JPH10267929A - 簡易測定方法及びそれに使用する反応板並びに試薬キ ット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ［目的］ 試料を希釈した希釈試料を用いて反応板上で
定性判定する際、希釈用アンプル等を不要にし、希釈の
操作を簡便とすること。 ［構成］ 反応板上に希釈部を形成しておき、目盛付き
ピペットで採取した試料を希釈部で希釈したものを、反
応板上の反応部に分取して免疫凝集試薬で定性判定若し
くは半定量測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は免疫凝集試薬を用いた簡
易測定方法及びそれに使用する反応板並びに試薬キット
にかかるものである。

【０００２】

【従来の技術】ラテックス粒子に抗体、熱変性ガンマグ
ロブリン、抗原等を感作して得られるラテックス試薬は
スライド板上で被験試料と反応させると、対応する抗
原、リューマチ因子、抗体等と夫々抗原抗体反応が起こ
り、ラテックス粒子が凝集して、肉眼で凝集の有無の判
定が可能になる。

【０００３】このラテックススライド試薬は２〜３分で
結果が得られることから広く普及している。

【０００４】しかし、被験試料中に対応する抗原等が大
過剰に存在する場合は、地帯現象により偽陰性の原因と
なるため予め試料を希釈する必要がある。

【０００５】また、＋か−かの定性反応であるため試料
中の目的物質の濃度を知るためには、ラテックス試薬の
検出感度付近まで試料を希釈する必要がある。

【０００６】たとえば、尿中エストロゲンの測定の場
合、尿を５０倍、１００倍、２００倍に希釈用アンプル
を用いて希釈し、各希釈尿１滴に抗エストリオール抗体
感作ラテックスを加えてスライド板上でよく攪拌し、次
いでエストリオール感作ラテックスを１滴加えて更に２
分間緩やかに攪拌して反応させ、凝集の有無を目視によ
り判定し、半定量値を得ている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、従来は試料を
希釈するために、希釈用試験管或いは希釈液を封入した
アンプル等を用いる必要があり、５０回用の測定キット
では１５０本の希釈用アンプル等をセットとして組み込
むため希釈操作が繁雑であるばかりでなく、キット自体
が大きくなり、且つコストも高いものとなっていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、上述の従来の
課題を解決するためになしたもので、第一の発明は、試
料を希釈し、しかる後希釈試料を反応板上で免疫凝集試
薬と反応させ、粒子の凝集の有無を指標として判定する
測定方法において、反応板の試料希釈部で試料を希釈
し、次いで試希釈試料を前記反応板の反応部に加えるこ
とを特徴とする簡易測定方法にかかるものである。

【０００９】第二の発明は、試料希釈部と反応部を有す
ることを特徴とする反応板にかかるものである。

【００１０】第三の発明は、試料希釈部を有する反応板
と目盛付きピペットと希釈液と免疫凝集試薬とからなる
簡易測定試薬キットにかかるものである。

【００１１】本発明の測定対象となる試料としては、
尿、血清、血漿、血液、涙液、唾液、鼻汁、腹水、頸管
粘液等が用いられる。

【００１２】試料の希釈に用いる希釈液としては生理食
塩水、リン酸、トリス、グリシン等の各緩衝液を用いる
ことができ、ｐＨは測定対象物質の安定性を考慮して酸
性からアルカリ性まで任意に選択することができる。

【００１３】免疫凝集試薬としては凝集反応又は凝集阻
止反応のいずれの反応原理を用いることができ、担体粒
子としてはラテックス、ゼラチン、菌体、リポソーム等
を用いたものが使用可能である。

【００１４】試料の希釈に使用する反応板は、円又は楕
円形のサークル又は凹状の反応部の近傍に試料希釈部を
少なくとも１個有するものを用いる。

【００１５】試料希釈部はサークル、凹部、或いは希釈
用キュベットと該キュベットをセットするための保持部
として反応板に形成し、必要に応じて適数設ける。

【００１６】反応板の素材としてはガラス、プラスチッ
ク、コート紙、金属等が用いられる。

【００１７】希釈用のサークルは反応板上に反応部と同
様の方法で塗料等により円形又は楕円形のリングを形成
する。

【００１８】希釈用の凹部は反応板の成型時に円形若し
くは楕円形に形成してもよく、コート紙、金属等ではプ
レスにより形成することができる。

【００１９】更に試料希釈部としては、反応板と一体に
設ける場合の他、希釈用キュベットを用いることができ
るように、希釈用キュベットをセットするための保持部
を反応板に形成してもよい。

【００２０】希釈用キュベットをセットする保持部は
穴、切欠き、又は切込折曲げ部のいずれかでよい。

【００２１】穴の形状は円形でよいが、希釈用キュベッ
トを保持し得る大きさであれば、形状は限定されない。

【００２２】切欠き部の形状はＵ字形、長円が好ましい
が、希釈用キュベットと嵌合し得る形状であればよい。

【００２３】切込折曲げ部の形状は、＋状、Ｖ状、Ｕ状
のいずれかでよく、使用時は反応板の裏側に折曲げて、
形成される穴にキュベットを嵌入して使用する。

【００２４】該希釈用キュベットは希釈液の量を多量に
して高希釈倍する際に便利である。

【００２５】以上において、サークル、凹部、キュベッ
トの大きさは試料の希釈倍数に応じて適宜の大きさとす
ることができる。

【００２６】また洗浄部も上記希釈部と同様に形成する
ことができる。

【００２７】被験試料の採取に使用するピペットは数μ
ｌから数十μｌを採取することのできる微量ピペットが
好ましく、毛細管、自動ピペット等も使用できるが、

【図２】に示した目盛付ピペットを使用するのが便利で
ある。

【００２８】該目盛付きピペットは、両端を開口した内
径１ｍｍφ前後の耐熱性細管の一端側に目盛を設け、且
つ他端側に該細管よりも若干太径で少なくとも試料の採
取・添加容量以上の内容量を有し且つ手指の押圧力によ
り容易に変形可能な熱収縮性の可撓性チューブを嵌装す
ると共に熱収縮により固定し、該可撓性チューブの他端
を両側から平たく加熱圧着により封じ、且つ該可撓性チ
ューブの封端部と前記熱収縮固定部との長さを、手指で
挟んだとき前記封端部に手指が触れない長さとしてあ
る。

【００２９】

【作用】例えば、妊娠後期の妊婦の尿を

【図２】に示す微量ピペット７により、

【図１】に示す反応板６の希釈用サークル５に５μｌ採
取し、希釈液を該希釈サークル５に４５μｌ加えて、該
反応板６をゆり動かして混和し、１０倍希釈の希釈試料
を調製する。

【００３０】該希釈試料５μｌ、２．５μｌ、１．２５
μｌを反応用サークル２、３、４に夫々とり、次いで抗
エストリオール抗体感作ラテックスを１滴加えて、該反
応板６をゆり動かして混和させ、更にエストリオール−
ＯＡコンジュゲート感作ラテックスを１滴加えて、反応
板６をゆり動かして２分間反応させる。

【００３１】抗エストリオール抗体感作ラテックスは、
原尿中エストリオール２０μｇ／ｍｌの１０倍希釈検体
１．２５μｌで抗エストリオール抗体が飽和して、凝集
反応しなくなるよう感度設定してある。

【００３２】すなわち、２０μｇ／ｍｌの１０倍希釈検
体のエストリオール濃度は２μｇ／ｍｌとなり、その
１．２５μｌ中のエストリオール量は２．５ｎｇとな
る。

【００３３】従って、反応サークル中に２．５ｎｇのエ
ストリオールが存在すれば、抗体感作ラテックスの抗エ
ストリオール抗体が飽和されるため、次に抗原感作ラテ
ックスを添加しても、ラテックスの凝集は起こらず陽性
と判定される。。

【００３４】反応サークル中のエストリオールが２．５
ｎｇ未満の場合は、抗体感作ラテックス表面の抗エスト
リオール抗体が完全には飽和されないため、次に加えら
れる抗原感作ラテックスと凝集反応して凝集像を呈し、
陰性の判定結果となる。

【００３５】

【表１】 に示すように、この凝集像が、１０倍希釈尿検体５μｌ
を加えたサークルにおいて認められた場合（判定：陰
性）は、原尿中のエストリオール濃度は５μｇ／ｍｌ未
満と判定される。

【００３６】又、１０倍希釈尿検体５μｌでは凝集像が
認められないが（判定：陽性）、２．５μｌで凝集像が
認められた場合（判定：陰性）は、原尿中のエストリオ
ール濃度は５μｇ／ｍｌ以上で１０μｇ／ｍｌ未満と半
定量される。

【００３７】更に、１０倍希釈尿検体５μｌ及び２．５
μｌでは凝集像が認められないが（判定：陽性）、１．
２５μｌで凝集像が認められた場合（判定：陰性）は、
原尿中のエストリオール濃度は１０μｇ／ｍｌ以上で２
０μｇ／ｍｌ未満と半定量される。

【００３８】そして、１０倍希釈尿検体５、２．５、
１．２５μｌのすべてのサークルで凝集像が認められな
い場合（判定：陽性）は、原尿中のエストリオール濃度
は２０μｇ／ｍｌ以上と半定量される。

【００３９】このように、原尿を１０倍希釈したものを
５、２．５、１．２５μｌそれぞれ反応用サークルに採
取して、抗体感作ラテックスと抗原感作ラテックスを加
えて反応させるだけで、容易に半定量測定が行える。

【００４０】

【実施例】

実施例１

【図１】は本発明の反応板の一例を示したもので、上面
が黒色で非吸水性コーティング処理をした台紙１に楕円
形の反応用サークル２、３、４を３個印刷により形成
し、該反応用サークル２、３、４の上方に楕円形の希釈
用サークル５を１個同様に印刷により形成して反応板６
を作成した。

【００４１】実施例２

【図２】は本発明に使用する微量ピペット７の一例であ
り、両端を開口した内径１ｍｍφ前後の耐熱性細管８の
一端部に５μｌ、２．５μｌ、１．２５μｌ相当の目盛
９、１０、１１を順次三カ所設け、且つ他端側に該細管
よりも若干太径で少なくとも試料の採取・添加容量以上
の内容量を有し且つ手指の指圧力により容易に変形可能
な熱収縮性の可撓性チューブ１２を嵌装すると共に熱収
縮により固定し、該可撓性チューブ１２の他端を両側か
ら平たく加熱圧着により封じて封端部１３を形成し、且
つ該可撓性チューブ１２の封端部１３と前記熱収縮固定
部１４との長さを手指で挟んだとき前記封端部１３に手
指が触れない長さとしてある。

【００４２】実施例３ ０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ８．２に牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を０．１％、ＮａＣｌを０．９％加えて希釈
液とする。

【００４３】実施例４ 市販の粒子径０．２μｍのポリスチレンラテックス粒子
に、ウサギ抗エストリオール抗体を常法により物理吸着
させて感作する。０．１％ＢＳＡを含む０．２Ｍグリシ
ン−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）により浮遊して、抗
体感作ラテックス試薬を得た。

【００４４】実施例５ エランガー（Ｂ．Ｆ．ＥＲＬＡＮＧＥＲ）らの方法
（Ｊ．Ｂ．Ｃ．２３４（５）、１０９０、１９５９）に
準じてエストリオール−１６−グルクロナイドと卵白ア
ルブミンのコンジュゲートを調製した。

【００４５】このコンジュゲートを市販の０．８μｍの
ポリスチレンラテックス粒子に常法により物理吸着さ
せ、０．１％ＢＳＡを含む０．２Ｍグリシン−ＮａＣｌ
緩衝液（ｐＨ８．２）に浮遊して、抗原感作ラテックス
試薬を得た。

【００４６】実施例６ 実施例３の希釈液４５μｌを反応板６の希釈用サークル
５にとり、次いで尿を微量ピペット７により５μｌの目
盛９まで吸い取り、前記希釈用サークル５に加えて、反
応板６をゆり動かして混和し、１０倍希釈尿を調製す
る。

【００４７】前記微量ピペット７を精製水で先端内部を
洗うか又は新しくして、希釈用サークル５内の希釈試料
８．７５μｌを目盛１１まで吸い上げ、反応用サークル
４、３、２にそれぞれ１．２５μｌ、２．５μｌ、５μ
ｌ順次目盛１１、１０、９に合わせるようにして押出
す。次いで、実施例４の抗エストリオール抗体感作ラテ
ックス試薬を各サークル４、３、２に１滴ずつ滴下し、
反応板６を揺り動かして混和し、更に実施例５のエスト
リオール感作ラテックスをそれぞれ一滴加えて混和し、
２分間反応させた後、目視により凝集像の有無を判定し
た。

【００４８】実施例７

【図３】は本発明の反応板の他の例であり、黒色の合成
樹脂製の平板１５に３つの反応用サークル２、３、４及
び１つの希釈用サークル５を印刷により設け、更に該希
釈用サークル５の隣に洗浄用サークル１７を印刷により
設けて反応板１６を形成した。

【００４９】実施例８ 実施例６と同様に希釈液を希釈用サークル５と洗浄用サ
ークル１７の両方に４５μｌずつ滴下し、微量ピペット
７で尿を５μｌ採取して前記希釈用サークル５に全量押
出して加え、次いで洗浄用サークル１７内の希釈液を該
微量ピペットで数回吸排して細管８内部を洗浄する。

【００５０】以下、実施例６と同様に操作することによ
り、尿中のエストリオール濃度を半定量することができ
る。抗体感作ラテックス１滴のエストリオール中和量を
２．５ｎｇ相当に設定しておくことにより、

【表１】に示すように、１０倍希釈試料１．２５μｌで
凝集しない場合（判定：陽性）は原尿中に２０μｇ／ｍ
ｌ以上のエストロゲンが含まれていることになり、２．
５μｌで非凝集且つ１．２５μｌで凝集の場合は、１０
μｇ／ｍｌ以上で２０μｇ／ｍｌ未満となり、５μｌで
非凝集且つ２．５μｌで凝集の場合は、５μｇ／ｍｌ以
上で１０μｇ／ｍｌ未満となり、５μｌで凝集した場合
は、５μｇ／ｍｌ未満と判定される。

【００５１】

【発明の効果】以上述べたように本発明によれば下記の
種々の優れた効果が得られる。

【００５２】１．本発明の方法によれば、試料を反応板
上の試料希釈部で希釈し、しかる後該希釈試料を反応板
上で免疫凝集試薬と反応させるので、従来必要としてい
た希釈用の希釈液入りアンプル、希釈液入りキュベット
等が不要になり、希釈操作が著しく簡便になる。

【００５３】２．目盛付きピペットを用いることによ
り、原試料の採取と、希釈後の試料の分取が容易とな
り、且つ一本のピペットで行えるため、操作及びキット
に無駄がなく合理的に半定量測定がなし得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例を示した説明図である。

【図２】本発明に使用する目盛付きピペットの一例を示
した説明図である。

【図３】本発明の他の実施例を示した説明図である。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料を希釈し、しかる後希釈試料を反応
   板上で免疫凝集試薬と反応させ、粒子の凝集の有無を指
   標として判定する測定方法において、反応板の試料希釈
   部で試料を希釈し、次いで希釈した試料を前記反応板の
   反応部に加えることを特徴とする簡易測定方法。
2. 【請求項２】 試料が尿、血清、血漿、血液、涙液、唾
   液、鼻汁、腹水、頸管粘液のいずれかである請求項１記
   載の簡易測定方法。
3. 【請求項３】 粒子がラテックス、ゼラチン、リポソー
   ム、金属コロイドのいずれかである請求項１記載の簡易
   測定方法。
4. 【請求項４】 判定方法がラテックス凝集反応、ラテッ
   クス凝集阻止反応のいずれかである請求項１記載の簡易
   測定方法。
5. 【請求項５】 試料希釈部と反応部を有することを特徴
   とする反応板。
6. 【請求項６】 粒子の凝集の有無を判定するための請求
   項５記載の反応板。
7. 【請求項７】 試料希釈部がサークル、凹部のいずれか
   である請求項５記載の反応板。
8. 【請求項８】 試料希釈部が希釈用キュベットと該希釈
   用キュベットをセットするための保持部とからなる請求
   項５記載の反応板。
9. 【請求項９】 保持部が穴である請求項８記載の反応
   板。
10. 【請求項１０】 保持部が半円型、Ｕ字型、又はＶ字型
    の切欠きである請求項８記載の反応板。
11. 【請求項１１】 保持部がＸ字状、Ｖ字状、Ｕ字状若し
    くは凹状の切込み、折曲げ部である請求項８記載の反応
    板。
12. 【請求項１２】 試料希釈部と洗浄部と反応部を有する
    ことを特徴とする反応板。
13. 【請求項１３】 試料希釈部を有する反応板と目盛付き
    ピペットと希釈液と免疫凝集試薬とからなる簡易測定試
    薬キット。
14. 【請求項１４】 試料希釈部及び洗浄部を有する反応板
    と目盛付きピペットと希釈液と免疫凝集試薬とからなる
    簡易測定試薬キット。
15. 【請求項１５】 免疫粒子凝集試薬が、抗体試薬と抗原
    感作ラテックスからなる請求項１３又は１４記載の簡易
    測定試薬キット。
16. 【請求項１６】 抗体試薬が抗体感作ラテックスである
    請求項１３又は１４記載の簡易測定試薬キット。
17. 【請求項１７】 免疫粒子凝集試薬が抗体感作ラテック
    スとポリマー抗原とからなる請求項１３又は１４記載の
    簡易測定試薬キット。
18. 【請求項１８】 免疫凝集試薬が抗体感作ラテックス又
    は抗原感作ラテックスである請求項１３又は１４記載の
    簡易測定試薬キット。