【発明の詳細な説明】
細胞培養由来コラーゲン
発明の分野
本発明は細胞培養系内のコラーゲン産生細胞からコラーゲンを産生するための
方法に関する。本発明は細胞培養から試験管内(in vitro)で合成したコラーゲン
にも関する。合成コラーゲンはバイオメディカル用、バイオテクノロジ用、化粧
品の用途に有用である。
発明の背景
コラーゲンは哺乳類の細胞外マトリクスの主要な蛋白質性成分である。コラー
ゲンの主な役割は、骨格を付与して組織を支持すること(Eyre,Science,207 :
1315 - 1322(1980)による)だが、コラーゲンについて他にも多くの機能が解明さ
れており、これには細胞接着(cell attachment)、細胞体内移行、濾過、形態形
成における役割が含まれる(Myas et al.,Biochemical Journal,276 :307 - 3
13(1991))。コラーゲンは、いくつかの共通する構造的および機能的特性を共有
し密接に関連している蛋白質のスーパーファミリーであり、これはアミノ酸グリ
シン−X−Yの反復三つ組(triplet)(ここでXはプロリンであることが多く、ま
たYはハイドロキシプロリンであることが多い。)を有する3重らせん領域を含
んでいる。ハイドロキシプロリンは間質原線維コラーゲンのほぼ12%(w/w
)を構成するもので、補体成分Clq、エラスチン、アセチルコリンエステラー
ゼ、コングルチニン、I型およびII型マクロファージ・スカベンジャー受容体、
マンノース結合蛋白、肺胞表面活性物質アポリポプロテインAおよびDなどを含
む他のいくつかの蛋白質だけにみられるが、それらの蛋白質における構成比はコ
ラーゲンに比べて極めて低い(Mays and Laurent,in”Molecular Biology of Lu
ng Disease”(Barnes and Stockley eds.)Blackwell
Scientific Publishers,UK;1994, pages 216 - 260)。従って、コラーゲンの
同定および定量のためのアミノ酸としてハイドロキシプロリンが頻繁に用いられ
る(Udenfriend,Science,152:1335 - 1340(1966))。
現在、19種の特徴づけられたコラーゲン(コラーゲンIからコラーゲンXIX
と呼ばれる)および2種類の充分な定義がなされていないコラーゲンがあり、こ
れらは異なる遺伝子座に由来する。Kivirikko,Annals of Medicine,25:113 -
126(1993);Mays and Laurent,in”Molecular Biology of Lung Disease”,s
upra.Myers et al.,Journal of Biological Chemistry 269:18549 - 18557(1
994)。別種のコラーゲンは体内で極めて異なる分布を示し、これを表1に掲載す
る。コラーゲンIは哺乳類でもっとも優位なコラーゲンの形態であり、全身に渡
り皮膚、骨、筋、腱、肺臓に遍在性に分布する。コラーゲンIVは基底膜にみられ
る。コラーゲンVIIとコラーゲンXVIIは皮膚/真皮接合部に局在している。表1
に図示してあるように、生体内(in vivo)、試験管内(in vitro)とも、種類の異
なるコラーゲンが特定の種類の細胞から合成される。
コラーゲンIは間質原線維コラーゲンのプロトタイプであると考えられており
、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、上皮細胞を含む各種細胞の大多数により
合成される。コラーゲンIはα1(I)およびα2(I)の2種類の異なるポリ
ペプチドα鎖から構成され、2本のα1(I)鎖と1本のα2(I)鎖が互いに
折れ曲って3重らせんコラーゲン分子構造を形成している。コラーゲン分子はプ
ロコラーゲンと呼ばれる大型の前駆体として合成され、前駆体において3重らせ
んコラーゲン分子はプロペプタイドと呼ばれる2個の大きな球状突起を有してい
る。ヒトにおいて、プロα1(I)鎖およびプロα2(I)鎖は異なった2か所
の遺伝子座で暗号化されており、プロα1(I)は17番染色体のCOL1A1
部位によりq21.3−q22.05で、またプロα2(I)は7番染色体のC
OL2A1部位によりq21.3−q22.1で暗号化されている。個々のコラ
ーゲンα鎖の遺伝子は核内でRNAに転写されてからmRNAにスプライスされ
る。mRNAは細胞質へ運搬され、ここで翻訳されて蛋白質を合成する。増殖す
るコラーゲン・ポリペプタイドは細胞内区画へのエントリと一致して加水分解的
に開裂した信号ペプタイドにより小胞体へ転座する。小胞体で
は、α鎖が、プロリンやリシンをそれぞれ水解する酵素であるプロリル4−ハイ
ドロキシラーゼ(EC1.4.11.2)やリシル・ハイドロキシラーゼ(EC1.14.11.4)によ
って後翻訳的に修飾され、数個の糖残基が分子に配置される。Kivirikko and My
llya,in ”Extracellular Matrix Biochemistry”(Piez & Reddi eds.)Elsev
ier,1984,pages 83 - 118)。2個のα1(I)鎖と1個のα2(I)鎖のC
末端はおそらく蛋白質の熱ショック群のひとつである分子シャペロンのコリジン
によって相互に引寄せられる。Clarke et al.,Journal of Cell Biology,121:
193 - 199(1993);Nakai et al.,Journal of Cell Biology,117:903 - 914(1
992)。C末端の初期配置はジスルフィド架橋により安定化されα鎖はC末端から
N末端への3重らせんに折り畳まれる。Gelman et al.,Journal of Biological
Chemistry,254:11741 - 11745(1979)。この折り畳みは、プロリル4−ハイド
ロキシラーゼの作用によってY位置プロリンがハイドロキシプロリンへ完全に水
解される時にだけ発生する。折り畳まれると、プロコラーゲン分子はゴルジ装置
へ搬送され、ここで分泌小胞へとパッケージされる。プロコラーゲンは細胞表面
の陥入襞に分泌される。分泌の際に、またはその直後に、プロコラーゲン・ペプ
タイドは特定のC−およびN−プロテイナーゼにより水解的に開裂する。Hojima
et al.,Journal of Biological Chemistry,260:15996 - 16003(1985);Hojim
a et al.,Journal of Biological Chemistry,264:11336 - 11345(1989)。開
裂したプロペプタイドはプロコラーゲン遺伝子発現を阻止する負のフィードバッ
クを行うと信じられている。Wu et al.,Journal of Biological Chemistry,26
6: 2983 - 2987(1991);Fouser et al.,Proceedings of the National Academy
of the Sciences of the United States of America,88:10158 - 10162(1991
)。プロペプタイドの開裂により遊離した3重らせんコラーゲン分子は、分子の
どちらかの末端にテロペプタイドと呼ばれる2本の短い非らせん延長部を含む。
コラーゲン分子は即時的に相互作用して、陥入した細胞表面に4本脚の構造を形
成する。テロペプタイドは細胞外コラーゲンの4本脚構造を安定させる上で重要
な役割を果たす。4本脚構造になると、酵素リシル・オキシダーゼ(プロテイン
・リシン6−オキシダーゼ、EC1.4.3.13)がC−およびN−テロペプ
タイド双方の特定のリシン残
基またはハイドロキシリシン残基のイプシロン・アミノ基を酸化してアルデヒド
カルボニルのα−アミノアジピン酸デルタ・セミアルデヒドにする。アルデヒド
カルボニルは非常に反応性が高く、未反応リシン残基の隣接するアミノ基と瞬間
的に縮合して共有架橋を形成する。リシン残基が隣接するコラーゲン分子に存在
する場合、得られる架橋は4本脚のコラーゲン原線維を安定させる。時間の経過
とともに、これらの架橋はアマドリ転位(Amadori rearrangement)によりさらに
安定し、コラーゲンは徐々に溶解性が低くなる。Reiser et al.,FASEB Journal
6:2439 - 2449(1992)。
細胞表面に形成されたコラーゲン原線維は細胞外マトリクスに蓄積し、ここで
さらに他のコラーゲン原線維やその他の細胞外マトリクスの構成成分と相互作用
を行い、機能的細胞外マトリクスを形成する。コラーゲン原線維は1種類以上の
コラーゲンから構成されることが多く、線維の組成は原繊維形成と組織機能の決
定に重要である。Lapiere et al.,Connective Tissue Research 5:21 - 29(19
77)、Andrikopoulos et al.,Nature Genetics 9:31 - 36(1995)。さらに、細
胞外マトリクスのパッキングは、細胞外のその他の非コラーゲン性成分で調整さ
れる。Hahn and Birk,Development 115:383 - 393(1992)。コラーゲンIの豊
富な組織(例えば腱)でのコラーゲン原線維は、重金属染色により電子顕微鏡観
察下で視覚化した場合に、67ナノメートルのバンド・パターンを特徴とする。
原繊維形成および架橋の間に、新生コラーゲン原繊維および線維は異なった薬
品溶液で抽出できるようになる。共有架橋の形成前に、コラーゲンは希釈塩溶液
で抽出可能である。共有架橋の形成後でアマドリ転位前では希釈酢酸でコラーゲ
ン抽出可能である。アマドリ転位が発生すると、コラーゲンは不溶性になり、コ
ラーゲンを分解する酵素作用(例えばペプシン、マトリクス・メタロ(金属)プ
ロテイナーゼ等)によってしか溶解することができない。このような知見は動物
の組織で最初に得られたものである。溶解性が異なるコラーゲン・プールが動物
組織に存在し、放射性ラベリングにより溶解性が高いプールは溶解性が低いプー
ルより放射性ラベルされる物質を大量に含んでいた。このことは、かなり新規に
合成されたことを示唆する。Nimni et al.,Biochemical Journal 102:
143 - 147(1967)。つぎに、これらの知見は培養中の細胞に拡張された。Chan et
al.,Biochemical Journal 269:175 - 181(1990)。
現在までに19種類の特徴付けられたコラーゲンが判別しており、その各々は
特定の特性、構造、機能を有している。表1。van der Rest and Garrone,FASE
B Journal 5:2814 - 2823(1991),Kielty et al in”Connective Tissue and It
s Heritable Disorders: Molecular,Gnetic and Meidcal Aspects”(Royce and
Steinmann,eds.),Wiley-Liss,1993,pages 103 - 147。コラーゲンII、III
、V、XIは、前述したような細胞間質原線維コラーゲンのプロトタイプであるコ
ラーゲンIと類似の構造および架橋パターンを共有している。コラーゲンIVは基
底膜に見られ、大型の球状C末端ドメインと、350nmの長いコラーゲン性ド
メインと、「チキン・ワイヤ」パターン(Chicken-wire pattern)として記載され
るフィラメント・ネットワークにパックされた成熟蛋白質の小さいN末端ドメイ
ンとを有している。コラーゲンIVの架橋は還元型(ジスルファイド)結合と非還
元型(リシン由来、リシル・オキシダーゼ媒介性)結合の両方による。コラーゲ
ンVIはマイクロフィブリル・ネットワークを形成し、分子内および分子間でジス
ルファイド結合している。コラーゲンVIIは真皮−表皮接合部の固定原繊維(anch
oring fibrils)に局在し、球状および遮断されたコラーゲン3重らせん領域を有
する巨大分子であり、端−端(tail-to-tail)アセンブリにおいてジスルファイド
結合を通じて会合すると信じられている。他のコラーゲンの架橋や分子パッキン
グについては殆んど分かっていないが、各種コラーゲンはその構造と機能に応じ
て異なる機構により架橋することは明らかである。コラーゲン原線維内の異なる
コラーゲンの間、例えば線維コラーゲンであるコラーゲンIIと遮断された3重ら
せんのある原繊維会合コラーゲン(FACIT)のコラーゲンIXとの間等には、
リシン由来のリシル・オキシダーゼ媒介性架橋である分子間架橋も存在する。Ey
re et al.,FEBS Letters 220:337 - 341(1987)。
リシル・オキシダーゼ酵素は411アミノ酸前駆体として細胞内で合成される
。リシル・オキシダーゼを暗号化する遺伝子は十分に特徴付けされており、5q
23.3〜31.2に局在するDNAの約19kbに7つのエクソンを有してい
る。翻訳された遺伝子産生物は、交互にポリアデニル化部位を用いること
で、約2.0〜5.5kbで大きさが異なるmRNAをいくつか生じ、結合組織
の豊富な細胞において生体内と試験管内どちらでも豊富に発現される。翻訳され
た遺伝子産生物は46.6kDaのプロ酵素で、金属プロテアーゼにより水解的
に活性化されて分子量が約32kDaの活性酵素を生ずる。この酵素は無細胞試
験管内発現系で発現した。Trackman et al.,Journal of Biological Chemistry
267:8666 - 8671(1992)。活性化された酵素は、コラーゲンおよびエラスチン
中のリシン残基およびハイドロキシリシン残基を酸化する。コラーゲンIではテ
ロペプタイド中の特定のリシン残基およびハイドロキシリシン残基だけが修飾さ
れるが、エラスチンでは1000基のアミノ酸あたりリシン残基48個のうちの
約30個が酸化される。コラーゲンIでは、リシル・オキシダーゼは、分子が4
本脚構造を実現すると、テロペプタイド中のリシン残基およびハイドロキシリシ
ン残基を酸化的に脱アミノ化反応することができる。この酵素は、隣接する4本
脚分子のテロペプタイド中のリシン残基またはハイドロキシリシン残基に最も近
いコラーゲン分子の三重らせんのC末端およびN末端端部付近の相同のシーケン
スと会合すると信じられている。Siegel,International Review of Connective
Tissue Research 8:73 - 118(1979)。この酵素は少くとも二つの共役因子であ
る銅とペプチジル・トリハイドロキシフェニルアラニン(TOPA)のキノンと
を必要とする。この酵素を阻害することのできる多数の薬剤が同定されており、
このような化合物の例としてつぎのようなものがある:β−アミノプロピオニト
リル、β−ブロモエチルアミン、β−ニトロエチルアミン、ベンジルアミン、ジ
アミン類似体、イソナイアザイド、イプロナイアザイド、シス−ジアミノシクロ
ヘキサン、ヒドラジン、セミカービザイドおよびジチオスレイトール(米国特許
第4997854号)。リシル・オキシダーゼ阻害剤の存在下で合成したコラー
ゲンは冷却希釈中性塩溶液に溶解可能である。この溶解性コラーゲンは原繊維を
構成できれば、リシル・オキシダーゼにより活性化してこの原繊維を架橋させて
もよく、この方法はリシル・オキシダーゼのアッセイとして用いられている。Pr
ockop and Tunderman,Methods in Enzymology,82:305 - 319(1982)。
コラーゲンでのリシン由来でリシル・オキシダーゼが媒介する架橋の形成およ
び/または成熟に妨害するその他の薬剤も知られており、これにはD−ペニシラ
ミンやヘパリンが含まれる。D−ペニシラミンは、テロペプタイド中のリシン/
ハイドロキシリシン残基の酸化的脱アミノ化反応に続けて形成されるアルデヒド
カルボニル基をブロックすることにより架橋の形成を阻害する。続いてこのコラ
ーゲンが抽出され、精製されて、D−ペニシラミンを除去すれば、安定な不溶性
コラーゲン原繊維が試験管内で形成されることになり、このことは、アルデヒド
・カルボニル基が暴露され、共有架橋を形成するために利用できることを表わし
ている。Nimni et al.,in”Chemistry and Molecular Biology of the Interce
llular Matrix”(Balazs ed.)Academic Press,New York,NY,1970,pages 4
17 - 430。ヘパリンはコラーゲン分子が原繊維を形成する能力を妨害することに
よりコラーゲンの架橋を阻害するので、コラーゲン分子はリシル・オキシダーゼ
の活性に必要とされる4本脚構造にならず、ヘパリンもリシル・オキシダーゼか
らコラーゲンIへの結合を凡そ40パーセントまで減少する。Gavriel and Kaga
n,Biochemistry 27:2811 - 2815(1988)。
医学的に、ヒト組織に汎用で親和性の高い生体材料が必要性とされている。コ
ラーゲンは医学的移植用途に非常に有望ないくつかの独自的特性を有しており、
そのもっとも顕著な例としてはコラーゲンが天然の生体材料であることがあげら
れる。コラーゲンを元にした移植は、移植後にホストによって再モデル化できる
ことが示されている。Kato et al.,Bone and Joint Surgery,73:561 - 574(1
991)。
コラーゲンは多くのバイオメディカル、バイオテクニカル、および化粧品の用
途に使用されてきた(Stenzel et al.,Annual Review of Biophysics and Bioen
gineering,3:231 - 253(1974))。コラーゲン医用装置は心血管外科用、形成外
科用、眼科用、整形用、泌尿器科用、胸部外科用、腹部外科用、耳鼻科用、神経
外科用として、また薬剤搬送システム(DDS:Drug Delibery system)、止血
剤、抗癒着剤および接着剤として設計されて来た。Chvapil M.,Kronenthal R.L
.and van Winkle W.,International Review of Connective Tissue Research
,6:1 - 61(1973)。コラーゲンの商業的用途の例としては、不溶性止血スポン
ジ(COLLASTAT,Integra Life Sciences,NJ)または粉
末(米国特許第3,443,261号)、押出成形されたコラーゲン縫合糸(米
国特許第3,114,593号)、コラーゲン組織等価物(米国特許第4,48
5,096号)、原線維構成物(米国特許第5,256,418号)、組織増殖
用の溶解性、注射用アテロペプタイド・コラーゲンとして(米国特許第3,94
9,073号)、抗生物質点眼用コラーゲン・アイシールドとして(Phinney et
al.,Archives of Ophthalmology 106:1599 - 1604(1988))、移植可能な薬剤供
給用コラーゲンーポリ(HEMA)ハイドロゲル(Jeyanthi et al.,Journal of
Pharmacy and Pharmacology 43:60 - 62(1991))、および薬剤供給用のコラー
ゲン微粒子(Rossler et al.,Journal of Microencapsulation 12:49‐57(1995
))としてが挙られる。医療用装置、薬学および化粧品用途で使用されるコラーゲ
ンの大半は今日では動物性供給源から入手している。コラーゲンは、ウシ、ブタ
、ラット、家禽類、魚類を含む多数の異なる門に由来するコラーゲンを豊富に含
有する組織から抽出できる。抽出方法は、ペプシンを多用して架橋しているテロ
ペプタイドを分子のコラーゲン性3重らせん領域から開裂させて、アテロペプタ
イド・コラーゲン3重らせんを遊離させるするような酵素学的方法、または弱酸
中でコラーゲンを抽出する方法のいずれかによる。これらの抽出した動物性コラ
ーゲンはヒト供給源から供給されたのではないという欠点を有しており、非コラ
ーゲン性材料で汚染される可能性がある。
コラーゲンの種の交雑の問題を克服するため、ヒト・コラーゲンの商業的に有
用な供給源を入手するいくつかのアプローチがとられて来た。ひとつの方法とし
ては米国特許第5,002,071号に記載されているようにヒト胎盤からコラ
ーゲンを抽出することがある(Harrell,C.;Research Development Foundation
)。しかしヒト胎盤の供給は変動性であり、感染症の伝染する可能性があり、こ
の方法の完全な商業化を制限する広い倫理面での問題がある。
別の方法として、培養組み換え細胞から供給したコラーゲンを増殖させて遺伝
子工学的処理を加えた遺伝子からヒト・コラーゲンを生成する。PCT出願第W
O93/07889号。例えば、プロコラーゲンIIの遺伝子をHT−1080細
胞に挿入し正常なプロコラーゲンII分子として細胞培地中に発現さ
せる。Fertala et al.,Biochemical Journal,298:31 - 37(1994)。HT−1
080細胞はコラーゲンIVとその他の基底膜成分だけを発現するので、これらの
細胞はコラーゲンの合成が可能である(即ち、すべての転写後酵素(post-transl
ational enzyme)を発現する)が、コラーゲンIやコラーゲンII等の細胞間質コ
ラーゲンは構造的に発現しないため、組み換えプロコラーゲンを産生する有用な
哺乳類細胞系列であると言えよう。同様に、同じ細胞系列でプロα1(I)鎖だ
けを含むホモ三量体プロコラーゲンIも作成されている。Geddis and Prockop,
Matrix,13:399 - 405(1993)。この方法の限界は、プロコラーゲンが、二つの
プロペプタイドを蛋白分解的な開裂により処理してコラーゲンにしてから、他の
培地成分から精製し、完全なテロペプタイドを備えたコラーゲンを遊離しなけれ
ばならないことである。これ以外にも、細胞培養培地中のプロコラーゲンをペプ
シン処理して、プロペプタイドとテロペプタイドを蛋白分解的に除去してもよい
。他の研究でも他のコラーゲンについて異なるタイプの細胞を用いる同様の方法
を用いており、例えばGreenspan と共同研究者は、コラーゲンα鎖を産生しない
チャイニーズ・ハムスター肝(CHL)細胞においてヒト・コラーゲンVのα2
鎖(α2(V))を発現させ、1本のヒトα2(V)鎖と2本のハムスターα1
(V)鎖を3重らせん構造で含むキメラ・ヘテロ三量体コラーゲンV分子を作成
している。Greenspan et al.,Journal of Biological Chemistry 264:20683 -
20687,1989。NC1およびCOL1ドメインを含むC末端部分とNC2ドメイ
ンの一部とを含むニワトリ・コラーゲンXII の寸断した形状が、ニワトリ・コラ
ーゲンXII のα1鎖についての組み換えミニ遺伝子を用いて発現しており、コラ
ーゲンIまたはXII を産生しないHeLa細胞において発現している。この構成
体の発現によって、細胞を増殖させるために使用した細胞培養培地中でヒト・コ
ラーゲンXII 三重鎖の寸断形状の形成が生じた。Mazzorana et al.,Journal of
Biological Chemistry 268:3029 - 3032,1993。遺伝子工学的な別のアプロー
チとして、プロコラーゲン合成に必要な遺伝子を含むバキュロウイルスベクター
をSf9昆虫細胞に挿入してヒト組み換えコラーゲンを産生させるものである。
Vuori et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the Uni
ted States of
America,89:7467 - 7470(1992)。このシステムの限界は、プロコラーゲン遺伝
子を挿入しなければならないことに加えて、必要とされるすべての転写後遺伝子
が例えばプロリル4−ハイドロキシラーゼを発現させ、折り畳みと分泌が行える
ようにする必要がある点である。このアプローチでも細胞培養培地からのプロコ
ラーゲンの精製とそれに続くプロコラーゲンからコラーゲンへの処理が必要にな
る。
さらに別のアプローチでは、遺伝形質転換動物を開発してプロコラーゲンを産
生させている。ヒト治療用タンパクの遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的に
操作し、遺伝形質転換動物へ導入して、該遺伝形質転換動物が哺乳類上皮細胞中
でタンパクを発現し組み換えヒトタンパクを泌乳に分泌することで、該動物の乳
汁から蛋白質を回収できるようにしてもよいことが示されている(米国特許第4
,873,316号;Lonberg,et al.,Biogen Inc.)。最近では、ヒト組み換
えコラーゲンを生成するためにこのようなアプローチを用いる方法が提案されて
いる(PCT WO94/16750;Berg,Collagen Corporation)。遺伝形
質転換動物はヒト・プロコラーゲンを産生できるが、さらにプロコラーゲンの精
製ならびに加工を行って乳タンパクから精製しプロペプタイドを除去する必要が
ある。
アスコルビン酸を補充した培養中で増殖する細胞がコラーゲンを産生すること
はすでに周知となっている。Goldberg et al.,Experimental Cell Research,3
1:444 - 447(1963);Schwartz et al.,Journal of Cell Biology,92:462 -
470(1982);Grinnel et al.,Experimental Cell Research,181:483 - 491(19
89)。しかし、合成コラーゲンの多くはプロコラーゲンとして細胞培養培地中に
分泌されており、コラーゲンに加工されない。Limeback and Sodek,European J
ournal of Biochemistry,100:541 - 550(1979)。合成されたプロコラーゲンの
もっと少ない分画がコラーゲンに加工されて細胞周囲の細胞辺縁マトリクスに蓄
積する。蓄積したコラーゲンは酵素リシル・オキシダーゼの作用により架橋し、
不溶性のコラーゲン・マトリクスを形成する。
培養によるコラーゲン合成は細胞の増殖状態と培養時間の両方に依存する。急
速増殖期では、細胞は極く僅かのコラーゲンしか合成しないが、一旦集密的に
なると、細胞のコラーゲン合成は顕著に増加する。Booth et al.,Biochemica B
iophysica Acta,607:145 - 160(1980);Steinberg,Laboratory Investigatio
n,39:491 - 496(1978)。1ないし3週間の後、コラーゲン合成および細胞周辺
マトリクスへの蓄積はほとんど無視できるレベルまで顕著に減少する。Chan et
al.,Biochemical Journal,269:175 - 181(1990);Grinnell et al.,Experim
ental Cell Research,181:483 - 491(1989)。プロコラーゲンの細胞培養培地
中への分泌も劇的に減少する。培養におけるコラーゲン合成についてのこれまで
の研究では、リシル・オキシダーゼを用いてコラーゲンの架橋を阻害し、これに
よって細胞外マトリクスに蓄積したコラーゲンのある程度の部分を、16時間か
ら48時間のさまざまな時間をかけて冷却中性塩溶液に溶解させることができて
いる。冷却中性塩溶液抽出の後、細胞層残渣はかき集めて酢酸(0.5モル)に
入れる(Lamande and Bateman,Matrix,13:323 - 330(1993))か、または水酸化
ナトリウム(0.2モル)(Bankowski & Dabrowski,Acta Biochemica Plonica
,27:405 - 411(1980))に入れ、部分的に架橋したコラーゲンのある程度の部
分を溶解させている。培養中で増殖してヒト・コラーゲンを商業的に利用可能な
量で産生する線維芽細胞の応用は、連続的な高レベルのコラーゲン合成を維持し
、プロコラーゲンを回収して、コラーゲンへ加工する方法に関する問題が解決さ
れなければ可能にはならない。
図面の簡単な説明
図1は、実施例3に示すように、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミ
ド・ゲル電気泳動により分離したさまざまなコラーゲンを示す。区画(lane)の割
り当て:区画1(左側):高分子量スタンダード(Bio-Rad Laboratories,Hercu
les,CA)、区画2:Dulbeccoのりん酸緩衝液で実施例1の細胞層から抽出しペプ
シン処理したヒト・コラーゲン、区画3:Dulbeccoのりん酸緩衝液で実施例1の
細胞層から抽出したヒト・コラーゲン、区画4:ペプシン処理したウシ・コラー
ゲンI(Organogenesis Inc.,Canton,MA)、区画5:ウシ・コラーゲンI(Organ
ogenesis Inc.,Canton,MA)、区画6:ペプシンで再処理したヒト・コ
ラーゲンI(Sigma Chemical Co,St Louis,MO)、区画7:ペプシン処理したヒ
ト・コラーゲンI(Sigma Chemical Co,St Louis,MO)、区画8および区画9:
高分子量スタンダード(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)、区画10:酢酸
水溶液(0.5モル)溶解ペプシン(100μg/ml)。
図2は、実施例1に説明するように、Dulbeccoのリン酸緩衝液で細胞層から抽
出したコラーゲンの濃度を示す。コラーゲン濃度は、実施例4に示すように、Du
lbeccoのりん酸緩衝液中のハイドロキシプロリンの量を測定して決定した。第1
の冷間サイクルは培地を産生培地に交換後2日間で、図に図示した最終冷間サイ
クルは培地を産生培地に交換後133日だった。
図3は、実施例8に示すように、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ド・ゲル電気泳動により分離した濃縮ヒト・コラーゲンの写真を示す。区画割り
当て、区画1(左側):高分子量域スタンダード(Bio-Rad Laboratories,Hercu
les,CA)で、上から、ミオシン(200kDa)、βガラクトシダーゼ(116
.5kDa)、フォスフォリラーゼB(97.4kDa)、血清アルブミン(6
6.2kDa)、区画2:実施例7による濃縮ヒト・コラーゲン、21μg、区
画3:実施例8による濃縮ヒト・コラーゲン、30μl塗布、区画4:実施例8
による濃縮ヒト・コラーゲン、15μl塗布、区画5:実施例8による濃縮ヒト
・コラーゲン、10μl塗布、区画6:実施例8による濃縮ヒト・コラーゲン、
8μl塗布、区画7:実施例8による濃縮ヒト・コラーゲン、6μl塗布、区画
8:実施例8による濃縮ヒト・コラーゲン、4μl塗布、区画9:実施例7によ
る濃縮ヒト・コラーゲン、14μl塗布、区画10:実施例7による濃縮ヒト・
コラーゲン、5.6μl塗布。
図4は、実施例9で説明するように調製したDFC構成の55,000倍拡大
における電子顕微鏡写真である。写真ではコラーゲン原繊維の通常のD周期バン
ドを示す。
図5は、ヒト・コラーゲン・スポンジの写真で、実施例10に説明するように
調製してあり、8倍拡大での表面組織を示す(スポンジ寸法=4ミリメートル×
30ミリメートル)。
図6は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲルで分離した濃縮
ヒト・コラーゲンからの臭化シアン誘導ペプタイドを示す写真で、実施例12に
示すように、コラーゲンIIIの存在を示す。区画割り当ては、区画1:ブランク
(緩衝液のみ載置)、区画2:広帯域分子量マーカー(Bio-Rad Laboratories,H
ercules,CA)、区画3:未消化の実施例1による濃縮ヒト・コラーゲン(12.
92μg、区画4:臭化シアンで消化した実施例1からの濃縮ヒト・コラーゲン
(32.7μg)、区画5:臭化シアンで消化したヒト・コラーゲンI(29.
4μg、Sigma type VIII,ヒト胎盤ペプシン抽出、Sigma Chemical Company,S
t.Louis,MO)、区画6:臭化シアンで消化した細胞層から抽出された濃縮ヒト
・コラーゲン(32.7μg)、区画7:臭化シアンで消化したヒト・コラーゲ
ンIII(29.4μg、Sigma type X,ヒト胎盤から抽出されたペプシン、Sigma
Chemical Company,St.Louis,MO)。
キー:A、α1(I)CB8;B、α1(III)CB5;C、α1(I)CB6
;D、α1(I)CB6′
図7は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で分離
した濃縮ヒト・コラーゲンからの臭化シアン誘導ペプタイドを示す写真で、実施
例13に示すように、テロペプタイドの存在を示す。区画割り当ては、区画1お
よび区画2:ブランク(緩衝液のみ載置)、区画3:広帯域分子量マーカ(Bio-R
ad Laboratories,Hercules,CA)、区画4:臭化シアンで消化したヒト・コラー
ゲン18μg(Sigma type VIII,ヒト胎盤ペプシン抽出、Sigma Chemical compa
ny,St.Louis,MO)、区画5:実施例8の細胞層由来の、臭化シアンで消化した
濃縮ヒト・コラーゲン、区画6:臭化シアンによる消化の前にペプシンで消化し
てある実施例8の細胞層由来の濃縮ヒト・コラーゲン、区画7:臭化シアンで消
化したヒト・コラーゲンI(8μg、シグマ型VIII、ヒト胎盤ペプシン抽出、Si
gma Chemical Company,St.Louis,MO)、区画8:臭化シアンで消化したヒト・
コラーゲンIII(10μg、ヒト胎盤絨毛ペプシン抽出、Southern Biotechnology
Associates,Birmingham,AL)、区画9および区画10:ブランク(緩衝液のみ
載置)。キー:A、α1(I)CB6;B、α1(I)CB6′
図8は、実施例14に示すように、Dulbeccoのりん酸緩衝液で回収し、細胞株
HDF B116の細胞層から酢酸抽出によるドデシル硫酸ナトリウム・ポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動で分離したコラーゲンα鎖の存在を示す写真である
。区画割り当ては、区画1(左側):ブランク(緩衝液のみ載置)、区画2:広
帯域分子量スタンダード(Bio-Rad Laboratories Hercules,CA)で、上から:ミ
オシン(200kDa)、βガラクトシダーゼ(116.5kDa)、フォスフ
ォリラーゼB(97.4kDa)、血清アルブミン(66.2kDa)である。
区画3:産生培地中で7日目のHDF B116細胞層からのDulbeccoりん酸緩
衝液抽出物、区画4:産生培地中で21日後のHDF B116細胞層からのDu
lbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画5:産生培地中で28日後のHDFB116細
胞層からのDulbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画6:産生培地中で35日後のHD
F B116細胞層からのDulbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画7:産生培地中で
42日後のHDF B116細胞層からのDulbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画8
:HDF B116細胞層からの酢酸溶解性コラーゲン細胞層、区画9:ヒト・
コラーゲンI(12μg、Sigma type VIII,ヒト胎盤由来ペプシン抽出コラーゲ
ン、Sigma Chemical Company,St Louis,MO)、区画10:ブランク(緩衝液の
み載置)。
図9は、実施例15に説明するような、細胞株HDF B117からの細胞層
のDulbeccoのりん酸緩衝液回収および酢酸抽出物のドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミド・ゲル電気泳動により分離したコラーゲンα鎖の存在を示す写
真である。区画割り当ては、区画1(左側):ブランク(緩衝液のみ載置)、区
画2:広帯域分子量スタンダード(Bio-Rad Laboratories Hercules,CA)、上か
ら、ミオシン(200kDa)、βガラクトシダーゼ(116.5kDa)、フ
ォスフォリラーゼB(97.4kDa)、血清アルブミン(66.2kDa)、
区画3:産生培地中で7日後のHDF B117細胞層からのDulbeccoりん酸緩
衝液抽出物、区画4:産生培地中で14日後のHDF B117細胞層からのDu
lbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画5:産生培地中で21日後のHDF B117
細胞層からのDulbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画6:産生培地中で28日後のH
DF B117細胞層からのDulbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画7:産生培地中
で35日後のHDF B117細胞層からの
Dulbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画8:HDF B117細胞層からの酢酸溶解
性コラーゲン細胞層、区画9および区画10:ブランク(緩衝液のみ載置)。
図10は、実施例16に説明するような、細胞株HDF B117からの細胞
層のDulbeccoのりん酸緩衝液回収および酢酸抽出物のドデシル硫酸ナトリウム・
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動により分離したコラーゲンα鎖の存在を示す
写真である。区画割り当ては、区画1(左側):ブランク(緩衝液のみ載置)、
区画2:広帯域分子量スタンダード(Bio-Rad Laboratories Hercules,CA)、上
から、ミオシン(200kDa)、βガラクトシダーゼ(116.5kDa)、
フォスフォリラーゼB(97.4kDa)、血清アルブミン(66.2kDa)
、区画3:産生培地中で21日後のSAF012A細胞層からのDulbeccoりん酸
緩衝液抽出物、区画4:産生培地中で28日後のSAF012A細胞層からのDu
lbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画5:産生培地中で35日後のSAF012A細
胞層からのDulbeccoりん酸緩衝液抽出物、区画6:SAF012A細胞層からの
酢酸溶解性コラーゲン細胞層、区画7から区画10:ブランク(緩衝液のみ載置
)。
発明の開示
本発明により、細胞培養系から以前には利用不可能だったほどの大量のコラー
ゲンを製造する能力と処理の簡略化が開示される。さらに詳しくは、本発明は、
試験管内細胞培養系から産生される新規なコラーゲン、特にヒト・コラーゲンに
関する。本発明の方法は、コラーゲン産生細胞とコラーゲンの架橋を妨害する薬
剤を含む培養培地とを用いる反復細胞培養法であり、産生されるコラーゲンが架
橋しないまま残留するようにしている。産生されるコラーゲンは塩溶液中に溶解
して、溶解したコラーゲンを含む塩溶液をコラーゲン産生培養細胞から分離する
ことで回収できる。同じコラーゲン産生細胞を新規の培養培地を用いて再培養し
、反復培養およびコラーゲン製造循環系を提供する。コラーゲン産生細胞を架橋
しないコラーゲンが合成されるような条件下で培養を行い、培養培地を除去し、
塩溶液で細胞を洗浄してコラーゲンを溶解回収し、細胞を再培養することに
より、同じコラーゲン産生細胞がプロコラーゲンの分泌を継続することができる
ため、これをコラーゲンに処理して細胞層内部に蓄積しておき本法による連続反
復で回収することができる。
新規なコラーゲン、特にヒト・コラーゲンはコラーゲン架橋を妨害後、架橋し
ない状態で初期に試験管内細胞培養系から産生される。各種回収技術を使用する
ことで、コラーゲンはバイオメディカル、バイオテクノロジー、および化粧品の
用途で使用可能である。抽出したコラーゲンは酵素、例えばリシルオキシダーゼ
等で処理して架橋させることが可能である。さらに、架橋していないコラーゲン
は化学的手段、例えばカルボジイミド、グルタルアルデヒド、糖、紫外線(UV
)照射等により架橋させることができる。さらに、回収したコラーゲンをペプシ
ンまたはトリプシン等の酵素処理することでアテロペプタイド・コラーゲンを形
成できる。さらに、プロコラーゲン・ペプタイドは使用した培養培地から別々に
分離回収可能である。さらに細胞培養培地中のプロコラーゲンを回収してペプシ
ン処理することにより、プロペプタイドおよびテロペプタイドを除去して3重ら
せんアテロペプタイド・コラーゲンを製造することが可能である。さらに、細胞
培養終了時に、コラーゲンは、細胞層の細胞周辺コラーゲンを希釈酢酸で可溶化
することによっても回収可能である。さらに、細胞培養終了時に、コラーゲンは
、ペプシン処理をして架橋テロペプタイドなしに3重らせんコラーゲン分子を遊
離することによっても回収できる。
発明の詳細な説明
本発明の試験管内細胞培養系は、培養中の細胞の能力を有利に利用して、コラ
ーゲンIの実際の細胞合成を用いて説明されるようにコラーゲンを合成する。
本発明の方法は細胞培養系に関し、該細胞培養系では、コラーゲン産生細胞を
コラーゲンの架橋を妨害する薬剤を含む細胞培養培地中で培養して、細胞が合成
するコラーゲンの分子内および分子間の架橋の形成を阻害または大幅に減少させ
、コラーゲンの冷却希釈中性塩溶液に対する溶解性を保持することに関する。
培養細胞がコラーゲンの合成を開始し分泌すると、産生された架橋していないコ
ラーゲンは冷却希釈中性塩溶液への溶解により除去でき、同時に培養のコラーゲ
ン合成能力を維持することができる。コラーゲンは、細胞層から細胞培養培地を
除去し細胞層を冷却希釈中性塩溶液で洗浄することにより回収する。合成された
コラーゲンは架橋していないので、冷却希釈中性塩溶液に可溶性であり、続いて
溶液から回収可能である。コラーゲン架橋を妨害する薬剤を含む新鮮な細胞培養
培地を同じ細胞層に追加し細胞培養系の循環を行なって、インキュベーション、
培養培地除去、冷却希釈中性塩溶液洗浄を反復する。コラーゲン産生細胞がコラ
ーゲンの産生を継続するかぎりこのような循環ステップを反復することができる
。経時的な培養系細胞によるコラーゲン産生の調節低下についての報告によれば
(Chanet al.,Biochemical Journal,269:175 - 181(1990);Grinnell et al.,
Experimental Cell Research,181:483 - 491(1989))、細胞培養系においてコ
ラーゲンの産生を継続する循環ステップを反復する能力は予測されていない。
コラーゲンを産生または合成する能力のあるあらゆる細胞が本発明の方法で使
用できる。線維芽細胞は主としてコラーゲンIを産生する。ヒト線維芽細胞株は
ヒト新生児の男児陰茎包皮、ヒト真皮線維芽細胞、ヒト・アキレス腱線維芽細胞
、ヒト肺動脈線維芽裁縫、ヒト尿道線維芽細胞、およびヒト小腸線維芽細胞を含
みこれに限定されない多数の供給源に由来することができる。ヒト細胞は線維芽
細胞に限定しなくとも良いが、ヒト平滑筋細胞、ヒト内皮細胞、ヒト肺および真
皮起源の上皮細胞を含むことができ、またこれに限定されない。さらに、細胞は
ヒト由来の細胞に限定されるものではなく、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ供
給源を含みこれに限定されない他の哺乳類からの細胞を使用することもでき、魚
類、鳥類、無脊椎動物門などを含む他の門からの細胞、自然発生的、化学的、ま
たはウィルスにより形質転換した細胞も本発明で使用できるが、何人かの研究者
らにより形質転換細胞は培養中のコラーゲン産生が少ないことが示されている。
Hajnal et al.,Advances in Enzyme Regulation 33:267 - 280(1993);Kopp e
t al.,International Journal of Cancer 60:275 - 279(1995);Kreig et al.
,Experimental Cell Research 125:23 - 30(1980);
Lefebrve et al.,Journal of Cell Biology 128:239 - 245(1995)。これらの
細胞はヒト組織由来、他の哺乳類由来、または他門由来であり得る。さらに、細
胞は、「正常」だが高レベルで発現するかまたは何らかの方法で変更を加えて治
療的に有利なコラーゲンを作成するかのいずれかの、遺伝子組み換えまたは遺伝
子工学的操作を加えたコラーゲン発現細胞でも良い。例えば、これを実行するに
は、所望するコラーゲンに対するヌクレオチド配列のコーディングは、ゲノムD
NAとして細胞または組織のどちらかから分離するか、または所望のコラーゲン
を発現する細胞または組織からのmRNAから生成されたcDNAとしてHTE
分離することができる。所望の構成は内因性5′プロモータによりまたは外因性
プロモータにより誘導でき、これは発現ベクターにより供給される。修飾コラー
ゲンは、適当な部位特異的突然変異誘発により設計してもよい。所望のヌクレオ
チド配列は、それを発現ベクターに挿入し、ヌクレオチドを複製できる宿主細胞
に複合DNA分子を導入し、これに続けて適切な標的ヌクレオチド配列でクロー
ンを選択することによりクローニングされる。適切なヌクレオチド配列を含むベ
クターを分離し、細胞への形質移入の前に系列化しておく。系列化したベクター
は適切な翻訳後機構を含む細胞にトランスフェクトして、コラーゲン合成を惹起
させ、マーカー遺伝子、例えばベクター構造の一部に組み込まれていない場合に
抗生物質に対する抵抗性を与えるような遺伝子も同時にトランスフェクトする。
トランスフェクトされた細胞は抗生物質を用いて単離されて、抗生物質に対する
抵抗性を有する、すなわちマーカー遺伝子が移入されている細胞だけを選択する
。トランスフェクト細胞は、タンパクとして所望のヌクレオチド配列を発現する
細胞系列にプールするかまたはクローン的に発生させることができる。このよう
な手順は従来の技術で一般に周知であり、Sambrook et al.,Molecular Cloning
,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY(
1989)に記述されている。前述した種類の細胞はすべて本発明で用いている「コ
ラーゲン産生細胞」の定義に含まれるものである。
同様に、薬理学的薬剤を培養に追加して、分泌されるコラーゲンの性質、量、
または種類を変化させた培養細胞から産生されるコラーゲンを回収する方法も本
発明の範囲に含まれるものである。これらの薬剤は、ポリペプタイド成長因子、
転写因子、またはコラーゲン転写を増強する無機塩類を含むことがある。ポリペ
プタイド成長因子の例としてはトランスフォーミング成長因子β1および組織プ
ラスミノーゲン・アクチベータが挙られ、このどちらもコラーゲン合成を増強す
ることが分かっている。Raghow et al.,Journal of Clinical Investigation,
79:1285 - 1288(1987);Pardes et al.,Journal of InvesIngative Dermatolo
gy,100:549(1993)。コラーゲン産生を刺激するような無機塩類の例としてはセ
リウムがある。Shivakumar et al.,Journal of Molecular and Cellular Cardi
ology 24:775 - 780(1992)。
線維芽細胞から分泌される主なコラーゲンはコラーゲンIだが、本発明はコラ
ーゲンIだけに限定されない。例えば、他のコラーゲン(コラーゲンII、III、I
V、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII、
XIX)を適当な種類の細胞(例えば表Iを参照)の使用により、および/または
薬理学的操作により、および/または遺伝子工学により、生産することができる
。薬理学的操作は、コラーゲン産生細胞から異なるコラーゲンの発現を惹起する
ために用いられる、および/またはコラーゲンの架橋の防止または妨害のために
用いられる。遺伝子工学的アプローチの例として、所望のコラーゲンに対する遺
伝子を挿入する、リシルオキシダーゼの遺伝子座を「ノックアウト(knocking-ou
t)」する、遺伝子発現アンチセンス戦略によりリシルオキシダーゼ産生をダウン
レギュレーション(負の調節)する、コラーゲン分子のテロペプタイドにあるリ
シン残基をリシルオキシダーゼの基質とならないような別のアミノ酸に変更する
、およびジスルファイド架橋に関与するシステイン残基を変化させること等が挙
られる。
同様に、本アプローチは、試験管内でエラスチンを産生し、バイオメディカル
用途での使用のために培養細胞から回収できるようにする。この理由は、トロポ
エラスチン(モノマー型エラスチン)がコラーゲンと類似の方法で架橋を形成し
、リシルオキシダーゼによる特定のリシン群の酸化を必要とするためである。
したがって、エラスチンを本発明の細胞培養系から分離精製することが可能であ
る。
細胞周囲の細胞辺縁マトリクスでコラーゲンと共存するような他の蛋白質も非
架橋コラーゲンによって回収でき、例えばデコリンやビグリカン等のプロテオグ
リカン類、ヴィトロネクチン、テナシン、フィブロネクチン、トロンボスポンジ
ンI等のグリコプロテイン類が回収できる。これらの分子は単離精製、濃縮して
バイオメディカル用途で使用できるものである。
血清を補充した培地または既知組成培地(言い替えれば限定されない動物臓器
または組織抽出物例えば血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、ま
たは胎児抽出物を含まないもの)中での細胞増殖を促進するような条件下でコラ
ーゲン産生細胞を増殖またはインキュベートする。培養培地には、コラーゲンの
架橋を妨害する薬剤を添加して分子内および分子間の架橋の形成を阻害または大
幅減少させる。使用される培養培地ならびに細胞の増殖および生存を促進するた
めに必要な特定の培養条件は、増殖させようとする細胞の種類に依存する。細胞
を培養するために必要な培地は平衡培地である必要があり、血清の追加(例えば
ウシ胎仔または新生仔血清)を含むような、例えばDulbeccoの改良Eagle 培地な
ど、それ以外ではHam and McKeehan,Methods in Enzymology,58:44 - 93(197
9)参照、または既知組成培地、例えば実施例1に挙げた培地等、それ以外の適切
な既知組成培地についてはBottenstein et al.,Methods in Enzymology,58:9
4 - 109(1979)参照、のいずれかとすることができる。コラーゲン合成を促進す
るには、アスコルビン酸ナトリウムまたはさらに化学的に安定な誘導体、例えば
L−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n水和物等を補充する必要が
ある。Tsao and Young,In Vitro Cellular and Developmental Biology 31:87
- 90(1995)。
架橋を作らずに細胞によるコラーゲン合成を完了するには、細胞周囲マトリク
スにおけるコラーゲン架橋またはコラーゲン・パッキングのいずれかに影響する
薬剤を細胞培養培地に添加する。コラーゲン架橋を妨害するこのような薬剤のひ
とつのグループはリシルオキシダーゼ阻害剤である。好適なリシルオキシダーゼ
阻害剤はβ−アミノプロピオニトリルである。しかし本発明はこのひとつの特定
のリシルオキシダーゼ阻害剤に限定されることを意図していない。本発明で使用
可能なその他のリシルオキシダーゼ阻害剤としては、2−ブロモエチルアミン・
ハイドロブロマイド、シス−1,2−ジアミノシクロヘキサン、トランス−2−
フェニルシクロプロピルアミン塩酸塩(トラニルシプロミン)、2−ニトロエチ
ルアミン塩酸塩、および2−クロロエチルアミン塩酸塩があり、またこれに制限
されない。コラーゲン架橋を妨害する薬剤のさらなる例としてはD−ペニシラミ
ンがあり、これは酸化リシン残基が相互に共有結合を形成する能力に影響するこ
とにより架橋の形成を阻害している。Nimni et al.,in”Chemistry and Molecu
lar Biology of the Intercellular Matrix”(Balazs ed)Academic Press,Ne
w York,NY,1970,pages 417 - 430。
培養が対数的増殖を終えたら、アスコルビン酸添加培地を追加してプロコラー
ゲンのヒドロキシル化と分泌を促進する。この培養ステージは生合成相(biosynt
hetic phase)と呼ばれる。細胞がコラーゲンを分泌する適当な時間、典型的には
約2日から約7日の後、培養条件を変更してコラーゲンを溶解する。ひとつの実
施例では、培養から培地を除去する。すべての実施例で、細胞層を冷却希釈中性
塩溶液で洗浄して、合成された架橋していないコラーゲンを溶解除去する。希釈
中性塩溶液はコラーゲンの原線維形成を防止する目的で冷却しておく必要がある
。洗浄ステップの好適な温度範囲は氷点より僅かに上の約2℃から約8℃である
。本発明の必須条件は、細胞培養系内に生存可能な細胞が残存し、架橋していな
いコラーゲンの合成を再開できるようにすることである。したがって、コラーゲ
ンを溶解する以外にも細胞が生存できるようにするその他の洗浄プロトコルが使
用できる。冷却希釈中性塩溶液は、この点で溶解した架橋していないコラーゲン
を含むことになり、細胞培養から除去され新鮮な細胞培養培地を同じコラーゲン
産生細胞培養に入れる。好適実施例において、典型的には約2日から約7日程度
の期間の後、冷却希釈中性塩溶液洗浄を反復し、さらに冷却希釈中性塩洗浄液を
除去してから新鮮な細胞培養培地を培養に加える。冷却希釈中性塩溶液によるこ
の細胞培養培地の循環は多数回反復することができる。
架橋していないコラーゲンを細胞層から溶解するための好適な薬剤は、BioWhi
ttaker(Walkersville,MD)から供給されるようなDulbeccoリン酸緩衝生
食液である。しかし本発明はDulbeccoリン酸緩衝生食水に限定する必要はなく、
むしろHankの平衡塩類溶液やEarle の平衡塩類溶液を含むことができる。当業者
であれば、コラーゲン溶解と細胞生存の双方を可能にするようなその他の溶液を
処方することが可能であろう。
塩類溶液による洗浄時間は30分から6時間まで変化させることができ、ある
条件では時間が長い程多くの原材料が得られる。同様に、冷却塩類溶液洗浄中の
攪拌程度も収率に影響する。さらに、2℃から8℃までの好適な洗浄温度範囲に
おける変化も、多くのコラーゲンを回収するまたはその他のマトリクス成分の回
収率に影響を与えることがある。
架橋していないコラーゲンもその他の化学的架橋剤で架橋でき、コラーゲン基
剤で繁用される薬剤には、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、カルボジイ
ミド、ヘキサメチレン・ジイソシアネート、ビスイミダート、グリオキサル、ポ
リグリセロール・ポリグリシジル・エーテル、塩化アジピル、デヒドロサーマル
、UV照射、糖担体を含むが、化学的架橋剤はこれらの例に限定すべきものでは
なく当業者に周知のその他の架橋剤および方法を用いることができる。
したがって本発明は架橋していないコラーゲンに関する。好適な架橋していな
いコラーゲンIはプロペプタイド(N−プロペプタイドおよびC−プロペプタイ
ド)を含まず、テロペプタイドを含み、ヒドロキシル化した分子の3重らせん領
域にプロリン残基全体の40%以上を有し、2本のα1(I)鎖と1本のα2(
I)鎖を含む。別の好適な非架橋コラーゲンIはプロペプタイド(N−プロペプ
タイドおよびC−プロペプタイド)を含まず、テロペプタイドを有さず、ヒドロ
キシル化分子の3重らせん領域内部の総翻訳プロリン残基の40%以上を有し、
2本のα1(I)鎖と1本のα2(I)鎖を含む。好適実施例において、架橋し
ていないコラーゲンはヒト・コラーゲンであり、もっとも好適な実施例において
はヒト・コラーゲンIである。
架橋していないコラーゲンも、例えば示差塩析(Trelstad R.L.,”Immunochem
istry of the Extracellular Matrix,”(Furthmayr ed.)CRC Press 1982,Vol
ume 1,pages 31 - 42;Kielty et al.,in”Connective Tissue and Its Herit
able Disorders:Molecular,Genetic and Medical
Aspects”(Royce and Steinmann,eds.),Wiley-Liss,1993,pages103 - 147)
、透析、または限外漉過ユニットを使用する典型的な接線フロー濃縮等の各種の
方法により冷却希釈中性塩溶液洗浄から回収できる。好適な方法では、冷却塩溶
液から回収した塩溶解性コラーゲンを公称分子量カットオフ値100,000k
Daの限外漉過ユニットを用いて濃縮できる。
さらに、プロコラーゲンを各種の方法により使用済み細胞培養培地から回収で
きる。培養培地からのプロコラーゲンの効率的除去およびプロコラーゲンの精製
が行なえるようなすべての方法を用いることができる。このようなアプローチに
は、使用済み細胞培養培地をペプシン処理し示差塩析を実行して、アテロペプタ
イド・コラーゲンを除去することが含まれる。他にも、使用済み細胞培養培地を
、プロコラーゲン・ペプタイドのひとつに対する抗体とともにアフィニティ・ク
ロマトグラフィのベッドへ流すことができる。このようにして回収したプロコラ
ーゲンは特定のC−およびN−プロテイナーゼで処理してプロペプタイドを開裂
し、損傷していない完全に処理されテロペプタイドを含むコラーゲンを分離する
ことができる。開裂したプロペプタイドを単離してコラーゲン代謝のバランス異
常を改善するための疾患治療に対して治療的に使用できる。
細胞層から抽出したコラーゲンの回収が止るまで、または培養が変質するまで
循環ステップを反復できる。この時点で、細胞層に堆積したコラーゲンは希釈塩
溶液に溶解できないので、培養を希釈酢酸に抽出して溶解させ、示差塩析で回収
することができる。この完全処理のテロペプタイドを含むコラーゲンは細胞周辺
マトリクスに架橋している。
実施例
リシルオキシダーゼ阻害剤のβ−アミノプロピオニトリルを含む培地で培養し
たヒト線維芽細胞を使用し、合成されたプロコラーゲンをリン酸緩衝塩溶液に溶
解し中空糸膜を用いてプロコラーゲンを回収濃縮する特定の実施例を参照して、
本発明をさらに詳しく説明する。当業者であれば、天然にコラーゲンを産生する
、または遺伝子工学的操作によりコラーゲンを産生する他の細胞、ならびに別
のコラーゲン架橋阻害剤や各種塩溶液を選択できるであろう。培養培地と培養条
件のパラメータならびに範囲は、各種パラメータおよび範囲を選択しテストして
請求の範囲で定める通りコラーゲン回収の操作性を決定する当業者の能力範囲に
含まれる。
実施例1:
Dulbeccoリン酸緩衝生食液による細胞層からのヒト・コラーゲンのルーチン抽
出に供したリシルオキシダーゼ阻害剤存在下での培養における線維芽細胞による
ヒト・コラーゲンの製造
ヒト包皮線維芽細胞(株名HDF B116、Organogenesis Inc.,Canton,
MAから供給)を大量培養する目的で連続的に継代培養した。実験を通して培養培
地は抗生物質を含まず血清も含んでいない。大量培養用培地にはつぎのものを含
む:Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方)/Ham のF−12培地(3
:1,v/v)に、GlutaMAX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3
M]、ハイドロコーチゾン[0.4μg/ml]、ウシ・インシュリン[5μg
/ml]、3,3′,5−トリヨード−L−サイロニン[2×10-11M]、ヒ
ト・トランスフェリン[5μg/ml]、エタノールアミン[1×10-4M]、
オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M]、塩化カルシウム[
1×10-3M]、アデニン[1.8×10-4M]、セレン酸[5.3×10-8M
]、マウス上皮成長因子[10ng/ml]を添加した。
滅菌およびシリコン処理(Prosil-28,PCR Inc.,Gainesville,FL)した3リッ
トル容スピナー・フラスコ(Bellco,Vineland,NJ)にガラス被覆した50グラム
のプラスチック・ビーズ(SoloHill,Ann Arbor,MI)を入れ、成分の分かってい
る増殖培地1リットルに対して1×108個の細胞を播種した。この培地はつぎ
のような構成である:Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方)/Ham の
F−12培地(3:1,v/v)に、GlutaMAX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,M
D)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[0.4μg/ml]、ウシ・インシ
ュリン[5μg/ml]、3,3′,5−トリヨード−L−サイロニン[2
×10-11M]、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml]、エタノールアミン
[1×10-4M]、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M]
、塩化カルシウム[1×10-3M]、アデニン[1.8×10-4M]、セレン酸
[5.3×10-8M]、マウス上皮成長因子[10ng/ml]、β−アミノプ
ロピオニトリル[50μg/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)を
添加した。フラスコを37℃±0.5℃/10%±0.5%CO2含有インキュ
ベータに配置した。細胞がビーズに付着するまで24時間かけ、同時にスピナー
を15〜18rpmで1分オン/30分オフの間歇サイクルとなるようにセット
した。取り付け後、増殖培地容量を数日掛けて徐々に増加させ、最終的容量3リ
ットルとした。撹拌子(インペラimpeller)速度は毎分25回転にセットし、6
週間後インペラ速度を毎分21回転に減少した。使用済み増殖培地のうちの2リ
ットルを取り出し、培地1リットルをスピナー・フラスコに残して新しく調整し
た増殖培地2リットルを添加することにより、培地は2〜3日ごとに充填した。
12日後、培養が集密化しており(即ち、細胞がビーズ表面を覆い尽くした時点
で)、増殖培地を除去して産生培地に交換した。産生培地はDulbeccoの改良Eagl
e 培地(高グルコース処方)/Ham のF−12培地(3:1,v/v)にGlutaM
AX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[
0.4μg/ml]、ウシ・インシュリン[5μg/ml]、3,3′,5−ト
リヨード−L−サイロニン[2×10-11M]、ヒト・トランスフェリン[5μ
g/ml]、エタノールアミン[1×10-4M]、オルソ−フォスフォリルエタ
ノールアミン[1×10-4M]、塩化カルシウム[1×10-3M]、β−アミノ
プロピオニトリル[50μg/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)
、L−アスコルビン酸リン酸マグネシウム含水塩(L-ascorbic acid phosphate m
agnesium salt n-hydrate)(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,Richmond,
VA)[50μg/ml]、L−プロリン[1.93×10-3M]、グリシン[1
.67×10-3M]を添加した。
冷却サイクルを産生培地で2日後に実施した。使用済み産生培地を容器から取
り出し、室温のDulbeccoリン酸緩衝生食水(BioWhittaker Inc.,Walkersville,
MD)500mlを1分間掛けて追加し、残存使用済み培地をすべて希釈除去し
た。Dulbeccoリン酸緩衝生食水をスピナー・フラスコからすぐに除去した。細胞
周辺のコラーゲンを溶解させるため、4〜8℃のDulbeccoリン酸緩衝生食水1リ
ットルを容器に添加し、冷蔵庫に1時間4〜8℃で静置して、容器を手作業によ
り10分おきに攪拌した。Dulbeccoのリン酸緩衝生食水は細胞層から溶解したコ
ラーゲンを含んでいるので取り出し、37℃の新鮮な産生培地を容器に追加した
。容器を37℃±0.5℃/10%±0.5%CO2含有インキュベータに再装
置した。細胞培養系への産生培地導入後、133日間に渡り培養を維持した。1
33日の間、2〜3日おきにサイクルを反復した。冷却サイクルからのDulbecco
リン酸緩衝生食水は濃縮するまで−20℃で凍結しつづけた。
可溶化したコラーゲンを濃縮するために、最初の22回の冷却サイクルからの
細胞層から得られたコラーゲンを含有するDulbeccoリン酸緩衝生食水の22リッ
トルを、4〜8℃一晩で凍結溶解した。凍結溶解後、Dulbeccoリン酸緩衝生食水
を酢酸で酸性にして、最終濃度0.05%(v/v)とした。酸性化した混合液
は、分子量カットオフ100,000の中空糸カートリッジ(A/G Technologies
,Needham,MA)をクローズドループで用いて、分子量カットオフ以下の分子除去
できるようにして濃縮した。濃縮液の最終容量は368mlとなった。
実施例2:
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による個々の冷
却サイクルからDulbeccoリン酸緩衝生食水を用いて細胞層から抽出したコラーゲ
ンα鎖の単離同定
各々の冷却サイクルからDulbeccoリン酸緩衝生食水を一定量取り出し、ドデシ
ル硫酸ナトリウム(0.4%,w/v)、グリセロール(6%,w/v)、βメ
ルカプトエタノール(1.5%、v/v)により100℃3分間で変性させてか
ら、トリス・グリシン・ドデシル硫酸ナトリウム系で120V(定電圧)2〜3
時間掛け、ポリアクリルアミド・ミニゲル(8%,w/v、Novex,San Diego,
CA)電気泳動で単離した(Laemmli,Nature,1970,227,680 - 685)。ゲルは、
メタノール/酢酸/水(5:1:4)に溶解したページ・ブルー83(0.1%
w/v、Fluka,Ronkonkoma,NY)で1〜2時間染色した。拡散脱染は酢酸水溶液
(8%、v/v)で24〜48時間掛けた。ゲルから、Dulbeccoリン酸緩衝生食
水4〜8℃で細胞層から抽出したヒト・コラーゲンの各サンプルの各々がゲル上
にコラーゲンα1(I)およびα2(I)鎖として移動するバンドを含むことが
明らかになった。使用した添加液では、ゲル上のページブルー83染色から他の
バンドは発見されなかった。
実施例3:
Dulbeccoリン酸緩衝生食水により細胞層から抽出した濃縮ヒト・コラーゲンの
ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動による単離
コラーゲン調製物に存在する主要なコラーゲンの種類を同定するため、原料を
ペプシン処理し、テロペプタイドとプロペプタイドを開裂させておき、さらにポ
リアクリルアミド・ゲル電気泳動に掛けた。Dulbeccoリン酸緩衝生食水で細胞層
から抽出した濃縮ヒト・コラーゲンと比較する意味で、子ウシ靭帯から酸抽出し
たウシ・コラーゲン(米国特許第5,106,949号、Kemp et al.,Organog
enesis Inc.,Canton,MA)およびペプシン抽出ヒト・コラーゲンI(Sigma type
VIII collagen,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を1.0±0.1mg/
mlで溶解した。異なるコラーゲンのサンプルを4℃16時間酢酸水溶液(終濃
度0.5M)でペプシン(100μg/ml)で消化した(Lamande & Bateman,
Matrix 1993,13,323 - 330)。
ペプシン処理コラーゲンと非ペプシン処理コラーゲン両方のサンプルをポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動による単離に調製した。コラーゲン・サンプルはド
デシル硫酸ナトリウム(0.2%,w/v)、グリセロール(8%,w/v)存
在下に、100℃3分間で変性させ、トリス/グリシン/ドデシル硫酸ナトリウ
ム系を用いて120V(定電圧)2.5時間掛け、ポリアクリルアミド・ミニゲ
ル(8%,w/v)Novex,San Diego,CA)電気泳動により単離した(Laemmli,
Nature,1970,227,680‐685)。ゲルはメタノール/酢酸/水(5:1:4)
に溶解したページ・ブルー83(0.1%w/v、Fluka,Ronkonkoma,NY)で1
時間染色した。ゲルの拡散脱染は酢酸水溶液(8%v/v)60時間掛けて行な
い、ゲルを乾燥させた。図1に示したゲルから、Dulbeccoリン酸緩衝生食水に抽
出した原料のほとんどがコラーゲンα1(I)およびα2(I)鎖として存在し
ていることが明らかとなった。ペプシン処理材料と非ペプシン処理材料の比較か
ら、それ以外のバンドは、[α1(III)]3,およびプロコラーゲンI種であ
る確率が高い。ゲルから最も明らかなことはコラーゲンIのβ成分の欠如である
(Sokolov et al.,Medical Science Research,1989,17,911‐913)。ゲル最上
部における物質の欠如は、Dulbeccoリン酸緩衝生食水で抽出した物質がモノマー
性のものであって分子内架橋を僅かしか含まないことをさらに示唆している。
実施例4:
Dulbeccoリン酸緩衝生食水により細胞層から取り出したヒト・コラーゲンの各
抽出物におけるコラーゲン定量
コラーゲンは、物質料中に存在するハイドロキシプロリンの量に基づいて定量
されることが多い。ハイドロキシプロリンは、以下に詳細に説明するような特定
の化学アッセイ(Woessner,Arch Biochem Biophys,1961,93,440 - 447)で測
定できる。
各々の冷却サイクルからDulbeccoリン酸緩衝生食水を一定量(1ミリリットル
)取り出し、等量の塩酸(1ml、12M)にて110℃16時間で水解した。
水解物を水酸化ナトリウム(10M)により中和した。中和した水解物からサン
プルを取り出し(100μl)、96ウェルのマイクロプレートのウェルに分注
した。標準曲線を生成するための各種濃度のアミノ酸標準液(水解コラーゲン、#
A9531,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)もサンプルと同じ96ウェルのプ
レートに分注した。各々のウェルには、水/エチレングリコール・モノメチルエ
ーテル/酢酸バッファpH6(2:3:5、v/v)に溶解したクロラミンT(
50μl、0.05M(Mallinckrodt Chemicals,Chesterfield,MO))を添
加して室温20分間インキュベートした。インキュベーションの後、過塩素酸(
50μl、3.15M,J.T.Baker,Phllipsburg NJ)を各ウェルに添加し室温
5分間インキュベートした。つぎにパラージメチルアミノベンズアルデヒド(Ald
rich Chemical Co.,Milwaukee,WI)をエチレングリコール・モノメチルエーテ
ルに溶解したもの(50μl、20%、w/v)を各ウェルに添加し、プレート
を60℃20分間インキュベートした。インキュベーション直後に、プレートを
570nmのマイクロプレート用分光光度計で読み取った。標準曲線は570n
mにおける吸光度に対するアミノ酸スタンダードの希釈系列に基づくハイドロキ
シプロリン量のプロットとなる。この曲線の傾きを用いて各サンプルのハイドロ
キシプロリン濃度を計算した。コラーゲン濃度は、コラーゲンが12.2%(w
/w)のハイドロキシプロリンを含むもの(Laurent et al.,Anal Biochem,198
1,113,301 - 312)と仮定して計算した。図2に示した結果から、すべての冷
却サイクルにおいてDulbeccoリン酸緩衝生食水により細胞層からコラーゲンが溶
解したことが示されている。
実施例5:
Dulbeccoリン酸緩衝生食水による細胞層からのヒト・コラーゲン濃縮抽出物で
のコラーゲン定量
酸性化した濃縮コラーゲンの一定量(1ml)を取り出して等量の塩酸(1m
l、12M)にて110℃16時間で水解した。サンプルを冷却してから水酸化
ナトリウム(1ml,10M)の添加により中和した。さらにサンプルを水20
0mlで希釈した。希釈溶液の3サンプル(1ml)とアミノ酸スタンダード(
標準液)系列(水解コラーゲン、#A9531,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)
をアッセイした。各サンプルおよびスタンダードには、水/エチレングリコール
・モノメチルエーテル/酢酸バッファpH6(2:3:5、v/v)に溶解した
クロラミンT(0.5ml、0.05M(Mallinckrodt Chemicals,Chesterfiel
d,MO))を添加し、溶液を混和してから室温20分間インキュベートした(Woess
ner,Arch Biochem Biophys 1961,93,440 - 447)。過
塩素酸(0.5ml、3.15M;J.T.Baker,Phllipsburg NJ)を各試験管に
添加した。サンプルを混合し、室温5分間インキュベートした。パラ−ジメチル
アミノベンズアルデヒド(0.5ml、エチレングリコールモノメチルエーテル
中20%w/v、Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)を添加し、混合した。
次にサンプルを60℃で20分間インキュベートした。インキュベーションの後
、サンプルを冷却して吸光度を560nmで分光光度計により読み取った。標準
曲線は、560nmにおける吸光度に対するアミノ酸スタンダードの希釈系列に
基づくハイドロキシプロリン量のプロットとなる。この曲線の傾きを用いて各サ
ンプルのハイドロキシプロリン濃度を計算した。コラーゲン濃度は、コラーゲン
が12.2%(w/w)のハイドロキシプロリンを含むものと仮定して計算した
(Laurent et al.,Analytical Biochemistry,113: 301 - 312,(1981))。Dulbe
ccoリン酸緩衝生食水により細胞層から回収し中空糸膜透析により濃縮したヒト
・コラーゲン量は330〜350ミリグラムの間だった。材料の最終コラーゲン
濃度は0.90〜0.95mg/mlだった。
実施例6:
Dulbeccoリン酸緩衝生食水により細胞層から抽出した濃縮ヒト・コラーゲンの
部分アミノ酸分析
サンプルのアミノ酸分析には、Pico−Tag法ハンドブック(Millipore C
orp.,Bedford,MA)に記載されている通りWaters Pico-Tag Systemを使用した(B
idlinger et al.,Journal of Chromatography,1984,336,93 - 104)。要する
に、Dulbeccoリン酸緩衝生食水により細胞層から抽出した濃縮ヒト・コラーゲン
、子ウシ靭帯から酸抽出したウシ・コラーゲン(米国特許第5,106,949
号、Kemp et al.,Organogenesis Inc.,Canton,MA)およびペプシン抽出ヒト・
コラーゲンI(Sigma type VIII collagen,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO
)を1.0±0.1mg/mlで溶解した。三つ組(triplicate)からの一定量(
0.1ml)を凍結乾燥し、窒素環境中でフェノール(1%、w/v)を含む塩
酸(6M)により蒸気相で145℃1時間掛けて
水解した。サンプルをまたエタノール:水:トリエチルアミン(2:2:1、v
/v)に再懸濁し凍結乾燥した。サンプルをフェニルイソチオシアネート(Pierc
e Chemical Co.,Rockford,IL):エタノール:水:トリエチルアミン(1:7
:1:1、v/v)で室温20分間掛けて誘導体化してから凍結した。サンプル
をさらに凍結乾燥し、Pico-Tag Sample Diluent(ピコタグ試料希釈液、Millipo
re corporation,Bedford,MA)に残渣を再懸濁して高速液体クロマトグラフィ
ー用に調製した。誘導したサンプルをWaters150mm×3.9mm逆相
C18カラム(Millipore corporation,Bedford,MA)に注入し、誘導したアミノ
酸を酢酸ナトリウム−アセトニトリル勾配(Pico-Tag eluents A and B,Millipo
re corporation,Bedford,MA)で溶出した。代表的なピークのピーク領域はスタ
ンダードの積分および比較で決定した。結果を表2に示した。結果から、他のヒ
トおよびウシ・コラーゲンと比較した場合、ほぼ正確な発生率で細胞層から抽出
したヒト・コラーゲンに主要なアミノ酸が存在していることが示される。
実施例7:
培養における線維芽細胞によるヒト・コラーゲンの産生:実施例1の続き
本実施例は実施例1の続きである。
実施例1から3リットルのスピナー・フラスコ(Bellco,Veneland,NJ)培養の
冷却サイクルを同じ条件下でさらに42日間継続した。つまり、培養はコラーゲ
ン産生培地中に合計175日間維持され、マグネシウムおよびカルシウムを含む
4〜8℃のDulbeccoリン酸緩衝生食水(BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)
で73回コラーゲン可溶化を行なった。冷却サイクルからのDulbeccoリン酸緩衝
生食水は濃縮するまでマイナス20℃で凍結しておいた。
溶解したコラーゲンを濃縮するため、冷却サイクル23番から冷却サイクル7
3番を通しての細胞層からのコラーゲンを含むDulbeccoリン酸緩衝生食水51リ
ットルを4〜8℃の間で一晩凍結溶解した。凍結溶解後、Dulbeccoリン酸緩衝生
食水を酢酸で酸性化して最終濃度0.05%(v/v)とした。酸性化した混合
液は、カットオフ分子量100,000の中空糸カートリッジ(A/G Technologie
s,Needham,MA)を用いて分子量カットオフ以下の分子を除去できるようにした
クローズドループにより濃縮した。濃縮液の最終容量は315mlだった。
後述するように濃縮ヒト・コラーゲンのサンプル中にあるハイドロキシプロリ
ン量に基づいてコラーゲンを定量した。酸性化した濃縮コラーゲンの一定量(1
ml)を取り出し、等量の塩酸(1ml、12M)を用いて110℃16時間で
水解した。水解物は水酸化ナトリウム(10M)により中和した。中和した水解
物からサンプルを取り出し(100μl)、96ウェルのマイクロプレートに分
注した。標準曲線を生成するように各種濃度のアミノ酸標準液(水解コラーゲン
、#A9531,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)もサンプルと同じ96ウェルの
プレートに分注した。各々のウェルには、水/エチレングリコール・モノメチル
エーテル/酢酸バッファpH6(2:3:5、v/v)に溶解したクロラミンT
(50μl、0.05M(Mallinckrodt Chemicals,Chesterfield,MO))を添加
して室温20分間インキュベートした。インキュベーションの後、過塩素酸
(50μl、3.15M,J.T.Baker,Phllipsburg NJ)を各ウェルに添加し室
温5分間インキュベートした。つぎにパラ−ジメチルアミノベンズアルデヒド(A
ldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)をエチレングリコール・モノメチルエー
テルに溶解したもの(50μl、20%、w/v)を各ウェルに添加し、プレー
トを60℃20分間インキュベートした。インキュベーション直後に、プレート
を570nmのマイクロプレート用分光光度計で読み取った。標準曲線は570
nmにおける吸光度とアミノ酸スタンダードの希釈系列に基づくハイドロキシプ
ロリン量のプロットとなる。この曲線の傾きを用いて各サンプルのハイドロキシ
プロリン濃度を計算した。コラーゲン濃度はコラーゲンが12.2%(w/w)
のハイドロキシプロリンを含むものと仮定して計算した(Laurent et al.,Anal
Biochem,1981,113,301 - 312)。Dulbeccoリン酸緩衝生食水抽出液による細胞
層から回収し中空糸膜で濃縮したヒト・コラーゲンの量は463mgだった。原
料のコラーゲン終濃度は1.47mg/mlだった。
実施例8:
リシルオキシダーゼ阻害剤β−アミノプロピオニトリル存在下で培養され、Du
lbeccoリン酸緩衝生食水による細胞層からのヒト・コラーゲンのルーチン抽出に
供された、線維芽細胞によるヒト・コラーゲンの製造
ヒト新生児包皮線維芽細胞(株名HDF B119、Organogenesis Inc.,Ca
nton,MAから供給)を培養し量産目的で継代培養した。実験全体を通して、培養
培地は抗生物質を含まず血清も含んでいない。量産用培地にはつぎのものを含む
:Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミンなし、BioWhit
taker Inc.,Walkersville,MD)とHam の栄養ミックスF−12(Nutrient Mix F
-12)(L−グルタミンなし、Hyclone Labs.,Logan,UT)とを3:1(v/v)で
混合し、GlutaMAX-I[4×10-3M](Gibco BRL,Gainthersburg,MD)、ハイド
ロコーチゾン[0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウ
シ・インシュリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、3
,3′,5−トリヨード−L−サイロニン[2×
10-11M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ヒト・トランスフェリン[
5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、エタノールアミン[1
×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、オルソ−フォスフォリル
エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ア
デニン[1.8×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、セレン酸
[5.3×10-8M](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、ヒト組み換え
上皮細胞成長因子[5ng/ml](Upstate Biotechnology Inc.,Lake Placi
d,NY)を添加したもの。
滅菌およびシリコン処理(Prosil-28,PCR Inc.,Gainesville,FL)した3リッ
トル容スピナー/フラスコ(Bellco,Vineland,NJ)にガラス被覆した50グラム
のプラスチック・マイクロキャリア(SoloHill,Ann Arbor,MI)を入れ、成分の
分かっている増殖培地1リットルに対して2.6×108個の細胞を接種した。
培地はつぎのような構成である:Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方
、L−グルタミンなし、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)/Ham の栄養素
混合F−12(L−グルタミンなし、Hyclone Labs,Logan,UT)を3:1(v/
v)に混合し、GlutaMAX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]
、ハイドロコーチゾン[0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,
MO)、ウシ・インシュリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O)、3,3′,5−トリヨード−L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chem
ical Co.,St.Louis,MO)、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma C
hemical Co.,St.Louis,MO)、エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chem
ical Co.,St.Louis,MO)、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×1
0-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、アデニン[1.8×10-4M
](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M](Aldr
ich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、ヒト組み換え上皮細胞成長因子[5ng/
ml](Upstate Biotechnology Inc.,Lake Placid,NY)を添加したもの。フ
ラスコを、37℃±0.5℃の温度と10%±0.5%二酸化炭素の豊富な雰囲
気に維持されたインキュベータに装置した。細胞がビーズに付着するまで24時
間かけ、同時にスピナーを15〜20rpmで
1分オン/30分オフの間歇サイクルとなるようにセットした。取り付け後、増
殖培地容量を数日掛けて徐々に増加させ、最終的容量3リットルとした。撹拌子
(インペラimpeller)速度は18〜22rpmにセットした。培地は、使用済み
増殖培地のうちの2リットルを取り出し、培地1リットルをスピナー・フラスコ
に残して新しく調製した増殖培地2リットルを添加することにより、2〜3日ご
とに充填した。10日後、培養が集密化しており(即ち、細胞がマイクロキャリ
ア表面を覆い尽くした時点)マイクロキャリアをクランプした。この時点で増殖
培地を除去してコラーゲン産生培地に交換した。産生培地は以下を含む:Dulbec
coの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミンなし、BioWhittaker In
c.,Walkersville,MD)とHam の栄養素混合F−12(L−グルタミンなし、Hyc
lone Labs.,Logan,UT)とを3:1(v/v)で混合し、GlutaMAX-I(Gibco B
RL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[0.4μg
/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウシ・インシュリン[5μg
/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、3,3′,5−トリヨード−
L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ヒト
・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、
エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、オ
ルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.
,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M](Aldrich Chemical Co.,Milw
aukee,WI)、β−アミノプロピオニトリル[50μg/ml](Aldrich Chemica
l Co.,Milwaukee,WI)、L−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n
水和物(和光純薬,Ltd.,Richmond,VA)[50μg/ml]、L−プロリン[
1.93×10-3M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、グリシン[終濃
度1.67×10-3M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)を添加したもの
。
コラーゲン産生培地で2日後に細胞層からコラーゲンを回収するため冷却サイ
クルを実施した。使用済み産生培地を容器から除去し、カルシウムおよびマグネ
シウムの入った室温のDulbeccoリン酸緩衝生食水(カタログ番号#17−513
Q、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)500mlを1分間掛けて添加し、
残存している使用済み培地をすべて希釈除去した。Dulbeccoリン酸緩衝生食水を
スピナー・フラスコからすぐに除去した。細胞周辺のコラーゲンを可溶化するた
め、カルシウムおよびマグネシウム入り4〜8℃のDulbeccoリン酸緩衝生食水(
カタログ番号#17−513Q、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)1リ
ットルを容器に添加し、冷蔵庫に1時間4〜8℃で静置し、容器を手作業により
10分おきに攪拌した。Dulbeccoのリン酸緩衝生食水は細胞層から溶解したコラ
ーゲンを含んでいるので除去し、37℃の新鮮な産生培地を容器に追加した。容
器を、37℃±0.5℃、二酸化炭素(10%±0.5%)の豊富な雰囲気下に
維持されたインキュベータに再装置した。2〜3日おきにサイクルを反復した。
150日の間で、可溶化したコラーゲンを含む57リットルのDulbeccoリン酸緩
衝生食水が回収できた。冷却サイクルからのDulbeccoリン酸緩衝生食水は後述す
るように濃縮するまでマイナス20℃に凍結保存した。157日目までコラーゲ
ン産生培地で培養はまだ維持されていた。
可溶化したコラーゲンを濃縮するため、最初の57回の冷却サイクルからの細
胞層コラーゲンを含むDulbeccoリン酸緩衝生食水57リットルを4〜8℃の間で
一晩凍結溶解した。凍結溶解後、溶液をひとつの容器に混合した。この容器から
、ステンレス鋼ストレーナと5μm清澄フィルタ(PALL Corporation,East Hill
s,New York)を通して溶液を圧送し、回収サンプルに残存しているガラス被覆プ
ラスチック・マイクロキャリアおよび細胞片をすべて除去した。この後、可溶化
したコラーゲンを含むDulbeccoリン酸緩衝生食水を氷酢酸(J.T.Baker,Inc.,P
hillipsburg,NJ)で酸性化して酢酸終濃度0.05%とした。可溶化コラーゲン
を含む酸性化した溶液は、密閉系で分子量カットオフ100,000の中空糸膜
型限外漉過カートリッジ(長さ310mm×直径32mm、A/G Technologies,N
eedham,MA)を用いて約3リットルまで濃縮した。限外漉過カートリッジにより
分子量カットオフより小さい材料の除去が行なえる。この後、溶
液は同じ限外漉過システムで残留塩および培地成分をすべて除去するために5倍
量の酢酸水溶液(0.05%、v/v)に対してダイアフィルトレーションし、
コラーゲンが酢酸水溶液中に残るようにした。コラーゲンはさらに同じシステム
により最終容量450mlまで濃縮した。
ヒト・コラーゲンとして濃縮物質を同定するため、ドデシル硫酸ナトリウム・
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に掛けて特性コラーゲンα鎖を検索した。濃
縮ヒト・コラーゲン(42μl)のサンプルをドデシル硫酸ナトリウム(0.4
%、w/v)、グリセロール(6%,w/v)およびβメルカプトエタノール(
1.5%、v/v)中で、最終容量100μlとして100℃3分間で変性させ
た。実施例7の濃縮ヒト・コラーゲンのサンプルも同様に調製した。これらのサ
ンプルはポリアクリルアミド・ミニゲル(8%、w/v、Novex,San Diego,CA
)で、トリス(0.025M)/グリシン(0.192M)/ドデシル硫酸ナト
リウム(0.1%、w/v)バッファ系を用いて20A(定電流)で1.9時間
の電気泳動により単離した。Laemmli,Nature,227: 680 - 685(1970)。ゲルは
メタノール/酢酸/水(5:1:4)に溶解したページ・ブルー83(0.1%
、w/v、Fluka,Ronkonkoma,NY)で1.5時間染色した。拡散脱染は酢酸水溶
液(8%、v/v)で36時間掛けて行なった。図3に示すように、このゲルか
ら、4〜8℃のDulbeccoリン酸緩衝生食水で細胞層から抽出したヒト・コラーゲ
ンの濃縮サンプルに、ゲル上のコラーゲンα1(I)およびα2(I)鎖として
移動したバンドが含まれていることが分かった。
実施例9:
高密度線維コラーゲン(DFC)構造の作成
トランスウェル(transwell、24ミリメートル、k−resin、ポア寸法3
.0μm、Costar Corporation,Cambridge,MA)を150mlガラス・ビーカー
上に設置し、トランスウェルの膜がビーカー上部から約1cm下に来るようにし
た。ビーカーには、リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.83、Na2HPO4、2
.84%、w/v、J.T.Baker Company,Phillipsburg,
NJ; NaH2PO4−H2O、3.11%、w/v、J.T.Baker Company,Phillip
sburg,NJ; NaCl、0.49%、w/v、Sigma Chemical Company,St.Lou
is,MO)にポリエチレングリコール(20%、w/v、分子量8,000、Spec
trum Chemical Manufacturing Company,Gardena,CA)を混じて膜表面の高さま
で充填した。スターラー・バーをビーカー内に入れ、ビーカーはマグネチック・
スターラ・プレート(Scientific Products,McGaw,IL)に載置し、これを4〜8
℃のチャンバに収容した。実施例1からの濃縮ヒト・コラーゲン(4.0ml、
0.95mg/ml)をトランスウェルに添加し、ポリエチレングリコール溶液
(上記参照)を優しく撹拌した。サランラップ(登録商標)をビーカーとトラン
スウェルの上に拡げてコラーゲン溶液の蒸発を抑え、また微粒子物質による汚染
を防止した。さらに濃縮ヒト・コラーゲン溶液を2時間間隔で追加し、濃縮ヒト
・コラーゲン総量8.0mlがトランスウェルに添加されるようにした。コラー
ゲンは合計36時間でトランスウェル膜上に堆積させることができた。トランス
ウェル膜をポリエチレングリコール溶液(上記参照)から取り出して相対湿度2
0%、4〜8℃の脱水チャンバに21時間静置した。
脱水したDFC構成を含むトランスウェルを150mlガラス・ビーカーにい
れ、これに脱イオン水を充填して脱水したDFC構成が完全に浸漬することによ
り、DFC構成を再水和させた。ビーカーにスターラ・バーをいれ、ビーカーを
スターラ・プレートに載せた。脱イオン水をゆっくり撹拌してDFCの再水和を
促進し、残留ポリエチレングリコールの洗浄を行なった。構成を15分間再水和
させた後、構成から水を排出した。構成をまた脱水チャンバに72時間静置した
。DFC構成を1時間の周期で前述したように再水和させた。
走査電子顕微鏡用のDFC構成の調製は以下に説明するように行なった。パラ
ホルムアルデヒド(2%、v/v)、グルタルアルデヒド(2.5%、v/v)
およびアクロレイン(1%、v/v)をカコジル酸ナトリウム(0.1M.pH
7.4)に溶解させたものにDFC構成を48時間にわたって固定した。このサ
ンプルを、カコジル酸ナトリウム(0.1M、pH7.4)に溶解した四酸化オ
スミウム(1%、w/v)にポスト固定し、酢酸ウラニル水溶液(2%、w/v
)でブロックごと染色(stained en bloc)した。2次固定の後、サンプルを段
階的エタノール脱水系列およびプロピレンオキサイドを通して脱水し、Epox
−812(Ernest F.Fullam,Rochester,NY)に包埋した。酢酸ウラニルとクエ
ン酸鉛で超薄切片(約700nm)を染色し、Joel JEM100S走査型電子顕微鏡を
80kVで使用して鏡検した。バンドになったコラーゲン線維の凝集塊が多数電
子顕微鏡写真に写っている。図4参照。凝集塊の長手方向断面は蜂の巣状の外観
を有し、原線維のグループ間に大きな「穴」がある。幾つかの部分には線維を形
成するように凝集しなかった繊細な原線維が含まれており、ちょうど「いじり回
した」凝集塊のように見える。D周期バンドを測定したところ、58.9±1.
7nm(n=10)だった。この数値はコラーゲンIのD周期について許容可能
範囲内にあり、生体内で67nm、また脱水後では60nmとなることが報告さ
れている。Parry and Craig,Bioploymers 16: 1015 - 1031(1977)。
実施例10:
ヒト・コラーゲンからのコラーゲン・スポンジの製造
冷却Dulbeccoリン酸緩衝生食水洗浄サイクルからの実施例1の濃縮ヒト・コラ
ーゲン(5ml、0.95mg/ml)をポリスチレン製組織培養皿(35mm
×10mm、Costar Corporation,Cambridge,MA)に分注した。培養皿には蓋を
被せてテープで固定した。培養皿をスタイロフォーム製容器にいれ、培養皿が容
器空間の中央に位置するようにした。コラーゲン溶液をゆっくりと冷凍した。こ
れは、最初にコラーゲン溶液をマイナス20℃で16時間冷凍し、つぎにマイナ
ス80℃で16時間冷凍して実施した。培養皿の蓋を取り去り、冷凍コラーゲン
溶液を含むさらを凍結乾燥器のバイアル(1200ml容量、VirTis Co.,Gardi
ner,NY)にいれて、コラーゲン溶液が完全に凍結乾燥されるまで凍結乾燥器(Vir
Tis Co.,Gardiner,NY)に入れた。凍結乾燥コラーゲンを最少量の酢酸(2ml
、0.5M、J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)に溶解して優しく混和した。この
酢酸中のヒト・コラーゲンには実施例1からの濃縮ヒト・コラーゲン3mlを追
加し、細胞培養皿に総量25mgのヒト・コラーゲンが添加されるまで、細胞培
養皿のヒト・コラーゲン冷凍処理とそれに続く凍結乾燥ならびに再溶
解を繰返した。25mgのヒト・コラーゲンが完全に凍結乾燥されたら、得られ
たスポンジを検査し写真撮影した(図5参照)。
実施例11:
リシルオキシダーゼ阻害剤β−アミノプロピオニトリル存在下に培養したヒト
新生児包皮線維芽細胞の細胞層からDulbeccoリン酸緩衝生食水により抽出した濃
縮ヒト・コラーゲンのプロテオグリカン/グリコサミノグリカン含量の定量
コラーゲン調製物中に存在するプロテオグリカンならびにグリコサミノグリカ
ンの量を決定するため、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン用の市販
のアッセイ・キット(Blyscan Proteoglycan and Glycosaminoglycan Assay kit
,Biocolor Ltd.,Belfast,Northern Ireland)を使用した。このキットはプロ
テオグリカンとグリコサミノグリカンが染料1,9−ジメチルメチレンブルーに
特異的に結合することに基づいている。プロテオグリカンとグリコサミノグリカ
ンが染料に結合すると、水溶液から沈澱する不溶性複合体を形成する。この沈澱
複合体を遠心分離によりペレット化した。未結合染料を含む上清はデカンテーシ
ョンし、イソプロパノール/カオトロピック塩溶液(chaotropic salt solution)
にペレットを再懸濁する。これによって染料−プロテオグリカン/グリコサミノ
グリカン複合体から染料を遊離させ、さらに分光光度的に定量することができる
ようになる。
実施例1(0.95mg/ml)と実施例7(1.4mg/ml)の2つのヒ
ト・コラーゲン・サンプルから一定量(100μl)で二組取り出して、サンプ
ルのプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン含量の決定のために1.5m
l容微量遠心管に分注した。一組の標準液も、キットとして供給されているウシ
気管から精製したコンドロイチン−4−硫酸の1.0,2.0,3.0,5.0
μgを二組、調製した。すべてのテスト・サンプルと標準液には、Blyscan 染料
試薬(1,9−ジメチル−メチレンブルー)1mlを添加して遠心管全部をボル
テックス・ミキサーで勢い良く混和した。試験管で室温で30分間反応させ、存
在しているプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンと染料
試薬とが不溶性複合体を形成できるようにした。サンプルおよび標準液をベック
マン(Beckman)高速遠心機(Model J2-21,Beckman Instruments,Inc.,Palo Alt
o,CA)で、JA−18.1ローターを用い、8000gで10分間遠心した。す
べての試験管の上清をデカンテーションで除去し、試験管内に残っている上清の
液滴は、試験管内に存在していると思われるペレットを壊さないように注意しな
がら、試験管を逆立ちさせて紙タオルに軽く叩いて除去した。すべてのサンプル
および標準液にはBlyscan解離試薬(Blyscan Dissociation Reagent)(1
.0ml)を添加してペレットを再溶解し、結合している染料を溶液に遊離した
。サンプルと標準液はボルテックス・ミキサーを用いて5秒間混和し、ペレット
が完全に溶解するまで室温に放置した。サンプルと標準液をキュベットに定量分
注した。サンプルと標準液の両方の吸光度は、DU−50ベックマン分光光度計
(Beckman Instruments,Palo alto,CA)により、蒸留水をブランクとして用いて
、656nmで測定した。各標準液の平均吸光度をコンドロイチン−4−硫酸の
量(マイクログラム)に対してプロットした。線回帰方程式(equation of the l
ine)を用いてヒト・コラーゲン・サンプルの双方に存在するプロテオグリカンお
よびグリコサミノグリカンの量を計算した。結果から、1ないし1.5mg/m
lの間で、ヒト・コラーゲンの双方のサンプルがヒト・コラーゲン100μl当
たりプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンとして1μg以下を含むこと
が分かった。これらの結果は、検査したヒト・コラーゲンの双方のサンプルには
、その調製において無視できる量のプロテオグリカンとグリコサミノグリカンし
か含まないことを示している。
実施例12:
コラーゲンIIIの存在を実証するための濃縮ヒト・コラーゲンの臭化シアン誘
導ペプタイドのドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に
よる単離
コラーゲンIIIが濃縮ヒト・コラーゲンサンプルに存在するか否かを判定する
ため、コラーゲンを臭化シアンで消化し、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動
によりマッピングした。臭化シアンによるコラーゲンの消化は、酸化されていな
いメチオニン残基から蛋白質を解離し、独立し認識可能なペプタイド・マップを
明らかにしてくれる。このアプローチは、多数の異なる哺乳類種族におけるコラ
ーゲンIとコラーゲンIIIとの識別が可能である。Laurent et al.,Analytical
Biochemistry,113:3011 - 312(1981);Kirk et al.,collagen and Related
Research,4:169 - 182(1987)(1984);Lillie et al.,Methods in Enzym
ology,145:171 - 183(1987);Mays et al.,Mechanisms of Aging and Deve
lopment,45:203 - 212(1988)。
実施例1からの濃縮ヒト・コラーゲンの一定量を1.5ml容微量遠心管にピ
ペット分注した。ペプシン抽出ヒト・コラーゲンI(Sigma type VIII collagen
,Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)と、ペプシン抽出ヒト・コラーゲン
III(Sigma type VIII collagen,Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)も一
定量を1.5ml容遠心管に分注した。すべての試験管はパラフィルム(登録商
標、American National Can,Neenah,WI)で被覆して穿孔し、−80℃4時間で
試験管を凍結し、凍結乾燥で蒸発乾固するようにした(VirTis Co.Gardiner,NY
)。
凍結乾燥サンプルは、窒素ガスでパージして溶存酸素を除去した70%ギ酸(
v/v、EM Science,Gibbstown,NJ)0.8mlに再懸濁した。臭化シアン(Sig
ma Chemical Company,St.Louis,MO)を70%v/vギ酸に溶解して、臭化シ
アンについて50mg/mlの溶液を実現し、窒素ガスで3分間パージした。臭
化シアン溶液の一定量(0.2ml)を再懸濁したサンプルに添加し、終濃度1
0mg/mlの臭化シアンを得た。サンプルは5秒間窒素ガスでパージした。試
験管に蓋をつけ、室温で16時間消化を行なった。サンプルを1.5ml容微量
遠心管に分注(3×0.3ml)し、4時間で−80℃凍結してから凍結乾燥し
て蒸発乾固させた。
凍結乾燥分注サンプルは、トリス塩酸(0.06M、pH6.8)に希釈した
ドデシル硫酸ナトリウム(3%,w/v)に消化サンプルを再懸濁し、40℃3
分間加熱することにより、電気泳動用に調製した。ドデシル硫酸ナトリウム(1
7.4%,w/v)、グリセロール(6%,w/v)にて100℃3分間で
サンプルを変性させ、トリス(0.025M)/グリシン(0.192M)/ド
デシル硫酸ナトリウム(0.1%、w/v)を用いたポリアクリルアミド・勾配
ミニゲル(8〜16%,w/v、Novex,San Diego,CA)において、3時間12
5V(定電圧)でバッファを流し、電気泳動により単離した。Laemmli,Nature
,227:680 - 685(1970)。単離は非還元条件下で行い、サンプルが還元されると
α1(III)CB5ペプタイドの近くに移動してしまうジスルファイド架橋したα
1(III)CB9ペプタイドの移動を回避した。Kirk et al.,supra.;Turner an
d Laurent,Biochemical Society Transactions 14:1079 - 1080(1986)。ゲル
は、メタノール/酢酸/水(5:1:4)に溶解したページ・ブルー83(0.
1%、w/v、Fluka,Ronkonkoma,NY)で1〜2時間染色した。拡散脱染は酢
酸水溶液(8%、v/v)で24〜48時間掛けて行なった。図6に示したゲル
は、コラーゲンIIIの典型的マーカーペプタイドであるα1(III)CB5ペプタイ
ド・フラグメントがサンプル中に存在することを示しており、ヒト・コラーゲン
調製物にコラーゲンIIIが存在することを表している。
実施例13:
テロペプタイドの存在を立証するための濃縮ヒト・コラーゲンIの臭化シアン
誘導ペプタイドのドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動
による単離
ヒト・コラーゲンIにテロペプタイドが存在することを立証するため、コラー
ゲンを臭化シアンで消化し、ペプタイドをドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリ
ルアミド・ゲル電気泳動でマッピングした。α1(I)CB6ペプタイドはα1
(I)鎖のカルボキシ末端から現れ、非ペプシン処理サンプルではα1(I)鎖
のカルボキシ−テロペプタイドを含んでいる。Chandrakasan et al.,Journal
of Biological Chemistry 251: 6062 - 6067(1976)。テロペプタイドを含有し
ないコラーゲン・サンプルでは(例えばペプシン処理したサンプル)、α1(I
)CB6ペプタイドは低分子量ペプタイドとして移動するので、
α1(I)CB6ペプタイドのこれら2つの態様に基づいてテロペプタイドの存
在を決定することができる[2つのペプタイドを識別するため、テロペプタイド
がない方のペプタイドをα1(I)CB6′と呼ぶことにする]。
ペプシン消化については、実施例8からの濃縮ヒト・コラーゲンを1.5ml
容微量遠心管にピペット分注した(0.75ml)。ペプシン(Sigma Chemical
Company,St.Louis,MO;1M酢酸に対して200μg/ml)を各サンプルに
加え、ペプシンの終濃度が0.5M酢酸中で100μg/mlとなるようにした
。サンプルは4℃16時間で消化した。サンプルの試験管を−80℃4時間で凍
結させてから凍結乾燥により蒸発乾固させた。これらのサンプルは後述するよう
に臭化シアンにより消化された。
実施例8からの非ペプシン処理コラーゲンのサンプルならびに、ヒト胎盤から
ペプシン抽出したコラーゲンIスタンダード、(Sigma type VIII collagen,Sig
ma Chemical Company,St.Louis,MO)、ヒト胎盤からペプシン抽出したコラー
ゲンIII スタンダード(Southern Biotechnology Associates,Birmingham,AL)
を1.5ml容微量遠心管に分注し、パラフィルム(登録商標)で被覆してから
フィルムに穿孔し、試験管を4時間−80℃で凍結し、凍結乾燥に掛け蒸発乾固
した。上記からの非ペプシン処理コラーゲンとペプシン処理コラーゲンの凍結乾
燥サンプルを70%ギ酸(v/v;EM Science,Gibbstown,NJ)0.8mlに再
懸濁し、窒素ガスでパージして溶存酸素を除去した。臭化シアン(Sigma Chemica
l Company,St.Louis,MO)を70%ギ酸(v/v)に溶解して臭化シアンにつ
いて50mg/mlの溶液を作成し、これも窒素ガスで3分間パージした。臭化
シアン溶液の一定量(0.2ml)を再懸濁サンプルに追加し、臭化シアンにつ
いて10mg/mlの終濃度とした。サンプルは5秒間窒素ガスでパージした。
試験管に蓋をして、16時間室温で消化を進行させた。サンプルを1.5ml容
微量遠心管に一定量分注(2×0.45ml)して4時間−80℃凍結してから
凍結乾燥により蒸発乾固させた。
凍結乾燥した臭化シアン消化コラーゲン分注は、トリス塩酸(0.06M、p
H6.8)に溶解したドデシル硫酸ナトリウム(3%,w/v)にサンプルを再
懸濁し、60℃5分間加熱することにより、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリア
クリルアミド・ゲル電気泳動用に調製した。ドデシル硫酸ナトリウム(17.4
%,w/v)、グリセロール(6%,w/v)にて100℃3分間でサンプルを
変性させ、ペプタイドは、トリス(0.025M)/グリシン(0.192M)
/ドデシル硫酸ナトリウム(0.1%、w/v)を用いたポリアクリルアミド・
ミニゲル(16%,w/v、Novex,Sandiego,CA)において、2.5時間12
5V(定電圧)で緩衝液を流し、電気泳動で単離した。Laemmbi,Nature,227:
680-685(1970)。ゲルは、メタノール/酢酸/水(5:1:4)に溶解したペー
ジ・ブルー83(0.1%、w/v、Fluka,Ronkonkoma,NY)で1〜2時間染色
した。拡散脱染は酢酸水溶液(8%、v/v)で24〜48時間掛けて行なった
。図7に示すように、このゲルは、コラーゲン調製物がヒト・コラーゲンの非ペ
プシン処理サンプルにおけるα1(I)CB6バンドの存在により判定される通
りに、完全なテロペプタイドを含むことを示している。非ペプシン処理ヒト・コ
ラーゲン・サンプルにおいては、α1(I)CB6′ペプタイドも幾らか存在し
ていたが、これはおそらく非らせんテロペプタイド領域の部分的分解により発生
したものと思われる。
実施例14:
リシルオキシダーゼ阻害剤β−アミノプロピオニトリルの存在下に無血清培地
中で培養し、Dulbeccoリン酸緩衝生食水により細胞層からヒト・コラーゲンをル
ーチン抽出したヒト線維芽細胞HDF B116細胞株によるコラーゲンの産生
ヒト包皮線維芽細胞(株名HDF B116、Organogenesis Inc.,Canton,
MAから供給)を、4個のプラスチック製組織培養用フラスコ(T75、Costar C
ompany,Cambridge,MA)に後述するような無血清無抗生物質増殖培地を入れて
細胞数5×105個/75cm2に播種した。無血清増殖培地は以下を含む:Dulb
eccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミンなし、BioWhittaker
,Walkersville,MD)とHam の栄養素混合F−12(L−グルタミンなし、Hyclo
ne Labs,Logan,UT)とを3:1(v/v)で混合し、
GlutaMAX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチ
ゾン[0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウシ・イン
シュリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、3,3′,
5−トリヨード−L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chemical Co.,St.
Louis,MO)、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,S
t.Louis,MO)、エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.
Louis,MO)、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M](Sigma
Chemical Co.,St.Louis,MO)、アデニン[1.8×10-4M](Sigma Chemic
al Company,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M](Aldrich Chemica
l Co.,Milwaukee,WI)、β−アミノプロピオニトリル[50μg/ml](Aldr
ich Chemical Co.,Milwaukee,WI)およびヒト遺伝子組み換え上皮成長因子[5
μg/ml](Upstate Biotechnology Inc.,Lake Placid,NY)を添加したも
の。細胞は、空気中に10.0%±0.5%の二酸化炭素を含む雰囲気下で温度
37℃±0.5℃のインキュベータ内でこの増殖培地に維持した。増殖培地は3
〜4日ごとに新たに調製した増殖培地と交換した。7日後、細胞が高度に集密化
し、即ち細胞が高密度に詰った層を組織培養フラスコの底に形成した。この時点
で増殖培地を除去し、コラーゲン産生培地に交換した。この産生培地は、Dulbec
coの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミンなし、BioWhittaker In
c.,Walkersville,MD)とHam の栄養素混合F−12(L−グルタミンなし、Hyc
lone Labs.,Logan,UT)とを3:1(v/v)で混合し、GlutaMAX-I(Gibco B
RL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[0.4μg
/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウシ・インシュリン[5μg
/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、3,3′,5−トリヨード−
L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ヒト
・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、
エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、オ
ルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.
,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M](Aldrich Chemical Co.,Mil
waukee,WI)、β−アミノプ
ロピオニトリル[50μg/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、
L−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n水和物(和光純薬,Richmo
nd,VA)[50μg/ml]、L−プロリン[終濃度1.93×10-3M](Sig
ma Chemical Company,St.Louis,MO)、グリシン[終濃度1.67×10-3M
]を添加したもの。コラーゲン産生培地は3〜4日ごとに新しく調製したコラー
ゲン産生培地と交換した。7日後にDulbeccoリン酸緩衝生食水のコラーゲンを回
収する冷却サイクルを実行した。使用済みコラーゲン産生培地を吸引し、室温Du
lbeccoリン酸緩衝生食水にカルシウムとマグネシウムを添加したもの(カタログ
番号#17−513Q、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)5mlで細胞を
1分間洗浄し、残留培地をすべて除去した。Dulbeccoリン酸緩衝生食水はこの後
吸引した。細胞周囲のコラーゲンを可溶化させるために、カルシウムとマグネシ
ウムを含む4〜8℃Dulbeccoリン酸緩衝生食水(カタログ番号#17−513Q
、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)5mlを各々のフラスコに追加し、フ
ラスコを4〜8℃1時間放置した。1時間後細胞層から溶解したコラーゲンを含
むDulbeccoリン酸緩衝生食水を吸引し、−20℃で凍結した。細胞を含むフラス
コには新鮮なコラーゲン産生培地を加え、高濃度の二酸化炭素10.0%±0.
5%の雰囲気下で温度37.0℃±0.5℃に維持したインキュベータに戻した
。コラーゲン産生培地は3〜4日おきに交換し、産生培地へ交換後、前述したよ
うに7日目、21日目、28日目、35日目、42日目にDulbeccoリン酸緩衝生
食水に抽出して細胞周囲層からコラーゲンを回収した。Dulbeccoリン酸緩衝生食
水で毎回コラーゲンを回収してから、新たに調製したコラーゲン産生培地を培養
に加えた。産生培地で42日目の第5回回収の後、培養を終了し、細胞スクレー
パー(Costar Corporation,Cambridge,MA)を用いて酢酸水溶液(5ml、0.
5M;J.T.Baker Inc.,Phllipsburg,NJ)に細胞を掻き落とした。掻き落とし
た細胞を含む酢酸は遠心管(25×89ミリ超遠心管、オープントップ型、肉厚
ポリアロマー遠心管、Nalge Company,Rochester,NY)に入れ、細胞層の酢酸溶
解性コラーゲンを可溶化した。掻き落とした細胞層は4〜8℃の酢酸に一晩放置
しておき、この後でベックマン高速遠心分離器(Model J2-21,Beckman Instrume
nts,Inc.,Palo Alto,CA)を用いて31,000gl
で時間で遠心した。各サンプルの上清をペレットから吸引し−20℃で凍結した
。ペレットは酢酸不溶性コラーゲン、細胞残渣、およびその他の不溶性物質を含
んでおり、これも−20℃で凍結した。
このような培養でのコラーゲン産生を検証するため、可溶化コラーゲンを含む
Dulbeccoリン酸緩衝生食水と酢酸上清をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動に掛けてコラーゲンα鎖の存在を同定した。各冷却サイク
ルからの可溶化コラーゲンを含むDulbeccoリン酸緩衝生食水と、水酸化ナトリウ
ムで中和しておいた細胞層からの酢酸溶解性材料、およびヒト胎盤からペプシン
抽出したヒト・コラーゲンI標準液(Sigma type VIIIコラーゲン,Sigma Chemic
al Company,St.Louis,MO)から一定量を取り出し、ドデシル硫酸ナトリウム(
17.4%,w/v)、グリセロール(6%,w/v)、βメルカプトエタノー
ル(1.5%、v/v)により100℃3分間で変性させてから、トリス(0.
025M)/グリシン(0.192M)/ドデシル硫酸ナトリウム(0.1%、
w/v)緩衝液系を用いたポリアクリルアミド・ミニゲル(8%,w/v、Nove
x,San diego,CA)で125V(定電圧)2.25時間の電気泳動により分離し
た。Laemmli,Nature,227: 680 - 685(1970)。ゲルは、メタノール/酢酸/水
(5:1:4)に溶解したページ・ブルー83(0.1%、w/v、Fluka,Ronk
onkoma,NY)で1〜2時間染色した。拡散脱染は酢酸水溶液(8%、v/v)で
24〜48時間掛けて行なった。図8に示すように、このゲルは、ゲル上のコラ
ーゲンα1(I)鎖およびa2(I)鎖として移動したバンドの存在により判定
されるように、4〜8℃のDulbeccoリン酸緩衝生食水で細胞層からヒト・コラー
ゲンが抽出されたことを示している。また、コラーゲンα鎖は細胞層から得られ
た酢酸溶解性物質にも観察された。使用した分注量ではゲル上のページ/ブルー
83染色によるその他のバンドは発見されなかった。以上の結果は、ヒト新生児
包皮線維芽細胞(細胞株HDF B116)がこの方法によってヒト・コラーゲ
ンを産生できることを示している。
実施例15:
リシルオキシダーゼ阻害剤β−アミノプロピオニトリルの存在下に無血清培地
中で培養し、Dulbeccoリン酸緩衝生食水により細胞層からヒト・コラーゲンのル
ーチン抽出した細胞株HDF B117ヒト線維芽細胞によるコラーゲンの産生
ヒト新生児包皮線維芽細胞(株名HDF B117、Organogenesis Inc.,Ca
nton,MAから供給)を、4個のプラスチック製組織培養用フラスコ(T75、Cos
tar Company,Cambridge,MA)に後述するような無血清無抗生物質増殖培地を入
れて細胞数5×105個/75cm2となるように播種した。無血清増殖培地は以
下を含む:Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミンなし
、BioWhittaker,Walkersville,MD)とHamの栄養素混合F−12(L−グルタミ
ンなし、Hyclone Labs,Logan,UT)とを3:1(v/v)で混合し、GlutaMAX-I
(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[0
.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウシ・インシュリン
[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、3,3′,5−トリ
ヨード−L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O)、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis
,MO)、エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O)、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemica
l Co.,St.Louis,MO)、アデニン[1.8×10-4M](Sigma Chemical Compa
ny,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M](Aldrich Chemical Co.,M
ilwaukee,WI)、β−アミノプロピオニトリル[50μg/ml](Aldrich Chem
ical Co.,Milwaukee,WI)およびヒト遺伝子組み換え上皮成長因子[5ng/m
l](Upstate Biotechnology Inc.,Lake Placid,NY)を添加したもの。細胞は
、空気中に10.0%±0.5%の二酸化炭素を含む雰囲気下で温度37℃±0
.5℃のインキュベータ内でこの増殖培地に保持した。増殖培地は3〜4日ごと
に新鮮な調製増殖培地と交換した。18日後、細胞が高度に集密化、即ち細胞が
高密度に
詰った層を組織培養フラスコの底に形成した。この時点で増殖培地を除去し、コ
ラーゲン産生培地に交換した。この産生培地は、Dulbeccoの改良Eagle 培地(高
グルコース処方、L−グルタミンなし、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)
とHam の栄養素混合F−12(L−グルタミンなし、Hyclone Labs.,Logan,UT
)とを3:1(v/v)で混合し、GlutaMAX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD
)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[0.4μg/ml](Sigma Chemica
l Co.,St.Louis,MO)、ウシ・インシュリン[5μg/ml](Sigma Chemical
Co.,St.Louis,MO)、3,3′,5−トリヨード−L−サイロニン[2×10-11
M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ヒト・トランスフェリン[5μ
g/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、エタノールアミン[1×1
0-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、オルソ−フォスフォリルエタ
ノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、セレン
酸[5.3×10-8M](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、β−アミノ
プロピオニトリル[50μg/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)
、L−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n水和物(和光純薬Wako Pu
re Chemical Industries,Ltd.,Richmond,VA)[50μg/ml]、L−プロ
リン[終濃度1.93×10-3M](Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)
およびグリシン[終濃度1.67×10-3M]を添加したもの。コラーゲン産生
培地は3〜4日ごとに新しく調製したコラーゲン産生培地と交換した。7日後に
、Dulbeccoリン酸緩衝生食水のコラーゲンを回収する冷却サイクルを実行した。
使用済みコラーゲン産生培地を吸引し、室温Dulbeccoリン酸緩衝生食水にカルシ
ウムとマグネシウムを添加したもの(カタログ番号#17−513Q、BioWhitta
ker Inc.,Walkersville,MD)5mlで細胞を1分間洗浄し、残留培地をすべて
除去した。Dulbeccoリン酸緩衝生食水はこの後吸引した。細胞周囲のコラーゲン
を可溶化させるために、カルシウムとマグネシウムを含む4〜8℃Dulbeccoリン
酸緩衝生食水(カタログ番号#17−513Q、BioWhittaker Inc.,Walkersvil
le,MD)5mlを各々のフラスコに追加し、フラスコを4〜8℃1時間放置した
。1時間後、細胞層から溶解したコラーゲンを含むDulbeccoリン酸緩衝生食水を
吸引し、−20℃で凍結し
た。細胞を含むフラスコには新鮮なコラーゲン産生培地を加え、空気中の二酸化
炭素10.0%±0.5%の雰囲気下で温度37.0℃±0.5℃に保持したイ
ンキュベータに戻した。コラーゲン産生培地は3〜4日おきに交換し、産生培地
へ交換後、前述したように毎週Dulbeccoリン酸緩衝生食水に抽出して細胞周囲層
からコラーゲンを回収した。Dulbeccoリン酸緩衝生食水で毎回コラーゲンを回収
してから、新規に調製したコラーゲン産生培地を培養に加えた。第5回目の回収
の後、細胞スクレーパー(Costar Corporation,Cambridge,MA)を用いて酢酸水
溶液(5ml、0.5M;J.T.Baker Inc.,Phllipsburg,NJ)に細胞を掻き落
とした。掻き落とした細胞を含む酢酸は遠心管(17×76ミリ超遠心管、オー
プントップ型、肉厚、ポリカーボネート製遠心管、Nalge Company,Rochester,
NY)に入れ、細胞層の酢酸溶解性コラーゲンを溶解した。掻き落とした細胞層は
4〜8℃の酢酸に一晩放置しておき、この後でベックマン超遠心機(model L8-70
M,Beckman Instruments,Inc.,Palo Alto,CA)において20,000g30分
間遠心した。各サンプルの上清をペレットから吸引し−20℃で凍結した。ペレ
ットは酢酸不溶性コラーゲン、細胞残渣、およびその他の不溶性物質を含んでお
り、これも−20℃で凍結した。
これらの培養によるコラーゲン産生を検証するため、可溶化したコラーゲンを
含むDulbeccoリン酸緩衝生食水と酢酸上清をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動に掛けてコラーゲンα鎖の存在を同定した。各冷却サ
イクルからの可溶化コラーゲンを含むDulbeccoリン酸緩衝生食水と、細胞層から
の酢酸抽出物を一定量取り出し、ドデシル硫酸ナトリウム(17.4%,w/v
)、グリセロール(6%,w/v)、βメルカプトエタノール(1.5%、v/
v)により100℃3分間で変性させてから、トリス(0.025M)/グリシ
ン(0.192M)/ドデシル硫酸ナトリウム(0.1%、v/v)緩衝液系を
用いたポリアクリルアミド・ミニゲル(8%,w/v、Novex,San diego,CA)
で125V(定電圧)2.25時間の電気泳動により分離した。Laemmli,Natur
e,227: 680 - 685(1970)。ゲルは、メタノール/酢酸/水(5:1:4)に
溶解したページ・ブルー83(0.1%、w/v、Fluka,Ronkonkoma,NY)で
1〜2時間染色した。拡散脱染は酢酸水溶液(8%、v/v)で24〜
48時間掛けて行なった。図9に示したすように、このゲルでは、ゲル上のコラ
ーゲンα1(I)およびα2(I)鎖として移動したバンドの存在により判定さ
れるように、4〜8℃のDulbeccoリン酸緩衝生食水で細胞層からヒト・コラーゲ
ンが抽出されたことを示している。また、コラーゲンα鎖は細胞層から得られた
酢酸溶解性物質にも観察された。使用した分注量ではゲル上のページ・ブルー8
3染色によるその他のバンドは発見されなかった。以上の結果は、ヒト新生児包
皮線維芽細胞細胞株HDF B117がこの方法によってヒト・コラーゲンを産
生できることを示している。
実施例16:
リシルオキシダーゼ阻害剤β−アミノプロピオニトリルの存在下に無血清培地
中で培養し、Dulbeccoリン酸緩衝生食水により細胞層からコラーゲンをルーチン
抽出した細胞株SAF 012Aヒツジ動脈線維芽細胞によるコラーゲンの産生
ヒツジ動脈線維芽細胞(細胞株名SAF 012A、Organogenesis Inc.,Ca
nton,MAから供給)を、4個のプラスチック製組織培養用フラスコ(T75、Cos
tar Company,Cambridge,MA)に後述するような無血清無抗生物質増殖培地を入
れて細胞数5×105個/75cm2となるように播種した。無血清増殖培地は以
下を含む:Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミンなし
、BioWhittaker,Walkersville,MD)とHam の栄養素混合F−12(L−グルタ
ミンなし、Hyclone Labs,Logan,UT)とを3:1(v/v)で混合し、GlutaMAX
-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[
0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウシ・インシュリ
ン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、3,3′,5−ト
リヨード−L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chemical Co.,St.Louis
,MO)、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Lo
uis,MO)、エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis
,MO)、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chem
ical Co.,St.Louis,MO)、アデニン
[1.8×10-4M](Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)セレン酸[5
.3×10-8M](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、β−アミノプロピ
オニトリル[50μg/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)および
ヒト遺伝子組み換え上皮成長因子[5ng/ml](Upstate Biotechnology Inc
.,Lake Placid,NY)を添加したもの。細胞は、空気中に10.0%±0.5%
の二酸化炭素を含む雰囲気下で温度37℃±0.5℃のインキュベータ内でこの
増殖培地に保持した。増殖培地は3〜4日ごとに新たに調製した増殖培地と交換
した。10日後、細胞が高度にに集密化、即ち細胞が高密度に詰った層を組織培
養フラスコの底に形成した。この時点で増殖培地を除去し、コラーゲン産生培地
に交換した。産生培地は、Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−
グルタミンなし、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)とHam の栄養素混合
F−12(L−グルタミンなし、Hyclone Labs.,Logan,UT)とを3:1(v/
v)で混合し、GlutaMAX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]
、ハイドロコーチゾン[0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,
MO)、ウシ・インシュリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O)、3,3′,5−トリヨード−L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chem
ical Co.,St.Louis,MO)、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma C
hemical Co.,St.Louis,MO)、エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chem
ical Co.,St.Louis,MO)、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×1
0-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M
](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、β−アミノプロピオニトリル[5
0μg/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、L−アスコルビン酸
リン酸エステルマグネシウム塩n水和物(和光純薬,Richmond,VA)[50μg
/ml]、L−プロリン[終濃度1.93×10-3M](Sigma Chemical Compan
y,St.Louis,MO)およびグリシン[終濃度1.67×10-3M]を添加したも
の。コラーゲン産生培地は3〜4日ごとに新しく調製したコラーゲン産生培地と
交換した。7日後に、Dulbeccoリン酸緩衝生食水のコラーゲンを回収する冷却サ
イクルを実行した。使用済みコラーゲン産生培地を吸引し、室温Dulbecco
リン酸緩衝生食水にカルシウムとマグネシウムを添加したもの(カタログ番号#
17−513Q、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)5mlで細胞を1分間
洗浄し、残留培地をすべて除去した。Dulbeccoリン酸緩衝生食水はこの後吸引し
た。細胞周囲のコラーゲンを溶解させるために、カルシウムとマグネシウムを含
む4〜8℃Dulbeccoリン酸緩衝生食水(カタログ番号#17−513Q、BioWhi
ttaker Inc.,Walkersville,MD)5mlを各々のフラスコに追加し、フラスコ
を4〜8℃1時間放置した。1時間後、細胞層から溶解したコラーゲンを含むDu
lbeccoリン酸緩衝生食水を吸引し、−20℃で凍結した。細胞を含むフラスコに
は新鮮なコラーゲン産生培地を加え、高濃度の二酸化炭素10.0%±0.5%
の雰囲気下で温度37.0℃±0.5℃に保持したインキュベータに戻した。コ
ラーゲン産生培地は3〜4日おきに交換し、産生培地へ交換後、前述したように
7日目、12日目、21日目、28日目、35日目にDulbeccoリン酸緩衝生食水
に抽出して細胞周囲層からコラーゲンを回収した。Dulbeccoリン酸緩衝生食水で
毎回コラーゲンを回収してから、新に調製したコラーゲン産生培地を培養に加え
た。産生培地で35日目の第5回目の回収の後、培養を終了し、細胞スクレーパ
ー(Costar Corporation,Cambridge,MA)を用いて酢酸水溶液(5ml、0.5
M;J.T.Baker Inc.,Phllipsburg,NJ)に細胞を掻き落とした。掻き落とした
細胞を含む酢酸は遠心管(16×76ミリ超遠心管、オープントップ型、肉厚、
ポリカーボネート製遠心管、Nalge Company,Rochester,NY)に入れ、細胞層の
酢酸溶解性コラーゲンを溶解させた。掻き落とした細胞層は4〜8℃の酢酸に一
晩放置しておき、この後でベックマン超遠心機(model L8-70M,Beckman Instrum
ents,Inc.,Palo alto,CA)において20,000g30分間遠心した。各サン
プルの上清をペレットから吸引し−20℃で凍結した。ペレットは酢酸不溶性コ
ラーゲン、細胞残渣、およびその他の不溶性物質を含んでおり、これも−20℃
で凍結した。
これらの培養によるコラーゲン産生を検証するため、可溶化したコラーゲンを
含むDulbeccoリン酸緩衝生食水と酢酸上清をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動に掛けてコラーゲンα鎖の存在を同定した。産生培地
において21日後、28日後、35日後の各冷却洗浄サイクル洗浄物からの
Dulbeccoリン酸緩衝生食水と、細胞層からの酢酸抽出物を一定量取り出し、ドデ
シル硫酸ナトリウム(17.4%,w/v)、グリセロール(6%,w/v)、
βメルカプトエタノール(1.5%、v/v)により100℃3分間で変性させ
てから、トリス(0.025M)/グリシン(0.192M)/ドデシル硫酸ナ
トリウム(0.1%、w/v)緩衝液系を用いたポリアクリルアミド・ミニゲル
(8%,w/v)Novex,Sandiego,CA)で125V(定電圧)2.25時間の
電気泳動により分離した。Laemmli,Nature,227: 680 - 685(1970)。ゲルは、
メタノール/酢酸/水(5:1:4)に溶解したページ・ブルー83(0.1%
、w/v、Fluka,Ronkonkoma,NY)で1〜2時間染色した。拡散脱染は酢酸水溶
液(8%、v/v)で24〜48時間掛けて行なった。図10に示すように、こ
のゲルでは、ゲル上のコラーゲンα1(I)鎖およびα2(I)鎖として移動し
たバンドの存在により判定されるように、4〜8℃のDulbeccoリン酸緩衝生食水
で細胞層からヒト・コラーゲンが抽出されたことを示している。また、コラーゲ
ンα鎖は細胞層から得られた酢酸溶解性物質にも観察された。使用した分注量で
はゲル上のページ・ブルー83染色によるその他のバンドは発見されなかった。
以上の結果は、ヒツジ動脈線維芽細胞の細胞株SAF 012Aがこの方法によ
ってヒト・コラーゲンを産生できることを示している。
実施例17:
リシルオキシダーゼ阻害剤β−アミノプロピオニトリルの存在下に無血清培地
中で培養し、カルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食
水により細胞層からのヒト・コラーゲンのルーチン抽出した細胞株HDF B1
19ヒト線維芽細胞によるコラーゲンの産生
ヒト新生児包皮線維芽細胞(株名HDF B119、Organogenesis Inc.,Ca
nton,MAから供給)を、4個のプラスチック製組織培養用フラスコ(T75、Cos
tar Company,Cambridge,MA)に後述するような無血清無抗生物質増殖培地を入
れて細胞数7×105個/75cm2となるように播種した。無血清増殖培地は以
下を含む:Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミン
なし、BioWhittaker,Walkersville,MD)とHam の栄養素混合F−12(L−グ
ルタミンなし、Hyclone Labs,Logan,UT)とを3:1(v/v)で混合し、Glut
aMAX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾ
ン[0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウシ・インシ
ュリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、3,3′,5
−トリヨード−L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chemical Co.,St.Lo
uis,MO)、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St
.Louis,MO)、エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.L
ouis,MO)、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M](Sigma
Chemical Co.,St.Louis,MO)、アデニン[1.8×10-4M](Sigma Chemica
l Company,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M](Aldrich Chemical
Co.,Milwaukee,WI)、β−アミノプロピオニトリル[50μg/ml](Aldri
ch Chemical Co.,Milwaukee,WI)およびヒト遺伝子組み換え上皮成長因子[5
ng/ml](Upstate Biotechnology Inc.,Lake Placid,NY)を添加したもの
。細胞は、空気中に10.0%±0.5%の二酸化炭素を含む雰囲気下で温度3
7℃±0.5℃のインキュベータ内でこの増殖培地に保持した。増殖培地は3〜
4日ごとに新鮮な調製増殖培地と交換した。13日後、細胞が高度に集密化、即
ち細胞が高密度に詰った層を組織培養フラスコの底に形成した。この時点で増殖
培地を除去し、コラーゲン産生培地に交換した。産生培地は、Dulbeccoの改良Ea
gle 培地(高グルコース処方、L−グルタミンなし、BioWhittaker Inc.,Walker
sville,MD)とHam の栄養素混合F−12(L−グルタミンなし、Hyclone Labs.
,Logan,UT)とを3:1(v/v)で混合し、GlutaMAX-I(Gibco BRL,Gainthe
rsburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[0.4μg/ml](Sig
ma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウシ・インシュリン[5μg/ml](Sigm
a Chemical Co.,St.Louis,MO)、3,3′,5−トリヨード−L−サイロニン
[2×10-11M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ヒト・トランスフェ
リン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、エタノールアミ
ン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、オルソ−フォス
フォリルエタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,
MO)、セレン酸[5.3×10-8M](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、
β−アミノプロピオニトリル[50μg/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwa
ukee,WI)、L−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n水和物(和光
純薬,Richmond,VA)[50μg/ml]、L−プロリン[終濃度1.93×1
0-3M](Sigma Chemical Company,St.Louis,MO およびグリシン[終濃度1
.67×10-3M]を添加した。コラーゲン産生培地は3〜4日ごとに新しく調
製したコラーゲン産生培地と交換した。15日後に、カルシウムまたはマグネシ
ウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水のコラーゲンを回収する冷却サイクル
を実行した。使用済みコラーゲン産生培地を吸引し、カルシウムとマグネシウム
を含まない室温のDulbeccoリン酸緩衝生食水洗浄液(カタログ番号#17−51
2F、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)5mlで細胞を1分間洗浄し、残
留培地をすべて除去した。カルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリ
ン酸緩衝生食水はこの後吸引した。細胞周囲のコラーゲンを溶解させるために、
カルシウムまたはマグネシウムを含まない4〜8℃Dulbeccoリン酸緩衝生食水(
カタログ番号#17−512F、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)5m
lを各々のフラスコに追加し、フラスコを4〜8℃1時間放置した。1時間後、
細胞層から溶解したコラーゲンを含みカルシウムまたはマグネシウムを含まない
Dulbeccoリン酸緩衝生食水を吸引し、−20℃で凍結した。細胞を含むフラスコ
には新鮮なコラーゲン産生培地を加え、大気中の二酸化炭素10.0%±0.5
%の雰囲気下で温度37.0℃±0.5℃に保持したインキュベータに戻した。
コラーゲン産生培地は3〜4日おきに交換し、産生培地へ交換後、前述したよう
に、毎週カルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水へ
抽出して、5週間に渡り細胞周囲層からコラーゲンを回収した。カルシウムまた
はマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水で毎回コラーゲンを回収し
てから、新規に調製したコラーゲン産生培地を培養に加えた。第5回目の回収の
後、細胞スクレーパー(Costar Corporation,Cambridge,MA)を用いて酢酸水溶
液(5ml、0.5M;J.T.Baker Inc.,Phllipsburg,NJ)に細胞を掻き落と
した。掻き落とした細胞を含む酢酸は遠心
管(16×76ミリ超遠心管、オープントップ型、肉厚、ポリカーボネート製遠
心管、Nalge Company,Rochester,NY)に入れ、細胞層の酢酸溶解性コラーゲン
を溶解した。掻き落とした細胞層は4〜8℃の酢酸に一晩放置しておき、この後
で40型ローターを使用してベックマン高速遠心機(model J2-21,Beckman Inst
ruments,Inc.,Palo alto,CA)で20,000g30分間遠心した。各サンプ
ルの上清をペレットから吸引し−20℃で凍結した。ペレットは酢酸不溶性コラ
ーゲン、細胞残渣、およびその他の不溶性物質を含んでおり、これも−20℃で
凍結した。
これらの培養によるコラーゲン産生を検証するため、溶解したコラーゲンを含
みカルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水と酢酸上
清をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に掛けてコラ
ーゲンα鎖の存在を同定した。各冷却サイクルからの溶解コラーゲンを含みカル
シウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水と、水酸化ナト
リウムで中和した細胞層からの酢酸抽出物を一定量取り出し、ドデシル硫酸ナト
リウム(17.4%,w/v)、グリセロール(6%,w/v)およびβメルカ
プトエタノール(1.5%、v/v)により100℃3分間で変性させてから、
トリス(0.025M)/グリシン(0.192M)/ドデシル硫酸ナトリウム
(0.1%、w/v)緩衝液系を用いたポリアクリルアミド・ミニゲル(8%,
w/v、Novex,San diego,CA)で125V(定電圧)2.25時間の電気泳動
により分離した。Laemmli,Nature,227: 680 - 685(1970)。ゲルは、メタノー
ル/酢酸/水(5:1:4)に希釈したページ・ブルー83(0.1%、w/v
、Fluka,Ronkonkoma,NY)で1〜2時間染色した。拡散脱染は酢酸水溶液(8%
、v/v)で24〜48時間掛けて行なった。ゲル上のコラーゲンα1(I)鎖
およびα2(I)鎖として移動したバンドの存在により判定されるように、4〜
8℃のDulbeccoリン酸緩衝生食水で細胞層からヒト・コラーゲンが抽出されたこ
とを示している。また、コラーゲンα鎖は細胞層から得られた酢酸溶解性物質に
も観察された。使用した分注量では、ゲル上のページ・ブルー83染色によるそ
の他のバンドは発見されなかった。以上の結果は、カルシウムまたはマグネシウ
ムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水でβ−アミノプロピオニト
リルの存在下に細胞層に堆積したコラーゲンを溶解し得たことを示している。
実施例18:
リシルオキシダーゼ阻害剤β−アミノプロピオニトリルの存在下に無血清培地
中で培養し、カルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食
水により細胞層からのヒト・コラーゲンのルーチン抽出した細胞株HDF B1
19ヒト線維芽細胞によるコラーゲンの産生
ヒト新生児包皮線維芽細胞(株名HDF B119、Organogenesis Inc.,Ca
nton,MAから供給)を、4個のプラスチック製組織培養用フラスコ(T75、Cos
tar Company,Cambridge,MA)に後述するような無血清無抗生物質増殖培地を入
れて細胞数7×105個/75cm2となるように播種した。無血清増殖培地は以
下を含む:Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミンなし
、BioWhittaker,Walkersville,MD)とHam の栄養素混合F−12(L−グルタ
ミンなし、Hyclone Labs,Logan,UT)とを3:1(v/v)で混合し、GlutaMAX
-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[
0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウシ・インシュリ
ン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、3,3′,5−ト
リヨード−L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chemical Co.,St.Louis
,MO)、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Lo
uis,MO)、エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis
,MO)、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chem
ical Co.,St.Louis,MO)、アデニン[1.8×10-4M](Sigma Chemical Co
mpany,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M](Aldrich Chemical Co.
,Milwaukee,WI)、β−アミノプロピオニトリル[50μg/ml](Aldrich C
hemical Co.,Milwaukee,WI)およびヒト遺伝子組み換え上皮成長因子[5ng
/ml](Upstate Biotechnology Inc.,LakePlacid,NY)を添加したもの。細
胞は、空気中に10.0%±0.5%の二酸化炭素を含む雰囲気下で温度37℃
±0.5℃のイ
ンキュベータ内でこの増殖培地に保持した。増殖培地は3〜4日ごとに新規調製
した増殖培地と交換した。13日後、細胞が高度に集密化、即ち細胞が高密度に
詰った層を組織培養フラスコの底に形成した。この時点で増殖培地を除去し、コ
ラーゲン産生培地に交換した。産生培地は、Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グル
コース処方、L−グルタミンなし、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)とHa
m の栄養素混合F−12(L−グルタミンなし、Hyclone Labs.,Logan,UT)とを
3:1(v/v)で混合し、GlutaMAX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4
×10-3M]、ハイドロコーチゾン[0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.
,St.Louis,MO)、ウシ・インシュリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.
,St.Louis,MO)、3,3′,5−トリヨード−L−サイロニン[2×10-11
M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ヒト・トランスフェリン[5μg
/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、エタノールアミン[1×10- 4
M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、オルソ−フォスフォリルエタノー
ルアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、セレン酸[
5.3×10-8M](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、β−アミノプロ
ピオニトリル[50μg/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、L
−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n水和物(和光純薬,Richmond
,VA)[50μg/ml]、L−プロリン[終濃度1.93×10-3M](Sigma
Chemical Company,St.Louis,MO)およびグリシン[終濃度1.67×10-3
M(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)]を添加した。コラーゲン産生培
地は3〜4日ごとに新しく調製したコラーゲン産生培地と交換した。15日後に
、カルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水のコラー
ゲンを回収する冷却サイクルを実行した。使用済みコラーゲン産生培地を吸引し
、カルシウムまたはマグネシウムを含まない室温のDulbeccoリン酸緩衝生食水(
カタログ番号#17−516B;BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)5ml
で細胞を1分間洗浄し、残留培地をすべて除去した。カルシウムまたはマグネシ
ウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水はこの後吸引した。細胞周囲のコラー
ゲンを溶解させるために、カルシウムまたはマグネシウムを含まない4〜8℃Du
lbeccoリン酸緩衝生食水(カタロ
グ番号#17−516B、BioWhittaker Inc.,Walkersville,MD)5mlを各々
のフラスコに追加し、フラスコを4〜8℃1時間放置した。1時間後、細胞層か
ら溶解したコラーゲンを含みカルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbecco
リン酸緩衝生食水を吸引し、−20℃で凍結した。細胞を含むフラスコには新鮮
なコラーゲン産生培地を加え、空気中の二酸化炭素濃度10.0%±0.5%の
雰囲気下で温度37.0℃±0.5℃に保持したインキュベータに戻した。コラ
ーゲン産生培地は3〜4日おきに交換し、産生培地へ交換後、前述したように、
毎週カルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水へ抽出
して5週間に渡り細胞周囲層からコラーゲンを回収した。カルシウムまたはマグ
ネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水で毎回コラーゲンを回収してから
、新規に調製したコラーゲン産生培地を培養に加えた。第5回目の回収の後、細
胞スクレーパー(Costar Corporation,Cambridge,MA)を用いて酢酸水溶液(5
ml、0.5M;J.T.Baker Inc.,Phllipsburg,NJ)に細胞を掻き落とした。
掻き落とした細胞を含む酢酸は遠心管(167×76ミリ超遠心管、オープント
ップ型、肉厚、ポリカーボネート製遠心管、Nalge Company,Rochester,NY)に
入れ、細胞層の酢酸溶解性コラーゲンを溶解した。掻き落とした細胞層は4〜8
℃の酢酸に一晩放置しておき、この後で40型ローターを使用してベックマン高
速遠心機(model J2-21,Beckman Instruments,Inc.,Palo alto,CA)で20,
000g30分間遠心した。各サンプルの上清をペレットから吸引し−20℃で
凍結した。ペレットは酢酸不溶性コラーゲン、細胞残渣、およびその他の不溶性
物質を含んでおり、これも−20℃で凍結した。
これらの培養によるコラーゲン産生を検証するため、溶解したコラーゲンを含
みカルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水と酢酸上
清をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動に掛けてコラ
ーゲンα鎖の存在を同定した。各冷却サイクルからの溶解コラーゲンを含みカル
シウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水と、水酸化ナト
リウムで中和した細胞層からの酢酸抽出物を一定量取り出し、ドデシル硫酸ナト
リウム(17.4%,w/v)、グリセロール(6%,w/v)、βメルカプト
エタノール(1.5%、v/v)により100℃3分間で変性させてから、ト
リス(0.025M)/グリシン(0.192M)/ドデシル硫酸ナトリウム(
0.1%、v/v)緩衝液系を用いたポリアクリルアミド・ミニゲル(8%,w
/v、Novex,Sandiego,CA)で125V(定電圧)2.25時間の電気泳動に
より分離した。Laemmli,Nature,227: 680 - 685(1970)。ゲルは、メタノール
/酢酸/水(5:1:4)に溶解したページ・ブルー83(0.1%、w/v、F
luka,Ronkonkoma,NY)で1〜2時間染色した。拡散脱染は酢酸水溶液(8%、
v/v)で24〜48時間掛けて行なった。ゲル上のコラーゲンα1(I)鎖お
よびα2(I)鎖として移動したバンドの存在により判定されるように、4〜8
℃のカルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水で細胞
層からヒト・コラーゲンが抽出されたことを示している。また、コラーゲンα鎖
は細胞層から得られた酢酸溶解性物質にも観察された。使用した分注量ではゲル
上のページ・ブルー83染色によるその他のバンドは発見されなかった。以上の
結果は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないDulbeccoリン酸緩衝生食水で
β−アミノプロピオニトリルの存在下に細胞層に堆積したコラーゲンを溶解し得
たことを示している。
実施例19:
リシルオキシダーゼ阻害剤β−アミノプロピオニトリルの存在下に無血清培地
中で培養し、0.3M塩化ナトリウム溶液による細胞層からのヒト・コラーゲン
のルーチン抽出した細胞株HDF B119ヒト線維芽細胞によるコラーゲンの
産生
ヒト新生児包皮線維芽細胞(細胞株名HDF B119、Organogenesis Inc.
,Canton,MAから供給)を、4個のプラスチック製組織培養用フラスコ(T75
、Costar Company,Cambridge,MA)に後述するような無血清無抗生物質増殖培地
を入れて細胞数7×105個/75cm2となるように播種した。無血清増殖培地
は以下を含む:Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミン
なし、BioWhittaker,Walkersville,MD)とHam の栄養素混合F−12(L−グ
ルタミンなし、Hyclone Labs,Logan,UT)とを3:1(v/
v)で混合し、GlutaMAX-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]
、ハイドロコーチゾン[0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,
MO)、ウシ・インシュリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O)、3,3′,5−トリヨード−L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chem
ical Co.,St.Louis,MO)、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma C
hemical Co.,St.Louis,MO)、エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chem
ical Co.,St.Louis,MO)、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×1
0-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、アデニン[1.8×10-4M
](Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M](
Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、β−アミノプロピオニトリル[50μ
g/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)およびヒト遺伝子組み換え
上皮成長因子[5ng/ml](Upstate Biotechnology Inc.,Lake Placid,NY
)を添加したもの。細胞は、空気中に10.0%±0.5%の二酸化炭素を含む
雰囲気下で温度37℃±0.5℃のインキュベータ内でこの増殖培地に保持した
。増殖培地は3〜4日ごとに新規調製した増殖培地と交換した。13日後、細胞
が高度に集密化、即ち細胞が高密度に詰った層を組織培養フラスコの底に形成し
た。この時点で増殖培地を除去し、コラーゲン産生培地に交換した。産生培地は
、Dulbeccoの改良Eagle 培地(高グルコース処方、L−グルタミンなし、BioWhi
ttaker Inc.,Walkersville,MD)とHam の栄養素混合F−12(L−グルタミ
ンなし、Hyclone Labs.,Logan,UT)とを3:1(v/v)で混合し、GlutaMAX
-I(Gibco BRL,Gainthersburg,MD)[4×10-3M]、ハイドロコーチゾン[
0.4μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、ウシ・インシュリ
ン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)、3,3′,5−トリ
ヨード−L−サイロニン[2×10-11M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O)、ヒト・トランスフェリン[5μg/ml](Sigma Chemical Co.,St.Louis
,MO)、エタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemical Co.,St.Louis,M
O)、オルソ−フォスフォリルエタノールアミン[1×10-4M](Sigma Chemica
l Co.,St.Louis,MO)、セレン酸[5.3×10-8M]
(Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、β−アミノプロピオニトリル[50
μg/ml](Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)、L−アスコルビン酸リ
ン酸エステルマグネシウム塩n水和物(和光純薬,Richmond,VA)[50μg/
ml]、L−プロリン[終濃度1.93×10-3M](Sigma Chemical Company
,St.Louis,MO)およびグリシン[終濃度1.67×10-3M](Sigma Chemica
l Company,St.Louis,MO)を添加した。コラーゲン産生培地は3〜4日ごとに
新しく調製したコラーゲン産生培地と交換した。15日後に、塩化ナトリウム溶
液中のコラーゲンを回収する冷却サイクルを実行した。使用済みコラーゲン産生
培地を吸引し、室温の塩化ナトリウム溶液(0.3M;Mallinckrodt Specialty
Chemicals,Chesterfield,MO)5mlで1分間、細胞を洗浄して残留培地をす
べて除去した。塩化ナトリウム溶液はその後吸引した。細胞周囲のコラーゲンを
可溶化させるために、4〜8℃の塩化ナトリウム溶液(0.3M;Mallinckrodt
Specialty Chemicals,Chesterfield,MO)5mlを各々のフラスコに追加し、
フラスコを4〜8℃1時間放置した。1時間後、細胞層から溶解したコラーゲン
を含む塩化ナトリウム溶液を吸引し、−20℃で凍結した。細胞を含むフラスコ
には新鮮なコラーゲン産生培地を加え、大気中の二酸化炭素10.0%±0.5
%の雰囲気下で温度37.0℃±0.5℃に保持したインキュベータに戻した。
コラーゲン産生培地は3〜4日おきに交換し、産生培地へ交換後、前述したよう
に毎週塩化ナトリウム溶液中に抽出することにより5週間に渡り細胞周囲層から
コラーゲンを回収した。塩化ナトリウム溶液により毎回コラーゲンを回収してか
ら、新規に調製したコラーゲン産生培地を培養に加えた。第5回目の回収の後、
細胞スクレーパー(Costar Corporation,Cambridge,MA)を用いて酢酸水溶液(
5ml、0.5M;J.T.Baker Inc.,Phllipsburg,NJ)に細胞を掻き落とした
。掻き落とした細胞を含む酢酸は遠心管(16×76ミリ超遠心管、オープント
ップ型、肉厚、ポリカーボネート製遠心管、Nalge Company,Rochester,NY)に
入れ、細胞層の酢酸溶解性コラーゲンを溶解した。掻き落とした細胞層は4〜8
℃の酢酸に一晩放置しておき、この後で40型ローターを使用してベックマン高
速遠心機(model J2-21,Beckman Instruments,Inc.,Palo alto,CA)で20,
000gで30分間遠心した。各サンプルの上清
をペレットから吸引し−20℃で凍結した。ペレットは酢酸不溶性コラーゲン、
細胞残渣、およびその他の不溶性物質を含んでおり、これも−20℃で凍結した
。
このような培養によるコラーゲン産生を検証するため、可溶化したコラーゲン
を含む塩化ナトリウム溶液と酢酸上清をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動に掛けてコラーゲンα鎖の存在を同定した。各冷却サイク
ルからの塩化ナトリウム溶液と、水酸化ナトリウムで中和した細胞層からの酢酸
抽出物を一定量取り出し、ドデシル硫酸ナトリウム(17.4%,w/v)、グ
リセロール(6%,w/v)、βメルカプトエタノール(1.5%、v/v)に
より100℃3分間で変性させてから、トリス(0.025M)/グリシン(0
.192M)/ドデシル硫酸ナトリウム(0.1%、w/v)緩衝液系を用いた
ポリアクリルアミド・ミニゲル(8%,w/v、Novex,San diego,CA)で12
5V(定電圧)2.25時間の電気泳動により分離した。Laemmli,Nature,227
: 680 - 685(1970)。ゲルは、メタノール/酢酸/水(5:1:4)に希釈した
ページ・ブルー83(0.1%、w/v、Fluka,Ronkonkoma,NY)で1〜2時
間染色した。拡散脱染は酢酸水溶液(8%、v/v)で24〜48時間掛けて行
なった。ゲル上のコラーゲンα1(I)鎖およびα2(I)鎖として移動したバ
ンドの存在により判定されるように、4〜8℃の塩化ナトリウム溶液により細胞
層からヒト・コラーゲンが抽出されたことがゲルから明らかになった。また、コ
ラーゲンα鎖は細胞層から得られた酢酸溶解性物質にも観察された。使用した分
注量ではゲル上のページ・ブルー83染色によるその他のバンドは発見されなか
った。以上の結果は、塩化ナトリウム溶液(0.3M)によりβ−アミノプロピ
オニトリルの存在下に細胞層に堆積したコラーゲンを溶解し得たことを示してい
る。
上記の発明は理解を明確にする目的で、図示および実施例を用いてある程度詳
細に説明したが、添付の請求項の範囲内で何らかの変化および変更を実現し得る
ことは明らかであろう。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Cell culture-derived collagen
Field of the invention
The present invention provides a method for producing collagen from collagen-producing cells in a cell culture system.
About the method. The present invention relates to collagen synthesized in vitro from cell culture.
Related to Synthetic collagen for biomedical, biotechnology, cosmetic
Useful for product applications.
Background of the Invention
Collagen is the major proteinaceous component of the mammalian extracellular matrix. Koller
The main role of Gen is to provide a skeleton and support tissue (Eyre, Science, 207:
1315-1322 (1980)), but many other functions have been elucidated for collagen.
Including cell attachment, internalization, filtration, morphology
Roles in growth (Myas et al., Biochemical Journal, 276: 307-3)
13 (1991)). Collagen shares some common structural and functional properties
A closely related superfamily of proteins,
A syn-XY repeat triplet (where X is often proline and
Y is often hydroxyproline. ).
It is. Hydroxyproline accounts for almost 12% (w / w) of stromal fibrillar collagen.
), The complement components Clq, elastin, acetylcholinesterer
Ze, conglutinin, type I and type II macrophage scavenger receptors,
Contains mannose binding protein, alveolar surfactant apolipoproteins A and D, etc.
However, it is found only in some other proteins, but the composition ratio in those proteins is
Extremely low compared to Lagen (Mays and Laurent, in “Molecular Biology of Lu
ng Disease "(Barnes and Stockley eds.) Blackwell
Scientific Publishers, UK; 1994, pages 216-260). Therefore, collagen
Hydroxyproline is frequently used as an amino acid for identification and quantification
(Udenfriend, Science, 152: 1335-1340 (1966)).
At present, 19 types of characterized collagen (collagen I to collagen XIX
And two types of poorly defined collagen.
They are from different loci. Kivirikko, Annals of Medicine, 25: 113-
126 (1993); Mays and Laurent, in “Molecular Biology of Lung Disease”, s
upra. Myers et al., Journal of Biological Chemistry 269: 18549-18557 (1
994). Different types of collagen have very different distributions in the body and are listed in Table 1.
You. Collagen I is the most predominant form of collagen in mammals and is distributed throughout the body.
It is ubiquitously distributed on skin, bones, muscles, tendons and lungs. Collagen IV is found in basement membrane
You. Collagen VII and collagen XVII are localized at the skin / dermis junction. Table 1
As shown in the figure, in vivo and in vitro (in vitro)
Collagen is synthesized from certain types of cells.
Collagen I is considered to be a prototype of interstitial fibril collagen
, Fibroblasts, smooth muscle cells, endothelial cells, epithelial cells
Synthesized. Collagen I is composed of two different types of α1 (I) and α2 (I)
Two α1 (I) chains and one α2 (I) chain
It is bent to form a triple helix collagen molecular structure. Collagen molecules
Synthesized as a large precursor called locollagen, and tripled in the precursor
Collagen collagen molecules have two large spherical protrusions called propeptides.
You. In humans, the pro-α1 (I) chain and the pro-α2 (I) chain
Pro1 (I) is chromosome 17 COL1A1
Q21.3-q22.05 depending on the site, and pro-α2 (I)
It is encrypted at q21.3-q22.1 by the OL2A1 site. Individual kora
The gene of the α-chain is transcribed into RNA in the nucleus and then spliced into mRNA.
You. The mRNA is transported to the cytoplasm where it is translated to synthesize protein. Proliferate
Collagen polypeptide is hydrolytically consistent with entry into the intracellular compartment
Is translocated to the endoplasmic reticulum by the signal peptide cleaved at In the er
Indicates that prolyl 4-hydroxy is an enzyme whose α chain hydrolyzes proline and lysine, respectively
Droxylase (EC1. Four. 11. 2) and lysyl hydroxylase (EC1. 14. 11. 4)
Thus, several sugar residues are placed on the molecule. Kivirikko and My
llya, in "Extracellular Matrix Biochemistry" (Piez & Reddieds. ) Elsev
ier, 1984, pages 83-118). C of two α1 (I) chains and one α2 (I) chain
The terminus collidine, a molecular chaperone, is probably at the end of the heat shock group of proteins
Attracted to each other. Clarke et al. , Journal of Cell Biology, 121:
193-199 (1993); Nakai et al. , Journal of Cell Biology, 117: 903-914 (1
992). The initial configuration of the C-terminal is stabilized by disulfide bridges, and the α-chain is
Folds into a triple helix to the N-terminus. Gelman et al. , Journal of Biological
Chemistry, 254: 11741-11745 (1979). This fold is prolyl 4-hide
By the action of roxylase, proline at the Y position is completely converted to hydroxyproline
Occurs only when unraveled. When folded, the procollagen molecule becomes the Golgi apparatus
Where it is packaged into secretory vesicles. Procollagen is on the cell surface
Secreted by the invaginated folds. During or immediately after secretion, procollagen pep
Tides are hydrolytically cleaved by specific C- and N-proteinases. Hojima
et al. , Journal of Biological Chemistry, 260: 15996-16003 (1985); Hojim
a et al. , Journal of Biological Chemistry, 264: 11336-11345 (1989). Open
Cleaved propeptidase negatively blocks procollagen gene expression
Is believed to do. Wu et al. , Journal of Biological Chemistry, 26
6: 2983-2987 (1991); Fouser et al. , Proceedings of the National Academy
of the Sciences of the United States of America, 88: 10158-10162 (1991
). Triple helix collagen molecules released by cleavage of the propeptid
Either end contains two short non-helical extensions called telopeptides.
Collagen molecules interact immediately to form a four-legged structure on the invaded cell surface.
To achieve. Telopeptides are important for stabilizing the four-legged structure of extracellular collagen
Play a role. When a four-legged structure is reached, the enzyme lysyl oxidase (protein
-Lysine 6-oxidase, EC1. 4. 3. 13) is C- and N-telopep
Specific lysine residues from both tides
Oxidizing the epsilon-amino group of the hydroxyl group or hydroxylysine residue to form an aldehyde
It is converted to carbonyl α-aminoadipate delta semialdehyde. aldehyde
The carbonyl is very reactive, and reacts immediately with the amino group adjacent to the unreacted lysine residue.
Condensation to form covalent crosslinks. Lysine residue present on adjacent collagen molecule
If so, the resulting crosslinks stabilize the four-legged collagen fibrils. Passage of time
At the same time, these crosslinks are further enhanced by Amadori rearrangement.
Stable and collagen gradually becomes less soluble. Reiser et al. , FASEB Journal
6: 2439-2449 (1992).
Collagen fibrils formed on the cell surface accumulate in the extracellular matrix, where
Interacts with other collagen fibrils and other extracellular matrix components
To form a functional extracellular matrix. Collagen fibrils
Often composed of collagen, the composition of the fibers is determined by fibril formation and tissue function.
Importantly. Lapiere et al. , Connective Tissue Research 5: 21-29 (19
77), Andrikopoulos et al. , Nature Genetics 9: 31-36 (1995). In addition,
Extracellular matrix packing is regulated by other extracellular non-collagenous components
It is. Hahn and Birk, Development 115: 383-393 (1992). Collagen I
Collagen fibrils in rich tissues (eg tendons) can be observed by electron microscopy with heavy metal staining.
It features a 67 nanometer band pattern when visualized under observation.
During fibril formation and cross-linking, nascent collagen fibrils and fibers are different drugs
It can be extracted with the product solution. Prior to the formation of covalent crosslinks, collagen is
Can be extracted with Collagen with dilute acetic acid after the formation of the covalent bridge and before the Amadori rearrangement
Extraction is possible. When Amadori rearrangement occurs, collagen becomes insoluble and
Enzyme action to decompose lagen (eg pepsin, matrix metallo (metal)
Rotatinase). Such findings are
It was first obtained by an organization. Collagen pools with different solubilities are animals
Pools that are present in tissues and are more soluble due to radiolabeling are less soluble pools.
Contained large amounts of radioactively labeled substances. This is quite new
Suggests that it was synthesized. Nimni et al. , Biochemical Journal 102:
143-147 (1967). Next, these findings were extended to cells in culture. Chan et
al. Biochemical Journal 269: 175-181 (1990).
To date, 19 types of characterized collagen have been identified, each of which is
Has specific properties, structures, and functions. Table 1. van der Rest and Garrone, FASE
B Journal 5: 2814-2823 (1991), Kielty et al in ”Connective Tissue and It
s Heritable Disorders: Molecular, Gnetic and Meidcal Aspects ”(Royce and
Steinmann, eds. ), Wiley-Liss, 1993, pages 103-147. Collagen II, III
, V and XI are the prototypes of the interstitial fibril collagen as described above.
It shares a similar structure and cross-linking pattern with Lagen I. Collagen IV is based
A large globular C-terminal domain found in the bottom membrane and a 350 nm long collagenous domain
Main and described as a `` chicken-wire pattern ''
N-terminal domain of mature protein packed into a filament network
And Collagen IV cross-linking is reduced (disulfide) bonding and non-reducible
By both archetypal (lysine-derived, lysyl oxidase-mediated) binding. Collage
VI form a microfibril network that disperses intra- and intermolecularly.
It has a sulfide bond. Collagen VII is a fixed fibril at the dermis-epidermal junction (anch
oring fibrils) and has a spherical and blocked collagen triple helix region.
Macromolecules, disulfides in tail-to-tail assembly
It is believed to meet through union. Crosslinking or molecular packing of other collagen
Little is known about the type of collagen, but various types of collagen depend on their structure and function.
It is clear that crosslinking occurs by different mechanisms. Different in collagen fibrils
Between collagens, for example, triples blocked with collagen II, which is fibrous collagen
Between fibrillar associated collagen (FACIT) and collagen IX, etc.
There are also intermolecular cross-links that are lysine-derived lysyl oxidase-mediated cross-links. Ey
re et al. , FEBS Letters 220: 337-341 (1987).
Lysyl oxidase enzyme is synthesized intracellularly as a 411 amino acid precursor
. The gene encoding lysyl oxidase has been well characterized and 5q
23. 3-31. It has seven exons in about 19 kb of DNA localized in 2.
You. Translated gene products use alternating polyadenylation sites
And about 2. 0-5. Generates several mRNAs of different sizes at 5 kb,
Is abundantly expressed in both in vivo and in vitro cells. Translated
The gene product is 46. 6kDa proenzyme, hydrolytic by metalloprotease
To produce an active enzyme having a molecular weight of about 32 kDa. This enzyme is a cell-free test
It was expressed in an in vitro expression system. Trackman et al. , Journal of Biological Chemistry
267: 8666-8671 (1992). Activated enzymes include collagen and elastin
It oxidizes lysine and hydroxylysine residues in it. Collagen I
Only certain lysine and hydroxylysine residues in the lopeptide are modified.
However, in elastin, out of 48 lysine residues per 1000 amino acids,
About 30 are oxidized. In collagen I, lysyl oxidase has four molecules.
When this leg structure is realized, lysine residues in telopeptides and hydroxylysine
Can be oxidatively deaminated. This enzyme has four adjacent
Closest to a lysine or hydroxylysine residue in the telopeptide of the leg molecule
Homologous sequences near the C-terminal and N-terminal ends of the triple helix of the collagen molecule
Is believed to meet with Siegel, International Review of Connective
Tissue Research 8: 73-118 (1979). This enzyme is at least two coupling factors
Copper and peptidyl trihydroxyphenylalanine (TOPA) quinone
Need. Numerous drugs that can inhibit this enzyme have been identified,
Examples of such compounds include: β-aminopropionit
Ryl, β-bromoethylamine, β-nitroethylamine, benzylamine, di
Amine analogs, isoniazid, iproniazide, cis-diaminocyclo
Hexane, hydrazine, semicarbazide and dithiothreitol (US Patent
No. 4,997,854). Collars synthesized in the presence of lysyl oxidase inhibitors
Gen is soluble in cold diluted neutral salt solutions. This soluble collagen converts fibrils
If it can be constructed, it is activated by lysyl oxidase to crosslink the fibrils
This method has been used as an assay for lysyl oxidase. Pr
ockop and Tunderman, Methods in Enzymology, 82: 305-319 (1982).
Lysyl oxidase-mediated cross-link formation and formation of lysine from collagen
Other drugs that interfere with maturation and / or maturation are also known, including D-penicilla
Contains min and heparin. D-penicillamine is lysine in telopeptides /
Aldehydes formed following oxidative deamination of hydroxylysine residues.
Blocking the carbonyl group inhibits the formation of crosslinks. Then this Photoshop
If the gen is extracted and purified to remove D-penicillamine, a stable insoluble
Collagen fibrils will form in vitro, which means that aldehydes
・ Indicates that the carbonyl group is exposed and can be used to form a covalent crosslink
ing. Nimni et al. , In ”Chemistry and Molecular Biology of the Interce
llular Matrix ”(Balazs ed. ) Academic Press, New York, NY, 1970, pages 4
17-430. Heparin interferes with the ability of collagen molecules to form fibrils
Collagen molecules are lysyl oxidase, as they more inhibit collagen crosslinking.
Heparin is not lysyl oxidase without the four-legged structure required for
Reduce binding to collagen I by approximately 40 percent. Gavriel and Kaga
n, Biochemistry 27: 2811-2815 (1988).
Medically, there is a need for biomaterials that are versatile and have high affinity for human tissues. Ko
Lagen has several unique properties that are very promising for medical transplant applications,
The most prominent example is that collagen is a natural biomaterial.
It is. Collagen-based transplant can be remodeled by host after transplant
It has been shown. Kato et al. , Bone and Joint Surgery, 73: 561-574 (1
991).
Collagen is used in many biomedical, biotechnical, and cosmetic products
(Stenzel et al. , Annual Review of Biophysics and Bioen
gineering, 3: 231-253 (1974)). Collagen medical device for cardiovascular surgery, extracorporeal
Medical, ophthalmic, orthopedic, urological, thoracic surgery, abdominal surgery, otolaryngology, nerves
For surgical use, drug delivery system (DDS), hemostasis
Has been designed as an agent, an anti-adhesive and an adhesive. Chvapil M. , Kronenthal R. L
. and van Winkle W. , International Review of Connective Tissue Research
, 6: 1-61 (1973). Examples of commercial uses for collagen include insoluble hemostatic sponges
Di (COLLASTAT, Integra Life Sciences, NJ) or powder
(US Pat. No. 3,443,261), an extruded collagen suture (US
No. 3,114,593), collagen tissue equivalents (US Pat. No. 4,48).
5,096), fibril constructs (US Pat. No. 5,256,418), tissue growth
As soluble, injectable atelopeptide collagen (U.S. Pat.
9,073), as a collagen eye shield for antibiotics (Phinney et al.
al. , Archives of Ophthalmology 106: 1599-1604 (1988))
Collagen-Poly (HEMA) hydrogel for feeding (Jeyanthi et al. , Journal of
Pharmacy and Pharmacology 43: 60-62 (1991)), and collers for drug supply
Gen particles (Rossler et al. , Journal of Microencapsulation 12: 49-57 (1995
)). Collage used in medical devices, pharmacy and cosmetic applications
Most of these are obtained from animal sources today. Collagen is bovine and porcine
Is rich in collagen from many different phyla, including rats, poultry, and fish.
Can be extracted from the tissue The extraction method is based on terrorism
Cleavage of the peptide from the collagenous triple helical region of the molecule results in atelopeptide
Enzymatic methods to release the triple helix of id collagen, or weak acids
By any of the methods of extracting collagen in. These extracted animal kora
Have the disadvantage that they are not sourced from human sources,
May be contaminated with genogenic materials.
To overcome the problem of crossing of collagen species, commercially available human collagen
Several approaches have been taken to obtain a good source of resources. As one method
U.S. Pat. No. 5,002,071 discloses a method for obtaining collagen from human placenta.
May be extracted (Harrell, C .; ; Research Development Foundation
). However, the supply of human placenta is variable and can transmit infections.
There are broad ethical issues that limit the full commercialization of the method.
Another method is to propagate collagen supplied from cultured recombinant cells and propagate
Generating human collagen from genetically engineered genes. PCT Application No. W
O93 / 07889. For example, the gene for procollagen II is
Inserted into cells and expressed in cell culture medium as normal procollagen II molecule
Let Fertala et al. Biochemical Journal, 298: 31-37 (1994). HT-1
080 cells express only collagen IV and other basement membrane components,
Cells are capable of synthesizing collagen (ie, all post-trans
which expresses a natural enzyme), but not in the interstitial cells such as collagen I and collagen II.
Lagen is not structurally expressed, which is useful for producing recombinant procollagen.
It can be said that it is a mammalian cell line. Similarly, the pro-α1 (I) chain in the same cell line
A homotrimeric procollagen I, including lipase, has also been produced. Geddis and Prockop,
Matrix, 13: 399-405 (1993). The limitation of this method is that procollagen
Propeptides are processed into collagen by proteolytic cleavage and then
Purify from media components and release collagen with complete telopeptides
It must be. In addition, procollagen in cell culture medium
Proteolytic removal of propeptides and telopeptides may be achieved by syn treatment
. Similar studies using different cell types for other collagens in other studies
For example, Greenspan and co-workers do not produce collagen α chains
Α2 of human collagen V in Chinese hamster liver (CHL) cells
Chain (α2 (V)), one human α2 (V) chain and two hamster α1
(V) Preparation of a chimeric heterotrimeric collagen V molecule containing a triple helical chain
doing. Greenspan et al. , Journal of Biological Chemistry 264: 20683-
20687, 1989. C-terminal portion containing NC1 and COL1 domains and NC2 domain
Chicken Collagen XII, which contains a part of the chicken collagen
Is expressed using a recombinant minigene for the α1 chain of
It is expressed in HeLa cells that do not produce gen I or XII. This configuration
Human expression in the cell culture medium used to grow the cells
The formation of a truncated shape of the Lagen XII triple chain occurred. Mazzorana et al. , Journal of
Biological Chemistry 268: 3029-3032, 1993. Another genetic engineering approach
Baculovirus vector containing genes required for procollagen synthesis
Is inserted into Sf9 insect cells to produce human recombinant collagen.
Vuori et al. , Proceedings of the National Academy of Sciences of the Uni
ted States of
America, 89: 7467-7470 (1992). The limitation of this system is that
In addition to having to insert the offspring, all required post-transcriptional genes
Can express, for example, prolyl 4-hydroxylase and perform folding and secretion
It is necessary to do so. This approach also requires that the protocol
Lagen purification and subsequent procollagen to collagen processing is required.
You.
Yet another approach is to develop transgenic animals to produce procollagen.
Alive. Cloning the gene for human therapeutic protein and genetic engineering
Manipulated and introduced into the transgenic animal so that the transgenic animal
Expresses the recombinant human protein in lactation to produce the milk of the animal.
It has been shown that protein may be able to be recovered from juice (U.S. Pat.
, 873, 316; Lonberg, et al. , Biogen Inc. ). Recently, human recombination
Methods have been proposed to use such an approach to produce collagen.
(PCT WO 94/16750; Berg, Collagen Corporation). Hereditary form
Transgenic animals can produce human procollagen, but also
Production and processing to purify milk proteins to remove
is there.
Cells growing in culture supplemented with ascorbic acid produce collagen
Is already well known. Goldberg et al. , Experimental Cell Research, 3
1: 444-447 (1963); Schwartz et al. , Journal of Cell Biology, 92: 462-
470 (1982); Grinnel et al. , Experimental Cell Research, 181: 483-491 (19
89). However, most of the synthetic collagen is in the cell culture medium as procollagen.
Secreted and not processed into collagen. Limeback and Sodek, European J
ournal of Biochemistry, 100: 541-550 (1979). Synthetic procollagen
Less fraction is processed into collagen and stored in the cell periphery matrix around the cell.
Stack. The accumulated collagen is cross-linked by the action of the enzyme lysyl oxidase,
Form an insoluble collagen matrix.
Collagen synthesis by culture depends on both the growth state of the cells and the culture time. Sudden
In the fast growing phase, cells synthesize very little collagen, but once confluent
When this occurs, the collagen synthesis of the cells is significantly increased. Booth et al. , Biochemica B
iophysica Acta, 607: 145-160 (1980); Steinberg, Laboratory Investigatio
n, 39: 491-496 (1978). After one to three weeks, collagen synthesis and pericellular
Matrix accumulation is significantly reduced to almost negligible levels. Chan et
al. Biochemical Journal, 269: 175-181 (1990); Grinnell et al. , Experim
ental Cell Research, 181: 483-491 (1989). Procollagen cell culture medium
Secretion into it is also dramatically reduced. So far on collagen synthesis in culture
In one study, lysyl oxidase was used to inhibit collagen cross-linking,
Therefore, some of the collagen accumulated in the extracellular matrix
Over a period of 48 hours to dissolve in the cooled neutral salt solution
I have. After extraction with the cooled neutral salt solution, the cell layer residue was scraped off and acetic acid (0. 5 mol)
(Lamande and Bateman, Matrix, 13: 323-330 (1993)) or hydroxylated
Sodium (0. 2 mol) (Bankowski & Dabrowski, Acta Biochemica Plonica
, 27: 405-411 (1980)) and some parts of partially cross-linked collagen.
Minutes are dissolved. Proliferate in culture and make human collagen commercially available
The application of high-volume fibroblasts maintains a continuous high level of collagen synthesis.
Solves the problem of collecting and processing procollagen into collagen
If not, it will not be possible.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. 1 shows that, as shown in Example 3, sodium dodecyl sulfate / polyacrylamide
3 shows various collagens separated by gel electrophoresis. Division (lane)
Application: Compartment 1 (left): High molecular weight standard (Bio-Rad Laboratories, Hercu
les, CA), compartment 2: extract from cell layer of Example 1 with Dulbecco's phosphate buffer
Synthesized human collagen, compartment 3: Dulbecco's phosphate buffer of Example 1
Human collagen extracted from cell layer, compartment 4: Pepsin-treated bovine collar
Gen I (Organogenesis Inc. , Canton, MA), Section 5: Bovine Collagen I (Organ
ogenesis Inc. , Canton, MA), compartment 6: human cells retreated with pepsin
Lagen I (Sigma Chemical Co, St Louis, MO), compartment 7: pepsin-treated chicks
G collagen I (Sigma Chemical Co, St Louis, MO), compartments 8 and 9:
High molecular weight standard (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), compartment 10: acetic acid
Aqueous solution (0. 5 mol) dissolved pepsin (100 μg / ml).
FIG. 2 shows the extraction from the cell layer with Dulbecco's phosphate buffer as described in Example 1.
Shows the concentration of collagen released. Collagen concentration, as shown in Example 4,
The amount of hydroxyproline in the phosphate buffer of lbecco was determined by measurement. First
The cold cycle of 2 days after the medium was replaced with the production medium, the final cold cycle shown in the figure.
Kleul was 133 days after the medium was changed to production medium.
FIG. 3 shows that, as shown in Example 8, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide.
3 shows a photograph of concentrated human collagen separated by gel electrophoresis. Division
Patch, compartment 1 (left): high molecular weight standard (Bio-Rad Laboratories, Hercu
les, CA), from above, myosin (200 kDa), β-galactosidase (116
. 5 kDa), phosphorylase B (97. 4 kDa), serum albumin (6
6. 2 kDa), compartment 2: concentrated human collagen according to Example 7, 21 μg, compartment
Drawing 3: enriched human collagen according to Example 8, 30 μl applied, compartment 4: Example 8
Human Collagen Enriched with, 15 μl applied, Section 5: Human Enriched with Example 8
Collagen, 10 μl application, compartment 6: concentrated human collagen according to Example 8,
8 μl application, compartment 7: concentrated human collagen according to Example 8, 6 μl application, compartment
8: concentrated human collagen according to Example 8, 4 μl applied, compartment 9: according to Example 7
Concentrated human collagen, 14 μl applied, compartment 10: concentrated human collagen according to Example 7
Collagen, 5. 6 μl applied.
FIG. 4 shows a 55,000 × magnification of the DFC configuration prepared as described in Example 9.
7 is an electron micrograph of the sample. In the photo, a normal D cycle van of collagen fibrils
Indicates
FIG. 5 is a photograph of human collagen sponge, as described in Example 10.
As prepared, showing surface texture at 8 × magnification (sponge size = 4 mm ×
30 mm).
Figure 6 shows the concentration separated on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel.
FIG. 14 is a photograph showing cyanogen bromide-derived peptide from human collagen, which is shown in Example 12.
As shown, the presence of collagen III is indicated. Partition assignment is Block 1: Blank
(Only buffer is loaded), compartment 2: broadband molecular weight marker (Bio-Rad Laboratories, H
ercules, CA), compartment 3: undigested concentrated human collagen according to Example 1 (12.
92 μg, compartment 4: concentrated human collagen from Example 1 digested with cyanogen bromide
(32. 7 μg), compartment 5: human collagen I digested with cyanogen bromide (29.
4 μg, Sigma type VIII, human placental pepsin extraction, Sigma Chemical Company, S
t. (Louis, MO), compartment 6: enriched human extracted from the cell layer digested with cyanogen bromide
-Collagen (32. 7 μg), compartment 7: human collage digested with cyanogen bromide
III (29. 4 μg, Sigma type X, pepsin extracted from human placenta, Sigma
Chemical Company, St. Louis, MO).
Key: A, α1 (I) CB8; B, α1 (III) CB5; C, α1 (I) CB6
D, α1 (I) CB6 ′
Figure 7 shows the separation by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
In the photo showing cyanogen bromide-derived peptide from concentrated human collagen
As shown in Example 13, the presence of telopeptide is shown. The parcel assignment is for parcel 1 and parcel 1.
And compartment 2: blank (only buffer is loaded), compartment 3: broadband molecular weight marker (Bio-R
ad Laboratories, Hercules, CA), compartment 4: Human broth digested with cyanogen bromide.
Gen 18 μg (Sigma type VIII, human placental pepsin extraction, Sigma Chemical compa
ny, St. Louis, MO), compartment 5: digested with cyanogen bromide from the cell layer of Example 8.
Concentrated human collagen, compartment 6: digest with pepsin before digestion with cyanogen bromide
Enriched human collagen from the cell layer of Example 8, compartment 7: erased with cyanogen bromide
Human collagen I (8 μg, sigma type VIII, human placental pepsin extraction, Si
gma Chemical Company, St. (Louis, MO), Section 8: Humans digested with cyanogen bromide.
Collagen III (10 μg, human placental villus pepsin extraction, Southern Biotechnology
Associates, Birmingham, AL), Section 9 and Section 10: Blank (buffer only)
Mounting). Key: A, α1 (I) CB6; B, α1 (I) CB6 ′
FIG. 8 shows that the cell line was collected with Dulbecco's phosphate buffer as described in Example 14.
Sodium dodecyl sulfate polya by acetic acid extraction from the cell layer of HDF B116
It is a photograph showing the presence of collagen α chain separated by acrylamide gel electrophoresis.
. Section assignments are as follows: Section 1 (left): blank (only buffer is loaded), Section 2: wide
From the top with a band molecular weight standard (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA):
Osin (200 kDa), β-galactosidase (116. 5kDa), Phosph
Orilase B (97. 4 kDa), serum albumin (66. 2 kDa).
Section 3: Dulbecco phosphate buffer from HDF B116 cell layer on day 7 in production medium.
Impulse extract, compartment 4: Du from HDF B116 cell layer after 21 days in production medium.
lbecco phosphate buffer extract, compartment 5: HDFB116 cells after 28 days in production medium.
Dulbecco phosphate buffer extract from alveolar layer, compartment 6: HD after 35 days in production medium
Dulbecco phosphate buffer extract from FB116 cell layer, compartment 7: in production medium
Dulbecco's phosphate buffer extract from HDF B116 cell layer after 42 days, compartment 8
: Acetate-soluble collagen cell layer from HDF B116 cell layer, compartment 9: human
Collagen I (12 μg, Sigma type VIII, human placenta-derived pepsin-extracted collagen
Sigma Chemical Company, St Louis, MO), compartment 10: blank (buffer
Only).
FIG. 9 shows the cell layer from cell line HDF B117 as described in Example 15.
Of Dulbecco's Phosphate Buffer and Acetic Acid Extract from Sodium Dodecyl Sulfate
Photo showing the presence of collagen α-chain separated by acrylamide gel electrophoresis
Is true. Section assignments are as follows: Section 1 (left): blank (only buffer is loaded), section 1
Figure 2: Broadband molecular weight standard (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA), top
Et al., Myosin (200 kDa), β-galactosidase (116. 5kDa),
Phosphorylase B (97. 4 kDa), serum albumin (66. 2kDa),
Section 3: Dulbecco phosphate buffer from HDF B117 cell layer after 7 days in production medium.
Impact extract, compartment 4: Du from HDF B117 cell layer after 14 days in production medium.
lbecco phosphate buffer extract, compartment 5: HDF B117 after 21 days in production medium
Dulbecco phosphate buffer extract from cell layer, compartment 6: H after 28 days in production medium
Dulbecco phosphate buffer extract from DF B117 cell layer, compartment 7: in production medium
From the HDF B117 cell layer after 35 days
Dulbecco phosphate buffer extract, compartment 8: acetic acid lysis from HDF B117 cell layer
Collagen cell layer, compartment 9 and compartment 10: blank (only buffer is loaded).
FIG. 10 shows cells from cell line HDF B117 as described in Example 16.
Of Dulbecco's Phosphate Buffer and Acetic Acid Extract of Sodium Dodecyl Sulfate
Shows the presence of collagen α-chain separated by polyacrylamide gel electrophoresis
It is a photograph. Section assignment: Section 1 (left): blank (only buffer is placed),
Section 2: Broadband molecular weight standard (Bio-Rad Laboratories Hercules, CA), top
From, myosin (200 kDa), β-galactosidase (116. 5kDa),
Phosphorylase B (97. 4 kDa), serum albumin (66. 2kDa)
, Compartment 3: Dulbecco phosphate from SAF012A cell layer after 21 days in production medium
Buffer extract, compartment 4: Du from SAF012A cell layer after 28 days in production medium.
lbecco phosphate buffer extract, compartment 5: SAF012A cells after 35 days in production medium.
Dulbecco phosphate buffer extract from alveolar layer, compartment 6: from SAF012A cell layer
Acetate-soluble collagen cell layer, compartments 7 to 10: blank (only buffer is placed)
).
Disclosure of the invention
According to the present invention, a large number of colonies previously not available from cell culture systems
Disclosed are the ability to produce gen and simplification of the process. More specifically, the present invention provides
Novel collagen produced from in vitro cell culture system, especially human collagen
Related. The method of the present invention relates to a drug for preventing crosslinking of collagen-producing cells and collagen.
It is a repetitive cell culture method using a culture medium containing
They are left without a bridge. Collagen produced is dissolved in salt solution
To separate the salt solution containing the dissolved collagen from the collagen-producing cultured cells
Can be recovered by Re-culture the same collagen-producing cells using a new culture medium
, A repetitive culture and a collagen production circulation system. Crosslink collagen producing cells
Culture under conditions such that no collagen is synthesized, remove the culture medium,
Washing the cells with a salt solution, dissolving and collecting the collagen, and reculturing the cells
The same collagen-producing cells can continue procollagen secretion
Therefore, this is processed into collagen and accumulated inside the cell layer, and the continuous reaction by this method is performed.
It can be recovered by return.
Novel collagen, especially human collagen, cross-links
Produced initially in vitro from cell culture systems in vitro. Use various collection technologies
This means that collagen can be used in biomedical, biotechnology, and cosmetic
It can be used for any purpose. The extracted collagen is an enzyme such as lysyl oxidase
And the like to allow crosslinking. In addition, uncrosslinked collagen
Means chemical means such as carbodiimide, glutaraldehyde, sugar, ultraviolet (UV)
) It can be crosslinked by irradiation or the like. In addition, the recovered collagen is
Ateropeptide / collagen by enzymatic treatment such as
Can be achieved. In addition, procollagen peptides are separately available from the culture medium used.
Separable and recoverable. In addition, procollagen in the cell culture medium is recovered and
Treatment removes the propeptides and telopeptides and triples
It is possible to produce glandular atelopeptide collagen. In addition, cells
At the end of the culture, the collagen is solubilized with dilute acetic acid in the pericellular collagen in the cell layer
Can also be recovered. Furthermore, at the end of cell culture, collagen
Treats triple helical collagen molecules without pepsin treatment and cross-linking telopeptide
It can also be recovered by separating.
Detailed description of the invention
The in vitro cell culture system of the present invention advantageously utilizes the ability of
Collagen is synthesized as described using the actual cellular synthesis of gen I.
The method of the present invention relates to a cell culture system, wherein collagen-producing cells are
Cells are synthesized by culturing in cell culture medium containing drugs that interfere with collagen crosslinking
Inhibits or significantly reduces the formation of intra- and intermolecular cross-links in collagen
, Maintaining the solubility of collagen in cold diluted neutral salt solutions.
When cultured cells begin to synthesize and secrete collagen, the uncrosslinked
Lagen can be removed by dissolution in cold diluted neutral salt solution and at the same time
The ability to synthesize can be maintained. Collagen removes cell culture medium from the cell layer
Remove and recover cell layer by washing with cold diluted neutral salt solution. Synthesized
Since collagen is not cross-linked, it is soluble in cold diluted neutral salt solutions, followed by
Recoverable from solution. Fresh cell cultures containing drugs that interfere with collagen crosslinking
The medium is added to the same cell layer, the cell culture system is circulated, incubation,
The culture medium is removed and the cold diluted neutral salt solution washing is repeated. Collagen-producing cells
These cycling steps can be repeated as long as the production of
. According to a report on the decrease in the regulation of collagen production by cultured cells over time
(Chanet al. , Biochemical Journal, 269: 175-181 (1990); Grinnell et al. ,
Experimental Cell Research, 181: 483-491 (1989)).
The ability to repeat the cycling steps to continue the production of lagen is not expected.
Any cell capable of producing or synthesizing collagen can be used in the method of the present invention.
Can be used. Fibroblasts mainly produce collagen I. Human fibroblast cell line
Human neonatal male penis foreskin, human dermal fibroblasts, human Achilles tendon fibroblasts
Including human pulmonary artery fibroblast sewing, human urethral fibroblasts, and human small intestinal fibroblasts.
It can come from a number of sources, including but not limited to: Human cells are fibroblasts
The cells need not be limited to human smooth muscle cells, human endothelial cells, human lung and true cells.
It can include, but is not limited to, epithelial cells of skin origin. In addition, cells
The cells are not limited to human-derived cells, and include horses, dogs, pigs, cows,
Cells from other mammals, including but not limited to sources, can also be used,
Cells from other phyla, including phylums, birds, invertebrate phyla, etc.
Alternatively, cells transformed with viruses or viruses can be used in the present invention, but some researchers
Have shown that transformed cells produce less collagen during culture.
Hajnal et al. , Advances in Enzyme Regulation 33: 267-280 (1993); Koppe
t al. , International Journal of Cancer 60: 275-279 (1995); Kreig et al.
, Experimental Cell Research 125: 23-30 (1980);
Lefebrve et al. , Journal of Cell Biology 128: 239-245 (1995). these
Cells can be from human tissues, from other mammals, or from other phyla. In addition,
The vesicle is "normal" but expressed at high levels or cured in some way.
Genetically modified or inherited, either to produce therapeutically advantageous collagen
Collagen-expressing cells that have been subjected to child engineering operations may be used. For example, to do this
Shows that the coding of the nucleotide sequence for the desired collagen
Separated from either cells or tissues as NA or desired collagen
HTE as cDNA generated from mRNA from cells or tissues expressing
Can be separated. Desired configuration is by endogenous 5 'promoter or exogenous
It can be induced by a promoter, which is supplied by the expression vector. Modified Coller
Gens may be designed by appropriate site-directed mutagenesis. Desired nucleo
The nucleotide sequence is a host cell that can insert it into an expression vector and replicate nucleotides.
Into a complex DNA molecule, followed by closing with the appropriate target nucleotide sequence.
Cloned by selecting a clone. A vehicle containing the appropriate nucleotide sequence
The vectors are separated and serialized prior to transfection of the cells. Vectorized series
Transfects cells containing the appropriate post-translational machinery to trigger collagen synthesis
The marker gene, for example when it is not integrated into a part of the vector structure
Genes that confer resistance to antibiotics are also transfected.
The transfected cells are isolated using an antibiotic and
Select only cells that are resistant, i.e., have the marker gene transferred
. Transfected cells express the desired nucleotide sequence as a protein
They can be pooled into cell lines or generated clonally. like this
Procedures are generally well known in the art and are described in Sambrook et al. , Molecular Cloning
, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (
1989). All cells of the above-mentioned type are used in the present invention.
Lagen-producing cells ".
Similarly, pharmacological agents can be added to the culture to determine the nature, amount,
Or a method to recover collagen produced from cultured cells of different types
It is within the scope of the invention. These drugs are polypeptide growth factors,
It may contain transcription factors or inorganic salts that enhance collagen transcription. Polype
Examples of peptide growth factors include transforming growth factor β1 and tissue growth factor.
Rasminogen activators are listed, both of which enhance collagen synthesis
I know that Raghow et al. , Journal of Clinical Investigation,
79: 1285-1288 (1987); Pardes et al. , Journal of InvesIngative Dermatolo
gy, 100: 549 (1993). Examples of inorganic salts that stimulate collagen production include
There is lium. Shivakumar et al. , Journal of Molecular and Cellular Cardi
ology 24: 775-780 (1992).
The main collagen secreted from fibroblasts is collagen I, but the present invention
However, the present invention is not limited to Gen I. For example, other collagens (collagen II, III, I
V, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII,
XIX) by the use of cells of a suitable type (see, for example, Table I) and / or
Can be produced by pharmacological manipulation and / or by genetic engineering
. Pharmacological manipulation triggers different collagen expression from collagen-producing cells
And / or to prevent or prevent collagen crosslinking
Used. As an example of a genetic engineering approach,
Inserting the gene, the lysyl oxidase locus is knocked out (knocking-ou
t), reduces lysyl oxidase production with a gene expression antisense strategy
Regulates (negatively regulates) the resources in the telopeptides of collagen molecules.
Change the syn residue to another amino acid that is not a substrate for lysyl oxidase
And altering cysteine residues involved in disulfide bridges.
Can be
Similarly, this approach produces elastin in vitro and biomedical
Be available for recovery from cultured cells for use in the application. The reason for this
Elastin (monomeric elastin) forms cross-links in a manner similar to collagen
This is because a specific lysine group needs to be oxidized by lysyl oxidase.
Therefore, it is possible to separate and purify elastin from the cell culture system of the present invention.
You.
Other proteins that coexist with collagen in the cell margin matrix around the cell
Recovered by cross-linked collagen, for example, proteologs such as decorin and biglycan
Licans, vitronectin, tenascin, fibronectin, thrombosponge
Glycoproteins such as N-I can be recovered. These molecules are isolated, purified and concentrated.
It can be used for biomedical applications.
Medium supplemented with serum or a chemically defined medium (in other words, animal organs that are not limited
Or tissue extracts such as serum, pituitary extract, hypothalamus extract, placenta extract, or
Or those that do not contain fetal extract) under conditions that promote cell growth in
Producing or incubating the gen-producing cells. The culture medium contains collagen
Add an agent that interferes with cross-linking to inhibit or increase the formation of intra- and intermolecular cross-links.
Reduce width. The culture medium used and to promote cell growth and survival
The specific culture conditions required for this will depend on the type of cells to be grown. cell
The medium required for culturing must be an equilibrium medium, and additional serum (eg,
Fetal bovine serum or neonatal serum), such as Dulbecco's modified Eagle's medium.
Other than that, Ham and McKeehan, Methods in Enzymology, 58: 44-93 (197
9) Reference or other suitable media such as the media listed in Example 1
For a well-defined medium, see Bottenstein et al. , Methods in Enzymology, 58: 9
4-109 (1979). Promotes collagen synthesis
Sodium ascorbate or a more chemically stable derivative such as
It is necessary to supplement L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate and the like.
is there. Tsao and Young, In Vitro Cellular and Developmental Biology 31:87
-90 (1995).
To complete collagen synthesis by cells without creating cross-links, use a pericellular matrix.
Affects either collagen cross-linking or collagen packing
The drug is added to the cell culture medium. These drugs interfere with collagen crosslinking.
One group is lysyl oxidase inhibitors. Suitable lysyl oxidase
The inhibitor is β-aminopropionitrile. However, the present invention
It is not intended to be limited to lysyl oxidase inhibitors. Used in the present invention
Other possible lysyl oxidase inhibitors include 2-bromoethylamine.
Hydrobromide, cis-1,2-diaminocyclohexane, trans-2-
Phenylcyclopropylamine hydrochloride (tranylcypromine), 2-nitroethyl
And 2-chloroethylamine hydrochloride
Not done. A further example of an agent that interferes with collagen crosslinking is D-penicillus
Which affect the ability of oxidized lysine residues to form covalent bonds with each other.
This inhibits the formation of crosslinks. Nimni et al. , In ”Chemistry and Molecu
lar Biology of the Intercellular Matrix ”(Balazsed) Academic Press, Ne
w York, NY, 1970, pages 417-430.
When the culture has completed logarithmic growth, add media containing ascorbic acid and add
Promotes gen hydroxylation and secretion. This culture stage is the biosynthesis phase (biosynt
hetic phase). The appropriate time for the cells to secrete collagen, typically
After about 2 to about 7 days, the culture conditions are changed to dissolve the collagen. One fruit
In embodiments, the medium is removed from the culture. In all examples, the cell layer is cooled, diluted and neutralized.
Washing with a salt solution dissolves and removes the synthesized non-crosslinked collagen. Dilution
Neutral salt solution must be cooled to prevent collagen fibril formation
. The preferred temperature range for the washing step is from about 2 ° C. to about 8 ° C., slightly above freezing
. An essential condition of the present invention is that viable cells remain in the cell culture system and are not crosslinked.
Is to be able to resume collagen synthesis. Therefore, the collage
In addition to lysing the cells, other washing protocols that allow the cells to survive are used.
Can be used. The chilled diluted neutral salt solution is the uncrosslinked collagen dissolved at this point.
Will contain fresh cell culture medium removed from the cell culture with the same collagen
Place in production cell culture. In preferred embodiments, typically on the order of about 2 to about 7 days
After the period of, the cold diluted neutral salt solution washing is repeated, and the cold diluted neutral salt washing solution is further added.
After removal, fresh cell culture medium is added to the culture. Use a neutral salt solution
The circulation of the cell culture medium can be repeated many times.
A suitable agent for dissolving uncrosslinked collagen from the cell layer is BioWhi
Dulbecco phosphate buffered raw material, as supplied by ttaker (Walkersville, MD)
It is a food solution. However, the invention need not be limited to Dulbecco's phosphate buffered saline,
Rather, it can include Hank's balanced salt solution and Earle's balanced salt solution. Skilled person
If so, use other solutions that allow both collagen lysis and cell viability.
It would be possible to prescribe.
The washing time with saline solution can be varied from 30 minutes to 6 hours, some
Under conditions, the longer the time, the more raw materials can be obtained. Similarly, during cooling salt solution washing
The degree of stirring also affects the yield. In addition, to a suitable washing temperature range from 2 ° C to 8 ° C
Changes in the recovery of more collagen or recovery of other matrix components
May affect yield.
Uncrosslinked collagen can also be crosslinked with other chemical
Commonly used drugs include glutaraldehyde, formaldehyde, carbodii
Amide, hexamethylene diisocyanate, bisimidate, glyoxal,
Liglycerol, polyglycidyl ether, adipyl chloride, dehydrothermal
, UV irradiation, sugar carriers, but the chemical crosslinking agent should not be limited to these examples
Instead, other crosslinking agents and methods well known to those skilled in the art can be used.
Thus, the present invention relates to non-crosslinked collagen. Not suitable cross-linked
Collagen I is a propeptide (N- and C-propeptide)
), Triple-helical form of hydroxylated molecules containing telopeptides
Region has more than 40% of all proline residues and has two α1 (I) chains and one α2 (
I) Include chains. Another suitable non-crosslinked collagen I is propeptide (N-propep
Tide and C-propeptide), without telopeptide,
Has more than 40% of the total translated proline residues within the triple helix region of the xylated molecule;
It contains two α1 (I) chains and one α2 (I) chain. In a preferred embodiment,
The non-collagen is human collagen and in the most preferred embodiment
Is human collagen I.
Uncrosslinked collagen, for example, also differential salting out (Trelstad R. L. , "Immunochem
istry of the Extracellular Matrix, ”(Furthmayr ed. ) CRC Press 1982, Vol
ume 1, pages 31-42; Kielty et al. , In ”Connective Tissue and Its Herit
able Disorders: Molecular, Genetic and Medical
Aspects ”(Royce and Steinmann, eds. ), Wiley-Liss, 1993, pages103-147)
Dialysis or typical tangential flow concentration using an ultrafiltration unit
It can be recovered from the cold diluted neutral salt solution wash by the method. In a preferred method, a cooled salt solution
The salt-soluble collagen recovered from the solution is reduced to a nominal molecular weight cutoff of 100,000 k.
It can be concentrated using an ultrafiltration unit of Da.
In addition, procollagen can be recovered from spent cell culture media by various methods.
Wear. Efficient removal of procollagen from culture medium and purification of procollagen
Any method that can be used can be used. For such an approach
Treats used cell culture medium with pepsin, performs differential salting out,
Removal of id collagen is involved. In addition, used cell culture media
With affinity for antibodies against one of the procollagen peptides
Can be flushed to a chromatographic bed. Procora recovered in this way
Is treated with specific C- and N-proteinases to cleave the peptide
Separates undamaged, fully processed collagen containing telopeptides
be able to. Isolation of cleaved propeptides and imbalance in collagen metabolism
It can be used therapeutically to treat diseases to improve the condition.
Until the collection of collagen extracted from the cell layer stops or the culture deteriorates
The circulation step can be repeated. At this point, the collagen deposited on the cell layer is
As it cannot be dissolved in solution, extract the culture in diluted acetic acid, dissolve it, and recover by differential salting out.
can do. This fully processed telopeptide-containing collagen is pericellular
Crosslinked to the matrix.
Example
Cultured in a medium containing the lysyl oxidase inhibitor β-aminopropionitrile.
Dissolved procollagen in phosphate buffered saline using human fibroblasts
With reference to a specific example of using a hollow fiber membrane to collect and concentrate procollagen,
The present invention will be described in more detail. If you are skilled in the art, naturally produce collagen
Or other cells that produce collagen by genetic engineering,
Collagen crosslinking inhibitors and various salt solutions could be selected. Culture media and culture strips
Parameters and ranges, select and test various parameters and ranges
Within the ability of those skilled in the art to determine the operability of collagen recovery as defined in the claims
included.
Example 1
Routine extraction of human collagen from cell layers with Dulbecco's phosphate buffered saline
By fibroblasts in culture in the presence of exogenous lysyl oxidase inhibitors
Manufacture of human collagen
Human foreskin fibroblasts (strain name HDF B116, Organogenesis Inc. , Canton,
(Supplied from MA) was continuously subcultured for the purpose of mass culture. Culture culture throughout the experiment
The ground contains no antibiotics and no serum. Medium for large-scale culture includes:
M: Dulbecco's modified Eagle medium (high glucose formulation) / Ham's F-12 medium (3
: 1, v / v), GlutaMAX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3
M], hydrocortisone [0.4 μg / ml], bovine insulin [5 μg
/ Ml], 3,3 ', 5-triiodo-L-thyronine [2 x 10-11M]
Transferrin [5 μg / ml], ethanolamine [1 × 10-FourM],
Ortho-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM], calcium chloride [
1 × 10-3M], adenine [1.8 × 10-FourM], selenic acid [5.3 × 10-8M
And mouse epidermal growth factor [10 ng / ml].
3 liters sterilized and siliconized (Prosil-28, PCR Inc., Gainesville, FL)
50 g glass-coated torr spinner flask (Bellco, Vineland, NJ)
Plastic beads (SoloHill, Ann Arbor, MI)
1x10 for 1 liter of growth medium8Individual cells were seeded. This medium is
The composition is as follows: Dulbecco's Modified Eagle Medium (High Glucose Formula) / Ham
GlutaMAX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, M.M.) was added to F-12 medium (3: 1, v / v).
D) [4 × 10-3M], hydrocortisone [0.4 μg / ml], bovine insect
Furin [5 μg / ml], 3,3 ′, 5-triiodo-L-thyronine [2
× 10-11M], human transferrin [5 μg / ml], ethanolamine
[1 × 10-FourM], ortho-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM]
, Calcium chloride [1 × 10-3M], adenine [1.8 × 10-FourM], selenic acid
[5.3 × 10-8M], mouse epidermal growth factor [10 ng / ml], β-aminop
Lopionitrile [50 μg / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)
Was added. Keep the flask at 37 ° C ± 0.5 ° C / 10% ± 0.5% COTwoInclusion
Placed in beta. Allow 24 hours for the cells to attach to the beads and simultaneously spinner
Set at 15-18 rpm for 1 minute on / 30 minute off intermittent cycle
did. After attachment, the growth medium volume is gradually increased over several days to a final volume of 3 l.
It was a title. The stirrer (impeller impeller) speed was set to 25 revolutions per minute,
After a week, the impeller speed was reduced to 21 revolutions per minute. 2 liters of spent growth medium
Remove the bottle and leave 1 liter of medium in the spinner flask to make a fresh adjustment.
The medium was filled every 2-3 days by adding 2 liters of the grown medium.
After 12 days, the culture is confluent (i.e., when cells have covered the bead surface).
), The growth medium was removed and replaced with production medium. The production medium is Dulbecco's modified Eagl
e medium (high glucose formulation) / GlutaM in Ham's F-12 medium (3: 1, v / v)
AX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M], hydrocortisone [
0.4 µg / ml], bovine insulin [5 µg / ml], 3,3 ', 5-
Liodo-L-thyronine [2 × 10-11M], human transferrin [5μ
g / ml], ethanolamine [1 × 10-FourM], ortho-phosphoryl eta
Nolamine [1 × 10-FourM], calcium chloride [1 × 10-3M], β-amino
Propionitrile [50 μg / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)
, L-ascorbic acid magnesium phosphate hydrate
agnesium salt n-hydrate) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Richmond,
VA) [50 μg / ml], L-proline [1.93 × 10-3M], glycine [1
. 67 × 10-3M] was added.
A cooling cycle was performed after two days in the production medium. Remove the used production medium from the container.
At room temperature in Dulbecco's phosphate buffered saline (BioWhittaker Inc., Walkersville,
(MD) Add 500 ml over 1 minute to dilute and remove any remaining spent medium.
Was. Dulbecco phosphate buffered saline was immediately removed from the spinner flask. cell
1 liter of Dulbecco phosphate buffered saline at 4-8 ° C to dissolve surrounding collagen
Add the turtle to the container, leave it in the refrigerator at 4-8 ° C for 1 hour and remove the container by hand.
And stirred every 10 minutes. Dulbecco's phosphate-buffered saline contains dissolved lysate from the cell layer.
Removed because it contained lagen and added fresh production medium at 37 ° C to the container
. Container at 37 ° C ± 0.5 ° C / 10% ± 0.5% COTwoReintroduced to contain incubator
Was placed. After the introduction of the production medium into the cell culture system, the culture was maintained for 133 days. 1
The cycle was repeated every 2-3 days for 33 days. Dulbecco from the cooling cycle
The phosphate buffered saline was kept frozen at -20 ° C until concentrated.
From the first 22 cooling cycles, to concentrate the solubilized collagen
22 liters of Dulbecco phosphate buffered saline containing collagen obtained from the cell layer
The torr were freeze-thawed overnight at 4-8 ° C. After freeze-thawing, Dulbecco phosphate buffered saline
Was acidified with acetic acid to a final concentration of 0.05% (v / v). Acidified mixture
Is a hollow fiber cartridge with a molecular weight cutoff of 100,000 (A / G Technologies
, Needham, MA) in a closed loop to remove molecules below the molecular weight cutoff
Concentrated as possible. The final volume of the concentrate was 368 ml.
Example 2:
Individual cooling by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
Extracted from cell layers using Dulbecco's phosphate buffered saline from a recycle cycle
And identification of α-chain
Remove a fixed amount of Dulbecco's phosphate buffered saline from each cooling cycle and
Sodium sulfate (0.4%, w / v), glycerol (6%, w / v), β-
Denatured with lcaptoethanol (1.5%, v / v) at 100 ° C for 3 minutes
, 120V (constant voltage) 2-3 with sodium tris-glycine-dodecyl sulfate
Over time, polyacrylamide minigel (8%, w / v, Novex, San Diego,
CA) isolated by electrophoresis (Laemmli, Nature, 1970, 227, 680-685). The gel is
Page Blue 83 (0.1%) dissolved in methanol / acetic acid / water (5: 1: 4)
w / v, Fluka, Ronkonkoma, NY) for 1-2 hours. Diffusion destaining is acetic acid aqueous solution
(8%, v / v) for 24 to 48 hours. From gel, Dulbecco phosphate buffered saline
Each sample of human collagen extracted from the cell layer at 4-8 ° C in water
Contains bands migrating as collagen α1 (I) and α2 (I) chains
It was revealed. In the additive solution used, the page blue 83 stain on the gel
No band was found.
Example 3
Of concentrated human collagen extracted from the cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline
Isolation by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
To identify the major types of collagen present in the collagen preparation,
Treat with pepsin to cleave the telopeptide and propeptide,
It was subjected to acrylamide gel electrophoresis. Cell layer in Dulbecco phosphate buffered saline
Acid extraction from calf ligaments in comparison with concentrated human collagen extracted from
Bovine collagen (U.S. Pat. No. 5,106,949; Kemp et al., Organog
enesis Inc., Canton, MA) and pepsin extracted human collagen I (Sigma type)
VIII collagen, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 1.0 ± 0.1 mg /
Dissolved in ml. Different collagen samples were prepared at 4 ° C for 16 hours in acetic acid
0.5 M) and digested with pepsin (100 μg / ml) (Lamande & Bateman,
Matrix 1993, 13, 323-330).
Samples of both pepsin-treated and non-pepsin-treated collagen
Prepared for isolation by acrylamide gel electrophoresis. Collagen samples
Presence of sodium decyl sulfate (0.2%, w / v) and glycerol (8%, w / v)
Denaturation at 100 ° C. for 3 minutes in the presence of tris / glycine / sodium dodecyl sulfate
120V (constant voltage) for 2.5 hours using a polyacrylamide minige
(8%, w / v) Novex, San Diego, CA) by electrophoresis (Laemmli,
Nature, 1970, 227, 680-685). Gel is methanol / acetic acid / water (5: 1: 4)
1 with Page Blue 83 (0.1% w / v, Fluka, Ronkonkoma, NY) dissolved in
Time stained. Diffusion and destaining of the gel is performed over 60 hours with an aqueous acetic acid solution (8% v / v).
The gel was dried. Extracted from the gel shown in Figure 1 into Dulbecco's phosphate buffered saline
Most of the raw materials released exist as collagen α1 (I) and α2 (I) chains.
It became clear that. Comparison between pepsin-treated and non-pepsin-treated materials?
The other bands were [α1 (III)] 3 and procollagen type I.
Probability is high. Most obvious from the gel is the lack of the beta component of collagen I
(Sokolov et al., Medical Science Research, 1989, 17, 911-913). Gel top
The lack of substance in the part indicates that the substance extracted with Dulbecco's phosphate buffered saline
It further suggests that it is neutral and contains few intramolecular crosslinks.
Example 4:
Human collagen extracted from cell layer by Dulbecco phosphate buffered saline
Collagen determination in extracts
Collagen is quantified based on the amount of hydroxyproline present in the material
Often done. Hydroxyproline is identified as described in detail below.
Measured by chemical assays (Woessner, Arch Biochem Biophys, 1961, 93, 440-447)
Can be determined.
An aliquot (1 ml) of Dulbecco's phosphate buffered saline from each cooling cycle
) Removed and hydrolyzed with an equal volume of hydrochloric acid (1 ml, 12M) at 110 ° C for 16 hours.
The hydrolyzate was neutralized with sodium hydroxide (10M). Sun from neutralized hydrolyzate
Remove the pull (100 μl) and dispense into the wells of a 96-well microplate
did. Amino acid standard solutions of various concentrations (hydrolyzed collagen, #
A9531, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
Dispensed into rates. Each well contains water / ethylene glycol monomethyl ether.
Chloramine T dissolved in water / acetate buffer pH 6 (2: 3: 5, v / v)
50 μl, 0.05 M (Mallinckrodt Chemicals, Chesterfield, MO))
And incubated for 20 minutes at room temperature. After incubation, perchloric acid (
50 μl, 3.15 M, J.T. Baker, Phllipsburg NJ) to each well and add room temperature
Incubated for 5 minutes. Next, para-dimethylaminobenzaldehyde (Ald
rich Chemical Co., Milwaukee, Wis.)
Solution (50 μl, 20%, w / v) was added to each well,
Was incubated at 60 ° C. for 20 minutes. Immediately after incubation, remove the plate
Reading was performed with a 570 nm microplate spectrophotometer. Standard curve is 570n
based on dilution series of amino acid standard for absorbance at m
It becomes a plot of the amount of cyproline. Using the slope of this curve,
The xyproline concentration was calculated. The collagen concentration was 12.2% (w
/ W) containing hydroxyproline (Laurent et al., Anal Biochem, 198).
1, 113, 301-312). From the results shown in FIG.
Collagen is dissolved from the cell layer by Dulbecco's phosphate buffered saline during the recycle cycle.
It is shown that it solved.
Example 5:
In a human collagen-enriched extract from cell layer with Dulbecco phosphate buffered saline
Determination of Collagen
An aliquot (1 ml) of the acidified concentrated collagen is taken out and an equal amount of hydrochloric acid (1 m) is taken out.
1, 12 M) at 110 ° C. for 16 hours. Cool the sample before hydroxylation
Neutralized by the addition of sodium (1 ml, 10M). In addition, sample 20
Diluted with 0 ml. Three samples (1 ml) of diluted solution and amino acid standard (
Standard solution) series (hydrolyzed collagen, # A9531, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
Was assayed. Water / Ethylene glycol for each sample and standard
-Dissolved in monomethyl ether / acetic acid buffer pH6 (2: 3: 5, v / v)
Chloramine T (0.5 ml, 0.05 M (Mallinckrodt Chemicals, Chesterfiel)
d, MO)), mix the solution and incubate for 20 minutes at room temperature (Woess
ner, Arch Biochem Biophys 1961, 93, 440-447). Excessive
Chloric acid (0.5 ml, 3.15 M; JT Baker, Phllipsburg NJ) was added to each test tube.
Was added. The samples were mixed and incubated for 5 minutes at room temperature. Para-dimethyl
Aminobenzaldehyde (0.5 ml, ethylene glycol monomethyl ether
20% w / v, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) was added and mixed.
The sample was then incubated at 60 ° C. for 20 minutes. After incubation
The sample was cooled and the absorbance was read by a spectrophotometer at 560 nm. standard
Curves represent dilution series of amino acid standard versus absorbance at 560 nm.
This results in a plot of the amount of hydroxyproline based on this. Using the slope of this curve,
The hydroxyproline concentration of the sample was calculated. Collagen concentration is collagen
Was calculated assuming that contains 12.2% (w / w) hydroxyproline.
(Laurent et al., Analytical Biochemistry, 113: 301-312, (1981)). Dulbe
Human recovered from cell layer with cco phosphate buffered saline and concentrated by hollow fiber membrane dialysis
-The amount of collagen was between 330 and 350 milligrams. Material of final collagen
The concentration was 0.90 to 0.95 mg / ml.
Example 6:
Of concentrated human collagen extracted from the cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline
Partial amino acid analysis
For amino acid analysis of samples, use the Pico-Tag Method Handbook (Millipore C
orp., Bedford, MA) using the Waters Pico-Tag System (B
idlinger et al., Journal of Chromatography, 1984, 336, 93-104). Cost
In addition, concentrated human collagen extracted from the cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline
Bovine collagen acid-extracted from calf ligaments (US Pat. No. 5,106,949)
No., Kemp et al., Organogenesis Inc., Canton, Mass.) And pepsin-extracted human
Collagen I (Sigma type VIII collagen, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO
) Was dissolved at 1.0 ± 0.1 mg / ml. A certain amount from a triplicate (
0.1 ml), freeze-dried and salt containing phenol (1%, w / v) in a nitrogen environment
1 hour at 145 ° C in the vapor phase with acid (6M)
I thawed. Samples were also prepared in ethanol: water: triethylamine (2: 2: 1, v
/ V) and lyophilized. Samples were phenylisothiocyanate (Pierc
e Chemical Co., Rockford, IL): ethanol: water: triethylamine (1: 7).
: 1, v / v) at room temperature for 20 minutes and then frozen. sample
Is further lyophilized to remove Pico-Tag Sample Diluent (Pico-Tag sample diluent, Millipo
recorp., Bedford, MA), resuspend the residue and perform high-performance liquid chromatography.
Prepared for Waters 150mm x 3.9mm reversed phase
Derived amino was injected into a C18 column (Millipore corporation, Bedford, MA).
The acid was subjected to a sodium acetate-acetonitrile gradient (Pico-Tag eluents A and B, Millipo
re corporation, Bedford, MA). The peak area of a typical peak is
Determined by Dund's integration and comparison. The results are shown in Table 2. From the results, other
Extracted from cell layer with near-accurate incidence when compared to bovine and bovine collagen
It is shown that major amino acids are present in the human collagen obtained.
Example 7:
Production of human collagen by fibroblasts in culture: continued from Example 1
This embodiment is a continuation of the first embodiment.
Example 1 From 3 liter spinner flask (Bellco, Veneland, NJ) culture
The cooling cycle continued for another 42 days under the same conditions. In other words, culture is
Maintained for a total of 175 days in magnesium production medium, containing magnesium and calcium
Dulbecco phosphate buffered saline at 4-8 ° C (BioWhittaker Inc., Walkersville, MD)
The collagen was solubilized 73 times. Dulbecco phosphate buffer from the cooling cycle
The saline was frozen at -20 ° C until concentrated.
In order to concentrate the dissolved collagen, cooling cycle 23 to cooling cycle 7
Dulbecco's phosphate buffered saline containing 51 l of collagen from the cell layer through No. 3
The turtle was freeze-thawed overnight between 4-8 ° C. After freeze-thawing, Dulbecco phosphate buffered
The tap water was acidified with acetic acid to a final concentration of 0.05% (v / v). Acidified mixing
The solution was a hollow fiber cartridge with a cut-off molecular weight of 100,000 (A / G Technologie
s, Needham, MA) to remove molecules below the molecular weight cutoff
Concentrated by closed loop. The final volume of the concentrate was 315 ml.
As described later, hydroxyprolyl in concentrated human collagen samples
Collagen was quantified based on the amount of protein. A certain amount of acidified concentrated collagen (1
ml) and removed at 110 ° C. for 16 hours using an equal volume of hydrochloric acid (1 ml, 12M).
I thawed. The hydrolyzate was neutralized with sodium hydroxide (10M). Neutralized hydrolysis
Remove the sample from the material (100 μl) and place in a 96-well microplate.
Noted. Amino acid standard solution (hydrolyzed collagen) at various concentrations to generate a standard curve
, # A9531, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
Dispensed into plates. Each well contains water / ethylene glycol monomethyl
Chloramine T dissolved in ether / acetate buffer pH 6 (2: 3: 5, v / v)
(50 μl, 0.05 M (Mallinckrodt Chemicals, Chesterfield, MO))
And incubated at room temperature for 20 minutes. After incubation, perchloric acid
(50 μl, 3.15 M, JT Baker, Phllipsburg NJ) was added to each well, and the
Incubated for 5 minutes. Next, para-dimethylaminobenzaldehyde (A
ldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.)
The solution (50 μl, 20%, w / v) dissolved in Ter was added to each well, and
The plate was incubated at 60 ° C. for 20 minutes. Immediately after incubation, plate
Was read on a 570 nm microplate spectrophotometer. Standard curve is 570
based on absorbance in nm and dilution series of amino acid standards
It becomes a plot of the amount of lorin. Use the slope of this curve to calculate the hydroxy
The proline concentration was calculated. The collagen concentration is 12.2% (w / w) of collagen.
Was calculated assuming that it contains hydroxyproline (Laurent et al., Anal.
Biochem, 1981, 113, 301-312). Cells with Dulbecco phosphate buffered saline extract
The amount of human collagen recovered from the layer and concentrated in the hollow fiber membrane was 463 mg. original
The final collagen concentration of the preparation was 1.47 mg / ml.
Example 8:
Cultured in the presence of the lysyl oxidase inhibitor β-aminopropionitrile, Du
Routine extraction of human collagen from cell layer using lbecco phosphate buffered saline
Production of human collagen by fibroblasts
Human neonatal foreskin fibroblasts (strain name HDF B119, Organogenesis Inc., Ca
nton, MA) and subcultured for mass production. Culture throughout the experiment
The medium contains no antibiotics and no serum. Mass production media contains:
: Dulbecco's modified Eagle medium (high glucose formulation, no L-glutamine, BioWhit
Nutrient Mix F-12 of taker Inc., Walkersville, MD and Ham
-12) (without L-glutamine, Hyclone Labs., Logan, UT) at 3: 1 (v / v).
After mixing, GlutaMAX-I [4 × 10-3M] (Gibco BRL, Gainthersburg, MD), Hyde
Locortisone [0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO);
Si insulin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3
, 3 ', 5-triiodo-L-thyronine [2 ×
10-11M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), human transferrin [
5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ethanolamine [1
× 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ortho-phosphoryl
Ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),
Denin [1.8 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), selenic acid
[5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), human recombinant
Epidermal growth factor [5 ng / ml] (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placi
d, NY).
3 liters sterilized and siliconized (Prosil-28, PCR Inc., Gainesville, FL)
50 grams glass-coated torr volume spinner / flask (Bellco, Vineland, NJ)
Plastic microcarriers (SoloHill, Ann Arbor, MI)
2.6 x 10 per liter of known growth medium8Cells were inoculated.
The medium consists of the following: Dulbecco's modified Eagle medium (high glucose formulation)
No, L-glutamine, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) / Ham nutrients
Mixed F-12 (without L-glutamine, Hyclone Labs, Logan, UT) was added 3: 1 (v /
v) and mixed with GlutaMAX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M]
, Hydrocortisone [0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO), bovine insulin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, M.
O), 3,3 ', 5-triiodo-L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO), human transferrin [5 μg / ml] (Sigma C
chemical Co., St. Louis, MO), ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO), ortho-phosphorylethanolamine [1 × 1
0-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), adenine [1.8 × 10-FourM
] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), selenic acid [5.3 x 10-8M] (Aldr
ich Chemical Co., Milwaukee, WI), human recombinant epidermal growth factor [5 ng /
ml] (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY). H
Rasco is heated to 37 ° C ± 0.5 ° C and 10% ± 0.5% carbon dioxide rich atmosphere.
It was set up in an incubator kept in mind. 24 hours until cells attach to beads
Over time and at the same time spinner at 15-20 rpm
It was set to be an intermittent cycle of 1 minute on / 30 minutes off. After installation,
The growth medium volume was gradually increased over several days to a final volume of 3 liters. Stir bar
The impeller speed was set at 18-22 rpm. Medium used
Remove 2 liters of growth medium and add 1 liter of medium to spinner flask
2 to 3 days by adding 2 liters of freshly prepared growth medium
And filled. After 10 days, the culture is confluent (ie, cells are
A) When the surface was completely covered), the microcarrier was clamped. Proliferate at this point
The medium was removed and replaced with a collagen production medium. The production medium contains: Dulbec
co modified Eagle medium (high glucose formulation, no L-glutamine, BioWhittaker In
c., Walkersville, MD) and nutrient mixture F-12 (without L-glutamine, Hyc
lone Labs., Logan, UT) at 3: 1 (v / v) and GlutaMAX-I (Gibco B
RL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M], hydrocortisone [0.4 μg
/ Ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), bovine insulin [5 μg
/ Ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3,3 ', 5-triiodo-
L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), human
Transferrin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),
Ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),
Luso-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co.
, St. Louis, MO), selenic acid [5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemical Co., Milw
aukee, WI), β-aminopropionitrile [50 μg / ml] (Aldrich Chemica
l Co., Milwaukee, WI), L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n
Hydrate (Wako Pure Chemical, Ltd., Richmond, VA) [50 μg / ml], L-proline [
1.93 × 10-3M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), glycine [final concentration
Degree 1.67 × 10-3M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
.
After 2 days in the collagen production medium, cool the cells to collect collagen from the cell layer.
Kuru was implemented. Remove the spent production medium from the container and remove calcium and magnetic
Room temperature Dulbecco's phosphate buffered saline containing cat (Cat. # 17-513)
Q, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) 500 ml over 1 minute,
All remaining spent medium was diluted and removed. Dulbecco phosphate buffered saline
Removed immediately from the spinner flask. For solubilizing collagen around cells
Dulbecco phosphate buffered saline containing calcium and magnesium at 4-8 ° C (
Catalog # 17-513Q, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD)
Add the turtle to the container and leave it in the refrigerator at 4-8 ° C for 1 hour.
Stir every 10 minutes. Dulbecco's phosphate-buffered saline is used for dissolving collagen from the cell layer.
And fresh production medium at 37 ° C. was added to the vessel. Content
In a 37 ° C ± 0.5 ° C, carbon dioxide (10% ± 0.5%) rich atmosphere
Reintroduced to the maintained incubator. The cycle was repeated every 2-3 days.
Between 150 days, 57 liters of Dulbecco phosphate buffer containing solubilized collagen
Impulsive edible water was collected. Dulbecco phosphate buffered saline from the cooling cycle is described below.
-20 ° C until concentrated. Collage until day 157
The culture was still maintained in the production medium.
To concentrate the solubilized collagen, the fines from the first 57 cooling cycles
57 liters of Dulbecco's phosphate buffered saline containing alveolar collagen at 4-8 ° C
Lyophilized overnight. After freeze-thawing, the solution was mixed in one container. From this container
, Stainless steel strainer and 5μm clarifying filter (PALL Corporation, East Hill
s, New York) and pump the solution over the glass-coated plate remaining in the collected sample.
All plastic microcarriers and cell debris were removed. After this, solubilize
Dulbecco's phosphate buffered saline containing isolated collagen was added to glacial acetic acid (JT Baker, Inc.
hillipsburg, NJ) to a final acetic acid concentration of 0.05%. Solubilized collagen
The acidified solution containing is a hollow fiber membrane with a molecular weight cutoff of 100,000 in a closed system.
Type ultrafiltration cartridge (length 310mm x diameter 32mm, A / G Technologies, N
eedham, MA) to about 3 liters. By ultra filtration cartridge
Materials smaller than the molecular weight cutoff can be removed. After this,
The solution is 5x in the same ultrafiltration system to remove any residual salts and media components
Diafiltration against an aqueous solution of acetic acid (0.05%, v / v)
Collagen was allowed to remain in the acetic acid aqueous solution. Collagen is the same system
To a final volume of 450 ml.
To identify a concentrated substance as human collagen, sodium dodecyl sulfate
Characteristic collagen α-chain was searched for by polyacrylamide gel electrophoresis. Dark
A sample of condensed human collagen (42 μl) was added to sodium dodecyl sulfate (0.4
%, W / v), glycerol (6%, w / v) and β-mercaptoethanol (
1.5%, v / v) in a final volume of 100 μl for 3 minutes at 100 ° C.
Was. A sample of the concentrated human collagen of Example 7 was similarly prepared. These services
The sample was a polyacrylamide minigel (8%, w / v, Novex, San Diego, CA)
), Tris (0.025 M) / glycine (0.192 M) / sodium dodecyl sulfate
1.9 hours at 20 A (constant current) using a lithium (0.1%, w / v) buffer system
Was isolated by electrophoresis. Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970). Gel
Page Blue 83 (0.1%) dissolved in methanol / acetic acid / water (5: 1: 4)
, W / v, Fluka, Ronkonkoma, NY) for 1.5 hours. Diffusion destaining is acetic acid aqueous solution
Liquid (8%, v / v) for 36 hours. As shown in FIG.
Human collagen extracted from the cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline at 4-8 ° C
Α1 (I) and α2 (I) chains on the gel
It was found that the band that moved was included.
Example 9:
Creation of high density fibrous collagen (DFC) structure
Transwell (transwell, 24 mm, k-resin, pore size 3
. 0 μm, Costar Corporation, Cambridge, MA) in a 150 ml glass beaker
So that the transwell membrane is about 1 cm below the top of the beaker.
Was. The beaker contains sodium phosphate buffer (pH 6.83, NaTwoHPOFour, 2
. 84%, w / v, J.T. Baker Company, Phillipsburg,
NJ; NaHTwoPOFour-HTwoO, 3.11%, w / v, J.T. Baker Company, Phillip
sburg, NJ; NaCl, 0.49%, w / v, Sigma Chemical Company, St. Lou
is, MO) to polyethylene glycol (20%, w / v, molecular weight 8,000, Spec
trum Chemical Manufacturing Company, Gardena, CA)
Filled with. Put the stirrer bar in the beaker,
Place on a stirrer plate (Scientific Products, McGaw, IL).
C. in a chamber. Concentrated human collagen from Example 1 (4.0 ml,
0.95 mg / ml) to the Transwell and add polyethylene glycol solution
(See above) was gently stirred. Saran Wrap (registered trademark)
Spread over the swell to suppress evaporation of the collagen solution and to contaminate with particulate matter
Was prevented. Add concentrated human collagen solution at 2 hour intervals
-A total of 8.0 ml of collagen was added to the transwell. Koller
Gen could be deposited on the transwell film in a total of 36 hours. Trance
Remove the well membrane from the polyethylene glycol solution (see above) and remove
The sample was allowed to stand in a dehydration chamber at 0% and 4 to 8 ° C. for 21 hours.
Place the transwell containing the dehydrated DFC configuration in a 150 ml glass beaker.
This is filled with deionized water and completely dehydrated with the dehydrated DFC structure.
The DFC configuration was rehydrated. Add stirrer bar to beaker and beaker
Placed on stirrer plate. Stir deionized water slowly to rehydrate DFC
Accelerated washing of residual polyethylene glycol. Rehydrate composition for 15 minutes
After allowing the water to drain from the configuration. The configuration was also left in the dehydration chamber for 72 hours.
. The DFC configuration was rehydrated as described above on a 1 hour cycle.
Preparation of the DFC configuration for the scanning electron microscope was performed as described below. Para
Formaldehyde (2%, v / v), glutaraldehyde (2.5%, v / v)
And acrolein (1%, v / v) with sodium cacodylate (0.1 M pH
The DFC configuration was fixed for 48 hours in the solution of 7.4). This service
The sample was dissolved in sodium cacodylate (0.1 M, pH 7.4).
Post-fixed to smium (1%, w / v), uranyl acetate aqueous solution (2%, w / v)
), The whole block was stained (stained en bloc). After secondary fixation, sample
Ethanol dehydration series and dehydration through propylene oxide, Epox
-812 (Ernest F. Fullam, Rochester, NY). Uranyl acetate and que
Ultra-thin sections (about 700 nm) were stained with lead acid, and Joel JEM100S scanning electron microscope was used.
Microscopy was performed at 80 kV. Many aggregates of banded collagen fibers
It is shown in the micrograph. See FIG. The longitudinal section of the agglomerate looks like a honeycomb
With large “holes” between groups of fibrils. Some parts have fibers
It contains delicate fibrils that did not aggregate to form
Looks like "agglomerated" clumps. The D periodic band was measured to be 58.9 ± 1.
It was 7 nm (n = 10). This value is acceptable for the D cycle of collagen I
It is reported to be 67 nm in vivo and 60 nm after dehydration.
Have been. Parry and Craig, Bioploymers 16: 1015-1031 (1977).
Example 10:
Production of collagen sponge from human collagen
Concentrated human Kola of Example 1 from a cooled Dulbecco phosphate buffered saline wash cycle
Gen (5 ml, 0.95 mg / ml) in a polystyrene tissue culture dish (35 mm
× 10 mm, Costar Corporation, Cambridge, Mass.). Cover the culture dish
It was covered and fixed with tape. Place the culture dish in a styrofoam container and allow the culture dish to
It is located in the center of the container space. The collagen solution was slowly frozen. This
This is done by first freezing the collagen solution at -20 ° C for 16 hours, then
This was carried out by freezing at 80 ° C. for 16 hours. Remove the lid of the culture dish and place the frozen collagen
The lyophilized vial containing the solution (1200 ml capacity, VirTis Co., Gardi)
ner, NY) and freeze-dryer (Vir) until the collagen solution is completely lyophilized.
Tis Co., Gardiner, NY). Freeze-dried collagen with minimal amount of acetic acid (2 ml
, 0.5M, J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) and gently mixed. this
3 ml of concentrated human collagen from Example 1 was added to human collagen in acetic acid.
Until the total 25 mg of human collagen has been added to the cell culture dish.
Frozen treatment of human dishes with collagen and subsequent freeze-drying and re-dissolving
The solution was repeated. Once 25 mg of human collagen has been completely lyophilized,
The sponge was inspected and photographed (see FIG. 5).
Example 11:
Human cultured in the presence of lysyl oxidase inhibitor β-aminopropionitrile
Concentrations extracted from Dulbecco's phosphate buffered saline from cell layers of neonatal foreskin fibroblasts
Determination of proteoglycan / glycosaminoglycan content of condensed human collagen
Proteoglycans and glycosaminoglycas present in collagen preparations
For proteoglycans and glycosaminoglycans to determine the amount of
Blyscan Proteoglycan and Glycosaminoglycan Assay kit
Biocolor Ltd., Belfast, Northern Ireland). This kit is professional
Theoglycans and glycosaminoglycans convert to dye 1,9-dimethylmethylene blue
Based on specific binding. Proteoglycans and glycosaminoglyca
When the compound binds to the dye, it forms an insoluble complex that precipitates from the aqueous solution. This precipitate
The complex was pelleted by centrifugation. Supernatant containing unbound dye is decanted
Isopropanol / chaotropic salt solution
Resuspend the pellet in This gives the dye-proteoglycan / glycosamino
Releases dyes from glycan complexes and allows for spectrophotometric quantification
Become like
Example 1 (0.95 mg / ml) and Example 7 (1.4 mg / ml)
Remove two sets of collagen (100 μl) from the collagen sample.
1.5 m for the determination of proteoglycan and glycosaminoglycan content
Dispensed into 1-volume microcentrifuge tubes. One set of standard solutions is also supplied as a kit.
1.0, 2.0, 3.0, 5.0 of chondroitin-4-sulfate purified from trachea
Two μg were prepared. Blyscan dye is used in all test samples and standards.
Add 1 ml of reagent (1,9-dimethyl-methylene blue) and vortex all tubes.
Mix vigorously with a Tex mixer. Incubate for 30 minutes at room temperature in a test tube.
Proteoglycans and glycosaminoglycans and dyes
The reagent was allowed to form an insoluble complex. Beck samples and standards
Beckman high-speed centrifuge (Model J2-21, Beckman Instruments, Inc., Palo Alt)
o, CA), and centrifuged at 8000 g for 10 minutes using a JA-18.1 rotor. You
Decant the supernatant from all tubes and remove any remaining supernatant from the tubes.
Care should be taken that the droplets do not break any pellets that may be present in the test tube.
In the meantime, the test tube was inverted and gently tapped on a paper towel to remove. All samples
And a standard solution containing Blyscan Dissociation Reagent (1)
. 0 ml) was added to redissolve the pellet, releasing bound dye into solution.
. Mix the sample and standard solution using a vortex mixer for 5 seconds, and pellet.
Was left at room temperature until completely dissolved. Quantify sample and standard solution into cuvette
Noted. The absorbance of both the sample and the standard solution was measured using a DU-50 Beckman spectrophotometer.
(Beckman Instruments, Palo alto, CA) using distilled water as blank
, 656 nm. The average absorbance of each standard solution was determined for chondroitin-4-sulfate.
Plotted against amount (micrograms). Equation of the l
ine) to detect proteoglycans and
And the amount of glycosaminoglycan was calculated. From the results, 1 to 1.5 mg / m
between 100 μl of human collagen and 100 μl of human collagen.
Contain 1 μg or less as proteoglycan and glycosaminoglycan
I understood. These results indicate that both human and collagen samples tested
In the preparation of negligible amounts of proteoglycans and glycosaminoglycans
Or not included.
Example 12:
Induction of cyanogen bromide in concentrated human collagen to demonstrate the presence of collagen III
For sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of conducting peptides
Isolation by
Determine if collagen III is present in concentrated human collagen samples
For this purpose, collagen is digested with cyanogen bromide and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis.
Was mapped by Digestion of collagen by cyanogen bromide is not oxidized.
Dissociate proteins from methionine residues to create an independently recognizable peptide map
Will reveal. This approach highlights the potential for disruptions in many different mammalian species.
It is possible to distinguish between gene I and collagen III. Laurent et al., Analytical
Biochemistry, 113: 3011-312 (1981); Kirk et al., Collagen and Related.
Research, 4: 169-182 (1987) (1984); Lillie et al., Methods in Enzym.
ology, 145: 171-183 (1987); Mays et al., Mechanisms of Aging and Deve.
lopment, 45: 203-212 (1988).
An aliquot of the concentrated human collagen from Example 1 was pipetted into a 1.5 ml microcentrifuge tube.
Pet dispensed. Pepsin extracted human collagen I (Sigma type VIII collagen)
, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) and pepsin-extracted human collagen
III (Sigma type VIII collagen, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)
The quantification was dispensed into 1.5 ml centrifuge tubes. All test tubes are Parafilm (registered trademark)
Standard, American National Can, Neenah, WI) and pierced at -80 ° C for 4 hours.
The tubes were frozen and lyophilized to dryness (VirTis Co. Gardiner, NY).
).
The lyophilized sample was purged with nitrogen gas to remove dissolved oxygen in 70% formic acid (
v / v, EM Science, Gibbstown, NJ). Cyanogen bromide (Sig
ma Chemical Company, St. Louis, MO) in 70% v / v formic acid
A solution of 50 mg / ml for Anne was achieved and purged with nitrogen gas for 3 minutes. Smell
An aliquot (0.2 ml) of the cyanide solution was added to the resuspended sample and a final concentration of 1
0 mg / ml of cyanogen bromide was obtained. The sample was purged with nitrogen gas for 5 seconds. Trial
The test tube was capped and digested at room temperature for 16 hours. 1.5 ml sample volume
Dispense into a centrifuge tube (3 × 0.3 ml), freeze at −80 ° C. for 4 hours, and freeze-dry
And evaporated to dryness.
The lyophilized dispensed sample was diluted in Tris-HCl (0.06 M, pH 6.8)
Resuspend the digested sample in sodium dodecyl sulfate (3%, w / v),
Prepared for electrophoresis by heating for minutes. Sodium dodecyl sulfate (1
7.4%, w / v), glycerol (6%, w / v) at 100 ° C. for 3 minutes
The sample was denatured and tris (0.025M) / glycine (0.192M) / do
Polyacrylamide gradient using sodium decyl sulfate (0.1%, w / v)
3 hr 12 in minigel (8-16%, w / v, Novex, San Diego, CA)
The buffer was run at 5 V (constant voltage) and isolated by electrophoresis. Laemmli, Nature
227: 680-685 (1970). Isolation is performed under non-reducing conditions and once the sample is reduced
Disulfide-bridged α migrating close to α1 (III) CB5 peptide
1 (III) Movement of the CB9 peptide was avoided. Kirk et al., Supra. Turner an
d Laurent, Biochemical Society Transactions 14: 1079-1080 (1986). gel
Is Page Blue 83 (0. 1) dissolved in methanol / acetic acid / water (5: 1: 4).
1%, w / v, Fluka, Ronkonkoma, NY) for 1-2 hours. Diffusion destaining is vinegar
The reaction was performed with an aqueous acid solution (8%, v / v) for 24 to 48 hours. Gel shown in FIG.
Is the α1 (III) CB5 peptide, a typical marker peptide for collagen III
Fragments are present in the sample, indicating that human collagen
This indicates the presence of collagen III in the preparation.
Example 13:
Cyanogen bromide of concentrated human collagen I to establish the presence of telopeptides
Induced peptide sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
Isolation by
To demonstrate the presence of telopeptides in human collagen I,
Digested with cyanogen bromide and the peptide was converted to sodium dodecyl sulfate / polyacrylic acid.
Mapping was performed by luamide gel electrophoresis. α1 (I) CB6 peptide is α1
Appearing from the carboxy terminus of the (I) chain, the α1 (I) chain in non-pepsin treated samples
Carboxy-telopeptides. Chandrakasan et al., Journal
of Biological Chemistry 251: 6062-6067 (1976). Contains telopeptides
For collagen samples without (eg, pepsin-treated samples), α1 (I
) Since the CB6 peptide migrates as a low molecular weight peptide,
Based on these two aspects of the α1 (I) CB6 peptide,
Can be determined [to distinguish the two peptides, the telopeptide
The peptide without the term is referred to as α1 (I) CB6 ′].
For pepsin digestion, 1.5 ml of concentrated human collagen from Example 8
Pipette was dispensed into a microcentrifuge tube (0.75 ml). Pepsin (Sigma Chemical
Company, St. Louis, MO; 200 μg / ml for 1 M acetic acid) for each sample
In addition, the final concentration of pepsin was adjusted to 100 μg / ml in 0.5 M acetic acid.
. Samples were digested at 4 ° C. for 16 hours. Freeze test tubes at -80 ° C for 4 hours
After tying, it was evaporated to dryness by freeze drying. These samples are described below.
Digested with cyanogen bromide.
Sample of non-pepsin-treated collagen from Example 8 and from human placenta
Collagen I standard extracted with pepsin, (Sigma type VIII collagen, Sig
ma Chemical Company, St. Louis, MO), Collar extracted from human placenta with pepsin
Gen III Standard (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)
Was dispensed into a 1.5 ml microcentrifuge tube and covered with Parafilm (registered trademark).
The film was perforated, the test tube was frozen at -80 ° C for 4 hours, freeze-dried and evaporated to dryness
did. Lyophilization of non-pepsin-treated and pepsin-treated collagen from above
The dried sample was reconstituted in 0.8 ml of 70% formic acid (v / v; EM Science, Gibbstown, NJ).
The suspension was suspended and purged with nitrogen gas to remove dissolved oxygen. Cyanogen bromide (Sigma Chemica
l Company, St. (Louis, MO) in 70% formic acid (v / v) to remove cyanogen bromide.
To make a 50 mg / ml solution, which was also purged with nitrogen gas for 3 minutes. Bromination
Add an aliquot (0.2 ml) of the cyan solution to the resuspended sample and remove
To a final concentration of 10 mg / ml. The sample was purged with nitrogen gas for 5 seconds.
The tubes were capped and digestion proceeded for 16 hours at room temperature. 1.5 ml sample
Dispense a fixed amount (2 x 0.45 ml) into a microcentrifuge tube and freeze at -80 ° C for 4 hours.
Evaporated to dryness by freeze drying.
Lyophilized cyanogen bromide digested collagen dispensing was performed using Tris-HCl (0.06 M, p
H6.8) dissolved in sodium dodecyl sulfate (3%, w / v).
By suspending and heating at 60 ° C. for 5 minutes, sodium dodecyl sulfate / polyamide is added.
Prepared for acrylamide gel electrophoresis. Sodium dodecyl sulfate (17.4
%, W / v) and glycerol (6%, w / v) at 100 ° C for 3 minutes.
Denatured, peptide was Tris (0.025M) / glycine (0.192M)
/ Polyacrylamide using sodium dodecyl sulfate (0.1%, w / v)
2.5 hours 12 in minigel (16%, w / v, Novex, Sandiego, CA)
The buffer was run at 5 V (constant voltage) and isolated by electrophoresis. Laemmbi, Nature, 227:
680-685 (1970). The gel was a gel dissolved in methanol / acetic acid / water (5: 1: 4).
Stain with the Blue 83 (0.1%, w / v, Fluka, Ronkonkoma, NY) for 1-2 hours
did. Diffusion destaining was performed with an aqueous acetic acid solution (8%, v / v) for 24 to 48 hours.
. As shown in FIG. 7, this gel shows that the collagen preparation is a non-pe
Communication determined by the presence of the α1 (I) CB6 band in the psin-treated sample
In addition, it shows that it contains the complete telopeptide. Non-pepsin treated human
In the lagen sample, some α1 (I) CB6 'peptide was also present.
This was probably caused by partial degradation of the non-helical telopeptide region.
It seems to have done.
Example 14:
Serum-free medium in the presence of the lysyl oxidase inhibitor β-aminopropionitrile
And collagen in the cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline.
Of collagen by human fibroblast HDF B116 cell line extracted by porcine
Human foreskin fibroblasts (strain name HDF B116, Organogenesis Inc., Canton,
MA supplied) in four plastic tissue culture flasks (T75, Costar C
ompany, Cambridge, MA) with serum-free and antibiotic-free growth media as described below.
5 × 10 cellsFivePiece / 75cmTwoSeeded. Serum-free growth medium includes: Dulb
ecco's Modified Eagle Medium (High Glucose Formula, No L-Glutamine, BioWhittaker
, Walkersville, MD) and Ham's nutrient mixture F-12 (without L-glutamine, Hyclo
ne Labs, Logan, UT) at 3: 1 (v / v)
GlutaMAX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M], Hydrocoach
Zon [0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), bovine in
Sulin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3, 3 ′,
5-triiodo-L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO), human transferrin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., S
t. Louis, MO), ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO), ortho-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO), adenine [1.8 × 10-FourM] (Sigma Chemic
al Company, St. Louis, MO), selenic acid [5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemica
l Co., Milwaukee, WI), β-aminopropionitrile [50 μg / ml] (Aldr
ich Chemical Co., Milwaukee, WI) and human recombinant epidermal growth factor [5
μg / ml] (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY).
of. Cells are heated under an atmosphere containing 10.0% ± 0.5% carbon dioxide in air.
This growth medium was maintained in a 37 ° C. ± 0.5 ° C. incubator. Growth medium is 3
Replaced with freshly prepared growth medium every ~ 4 days. After 7 days, cells are highly confluent
That is, a densely packed layer of cells formed at the bottom of the tissue culture flask. at the time
The growth medium was removed with and replaced with a collagen production medium. This production medium is Dulbec
co modified Eagle medium (high glucose formulation, no L-glutamine, BioWhittaker In
c., Walkersville, MD) and nutrient mixture F-12 (without L-glutamine, Hyc
lone Labs., Logan, UT) at 3: 1 (v / v) and GlutaMAX-I (Gibco B
RL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M], hydrocortisone [0.4 μg
/ Ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), bovine insulin [5 μg
/ Ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3,3 ', 5-triiodo-
L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), human
Transferrin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),
Ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO),
Luso-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co.
, St. Louis, MO), selenic acid [5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemical Co., Mil
waukee, WI), β-aminop
Lopionitrile [50 μg / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI),
L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate (Wako Pure Chemical, Richmo
nd, VA) [50 μg / ml], L-proline [final concentration 1.93 × 10-3M] (Sig
ma Chemical Company, St. Louis, MO), glycine [final concentration 1.67 × 10-3M
] Is added. Collagen production medium is freshly prepared every 3-4 days
The medium was replaced with a gene production medium. After 7 days, collagen of Dulbecco's phosphate buffered saline is recirculated.
A refrigeration cooling cycle was performed. Aspirate the used collagen production medium and leave it at room temperature Du.
lbecco phosphate buffered saline with calcium and magnesium added (catalog
# 17-513Q, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD)
Washed for 1 minute to remove any residual media. Dulbecco phosphate buffered saline will be
Aspirated. To solubilize pericellular collagen, calcium and magnesium
4-8 ° C Dulbecco's phosphate buffered saline (Cat. # 17-513Q)
, BioWhittaker Inc., Walkersville, Md.) To each flask.
Rusco was left at 4-8 ° C for 1 hour. After one hour, the cells contain collagen dissolved from the cell layer.
The Dulbecco phosphate buffered saline was aspirated and frozen at -20 ° C. Frus containing cells
A fresh collagen production medium was added to the cells, and high-concentration carbon dioxide 10.0% ± 0.1% was added.
Returned to the incubator maintained at a temperature of 37.0 ° C. ± 0.5 ° C. under a 5% atmosphere.
. The collagen production medium was changed every 3 to 4 days.
On days 7, 21, 28, 35, and 42, Dulbecco's phosphate buffered saline was used.
The collagen was recovered from the pericellular layer by extracting into the edible water. Dulbecco phosphate buffered saline
Collect collagen each time with water, then culture freshly prepared collagen production medium
Added. After the fifth collection on the 42nd day in the production medium, the culture was terminated, and the cells were scraped.
Aqueous acetic acid (5 ml, 0.1 mL) using Parr (Costar Corporation, Cambridge, Mass.).
5M; J.T. Baker Inc., Phllipsburg, NJ). Scraping
Acetic acid containing dried cells was centrifuged (25 x 89 mm ultracentrifuge tube, open top type, thick
Polyallomer centrifuge tube, Nalge Company, Rochester, NY)
The degradable collagen was solubilized. The scraped cell layer is left overnight in acetic acid at 4-8 ° C
After that, Beckman high-speed centrifuge (Model J2-21, Beckman Instrume
nts, Inc., Palo Alto, CA).
And centrifuged for hours. The supernatant of each sample was aspirated from the pellet and frozen at -20 ° C.
. The pellet contains acetate-insoluble collagen, cell debris, and other insoluble materials.
And also frozen at -20 ° C.
Include solubilized collagen to verify collagen production in such cultures
Dulbecco phosphate-buffered saline and acetic acid supernatant are combined with sodium dodecyl sulfate / polyacryl
Amide gel electrophoresis was performed to identify the presence of collagen α chain. Each cooling cycle
Dulbecco's phosphate buffered saline containing solubilized collagen from sodium chloride and sodium hydroxide
Acetate-soluble material from the cell layer neutralized with serum and pepsin from the human placenta
Extracted human collagen I standard solution (Sigma type VIII collagen, Sigma Chemic
al Company, St. Louis, MO) and take out a certain amount from sodium dodecyl sulfate (
17.4%, w / v), glycerol (6%, w / v), β-mercaptoethanol
(1.5%, v / v) for 3 minutes at 100 ° C., then tris (0.
025M) / glycine (0.192M) / sodium dodecyl sulfate (0.1%,
w / v) Polyacrylamide minigel using buffer system (8%, w / v, Nove
x, San diego, CA) and separated by electrophoresis at 125 V (constant voltage) for 2.25 hours.
Was. Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970). Gel is methanol / acetic acid / water
Page Blue 83 (0.1%, w / v, Fluka, Ronk) dissolved in (5: 1: 4)
onkoma, NY) for 1-2 hours. Diffusion destaining is performed with an aqueous acetic acid solution (8%, v / v).
Performed over 24-48 hours. As shown in FIG. 8, the gel
Judgment by the presence of bands that migrated as α1 (I) chain and a2 (I) chain
To remove human colonies from the cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline at 4-8 ° C.
This indicates that the gen was extracted. In addition, collagen α chain is obtained from the cell layer.
Acetic acid soluble material was also observed. Page on the gel / blue at the dispensed volume used
No other bands with 83 staining were found. These results are for human newborn
Foreskin fibroblasts (cell line HDF B116) are used to generate human collagen
It is possible to produce
Example 15:
Serum-free medium in the presence of the lysyl oxidase inhibitor β-aminopropionitrile
Cultured in Dulbecco's phosphate buffered saline to remove human collagen from the cell layer.
Of collagen by cell line-extracted HDF B117 human fibroblasts
Human neonatal foreskin fibroblasts (strain name HDF B117, Organogenesis Inc., Ca
nton, MA) in four plastic tissue culture flasks (T75, Cos
tar Company, Cambridge, MA) with serum-free and antibiotic-free growth media as described below.
5 × 10 cellsFivePiece / 75cmTwoAnd sowed. Serum-free growth medium
Including: Dulbecco's Modified Eagle Medium (High Glucose Formula, without L-Glutamine)
, BioWhittaker, Walkersville, MD) and Ham's nutrient mixture F-12 (L-glutamic acid).
No, Hyclone Labs, Logan, UT) at 3: 1 (v / v) and GlutaMAX-I
(Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M], hydrocortisone [0
. 4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), bovine insulin
[5 µg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3,3 ', 5-tri
Iodine-L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, M.
O), human transferrin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis)
, MO), ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, M.
O), ortho-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemica
l Co., St. Louis, MO), adenine [1.8 × 10-FourM] (Sigma Chemical Compa
ny, St. Louis, MO), selenic acid [5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemical Co., M
ilwaukee, WI), β-aminopropionitrile [50 μg / ml] (Aldrich Chem.
ical Co., Milwaukee, WI) and human recombinant epidermal growth factor [5 ng / m2.
l] (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY). Cells
37 ° C. ± 0 in an atmosphere containing 10.0% ± 0.5% carbon dioxide in the air.
. The growth medium was maintained in a 5 ° C. incubator. Growth medium every 3-4 days
Was replaced with fresh conditioned growth medium. After 18 days, the cells are highly confluent,
Densely
A packed layer formed at the bottom of the tissue culture flask. At this point, remove the growth medium and allow
The medium was replaced with a lagen production medium. This production medium is based on Dulbecco's modified Eagle medium (high
Glucose prescription, without L-glutamine, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD)
F-12 (without L-glutamine, Hyclone Labs., Logan, UT)
) And 3: 1 (v / v), and GlutaMAX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD)
) [4 × 10-3M], hydrocortisone [0.4 μg / ml] (Sigma Chemica
l Co., St. Louis, MO), bovine insulin [5 μg / ml] (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO), 3,3 ', 5-triiodo-L-thyronine [2 × 10-11
M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), human transferrin [5μ
g / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ethanolamine [1 × 1
0-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ortho-phosphoryl eta
Nolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), selenium
Acid [5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), β-amino
Propionitrile [50 μg / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)
, L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate (Wako Pure Chemicals Wako Pu
re Chemical Industries, Ltd., Richmond, VA) [50 μg / ml], L-Pro
Phosphorus [final concentration 1.93 × 10-3M] (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)
And glycine [final concentration 1.67 × 10-3M]. Collagen production
The medium was replaced with a freshly prepared collagen production medium every 3-4 days. 7 days later
A cooling cycle was performed to recover collagen in Dulbecco's phosphate buffered saline.
Aspirate the spent collagen production medium and add calcium to room temperature Dulbecco phosphate buffered saline.
With magnesium and magnesium (Catalog # 17-513Q, BioWhitta
Wash the cells for 1 minute with 5 ml of ker Inc., Walkersville, MD and remove any residual medium.
Removed. Dulbecco phosphate buffered saline was then aspirated. Collagen around cells
4-8 ° C Dulbecco phosphorus containing calcium and magnesium to solubilize
Acid buffered saline (Cat # 17-513Q, BioWhittaker Inc., Walkersvil)
le, MD) 5 ml was added to each flask, and the flask was left at 4-8 ° C. for 1 hour.
. One hour later, Dulbecco's phosphate buffered saline containing dissolved collagen from the cell layer
Aspirate, freeze at -20 ° C
Was. Add fresh collagen production medium to the flask containing the cells and allow
The temperature was maintained at 37.0 ° C ± 0.5 ° C in an atmosphere of 10.0% ± 0.5% carbon.
Returned to the incubator. Change the collagen production medium every 3-4 days,
After replacement, extract into Dulbecco's phosphate buffered saline weekly as described above
Was recovered from the collagen. Collagen recovery every time with Dulbecco phosphate buffered saline
Then, the newly prepared collagen production medium was added to the culture. Fifth collection
After that, aqueous acetic acid was used using a cell scraper (Costar Corporation, Cambridge, Mass.).
Cells were scraped into a solution (5 ml, 0.5 M; JT Baker Inc., Phllipsburg, NJ)
And The acetic acid containing the scraped cells was transferred to a centrifuge tube (17 × 76 mm ultracentrifuge tube,
Puntop, Thick, Polycarbonate Centrifuge Tube, Nalge Company, Rochester,
NY) to dissolve the acetate-soluble collagen in the cell layer. The scraped cell layer
Leave in acetic acid at 4-8 ° C overnight, after which the Beckman ultracentrifuge (model L8-70)
M, Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) at 20,000 g for 30 minutes.
And centrifuged. The supernatant of each sample was aspirated from the pellet and frozen at -20 ° C. Pele
The kit contains acetate-insoluble collagen, cell debris, and other insoluble materials.
This was also frozen at -20 ° C.
To verify collagen production by these cultures, solubilized collagen was
Containing Dulbecco's phosphate buffered saline and acetic acid supernatant
Lilamide gel electrophoresis was performed to identify the presence of collagen α-chain. Each cooling unit
Dulbecco's phosphate buffered saline containing solubilized collagen from cells and
Of acetic acid extract was taken out and sodium dodecyl sulfate (17.4%, w / v)
), Glycerol (6%, w / v), β-mercaptoethanol (1.5%, v / v)
v) for 3 minutes at 100 ° C., and then tris (0.025 M) / glyc
(0.192 M) / sodium dodecyl sulfate (0.1%, v / v) buffer system.
Polyacrylamide mini gel used (8%, w / v, Novex, San diego, CA)
At 125 V (constant voltage) for 2.25 hours. Laemmli, Natur
e, 227: 680-685 (1970). The gel was run in methanol / acetic acid / water (5: 1: 4).
With dissolved Page Blue 83 (0.1%, w / v, Fluka, Ronkonkoma, NY)
Stained for 1-2 hours. Diffusion and destaining are performed using an aqueous acetic acid solution (8%, v / v).
Performed over 48 hours. As shown in FIG. 9, the gel on the gel
Determined by the presence of bands migrating as α1 (I) and α2 (I) chains.
To remove human collagen from the cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline at 4-8 ° C.
This indicates that the application has been extracted. In addition, collagen α chain was obtained from the cell layer
It was also observed in acetic acid soluble substances. The dispensed volume used is Page Blue 8 on the gel
No other bands from the three stains were found. These results show that
The skin fibroblast cell line HDF B117 produces human collagen by this method.
It shows that you can live.
Example 16:
Serum-free medium in the presence of the lysyl oxidase inhibitor β-aminopropionitrile
In collagen and routinely remove collagen from the cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline
Collagen production by extracted cell line SAF012A sheep artery fibroblasts
Sheep artery fibroblasts (cell line name SAF012A, Organogenesis Inc., Ca
nton, MA) in four plastic tissue culture flasks (T75, Cos
tar Company, Cambridge, MA) with serum-free and antibiotic-free growth media as described below.
5 × 10 cellsFivePiece / 75cmTwoAnd sowed. Serum-free growth medium
Including: Dulbecco's Modified Eagle Medium (High Glucose Formula, without L-Glutamine)
, BioWhittaker, Walkersville, MD) and Ham's nutrient mixture F-12 (L-Gluta).
No Min, Hyclone Labs, Logan, UT) at 3: 1 (v / v), and GlutaMAX
-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M], hydrocortisone [
0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), bovine insulin
[5 µg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3,3 ', 5-
Liodo-L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chemical Co., St. Louis
, MO), human transferrin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Lo)
uis, MO), ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis
, MO), ortho-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO), Adenine
[1.8 × 10-FourM] (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) selenic acid [5
. 3 × 10-8M] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), β-aminopropyl
Onitrile [50 μg / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) and
Human recombinant epidermal growth factor [5 ng / ml] (Upstate Biotechnology Inc
., Lake Placid, NY). Cells are 10.0% ± 0.5% in air
In an incubator at a temperature of 37 ° C ± 0.5 ° C under an atmosphere containing carbon dioxide,
It was kept in growth medium. Replace growth medium with freshly prepared growth medium every 3-4 days
did. After 10 days, the cells are highly confluent, ie, a densely packed layer of cells is grown in tissue culture.
Formed at the bottom of the culture flask. At this point the growth medium is removed and the collagen production medium
Was replaced. The production medium was Dulbecco's modified Eagle medium (high glucose formulation, L-
Glutamine-free, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) and Ham's nutrient mix
F-12 (without L-glutamine, Hyclone Labs., Logan, UT) at 3: 1 (v /
v), and GlutaMAX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M]
, Hydrocortisone [0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO), bovine insulin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, M.
O), 3,3 ', 5-triiodo-L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO), human transferrin [5 μg / ml] (Sigma C
chemical Co., St. Louis, MO), ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO), ortho-phosphorylethanolamine [1 × 1
0-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), selenic acid [5.3 × 10-8M
] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), β-aminopropionitrile [5
0 μg / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), L-ascorbic acid
Phosphate ester magnesium salt n-hydrate (Wako Pure Chemical, Richmond, VA) [50 μg
/ Ml], L-proline [final concentration 1.93 × 10-3M] (Sigma Chemical Compan
y, St. Louis, MO) and glycine [final concentration 1.67 × 10-3M]
of. The collagen production medium is freshly prepared every 3 to 4 days.
Replaced. Seven days later, a cooling system for collecting collagen in Dulbecco's phosphate buffered saline
I ran a cycle. Aspirate the used collagen production medium and place at room temperature Dulbecco
Phosphate buffered saline with calcium and magnesium added (Catalog No. #
17-513Q, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) with 5 ml of cells for 1 minute
Washed to remove any residual media. Dulbecco phosphate buffered saline is then aspirated.
Was. Contains calcium and magnesium to dissolve pericellular collagen
4-8 ° C Dulbecco phosphate buffered saline (Catalog No. # 17-513Q, BioWhi
ttaker Inc., Walkersville, MD) Add 5 ml to each flask and add flask
Was left at 4-8 ° C. for 1 hour. One hour later, Du containing collagen dissolved from the cell layer
lbecco phosphate buffered saline was aspirated and frozen at -20 ° C. In a flask containing cells
Is a fresh collagen production medium, high concentration of carbon dioxide 10.0% ± 0.5%
The temperature was returned to the incubator maintained at a temperature of 37.0 ° C. ± 0.5 ° C. in the atmosphere described above. Ko
The lagen production medium is changed every 3 to 4 days, and after changing to the production medium,
Dulbecco phosphate buffered saline on days 7, 12, 21, 28, and 35
And collagen was recovered from the pericellular layer. Dulbecco in phosphate buffered saline
After collecting collagen each time, add a freshly prepared collagen production medium to the culture.
Was. After the fifth collection on day 35 in the production medium, the culture was terminated and the cell scraper
-(Costar Corporation, Cambridge, MA) using an aqueous solution of acetic acid (5 ml, 0.5 ml).
M; J.T. Baker Inc., Phllipsburg, NJ). Scraped
Acetic acid containing cells is collected in a centrifuge tube (16 × 76 mm ultracentrifuge tube, open top type, thick,
Polycarbonate centrifuge tube, Nalge Company, Rochester, NY)
Acetic acid soluble collagen was dissolved. The scraped cell layer is washed with acetic acid at 4-8 ° C.
Leave it to stand overnight and then use the Beckman ultracentrifuge (model L8-70M, Beckman Instrum
ents, Inc., Palo alto, CA) at 20,000 g for 30 minutes. Each sun
The supernatant of the pull was aspirated from the pellet and frozen at -20 ° C. Pellets are acetic acid insoluble
Contains Lagen, cell debris, and other insoluble materials, also at -20 ° C.
Frozen.
To verify collagen production by these cultures, solubilized collagen was
Containing Dulbecco's phosphate buffered saline and acetic acid supernatant
Lilamide gel electrophoresis was performed to identify the presence of collagen α-chain. Production medium
At 21 days, 28 days, and 35 days
Remove a certain amount of Dulbecco phosphate buffered saline and acetic acid extract from the cell layer, and
Sodium silsulfate (17.4%, w / v), glycerol (6%, w / v),
Denatured with β-mercaptoethanol (1.5%, v / v) at 100 ° C. for 3 minutes
And then tris (0.025M) / glycine (0.192M) / dodecyl sulfate
Polyacrylamide minigel using thorium (0.1%, w / v) buffer system
(8%, w / v) Novex, Sandiego, CA) at 125V (constant voltage) for 2.25 hours
Separated by electrophoresis. Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970). The gel is
Page Blue 83 (0.1%) dissolved in methanol / acetic acid / water (5: 1: 4)
, W / v, Fluka, Ronkonkoma, NY) for 1-2 hours. Diffusion destaining is acetic acid aqueous solution
Liquid (8%, v / v) for 24 to 48 hours. As shown in FIG.
Gel migrates as collagen α1 (I) and α2 (I) chains on the gel.
Dulbecco's phosphate buffered saline at 4-8 ° C, as determined by the presence of the
Indicates that human collagen was extracted from the cell layer. Also Collage
Α-chain was also observed in acetic acid-soluble substances obtained from the cell layer. With the used dispensing volume
No other bands on the gel due to Page Blue 83 staining were found.
The above results indicate that sheep arterial fibroblast cell line SAF012A was used in this method.
Shows that human collagen can be produced.
Example 17:
Serum-free medium in the presence of the lysyl oxidase inhibitor β-aminopropionitrile
Dulbecco phosphate-buffered saline without calcium or magnesium cultured in
Cell line HDF B1 with routine extraction of human collagen from cell layer by water
Collagen production by 19 human fibroblasts
Human neonatal foreskin fibroblasts (strain name HDF B119, Organogenesis Inc., Ca
nton, MA) in four plastic tissue culture flasks (T75, Cos
tar Company, Cambridge, MA) with serum-free and antibiotic-free growth media as described below.
7 × 10 cellsFivePiece / 75cmTwoAnd sowed. Serum-free growth medium
Including: Dulbecco's Modified Eagle Medium (High Glucose Formula, L-Glutamine)
None, Bio-Whittaker, Walkersville, MD) and Ham's nutrient mixture F-12 (L-G)
Without glutamine, Hyclone Labs, Logan, UT) at 3: 1 (v / v) and Glut
aMAX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M], Hydrocortizo
[0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Bovine Inci
Furin [5 µg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3, 3 ', 5
Triiodo-L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chemical Co., St. Lo.
uis, MO), human transferrin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St.
. Louis, MO), ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. L
ouis, MO), ortho-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO), adenine [1.8 × 10-FourM] (Sigma Chemica
l Company, St. Louis, MO), selenic acid [5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemical
Co., Milwaukee, WI), β-aminopropionitrile [50 μg / ml] (Aldri
ch Chemical Co., Milwaukee, Wis.) and human recombinant epidermal growth factor [5
ng / ml] (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY)
. Cells were grown at a temperature of 3% in an atmosphere containing 10.0% ± 0.5% carbon dioxide in air.
The growth medium was kept in an incubator at 7 ° C ± 0.5 ° C. Growth medium is 3 ~
Replaced with fresh conditioned growth medium every 4 days. 13 days later, cells are highly confluent and immediately
A densely packed layer of cells formed at the bottom of the tissue culture flask. Proliferate at this point
The medium was removed and replaced with a collagen production medium. The production medium is Dulbecco's modified Ea
gle medium (high glucose formulation, no L-glutamine, BioWhittaker Inc., Walker
sville, MD) and Ham's nutrient mixture F-12 (without L-glutamine, Hyclone Labs.
, Logan, UT) at 3: 1 (v / v) and GlutaMAX-I (Gibco BRL, Gainthe
rsburg, MD) [4 × 10-3M], hydrocortisone [0.4 μg / ml] (Sig
ma Chemical Co., St. Louis, MO), bovine insulin [5 μg / ml] (Sigm
a Chemical Co., St. Louis, MO), 3,3 ', 5-triiodo-L-thyronine
[2 × 10-11M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), human transfer
Phosphorus [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ethanol
[1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Ortho-phos
Folylethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO), selenic acid [5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI),
β-aminopropionitrile [50 μg / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwa
ukee, WI), L-ascorbic acid phosphate magnesium salt n-hydrate (Wako
Pure Chemicals, Richmond, VA) [50 μg / ml], L-proline [final concentration 1.93 × 1
0-3M] (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO and glycine [final concentration 1
. 67 × 10-3M] was added. The collagen production medium is freshly prepared every 3-4 days.
The medium was replaced with the produced collagen production medium. 15 days later, calcium or magnesium
Cooling cycle to recover collagen without Dulbecco's phosphate buffered saline
Was executed. Aspirate the spent collagen production medium and remove calcium and magnesium
Room temperature Dulbecco phosphate buffered saline wash (Cat. # 17-51)
(2F, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) 5 ml of cells were washed for 1 minute.
All distillation media was removed. Dulbecco Li free of calcium or magnesium
The phosphate buffered saline was then aspirated. To dissolve collagen around cells,
4-8 ° C Dulbecco phosphate buffered saline without calcium or magnesium (
Catalog # 17-512F, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) 5m
was added to each flask and the flasks were left at 4-8 ° C for 1 hour. One hour later,
Contains collagen dissolved from the cell layer and does not contain calcium or magnesium
Dulbecco phosphate buffered saline was aspirated and frozen at -20 ° C. Flask containing cells
, A fresh collagen production medium was added, and the atmospheric carbon dioxide 10.0% ± 0.5
The temperature was returned to the incubator maintained at a temperature of 37.0 ° C. ± 0.5 ° C. in an atmosphere of 10%.
The collagen production medium is changed every 3 to 4 days, and after replacing with the production medium, as described above.
Weekly to Dulbecco's phosphate-buffered saline without calcium or magnesium
After extraction, collagen was recovered from the pericellular layer for 5 weeks. Calcium and
Recovers collagen every time with Dulbecco's phosphate-buffered saline without magnesium
Thereafter, a freshly prepared collagen production medium was added to the culture. Of the fifth collection
Then, acetic acid aqueous solution was used using a cell scraper (Costar Corporation, Cambridge, Mass.).
Cells (5 ml, 0.5 M; JT Baker Inc., Phllipsburg, NJ)
did. Acetic acid containing scraped cells is centrifuged
Tube (16 x 76 mm ultracentrifuge tube, open top type, thick, polycarbonate made
Cardiac tubing, Nalge Company, Rochester, NY) and cell-layer acetic acid-soluble collagen
Was dissolved. The scraped cell layer is left overnight in acetic acid at 4-8 ° C.
Beckman high-speed centrifuge (model J2-21, Beckman Inst.
ruments, Inc., Palo alto, CA) at 20,000 g for 30 minutes. Each sump
The supernatant was aspirated from the pellet and frozen at -20 ° C. Pellets are acetic acid-insoluble cola
Gen, cell debris, and other insoluble materials, also at -20 ° C.
Frozen.
In order to verify collagen production by these cultures,
Dulbecco phosphate buffered saline without calcium or magnesium and on acetic acid
After subjecting the lysate to sodium dodecyl sulfate / polyacrylamide gel electrophoresis,
The presence of the α-chain was identified. Cal containing dissolved collagen from each cooling cycle
Dulbecco's phosphate-buffered saline without calcium or magnesium, and sodium hydroxide
A certain amount of the acetic acid extract from the cell layer neutralized with lium was removed, and sodium dodecyl sulfate was removed.
Lium (17.4%, w / v), glycerol (6%, w / v) and β-merca
After denaturation with peptethanol (1.5%, v / v) at 100 ° C. for 3 minutes,
Tris (0.025M) / glycine (0.192M) / sodium dodecyl sulfate
(0.1%, w / v) polyacrylamide mini gel (8%, w / v)
w / v, Novex, San diego, CA) at 125 V (constant voltage) for 2.25 hours
Separated. Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970). Gel is Methanol
Page 83 (0.1%, w / v) diluted in toluene / acetic acid / water (5: 1: 4)
, Fluka, Ronkonkoma, NY) for 1-2 hours. Diffusion and destaining is performed with an aqueous acetic acid solution (8%
, V / v) for 24 to 48 hours. Collagen α1 (I) chain on gel
And 4 to 4 as determined by the presence of a band that migrated as the α2 (I) chain.
Extracted human collagen from cell layer with Dulbecco's phosphate buffered saline at 8 ° C
Are shown. In addition, collagen α chain is converted into acetic acid-soluble substance obtained from the cell layer.
Was also observed. The dispensed volume used was the page Blue 83 stain on the gel.
No other bands were found. These results indicate that calcium or magnesium
Β-Aminopropionit in Dulbecco's phosphate-buffered saline without serum
This shows that collagen deposited in the cell layer could be dissolved in the presence of rill.
Example 18:
Serum-free medium in the presence of the lysyl oxidase inhibitor β-aminopropionitrile
Dulbecco phosphate-buffered saline without calcium or magnesium cultured in
Cell line HDF B1 with routine extraction of human collagen from cell layer by water
Collagen production by 19 human fibroblasts
Human neonatal foreskin fibroblasts (strain name HDF B119, Organogenesis Inc., Ca
nton, MA) in four plastic tissue culture flasks (T75, Cos
tar Company, Cambridge, MA) with serum-free and antibiotic-free growth media as described below.
7 × 10 cellsFivePiece / 75cmTwoAnd sowed. Serum-free growth medium
Including: Dulbecco's Modified Eagle Medium (High Glucose Formula, without L-Glutamine)
, BioWhittaker, Walkersville, MD) and Ham's nutrient mixture F-12 (L-Gluta).
No Min, Hyclone Labs, Logan, UT) at 3: 1 (v / v), and GlutaMAX
-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M], hydrocortisone [
0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), bovine insulin
[5 µg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3,3 ', 5-
Liodo-L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chemical Co., St. Louis
, MO), human transferrin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Lo)
uis, MO), ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis
, MO), ortho-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO), adenine [1.8 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co.
mpany, St .; Louis, MO), selenic acid [5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemical Co.
, Milwaukee, WI), β-aminopropionitrile [50 μg / ml] (Aldrich C
chemical Co., Milwaukee, WI) and human recombinant epidermal growth factor [5 ng
/ Ml] (Upstate Biotechnology Inc., LakePlacid, NY). Fine
The vesicles were heated to 37 ° C. in an atmosphere containing 10.0% ± 0.5% carbon dioxide in the air.
± 0.5 ℃
This growth medium was maintained in the incubator. Growth medium is freshly prepared every 3-4 days
The growth medium was replaced. After 13 days, the cells are highly confluent, ie
A packed layer formed at the bottom of the tissue culture flask. At this point, remove the growth medium and allow
The medium was replaced with a lagen production medium. The production medium is Dulbecco's modified Eagle medium (high glue medium).
Course formula, without L-glutamine, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) and Ha
m of nutrient mixture F-12 (without L-glutamine, Hyclone Labs., Logan, UT).
3: 1 (v / v), GlutaMAX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4
× 10-3M], hydrocortisone [0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co.
, St. Louis, MO), bovine insulin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co.
, St. Louis, MO), 3,3 ', 5-triiodo-L-thyronine [2 × 10-11
M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), human transferrin [5 μg
/ Ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ethanolamine [1 x 10- Four
M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ortho-phosphoryl ethanol
Luamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), selenic acid [
5.3 × 10-8M] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), β-aminopro
Pionitrile [50 μg / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), L
-Magnesium ascorbic acid phosphate n-hydrate (Wako Pure Chemical, Richmond
, VA) [50 μg / ml], L-proline [final concentration 1.93 × 10-3M] (Sigma
Chemical Company, St. Louis, MO) and glycine [final concentration 1.67 × 10-3
M (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)]. Collagen production medium
The ground was replaced with a freshly prepared collagen production medium every 3-4 days. 15 days later
Dulbecco phosphate-buffered saline without calcium or magnesium
A cooling cycle to recover the gen was performed. Aspirate used collagen production medium
Dulbecco's phosphate buffered saline without calcium or magnesium at room temperature (
Catalog number # 17-516B; BioWhittaker Inc., Walkersville, MD) 5 ml
The cells were washed with for 1 minute to remove any residual media. Calcium or magnesi
Dulbecco's phosphate buffered saline without um was then aspirated. Collar around cells
4-8 ° C containing no calcium or magnesium to dissolve
lbecco phosphate buffered saline (Cataro
No. # 17-516B, BioWhittaker Inc., Walkersville, MD)
And left the flask at 4-8 ° C. for 1 hour. 1 hour later,
Dulbecco with dissolved collagen and no calcium or magnesium
The phosphate buffered saline was aspirated and frozen at -20 ° C. Fresh in flask containing cells
A medium for collagen production, and adjust the concentration of carbon dioxide in the air to 10.0% ± 0.5%.
It was returned to the incubator maintained at a temperature of 37.0 ° C ± 0.5 ° C under an atmosphere. Kora
The gen-producing medium is changed every 3 to 4 days, and after changing to the production medium, as described above,
Extracted weekly into Dulbecco's phosphate-buffered saline without calcium or magnesium
The collagen was recovered from the pericellular layer for 5 weeks. Calcium or mug
Collagen recovery every time with Dulbecco's phosphate buffered saline without cesium
A freshly prepared collagen production medium was added to the culture. After the fifth collection,
Acetic acid aqueous solution (5) using a cell scraper (Costar Corporation, Cambridge, Mass.).
ml, 0.5M; J.T. Baker Inc., Phllipsburg, NJ).
The acetic acid containing the scraped cells was collected in a centrifuge tube (167 x 76 mm ultracentrifuge tube, open
Type, thick, polycarbonate centrifuge tube, Nalge Company, Rochester, NY)
Then, the acetic acid-soluble collagen in the cell layer was dissolved. 4-8 scraped cell layers
Acetic acid at room temperature overnight, and then use a 40-type rotor to increase the Beckman height.
20, using a high speed centrifuge (model J2-21, Beckman Instruments, Inc., Palo alto, CA)
Centrifugation was performed at 000 g for 30 minutes. Aspirate the supernatant of each sample from the pellet at -20 ° C
Frozen. The pellet contains acetate-insoluble collagen, cell debris, and other insoluble
Containing material, which was also frozen at -20 ° C.
In order to verify collagen production by these cultures,
Dulbecco phosphate buffered saline without calcium or magnesium and on acetic acid
After subjecting the lysate to sodium dodecyl sulfate / polyacrylamide gel electrophoresis,
The presence of the α-chain was identified. Cal containing dissolved collagen from each cooling cycle
Dulbecco's phosphate-buffered saline without calcium or magnesium, and sodium hydroxide
A certain amount of the acetic acid extract from the cell layer neutralized with lium was removed, and sodium dodecyl sulfate was removed.
Lium (17.4%, w / v), glycerol (6%, w / v), β-mercapto
After denaturation with ethanol (1.5%, v / v) at 100 ° C for 3 minutes,
Squirrel (0.025M) / glycine (0.192M) / sodium dodecyl sulfate (
Polyacrylamide minigel (8%, w / v) buffer system (0.1%, v / v)
/ V, Novex, Sandiego, CA) for electrophoresis at 125 V (constant voltage) for 2.25 hours
More separated. Laemmli, Nature, 227: 680-685 (1970). Gel is methanol
Blue 83 (0.1%, w / v, F) dissolved in acetic acid / acetic acid / water (5: 1: 4)
luka, Ronkonkoma, NY) for 1-2 hours. Diffusion destaining is performed with an aqueous acetic acid solution (8%,
v / v) for 24 to 48 hours. Collagen α1 (I) chains on the gel
And 4-8 as determined by the presence of a band that migrated as the α2 (I) chain.
Cells in Dulbecco's phosphate-buffered saline without calcium or magnesium
This indicates that human collagen was extracted from the layer. Also, collagen α chain
Was also observed in acetic acid soluble material obtained from the cell layer. Gel at the dispensed volume used
No other bands from the upper Page Blue 83 stain were found. More than
The results were obtained in Dulbecco's phosphate buffered saline without calcium or magnesium.
can dissolve collagen deposited in the cell layer in the presence of β-aminopropionitrile
It shows that.
Example 19:
Serum-free medium in the presence of the lysyl oxidase inhibitor β-aminopropionitrile
Collagen from cell layer with 0.3M sodium chloride solution cultured in
Of collagen by cell line HDF B119 human fibroblasts routinely extracted from
Production
Human neonatal foreskin fibroblasts (cell line name HDF B119, Organogenesis Inc.
, Canton, MA) in four plastic tissue culture flasks (T75).
, Costar Company, Cambridge, MA) as described below.
7 × 10 cellsFivePiece / 75cmTwoAnd sowed. Serum-free growth medium
Includes: Dulbecco's Modified Eagle Medium (High Glucose Formula, L-Glutamine)
None, Bio-Whittaker, Walkersville, MD) and Ham's nutrient mixture F-12 (L-G)
3: 1 (v / v) without glutamine, Hyclone Labs, Logan, UT)
v), and GlutaMAX-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M]
, Hydrocortisone [0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO), bovine insulin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, M.
O), 3,3 ', 5-triiodo-L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO), human transferrin [5 μg / ml] (Sigma C
chemical Co., St. Louis, MO), ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chem
ical Co., St. Louis, MO), ortho-phosphorylethanolamine [1 × 1
0-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), adenine [1.8 × 10-FourM
] (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), selenic acid [5.3 x 10-8M] (
Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), β-aminopropionitrile [50μ
g / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) and human genetic modification
Epidermal growth factor [5 ng / ml] (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY
) Added. Cells contain 10.0% ± 0.5% carbon dioxide in air
This growth medium was maintained in an incubator at a temperature of 37 ° C. ± 0.5 ° C. under an atmosphere.
. The growth medium was replaced with a freshly prepared growth medium every 3 to 4 days. 13 days later, cells
Is highly confluent, forming a densely packed layer of cells at the bottom of the tissue culture flask.
Was. At this point, the growth medium was removed and replaced with a collagen production medium. The production medium is
, Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose formulation, no L-glutamine, BioWhi
ttaker Inc., Walkersville, MD) and Ham's nutrient mixture F-12 (L-glutamic)
No, Hyclone Labs., Logan, UT) at 3: 1 (v / v) and GlutaMAX
-I (Gibco BRL, Gainthersburg, MD) [4 × 10-3M], hydrocortisone [
0.4 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), bovine insulin
[5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 3,3 ′, 5-triene
Iodine-L-thyronine [2 × 10-11M] (Sigma Chemical Co., St. Louis, M.
O), human transferrin [5 μg / ml] (Sigma Chemical Co., St. Louis)
, MO), ethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemical Co., St. Louis, M.
O), ortho-phosphorylethanolamine [1 × 10-FourM] (Sigma Chemica
l Co., St. Louis, MO), selenic acid [5.3 × 10-8M]
(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI), β-aminopropionitrile [50
μg / ml] (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.), L-ascorbic acid
Acid magnesium ester n-hydrate (Wako Pure Chemical, Richmond, VA) [50 μg /
ml], L-proline [final concentration 1.93 × 10-3M] (Sigma Chemical Company
, St. Louis, MO) and glycine [final concentration 1.67 × 10-3M] (Sigma Chemica
l Company, St. Louis, MO). Collagen production medium every 3-4 days
The medium was replaced with a freshly prepared collagen production medium. 15 days later, sodium chloride solution
A cooling cycle to recover the collagen in the liquid was performed. Used collagen production
The medium is aspirated and room temperature sodium chloride solution (0.3M; Mallinckrodt Specialty)
(Chemicals, Chesterfield, MO) Wash cells with 5 ml for 1 minute to remove residual medium.
All were removed. The sodium chloride solution was subsequently aspirated. Collagen around cells
For solubilization, sodium chloride solution at 4-8 ° C (0.3 M; Mallinckrodt)
Specialty Chemicals, Chesterfield, MO) Add 5 ml to each flask,
The flask was left at 4-8 ° C for 1 hour. 1 hour later, collagen dissolved from cell layer
The sodium chloride solution containing was aspirated and frozen at -20 ° C. Flask containing cells
, A fresh collagen production medium was added, and the atmospheric carbon dioxide 10.0% ± 0.5
The temperature was returned to the incubator maintained at a temperature of 37.0 ° C. ± 0.5 ° C. in an atmosphere of 10%.
The collagen production medium is changed every 3 to 4 days, and after replacing with the production medium, as described above.
Weekly by extracting into sodium chloride solution from the pericellular layer for 5 weeks
Collagen was recovered. Do you always collect collagen with sodium chloride solution?
A newly prepared collagen production medium was added to the culture. After the fifth collection,
Acetic acid aqueous solution (Costar Corporation, Cambridge, MA) using a cell scraper
5 ml, 0.5 M; J.T. Baker Inc., Phllipsburg, NJ)
. The acetic acid containing the scraped cells was collected in a centrifuge tube (16 x 76 mm ultracentrifuge tube, open
Type, thick, polycarbonate centrifuge tube, Nalge Company, Rochester, NY)
Then, the acetic acid-soluble collagen in the cell layer was dissolved. 4-8 scraped cell layers
Acetic acid at room temperature overnight, and then use a 40-type rotor to increase the Beckman height.
20, using a high speed centrifuge (model J2-21, Beckman Instruments, Inc., Palo alto, CA)
Centrifuged at 000 g for 30 minutes. Supernatant of each sample
Was aspirated from the pellet and frozen at -20 ° C. The pellet is acetate-insoluble collagen,
Contains cell debris and other insoluble material, which was also frozen at -20 ° C
.
To verify collagen production by such culture, solubilized collagen
Sodium chloride solution containing acetic acid and acetic acid supernatant
Amide gel electrophoresis was performed to identify the presence of collagen α chain. Each cooling cycle
Sodium chloride solution from sodium chloride and acetic acid from the cell layer neutralized with sodium hydroxide
A certain amount of the extract was taken out, and sodium dodecyl sulfate (17.4%, w / v) was added.
Lycerol (6%, w / v), β-mercaptoethanol (1.5%, v / v)
After denaturing at 100 ° C. for 3 minutes, tris (0.025 M) / glycine (0
. 192M) / sodium dodecyl sulfate (0.1%, w / v) buffer system was used.
12 on polyacrylamide minigel (8%, w / v, Novex, San diego, CA)
Separation was performed by electrophoresis at 5 V (constant voltage) for 2.25 hours. Laemmli, Nature, 227
: 680-685 (1970). The gel was diluted in methanol / acetic acid / water (5: 1: 4)
Page Blue 83 (0.1%, w / v, Fluka, Ronkonkoma, NY) at 1-2
Staining. Diffusion destaining is performed with an aqueous acetic acid solution (8%, v / v) for 24 to 48 hours.
became. The gel migrated as collagen α1 (I) and α2 (I) chains on the gel
Cells at 4-8 ° C. sodium chloride solution as determined by the presence of
The gel revealed that human collagen was extracted from the layer. Also,
Lagen α-chain was also observed in acetic acid-soluble substances obtained from the cell layer. Minutes used
No other bands on the gel due to Page Blue 83 staining were found at the injection volume
Was. The above results indicate that β-aminopropyl
This indicates that collagen deposited in the cell layer could be dissolved in the presence of onitrile.
You.
The above invention is described in some detail by way of illustration and example, for purposes of clarity of understanding.
Although described in detail, any changes and modifications may be made within the scope of the appended claims.
It should be clear.