JPH10501422A - 血栓溶解酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 提案された血栓溶解酵素は、合成基質、安定化フィブリン、及び、部分アミノ酸配列及び同一ファミリーの対応する２個の付加的遺伝子に対応する構造を有するＤ−Ｄフラグメント中のエキソ−及びエンド−ε−（γ−Ｇｌｕ−）Ｌｙｓイソペプチド結合を加水分解することができ、グリシン残基が、蛋白質一次構造の１５、２１、２４、２８、３３、４６、４９及び５０位に見られる。提案された、唾液又は調製物から血栓溶解酵素を製造する方法は、薬用ヒルから血栓溶解酵素を抽出し、天然酵素に対する抗体を固定化したアフィニティークロマトグラフィーと、それに続くイオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過からなる。

Description

【発明の詳細な説明】 血栓溶解酵素及びその製造方法 発明の分野 薬の分野における本発明は、止血学及び薬理学に関し、また、血栓溶解生物学 的活性製剤としての臨床医学及び実験医学への利用を企図する。 先行技術 現在、種々の起源の、薬用ヒル唾液腺分泌液の使用が、血栓溶解及び繊維素溶 解活性を有する生物学的に活性な物質の調製に用いられている。生物学的活性物 質の起源である、薬用ヒルの天然の分泌液の実用的、薬用ヒルの血栓溶解効果の ヒルドセラピー(hirudotherapy)(Zaitsev G.B．"Thrombophlebitis"，1947，Med giz，Moscow，p.78)における治療中に使用する場合の、異なる病因の血栓性静脈 炎の治療効果の相関関係の決定に起因する。 薬用ヒルの唾液腺分泌の使用は、新しい特性への転換のための新しい機構の発 見に起因する。 薬用ヒルの唾液腺分泌液の特性の解析の際に、分泌液が、カゼイン及び非安定 化フィブリンを基質として用いた場合に、蛋白質白分解活性をほとんど完全に有 さないことが分かった。けれども、第XIII因子で架橋結合した、非溶解性の安定 化フィブリンとインキュベーションする間、分泌液は、溶解状態へと変換でき、 フィブリンの安定度は高められる。即ち、多くのε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ− イソペプチド結合がフィブリン調製品の中にある。この一見して逆説的の状況は 、我々によって、ヒル分泌液組成物中の酵素の存在によること、特に、安定化フ ィブリンにおけるイソペプチド結合を加水分解し、そのようなイソペプチド結合 の存在しない非安定化フィブリンにおいては作用しない酵素の存在によることが 説明された。該酵素はデスタビラーゼと呼ばれた(Biokhimiya 50，1985，Nauka ，Moscow，pp.424-431)。 公知の血栓溶解酵素及び繊維素溶解酵素は、フィブリンにおいて、第XIII因子 のトランスペプチダーゼ活性の結果として形成される（γ−Ｇｌｕ）−Ｌｙｓ− イソペプチド結合を有する、架橋フィブリンの程度と関係なく、ペプチド結合の 加水分解を触媒する。通常、イソペプチド結合と「結合した」か、安定化された フィブリンは、非安定化フィブリンよりも、蛋白質白分解酵素の影響に対してよ り耐性である。同時に、非安化フィブリンは、繊維素溶解酵素によって刺激され た蛋白質分解の結果として可溶性の状態に変化するだけでなく、非特異的薬剤の 下で、フィブリン単量体間の、イオン性で、疎水性で、かつＨ−Ｏ相互作用を弱 める。 発明の開示 本発明は、トロンビン(thrombi)を溶解する能力を有する、エキソ−イソペプ チダーゼ及びエンド−イソペプチダーゼ活性の両方のアミド分解酵素活性を有す る血栓溶解酵素、その特性及び製造方法に関する。該酵素はトロンビン分子量及 びアミノ酸配列によって薬用ヒルから得られた公知の調製物と区別される。 デスタビラーゼ酵素の製造方法は以下のようにして行われる。 薬用ヒルからの抽出物に対して、デスタビラーゼに対する抗体をセファロース ４Ｂに固定させたカラム上で、アフィニティークロマトグラフィーを実施する。 カラムを０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ＝７.４で平衡化する。未結合の蛋 白質を上記緩衝液で洗浄し、デスタビラーゼを０.３Ｍ塩化ナトリウムを含む上 記緩衝液で溶出する。得られた調製物に対して、０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液 、ｐＨ＝７.４で平衡化させた、ＣＭ−トリアクリル酸吸着剤のカラムで再びク ロマトグラフ分析を行う。所望の生成物は、０.０５〜０.２０Ｍ塩化ナトリウム を溶解した同一の０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液で溶出する。最終生成物を含む 画分を集め、スペローズ(Superose)−１２によるゲル濾過で脱塩を行い、凍結乾 燥する。得られた調製物は、１００％活性のある物質を含有する。精製の程度は 電気泳動により確認した。 一次構造 一次構造を確認するため、アセトニトリル０〜６０％の勾配で酵素をアクアポ ール(Aquapore)ＲＰ−３００（４.６×１００）の逆相カラムに６０分間かけて 、クロマトグラフ分析を行った。デスタビラーゼのＮ末端が決定された。スレオ ニンは、Ｎ末端アミノ酸として決定した。次いで、デスタビラーゼのブロモシア ンで加水分解を行い、得られた混合物について、同一の条件で同一のカラムで再 びクロマトグラフ分析を行った。その結果、４個のペプチドフラグメントが得ら れた。第１のフラグメントのアミノ酸配列を決定したところ、２５アミノ酸残基 からなり、ＮＨ₂−末端にスレオニン残基を有し、以下の配列：Thr Val Pro Ser Asp Cys Leu Arg Cys Ile Cys Gln Val Glu Gly Cys Asn Asn Glu Ile Gly Arg Cys Gly Met からなっていた。 Ｎ−末端にアスパラギン酸を有する、Ｎ−末端から２８個のアミノ酸残基のア ミノ酸配列が第２のフラグメントとして決定され、以下の配列：Asp Ala Gly Se r Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Gln Ile Lys Glu Pro Tyr X Ile Asp X Gly Arg Pr o Gly Gly X Tyr Gln からなっていた。 Ｎ−末端にアスパラギン酸を有する、Ｎ−末端から２４個のアミノ酸残基のア ミノ酸配列が第３のフラグメントとして決定され、以下の配列：Asp Arg Tyr Al a Pro Pro Cys Thr Gly Gly Arg Gln Pro Thr Cys Gln Asp Tyr Ala Lys Ile Hi s Asn Met からなっていた。 Ｎ−末端から１０個のアミノ酸残基の部分配列が第４のフラグメントとして決 定され、以下の配列：Gly Pro Asn Gly Cys Gln Ser Leu Asn Asn からなってい た。 グリシンはＮ−末端アミノ酸である。 標準的な工程を用い、ｍ−ＲＮＡを薬用ヒルから分離した。最初のｃ−ＤＮＡ 鎖を、基礎となる逆転写酵素を用いて合成した。デスタビラーゼをコードするＤ ＮＡの増幅は、先行する段階において得られる第１のｃ−ＤＮＡ鎖、及びデスタ ビラーゼのアミノ酸配列に基づいて選択されたプライマーを用いたポリマー連鎖 反応にもたらされる。その結果、予想された長さのＤＮＡフラグメント(102ヌク レオチド対)が得られた。得られたＤＮＡフラグメントのクローニング及び配 列の決定は標準的な方法で行った(Maniatia ら，1982; Tabor，Richardson，198 7)。その結果、１０個の独立クローン、及び２個の異なるＤＮＡ配列、ＤＳ１及 びＤＳ２が検出された。ヌクレオチド配列ＤＳ１及びＤＳ２の相違点から、密接 に関係のある蛋白質をコードするヒルゲノム中の遺伝子ファミリーがあることが 分かった。 ＤＳ１の部分配列及びＤＳ２の完全なヌクレオチド配列を下記に示す。 ヌクレオチド配列 ＤＳ１： リーダー： 構造部分： ヌクレオチド配列 ＤＳ２： リーダー： 構造部分： 本発明を実施するための最良の方法 デスタビラーゼ酵素の製造方法は、下記の実施の具体例によって示される。 実施例１ 少なくとも３ヶ月飢えさせた薬用ヒルを肉粉砕機に通し、生理食塩溶液で抽出 した。抽出物を、デスタビラーゼに対する抗体を固定し、０.０２Ｍトリス−塩 酸 緩衝液、ｐＨ＝７.４で平衡化したセファロース４Ｂのカラムにかけた。酵素を 、０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ＝７.４に溶解した０.３Ｍ塩化ナトリウ ムで溶出した。画分を集めた。得られた溶液（８ｍｌ、蛋白質濃度０.５ｍｇ／ ｍｌ）を０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ＝７.４で平衡化したＣＭ−トリア クリル酸吸着剤のカラムにかけた。デスタビラーゼ酵素は０.０５〜０.２０Ｍ塩 化ナトリウムの勾配で溶出した（図１）。脱塩を、スペロース−１２のゲル濾過 で行った。デスタビラーゼに対応するピーク位置は、画分のアミド分解活性（基 質：Ｌ−γ−Ｇｌｕ−ｐＮａ）によって決定し、３.１０ｃａｔ／ｍｇであった （図２）。 この方法は、出発抽出物に対し、酵素の２４００倍の精製を可能にする。蛋白 質の収率は、出発蛋白質混合物の０.１％である。調製物の均一性は、ポリアク リルアミドのゲルによる電気泳動法により確認した。 実施例２ ４ヶ月以上飢えさせた薬用ヒルを細かく砕き、生理食塩溶液で抽出した。抽出 物を、デスタビラーゼに対する抗体を固定し、０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、 ｐＨ＝７.２で平衡化したアガロース６Ｂのカラムにかけた。デスタビラーゼを ０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ＝７.２に溶解した０.２Ｍ塩化ナトリウム で溶出した。アミド分解活性（基質：ε−γ−Ｇｌｕ−ｐＮａ）を有する画分を 一緒にし、０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ＝７.２で平衡化したＤＥＡＥ− セファデックスＡ−Ｌ５０のカラムに通した。得られた画分をＣＭ−セルロース カラムにかけ、０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ＝６.５に溶解させた０.１ 〜０.３Ｍ塩化ナトリウムの勾配で溶出した。 アミド分解活性を有する画分を一緒にし、セファデックスＧ−２５を通したゲ ル濾過により脱塩を行った。 結果として２５００倍の精製が達成された。最終のデスタビラーゼのアミド分 解活性（基質：Ｌ−γ−Ｇｌｕ−ｐＮａ）は７.１０〜９ｃａｔ／ｍｇであった 。 蛋白質の収率は、出発の蛋白質混合物の含有量に対し、０.１２％であった。 酵素の均一性は、ポリアクリルアミドのゲルによる電気泳動法による確認した。 新規血栓溶解酵素、デスタビラーゼのシステイン残基の高い含有量によって特 徴づけられる一次構造、物理化学的、運動論的特性の研究の結果として、以下の 特性が確認された。 ＵＶ−スペクトル λ＝２７８ｎｍの最大吸収に特徴がある。 分子量 デスタビラーゼの単量体の分子量は、１２６００±３００Ｄａである。それは 、スペロース−１２カラムによる高い効果的なゲル濾過法（０.０２Ｍトリス− 塩酸、ｐＨ＝７.０）及び１％ＳＤＳを含む４〜１６％ＰＡＡＧの勾配電気泳動 により決定された。 イソペプチダーゼ活性 イソペプチダーゼ活性は、天然基質（安定化フィブリンの限定された蛋白質分 解の生成物）におけるイソペプチド結合を加水分解する酵素の能力により決定さ れ、フィブリンのγ−γ結合の間のＤ−フラグメント（Ｄ−Ｄ−二量体）の二量 体は維持される(Thromb．Res.，71，1993，Elsevier Science Ltd.，US，pp.241 -244)。この点を明記して、０.１〜２.０μｇの酵素が５０μｇのＤ−Ｄ−二量 体を、０.０２Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ＝８.０中で１０〜７０時間インキュベ ーションする。インキュベーション混合物の全容量は１００μＬである。反応に よって、Ｄ−Ｄ−二量体中のイソペプチド結合の加水分解とＤ−単量体の生成が 観察され、それらの蓄積はＰＡＡＧの電気泳動法を用いて追跡される。新規蛋白 質は、安定化フィブリンのクロットの溶解、フラグメントＤの二量体及びジイソ ペプチドγ−Ｇｌｕ−ε−Ｌｙｓのγ−Ｇｌｕ−ε−Ｌｙｓジイソペプチド結合 の加水分解を起こすことが証明された。 アミド分解活性 アミド分解活性は、Baskova I.P.らの方法による、ニトロアニリンの形成をも ってγ−Ｇｌｕ−ｐＮＡ中のアミド結合を加水分解する能力によって決定される (Biokhimiya，55，1990，Nauka，Moscow，pp．674-679)。この測定を行うために 、酵素溶液１０〜１００μＬを、０.０２Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ＝８.０を 含む試料及び０.０５ｍｇ／ｍｌのγ−Ｇｌｕ−ｐＮＡに、全容量が０.５ｍｌに なるように添加し、２５℃で５〜３０分間インキュベートする。反応は、４０５ ｎｍの波長の分光光度測定により追跡される。 新規酵素は、γ−Ｇｌｕ−ダンシルカダベリン、Ｐ１の位置に塩基又は疎水性 アミノ酸を含有するトリプシン及びキモトリプシンの低分子量基質のアミド結合 を加水分解することが証明された(Blood Coagulation and Fibrinolysis，2，19 90，Rapid Communications of Oxford Ltd.，GB,pp．167-172)。 熱安定性範囲 酵素は、２２〜３７℃で８０時間、７℃で１５日間、７５℃で１５分間活性を 保持した。 ｐＨ安定性 １.５〜８.５のｐＨで活性が保持される（３７℃、７日間、基質γ−Ｇｌｕ− ｐＮＡ）。 一次構造 一次構造を決定するため、酵素に対して、アグマポーク(Agmapoke)ＲＰ−３０ ０（４.５×１００）の逆相カラムで、１分間、０〜６０％のアクリロニトリル の濃度勾配でクロマトグラフ分析を行った。デスタビラーゼのＮ−末端を決定し た。４１番目のアミノ酸残基が確認された。スレオニンがＮ末端アミノ酸として 決定された。次いで、デスタビラーゼのブロモシアン加水分解を行い、得られた 混合物について、再び同一のカラムで同一の条件でクロマトグラフ分析を行った 。その結果、４個のペプチドが得られた。第１のフラグメントのアミノ酸配列は 完全に決定され、それは２５個のアミノ酸残基からなり、そのＮ末端にスレオニ ン残基を有する。 第２のフラグメントとして、Ｎ末端から２８個のアミノ酸残基であって、その ＮＨ₂末端がアスパラギン酸であるものが決定された。グリシンはＮ−末端アミ ノ酸である。 第３のフラグメントとして、Ｎ末端から２４個のアミノ酸残基であり、そのＮ Ｈ₂末端のアスパラギン酸であるものが決定された。 第４のフラグメントとして、Ｎ末端から１０個のアミノ酸残基であり、そのＣ 末端から５個のアミノ酸残基が決定された。 血栓溶解活性 デスタビラーゼ酵素の血栓溶解活性は、動物実験で解析された（２００ｇの体 重のラット）。トロンビンの形成は、ガラスで活性化された血清の投与及びそれ に続く頚静脈部位におけるうっ血によって、動物の頚静脈中で刺激される(Circu lation，20，1959，American Heart Association，US，pp.864-867)。従って、 形成される血栓は、静脈の対応している部分に結紮を適用することによって固定 される。コントロール動物は０.２ｍｌの生理食塩液を静脈注射され、一方、実 験動物は、蛋白質を０.７２ｍｇ含有するデスタビラーゼの同量の溶液を静脈注 射される。血栓の溶解は、調製剤の投与後６７時間で８５％であることが観察さ れ、投与後１３７時間で１００％であった。コントロール動物群で、自発的な血 栓溶解は、生理食塩液の投与後６７時間で１７％であり、投与後１３７時間で２ ３％であった(Blood coagulation and Fibrinolysis，2，1990，Rapid Communic ations of Oxford Ltd.，GB，pp.167-172)。 産業上の適用 本発明は、臨床医学及び実験医学のための血栓溶解性生物学的活性調製剤とし て用いられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/22 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/435 14/435 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 バスコーヴァ イゾルダ ポルフィリエヴ ナ ロシア連邦 123100 モスコウ ステュー デネツキ ペレウロク デー６ ケーヴィ 50 (72)発明者 ザヴァロヴァ リュードミラ ルヴォヴナ ロシア連邦 117296 モスコウ ロモノソ ヴスキ プロスペクト デー14 ケーヴィ 435 (72)発明者 ルキアノフ セルゲイ アナトリエヴィッ チ ロシア連邦 117574 モスコウ ウリッサ ゴルビンスカヤ デー９ ケーヴィ 625 (72)発明者 バルソーヴァ エカテリーナ ウラディミ ロヴナ ロシア連邦 113570 モスコウ ウリッサ ドネプロペトロフスカヤ デー35 コル プス３ ケーヴィ 14 (72)発明者 ボグダノヴァ エカテリーナ アンドレエ ヴナ ロシア連邦 117465 モスコウ テプリ スタンデー３ コルプス１ ケーヴィ 45

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．合成基質、安定化されたフィブリン及びそのＤ−Ｄ−フラグメント中のエキ ソ−及びエンド−ε−（γ−Ｇｌｕ−）Ｌｙｓイソペプチド結合を加水分解する ことができる血栓溶解酵素であって、 対応する遺伝子構造を有し、かつその同一ファミリーからの２個の付加的遺 伝子を有する部分的アミノ酸配列によって特徴付けられ、しかも、その蛋白質の 一次構造中、１５、２１、２４、２８、３３、４６、４９及び５０位のグリシン 残基の存在によって区別されることを特徴とする血栓溶解酵素。 ２．薬用ヒル唾液腺分泌液又は該分泌液を含有する調製物から得られる請求項１ 記載の血栓溶解酵素の製造方法において、 固体担体に固定化された天然酵素に対する抗体のアフィニティークロマトグ ラフィーを行い、続いてイオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過により酵素 を精製することを特徴とする方法。