−ＧＧＴＡＣＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＴＧＡＴＧＣ−３’、配列番号８：及び５’−ＣＣＡＣＡＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＧＡＡＣＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＣＴＧＴＴＣ−３’、配列番号９を用いるＰＣＲによりＢ７を増幅した。これらのオリゴマーは、ＮｃｏＩ制限部位及び３’−末端ＢｇｌＩＩ部位の直前に位置する追加ＮｃｏＩ部位を有するコザック翻訳開始配列の他に、このインサートの端部にＢｇｌＩＩ制限酵素部位を提供する。ＮｃｏＩ消化により、ＮｃｏＩで消化されているｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳへのクローニングに適する断片が生じた。得られるベクター、ｐＧＥＭ−３−ＩＲＥＳ−Ｂ７は、Ｖ１Ｊｎｓ− Ｘ（ここで、Ｘは抗原をコードする遺伝子を表す）に容易に移入され得るＩＲＥＳ−Ｂ７カセットを有する。Ｇ）ｐＧＥＭ−３−Ｘ−ＩＲＥＳ−ＧＭ−ＣＳＦ（ここで、Ｘ＝あらゆる抗原性遺伝子）このベクターは、Ｂ７よりも免疫刺激性サイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦの遺伝子が用いられることを除いて、上記項目Ｃに記述されるものに類似するカセットを有する。ＧＭ−ＣＳＦは、生体内において強力な抗−腫瘍Ｔ細胞活性を誘発することが示されているマクロファージ分化及び刺激サイトカインである［Ｇ．Ｄｒａｎｏｆｆｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，３５３９（１９９３）］。Ｈ）ｐＧＥＭ−３−Ｘ−ＩＲＥＳ−ＩＬ−１２（ここで、Ｘ＝あらゆる抗原性遺伝子）このベクターは、Ｂ７よりも免疫刺激性サイトカイン、ＩＬ− １２の遺伝子が用いられることを除いて、上記項目Ｃに記述されるものに類似するカセットを有する。ＩＬ−１２は、体液性応答と対立する細胞性Ｔ細胞優位経路への免疫応答の転換において影響の大きい役割を果たすことが示されている［Ｌ．Ａｌｆｏｎｓｏｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３，２３５，１９９４］。実施例２ベクターＶ１Ｒ調製基本的なワクチン接種ベクターを最適化を続ける努力において、Ｖ１Ｒと命名されるＶ１Ｊｎｓの派生物を調製した。このベクターの構築の目的は、依然として最適化された異種遺伝子発現特性の全てとＶ１Ｊ及びＶ１Ｊｎｓが提供する高プラスミド収量とを保持する、不要ＤＮＡ配列を持たない最小サイズのワクチンベクターを得ることであった。（１）大腸菌複製起点を含むｐＵＣバックボーン内の領域は細菌からのプラスミド収量に影響を及ぼすことなく除去することが可能であり；（２）カナマイシン・オープン・リーディング・フレームに続くｋａｎ^r遺伝子の３’−領域は、細菌ターミネーターがその場所に挿入されたならば除去することが可能であり；かつ（３）ＢＧＨターミネーターの３’−半分からの〜３００ｂｐはその調節機能に影響を及ぼすことなく除去することが可能である（ＢＧＨ要素内の本来のＫｐｎＩ制限酵素部位に続いて）ことは、実験及び他に文献から決定した。Ｖ１Ｒは、それぞれＣＭＶｉｎｔＡプロモーター／ＢＧＨターミネーター、複製起点、及びカナマイシン耐性要素に相当する３つのＤＮＡ断片のＶ１Ｊｎｓからの合成にＰＣＲを用いることにより構築した。各断片にユニークな制限酵素を、ＰＣＲオリゴマーを用いて各断片末端に付加した：ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨにはＳｓｐＩ及びＸｈｏＩ；ｋａｎ^r遺伝子にはＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩ；及びｏｒｉ^rにはＢｃＩＩ及びＳａｌＩ。これらの酵素部位は、それらが各ＰＣＲ誘導ＤＮＡ断片の指向性ライゲーションを各部位が引き続いて失われることで可能にするため選択された：ＥｃｏＲＶ及びＳｓｐＩはライゲーションに適合する平滑末端ＤＮＡを残し、ＢａｍＨＩ及びＢｃｌＩはＳａｌＩ及びＸｈｏＩと同様に相補的な張り出しを残す。ＰＣＲによりこれらの断片を得た後、各断片を上に示される適当な制限酵素で消化し、次いで３つのＤＮＡ断片の全てを含む単一の反応混合物中で一緒にライゲートした。ｏｒｉ^rの５’ −末端は、これがカナマイシン耐性遺伝子の終了情報を提供し得るように、この領域に通常見出されるＴ２ｒｈｏ独立ターミネーター配列を含むように設計した。ライゲートした生成物は、ライゲーション接合部のＤＮＡ配列決定による他に、制限酵素消化（＞８酵素）により確認した。ＤＮＡプラスミド収量及びＶ１Ｒ内のウイルス性遺伝子を用いる異種発現はＶ１Ｊｎｓに類似するものと思われる。達成されたベクターサイズの正味の減少は１３４６ｂｐであった（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６ｋｂ；Ｖ１Ｒ＝３．５２ｋｂ）。Ｖ１Ｒの合成に用いられるＰＣＲオリゴマー配列（制限酵素部位には下線が付され、配列に続いて括弧内に同定されている）：（１）５’−ＧＧＴＡＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＧ−３’［ＳｓｐＩ］、配列番号１０：（２）５’−ＣＣＡＣＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣ−３’［ＸｈｏＩ］、配列番号１１：（ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨ断片用）（３）５’−ＧＧＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣ−３’［ＥｃｏＲＶ］、配列番号１２：（４）５’−ＣＣＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣ−３’［ＢａｍＨＩ］、配列番号１３：（カナマイシン耐性遺伝子断片用）（５）５’−ＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧ−３’［ＢｃｌＩ］、配列番号１４：（６）５’−ＣＣＡＣＡＴＧＴＣＧＡＣＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧ−３’［ＳａｌＩ］、配列番号１５：（大腸菌複製起点用）実施例３細胞、ウイルス及び細胞培養ＶＥＲＯ、ＢＨＫ−２１、及びＲＤ細胞をＡＴＣＣから入手した。ウイルスは、子ウシ血清（ＦＢＳ）を含まない小容量の培地において、３７℃で、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）０．１でほぼ集密的なＶＥＲＯ又はＢＨＫ細胞を感染させることにより、定法により調製した。１時間後、ウイルス接種物を除去し、培養物に２％熱不活性化ＦＢＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した高グルコースＤＭＥＭを再供給した。インキュベーションを細胞変性が広範囲に及ぶまで続けた：通常２４ないし４８時間。細胞に付着したウイルスを１８００×ｇ、１０分間、４℃で遠心することにより集めた。上清ウイルスを、６４０×ｇで１０分間、４℃で遠心することにより清透化した。実施例４クローニング及びＤＮＡ調製ＰＣＲテンプレートとして用いるＨＳＶ−２（Ｃｕｒｔｉｓ）ＤＮＡを、感染ＶＥＲＯ細胞から単離したヌクレオカプシドから調製した。（Ｄｅｎｎｉｓｔｏｎ，Ｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ，１５，ｐｐ．３６５−３７８）。ＢｇｌＩＩ制限認識部位を含む、ＨＳＶ２ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、又はＩＣＰ２７遺伝子の５’及び３’末端並列（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列に対応する合成オリゴマー（ＭｉｄｌａｎｄＣｅｒｔｉｆｉｅｄＲｅａｇｅｎｔＣｏｍｐａｎｙ；Ｍｉｄｌａｎｄ，Ｔｅｘａｓ）を各々２０ピコモルで用いた。ｇＤ遺伝子をコードする１．１ｋｂ断片を、ｄＧＴＰの代わりに１：４のデアザｄＧＴＰ：ｄＧＴＰ比を用い、バッファを３ｍＭＭｇＣｌ₂に補足したことを除いて製造者の仕様書に従い、ＰＣＲ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ、ＬａＪｏｌｌａ）により増幅した。ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡテンプレートを１００ｎｇ／１００μｇ反応物で用いた。このＰＣＲ増幅断片をＢｇｌＩＩで制限し、ＢｇｌＩＩで消化し、脱リン酸化したベクターＶ１Ｊ（前出のＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら）にライゲートした。製造者の仕様書に従い、大腸菌ＤＨ５α（ＢＲＬ−Ｇｉｂｃｏ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）を形質転換した。³²Ｐ標識３’ＰＣＲプライマーを用いるハイブリダイゼーションによりアンピシリン耐性コロニーをスクリーニングした。候補プラスミドを、制限マッピング、及びＳｅｑｕｅｎａｓｅＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ、バージョン２．０（ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いるベクター−インサート接合部の配列決定により特徴付けた。同様にして、ｇＢ遺伝子をコードする２．７Ｋｂ断片；ｇＣ遺伝子をコードする１．５Ｋｂ断片；及びＩＣＰ２７遺伝子をコードする１．６Ｋｂ断片もＰＣＲ増幅した。誘導された単離体を、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、又はＩＣＰ２７遺伝子のいずれかを含む適正ＤＮＡ構築体の存在について、独立に、同定及び特徴付けした。大スケールＤＮＡ調製は、８００ｍｌ培養物を２４ないし４８時間成長させ、幾つかの実験についてはＤＮＡを単一ＣｓＣｌ−ＥｔＢｒ等密度遠心によって精製したことを除いて、本質的に記述された（前出のＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．Ｌ．ら）通りであった。これらのプラスミド構築物を、制限マッピング及びベクター−インサート接合部の配列分析により特徴付けた。結果は、公開されているＨＳＶ−２Ｇ株（Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．ｅｔａｌ．，１９８４，ＤＮＡ，３，ｐｐ．２３−２９）配列データと一致し、各構築物について開始及び終止コドンが損なわれていないことが示された。実施例５Ｖ１ＪプラスミドからのＨＳＶ−２ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ及びＩＣＰ２７蛋白質の発現横紋筋肉腫細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１３６）を、使用前に１日、９．５ｃｍ² ウェル当たり１．２×１０⁶細胞の密度で、６−ウェル組織培養クラスター中において、１０％熱不活性化子ウシ血清、２ｍＭＬ−グルタミン、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てＢＲＬ−Ｇｉｂｃｏから）を補足した高グルコースＤＭＥＭに植え付けた。フェノール：クロロホルム抽出し、塩化セシウム精製したプラスミドＤＮＡを、ＲＤ細胞の９．５ｃｍ²ウェルの各々について５−１５μｇを用いることを除いてキットの指示に従い、ＰｈａｒｍａｃｉａＣｅｌｌＰｈｅｃｔ試薬を用いてリン酸カルシウムで沈殿させた。リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿物を添加して６時間後、培養物をグリセロール衝撃した；再供給の後、回収前に２日間培養物をインキュベートした。形質転換した培養物の溶解物を、１μＭロイペプシン、１μＭペプスタチン、３００ｎＭアプロチニン、及び１０μＭＴＬＣＫを補足した１×ＲＩＰＡ（０．５％ＳＤＳ）１．０％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２５ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌｐＨ７．４）において調製し、簡単に超音波処理して粘度を低下させた。溶解物を１０％Ｔｒｉｃｉｎｅゲル（Ｎｏｖｅｘ）で電気泳動することにより分離した後、ニトロセルロース・メンブランに移した。ＨＳＶ−２回復期マウス血清を用いて免疫ブロットを行い、ＥＣＬ検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で展開した。Ｖ１Ｊ：ｇＤからのＨＳＶｇＤの発現が、ＲＤ細胞の一過性形質導入により示された。Ｖ１Ｊ：ｇＤ−形質導入または擬似形質導入細胞の溶解物をＳＤＳＰＡＧＥにより分画し、免疫ブロット法により分析した。図１Ａは、Ｖ１Ｊ：ｇＤ形質導入ＲＤ細胞が約５５Ｋの見かけの分子量を有する免疫反応性蛋白質を発現することを示す。比較のため、ＨＳＶ−２（Ｃｕｒｔｉｓ）、ＨＳＶ−２（１８６）、または擬似感染Ｖｅｒｏ細胞からの溶解物が含まれる。クローン化ｇＤと感染細胞に由来する真正蛋白質との同一の移動度は、この蛋白質が完全長であり、ＨＳＶ−感染細胞におけるｇＤのものと同様にプロセッシングされ、かつグリコシル化されていることを示す。固定化Ｖ１Ｊ：ｇＤ形質転換細胞の間接免疫蛍光は、拡散細胞質信号を示した。Ｖ１Ｊｎｓ：ｇＢからのＨＳＶｇＢの発現が、ＲＤ細胞の一過性形質導入により示された。Ｖ１Ｊｎｓ：ｇＢ−形質導入または擬似形質導入細胞の溶解物をＳＤＳＰＡＧＥにより分画し、免疫ブロット法により分析した。図１Ｂは、Ｖ１Ｊｎｓ：ｇＢ形質導入ＲＤ細胞が約１４０ｋの見かけの分子量を有する免疫反応性蛋白質を発現することを示す。比較のため、ＨＳＶ−２（Ｃｕｒｔｉｓ）、ＨＳＶ−２（１８６）、または擬似感染Ｖｅｒｏ細胞からの溶解物が含まれる。クローン化ｇＢと感染細胞に由来する真正蛋白質との類似する移動度は、この蛋白質が完全長であることを示す。固定化Ｖ１Ｊｎｓ：ｇＢ形質導入細胞の間接免疫蛍光は、膜に関連する斑点状の信号を示した。Ｖ１Ｊ：ｇＣからのＨＳＶｇＣの発現が、ＲＤ細胞の一過性形質導入により示された。固定化Ｖ１Ｊ：ｇＣ形質導入細胞の間接免疫蛍光は、主として拡散細胞質信号を示した。ＩＣＰ２７の発現が、ＲＤ細胞の一過性形質導入と、続くウェスタンブロット分析により示された。ＩＣＰ２７に特異的なマウスモノクローナル抗体により、ＨＳＶ２感染細胞中の主要免疫反応性蛋白質と一致する、約６０ｋＤａの蛋白質が検出された（図１Ｃ）。実施例６ＰＮＶでの免疫化及び抗−ＨＳＶ抗体の検出５ないし６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、生理食塩中５ｍｇのケタミンＨＣｌ（Ａｖｅｃｏ、ＦｏｒｔＤｏｄｇｅ、ＩＡ）および０．５ｍｇのキシラジン（ＭｏｂｌｅｙＣｏｒｐ．、Ｓｈａｗｎｅｅ、ＫＳ．）の混合物を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することにより麻酔した。後肢を電気バリカンで剃り、７０％エタノールで洗浄した。動物に総量１００μｌの生理食塩水に懸濁したＤＮＡを注射した：各肢５０μｌ。最初に、ＨＳＶｇＤに対する免疫応答を誘発するＶ１Ｊ：ｇＤＤＮＡの能力を力価実験において試験した。１０匹のマウスの群に、２００μｇないし０．７８μｇ（８回２倍希釈）の用量範囲でＤＮＡをｉ．ｍ．注射し、あるいは生理食塩水で擬似免疫化した。免疫後４及び６週に得られた血清をＥＬＩＳＡにより分析した。このＥＬＩＳＡのため、ＨＳＶ−２糖蛋白質を５０ｍＭ炭酸塩バッファｐＨ９．５中に５μｇ／ｍｌに希釈した。ＮｕｎｃＭａｘｉ−ｓｏｒｂ平底９６−ウェルプレートを、４℃で一晩、ウェル当たり１００μｌのＨＳＶ糖蛋白質でコートした。プレートをＰＢＳｐＨ７．２で４回洗浄し、室温で１時間、ブロッキング及び希釈バッファ、２０ｍＭＴＲＩＳ−ＨＣｌｐＨ７．５、１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、０．５％ゼラチン、０．０５％トウィーン２０を用いて、非特異的反応性を低下させた。マウス血清の連続希釈を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の添加に先立ってプレートをＰＢＳで４回、蒸留水で１回洗浄し、室温で１時間インキュベートした。過剰の二次抗体を４回のＰＢＳ洗浄、次いで１回の蒸留水洗浄で除去した。ＥＬＩＳＡを、１０％ジエタノールアミンｐＨ９．８、１００μｇ／ｍｌＭｇＣｌ・６Ｈ₂Ｏ中１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェートをウェル当たり１００μｌ添加し、３７℃で展開した。４０５ｎｍで吸光度を読み取り、ＯＤ⁴⁰⁵が生理食塩水対照血清の同じ希釈物の平均プラス３標準偏差より大きければ血清希釈物を陽性と評価した。４週間で、≧６．２５ μｇのＤＮＡを投与された動物の大部分は血清陽性であった。６．２５μｇ未満の用量では血清転換した動物はより少ないが、最低用量でさえ数匹の動物がＥＬＩＳＡ陽性であった。生理食塩水注射対照動物で陽性のものはいなかった。６週で動物の大部分は血清陽性になった。７週目に、初期注射において用いられたＤＮＡ（または生理食塩水）を同用量用いて動物を再免疫化した。１０週目（第２注射の３週間後）に血清を得、ＥＬＩＳＡにより終末点力価を決定した。結果を表１にまとめる。１０週で、９３％のＤＮＡ注射マウスが血清陽性であった。０．７８μｇ用量でさえ、９匹の動物のうちの８匹が陽性であった。ＥＬＩＳＡ反応性が抗−ｇＤ抗体によるものであったことを確認するため、幾つかの高ＥＬＩＳＡ力価血清を、ＨＳＶ又は擬似感染細胞溶解物の免疫ブロットでそれらの反応性により特徴付けた。図２Ａは、Ｖ１Ｊ：ｇＤ免疫マウスからの血清が単一ＨＳＶコード化蛋白質と特異的に反応することを、ＨＳＶｇＤのものと一致する電気泳動での移動性で示す。これらを考え合わせると、これらのデータは、マウスのＶ１Ｊ：ｇＤＤＮＡ腹腔内注射がｇＤエピトープの発現とｇＤ蛋白質に対する免疫応答の発生を生じることを示す。これらの結果を拡張し、最小有効ＰＮＶ用量を確立するため、動物を１回だけ免疫する実験においてＶ１Ｊ：ｇＤの力価測定をさらに行った。マウスの群に５ｎｇないし５０μｇの範囲をとるＶ１Ｊ：ｇＤを注射した。免疫後第４、第７、及び第１０週に集めた血清をＥＬＩＳＡにより分析した；そのデータを図３にまとめる。この力価測定は、約０．５μｇＤＮＡの応答閾値を明らかにする。より少ない量のＤＮＡを投与された動物の幾らかがＥＬＩＳＡによって血清陽性であったが、その陽性応答は一過性であり、最低血清希釈でのみ生じた。≧１．６７μｇのＤＮＡ用量で、９０％を越える動物が４週で血清転換し、第７週及び第１０週で陽性のままであった。個々の動物の抗体力価の経時増加は、図３に見られる群ＧＭＴの増加によって反映されている。≧０．５μｇの用量で、ＧＭＴは第４及び第７週の間で急速に上昇する。第７及び第１０週の間に、１例を除く全てで力価は上昇し、あるいは一定に保たれる。≧０．５μｇを投与された動物の第１０週ＥＬＩＳＡ力価は、第２ＤＮＡ免疫が与えられた前の実験で達成されたものに類似する。免疫応答を惹起するのに必要なＰＮＶの量は、類似のベクターを用いる公表された報告よりも１００倍も少ないものであった。（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，１９９３，Ｖａｃｃｉｎｅ，１１，ｐｐ．９５７−９６０；及びＦｙｎａｎｅｔａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，ｐｐ．１１４７８−１１４８２）標準化プロトコルを確立するため、１回及び２回投与免疫の有効性を比較した。２回投与実験において、我々は最高（２００μｇ）用量及び最低（０．７８μ ｇ）用量で防御に有意の相違はないことを見出した。１回投与実験において力価測定を拡張した場合には、血清転換及び防御の効力を示す、ＥＬＩＳＡＧＭＴに対する用量応答が観察された。これらの応答の閾値は０．５μｇであった。しかしながら、５０ｎｇという少量のＤＮＡで血清転換が生じる。一般に、１回注射の後１０週にわたって力価は上昇し続け、２回投与実験においては第２の注射の後に力価の明白な上昇はない。結局、５０μｇの、ＤＮＡ、両実験において共通である唯一の用量で、１回及び２回投与の間に有意の相違はない。上の説明に類似する分析を、ＨＳＶ遺伝子ｇＢ及びｇＣを含むＰＮＶ構築物について行った。マウス（群当たり１０匹のマウス）を、ＨＳＶｇＢ遺伝子を有するＤＮＡ又はＨＳＶｇＣ遺伝子を有するＤＮＡを用いて、上述の通りに免疫した。血清を集め、上述のＥＬＩＳＡにおいて抗−ｇＢ又は抗−ｇＣ抗体の存在について分析した。ｇＢ抗体についてのＥＬＩＳＡデータを表２に示す。これは、Ｖ１ＪＮＳ：ｇＢで免疫されたマウスが抗−ｇＢ抗体について血清陽性であったことを示す。ｇＣ抗体についてのＥＬＩＳＡデータを表３に示す。これはＶ１Ｊ：ｇＣで免疫されたマウス（群当たり５匹のマウス）が抗−ｇＣ抗体について血清陽性であったことを示す。ｇＢに対するＥＬＩＳＡ反応性が抗−ｇＢ抗体によるものであったことを確認するため、幾つかの高ＥＬＩＳＡ力価血清を、ＨＳＶ又は擬似感染細胞溶解物を用いてそれらの反応性により特徴付けた。図２Ｂは、Ｖ１ＪＮＳ：ｇＢ免疫マウスからの血清が単一ＨＳＶコード化蛋白質と特異的に反応することを、ＨＳＶｇＢのものと一致する電気泳動での移動性で示す。これらを考え合わせると、これらのデータは、マウスにＨＳＶＰＮＶを腹腔内注射することがＨＳＶエピトープの発現とそれらのＨＳＶ蛋白質に対する免疫応答の発生を生じることを示す。実施例７ＨＳＶ中和マウス血清を、ＤＭＥＭ、２％熱不活性化ＦＢＳへの連続希釈に先立って５６℃で３０分間熱不活性化し、次いで各希釈の５０μｌを無菌ポリプロピレン９６ディープウェルプレート（ＭａｒｓｈＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）ＮＹ．）のウェルに重複させて移した。ＨＳＶ−１又はＨＳＶ−２ストックを４，０００ｐｆｕ／ｍｌに希釈した後、各試料ウェルに５０μｌのウイルスを添加し、プレートを４℃で一晩インキュベートした。モルモット補体（Ｃａｐｐｅｌ）をＤＭＥＭ、２％熱不活性化ＦＢＳに１：４に希釈し、５０μｌを各試料ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、１００μｌの血清非含有培地を各ウェルに添加し、各反応混合物を１２−ウェル・クラスタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）中の集密的ＶＥＲＯ細胞の感染に用いた。中和されたウイルス試料を３７℃で１時間吸着させた。接種物を穏やかに吸引し、単層を１ｍｌの０．５％カルボキシメチルセルロース、１×ＭＥＭ、５％熱不活性化ＦＢＳ、１０ｍＭＬ−グルタミン、２５Ｕ／ｍｌペニシリン、２５μ ｇ／ｍｌストレプトマイシン、１２．５ｍＭＨＥＰＥＳで覆った。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。被覆物を除去し、細胞単層を１％塩基性フクシン、５０％メタノール、１０％フェノールで染色した。プラークを数え、擬似免疫マウスからの血清と比較したときにプラーク数の５０％の減少を生じた血清希釈として中和力価を決定した。抗−ｇＤ抗体が生物学的に活性であるかどうかを決定するため、第０及び第７週に免疫されたマウスから選択された高力価第１０週血清をＨＳＶ−２中和活性について検定した。プラーク減少検定の結果が表４にある。Ｖ１Ｊ：ｇＤ免疫マウスからの血清はＨＳＶ−２（Ｃｕｒｔｉｓ）だけではなくＨＳＶ−１２（１８６）をも中和した。さらに、少なくとも幾つかの血清は、ＨＳＶ−１（ＫＯＳ）感染性のそれらの中和により示される型共通中和抗体を含む。幾つかの事例において中和力価が低かったものの、これらの結果は、これらの抗−ｇＤ抗体が致死的ＨＳＶ抗原投与から動物を保護し得るのではないかと思わせた。１回投与実験において≧０．５μｇのＶ１Ｊ：ｇＤで免疫された全ての動物からの第１０週血清も、ＨＳＶ−２プラーク減少検定において試験した。検定した４９の血清のうちの２９が陽性、１：１０希釈で＞５０％減少であった。１６．７及び５０μｇ用量レベルで、各群からの１０の血清のうちの９が中和陽性であった。実施例８ＨＳＶ抗原投与抗原投与ウイルスのストックを、上述のように、集密的ＶＥＲＯ単層にＨＳＶ −２Ｃｕｒｔｉｓを感染させることにより調製した。清透化上清ウイルスをＶＥＲＯ細胞上で力価測定し、そのアリコートを−７０℃で保存した。動物をｉ．ｐ．注射により０．２５ｍｌのウイルスストックで感染させた後、３週間観察した。生存データをログ−ランク試験（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔｅｔａｌ．，１９８９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１６９，ｐにおいて分析した。≦０．００１の蓋然性の相違を高度に有意であると判断した。初期ＤＮＡ注射の１１週間後、２用量のＶ１Ｊ：ｇＤで免疫されたマウスにｉ．ｐ．注射により１０５．７ｐ．ｆ．ｕ．のＨＳＶ−２（Ｃｕｒｔｉｓ）を抗原投与し、２１日間観察した。生存データが図４にある。僅か０．７８μｇのＶ１Ｊ：ｇＤで免疫された動物が致死的感染から有意に保護されたことが容易に認められる。死亡した３匹の動物のうち２匹は、第１０週に、ＥＬＩＳＡで血清陰性であった。生存する動物の幾らかは、毛並みの不足、成長の不足、又は背を丸める姿勢を含む一過性の疾患の徴候を示した。ＤＮＡの全ての用量で達成される死からの保護のレベルは有意であった（ｐ＜０．０１）が、これらの症状はブレークスルー感染が幾らか生じたことを示唆している。回復期動物から得られた血清の分析が、ＨＳＶ−２感染Ｖｅｒｏ細胞溶解物の免疫ブロットにおけるそれらの反応により特徴付けられた。幾つかの事例においては血清はｇＤのみを認識し、別のものでは血清は多くのＨＳＶ蛋白質と反応した。これらの結果は、少なくともＨＳＶ感染を経験したマウスの幾匹かと一致する。１回ＤＮＡ注射で免疫された動物に上述の通りに抗原投与した。生存データは図５に提示される。≧１．６７μｇのＶ１Ｊ：ｇＤを投与された動物の群においては、死に対する統計的に有意（ｐ＜．００１）の防御が得られた。この生存用量応答はＥＬＩＳＡ力価（図３）に見られるものに類似する。２回投与実験において見られたように、数匹の生存マウスが観察期間中に疾患の一過性徴候を示した。高用量のＤＮＡ（１６．７及び５０μｇ）で免疫された生存動物は、観察期間を通じて毛並みがよく、健康な外見のままであった。ＨＳＶｇＢ又はｇＣを含むＰＮＶ構築体で免疫された動物にも、ｇＤについて上述されるように、致死的用量のＨＳＶで抗原投与した。Ｖ１Ｊｎｓ：ｇＢで免疫された動物の生存データを図６に示し、Ｖ１Ｊ：ｇＣで免疫した動物の生存データを図７に示す。これらは、死からの保護が得られたことを示している。これらの結果は、ＨＳＶ感染の予防における直接ＤＮＡ免疫の潜在能力を示す。糖蛋白ｇＤをモデルとして用いて、僅か０．５μｇのＶ１Ｊ：ｇＤＤＮＡの１回ｉ．ｍ．注射が、致死的ＨＳＶ抗原投与に対する統計的に有意の防御を供与する、ｇＤに対する中和抗体応答を誘発することが見出された。２回投与処方における僅か３．１３μｇのＤＮＡでの免疫は、全ての動物を死から保護した。実施例９ＨＳＶＰＮＶを用いるモルモットのワクチン接種各々約２００−２５０ｇの体重のハートレー種モルモット（ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙＬａｂｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、ウイルス抗原投与の１１及び４週間前に、右大腿部に０．１ｍｌ及び左大腿部に０．１ｍｌ筋肉内にワクチン接種した。各ワクチン接種のため、ワクチンの新鮮な溶液及びプラセボが我々に送られた。これらの動物におけるＨＳＶ−２抗体の生成を測定するため、これらのモルモットを第１のワクチン接種の後５週間及び第２のワクチン接種の後２週間飼育した。趾を切ることにより血液（動物当たり０．６−１ｍｌ）を得た。血液を微小分離管（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）に集め、後に１０００×ｇで１０分間遠心して血清を分離した。これらのモルモットから集められた血清を、実施例６に説明されるＥＬＩＳＡを用いて、抗−ＨＳＶ抗体の存在について分析した。結果を表５に示す。感染の時点で、モルモットは各々６００−７００ｇ重であった。これらを膣内で単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）、Ｅ１９４株に感染させた。これは、３工程プロセスで成し遂げた。第１に、各動物の膣を０．１ＮＮａＯＨに浸した木綿チップアプリケーターで５秒間拭った。この処理は膣領域を刺激し、その結果感染が良好に生じる。約４５−６０分後、各膣の乾燥拭いを５秒間行った。その後、各モルモットを２０秒間拭うのにウイルス培地（ｍｌ当たり約５×１０⁶プラーク形成単位のＨＳＶ−２）に浸したアプリケーターを用いた。この拭いは、それらがその場所にある間、穏やかに、かつゆっくりと前後に曲進させるものであった。感染動物における病変スコアを、感染後第２−１５日、毎日測定した。スコア１＋は肛門−膣面積の２５％が冒されたことを示し（通常、膣のすぐ周辺の赤みにより）；２＋は肛門−膣の５０％が冒されたことを示し；３＋は７５％が冒されたことを示し：かつ４＋は１００％が冒されたことを示す。数匹の動物が途中で死亡したため、死亡時近くの病変スコアを１５日間の最後に移した。これを行わなかったならば、冒された動物のほとんどが死に去ってしまうため、平均病変スコアは低下するものと思われる。死亡は２１日間毎日記録した。平均死亡日の算出には、死亡したモルモットのみを考慮した。後肢麻痺を有する動物の数には感染を通して注目した。膣のウイルス力価は、ウイルス接種の１、４及び６日後に膣を拭うことにより得られたウイルスの力価測定によりなした。これらのスワブを１ｍｌの細胞培養培地を収容する管に入れた。これらの試料の力価測定を、９６−ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞において行った。ウイルス力価の算出は、ＲｅｅｄＬ．Ｊ．及びＭｕｅｎｃｈＭ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．２７，４９３−４９８（１９３８）の５０％終末点希釈法により行った。ウイルス力価は、ｍｌ当たりのｌｏｇ１０細胞培養物感染用量で表した。生存（フィッシャー精密試験（Ｆｉｓｈｅｒｅｘａｃｔｔｅｓｔ））、死亡までの平均日数（マン−ウィットニーＵ試験（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵｔｅｓｔ））、麻痺（フィッシャー精密試験）、膣ウイルス力価（マン−ウィットニーＵ試験）及び膣病変スコア（マン−ウィットニーＵ試験）の統計学的解釈は両側分析により行った。図８は、ＨＳＶ−２感染モルモットにおける生存、死亡までの平均日数、麻痺、及び膣ウイルス力価の結果を示す。高用量のワクチンは、プラセボ対照に対して、死亡率を下げ、第２及び第４日の膣ウイルス力価を減少した。高用量のワクチンは、これらの動物において、麻痺を有意に予防した。低容量のワクチンも上記パラメータを低下させた。表７は、この実験についての毎日の膣病変スコアを示す。高及び低容量のワクチンの両者は、プラセボ群と比較して、感染の第３日から第１５日に膣病変重篤性の有意の低下を引き起こした。表７の結果を図９に図式的に示す。これらの結果は、このワクチンがＨＳＶ−２に感染したモルモットにおいて防御的であり、高用量のワクチンが低用量よりも活性であることを明白に示す。高用量のワクチンは、被ワクチン接種体からウイルスが回復し、低グレードの膣病変の発達が起こるため、感染を完全にブロックすることはできない。それにもかかわらず、この用量のワクチンで得られる防御の程度は相当なものであった。この抗体研究の結果は抗ウイルス防御と相互に関連する。膣内ＨＳＶ−２抗原投与の１１及び４週間前に、２つの異なる用量でモルモットに筋肉内投与されたワクチンは、この疾患から動物を有意に保護した。高用量のワクチンは低用量よりも有効であった。このワクチンはこれらの動物では安全であるように思われる。実施例１０ＰＮＶＨＳＶを筋肉内にワクチン接種されたマウスが粘膜ＨＳＶ−特異的抗体を生成するかどうかを決定するため、マウスを１２．５又は１．５６μｇのＶ１Ｊｎｓ：ｇＤを用いてワクチン接種した。膣の液体を拭うことにより集め、このスラブからリン酸緩衝生理食塩水を用いて抗体を溶出した。この溶出液をＨＳＶ−２蛋白質に特異的なＩｇＧ及びＩｇＡの存在について分析した。このマウス試料中のＨＳＶ−特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの存在の検出にマウスＩｇＧに特異的な市販抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）及びマウスＩｇＡに特異的な市販抗体（Ｓｅｒａｌａｂ）を用いたことを除いて、上述の通りにＥＬＩＳＡを行った。ＩｇＧについての結果を表８に示す：ＩｇＡはいかなる動物においても検出されなかった。これらの結果は、Ｖ１Ｊ：ｇＤがワクチン接種されたマウスにおけるＨＳＶ− ２に特異的な粘膜ＩｇＧの存在を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ (72)発明者キース，ロバート・デイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ルイス，ジヨン・エイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者リウ，マーガレツト・エイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者マクレメンツ，ウイリアム・エルアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．脊椎動物組織に導入された際に抗−ＨＳＶ抗体又は防御免疫応答を誘発するポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが１以上のＨＳＶ蛋白質又はそれらの機能的等価物をコードする１以上の遺伝子を含み、該遺伝子が転写プロモーターに作動可能に結合しているポリヌクレオチド。２．前記遺伝子が、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ＩＣＰ２７、及びそれらの機能的等価物からなる群より選択されるＨＳＶ蛋白質をコードする請求項１記載のポリヌクレオチド。３．ヒト以外の脊椎動物においてＨＳＶエピトープに対する免疫応答を誘発する方法であって、１ｎｇ〜５ｍｇの請求項１記載のポリヌクレオチドを脊椎動物の組織に導入することを包含する方法。４．ＨＳＶに対する免疫応答を誘発するワクチンであって、請求項１記載のポリヌクレオチド及び薬学的に許容し得る担体を含有するワクチン。５．ＨＳＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、ヒト以外の脊椎動物の組織に、ＨＳＶ感染を予防し、及び／又はＨＳＶ疾患を改善する免疫応答を誘発する１以上の単離され、かつ精製されたＨＳＶ遺伝子を導入することを包含する方法。６．ａ）真核性転写プロモーター；ｂ）該プロモーターに作動可能に結合する、１以上のＨＳＶエピトープをコードするオープン・リーディング・フレーム及び翻訳終止シグナル；並びにｃ）任意に、１以上の作動可能に結合するＩＲＥＳ，１以上のさらなる遺伝子をコードする１以上のオープン・リーディング・フレーム、及び１以上の転写ターミネーターシグナル、を含むポリヌクレオチド。７．前記ｃ）のさらなる遺伝子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、インターフェロン、及びＴ細胞共同刺激蛋白質のＢ７ファミリーの一員からなる群より選択される免疫調節又は免疫刺激遺伝子である請求項６記載のポリヌクレオチド。８．前記ａ）のＨＳＶ遺伝子が、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ＩＣＰ２７、及びそれらの機能的等価物からなる群より選択されるＨＳＶ蛋白質をコードする請求項６記載のポリヌクレオチド。９．前記ｃ）の更なる遺伝子が、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ＩＣＰ２７、及びそれらの機能的等価物からなる群より選択されるＨＳＶ遺伝子である請求項６記載のポリヌクレオチド。１０．ヒト以外の脊椎動物組織内に導入された際に抗−ＨＳＶ抗体又は防御免疫応答を誘発するポリヌクレオチドを用いて治療の必要なヒト以外の脊推動物を治療する方法であって、該ポリヌクレオチドが１以上のＨＳＶ蛋白質又はそれらの機能的等価物をコードする遺伝子を含み、該遺伝子が転写プロモーターに作動可能に結合している方法。１１．前記ポリヌクレオチドが、ｇＢ、ｇＣ，ｇＤ、ｇＨ、ｇＬ、ＩＣＰ２７、及びそれらの機能的等価物からなる群より選択される１以上のＨＳＶ蛋白質をコードする遺伝子を含む請求項１０記載の方法。