JPH10155481A - Ｄｎａの回収方法 - Google Patents
Ｄｎａの回収方法Info
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- JPH10155481A JPH10155481A JP15996397A JP15996397A JPH10155481A JP H10155481 A JPH10155481 A JP H10155481A JP 15996397 A JP15996397 A JP 15996397A JP 15996397 A JP15996397 A JP 15996397A JP H10155481 A JPH10155481 A JP H10155481A
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- dna
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 カオトロピックイオン法を利用して、より簡
単な構造の器具を使用し、かつより少ない操作により精
製されたＤＮＡを回収する方法の提供。 【解決手段】 微生物菌体を溶菌し、遊離のＤＮＡを担
体に吸着し、担体に吸着したＤＮＡを回収する方法。
担体の存在下、微生物菌体を溶菌し、かつ溶菌により得
られるＤＮＡを前記担体に吸着させる工程、溶菌及び吸
着のために用いた溶液を前記担体から分離する工程、及
び前記担体に吸着したＤＮＡをＤＮＡ溶出用溶液で溶出
させて回収する工程からなる。溶液保持能力と吸引時
に溶液透過能力とを有するメンブレンフィルター上に担
体を設けたカラムに微生物菌体を供給する工程、次い
で、前記カラム中の微生物菌体を溶菌し、かつ溶菌によ
り得られるＤＮＡを前記担体に吸着させる工程、前の工
程で溶菌及び吸着のために用いた溶液を吸引によりカラ
ムから除去する工程、カラムにＤＮＡ溶出用溶液を供給
し、吸引して前記担体に吸着したＤＮＡを回収する工程
からなる。
単な構造の器具を使用し、かつより少ない操作により精
製されたＤＮＡを回収する方法の提供。 【解決手段】 微生物菌体を溶菌し、遊離のＤＮＡを担
体に吸着し、担体に吸着したＤＮＡを回収する方法。
担体の存在下、微生物菌体を溶菌し、かつ溶菌により得
られるＤＮＡを前記担体に吸着させる工程、溶菌及び吸
着のために用いた溶液を前記担体から分離する工程、及
び前記担体に吸着したＤＮＡをＤＮＡ溶出用溶液で溶出
させて回収する工程からなる。溶液保持能力と吸引時
に溶液透過能力とを有するメンブレンフィルター上に担
体を設けたカラムに微生物菌体を供給する工程、次い
で、前記カラム中の微生物菌体を溶菌し、かつ溶菌によ
り得られるＤＮＡを前記担体に吸着させる工程、前の工
程で溶菌及び吸着のために用いた溶液を吸引によりカラ
ムから除去する工程、カラムにＤＮＡ溶出用溶液を供給
し、吸引して前記担体に吸着したＤＮＡを回収する工程
からなる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、微生物に含まれる
ＤＮＡを回収する方法に関する。
ＤＮＡを回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子工学の分野において、大腸菌等の
微生物を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、複
製増幅した形質転換体から所望のプラスミドＤＮＡを回
収することが常時行われている。ところが形質転換体か
らプラスミドＤＮＡを回収精製するに複数の工程が必要
であり、手間が掛かる。そこで、より簡単にプラスミド
ＤＮＡを回収精製する方法が提案されている。例えば、
特開平４−３６０６８６号公報には、微生物菌体を溶菌
した溶液から、メンブレンフィルターを介して溶液中の
不溶物を除去し、ついで限外ろ過により不純物を除去し
てＤＮＡを濃縮するプラスミドＤＮＡ及び／又はコスミ
ドＤＮＡの精製方法が開示されている。
微生物を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、複
製増幅した形質転換体から所望のプラスミドＤＮＡを回
収することが常時行われている。ところが形質転換体か
らプラスミドＤＮＡを回収精製するに複数の工程が必要
であり、手間が掛かる。そこで、より簡単にプラスミド
ＤＮＡを回収精製する方法が提案されている。例えば、
特開平４−３６０６８６号公報には、微生物菌体を溶菌
した溶液から、メンブレンフィルターを介して溶液中の
不溶物を除去し、ついで限外ろ過により不純物を除去し
てＤＮＡを濃縮するプラスミドＤＮＡ及び／又はコスミ
ドＤＮＡの精製方法が開示されている。
【０００３】さらに、特開平８−２３９７６号公報に
は、平均孔径が１０ｎｍ〜３５ｎｍであるろ過フィルタ
ーによりプラスミド混合液から不純物を除去するスーパ
ーコイル状のプラスミドＤＮＡの精製方法が開示されて
いる。しかしながら、これらの方法では、精製されたＤ
ＮＡ中に、微生物菌体にＤＮＡとともに含まれるＲＮＡ
も含まれてしまい、ＤＮＡのみを回収するするためには
別途ＲＮＡの分解の工程を必要とする。
は、平均孔径が１０ｎｍ〜３５ｎｍであるろ過フィルタ
ーによりプラスミド混合液から不純物を除去するスーパ
ーコイル状のプラスミドＤＮＡの精製方法が開示されて
いる。しかしながら、これらの方法では、精製されたＤ
ＮＡ中に、微生物菌体にＤＮＡとともに含まれるＲＮＡ
も含まれてしまい、ＤＮＡのみを回収するするためには
別途ＲＮＡの分解の工程を必要とする。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ところで、ＲＮＡとＤ
ＮＡとを分離する方法として、ＤＮＡ吸着性の担体とカ
オトロピックな溶液とを併用する方法（カオトロピック
イオン法）が知られている〔R. Room et al,. J. Clin.
MicroBiol. Vol.28, No.3, p495-503〕。この方法を利
用して、 微生物菌体にＤＮＡとともに含まれるＲＮＡ
を除去してＤＮＡのみを精製する方法が特開平７−２５
０６８１号公報に開示されている。この方法は形質転換
体培養液を第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに集菌
する工程、溶菌及び不要ＲＮＡの分離工程、第１のＤＮ
Ａ抽出精製用カートリッジによる不純物濾過工程、第２
のＤＮＡ抽出精製用カートリッジでＤＮＡを吸着、洗
浄、溶出する工程を含むプラスミドＤＮＡの抽出精製方
法である。
ＮＡとを分離する方法として、ＤＮＡ吸着性の担体とカ
オトロピックな溶液とを併用する方法（カオトロピック
イオン法）が知られている〔R. Room et al,. J. Clin.
MicroBiol. Vol.28, No.3, p495-503〕。この方法を利
用して、 微生物菌体にＤＮＡとともに含まれるＲＮＡ
を除去してＤＮＡのみを精製する方法が特開平７−２５
０６８１号公報に開示されている。この方法は形質転換
体培養液を第１のＤＮＡ抽出精製用カートリッジに集菌
する工程、溶菌及び不要ＲＮＡの分離工程、第１のＤＮ
Ａ抽出精製用カートリッジによる不純物濾過工程、第２
のＤＮＡ抽出精製用カートリッジでＤＮＡを吸着、洗
浄、溶出する工程を含むプラスミドＤＮＡの抽出精製方
法である。
【０００５】ところが、この方法は、２つのカートリッ
ジを使用しなければならず、しかも上記第１のＤＮＡ抽
出精製用カートリッジは少なくともトラップフィルター
とメンブレンフィルターを有し、第２のＤＮＡ抽出精製
用カートリッジは少なくともガラス繊維フィルターとガ
ラスパウダー層とメンブレンフィルターとを有するもの
であり、単なるフィルターに比べて構造も複雑である。
さらにこの方法では、上記２つのカートリッジを使用し
て、溶液の供給と排出（吸引による）を何回も繰返行う
必要がある。
ジを使用しなければならず、しかも上記第１のＤＮＡ抽
出精製用カートリッジは少なくともトラップフィルター
とメンブレンフィルターを有し、第２のＤＮＡ抽出精製
用カートリッジは少なくともガラス繊維フィルターとガ
ラスパウダー層とメンブレンフィルターとを有するもの
であり、単なるフィルターに比べて構造も複雑である。
さらにこの方法では、上記２つのカートリッジを使用し
て、溶液の供給と排出（吸引による）を何回も繰返行う
必要がある。
【０００６】そこで本発明の目的は、カオトロピックイ
オン法を利用して、より簡単な構造の器具を使用し、か
つより少ない操作により精製されたＤＮＡを回収する方
法を提供することにある。
オン法を利用して、より簡単な構造の器具を使用し、か
つより少ない操作により精製されたＤＮＡを回収する方
法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、微生物菌体を
溶菌し、遊離のＤＮＡを担体に吸着し、担体に吸着した
ＤＮＡを回収する方法であって、前記担体の存在下、微
生物菌体を溶菌し、かつ溶菌により得られるＤＮＡを前
記担体に吸着させる工程、溶菌及び吸着のために用いた
溶液を前記担体から分離する工程、及び前記担体に吸着
したＤＮＡをＤＮＡ溶出用溶液で溶出させて回収する工
程からなることを特徴とするＤＮＡの回収方法（第１方
法）に関する。
溶菌し、遊離のＤＮＡを担体に吸着し、担体に吸着した
ＤＮＡを回収する方法であって、前記担体の存在下、微
生物菌体を溶菌し、かつ溶菌により得られるＤＮＡを前
記担体に吸着させる工程、溶菌及び吸着のために用いた
溶液を前記担体から分離する工程、及び前記担体に吸着
したＤＮＡをＤＮＡ溶出用溶液で溶出させて回収する工
程からなることを特徴とするＤＮＡの回収方法（第１方
法）に関する。
【０００８】さらに本発明は、微生物菌体を溶菌し、遊
離のＤＮＡを担体に吸着し、担体に吸着したＤＮＡを回
収する方法であって、溶液保持能力と吸引時に溶液透過
能力とを有するメンブレンフィルター上に担体を設けた
カラムに微生物菌体を供給する工程、次いで、前記カラ
ム中の微生物菌体を溶菌し、かつ溶菌により得られるＤ
ＮＡを前記担体に吸着させる工程、前の工程で溶菌及び
吸着のために用いた溶液を吸引によりカラムから除去す
る工程、カラムにＤＮＡ溶出用溶液を供給し、吸引して
前記担体に吸着したＤＮＡを回収する工程からなること
を特徴とするＤＮＡの回収方法（第２方法）に関する。
離のＤＮＡを担体に吸着し、担体に吸着したＤＮＡを回
収する方法であって、溶液保持能力と吸引時に溶液透過
能力とを有するメンブレンフィルター上に担体を設けた
カラムに微生物菌体を供給する工程、次いで、前記カラ
ム中の微生物菌体を溶菌し、かつ溶菌により得られるＤ
ＮＡを前記担体に吸着させる工程、前の工程で溶菌及び
吸着のために用いた溶液を吸引によりカラムから除去す
る工程、カラムにＤＮＡ溶出用溶液を供給し、吸引して
前記担体に吸着したＤＮＡを回収する工程からなること
を特徴とするＤＮＡの回収方法（第２方法）に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下本発明について説明する。本
発明は、第１方法及び第２方法とも、微生物菌体を溶菌
し、遊離のＤＮＡを担体に吸着し、担体に吸着したＤＮ
Ａを回収する方法である。本発明の方法の対象となる微
生物菌体は特に制限はない。目的とするＤＮＡを含む微
生物菌体であればよい。例えば、宿主微生物に目的とす
るＤＮＡを導入した形質転換体であることができる。
発明は、第１方法及び第２方法とも、微生物菌体を溶菌
し、遊離のＤＮＡを担体に吸着し、担体に吸着したＤＮ
Ａを回収する方法である。本発明の方法の対象となる微
生物菌体は特に制限はない。目的とするＤＮＡを含む微
生物菌体であればよい。例えば、宿主微生物に目的とす
るＤＮＡを導入した形質転換体であることができる。
【００１０】本発明の方法における微生物菌体の溶
菌、遊離ＤＮＡの担体への吸着及び溶出は、それぞれ
公知の方法である。しかるに本発明の方法の特徴は、上
記微生物菌体の溶菌及び遊離ＤＮＡの担体への吸着を１
ポットで行うことである。本発明の第１方法では、担体
の存在下、微生物菌体に溶菌用溶液及びＤＮＡ吸着用溶
液を順次添加して前記担体にＤＮＡを吸着させるか、ま
たは担体の存在下、微生物菌体に溶菌用溶液並びに中和
及びＤＮＡ吸着用溶液を順次添加して前記担体にＤＮＡ
を吸着させる。ガラスは、カオトロピックイオンを含有
するＤＮＡ吸着用溶液の存在下でＤＮＡは吸着するがＲ
ＮＡは吸着しない〔R. Room et al,. J. Clin. MicroBi
ol. Vol.28, No.3, p495-503〕ものである。担体として
は、ガラス、シリカゲル、アニオン交換樹脂、ハイドロ
キシアパタイト及びDiatomaceous Earthのようなセライ
トから選ぶことができる。担体の形状には特に制限はな
いが、吸着用の大きい表面積を有するものが好ましい。
担体は、例えば、メッシュフィルター、ビーズまたは粉
末であることができる。例えば、担体は、例えば、ガラ
スフィルター、ガラスビーズまたはガラス粉末であるこ
とができる。
菌、遊離ＤＮＡの担体への吸着及び溶出は、それぞれ
公知の方法である。しかるに本発明の方法の特徴は、上
記微生物菌体の溶菌及び遊離ＤＮＡの担体への吸着を１
ポットで行うことである。本発明の第１方法では、担体
の存在下、微生物菌体に溶菌用溶液及びＤＮＡ吸着用溶
液を順次添加して前記担体にＤＮＡを吸着させるか、ま
たは担体の存在下、微生物菌体に溶菌用溶液並びに中和
及びＤＮＡ吸着用溶液を順次添加して前記担体にＤＮＡ
を吸着させる。ガラスは、カオトロピックイオンを含有
するＤＮＡ吸着用溶液の存在下でＤＮＡは吸着するがＲ
ＮＡは吸着しない〔R. Room et al,. J. Clin. MicroBi
ol. Vol.28, No.3, p495-503〕ものである。担体として
は、ガラス、シリカゲル、アニオン交換樹脂、ハイドロ
キシアパタイト及びDiatomaceous Earthのようなセライ
トから選ぶことができる。担体の形状には特に制限はな
いが、吸着用の大きい表面積を有するものが好ましい。
担体は、例えば、メッシュフィルター、ビーズまたは粉
末であることができる。例えば、担体は、例えば、ガラ
スフィルター、ガラスビーズまたはガラス粉末であるこ
とができる。
【００１１】ＤＮＡ吸着用溶液は、カオトロピックイオ
ンを含有する溶液である。また、溶菌用溶液は、菌体の
細胞壁分解溶液（溶液Ｉ）、アルカリ−イオン化表面活
性剤溶液（溶液II）及び中和液（溶液III)からなるか、
または、菌体の細胞壁分解溶液（溶液Ｉ）及びアルカリ
−イオン化表面活性剤溶液（溶液II）からなることがで
きる。但し、後者の場合（溶菌用溶液が溶液Ｉ及び溶液
IIからるなる場合）は、中和剤とカオトロピックイオン
とを含有する単一の溶液である中和及びＤＮＡ吸着用溶
液を用いる。
ンを含有する溶液である。また、溶菌用溶液は、菌体の
細胞壁分解溶液（溶液Ｉ）、アルカリ−イオン化表面活
性剤溶液（溶液II）及び中和液（溶液III)からなるか、
または、菌体の細胞壁分解溶液（溶液Ｉ）及びアルカリ
−イオン化表面活性剤溶液（溶液II）からなることがで
きる。但し、後者の場合（溶菌用溶液が溶液Ｉ及び溶液
IIからるなる場合）は、中和剤とカオトロピックイオン
とを含有する単一の溶液である中和及びＤＮＡ吸着用溶
液を用いる。
【００１２】菌体の細胞壁分解溶液（溶液Ｉ）は、菌体
をスフェロプラスト化する働きがあり、例えば、Tris-E
DTA-グルコース−リゾチーム水溶液（溶液Ｉ）を挙げる
ことができる。また、アルカリ−イオン化表面活性剤溶
液（溶液II）は、菌体の膜とタンパク質とを溶解して溶
菌すると共にＤＮＡを変性させる働きがあり、例えば、
NaOH-SDS水溶液（溶液II) を挙げることができる。中和
液（溶液III)は、溶液IIによりアルカリ性になった溶液
を中和する働きがあり、例えば、酢酸カリウム水溶液を
挙げることができる。溶菌は、これら３種類または２種
類の溶液を菌体に順次添加していくことで行うことがで
きる。各溶液の濃度や使用量は、菌体の種類や量に応じ
て適宜決定できる。
をスフェロプラスト化する働きがあり、例えば、Tris-E
DTA-グルコース−リゾチーム水溶液（溶液Ｉ）を挙げる
ことができる。また、アルカリ−イオン化表面活性剤溶
液（溶液II）は、菌体の膜とタンパク質とを溶解して溶
菌すると共にＤＮＡを変性させる働きがあり、例えば、
NaOH-SDS水溶液（溶液II) を挙げることができる。中和
液（溶液III)は、溶液IIによりアルカリ性になった溶液
を中和する働きがあり、例えば、酢酸カリウム水溶液を
挙げることができる。溶菌は、これら３種類または２種
類の溶液を菌体に順次添加していくことで行うことがで
きる。各溶液の濃度や使用量は、菌体の種類や量に応じ
て適宜決定できる。
【００１３】中和及びＤＮＡ吸着用溶液として中和剤
（例えば、酢酸カリウム）とカオトロピックイオンとを
含有する溶液を用いることで、溶液の中和と並行してＤ
ＮＡの吸着を行うことができ、処理時間を短縮できると
いう利点がある。また、ＤＮＡ吸着用溶液として、中和
剤とカオトロピックイオンとを含有する溶液を用いる場
合、溶液のｐＨを６〜１２の範囲に調整しておくこと
が、ＲＮＡの混入を防止するという観点から好ましい。
但し、このｐＨ範囲は、イオン強度によってもことなる
ので、条件により適宜決定できる。尚、ＲＮＡの混入を
防止するために、溶液ＩにRNase を添加しておくことも
できる。
（例えば、酢酸カリウム）とカオトロピックイオンとを
含有する溶液を用いることで、溶液の中和と並行してＤ
ＮＡの吸着を行うことができ、処理時間を短縮できると
いう利点がある。また、ＤＮＡ吸着用溶液として、中和
剤とカオトロピックイオンとを含有する溶液を用いる場
合、溶液のｐＨを６〜１２の範囲に調整しておくこと
が、ＲＮＡの混入を防止するという観点から好ましい。
但し、このｐＨ範囲は、イオン強度によってもことなる
ので、条件により適宜決定できる。尚、ＲＮＡの混入を
防止するために、溶液ＩにRNase を添加しておくことも
できる。
【００１４】また、ＤＮＡ吸着用溶液並びに中和及びＤ
ＮＡ吸着用溶液であるカオトロピックイオンを含有する
溶液は、例えば、LiClO4、KI、NaI 、LiCl、NaCO2H、塩
酸グアニジン等を含有する水溶液を挙げることができ
る。カオトロピックな溶液の濃度や使用量等は、菌体の
種類や量に応じて適宜決定できる。ＤＮＡ吸着用溶液又
は中和及びＤＮＡ吸着用溶液は、先に溶菌用溶液を添加
した菌体との混合物に担体の存在下、さらに添加する。
ＤＮＡ吸着用溶液を添加することで、菌体から溶解した
ＤＮＡが担体に吸着される。本発明の特徴は、上記添加
された各溶液は、前に添加された溶液を分離除去するこ
となくそのまま順次注ぎ足され、添加の都度、溶液の分
離の必要がない点にある。尚、各溶液の添加は、１つの
溶液を添加した後、例えば、１秒〜６０分程度放置した
後に次の溶液を添加することで行うことが、各操作を確
実に行うという観点から好ましい。
ＮＡ吸着用溶液であるカオトロピックイオンを含有する
溶液は、例えば、LiClO4、KI、NaI 、LiCl、NaCO2H、塩
酸グアニジン等を含有する水溶液を挙げることができ
る。カオトロピックな溶液の濃度や使用量等は、菌体の
種類や量に応じて適宜決定できる。ＤＮＡ吸着用溶液又
は中和及びＤＮＡ吸着用溶液は、先に溶菌用溶液を添加
した菌体との混合物に担体の存在下、さらに添加する。
ＤＮＡ吸着用溶液を添加することで、菌体から溶解した
ＤＮＡが担体に吸着される。本発明の特徴は、上記添加
された各溶液は、前に添加された溶液を分離除去するこ
となくそのまま順次注ぎ足され、添加の都度、溶液の分
離の必要がない点にある。尚、各溶液の添加は、１つの
溶液を添加した後、例えば、１秒〜６０分程度放置した
後に次の溶液を添加することで行うことが、各操作を確
実に行うという観点から好ましい。
【００１５】次にＤＮＡが吸着した担体を溶液と分離す
る。担体と溶液との分離は、デカンテーション、遠心分
離、濾過等の方法で行うことができる。溶液から分離し
た担体は、必要により洗浄し、乾燥することもできる。
洗浄には例えば、Tris-EDTA-NaCl／エタノール混合液、
エタノール、エタノール／グリセロール混合溶液等を使
用することができる。次に、前記担体に吸着したＤＮＡ
をＤＮＡ溶出用溶液で溶出させて回収する。ＤＮＡ溶出
用溶液は、例えば、Tris-EDTA 緩衝液を用いることがで
きる。
る。担体と溶液との分離は、デカンテーション、遠心分
離、濾過等の方法で行うことができる。溶液から分離し
た担体は、必要により洗浄し、乾燥することもできる。
洗浄には例えば、Tris-EDTA-NaCl／エタノール混合液、
エタノール、エタノール／グリセロール混合溶液等を使
用することができる。次に、前記担体に吸着したＤＮＡ
をＤＮＡ溶出用溶液で溶出させて回収する。ＤＮＡ溶出
用溶液は、例えば、Tris-EDTA 緩衝液を用いることがで
きる。
【００１６】本発明の第２方法では、溶液保持能力と吸
引時に溶液透過能力とを有するメンブレンフィルター上
に担体を設けたカラムを使用する。このカラムを使用す
ることで、分離回収操作をより簡便に行うことができ
る。また、少量かつ複数のサンプルを同時に並行して処
理するという場合、複数のカラムを束ねたものを用いる
ことができる。また、複数の貫通孔を有するプレートの
一方の開口にメンブレンフィルターを設け孔（ウェル）
中に担体を充填したものをカラムとして使用することも
できる。
引時に溶液透過能力とを有するメンブレンフィルター上
に担体を設けたカラムを使用する。このカラムを使用す
ることで、分離回収操作をより簡便に行うことができ
る。また、少量かつ複数のサンプルを同時に並行して処
理するという場合、複数のカラムを束ねたものを用いる
ことができる。また、複数の貫通孔を有するプレートの
一方の開口にメンブレンフィルターを設け孔（ウェル）
中に担体を充填したものをカラムとして使用することも
できる。
【００１７】メンブレンフィルターは、溶液保持能力と
吸引時に溶液透過能力とを有するものであれば特に制限
はない。市販のメンブレンフィルターをそのまま使用す
ることができる。また、担体は、上記第１方法で説明し
たものと同様のものを使用できる。カラムの大きさや形
状等は、処理する菌体の量や溶液の量を考慮して適宜決
定できる。上記カラム中に微生物菌体を供給する。供給
する微生物菌体は、別途濾過や遠心分離等により培養液
から分離したものでもよいが、微生物菌体を含む培養液
をそのまま上記カラムに供給し、液を吸引して微生物菌
体をメンブレンフィルターで捕捉することにより、微生
物菌体を供給することもできる。
吸引時に溶液透過能力とを有するものであれば特に制限
はない。市販のメンブレンフィルターをそのまま使用す
ることができる。また、担体は、上記第１方法で説明し
たものと同様のものを使用できる。カラムの大きさや形
状等は、処理する菌体の量や溶液の量を考慮して適宜決
定できる。上記カラム中に微生物菌体を供給する。供給
する微生物菌体は、別途濾過や遠心分離等により培養液
から分離したものでもよいが、微生物菌体を含む培養液
をそのまま上記カラムに供給し、液を吸引して微生物菌
体をメンブレンフィルターで捕捉することにより、微生
物菌体を供給することもできる。
【００１８】次いで、前記カラムに溶菌用溶液及びＤＮ
Ａ吸着用溶液を順次添加して前記担体にＤＮＡを吸着さ
せるか、または前記カラムに溶菌用溶液並びに中和及び
ＤＮＡ吸着用溶液を順次添加して前記担体にＤＮＡを吸
着させる。ここで使用する溶菌用溶液、ＤＮＡ吸着用溶
液並びに中和及びＤＮＡ吸着用溶液は上記第１方法で説
明したものと同様のものである。前述のように、本発明
の特徴は、カラムに添加された各溶液は、前に添加され
た溶液を分離除去することなくそのまま順次注ぎ足さ
れ、添加の都度、溶液の分離の必要はない。
Ａ吸着用溶液を順次添加して前記担体にＤＮＡを吸着さ
せるか、または前記カラムに溶菌用溶液並びに中和及び
ＤＮＡ吸着用溶液を順次添加して前記担体にＤＮＡを吸
着させる。ここで使用する溶菌用溶液、ＤＮＡ吸着用溶
液並びに中和及びＤＮＡ吸着用溶液は上記第１方法で説
明したものと同様のものである。前述のように、本発明
の特徴は、カラムに添加された各溶液は、前に添加され
た溶液を分離除去することなくそのまま順次注ぎ足さ
れ、添加の都度、溶液の分離の必要はない。
【００１９】全ての溶液の添加が終了した後、溶液をメ
ンブレンフィルターを介した吸引によりカラムから除去
する。これにより、菌体の残渣はフィルター上に残り、
またＤＮＡも担体に吸着されて、フィルター上に残る。
次いで、担体を含めてカラムを、必要により洗浄して遊
離のＲＮＡやタンパク質等の夾雑物を除去した後、乾燥
することができる。回収するＤＮＡの純度を高めるとい
う観点からは、上記洗浄を行うことが好ましい。洗浄に
は例えば、Tris-EDTA-NaCl／エタノール混合液、エタノ
ール、エタノール／グリセロール混合溶液等を使用する
ことができる。次いで、カラムにＤＮＡ溶出用溶液を供
給し、吸引して前記担体に吸着したＤＮＡを回収する。
ＤＮＡ溶出用溶液は、例えば、Tris-EDTA 緩衝液を用い
ることができる。
ンブレンフィルターを介した吸引によりカラムから除去
する。これにより、菌体の残渣はフィルター上に残り、
またＤＮＡも担体に吸着されて、フィルター上に残る。
次いで、担体を含めてカラムを、必要により洗浄して遊
離のＲＮＡやタンパク質等の夾雑物を除去した後、乾燥
することができる。回収するＤＮＡの純度を高めるとい
う観点からは、上記洗浄を行うことが好ましい。洗浄に
は例えば、Tris-EDTA-NaCl／エタノール混合液、エタノ
ール、エタノール／グリセロール混合溶液等を使用する
ことができる。次いで、カラムにＤＮＡ溶出用溶液を供
給し、吸引して前記担体に吸着したＤＮＡを回収する。
ＤＮＡ溶出用溶液は、例えば、Tris-EDTA 緩衝液を用い
ることができる。
【００２０】本発明の第１方法及び第２方法のいずれ
も、溶菌用溶液及びＤＮＡ吸着用溶液又は中和及びＤＮ
Ａ吸着用溶液を順次添加する工程、担体を溶液から分離
する工程、及び担体からＤＮＡを溶出する工程の３つの
工程からなり、この３つの工程により、微生物菌体から
ＤＮＡを回収できる。さらに、ＤＮＡの溶出工程の前に
夾雑物の洗浄工程を設けることが、回収したＤＮＡの純
度を高めるという観点からは好ましい。本発明の方法に
より回収されるＤＮＡは２本鎖環状プラスミドＤＮＡで
あり、コスミドＤＮＡ、Bacterial Artificial Chromos
ome (BAC) 、P1-derived Artificial Chromosome (PAC)
もプラスミドＤＮＡに含まれる。
も、溶菌用溶液及びＤＮＡ吸着用溶液又は中和及びＤＮ
Ａ吸着用溶液を順次添加する工程、担体を溶液から分離
する工程、及び担体からＤＮＡを溶出する工程の３つの
工程からなり、この３つの工程により、微生物菌体から
ＤＮＡを回収できる。さらに、ＤＮＡの溶出工程の前に
夾雑物の洗浄工程を設けることが、回収したＤＮＡの純
度を高めるという観点からは好ましい。本発明の方法に
より回収されるＤＮＡは２本鎖環状プラスミドＤＮＡで
あり、コスミドＤＮＡ、Bacterial Artificial Chromos
ome (BAC) 、P1-derived Artificial Chromosome (PAC)
もプラスミドＤＮＡに含まれる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明について詳細
に説明する。 実施例１ マウス由来である 5.6 kb の cＤＮＡを挿入したプラス
ミドpBluescript SK（＋）を有する大腸菌ＳＯＬＲ株を
100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地中で一晩培養
した。この内 0.6mlの培養液を96穴のガラスフィルター
とメンブレンで閉じたウェルに移し、吸引により液をろ
過して菌体をガラスフィルター中に集めた。菌体を含む
各ウェルに25μl の溶液Ｉ(50mM グルコース、25mMトリ
ス塩酸緩衝液[pH8.0] 、10mM EDTA 、10mg/ml リゾチー
ム) を加え、５分間放置した。その後、50μl の溶液II
(0.2N 水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム）を加えて５分間放置後、37.5μl の溶液III(3M酢酸
カリウム[pH4.8])を加えて５分間放置した。さらに 120
μl の７Ｍグアニジン塩酸塩溶液（吸着用溶液）を加え
て吸引によりろ過した。
に説明する。 実施例１ マウス由来である 5.6 kb の cＤＮＡを挿入したプラス
ミドpBluescript SK（＋）を有する大腸菌ＳＯＬＲ株を
100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地中で一晩培養
した。この内 0.6mlの培養液を96穴のガラスフィルター
とメンブレンで閉じたウェルに移し、吸引により液をろ
過して菌体をガラスフィルター中に集めた。菌体を含む
各ウェルに25μl の溶液Ｉ(50mM グルコース、25mMトリ
ス塩酸緩衝液[pH8.0] 、10mM EDTA 、10mg/ml リゾチー
ム) を加え、５分間放置した。その後、50μl の溶液II
(0.2N 水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム）を加えて５分間放置後、37.5μl の溶液III(3M酢酸
カリウム[pH4.8])を加えて５分間放置した。さらに 120
μl の７Ｍグアニジン塩酸塩溶液（吸着用溶液）を加え
て吸引によりろ過した。
【００２２】次に、 300μl の洗浄緩衝液(100mMトリス
塩酸緩衝液[pH8.0] 、5mM EDTA、0.2M塩化ナトリウム、
60％エタノール) を加えて吸引によりろ過する工程を２
回、300μl の80％エタノールで１回、 300μl の 100
％エタノールで１回行った。その後、吸引を20分間行っ
てガラスフィルター上のプラスミドＤＮＡを乾燥し、最
後に65％に温めたＴＥ緩衝液（10mMトリス塩酸[pH8.0]
、1mM EDTA) を25〜50μl 加えて吸引することにより
プラスミドＤＮＡを溶出した。この操作により４〜６μ
ｇのプラスミドＤＮＡを得ることが出来た。また、その
純度は 280nmに対する 260nmの吸光度比が２前後と高
く、ジデオキシ法によるＤＮＡ塩基配列決定法に用いて
も十分使用可能であった。
塩酸緩衝液[pH8.0] 、5mM EDTA、0.2M塩化ナトリウム、
60％エタノール) を加えて吸引によりろ過する工程を２
回、300μl の80％エタノールで１回、 300μl の 100
％エタノールで１回行った。その後、吸引を20分間行っ
てガラスフィルター上のプラスミドＤＮＡを乾燥し、最
後に65％に温めたＴＥ緩衝液（10mMトリス塩酸[pH8.0]
、1mM EDTA) を25〜50μl 加えて吸引することにより
プラスミドＤＮＡを溶出した。この操作により４〜６μ
ｇのプラスミドＤＮＡを得ることが出来た。また、その
純度は 280nmに対する 260nmの吸光度比が２前後と高
く、ジデオキシ法によるＤＮＡ塩基配列決定法に用いて
も十分使用可能であった。
【００２３】実施例２ マウス由来である 5.6 kb の cＤＮＡを挿入したプラス
ミドpBluescript SK（＋）を有する大腸菌ＳＯＬＲ株を
100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地中で一晩培養
した。この内 0.6mlの培養液を96穴のガラスフィルター
とメンブレンで閉じたウェルに移し、吸引により液をろ
過して菌体をガラスフィルター中に集めた。菌体を含む
各ウェルに25μl の溶液Ｉ(50mM グルコース、25mMトリ
ス塩酸緩衝液[pH8.0] 、10mM EDTA 、10mg/ml リゾチー
ム) を加え、５分間放置した。その後、50μl の溶液II
(0.2N 水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム）を加えて５分間放置後、160 μl の中和及び吸着用
溶液(0.7M 酢酸カリウム[pH4.8、5.3Mグアニジン塩酸塩
溶液）を加えて５分間放置した。
ミドpBluescript SK（＋）を有する大腸菌ＳＯＬＲ株を
100μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地中で一晩培養
した。この内 0.6mlの培養液を96穴のガラスフィルター
とメンブレンで閉じたウェルに移し、吸引により液をろ
過して菌体をガラスフィルター中に集めた。菌体を含む
各ウェルに25μl の溶液Ｉ(50mM グルコース、25mMトリ
ス塩酸緩衝液[pH8.0] 、10mM EDTA 、10mg/ml リゾチー
ム) を加え、５分間放置した。その後、50μl の溶液II
(0.2N 水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム）を加えて５分間放置後、160 μl の中和及び吸着用
溶液(0.7M 酢酸カリウム[pH4.8、5.3Mグアニジン塩酸塩
溶液）を加えて５分間放置した。
【００２４】次に、ウェルから吸引により混合溶液をろ
過した後、 300μl の80％エタノールで３回、 300μl
の80％エタノール−20% グリセロールで1 回洗浄した。
その後、吸引を20分間行ってガラスフィルター上のプラ
スミドＤＮＡを乾燥し、最後に65％に温めたＴＥ緩衝液
（10mMトリス塩酸[pH8.0] 、1mM EDTA) を25〜50μl加
えて吸引することによりプラスミドＤＮＡを溶出した。
過した後、 300μl の80％エタノールで３回、 300μl
の80％エタノール−20% グリセロールで1 回洗浄した。
その後、吸引を20分間行ってガラスフィルター上のプラ
スミドＤＮＡを乾燥し、最後に65％に温めたＴＥ緩衝液
（10mMトリス塩酸[pH8.0] 、1mM EDTA) を25〜50μl加
えて吸引することによりプラスミドＤＮＡを溶出した。
【００２５】この操作により４〜６μｇのプラスミドＤ
ＮＡを得ることが出来た。また、その純度は 280nmに対
する 260nmの吸光度比が２前後と高く、ジデオキシ法に
よるＤＮＡ塩基配列決定法に用いても十分使用可能であ
った。また、吸着用溶液として酢酸カリウムとグアニジ
ン塩酸塩の混合溶液を用いたため、実施例１に比べて処
理時間を約１５分間短縮することができた。また、洗浄
に80％エタノール−20% グリセロールを用いることで、
100％エタノールを用いた実施例１に比べて溶出に用い
るＴＥ緩衝液のガラスフィルターへの浸透が良く、プラ
スミドＤＮＡの回収量に若干の改善が見られるという利
点があった。
ＮＡを得ることが出来た。また、その純度は 280nmに対
する 260nmの吸光度比が２前後と高く、ジデオキシ法に
よるＤＮＡ塩基配列決定法に用いても十分使用可能であ
った。また、吸着用溶液として酢酸カリウムとグアニジ
ン塩酸塩の混合溶液を用いたため、実施例１に比べて処
理時間を約１５分間短縮することができた。また、洗浄
に80％エタノール−20% グリセロールを用いることで、
100％エタノールを用いた実施例１に比べて溶出に用い
るＴＥ緩衝液のガラスフィルターへの浸透が良く、プラ
スミドＤＮＡの回収量に若干の改善が見られるという利
点があった。
【００２６】実施例３ ガラスフィルターの代わりに、担体としてDiatomaceous
Earth (Bio RAD Co &Ltd.)、ガラス粉末( リケン) 、
多孔質高表面積ガラス(Bio101)またはアニオン交換樹脂
(Qiagen)を用いた以外は実施例１と同様の操作を繰り返
して、各担体について４〜６μｇのプラスミドＤＮＡを
得た。４〜６μｇのプラスミドＤＮＡが最大収量である
ので、上記収量は実施例１と同程度であった。担体ｍｇ
当たりのプラスミドＤＮＡの収量は、担体の表面積に比
例し、担体１０ｍｇ当たりのプラスミドＤＮＡの回収効
率を以下に示す。 Diatomaceous Earth (Bio RAD Co & Ltd.) １５〜２０μｇ ガラス粉末( リケン) ５μｇ 多孔質高表面積ガラス(Bio101) １０〜２０μｇ アニオン交換樹脂(Qiagen) ５μｇ
Earth (Bio RAD Co &Ltd.)、ガラス粉末( リケン) 、
多孔質高表面積ガラス(Bio101)またはアニオン交換樹脂
(Qiagen)を用いた以外は実施例１と同様の操作を繰り返
して、各担体について４〜６μｇのプラスミドＤＮＡを
得た。４〜６μｇのプラスミドＤＮＡが最大収量である
ので、上記収量は実施例１と同程度であった。担体ｍｇ
当たりのプラスミドＤＮＡの収量は、担体の表面積に比
例し、担体１０ｍｇ当たりのプラスミドＤＮＡの回収効
率を以下に示す。 Diatomaceous Earth (Bio RAD Co & Ltd.) １５〜２０μｇ ガラス粉末( リケン) ５μｇ 多孔質高表面積ガラス(Bio101) １０〜２０μｇ アニオン交換樹脂(Qiagen) ５μｇ
Claims (14)
- 【請求項１】 微生物菌体を溶菌し、遊離のＤＮＡを担
体に吸着し、担体に吸着したＤＮＡを回収する方法であ
って、 前記担体の存在下、微生物菌体を溶菌し、かつ溶菌によ
り得られるＤＮＡを前記担体に吸着させる工程、 溶菌及び吸着のために用いた溶液を前記担体から分離す
る工程、及び前記担体に吸着したＤＮＡをＤＮＡ溶出用
溶液で溶出させて回収する工程からなることを特徴とす
るＤＮＡの回収方法。 - 【請求項２】 微生物菌体を溶菌し、遊離のＤＮＡを担
体に吸着し、担体に吸着したＤＮＡを回収する方法であ
って、 溶液保持能力と吸引時に溶液透過能力とを有するメンブ
レンフィルター上に担体を設けたカラムに微生物菌体を
供給する工程、 次いで、前記カラム中の微生物菌体を溶菌し、かつ溶菌
により得られるＤＮＡを前記担体に吸着させる工程、 前の工程で溶菌及び吸着のために用いた溶液を吸引によ
りカラムから除去する工程、 カラムにＤＮＡ溶出用溶液を供給し、吸引して前記担体
に吸着したＤＮＡを回収する工程からなることを特徴と
するＤＮＡの回収方法。 - 【請求項３】 微生物菌体の供給を、微生物菌体を含む
培養液を供給し、次いで液を吸引して微生物菌体をメン
ブレンフィルターで捕捉することにより行う請求項２に
記載の方法。 - 【請求項４】 微生物菌体に溶菌用溶液及びＤＮＡ吸着
用溶液を順次添加して担体にＤＮＡを吸着させる請求項
１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 溶菌用溶液が菌体の細胞壁分解溶液（溶
液Ｉ）、アルカリ−イオン化表面活性剤溶液（溶液II）
及び中和液（溶液III)からなり、ＤＮＡ吸着用溶液がカ
オトロピックイオン含有溶液である請求項４に記載の方
法。 - 【請求項６】 溶液ＩがTris-EDTA-グルコース−リゾチ
ーム水溶液であり、溶液IIがNaOH-SDS水溶液であり、溶
液III が酢酸カリウム水溶液である請求項５に記載の方
法。 - 【請求項７】 微生物菌体に溶菌用溶液並びに中和及び
ＤＮＡ吸着用溶液を順次添加して担体にＤＮＡを吸着さ
せる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 溶菌用溶液が菌体の細胞壁分解溶液（溶
液Ｉ）、及びアルカリ−イオン化表面活性剤溶液（溶液
II）からなり、中和及びＤＮＡ吸着用溶液が中和剤とカ
オトロピックイオンとを含有する単一の溶液である請求
項７に記載の方法。 - 【請求項９】 溶液ＩがTris-EDTA-グルコース−リゾチ
ーム水溶液であり、溶液IIがNaOH-SDS水溶液であり、中
和及びＤＮＡ吸着用溶液が酢酸カリウムカオトロピック
イオンとを含有する溶液である請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 溶液ＩがRNase を含有する請求項５ま
たは８に記載の方法。 - 【請求項１１】 中和及びＤＮＡ吸着用溶液が６〜12の
範囲のpHに調整されている請求項７に記載の方法。 - 【請求項１２】 ＤＮＡ溶出用溶液で溶出前の担体を洗
浄し、乾燥する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項１３】 担体がガラス、シリカゲル、アニオン
交換樹脂、ハイドロキシアパタイト及びセライトからな
る群から選ばれる請求項１〜１２のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１４】 担体が、メッシュフィルター、ビーズ
または粉末である請求項１３に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15996397A JPH10155481A (ja) | 1996-06-18 | 1997-06-17 | Ｄｎａの回収方法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-157245 | 1996-06-18 | ||
| JP15724596 | 1996-06-18 | ||
| JP26149796 | 1996-10-02 | ||
| JP8-261497 | 1996-10-02 | ||
| JP15996397A JPH10155481A (ja) | 1996-06-18 | 1997-06-17 | Ｄｎａの回収方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10155481A true JPH10155481A (ja) | 1998-06-16 |
Family
ID=27321132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15996397A Pending JPH10155481A (ja) | 1996-06-18 | 1997-06-17 | Ｄｎａの回収方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10155481A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000042410A1 (en) * | 1999-01-18 | 2000-07-20 | Precision System Science Co., Ltd. | Concentration device using magnetic particles and method therefor |
| JP2003510254A (ja) * | 1999-09-21 | 2003-03-18 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 核酸単離方法およびキット |
| US7737268B2 (en) | 2003-05-19 | 2010-06-15 | Hitachi High-Technologies Corporation | Method of recovering nucleic acids and kit for recovering nucleic acids |
| WO2016035812A1 (ja) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | 株式会社ミズホメディー | 前処理方法及びそれに用いられる核酸抽出キット |
| WO2024106421A1 (ja) * | 2022-11-15 | 2024-05-23 | 学校法人関西医科大学 | ｍｉＲＮＡの捕集方法、捕集用メンブレンフィルター、捕集用メンブレンフィルターユニット、及び捕集用キット |
-
1997
- 1997-06-17 JP JP15996397A patent/JPH10155481A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000042410A1 (en) * | 1999-01-18 | 2000-07-20 | Precision System Science Co., Ltd. | Concentration device using magnetic particles and method therefor |
| JP2003510254A (ja) * | 1999-09-21 | 2003-03-18 | スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー | 核酸単離方法およびキット |
| US7737268B2 (en) | 2003-05-19 | 2010-06-15 | Hitachi High-Technologies Corporation | Method of recovering nucleic acids and kit for recovering nucleic acids |
| WO2016035812A1 (ja) * | 2014-09-03 | 2016-03-10 | 株式会社ミズホメディー | 前処理方法及びそれに用いられる核酸抽出キット |
| US10316350B2 (en) | 2014-09-03 | 2019-06-11 | Mizuho Medy Co., Ltd. | Pretreatment method and nucleic-acid-extracting kit usable for the same |
| WO2024106421A1 (ja) * | 2022-11-15 | 2024-05-23 | 学校法人関西医科大学 | ｍｉＲＮＡの捕集方法、捕集用メンブレンフィルター、捕集用メンブレンフィルターユニット、及び捕集用キット |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031201 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040506 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040705 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041006 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20050216 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |