JPH10127296A - Ｅｘｔ２遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝性多発性外骨腫症などの機能不全の治療
に有用なＥＸＴ２遺伝子についてさらに同定かつ特性化
する必要がある。 【解決手段】 本発明はＥＸＴ２ポリペプチドおよびか
かる酵素をコードするＤＮＡ（ＲＮＡ）ならびに組み換
え技法によるかかるポリペプチドの産生方法を開示す
る。とりわけ、軟骨肉腫などの遺伝性多発性外骨腫症お
よび癌の治療の開発にてかかるＥＸＴ２を用いる方法を
開示する。さらに、核酸配列における突然変異およびポ
リペプチドの濃度変化に関連する疾患を検出するための
診断分析を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一部、新たに同定
されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；このよう
なポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種および誘
導体；このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチド
ならびにそれらの変種および誘導体の産生法；このよう
なポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニスト；な
らびにこのようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、変
種、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの使用に
関する。特に、これらおよびその他の点で、本発明は、
遺伝性多発性外骨腫症のファミリー（以下、ＥＸＴ２と
称する）の新規なポリヌクレオチドおよびポリペプチド
に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】遺伝
性多発性外骨腫症（ＨＭＥまたはＥＸＴ）は、長骨の骨
端近傍域より通常生じる多発性外骨腫症により特徴付け
られる常染色体優性障害である。関与しうる他の骨とし
て、胸筋骨、下肢帯骨、肋骨、多くはないが、根骨、胸
骨、頭蓋骨、手根骨および足根骨が挙げられる。加え
て、異常な骨形成、特に長骨の骨形成が一の特徴であ
る。これは、関与する骨における腰の曲り、脆性、皮質
不整および形而上の拡張を引き起こし、前腕の奇形をも
たらし、重度の場合には身長が不相当に低くなる。外骨
腫症は、隣接神経、血管および腱の圧縮または刺激、お
よび尿または腸閉塞などの合併症を引き起こし得る。大
部分の重度の合併症は、冒された患者の０.５〜２％で
起こる、肉腫変性である（Ｈennekam,Ｒ.Ｃ.Ｍ.，Ｈere
ditary Ｍultiple Ｅxostoses，Ｊ.Ｍed.Ｇenet. ２
８：２６２−２６６（１９９１））。Ｈechtら（Ｈech
t,Ｊ.Ｔ.；Ｈogue,Ｄ.；Ｓtrong,Ｌ.Ｃ.；Ｈansen,Ｍ.
Ｆ.；Ｂlanton,Ｓ.Ｈ.；Ｗagner,Ｍ.，Ｈereditary Ｍu
ltiple Ｅxostosisand Ｃhondrosarcoma：Ｌinkage to
Ｃhromosome １１ and Ｌoss of Ｈeterozygosity for
ＥＸＴ−Ｌinked Ｍarkers on Ｃhromosomes １１ and
８.，Ａm.Ｊ.Ｈum.Ｇenet. ５６：１１２５−１１３１
（１９９５））は、２％ないし５％の多発性外骨腫症中
の軟骨肉腫の罹患率が、すべての骨腫瘍に対して１／１
０００００の出現率に匹敵すると報告した。多発性外骨
腫症は、Ｌanger−Ｇiedion症候群（１５０２３０）の
一つであり、８ｑ２４領域における欠失による、接触性
遺伝子症候群（contiguous gene syndrome）であること
は明らかである。

【０００３】遺伝的結合の研究により、多発性外骨腫遺
伝子の３つの位置が確立された。それらは、各々、染色
体８、１１および１９にあると確認された。Ｃookら
（Ｃook,Ａ.；Ｒaskind,Ｗ.；Ｂlanton,Ｓ.Ｈ.；Ｐaul
i,Ｒ.Ｍ.；Ｇregg,Ｒ.Ｇ.；Ｆrancomano,Ｃ.Ａ.；Ｐuff
enberger,Ｅ.；Ｃonrad,Ｅ.Ｕ.；Ｓchmale,Ｇ.；Ｓchel
lenberg,Ｇ.；Ｗijsman,Ｅ.；Ｈecht,Ｊ.Ｔ.；Ｗells,
Ｄ.；Ｗagner,Ｍ.Ｊ.，Ｇenetic Ｈeterogeneity in Ｆ
amilies with Ｈereditary Ｍultiple Ｅxostoses, Ａ
m.Ｊ.Ｇenet. ５３：７１−７９（１９９３））は、多
発性外骨腫症の家族の約７０％が８ｑ２４．１１ｑ２
４．１３領域にてマーカーへの結合を示すと結論づけ
た。２つの外骨腫症の大家系を調査し、８ｑ２４からマ
ーカーへの結合を排除した。Ｗuら（Ｗu,Ｙ.Ｑ.；Ｈeut
ink,Ｐ.；de Ｖries,Ｂ.Ｂ.Ａ.；Ｓandkuiji,Ｌ.Ａ.；v
an den Ｏuweland,Ａ.Ｍ.Ｗ.；Ｎiermeijer,Ｍ.Ｆ.；Ｇ
aljaard.Ｈ.；Ｒeyniers,Ｅ.；Ｗillems,Ｐ.Ｊ.；Ｈall
ey,Ｄ.Ｊ.Ｊ.，Ａssignment of a second Ｌocus for
Ｍultiple Ｅxostoses to the Ｐericentromeric Ｒegi
on of Ｃhromosome １１, Ｈum.Ｍolec.Ｇenet. ３：１
６７−１７１（１９９４））は、染色体１１の近位短お
よび長腕からミクロサテライトマーカーに結合している
証拠を見つけた。２点分析によりlodの最高値はＤ１１
Ｓ５５４で見つかった；最大lod＝７.１４８（θ＝０.
０３）。Ｈechtら（１９９５）およびＲaskiindら（Ｒa
skind,Ｗ.Ｈ.；Ｃonrad,Ｅ.Ｕ.；Ｃhansky,Ｈ.；Ｍatsu
shia,Ｍ., Ｌoss of Ｈeterozygosity in Ｃhondrosarc
omas for Ｍarkers Ｌinked to Ｈereditary Ｍultiple
Ｅxostoses Ｌoci onＣhromosomes ８ and １１，Ａm.
Ｊ.Ｈum.Ｇenet. ５６：１１３２−１１３９（１９９
５））は、染色体８上のＥＸＴ１遺伝子および染色体１
１上のＥＸＴ２遺伝子が腫瘍抑制剤機能を有することを
示唆する証拠を示した。彼らは、多発性外骨腫症の患者
を起源とする軟骨肉腫および散発性軟骨肉腫におけるこ
れら２種の遺伝子に結合したマーカーについてヘテロ接
合性の喪失を見出した。

【０００４】アメリカ合衆国における３ＥＸＴ型の頻度
を測定する大規模な研究の一部として、Ｈechtら（１９
９５）は多発性外骨腫症の多世代の大家族の１人に軟骨
肉腫を確認した。この家族は該疾患と染色体１１との関
連を証明した。患者の家族からの構成ＤＮＡおよび腫瘍
ＤＮＡを、染色体８、１１および１９からのshort−tan
dem−repeat（ＳＴＲ）マーカーを用いて比較した。腫
瘍におけるヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）が染色体８お
よび１１マーカーで観察されたが、染色体１９マーカー
では無傷であった。Ｈechtら（１９９５）はすべての患
者からの構成ＤＮＡおよび腫瘍サンプルにてＤ１１Ｓ９
０３の見かけの欠失を観察した。これらの結果は、ＥＸ
Ｔ２遺伝子が側面にＤ１１Ｓ１３５５およびＤ１１Ｓ１
３６１を付した、Ｄ１１Ｓ９０３を含有する領域に位置
していることを示す。同様に、６人の無関係な患者から
の構成および軟骨肉腫ＤＮＡを分析し、そのうちの２人
がＥＸＴを有した。ＥＸＴの患者からの一の腫瘍は染色
体８マーカーでのＬＯＨを示し、散発性軟骨肉腫の一人
が腫瘍特異的ＬＯＨおよび染色体１１マーカーのホモ接
合的欠失を有することがわかった。これらの知見はＨec
htら（１９９５）にＥＸＴ遺伝子が腫瘍抑制剤遺伝子で
あり、腫瘍増殖の開始が多段階モデルに従うことを示唆
した。Ｒaskindら（１９９５）は多発性外骨腫症に関連
する遺伝子に結合した多形的遺伝子座で構成ヘテロ接合
性の喪失を見いだした。Ｒaskindらは多発性外骨腫症の
人に生じる軟骨肉腫における染色体８上のＥＸＴ１に結
合したマーカーについてＬＯＨを検出した。彼らはま
た、散発性軟骨肉腫の１７人のうち４人にＥＸＴ１に結
合したマーカーに関するＬＯＨを見つけ、７人はＥＸＴ
２に結合したマーカーに関するＬＯＨを示した。Ｒaski
ndら（１９９５）は１８人の腫瘍患者のうち、４４％に
てＥＸＴ１またはＥＸＴ２に結合したマーカーに関する
ＬＯＨを観察し、それに対してヘテロ接合性はＥＸＴ３
に結合した１９ｐ上のマーカーについて保持されたまま
であった。これらの知見はＥＸＴ遺伝子についての腫瘍
抑制剤的役割を示唆する。

【０００５】ＥＸＴ２遺伝子座に結合した、多発性外骨
腫症の７家族を研究し、Ｗuytsら（Ｗuyts,Ｗ.；Ｒamla
khan,Ｓ.；Ｖan Ｈul,Ｗ.；Ｈecht,Ｊ.Ｔ.；van den Ｏ
uweland,Ａ.Ｍ.Ｗ.；Ｒaskind,Ｗ.Ｈ.；Ｈofstede,Ｆ.
Ｃ．Ｒeyniers,Ｅ.；Ｗells,Ｄ.Ｅ.；de Ｖries,Ｂ.；
Ｃonrad,Ｅ.Ｕ.；Ｈill,Ａ.；Ｚalatayev,Ｄ.；Ｗeisse
nbach,Ｊ.；Ｗagner,Ｍ.Ｊ.；Ｂakker,Ｅ.；Ｈalley,
Ｄ.Ｊ.Ｊ.；Ｗillems,Ｐ.Ｊ.，Ｒefinement of the Ｍu
ltiple Ｅxostoses Ｌocus（ＥＸＴ２） to a ３−ｃＭ
Ｉnterbal on Ｃhromosome １１，Ａm.Ｊ.Ｈum.Ｇene
t. ５７：３８２−３８７（１９９５））は、ＥＸＴ２
遺伝子の側面にＤ１１Ｓ１３５５およびＤ１１Ｓ１３６
１／Ｄ１１Ｓ５５４を付加した３−ｃＭ領域への配置を
詳細に記載した。この知見はＥＸＴ２遺伝子が１１ｐ１
２−ｐ１１上に位置することを示す。その位置決定によ
り、染色体１１の動原体周囲の領域に位置する多数の推
定候補遺伝子を除外した。ＥＸＴ２遺伝子を位置決定す
る支持結果が、多発性外骨腫症と、１１ｐ１３の欠失に
由来する詳細に研究された接触性遺伝子症候群である、
ＷＡＧＲ症候群（Ｗilms腫瘍、無虹彩症、生殖異常、お
よび精神遅滞；１９４０７０）を組み合わせた疾患を有
する患者を記載する、ＭcＧaughranら（ＭcＧaughran,
Ｊ.Ｍ.；Ｗard,Ｈ.Ｂ.；Ｅvans,Ｄ.Ｇ.Ｒ.，ＷＡＧＲ
Ｓyndrome and Ｍultiple Ｅxostosesin a Ｐatient wi
th Ｄel（１１）（ｐ１１.２ｐ１４.２），Ｊ.Ｍed.Ｇe
net.３２：８２３−８２４（１９９５））の報告で提供
された。その患者はｄｅｌ（１１）（ｐ１４.２ｐ１１.
２）を示した。

【０００６】Ｐotockiら（Ｐotocki,Ｌ.；Ｇreenberg,
Ｆ.；Ｓhaffer,Ｌ.Ｇ.，Ｉnterstitial Ｄeletion of
１１（ｐ１１ｐ１１.２）：Ａ Ｒare Ｃhromosomal Ｓy
ndromewith Ｍental Ｒetardation，Ｐartial Ｆoramin
a，and Ｍultiple Ｅxostoses．（Ａbstract），Ａm.
Ｊ.Ｈum.Ｇenet. ５７：Ａ１２３（１９９５））により
指摘されるように、特色として、多発性外骨腫症を包含
する、１１ｐの介在性欠失、ｄｅｌ（１１）（ｐ１２ｐ
１１.２）に由来する接触性遺伝子症候群の記載は、Ｅ
ＸＴ２の遺伝地図作製を確定した。この接触性遺伝子症
候群の他の特色は、精神遅滞およびカトリン（Ｃatli
n）マークとして知られている、頭頂孔である。Ｐotock
iおよびＳhaffer（Ｐotocki,Ｌ.；Ｓhaffer,Ｌ.Ｇ.，Ｉ
nterstitialＤeletion of １１（ｐ１１.２ｐ１２）：
Ａ Ｎewly Ｄescribed ＣontiguousＧene Ｄeletion Ｓ
yndrome Ｉnvolving the Ｇene Ｈereditary Ｍultiple
Ｅxostoses（ＥＸＴ２），Ａm.Ｊ.Ｍed.Ｇenet. ６
２：３１９−３２５（１９９６））は、別の１１（ｐ１
２ｐ１１.２）欠失の患者にて臨床的および分子的知見
を報告した。細胞遺伝学および分子学分析により、ＥＸ
Ｔ２に密接に結合することが知られているマーカーにつ
いて、新たに父親由来の欠失であることが証明された。
患者は異常な遺伝子座（両側性内眼角贅皮、下垂症、短
人中、およびへの字に曲った上唇）、精神遅滞、多発性
外骨腫症、短頭蓋症および両側性頭頂孔を有する。

【０００７】Ａhnら（Ａhn,Ｊ.ら、Ｃloning of the Ｐ
utative Ｔumor Ｓuppressor Ｇenefor Ｈereditary Ｍ
ultiple Ｅxostoses，Ｎature Ｇenet.，１１，１３７
−１４３（１９９５））は、２人の多発性外骨腫症患者
にて以前に同定された染色体破壊点に及ぶｃＤＮＡをク
ローンし、特徴付けた。さらには、ＥＸＴ１の２家族の
患者はその遺伝子にてフレームシフト突然変異を有し
た。該ｃＤＮＡは、他の公知遺伝子配列と明瞭な相同性
を有しない、２２３８ｂｐのコーディング領域を有し
た。Ｓtickensら（Ｓtrickens,Ｄ.；Ｃlines,Ｇ.；Ｂur
bee,Ｄ.；Ｒamos,Ｐ.；Ｔhomas,Ｓ.；Ｈogue,Ｄ.；Ｈec
ht,Ｊ.Ｔ.；Ｌovett,Ｍ.；Ｅvans,Ｇ.Ａ.，Ｔhe ＥＸＴ
２ Ｍultiple Ｅxostoses Ｇene Ｄefines a Ｆamily o
f Ｐutative Ｔumour ＳupPressor Ｇenes，Ｎature Ｇ
enet. １４：２５−３２（１９９６））は、染色体１１
上のＥＸＴ２遺伝子の同定および特徴を報告した。ＥＸ
Ｔ２遺伝子は７個のエキソンを含有し、７１８個のアミ
ノ酸のポリペプチドをコードする。ノーザン分析によ
り、ほとんどすべての組織にて３.５ｋｂの転写物を検
出した。また、スプライシングに付し、いくつかの組織
で３.７ｋｂの転写物を生成する。該遺伝子は染色体８
上のＥＸＴ１遺伝子に対してストライキング配列類似性
を示す。染色体１１結合の多発性外骨腫症の多世代家族
がＨechtら（１９９５）に記載されており、そのうちの
家族の一人が悪性軟骨肉腫を発病した。この家族では、
多形性マーカーＤ１１Ｓ９０３を含む領域の明瞭な欠失
がすべての患者にて観察された。軟骨肉腫の患者に由来
の腫瘍組織にて、Ｓtickensら（１９９６）は、多形性
マーカーＤ１１Ｓ９０３が欠失され、他の染色体１１マ
ーカーではＬＯＨがあることを観察した。突然変異につ
いてのＥＸＴ２候補遺伝子の初期の研究にて、彼らは無
関係の３家族の患者由来のＤＮＡを用いてＳＳＣＰ分析
を行った。一人の患者の２対立遺伝子の１つにて、ヌク
レオチド７８４ないし７８７の欠失が同定され、それは
ＥＸＴ２遺伝子産物のフレームシフトおよび早期停止を
もたらした。

【０００８】顕微解剖により１１ｐ１１−１２から構築
されたゲノムＤＮＡライブラリーを用い、ヒト胎盤ｃＤ
ＮＡライブラリーから数個のｃＤＮＡクローンを単離し
た。これらのクローンの一つはいくつかの部分でＥＸＴ
１ｃＤＮＡと５９％の相同性を共有する。この遺伝子
を、さらには、ＥＸＴ２遺伝子が配置されている確かな
領域である、染色体１１ｐ１１に蛍光インシトューハイ
ブリダイゼーションすることにより遺伝地図作製した。
ｃＤＮＡライブラリースクリーニングおよび５’ＲＡＣ
Ｅ技法により、完全なｃＤＮＡ配列をクローンした。こ
のｃＤＮＡが７２８アミノ酸をコードすると考えられ
る。ｃＤＮＡとアミノ酸配列は共にＥＸＴ１とストライ
キング類似性を共有する。かくして、この遺伝子が、染
色体１１結合の多発性外骨腫症に関与している。

【０００９】本発明のｃＤＮＡ配列を報告されているＥ
ＸＴ２遺伝子配列と比較すれば、その差異は、Ｓticken
sにより報告されている配列（Ｓtickens，１９９６）と
３０個のアミノ酸が異なる、コーディング領域の中部に
ある９０塩基対である。ＳtickensらはこのｃＤＮＡを
脳ｃＤＮＡライブラリーより単離したのに対して、本発
明のｃＤＮＡは胎盤ｃＤＮＡライブラリーからのもので
ある。本発明のＤＮＡ配列と彼らのＤＮＡ配列の間の差
異によれば、ＥＸＴ２コードの蛋白質で少なくとも２つ
のイソフォームがあることがわかる。このことはＥＸＴ
２遺伝子が治療標的として有用であることを示す。限定
するものではないが、とりわけ、軟骨肉腫などの遺伝性
多発性外骨腫症および癌を包含する機能障害または疾患
の防止、改善または矯正にて役割を果たしうるさらなる
遺伝子を同定および特徴付ける必要があるのは明らかで
ある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】これらの課題および他の
課題に向かって、とりわけ、図１〜４に示されるアミノ
酸配列とＥＸＴ１などの他の蛋白質の既知アミノ酸配列
の間の相同性によって新規ＥＸＴ２と同定されたポリペ
プチドを提供することが本発明の一の目的である。さら
にその上、ＥＸＴ２をコードするポリヌクレオチド、特
に、本明細書で配列番号２で示されるポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを提供することが本発明のさ
らなる目的である。本発明のこの態様の特に好ましい具
体例において、該ポリヌクレオチドは図１〜４に示す配
列におけるＥＸＴ２をコードする領域からなる。本発明
のこの態様によれば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａおよびそのフラグメンを含むＥＸＴ２をコードする単
離された核酸分子が提供され、本発明のこの態様のさら
なる具体例では、生物学的、診断的、臨床的または治療
的に有用なそれらの変種、類縁体または誘導体のフラグ
メントを含め、それらの変種、類縁体または誘導体が提
供される。本発明のこの態様の特に好ましい具体例は、
ＥＸＴ２の天然の対立遺伝子変種である。

【００１１】また、本発明の目的は、治療目的、例え
ば、とりわけ、軟骨肉腫などの遺伝性多発性外骨腫症お
よび癌の治療に使用できる、特に、ＥＸＴ２ポリペプチ
ドを提供することである。本発明のこの態様に従い、本
明細書でＥＸＴ２と称されるヒト起源の新規ポリペプチ
ドならびにその生物学的、診断的または治療的に有用な
フラグメント、変種および誘導体、フラグメントの変種
および誘導体、これらの類縁体が提供される。本発明の
この態様の特に好ましい具体例は、ＥＸＴ２遺伝子の天
然の対立遺伝子によってコードされるＥＸＴ２の変種で
ある。本発明の他の態様においては、本発明のポリペプ
チドと結合し、それを活性化するかまたは抑制する化合
物のスクリーニング法が提供される。本発明のさらに別
の目的は、前記のポリペプチド、ポリペプチドフラグメ
ント、変種および誘導体、変種および誘導体のフラグメ
ントならびに類縁体の産生法を提供することである。こ
の態様の好ましい具体例においては、発現可能に組み込
まれた外因的に誘導されたＥＸＴ２をコードするポリヌ
クレオチドを含む宿主細胞を、宿主中でのＥＸＴ２の発
現のための条件下で培養し、その宿主細胞にてＥＸＴ２
を発現させ、発現された該ポリペプチドを該宿主細胞よ
り回収することからなる、前記のＥＸＴ２ポリペプチド
の産生法が提供される。本発明のさらに別の目的によ
り、前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、とり
わけ、研究、生物学的、臨床的および治療目的に利用す
る生産物、組成物、プロセスおよび方法が提供される。

【００１２】本発明のこの態様の好ましい具体例によれ
ば、とりわけ、ＥＸＴ２ポリペプチドまたはＥＸＴ２コ
ード用ｍＲＮＡの測定による細胞におけるＥＸＴ２発現
の評価；本明細書に開示されるＥＸＴ２ポリペプチドま
たはポリヌクレオチドに細胞を曝すことによる、とりわ
け、軟骨肉腫などの遺伝性多発性外骨腫症および癌のin
vitro、ex vivoまたはin vivoにおける処置；ＥＸＴ２
遺伝子における欠損のような遺伝的変形および欠陥の分
析；および生物にＥＸＴ２ポリペプチドまたはポリヌク
レオチドを投与し、ＥＸＴ２機能の増大またはＥＸＴ２
機能不全の改善のための生産物、組成物および方法が提
供される。本発明のさらに別の具体例により、ＥＸＴ２
の過少発現に関連する症状の治療に、本発明のポリペプ
チドを刺激するための活性化化合物を用いる方法が提供
される。本発明のさらに別の態様により、ＥＸＴ２の過
剰発現に伴う症状の治療に、そのための阻害化合物を用
いる方法が提供される。

【００１３】本発明のさらに別の態様により、天然に存
在しない合成、単離および／または組み換えＥＸＴ２ポ
リペプチドであって、本発明のＥＸＴ２の少なくとも１
つのドメインのフラグメント、コンセンサスフラグメン
トおよび／または保存アミノ酸置換を有する配列であっ
て、かかるポリペプチドがそのレセプターまたはリガン
ドへのＥＸＴ２結合を定量的または定性的に調節するよ
うなポリペプチドが提供される。本発明のさらに別の態
様により、診断、治療および／または研究用に用いられ
る、合成または組み換えＥＸＴ２ポリペプチド、その保
存的置換および誘導体、それに対する抗体、抗イディオ
タイプ抗体、ポリペプチドと結合させるかまたはその予
想される生物学的性質によりポリペプチド結合を調節す
ることによりＥＸＴ２機能の潜在的モジュレーターとし
て有用な組成物および方法が提供される。

【００１４】本発明のさらに別の目的は、種々のＥＸＴ
２またはそのフラグメントを阻害または模倣するように
設計された、合成、単離または組換えポリペプチドを提
供することである。本発明のこの、またさらに別の態様
の具体例により、ＥＸＴ２配列にハイブリダイズするプ
ローブが提供される。本発明のこの態様のさらなる好ま
しい態様においては、ＥＸＴ２ポリペプチドに対する抗
体を提供する。この点で特に好ましい具体例において
は、抗体はＥＸＴ２に対して非常に選択的である。本発
明のもう一つ別の態様においては、ＥＸＴ２アゴニスト
が提供される。好ましいアゴニストは、ＥＸＴ２を模倣
する分子、ＥＸＴ２結合分子またはレセプター分子に結
合する分子およびＥＸＴ２誘発応答を誘起または増大す
る分子である。また、好ましいアゴニストは、ＥＸＴ２
またはＥＸＴ２ポリペプチド、またはＥＸＴ２活性の他
のモジュレーターと相互反応し、それによりＥＸＴ２の
１つの効果またはＥＸＴ２の１つ以上の効果を発効また
は増大させる分子である。本発明の他の態様によれば、
ＥＸＴ２アンタゴニストが提供される。好ましいアンタ
ゴニストは、ＥＸＴ２ポリペプチドを模倣し、ＥＸＴ２
レセプターまたは結合分子に結合するが、１つのＥＸＴ
２誘発応答または１つ以上のＥＸＴ２誘発応答を誘起し
ないものである。また、好ましいアンタゴニストは、Ｅ
ＸＴ２と結合し、または相互反応し、１つのＥＸＴ２の
効果または１つ以上のＥＸＴ２の効果を阻害するか、Ｅ
ＸＴ２の発現を防止する分子である。本発明のさらなる
態様においては、細胞にin vitro、細胞にex vivoおよ
び細胞にin vivoで、あるいは多細胞生物に投与するＥ
ＸＴ２ポリヌクレオチドまたはＥＸＴ２ポリペプチドか
らなる組成物を提供する。本発明のこの態様の特に好ま
しい具体例においては、該組成物は、疾患の治療のため
に宿主生物においてＥＸＴ２ポリペプチドを発現させる
ためのＥＸＴ２ポリヌクレオチドからなる。この点で特
にこのましいのは、ＥＸＴ２の異常な内因性活性に伴う
機能不全治療用の患者の、軟骨肉腫などの遺伝性多発性
外骨腫症および癌における発現である。本発明の他の目
的、特徴、利点および態様は本明細書の以下の記載から
当業者に自明である。しかし、以下の記載、実施例は本
発明の好ましい具体例であり、例示だけのものである。
以下の記載および本明細書の他の開示から、本明細書に
記載の精神および範囲内において、種々の変形および修
正ができることは当業者に自明であろう。図面も本発明
の具体例を示すもので、例示であり、本明細書に開示の
発明をそれに限定するものではない。

【００１５】

【発明の実施の形態】

用語説明 以下の説明は、本明細書でよく使用する用語、特に実施
例で使用する用語の理解を容易にするためのもので、便
宜のためのものであって、発明を限定するものではな
い。ＤＮＡの「消化」は、限定するものではないが、Ｄ
ＮＡのある配列のみに作用する制限酵素のような酵素に
よるＤＮＡの接触切断を言う。本明細書で述べる種々の
制限酵素は商業的に入手でき、その反応条件、コファク
ターおよび使用のための他の要件は当業者に公知であ
り、日常的である。分析目的には、典型的には、プラス
ミドまたはＤＮＡフラグメントの１μｇを、約２０μｌ
の反応緩衝液中、約２単位の酵素で消化する。プラスミ
ド構築用のＤＮＡフラグメントの単離の目的には、典型
的には、５〜５０μｇのＤＮＡを比較的大容量中、２０
〜２５０単位の酵素で消化する。個々の制限酵素につい
ての適当な緩衝液および基質の量は、以下に挙げるよう
な標準的な実験室マニュアルに記載されており、また、
商業的供給者により特定されている。通常、３７℃で約
１時間のインキュベーション時間が使用されるが、条件
は、標準的操作、供給者の指示および反応の詳細に従っ
て変更できる。消化後、当業者に日常的な、よく知られ
た方法を使用し、アガロースまたはポリアクリルアミド
ゲルでの電気泳動により、反応を分析し、フラグメント
を精製できる。

【００１６】「遺伝要素」は、一般に、ポリペプチドを
コードする領域または、複製、転写または翻訳を調節す
る領域からなるポリヌクレオチドまたは宿主において該
ポリペプチドを発現するために重要なその他の方法、あ
るいは該ポリペプチドをコードする領域およびそれに機
能可能に連結した発現を調節する領域からなるポリヌク
レオチドを意味する。遺伝要素は、エピソーム要素とし
て、すなわち、宿主細胞ゲノムとは物理的に独立した分
子として複製するベクターに含まれていてもよい。これ
らは、真核細胞でのメトトレキセート選択によるトラン
スフェクトされたＤＮＡの増幅の間に起こるようなミニ
クロモソームに含まれていてもよい。また、遺伝要素
は、天然状態ではなく、むしろ、単離、クローニングお
よび精製されたＤＮＡの形、とりわけ、ベクターでの宿
主細胞への導入のような操作の後の宿主細胞に含まれて
いてもよい。「単離」は、その天然の状態から「ヒトの
手により」変えられこと、すなわち、天然に存在する場
合、その最初の環境から変えられ、もしくは取り出さ
れ、または両方を意味する。例えば、生体に天然に存在
するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」さ
れていないが、その天然系における共存物質から分離さ
れた同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明
細書で使用する用語として、「単離」されている。例え
ば、ポリヌクレオチドに関し、「単離」なる用語は天然
のクロモソームおよび細胞から分離されていることを意
味する。

【００１７】単離の一部または単離に続いて、かかるポ
リヌクレオチドは、突然変異誘発のために、および、例
えば、宿主における増殖または発現のために、ＤＮＡの
ような他のポリヌクレオチドと結合して融合蛋白質を形
成することができる。単離されたポリヌクレオチドは、
単独でまたはベクターのような他のポリヌクレオチドと
結合させて培養中の宿主細胞または生物全体に導入でき
る。培養中の宿主細胞または生物全体に導入されたＤＮ
Ａは、それらが天然の形態または環境にないので、本明
細書で使用するように、そのＤＮＡもやはり、単離され
ている。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
は、培地、処方、例えば、化学または酵素反応用の細
胞、組成物または溶液へのポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド導入のための溶液のような組成物にあってもよ
く、これらも天然の組成物ではなく、本明細書で使用す
るような用語の意味における単離されたポリヌクレオチ
ドまたはポリペプチドがそのなかに存在する。「連結」
は、２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド、最も頻繁
には二本鎖ＤＮＡ間のホスホジエステル結合の形成方法
を言う。連結の技術はよく知られており、連結のための
プロトコールは、例えば、Sambrookら，Molecular Clon
ing：ALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harb
or Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(198
9)（以下、サムブルックらと称する）のような標準的な
実験室マニュアルや文献に記載されている。

【００１８】「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い
ポリヌクレオチドを言う。しばしば、この用語は、一本
鎖デオキシリボヌクレオチドを言うが、一本鎖または二
本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドお
よび二本鎖ＤＮＡ等も言うことができる。一本鎖ＤＮＡ
プローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチ
ドは、しばしば、自動化オリゴヌクレオチド・シンセサ
イザーで実施されるような化学的方法により合成され
る。しかし、オリゴヌクレオチドは、in vitro組み換え
ＤＮＡ介在技術、細胞や生物におけるＤＮＡの発現を含
む他の種々の方法で生成できる。最初に、化学的合成Ｄ
ＮＡは、典型的には５'ホスフェートなしに得られる。
かかるオリゴヌクレオチドの５'末端は、典型的には組
み換えＤＮＡ分子の形成に使用されるＤＮＡリガーゼを
使用する連結反応によるホスホジエステル結合形成用の
基質ではない。そのようなオリゴヌクレオチドの連結が
所望の場合は、キナーゼおよびＡＴＰを使用するような
標準的な技術によってホスフェートを付加することがで
きる。化学的合成オリゴヌクレオチドの３'末端は、一
般に遊離のヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
のようなリガーゼの存在下、他のオリゴヌクレオチドの
ような他のポリヌクレオチドの５’ホスフェートと容易
にホスホジエステル結合を形成する。よく知られている
ごとく、この反応は、所望により、連結前に該他のポリ
ヌクレオチドの５'ホスフェートを除去することにより
選択的に防止できる。

【００１９】「プラスミド」は、それらの宿主細胞の染
色体の一部ではなく、安定に受け継がれる遺伝要素であ
る。それらはＤＮＡまたはＲＮＡからなってよく、鎖状
でも環状でもよい。プラスミドは、細胞複製の間に分子
の複製と安定な受け継ぎを確保するそれら分子をコード
し、医学的、農業的および環境的にかなり重要な産物を
コードしうる。例えば、プラスミドは、病原性細菌の毒
性を大いに増加させるトキシンをコードする。また、プ
ラスミドは、抗生物質に耐性を与える遺伝子もコードす
る。プラスミドは、組み換え遺伝子のクローンおよび発
現に用いられるベクターとして分子生物学において広く
使用され、組換え遺伝子を発現する。プラスミドは、一
般に、本明細書では、当業者になじみのある標準的な命
名法に従い、前に付く小文字のｐおよび／またはそれに
続く大文字および／または数字で命名される。本明細書
に開示の出発プラスミドは、商業的に入手可能なもの、
公に入手可能なものであり、またはよく知られた、文献
記載の操作による日常的方法により、入手可能なプラス
ミドから構築できる。本発明により使用できる多くのプ
ラスミドおよび他のクローニングまたは発現ベクター
は、当業者によく知られており、容易に入手できる。さ
らに、当業者は、本発明で使用するのに適した他のプラ
スミドをいくらでも容易に構築できる。本発明におい
て、かかるプラスミドならびに他のベクターの性質、構
築および使用は、以下の開示から、当業者に容易に明ら
かとなろう。

【００２０】「ポリヌクレオチド」は、一般に、いずれ
ものポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌク
レオチドを言い、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修
飾ＲＮＡまたはＤＮＡでよい。すなわち、例えば、本明
細書で使用するポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖
および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合し
たＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二
本鎖領域の混合したＲＮＡ、一本鎖でも、またはさらに
典型的には二本鎖でもまたは一本鎖および二本鎖領域が
混合してもよいＤＮＡおよびＲＮＡからなるハイブリッ
ド分子を言う。加えて、本明細書にて使用するポリヌク
レオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよび
ＤＮＡの両方からなる三本鎖領域も言う。そのような領
域の鎖は同じ分子からでも、異なる分子からでもよい。
該領域には、１またはそれ以上の分子の全てが含まれて
もよいが、より典型的には、いくつかの分子の領域のみ
が含まれる。トリプルヘリックス領域の分子の１つは、
しばしば、オリゴヌクレオチドである。本明細書で使用
するように、ポリヌクレオチドなる用語には、前記のご
とく、１またはそれ以上の修飾塩基を含むＤＮＡおよび
ＲＮＡが包含される。すなわち、安定性またはその他の
理由で修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、
本明細書で言うポリヌクレオチドである。さらに、例え
ば、イノシンのような通常でない塩基またはトリチル化
塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも（２
つの例だけを示す）、本明細書で言うポリヌクレオチド
である。明らかなごとく、当業者に公知の多くの有用な
目的に供すことができるように、非常に多くの修飾がＤ
ＮＡおよびＲＮＡに施されている。本明細書で使用する
ポリヌクレオチドなる用語には、化学的、酵素的または
代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチドや、とりわ
け、単純型および複雑型細胞を包含するウイルスおよび
細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特徴の化学的形態が含まれ
る。

【００２１】本明細書で使用する「ポリペプチド」に
は、以下に記載するような全てのポリペプチドが包含さ
れる。ポリペプチドの基本構造はよく知られており、当
該分野の多数の教科書および他の刊行物に記載されてい
る。この点で、本明細書で用いるこの用語は、ペプチド
結合で直鎖状に相互に結合した２またはそれ以上のアミ
ノ酸からなるいずれものペプチドまたは蛋白質を言う。
ここで使用するごとく、この用語は、例えば、ペプチド
の分野で通常、オリゴペプチドおよびオリゴマーと称さ
れる短鎖および、当該分野で蛋白質と総称される多くの
型のある長鎖の両方を言う。明らかなごとく、ポリペプ
チドは、しばしば、通常２０個の天然アミノ酸と称され
る２０個のアミノ酸以外のアミノ酸を含み、末端アミノ
酸を含め、それらの多くのアミノ酸は、与えられたポリ
ペプチドにおいて、プロセッシングやその他のポスト翻
訳修飾のような天然のプロセスまたは当該分野でよく知
られた化学的修飾技術によって修飾されていてもよい。
ポリペプチドにおいて天然に起こる普通の修飾ですら、
ここに全て記載するのには多すぎるが、それらは基本的
な教科書、より詳細な論文および多くの研究文献によく
記載されており、当業者によく知られている。本発明の
ポリペプチドに存在してもよい公知の修飾は、限定する
ものではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボ
シル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム基の共有
結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結
合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイ
ノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合
形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、
ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシ
ル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシ
ル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋
白分解プロセッシング、ホスホリル化、プレニル化、ラ
セミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような
蛋白質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ介在付加およびユビキ
チン化がある。このような修飾は当業者によく知られて
おり、科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつ
かの特に普通の修飾であるグリコシル化、脂質結合、硫
酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロ
キシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、例えば、PROTEI
NS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2nd Ed.，
T．E．Creighton，W．H．Freeman and Company，New Yo
rk，1993のような最も基本的な教科書に記載されてい
る。この主題についての詳細な報文も入手可能である。
例えば、POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF
PROTEINS，B．C．Johnson，Ed.，Academic Press，New
York，1983のWold，F.，"Posttranslational Protein
Modifications：Perspectives and Prospects"，pp.1-1
2；Seifter et al.，"Analysis for protein modificat
ions and nonprotein cofactors", Meth．Enzymol.，19
90，182:626-646；Rattanら，"Protein Synthesis：Pos
ttranslational Modifications and Aging"，Ann. N.
Y．Acad．Sci.，1992，663:48-62にある。

【００２２】明らかなごとく、よく知られているよう
に、また、前記したように、ポリペプチドは必ずしも全
部が直鎖状ではない。例えば、ユビキチン化によるごと
く、分岐していてもよく、また一般に天然のプロセッシ
ング事象や天然には生じないヒトの操作によりもたらさ
れた事象を含むポスト翻訳事象の結果としての分岐し
た、または、分岐しない環状でもよい。環状、分岐およ
び分岐した環状ポリペプチドは、非翻訳天然プロセスよ
っても、全くの合成法によっても合成できる。

【００２３】ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ
またはカルボキシ末端を含め、修飾は、ポリペプチドの
いずれの部位でも起こり得る。事実、共有修飾によるポ
リペプチドにおけるアミノまたはカルボキシ基または両
方のブロックは天然に、また、合成ポリペプチドに普通
に起きるもので、そのような修飾が本発明のポリペプチ
ドに存在していえてもよい。例えば、プロセッシング前
にイー・コリ（E．coli）で作られるポリペプチドのア
ミノ末端残基は、ほぼ変わりなくＮ−ホルミルメチオニ
ンである。ポリペプチドに起きる修飾は、しばしば、そ
れがいかに作られたかの関数となる。例えば、宿主中で
クローンした遺伝子の発現により作られたポリペプチド
について、大部分の修飾の性質および程度は、宿主細胞
のポスト翻訳修飾能およびポリペプチドアミノ酸配列に
存在する修飾シグナルによって決定される。例えば、よ
く知られているごとく、グリコシル化は、イー・コリの
ような細菌宿主においては、しばしば生じない。したが
って、グリコシル化が所望の場合は、ポリペプチドはグ
リコシル化宿主、一般には真核細胞で発現させるべきで
ある。昆虫細胞は、しばしば、哺乳動物細胞と同様のポ
スト翻訳グリコシル化を行うので、その理由で、とりわ
け、グリコシル化の天然のパターンを有する哺乳動物蛋
白質を効率よく発現させるために昆虫細胞発現系が開発
されている。同様な考慮が他の修飾にも適用される。

【００２４】明らかなごとく、同じタイプの修飾が、与
えられたポリペプチドにおいて、同じまたは異なる程度
にいくつかの部位に存在してもよい。また、与えられた
ポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでもよい。一
般に、本明細書で使用するように、ポリペプチドなる用
語は、全てのこのような修飾、特に、宿主細胞中でポリ
ヌクレオチドの発現により合成されたポリペプチドに存
在する修飾を包含する。本明細書で使用するポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの「変種」なる用語は、各
々、対照となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドと
は異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。
この意味の変種は、以下および本明細書のあらゆる部分
に詳細に記載されている。

【００２５】変種は、他の対照ポリヌクレオチドとはヌ
クレオチド配列の異なるポリヌクレオチドを包含する。
一般に、相違は、対照および変種のヌクレオチド配列が
全体として非常に類似しており、多くの領域で同一とな
る程に限定されている。以下に示すように、変種におけ
るヌクレオチド配列の変化はサイレントでありうる。す
なわち、そのような変化はポリヌクレオチドによってコ
ードされるアミノ酸を変化させない。変化がこのタイプ
のサイレント変化に限定される場合、変種は対照と同じ
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。ま
た、以下に示すごとく、変種のヌクレオチド配列は、対
照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列を変えうる。このようなヌクレオチドの変
化は、以下に議論するように、対照配列によってコード
されるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠
失、融合および短縮をもたらす。

【００２６】変種はまた、他の対照ポリペプチドとアミ
ノ酸配列の異なるポリペプチドを包含する。一般に、相
違は、対照および変種の配列が全体として非常に類似し
ており、多くの領域で同一である程に限定されている。
変種および対照ポリペプチドは、１またはそれ以上の置
換、付加、欠失、融合および短縮、またはこれらのいず
れかの組み合わせにより、アミノ酸配列が相違しうる。
本明細書で使用する「融合蛋白質」なる用語は、２つ
の、しばしば関係のない融合した遺伝子またはそのフラ
グメントによりコードされる蛋白質である。欧州特許出
願公開ＥＰ−Ａ−０４６４５３３（カナダ特許出願第２
０４５８６９号の対応出願）はイムノグロブリン分子の
定常領域の種々の部分と、他のヒト蛋白質またはその部
分とからなる融合蛋白質を開示している。多くの場合、
融合蛋白質の一部としてイムノグロブリンＦc領域を使
用することが治療および診断に使用するのに有利であ
り、例えば、薬物動態学的性質の改善をもたらす（ＥＰ
−Ａ−０２３２２６２参照）。他方、ある用途には、融
合蛋白質が発現され、検出され、精製された後にＦc部
分を除くことができるよう望まれる。したがって、融合
蛋白質の成分を化学的または酵素的に切断できる連結領
域で連結することが望まれうる。Ｆc部分が治療または
診断に使用するのに障害となることが証明された場合、
例えば、融合蛋白質を免疫用の抗体として使用する場合
に、これが問題となる。医薬の発見において、例えば、
ｓhＩＬ−５のようなヒト蛋白質が、hＩＬ−５のアンタ
ゴニストを同定するための高処理量スクリーニング検定
における用途としてＦc部分と融合された。D．Bennett
ら、Journal of Molecular Recognition，8：52-58(199
5)およびK．Johansonら、The Journal of Biological C
hemistry，270(16):9459-9471(1995)を参照のこと。

【００２７】かくして、本発明はまた、ＥＸＴ２または
その一部、およびその種々のサブクラスのイムノグロブ
リン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖または
軽鎖の定常領域の種々の部分からなる遺伝子操作した可
溶性融合蛋白質にも関する。イムノグロブリンとして好
ましいのは、そのヒンジ領域で融合が起こるヒトＩｇ
Ｇ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部である。１つの具体例
では、Ｆｃ部分は、血液凝固因子Ｘａで切断できる切断
配列の組み込みで簡単に除去できる。さらに、本発明
は、遺伝子工学によるこれらの融合蛋白質の製造方法お
よびそれらの診断、治療への使用に関する。本発明のさ
らなる態様はまた、そのような融合蛋白質をコードする
ポリヌクレオチドにも関する。膜結合レセプターは融合
蛋白質の形成に特に有用である。そのようレセプター
は、一般に、３つの明瞭な構造領域、すなわち、細胞外
ドメイン、トランスメンブラン・ドメインおよび細胞質
ドメインを有することにより特徴付けられる。本発明
は、融合蛋白質の成分として、これらの領域の１または
それ以上を使用するものである。そのような融合蛋白質
技術の他の例は、国際公開公報ＷＯ９４／２９４５８お
よびＷＯ９４／２２９１４に見られる。「結合分子」
（あるいは「相互反応性分子」または「レセプター成分
因子」）なる用語は、レセプターを含め、本発明のポリ
ペプチドに特異的に結合するか、相互作用する分子を言
う。かかる結合分子も本発明の一部である。結合分子は
また、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体ま
たは抗体誘導試薬のような非天然のものでもよい。

【００２８】公知のごとく、２つのポリペプチドの「類
似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびそ
の保存構成アミノ酸置換基を第２のポリペプチドの配列
と比較することにより決定される。さらに、公知のごと
く、「同一性」は、２つのポリペプチドまたは２つのポ
リヌクレオチド配列間の、かかる配列の２つの長さの間
の対合の同一性によって決定される配列の関連の度合を
意味する。同一性および類似性は共に、容易に計算でき
る［COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，A．M.，
ed.，Oxford，University Press，New York, (1988)；B
IOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smit
h，D．W.，ed.，Academic Press，NewYork，(1993)；CO
MPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PART I，Griffi
n，A．M.，およびGriffin，H．G.，eds.，Humana Pres
s，New Jersey，(1994)；SEQUENCEANALYSIS IN MOLECUL
AR BIOLOGY，von Heinje，G.，Academic Press，(198
7)；SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov，M．およびD
evereux，Ｊ.，eds.，M Stockton Press，New York，(1
991)］。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配
列の間の同一性および類似性を測定するのに多くの方法
があるが、「同一性」および「類似性」なる用語は当業
者によく知られている［H．CarilloおよびD．Lipton，S
IAM J．Applied Math.，48：1073(1988)］。２つの配列
の間の同一性および類似性の決定に一般に使用される方
法は、限定するものではないが、Guideto Huge Compute
rs，Martin J．Bishop，ed.，Academic Press，San Die
go，1994およびH．CarilloおよびD．Lipton，SIAM J．A
pplied Math.，48：1073(1988)に開示されているものが
挙げられる。同一性決定のための好ましい方法は、試験
する２つの配列の間の最大の対合を与えるように設計さ
れている。同一性および類似性の決定方法は、コンピュ
ータ・プログラムに組み込むことができる。２つの配列
の間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュ
ータ・プログラム法としては、限定するものではない
が、ＧＣＳプログラム・パッケージ［J．Devereuxら、N
ucleic Acids Research，12(1)：387(1984)］、ＢＬＡ
ＳＴ、ＦＡＳＴＡ［S．F．Atschulら、J．Molec．Bio
l.，215：403(1990)］が挙げられる。

【００２９】本発明は、とりわけ、以下に詳細に記載す
る、新規ＥＸＴ２ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
に関する。特に、本発明は、ＥＸＴ１に対するアミノ酸
配列相同性により関連付けられる、新規なＥＸＴ２のポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。本発明は
特に図１〜４に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を
有するＥＸＴ２に関する。

【００３０】ポリヌクレオチド 本発明の１つの態様により、図１〜４の推定アミノ酸配
列を有するＥＸＴ２ポリペプチドをコードする単離され
たポリヌクレオチドが提供される。本発明のポリヌクレ
オチドは、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、または例え
ば、化学合成技法によりもしくはその組み換えによりク
ローニングまたは産生することにより得られるｃＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡを含め、ＤＮＡの形態とすることが
できる。そのＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってもよ
い。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても知られている、
コーディング鎖であってもよく、あるいはアンチセンス
鎖としても知られている非コーディング鎖であってもよ
い。ポリヌクレオチドをコードするコーディング配列は
図１〜４（配列番号１）に示すポリヌクレオチドのコー
ディング配列と同じでよい。また、遺伝コードの重複性
（縮重）の結果として、図１〜４（配列番号２）のポリ
ペプチドをコードする異なる配列を有するポリヌクレオ
チドでもよい。

【００３１】図１〜４のポリペプチドをコードする本発
明のポリヌクレオチドは、限定するものではないが、そ
れ自体がマチュア・ポリペプチドのコーディング配列；
マチュア・ポリペプチドと付加的コーディング配列につ
いてのコーディング配列；前記した付加的コーディング
配列と共にまたはなしで、付加的な非コーディング配列
を含むマチュア・ポリペプチドのコーディング配列を包
含する。付加的コーディング配列として、例えば、限定
されるものではないが、プレ、プロ−またはプレプロ−
蛋白質配列のような、リーダーまたは分泌配列をコード
する配列が挙げられる。付加的な非コーディング配列と
しては、限定されるものではないが、転写、スプライシ
ングやポリアデニレーション・シグナル、例えば、ｍＲ
ＮＡのリボソーム結合および安定性についてのｍＲＮＡ
プロセッシングにおいて役割を果たす、転写される非翻
訳配列のようなイントロンおよび非コーディング５'お
よび３'配列が挙げられる。さらなる機能性を与えるコ
ーディング配列も該ポリペプチドに組み込んでよい。す
なわち、例えば、ポリペプチドは、融合ポリペプチドの
精製を容易にする、ペプチドのごときマーカー配列と融
合させてもよい。本発明のこの態様のある種の好ましい
具体例において、マーカー配列はｐＱＥベクター（Qiag
en，Inc.）に付与されたタグのようなヘキサヒスチジン
ペプチドである。例えば、Gentzら、Proc. Natl. Acad.
Sci.，USA，1989，86：821-824に記載されているよう
に、ヘキサヒスチジンは融合蛋白質の都合よい精製を提
供する。別の具体例において、マーカー配列はＨＡタグ
である。ＨＡタグはインフルエンザ赤血球凝集蛋白質か
ら由来するエピトープで、例えば、Wilsonら、Cell, 19
84，37：767に記載されている。他の多くのタグが商業
的に入手できる。

【００３２】上記に従って、本明細書で使用する「ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる語は、遺
伝コードの重複性から、本発明のポリペプチド、特に、
図１〜４（配列番号２）に示すアミノ酸配列を有するＥ
ＸＴ２をコードするいずれかの配列を含むポリヌクレオ
チドを包含する。この用語はまた、該ポリペプチドをコ
ードする単一の連続領域または不連続領域（例えば、イ
ントロンで中断されている）と、コーディングおよび／
または非コーディング配列を含んでいてよい付加的領域
とを含むポリヌクレオチドも包含する。本発明はさら
に、図１〜４の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド
のフラグメント、類縁体および誘導体をコードする上記
ポリヌクレオチドの変種にも関する。該ポリヌクレオチ
ドの変種は、天然の対立遺伝子変種のような天然の変種
でも、天然には知られていない変種でもよい。そのよう
な非天然のポリヌクレオチドの変種は、ポリヌクレオチ
ド、細胞または生物に適用されるものを含め、突然変異
誘発技術により作ることができる。

【００３３】この点で、変種には、上記ポリヌクレオチ
ドとは、塩基の置換、欠失または付加によって異なる変
種がある。この置換、欠失または付加には、１またはそ
れ以上のヌクレオチドが含まれていてもよい。変種は、
コーディングまたは非コーディング領域あるいは両方に
おいて変化してよい。コーディング領域における変化
は、保存または非保存アミノ酸置換、欠失または付加を
生じ得る。この点で、本発明の特に好ましい具体例は、
図１〜４に示すＥＸＴ２のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド、その変種、類縁
体、誘導体およびフラグメント、および該変種、類縁体
および誘導体のフラグメントである。

【００３４】さらに、この点で特に好ましいものは、図
１〜４のＥＸＴ２ポリペプチドのアミノ酸配列におい
て、数個、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０
個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加あるいはそれ
らの何れかの組み合わせであるＥＸＴ２変種、類縁体、
誘導体およびフラグメントならびにフラグメントの変
種、類縁体および誘導体をコードするポリヌクレオチド
である。これらのうちで、特に好ましいものは、ＥＸＴ
２の性質および活性を変化させないサイレント置換、付
加および欠失である。また、この点で保存置換も特に好
ましい。最も好ましくは、置換のない図１〜４のアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドである。

【００３５】本発明のさらに好ましい具体例は、図１〜
４に示すアミノ酸配列を有するＥＸＴ２ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドと少なくとも約９６％同一
であるポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレ
オチドに相補性のポリヌクレオチドである。さらにま
た、この点で特に好ましい具体例は、図１〜４のｃＤＮ
Ａによってコードされるマチュア・ポリペプチドと、実
質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドである。

【００３６】本発明はまた、上記の配列とハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドに関する。この点で、本発明
は、特に、上記のポリヌクレオチドにストリンジェント
な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書で使用する「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも９６％同一である場合にのみハ
イブリダイゼーションが起こることを意味する。本発明
のポリヌクレオチド分析に関してさらに検討するよう
に、例えば、上記の本発明のポリヌクレオチドは、ＥＸ
Ｔ２をコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローン
を単離するため、またはＥＸＴ２遺伝子に対して高い配
列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムク
ローンを単離するためのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ用
のハイブリダイゼーション・プローブとして使用でき
る。そのようなプローブは、一般に、少なくとも１５ヌ
クレオチドからなる。好ましくは、そのようなプローブ
は、少なくとも３０ヌクレオチドを有し、少なくとも５
０ヌクレオチドを有してもよい。特に好ましいプローブ
は、３０〜５０ヌクレオチドの範囲である。

【００３７】例えば、ＥＸＴ２遺伝子のコーティング領
域は、公知のＤＮＡ配列をオリゴヌクレオチドプローブ
合成に使用してスクリーニングすることにより単離でき
る。ついで、本発明の遺伝子の配列に相補性を有するラ
ベルしたオリゴヌクレオチドを使用し、ヒトｃＤＮＡ、
ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーをスクリーニ
ングし、プローブがハイブリダイズするライブラリーの
メンバーを決定する。本発明のポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドは、本明細書において、ポリヌクレオチド
分析に関してさらに検討するとおり、ヒトの疾患の治療
および診断の発見用の研究試薬および材料として使用で
きる。

【００３８】ポリヌクレオチドは、マチュア蛋白質に、
付加的アミノまたはカルボキシル末端アミノ酸またはマ
チュア・ポリペプチドに対する内部アミノ酸（例えば、
マチュア形が２つ以上のポリペプチド鎖を有する場合）
が加わったポリペプチドをコードしてよい。このような
配列は、とりわけ、蛋白質を前駆体からマチュア形へプ
ロセッシングする際に役割を果たすことができ、蛋白質
トラフィッキングを容易にすることができ、蛋白質の半
減期を延長または短縮することができ、あるいは分析ま
たは製造のために蛋白質の操作を容易にすることができ
る。ここで、一般的には、付加的アミノ酸配列はin sit
uで細胞酵素によりマチュア蛋白質から外れるようにプ
ロセッシングされ得る。

【００３９】１またはそれ以上のプロ配列に融合したポ
リペプチドのマチュア形を有する前駆体蛋白質は、該ポ
リペプチドの不活性形であってよい。プロ配列を除去す
ると、一般に、不活性前駆体は活性化される。プロ配列
のいくつか、または全部は、活性化前に除去してよい。
一般に、そのような前駆体をプロ蛋白質と言う。総じ
て、本発明のポリヌクレオチドはマチュア蛋白質、マチ
ュア蛋白質とリーダー配列（プレ蛋白質と称することも
できる）、プレ蛋白質のリーダー配列ではない１または
それ以上のプロ配列を有するマチュア蛋白質の前駆体、
または、一般にポリペプチドの活性形もしくはマチュア
形を製造するプロセッシング工程の間に除去されるリー
ダー配列および１またはそれ以上のプロ配列を有するプ
ロ蛋白質の前駆体であるプレプロ蛋白質をコードでき
る。

【００４０】ポリペプチド 本発明はさらに、図１〜４（配列番号２）の推定アミノ
酸配列を有するＥＸＴ２ポリペプチドに関する。また、
本発明はこれらのポリペプチドのフラグメント、類縁体
および誘導体にも関する。図１〜４のポリペプチドに言
及する場合、「フラグメント」、「誘導体」および「類
縁体」なる用語は、実質的にこのようなポリペプチドと
同じ生物学的機能または活性、すなわちＥＸＴ２として
の機能を有するか、またはポリペプチドがＥＸＴ２ポリ
ペプチドとして機能しなくても、レセプターまたは結合
分子との結合能を保持するポリペプチドを意味する。か
くして、類縁体は、例えば、プロ蛋白質部の開裂により
活性化され、活性なマチュア・ポリペプチドを産生しう
るプロ蛋白質を包含する。

【００４１】本発明のポリペプチドは、組み換えポリペ
プチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドで
あってもよい。好ましい具体例において、それは組み換
えポリペプチドである。図１〜４のポリペプチドのフラ
グメント、誘導体または類縁体は、（ｉ）１またはそれ
以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基
（好ましくは保存アミノ残基）で置換されていて、この
ような置換アミノ酸残基が遺伝コードによりコードされ
ているかまたはコードされていないもの；（ii）１また
はそれ以上のアミノ酸残基が置換基を包含するもの、
（iii）マチュア・ポリペプチドが他の化合物、例え
ば、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例え
ば、ポリエチレングリコール）と融合しているもの、ま
たは（iv）リーダーまたは分泌配列またはマチュア・ポ
リペプチドまたはプロ蛋白質配列の精製に使用される配
列のような付加的のアミノ酸がマチュア・ポリペプチド
と融合したものであり得る。このようなフラグメント、
誘導体および類縁体は本明細書の記載から当業者の範囲
内と考えられる。

【００４２】この点で、本発明の特に好ましい具体例
は、図１〜４（配列番号２）に示すＥＸＴ２のアミノ酸
配列を有するポリペプチド、その変種、類縁体、誘導体
およびフラグメント、ならびにフラグメントの変種、類
縁体および誘導体である。さらに、この点で特に好まし
い本発明の具体例は、ＥＸＴ２のアミノ酸配列を有する
ポリペプチド、その変種、類縁体、誘導体およびフラグ
メント、このポリペプチドの活性／機能を保持するフラ
グメントの変種、類縁体、誘導体および誘導体である。
好ましい変種は、保存アミノ酸置換によって対照と変化
しているものである。かかる置換は、同様な特性の他の
アミノ酸によってポリペプチドの所定アミノ酸が置換さ
れているものである。典型的な保存置換は、脂肪族アミ
ノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ相互の置換、
ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性
残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎおよ
びＧｌｎ間の置換、塩基残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間の交
換ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換であ
る。

【００４３】さらに、この点で特に好ましいものは、図
１〜４のＥＸＴ２ポリペプチドのアミノ酸配列におい
て、数個、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１または０
個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加あるいはそれ
らの何れかの組み合わせであるＥＸＴ２の変種、類縁
体、誘導体およびフラグメントならびにフラグメントの
変種、類縁体および誘導体である。これらのうちで、特
に好ましいものは、該ポリペプチドの性質および活性を
変化させないサイレント置換、付加および欠失である。
また、この点で保存置換も特に好ましい。最も好ましく
は、置換のない図１〜４（配列番号２）のアミノ酸配列
を有するポリペプチドである。

【００４４】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離された形で、好ましくは均質
に精製された形で提供される。本発明のポリペプチド
は、配列番号２のポリペプチド（特に、マチュア・ポリ
ペプチド）ならびに、配列番号２のポリペプチドと少な
くとも約９６％の類似性（さらに好ましくは少なくとも
９６％の同一性）を有するポリペプチドである。

【００４５】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分はペプチド合成による対応する完全長ポリペプチ
ドの産生に用いられる；したがって、フラグメントは完
全長ポリペプチドを産生するための中間体として用いら
れる。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは
部分は本発明の完全長ポリヌクレオチドの合成に用いら
れる。フラグメントは、「自立」、すなわち、他のアミ
ノ酸またはポリペプチドの一部またはそれに融合したも
のでなくても、あるいは大きなポリペプチド内に含ま
れ、その一部または領域を形成しているものでもよい。
より大きなポリペプチド内に含まれる場合、ここで議論
するフラグメントは、最も好ましくは、単一の連続した
領域を形成する。しかし、数個のフラグメントが、単一
のより大きいポリペプチドに含まれていてもよい。例え
ば、ある好ましい具体例は、宿主中での発現用に設計さ
れた前駆体ポリペプチド内に含まれ、ＥＸＴ２フラグメ
ントのアミノ末端に融合した異種プレおよびプロポリペ
プチド領域と、当該フラグメントのカルボキシ末端に融
合した付加的領域を有する本発明のＥＸＴ２ポリペプチ
ドのフラグメントに関する。したがって、本明細書で意
図する意味の１つの態様におけるフラグメントは、ＥＸ
Ｔ２から由来する融合ポリペプチドまたは融合蛋白質の
部分を言う。

【００４６】とりわけ、本発明はまた、上記のフラグメ
ントをコードするポリヌクレオチド、該フラグメントを
コードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド、特に、ストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするポリヌクレオチドおよびＰＣＲプライマ
ーのような、該フラグメントをコードするポリヌクレオ
チドを増幅するポリヌクレオチドに関することは明らか
であろう。この点で、好ましいポリヌクレオチドは、上
記の好ましいフラグメントに対応するフラグメントであ
る。

【００４７】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞およ
び組み換え技法による本発明のポリペプチドの製造にも
関する。宿主細胞を遺伝子操作して、ポリヌクレオチド
を組み込み、本発明のポリペプチドを発現させることが
できる。例えば、ポリヌクレオチドは、よく知られたイ
ンフェクション、トランスダクション、トランスフェク
ション、トランスベクションおよびトランスフォーメー
ションの技術を用いて宿主細胞に組み込むことができ
る。ポリヌクレオチドは、単独でも他のポリヌクレオチ
ドと共に組み込むことができる。このような他のポリヌ
クレオチドは独立して組み込むことも、一緒または本発
明のポリヌクレオチドに連結して組み込むこともでき
る。

【００４８】かくして、例えば、本発明のポリヌクレオ
チドは、他の、選択可能なマーカーをコードする別のポ
リヌクレオチドと共に、例えば、哺乳動物細胞における
共トランスフェクションおよび選択のための標準的な方
法を用いて宿主細胞にトランスフェクションできる。こ
の場合、ポリヌクレオチドは、一般に、宿主細胞ゲノム
に安定に組み込むことができる。別法として、ポリヌク
レオチドは、宿主中で、増殖用の選択可能なマーカーを
含むベクターと連結できる。該ベクター構築物は、上記
の技術によって宿主細胞に組み込むことができる。一般
に、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中または荷
電脂質との複合体のＤＮＡとしてプラスミドベクターが
組み込まれる。ポリヌクレオチドを宿主中に組み込むた
めに、電気穿孔法も使用できる。ベクターがウイルスの
場合、in vitroでパッケージするか、パッケージ細胞に
組み込み、パッケージしたウイルスを細胞にトランスダ
クションすることができる。本発明のこの態様に従っ
て、ポリヌクレオチドを生成し、ポリヌクレオチドを細
胞に組み込むのに適した多種の技術がよく知られてお
り、当業者にとって慣用的なことである。そのような技
術はサムブルックらに詳細に説明されており、これはこ
れらの技術の詳細を示す多くの実験室マニュアルを説明
している。

【００４９】本発明のこの態様によれば、ベクターは、
例えば、プラスミドベクター、一本鎖もしくは二本鎖フ
ァージベクターまたは一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもし
くはＤＮＡウイルスベクターでよい。そのようなベクタ
ーは、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に組み込むためによく
知られている技術により、ポリヌクレオチド、好ましく
はＤＮＡとして細胞中に組み込むことができる。ファー
ジおよびウイルスベクターの場合、ベクターは、インフ
ェクションおよびトランスダクションのためのよく知ら
れた技術によりパッケージまたはカプセル化ウイルスと
して細胞に組み込みことができ、好ましい。ウイルスベ
クターは複製成分または複製欠損でもよい。後者の場
合、ウイルス増殖は、一般に、宿主細胞を相補した場合
のみ起こる。

【００５０】この点で、好ましいベクターは本発明のポ
リヌクレオチドおよびポリペプチド発現用のベクターで
ある。一般に、そのようなベクターは、発現させるべき
ポリヌクレオチドに機能可能に連結した、宿主における
発現に有効なシス−作用調節領域からなる。適当な、ト
ランス−作用因子は宿主から供給されるか、相補ベクタ
ーによって供給されるか、宿主に組み込んだ場合にベク
ター自体によって供給される。

【００５１】この点の好ましい具体例においては、ベク
ターは特異的発現に供される。そのような特異的発現
は、誘導発現またはある種のタイプの細胞のみでの発現
あるいは誘導および細胞特異的発現の両方であり得る。
誘導ベクターのうちで、特に好ましいものは、温度や、
栄養添加剤のような、操作の容易な環境因子によって蛋
白質を発現するように誘導できるベクターである。本発
明のこの態様に適した種々のベクターは、原核および真
核宿主において使用するための構成性および誘導性発現
ベクターを含め、よく知られており、当業者に慣用的に
使用されている。

【００５２】操作した宿主細胞は、通常の栄養培地で培
養でき、培地は、とりわけ、プロモーターを活性化する
ため、形質転換体を選択するため、または遺伝子を増幅
するために適宜修飾することができる。発現のために選
択した宿主細胞で前に使用した、温度、ｐＨ等の培養条
件が、一般に、本発明のポリペプチドの発現に適当であ
り、当業者に自明である。本発明のポリペプチドの発現
には種々の発現ベクターを使用することができる。この
ようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイル
ス誘導ベクター、例えば、細菌性プラスミド、バクテリ
オファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメントか
ら誘導されるベクター、バキュロウイルス、パポーバウ
イルス、ＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイル
スのようなウイルスならびにプラスミドとバクテリオフ
ァージの遺伝因子から誘導されるベクター、コスミドお
よびファージミドのようなこれらの組み合わせから誘導
されるベクターが包含される。一般に、宿主にてポリヌ
クレオチドを維持し、増殖し、発現させてポリペプチド
を製造するのに適したいずれのベクターも、この点にお
いて発現に使用できる。

【００５３】適当なＤＮＡ配列を、種々の公知の、日常
的な操作によりベクター中に挿入できる。一般に、発現
用のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列および発現ベクターを１
またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで切断し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを使用して制限フラグメントを一緒に
連結することにより発現ベクターに連結される。この目
的に使用できる制限および連結用の操作は当業者によく
知られており、日常的である。この点で適当な操作、お
よび発現ベクターを構築するために、当業者によく知ら
れた、日常的な別法を用いる操作は、サムブルックらに
詳細に記載されている。

【００５４】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
ｍＲＮＡ転写を指示するプロモーターを包含する適当な
発現調節配列に操作可能に結合させる。このようなプロ
モーターの代表例として、ファージラムダＰＬプロモー
ター、イー・コリｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモー
ター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、レトロウ
イルスＬＴＲが周知のプロモーターのうちのいくつかと
して挙げられる。本発明において有用な多くの他のプロ
モーターは、よく知られており、本明細書および実施例
に説明する方法に、当業者が日常的に使用できる。

【００５５】一般に、発現構築物は、転写開始および終
止部位を有し、翻訳領域には、翻訳のためのリボソーム
結合部位を有する。該構築物によって発現されるマチュ
ア転写物のコーディング部分は、翻訳されるポリペプチ
ドの始めに翻訳開始ＡＵＧおよび終わりに適当に位置す
る翻訳終止コドンを含む。加えて、構築物は発現を調節
し、起こさせる制御領域を含んでよい。一般に、多くの
共通して実施される操作に従い、そのような領域は、転
写を制御することにより操作される。例として、とりわ
け、レプレッサー結合部位およびエンハンサーが挙げら
れる。

【００５６】増殖および発現用ベクターには、一般に、
選択可能なマーカーが含まれる。選択可能なマーカー遺
伝子は、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型
特徴を与える。好ましいマーカーには、限定するもので
はないが、真核細胞培養についてジヒドロ葉酸還元酵素
またはネオマイシン耐性、およびイー・コリおよびその
他の細菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン
耐性などが挙げられる。このようなマーカーは、増幅に
も適している。別法として、この目的に、さらなるマー
カーを含んでもよい。

【００５７】本明細書に記載した選択されたポリヌクレ
オチド配列、ならびに適当なプロモーターおよび他の適
当な制御配列を含有するベクターは、所望のポリペプチ
ドをその中で発現させるのに適した種々のよく知られた
方法を用いて適当な宿主中に導入される。適当な宿主の
代表例には、イー・コリ、ストレプトマイセスおよびサ
ルモネラ・チフィムリウム細胞などの細菌細胞；酵母細
胞などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２およびシロナ
ヨトウＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳまた
はＢowes黒色腫細胞などの動物細胞；および植物細胞が
挙げられる。多種の発現構築物の宿主は、よく知られて
おり、当業者であれば、本明細書の記載から、本発明の
態様に従ってポリペプチドの発現用の宿主を日常的に選
択することができる。

【００５８】特に、本発明は前記した１またはそれ以上
の配列を含む発現構築物のような組換え構築物も包含す
る。構築物は、本発明の配列が挿入されるプラスミドま
たはウイルスベクターなどのベクターを有してなる。こ
の配列は正または逆の向きでその中に挿入されてもよ
い。この点において、好ましい具体例において、構築物
はさらに、例えば、該配列に操作可能に結合したプロモ
ーターを含む調節配列を有してなる。多数の適当なベク
ターおよびプロモーターが当業者に公知であり、本発明
の使用に適当な商業上入手可能なベクターが多数ある。

【００５９】以下に、商業上入手可能なベクターを例示
のために挙げる。細菌において使用するのに好ましいベ
クターは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑia
gen製）；ｐＢＳベクター、ファージスクリプトベクタ
ー、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１
６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓtratagene
製）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３
３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐharmacia製）で
ある。好ましい真核細胞用ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、
ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓtr
atagene製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳ
ＶＬ（Ｐharmacia製）である。これらは、多くの商業上
入手可能な、本発明の態様に従って使用できる当業者に
利用できるよく知られたベクターの単なる例示である。
例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
の宿主における導入、維持、増殖または発現に適当ない
ずれの他のプラスミドまたはベクターも本発明の態様に
て使用できる。

【００６０】プロモーター領域は、クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）転写ユニッ
ト、候補プロモーターフラグメント導入用の制限部位の
下流、すなわち、プロモーターを含むことのできるフラ
グメントなどの、プロモーター領域を欠く、レポーター
転写ユニットを含むベクターを用いて、望ましいいずれ
の遺伝子からも選択できる。よく知られるごとく、ＣＡ
Ｔ遺伝子の制限部位上流にプロモーターを含有するフラ
グメントのベクターを導入すると、ＣＡＴ活性の産生が
起こり、標準的なＣＡＴ分析で検出できる。この目的に
適したベクターは、よく知られており、容易に入手でき
る。このようなベクターの２つの適当な例はｐＫＫ２３
２−８およびｐＣＭ７である。すなわち、本発明のポリ
ヌクレオチドの発現用のプロモーターは、よく知られて
いて、容易に入手可能なものであるばかりでなく、レポ
ーター遺伝子を用いて上記の方法によって容易に得られ
るものでもよい。本発明に従って、ポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの発現に適した公知の細菌性プロモー
ターは、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモータ
ー、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモータ
ー、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモ
ーターである。

【００６１】この点で適当な公知の真核細胞プロモータ
ーは、ＣＭＶ即時初期型プロモーター、ＨＳＶチミジン
キナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモ
ーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲのよう
なレトロウイルス由来のプロモーター、およびマウスメ
タロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネ
インプロモーターである。宿主での発現に適当なベクタ
ーおよびプロモーターの選択は、よく知られた操作であ
り、発現ベクター、ベクターの宿主への導入および宿主
での発現に必要な技術は当業者の日常的なものである。

【００６２】本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞
にも関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真
核細胞、酵母細胞のような下等真核細胞または細菌細胞
のような原核細胞とすることができる。構築物の宿主細
胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクショ
ン、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクショ
ン、カチオン性リピド介在トラスフェクション、電気穿
孔法、トランスダクション、インフェクション等により
行うことができる。これらの方法は多くの標準的実験室
マニュアルに記載されている。

【００６３】宿主細胞中の構築物を常法にて用い、組換
え体配列によりコードされる遺伝子産物を産生すること
ができる。別法として、本発明のポリペプチドは通常の
ペプチド・シンセサイザーにより合成できる。マチュア
蛋白質は哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞に
おいて適当なプロモーターの調節下で発現できる。無細
胞翻訳系もまた使用して、本発明のＤＮＡ構築物由来の
ＲＮＡを用いてこのような蛋白質を産生することができ
る。原核および真核宿主について用いられる適当なクロ
ーニングおよび発現ベクターは、サムブルックら、に記
載されている。

【００６４】一般に、組換え体発現ベクターは複製の開
始点、下流構造配列の転写を指令する高度発現遺伝子か
ら由来するプロモーターおよびベクターへの暴露後、ベ
クター含有細胞の単離を可能にする選択可能なマーカー
を含む。適当なプロモーターは、とりわけ、３−ホスホ
グリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α−ファクター、酸
ホスファターゼまたは熱ショック蛋白質などの解糖酵素
をコードする遺伝子から誘導できるプロモーターであ
る。適当なマーカーには、イー・コリのアンピシリン耐
性遺伝子およびサッカロミセス・セレビシアエのｔｒｐ
１遺伝子が包含される。

【００６５】高等な真核細胞による本発明のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの転写はエンハンサー配列をベク
ター中に挿入することに増加できる。エンハンサーはＤ
ＮＡシス−作用因子で、通常約１０ないし３００ｂｐ
の、所定の宿主細胞型で作用してプロモーターの転写活
性を増加させるものである。例えば、複製開始点ｂｐ１
００ないし２７０の後側のＳＶ４０エンハンサー、サイ
トメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製
開始点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノ
ウイルスエンハンサーが挙げられる。

【００６６】本発明のポリペプチドのヘテロローガスな
構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは、一
般に、発現のために操作可能にプロモーターに連結する
ように、標準的な技術を使用してベクターに挿入され
る。ポリヌクレオチドは、転写開始部位がリボソーム結
合部位に対して適当な５’に存在するように位置され
る。リボソーム結合部位は、発現されるべきポリペプチ
ドの翻訳を開始するＡＵＧに対して５’にある。一般
に、通常ＡＵＧである開始コドンと共に始まり、リボソ
ーム結合部位と開始コドンの間に存在する、オープンリ
ーディングフレームは他にない。また、一般に、ポリペ
プチドの最後には翻訳終止コドンがあり、ポリアデニレ
ーションシグナルおよび転写終止シグナルが、適宜、転
写領域の３’末端に配置される。翻訳タンパク質を、小
胞体内腔、ペリプラズム腔または細胞外環境へ分泌する
ために、適当な分泌シグナルを発現するポリペプチドに
組み込むことができる。これらのシグナルはポリペプチ
ドに対して内在性であってもよく、あるいは異種性のシ
グナルでもよい。

【００６７】ポリペプチドは、融合蛋白質のような修飾
形で発現されてもよく、また、分泌シグナルのみなら
ず、さらなるヘテロローガスな機能性領域を含んでいて
もよい。すなわち、例えば、付加的なアミノ酸、特に、
荷電アミノ酸の領域をポリペプチドのＮ−末端に付加し
て、精製の間またはその後の取り扱いおよび貯蔵におけ
る宿主細胞での安定性および持続性を改善することがで
きる。精製を容易にするために領域をポリペプチドに付
加することもできる。そのような領域は、ポリペプチド
の最終製造前に除去できる。とりわけ、ぺプチド部分を
ポリペプチドへ付加して分泌または排出を起こさせ、安
定性を向上させ、精製を容易にすることは、当該分野で
よく知られており、日常的な技術である。

【００６８】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドの増殖、維持または発現用の適当な原核宿主として
は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、バシラ
ス・サチリス（Bacillus subtilis）およびサルモネラ
・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）が挙げら
れる。シュウドモナス（Pseudomonas）属、ストレプト
マイセス（Streptomyces）属およびスタフィロコッカス
（Staphylococcus）属の種々の種も、この点で適当な宿
主である。さらに、当業者に公知の他の宿主も使用でき
る。限定するものではないが、代表的な例として、有用
な、細菌用の発現ベクターは、選択可能なマーカーと、
よく知られたクローニングベクターであるｐＢＲ３２２
（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝因子からなる商業上入手
できるプラスミドに由来する細菌性複製開始点からな
る。そのような商業的なベクターとしては、例えば、ｐ
ＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals，Uppsal
a，Sweden）およびＧＥＭ１（Promega Biotec，Madison
s，WI，USA）が挙げられる。これらのベクターにおい
て、ｐＢＲ３２２「主鎖」部分と、適当なプロモーター
および発現させるべき構造配列とを組み合わす。

【００６９】適当な宿主株を形質転換させた後、宿主株
を適当な細胞密度まで増殖させる。選択したプロモータ
ーを導入できる場合は、適当な手段（例、温度シフトま
たは化学誘発剤への暴露）で導入し、細胞をさらなる期
間、培養する。ついで、典型的には、細胞を遠心分離で
収集し、物理的または化学的手段で破壊し、得られた粗
抽出物を、さらに精製するために保持する。蛋白質の発
現に使用した微生物細胞は、凍結−解凍の繰り返し、音
波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む、い
ずれの通常の方法によっても破壊できる。そのような方
法も当業者によく知られている。

【００７０】種々の哺乳動物細胞培養系も同様に発現に
使用できる。哺乳動物発現系の例としては、Ｃ１２７、
３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨ
Ｋセルラインや、Glunzmanら，Cell，1981，23：175に
記載されるサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７ラインが挙
げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにいずれか
必要なリボソーム結合部位、ポリアデニレーション部
位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終
止配列および発現に必要な５’フランキング非転写配列
からなる。好ましい具体例においては、ＳＶ４０スプラ
イス部位およびＳＶ４０ポリアデニレーション部位から
由来するＤＮＡ配列が必要な非転写遺伝因子として使用
される。

【００７１】ＥＸＴ２ポリペプチドは、硫酸アンモニウ
ムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イ
オン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフ
ィーを含む周知方法により、組み換え細胞培養から回収
および精製できる。高速液体クロマトグラフィー（「Ｈ
ＰＬＣ」）を精製に用いるのが最も好ましい。ポリペプ
チドが単離および／または精製中に変性した場合、再び
活性な立体配座にするために、蛋白質再生のための周知
の技法を用いることができる。

【００７２】本発明のポリペプチドには、天然の精製ポ
リペプチド、化学合成法により得られたポリペプチドお
よび、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳
動物細胞のような原核または真核宿主から組み換え技術
で製造されたポリペプチドが包含される。組み換え製造
操作において用いた宿主により、本発明のポリペプチド
は、グリコシル化または非グリコシル化されていてもよ
い。加えて、本発明のポリペプチドには、宿主介在方法
の結果、いくつかの場合には開始の修飾メチオニン残基
を含んでよい。ＥＸＴ２ポリヌクレオチドおよびポリペ
プチドは、本発明により、種々の用途、特に、該酵素の
化学的および生物学的性質を使用する用途に用いること
ができる。さらなる用途は、細胞、組織および器官の障
害の診断および治療に関する。本発明のこれらの態様
は、以下の記載でさらに詳細に説明する。

【００７３】ポリヌクレオチド分析 本発明はまた、例えば、診断試薬として使用するため
の、相補性ポリヌクレオチド検出のためのＥＸＴ２ポリ
ヌクレオチドの使用に関する。機能不全に伴うＥＸＴ２
の突然変異形の検出は、ＥＸＴ２の過小発現、過剰発現
または変更発現からもたらされる疾患または疾患の罹病
しやすさの診断または診断に加えることのできる診断道
具を提供する。ＥＸＴ２遺伝子に突然変異のある個体
が、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出される。診断
用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料
のような患者の細胞から得ることができる。ゲノムＤＮ
Ａは直接的に検出するのに使用できるか、または分析の
前にＰＣＲ（Saikiら，Nature，324：163-166（198
6））により酵素的に増幅できる。同様に、ＲＮＡまた
はｃＤＮＡも使用できる。一例として、ＥＸＴ２をコー
ドする核酸に相補的なＰＣＲプライマーを用いてＥＸＴ
２発現および突然変異を同定し、分析することができ
る。例えば、欠失および挿入は、正常遺伝子型と比較し
て増幅生成物の大きさの変化により検出できる。点突然
変異は、増幅ＤＮＡを放射線標識のＥＸＴ２ＲＮＡまた
は放射線標識のＥＸＴ２アンチセンスＤＮＡ配列に対し
てハイブリダイゼーションすることにより同定できる。
完全に対合した配列はＲＮaseＡ消化または融解温度の
差により、ミスマッチ二重螺旋から区別できる。

【００７４】対照遺伝子と突然変異を有する遺伝子の間
の配列の相違も直接ＤＮＡシーケンシングで示すことが
できる。加えて、クローンしたＤＮＡセグメントをプロ
ーブとして、特異的ＤＮＡセグメントを検出するのに用
いることができる。これらの方法の感度はＰＣＲまたは
他の増幅方法の適当な使用により大いに増強できる。例
えば、シーケンシングプライマーは、修飾ＰＣＲにより
生じた二本鎖ＰＣＲ生成物または一本鎖鋳型分子と共に
使用される。配列決定は、放射線標識した核酸を用いる
常法または蛍光タグを用いる自動シーケンシング操作に
よって行うことができる。ＤＮＡ配列の差に基づく遺伝
的テストは、変性剤と共にまたは無しでゲル中のＤＮＡ
フラグメントの電気泳動の移動度の変化により検出でき
る。小さな配列の欠失および挿入は、高分解ゲル電気泳
動で明視化できる。異なる配列のＤＮＡフラグメント
は、異なるＤＮＡフラグメントの移動度が、それらの特
異的または部分的溶融温度に従って、異なる位置のゲル
中で遅滞する変性ホルムアミドグラディエントゲルによ
って区別できる（例えば、Myersら，Science，230:1242
（1985）を参照のこと）。

【００７５】特異的な位置での配列の変化はまた、ヌク
レアーゼ保護分析、例えば、ＲＮaseおよびＳ１保護ま
たは化学的切断法によっても明らかにすることができる
（例えば、Cottonら，Proc．Natl.Acad.Sci.,USA，85:4
397-4401（1985）を参照のこと）。かくして、特定のＤ
ＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮase
保護、化学的切断、直接シーケンシングまたは制限酵素
の使用（例、制限断片長多形（ＲＦＬＰ））およびゲノ
ムＤＮＡのサザーンブロッティングにより行うことがで
きる。

【００７６】本発明のさらなる態様によれば、とりわ
け、軟骨肉腫などの遺伝性多発性外骨腫症および癌の罹
病しやすさの診断または測定方法が提供される。ＥＸＴ
２遺伝子における突然変異は、とりわけ、軟骨肉腫など
の遺伝性多発性外骨腫症および癌の罹病しやさの指標で
あり、前記した核酸配列は、そのような罹病しやすさの
分析に使用できる。すなわち、例えば、該分析を用い
て、本明細書に記載したＥＸＴ２遺伝子における、置
換、欠失、末端切除、挿入、フレームシフトなどの突然
変異を測定し、そのような突然変異はとりわけ軟骨肉腫
などの遺伝性多発性外骨腫症および癌に対する罹病しや
すさの指標である。

【００７７】本発明は、とりわけ、図１〜４（配列番号
１）の配列を有するポリヌクレオチドの異常に増加また
は減少した発現レベルの患者由来の試料から測定するこ
とからなる、疾患、特に軟骨肉腫などの遺伝性多発性外
骨腫症および癌の診断方法を提供するものである。ポリ
ヌクレオチドの発現の増加または減少は、例えば、ＰＣ
Ｒ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノーザンブロッティ
ングおよび他のハイブリダイゼーション方法などの、ポ
リヌクレオチドの定量に当該分野で周知の方法の何れか
を使用して測定できる。通常のゲル電気泳動およびＤＮ
Ａシーケンシングに加え、突然変異もin situ分析によ
って検出できる。

【００７８】ポリペプチド分析 本発明はまた、細胞および組織におけるＥＸＴ２蛋白質
のレベルを検出するための診断分析にも関する。そのよ
うな分析は、定量的でも、定性的でもよい。すなわち、
例えば、正常な対照組織試料との比較でＥＸＴ２蛋白質
の過小発現を検出する本発明の診断分析を用いて、とり
わけ軟骨肉腫などの遺伝性多発性外骨腫症および癌の存
在を検出することができる。宿主から由来する試料中
の、本発明のＥＸＴ２蛋白質のような蛋白質のレベルの
測定に使用できる分析技術は、当業者によく知られてい
る。そのような分析方法には、ラジオイムノアッセイ、
競合的結合アッセイ、ウェスタンブロット分析および酵
素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が包含され
る。とりわけ、ＥＬＩＳＡが好ましい。ＥＬＩＳＡアッ
セイは、まず、ＥＸＴ２に特異的な抗体、好ましくはモ
ノクローナル抗体を調製することからなる。加えて、該
モノクローナル抗体と結合するリポーター抗体が一般に
調製される。該リポーター抗体は、放射能、蛍光または
酵素試薬、例えば、ここでは西洋ワサビパーオキシダー
ゼ酵素のような検出可能な試薬と結合させる。

【００７９】ＥＬＩＳＡを行うには、宿主から試料を取
り出し、例えば、ポリスチレン皿のような、試料中の蛋
白質と結合する固体担体上でインキュベーションする。
ついで、皿上のいずれの遊離蛋白質結合部位も、ウシ血
清アルブミンのような非特異性蛋白質と共にインキュベ
ーションして被覆する。ついで、モノクローナル抗体を
皿中でインキュベーションする。この間に、モノクロー
ナル抗体は、ポリスチレン皿に結合したいずれのＥＸＴ
２蛋白質とも結合する。結合しないモノクローナル抗体
を緩衝液で洗い流す。西洋ワサビパーオキシダーゼに結
合したリポーター抗体を皿に入れ、ＥＸＴ２蛋白質と結
合したいずれのモノクローナル抗体とも結合させる。つ
いで、結合しなかったリポーター抗体を洗い流す。次
に、比色測定用の基質を含むパーオキシダーゼ活性用の
試薬を皿に加える。一次および二次抗体を介してＥＸＴ
２に結合した、固定化されたパーオキシダーゼは呈色反
応生成物を生成する。所定の時間内に発色した色の量が
試料中に存在するＥＸＴ２蛋白質の量の指標となる。定
量的結果は、典型的には、標準曲線との対比により得ら
れる。競合分析も使用でき、ＥＸＴ２に特異的な抗体を
固体担体に結合させ、標識したＥＸＴ２および宿主由来
の試料を固体担体に通す。固体担体に結合した検出した
ラベルの量を試料中のＥＸＴ２の量と相関させることが
できる。

【００８０】抗体 本発明のポリペプチド、それらのフラグメントまたはそ
の他の誘導体、またはそれらの類縁体、またはそれらを
発現する細胞もまた、これらに対する抗体を産生する免
疫原として用いることができる。これらの抗体は、例え
ば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体である。
本発明にはまた、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、な
らびにＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリ
ーの生成物を包含する。当該分野に公知の種々の方法が
このような抗体およびフラグメントの製造に使用でき
る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生じ
る抗体は、当業者に周知の種々の手段により得ることが
できる。例えば、一の具体例において、該ポリぺプチド
を、動物、好ましくはヒト以外の動物に、直接注射す
る。そうして得られた抗体はポリペプチドその自体と結
合するであろう。この具体例において、ポリペプチドの
フラグメントのみをコードする配列でさえも、全体の天
然ポリペプチドと結合する抗体の産生に使用できる。そ
のような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織から
該ポリペプチドを単離するのに使用できる。

【００８１】モノクローナル抗体を調製する場合、連続
的セルライン培養により産生される抗体を提供するいず
れの技術も用いることができる。例えば、ハイブリドー
マ法（Kohler，G.およびMilstein,C.，Nature，256:495
-497（1975））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリ
ドーマ法（Kozborら、Immunology Today，4:72（198
3））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Coleら、Monoc
lonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss,
Inc.、77-96頁（1985））が挙げられる。一本鎖抗体の
製造のために記載された技術（米国特許第４９４６７７
８号）を用いて、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に
対する一本鎖抗体を産生することができる。また、トラ
ンスジェニックマウスまたはその他の生物、例えばその
他の哺乳動物を用いて、本発明の免疫原性ヒト化抗体を
発現させることができる。

【００８２】前記した抗体を用いて該ポリペプチドを発
現するクローンを単離または同定することができ、アフ
ィニティークロマトグラフィーにより、単離および／ま
たは精製用の固体担体に抗体を結合させて本発明のポリ
ペプチドを精製することができる。ＥＸＴ２に対する抗
体はまた、とりわけ、軟骨肉腫などの遺伝性多発性外骨
腫症および癌を阻害するのに用いることができる。

【００８３】ＥＸＴ２結合分子および分析 ＥＸＴ２はまた、該蛋白質と相互反応する蛋白質の単離
にも使用でき、この相互反応を、干渉の標的とすること
ができる。ＥＸＴ２と他の因子との間の蛋白質−蛋白質
相互反応の阻害剤は、ＥＸＴ２活性調節用の医薬の開発
に通じる。かくして、本発明はまた、ＥＸＴ２への結合
分子の同定方法も提供する。ＥＸＴ２に結合する分子に
ついての蛋白質をコードする遺伝子は、例えば、リガン
ドパンニングおよびＦＡＣＳソーティングのような多く
の公知の方法により同定できる。そような方法は、例え
ば、Coliganら、Current Protocols in Immunology1
(2):第5章（1991）のような多くの実験室マニュアルに
記載されている。

【００８４】例えば、酵母二ハイブリッドシステムは、
転写アクチベーターの活性の再構築を使用する、第一の
テスト蛋白質と第二のテスト蛋白質の間のin vivoにお
ける相互反応検出のための方法を提供する。この方法は
米国特許５２８３１７３号に開示されており、試薬はCl
ontechおよびStratageneから入手できる。簡単には、Ｅ
ＸＴ２ｃＤＮＡをＧａｌ４転写因子ＤＮＡ結合ドメイン
に融合させ、酵母細胞で発現させる。関心のある細胞か
ら得られたｃＤＮＡライブラリーメンバーをＧａｌ４の
トランス活性化ドメインに融合させる。ＥＸＴ２と相互
反応できる蛋白質を発現するｃＤＮＡクローンは、Ｇａ
ｌ４活性の再構築およびＧａｌ１−ｌａｃＺのようなリ
ポーター遺伝子のトランス活性化をもたらす。

【００８５】別法として、組み換えＥＸＴ２を用いるλ
ｇｔ１１またはλＺＡＰ（Stratagene）または均等なｃ
ＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングがある。組み
換えＥＸＴ２蛋白質またはそのフラグメントを、ＦＬＡ
Ｇ、ＨＳＶまたはＧＳＴのような小さなペプチドタグと
融合させる。該ペプチドタグは、心筋クレアチンキナー
ゼのようなキナーゼに対する好都合なホスホリル化部位
を有することができ、またはビオチニル化できる。組み
換えＥＸＴ２は、³²［Ｐ］でホスホリル化でき、または
ラベルなしで使用して、ストレプトアビジンまたはタグ
に対する抗体で検出できる。λｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ラ
イブラリーは、関心ある細胞から作成され、組み換えＥ
ＸＴ２と共にインキュベーションし、洗浄し、ＥＸＴ２
と相互反応するｃＤＮＡクローンを単離する。このよう
な方法は当業者に日常的であり。例えば、サムブルック
らを参照のこと。

【００８６】他の方法は、哺乳動物の発現ライブラリー
のスクリーニングである。この方法では、ｃＤＮＡを、
哺乳動物プロモータとポリアデニレーション部位の間で
ベクターにクローンし、一時的にＣＯＳまたは２９３細
胞にトランスフェクトする。４８時間後、固定化し、洗
浄した細胞をラベルしたＥＸＴ２と共にインキュベーシ
ョンすることで、結合した蛋白質を検出する。好ましい
具体例では、ＥＸＴ２をヨー素化し、結合したＥＸＴ２
をオートラジオグラフィーで検出する。Simsら，Scienc
e，1988，241：585-589およびMcMahanら，EMBO．J.，19
91，10：2821-2831を参照のこと。この方法において
は、関心ある結合蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むｃ
ＤＮＡのプールを選択し、さらに各プールを細分割し、
ついで一時的なトランスフェクション、結合およびオー
トラジオグラフィーのサイクルを繰り返し、関心あるｃ
ＤＮＡを単離できる。別法として、全ｃＤＮＡライブラ
リーを哺乳動物細胞にトランスフェクションし、プレー
トに結合したＥＸＴ２を含む皿で細胞をパンニングする
ことにより関心あるｃＤＮＡを単離できる。洗浄後に結
合している細胞を溶解し、プラスミドＤＮＡを単離し、
細菌中で増幅し、単一のｃＤＮＡクローンが得られるま
で、トランスフェクションおよびパンニングのサイクル
を繰り返す。Seedら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，19
87，84：3365およびAruffoら，EMBO J.，1987，6：3313
を参照のこと。結合蛋白質が分泌される場合、一旦、結
合または中和分析が一時的にトランスフェクションされ
た細胞由来の上澄液の分析ように確立されたら、そのｃ
ＤＮＡを同様なプール法で得ることができる。上澄液の
スクリーニングの一般的な方法はWongら，Science，198
5，228：810-815に開示されている。

【００８７】もう一つの他の方法として、細胞からのＥ
ＸＴ２と直接、相互反応する蛋白質の単離が挙げられ
る。ＥＸＴ２とＧＳＴまたは小さなぺプチドタグとの融
合蛋白質を作成し、ビーズに固定化する。関心ある細胞
からの生合成的にラベルした、またはラベルしない蛋白
質の抽出物を調製し、ビーズと共にインキュベーション
し、緩衝液で洗浄する。ＥＸＴ２と相互反応した蛋白質
をビーズから特異的に溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析
する。結合相手の一次アミノ酸配列データはマイクロシ
ーケンシングによって得られる。所望により、細胞蛋白
質のチロシンホスホリレーションのような機能的応答を
導く試薬で細胞を処理してもよい。そのような試薬の例
は、成長因子またはインターロイキン−２のようなサイ
トカインである。

【００８８】他の方法は、イムノアフィニティー精製で
ある。組み換えＥＸＴ２をラベルした、またはラベルし
ない細胞抽出物と共にインキュベーションし、抗ヒト抗
体で免疫沈降させる。免疫沈降物をプロテインＡ−セフ
ァロースで回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。ラベ
ルしない蛋白質は、ビオチニル化によりラベルし、スト
レプトアビジンでＳＤＳゲル上で検出する。結合相手の
蛋白質をマイクロシーケンシングで分析する。さらに、
公知の標準的な生化学精製工程をマイクロシーケンシン
グ前に使用してもよい。さらに別の方法は、結合相手の
ためにペプチドライブラリーをスクリーニングすること
である。タグを付すか、ラベルした組み換えＥＸＴ２を
用い、ペプチドまたはホスホペプチドライブラリーか
ら、ＥＸＴ２と相互反応するペプチドを選択する。ペプ
チドをシーケンシングに付し、相互反応する蛋白質に見
いだされ得るコンセンサスペプチド配列の同定を誘導す
る。

【００８９】アゴニストおよびアンタゴニスト−分析お
よび分子 本発明のＥＸＴ２は、本発明のポリペプチドの活性を活
性化（アゴニスト）または阻害（アンタゴニスト）する
化合物をスクリーニングする方法にも使用できる。例え
ば、膜またはその調製物、例えば膜調製物などの細胞区
画は、ＥＸＴ２に結合する分子、例えばＥＸＴ２により
制御されるシグナル化または調節経路の分子を発現する
細胞より調製することができる。その調製物を、ＥＸＴ
２アゴニストまたはアンタゴニストであるかもしれない
候補分子の不在または存在下、ラベルしたＥＸＴ２と一
緒にインキュベーションする。その候補分子の結合分子
に結合する能力はラベルしたリガンドの結合の減少に反
映される。無償で、すなわち、ＥＸＴ２結合分子の結合
についてＥＸＴ２の効果を誘発することなく、結合する
分子は、大抵が優れたアンタゴニストである。よく結合
し、ＥＸＴ２と同じまたは密接に関連した効果を惹起す
る分子はアゴニストである。

【００９０】潜在的アゴニストおよびアンタゴニストの
ＥＸＴ２様作用は、例えば、候補分子を細胞または適当
な細胞調製物と相互作用させた後、第二メッセンジャー
系の活性を測定し、その作用をＥＸＴ２またはＥＸＴ２
と同じ作用を惹起する分子の作用と比較することにより
決定することができる。この点で有用である第二メッセ
ンジャー系は、限定されるものではないが、ｃＡＭＰグ
アニレートシクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイ
ノシチド加水分解の第二メッセンジャー系を包含する。
ＥＸＴ２アンタゴニストについての分析の別の例は、競
合阻害分析についての適当な条件下、ＥＸＴ２および潜
在的アンタゴニストを膜結合ＥＸＴ２レセプター分子ま
たは組み換えＥＸＴ２レセプター分子と結合させる競合
分析である。ＥＸＴ２は、レセプター分子に結合したＥ
ＸＴ２の数を正確に測定し、潜在的アンタゴニストの効
力が評価できるように、例えば、放射能により標識化さ
せてることができる。潜在的アンタゴニストとして、例
えば、ポリヌクレオチドの活性が妨げられるように、ポ
リペプチドに結合するが、第二メッセンジャー応答を惹
起しない抗体、またはある場合には、オリゴヌクレオチ
ドが挙げられる。によりレセプターの活性化を妨げない
抗体または、いくつかの場合には、オリゴヌクレオチド
が包含される。また、潜在的アンタゴニストには、ＥＸ
Ｔ２に密接に関係する蛋白質、すなわち、酵素学的活性
を失っていない、ポリペプチドのフラグメントも包含さ
れる。

【００９１】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス技術を使用して調製したアンチセンス構築物も包含す
る。アンチセンス技術は、三重螺旋形成またはアンチセ
ンスＤＮＡまたはＲＮＡにより遺伝子発現を調節するの
に用いることができ、両方法ともポリヌクレオチドのＤ
ＮＡまたはＲＮＡに対する結合に基づく。例えば、本発
明のマチュアポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列の５'コーディング部は約１０ないし４０塩基対
の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計
するのに用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転
写に関与する遺伝子の領域に相補的になるように設計さ
れ（三重螺旋）（Ｌeeら，Nucl.AcidsＲes.，6：3073(1
979)；Cooneyら，Science，241：456(1988)；およびDer
vanら，Science，251：1360(1991)を参照のこと）、こ
れによりＥＸＴ２の転写および産生を防止する。アンチ
センスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、in vivoでｍＲＮ
Ａとハイブリッド形成し、ｍＲＮＡ分子の該酵素への翻
訳をブロックする（アンチセンス）（Okano，J．Neuroc
hem.，56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides asAntise
nse Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca
Raton，FL(1988)）。上記オリゴヌクレオチドはまた、
アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがin vivoで発現さ
れ、ＥＸＴ２レセプターの産生を阻害するように細胞に
デリバリーされ得る。

【００９２】他の潜在的アンタゴニストは、該ポリぺプ
チ緒と結合し、結合分子と接近しにくくなるようにして
正常な生物学的活性を防止する小型分子である。小型分
子の例は、限定するものではないが、小型ペプチドまた
はペプチド様分子である。潜在的アンタゴニストはま
た、可溶性形態のＥＸＴ２、例えば、ポリペプチドのフ
ラグメントが含まれ、結合分子と結合し、その結合分子
が膜結合ＥＸＴ２と相互反応するのを防止する。

【００９３】ＥＸＴ２は哺乳動物宿主において遍在し、
多くの病理を含む多くの生物学的機能に関与する。した
がって、一方で酵素活性を刺激し、他方でＥＸＴ２の機
能を阻害できる化合物および試薬を見出すことが望まし
い。ＥＸＴ２のアンタゴニストは、とりわけ、軟骨肉腫
などの遺伝性多発性外腫症および癌の種々の治療および
予防に使用できる。本発明はさらに過剰のＥＸＴ２活性
と関連した異常な状態の治療法であって、対象に上記し
た阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容される担
体とともに、酵素の活性化を阻害するか、または第二の
シグナルを阻害することにより活性化を阻害するのに有
効な量にて投与し、それにより異常な症状を軽減するこ
とからなる方法を提供する。

【００９４】一般に、ＥＸＴ２のアゴニストは、とりわ
け、軟骨肉腫等の遺伝性多発性外骨腫症および癌の治療
および予防に用いられる。本発明はまたＥＸＴ２および
その活性の過小発現と関連した異常な症状の治療法であ
って、対象に治療上有効量のポリペプチドを活性化（ア
ゴニスト）する化合物を投与し、とりわけ、軟骨肉腫な
どの遺伝性多発性外骨腫症および癌の異常な症状を軽減
することからなる方法も提供する。

【００９５】組成物およびキット 可溶性形態のＥＸＴ２、およびこのような酵素を活性化
または阻害する化合物を適当な医薬担体と組み合わせて
用いることができる。このような組成物は治療上有効量
のポリペプチドまたは化合物と医薬上許容される担体ま
たは賦形剤とを含んでなる。このような担体は、食塩
水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびその組み合わせを包含するが、これ
に限定されない。処方は投与方法に適合するものでなけ
ればならない。投与方法に合った適当な担体の選択は当
業者が日常行うことである。本発明はさらには、１また
はそれ以上の前記した本発明の医薬組成物の成分を充填
した１またはそれ以上の容器からなる医薬パックおよび
キットを提供する。

【００９６】投与 本発明のポリペプチドおよびその他の化合物は、単独
で、または治療用化合物などの他の化合物と組み合わせ
て使用できる。該医薬組成物は、例えば、とりわけ、局
所、経口、経肛門、経膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮
下、鼻腔内または皮内経路による投与を包含する、有効
で、都合のよい方法で投与される。医薬組成物は、一般
に、具体的な適応症（複数も可）の治療および予防に有
効な量で投与される。一般に、医薬組成物は、少なくと
も１０μｇ／体重ｋｇの量で投与される。ほとんどの場
合、一日あたり約８ｍｇ／体重ｋｇを超えない量で投与
される。好ましくは、ほとんどの場合、投与量は、毎日
約１０μｇ／体重ｋｇないし約１ｍｇ／体重ｋｇであ
る。明らかなごとく、最適用量は、適応症、その重篤
度、投与経路、合併症などを考慮し、個々の治療モダリ
ティーおよび適応症のための標準的な方法によって決定
される。

【００９７】遺伝子療法 ＥＸＴ２ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリペプチ
ドであるアゴニストおよびアンタゴニストは、しばしば
「遺伝子療法」と称される治療モダリティーにおいてそ
のようなポリペプチドを発現させることにより本発明に
従って使用できる。すなわち、例えば、患者からの細胞
をex vivoでポリペプチドをコードする、ＤＮＡまたは
ＲＮＡのようなポリヌクレオチドで遺伝子操作する。つ
いで、遺伝子操作した細胞を、ポリペプチドで治療すべ
き患者に与える。この具体例においては、例えば、本発
明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロ
ウイルスプラスミドベクターを使用することにより、細
胞をex vivoで遺伝子操作できる。このような方法は当
該分野でよく知られており、本発明におけるそれらの使
用は、本明細書の記載から明らかであろう。

【００９８】同様に、当該分野における公知操作によ
り、ポリペプチドをin vivoにて発現させるために細胞
をin vivoで遺伝子操作してもよい。例えば、本発明の
ポリヌクレオチドは、上記のごとく、複製欠損レトロウ
イルスベクター中で発現するように操作できる。レトロ
ウイルス発現構築物を単離し、本発明のポリペプチドを
コードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミド
ベクターを形質導入したバッケージング細胞に入れ、パ
ッケージング細胞が関心のある遺伝子を含有する感染性
ウイルス粒子を産生するようにする。このような産生細
胞を、患者に投与し、in vivoで細胞を操作し、in vivo
でポリペプチドを発現させる。本発明のポリペプチドを
投与するためのこれら、および他の方法は、本発明の教
示から当業者に明らかであろう。上記のレトロウイルス
プラスミドベクターを誘導できるレトロウイルスは、限
定するものではないが、モロニーネズミ白血病ウイル
ス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉
腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血
病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイル
ス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを包含
する。好ましい態様においては、レトロウイルスプラス
ミドベクターは、モロニーネズミ白血病ウイルスから誘
導される。

【００９９】そのようなベクターは、該ポリペプチド発
現用の１つ以上のプロモーターを含む。使用できる適当
なプロモーターは、限定するものではないが、レトロウ
イルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーターおよびMillerら，
Biotechniques，1989，7：980-990に記載されるヒトサ
イトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを包含す
る。限定するものではないが、ヒストン、ＲＮＡポリメ
ラーゼＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーターを包含す
る真核細胞プロモーターのような細胞プロモーターも使
用できる。さらに、使用できるウイルスプロモーター
は、限定するものではないが、アデノウイルスプロモー
ター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＢ
１９パルボウイルスプロモーターを包含する。適当なプ
ロモーターの選択は本明細書の教示から当業者に明らか
であろう。

【０１００】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適当なプロモーターの制御下に置かれる。使用で
きる適当なプロモーターは、限定するものではないが、
アデノウイルス主後期プロモーターのようなアデノウイ
ルスプロモーター；サイトメガロウイウス（ＣＭＶ）プ
ロモーターのようなヘテロローガスプロモーター；ＲＳ
ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーターのような誘導性プロ
モーター；ヒートショックプロモーター；アルブミンプ
ロモーター；ＡpoＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロ
モーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター
のようなウイルス性チミジンキナーゼプロモーター；レ
トロウイルスＬＴＲ（上記した修飾レトロウイルスＬＴ
Ｒを含む）；β−アクチンプロモーターおよびヒト成長
ホルモンプロモーターを包含する。プロモーターはま
た、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然の
プロモーターでもよい。

【０１０１】レトロウイルスプラスミドベクターを用い
て、パッケージングセルラインを形質導入し、産生セル
ラインを形成する。トランスフェクトできるパッケージ
ング細胞の例としては、限定するものではないが、ＰＥ
５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ
１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、Ｙ
ＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およ
びMiller，A.，HumanGene Therapy，1990，1：5-14に記
載されるＤＮＡセルラインが挙げられる。ベクターは、
公知のいずれかの手段によりパッケージング細胞に形質
導入できる。そのような方法は、限定するものではない
が、電気穿孔法、リポソームの使用およぎＣaＰＯ₄沈殿
法を包含する。別法の１つとして、レトロウイルスプラ
スミドベクターをリポソームに封入するか、または脂質
に結合させ、ついで宿主に投与してもよい。

【０１０２】産生セルラインは、該ポリペプチドをコー
ドする核酸配列を含む感染性のレトロウイルスベクター
粒子を生じさせる。そのようなレトロウイルスベクター
粒子を使用してin vitroまたはin vivoで真核細胞に形
質導入できる。形質導入された真核細胞は、該ポリペプ
チドをコードする核酸配列を発現させる。形質導入され
る真核細胞は、限定するものではないが、胎児性幹細
胞、胎児性癌細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽
細胞、筋芽細胞、角化細胞、内皮細胞および気管支上皮
細胞を包含する。

【０１０３】

【実施例】

ＥＸＴ２の遺伝子治療発現 線維芽細胞を皮膚生検により対象より得る。得られた組
織を組織培養培地に置き、小さいな部分に分けた。小さ
な組織のチャンクを組織培養フラスコの湿った表面に置
き、約１０個の片を各フラスコに入れた。そのフラスコ
を上下逆にし、気密状態にし、室温に一夜放置した。室
温で２４時間経過した後、フラスコを元に戻す；組織の
チャンクはフラスコの底に固定されたままである；新鮮
な培地を加える（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンお
よびストレプトマイシンを含む、Ｈam Ｆ１２培地）。
ついで、該組織を３７℃で約１週間インキュベーション
する。この時点で、新鮮な培地を加え、その後、７日毎
に交換する。さらに２週間培養すると、単層の線維芽細
胞が出現する。その単層をトリプシン化し、より大きな
フラスコにスケールを拡大した。

【０１０４】遺伝子治療用ベクターを、フラグメントを
クローンし、発現させるために制限酵素で消化する。そ
の消化されたベクターをウシ腸内ホスファターゼで処理
し、自己連結を防止する。脱ホスホリル化線形ベクター
をアガロースゲル上で分画し、精製する。活性なＥＸＴ
２の発現能を有するＥＸＴ２ ｃＤＮＡを単離する。必
要ならば、ベクターにクローンするために、フラグメン
トの末端を修飾する。例えば、５’突出末端をＤＮＡポ
リメラーゼで処理し、平滑末端を形成する。３’突出末
端をＳ１ヌクレアーゼを用いて除去してもよい。リンカ
ーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて平滑末端に連結しても
よい。等量のモロニーネズミ白血病ウイルス線形主鎖お
よびＥＸＴ２フラグメントを混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結する。その連結混合物を用いてイー・
コリを形質転換させ、ついで該細菌をカナマイシン含有
の寒天に接種する。カナマイシン表現型および拘束を分
析し、ベクターが適宜挿入された遺伝子を有することを
確認する。

【０１０５】パッケージ細胞を、１０％子ウシ血清（Ｃ
Ｓ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む、ダ
ルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、全面成長密
度まで組織培養にて増殖させた。ＥＸＴ２遺伝子を含有
するベクターを、今回、産生細胞と称される、そのパッ
ケージ細胞から収集する。新鮮な培地を産生細胞に加
え、インキュベーション時間が適当に経過した後、培地
を集密産生細胞のプレートから収穫する。感染ウイルス
粒子を含有する培地をＭillipore濾紙を介して濾過し、
分離した産生細胞を除去する。ついで濾過した培地を用
いて線維芽細胞を感染させる。培地を線維芽細胞のサブ
集密プレートから取り出し、速やかに濾過した培地と置
換する。ポリブレン（Ｐolybrene）（Ａldrich）を培地
に含め、形質導入を促進してもよい。適当にインキュベ
ーションした後、培地を取り出し、新鮮な培地と置換す
る。ウイルスのタイターが高ければ、実質的にすべての
線維芽細胞は感染し、選択の必要はない、タイターが低
ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓのような選択可能なマーカ
ーを有するレトロウイルスベクターを用い、拡張のため
に形質導入細胞を選出する必要がある。

【０１０６】ついで操作した線維芽細胞を、単独で、ま
たはミクロキャリアービーズ、例えばサイトデックス３
ビーズ上で集密するまで増殖させた後、ラットに注射し
てもよい。注射された線維芽細胞はＥＸＴ２産物を産生
し、その蛋白質の生物学的作用が宿主に導入される。前
記した説明および実施例に詳細に記載されている方法と
別の方法で本発明を実施することができるのは明らかで
ある。前記した教示を考慮すれば本発明にて多くの修飾
および変形をすることも可能であり、したがってそれら
も前記した特許請求の範囲の範囲内である。

【０１０７】

【配列表】

（１）一般情報 （ｉ）出願人： ホウナン・メディカル・ユニバーシテ
ィ （ｉｉ）発明の名称： ＥＸＴ２ （ｉｉｉ）配列の数： ２ （ｉｖ）連絡先住所： （Ａ）名宛人： スミスクライン・ビーチャム・コーポ
レーション （Ｂ）通り名： ７０９ スウェーデランド・ロード （Ｃ）都市名： キング・オブ・プロシア （Ｄ）州名： ペンシルベニア （Ｅ）国名： アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号： １９４０６ （ｖ）コンピューター読み取り可能フォーム： （Ａ）媒介タイプ： ディスケット （Ｂ）コンピューター： ＩＢＭ互換性 （Ｃ）オペレーティングシステム： ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ファーストＳＥＱ バージョン１.
５ （ｖｉ）現出願データ： （Ａ）出願番号 （Ｂ）出願日： １９９７年８月２８日 （Ｃ）分類： （ｖｉｉ）先の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （ｖｉｉｉ）代理人／代行者情報： （Ａ）名前： ウィリアム・ティ，ハン （Ｂ）登録番号： ３４３４４ （Ｃ）照会／証明番号： ＡＴＧ５００１９ （ｉｘ）テレコミュニケーション情報： （Ａ）電話： ６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）テレファックス： ６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：

【０１０８】（２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ： ３００３塩基対 （Ｂ）タイプ： 核酸 （Ｃ）鎖の数： １本 （Ｄ）トポロジー： 線形 （ｉｉ）分子タイプ： ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル： なし （ｉｖ）アンチセンス： なし （ｖ）フラグメントの型： （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載： 配列番号１： CTCGCCAGCC CAGACTCGGC CCTGGCAGTG GCGGCTGGCG ATTCGGACCG ATCCGACCTG 60 GGCGGAGGTG GCCCGCGCCC CGCGGCATGA GCCGGTGACC AAGCTCGGGG CCGAGCGGGA 120 GGCAGCCGTG GCCGAGGAGT GTGAGGAAGA GGCTGTCTGT GTCATTATGT GTGCGTCGGT 180 CAAGTATAAT ATCCGGGGTC CTGCCCTCAT CCCAAGAATG AAGACCAAGC ACCGAATCTA 240 CTATATCACC CTCTTCTCCA TTGTCCTCCT GGGCCTCATT GCCACTGGCA TGTTTCAGTT 300 TTGGCCCCAT TCTATCGAGT CCTCAAATGA CTGGAATGTA GAGAAGCGCA GCATCCGTGA 360 TGTGCCGGTT GTTAGGCTGC CAGCCGACAG TCCCATCCCA GAGCGGGGGG ATCTCAGTTG 420 CAGAATGCAC ACGTGTTTTG ATGTCTATCG CTGTGGCTTC AACCCAAAGA ACAAAATCAA 480 GGTGTATATC TATGCTCTGA AAAAGTACGT GGATGACTTT GGCGTCTCTG TCAGCAACAC 540 CATCTCCCGG GAGTATAATG AACTGCTCAT GGCCATCTCA GACAGTGACT ACTACACTGA 600 TGACATCAAC CGGGCCTGTC TGTTTGTTCC CTCCATCGAT GTGCTTAACC AGAACACACT 660 GCGCATCAAG GAGACAGCAC AAGCGATGGC CCAGCTCTCT AGGTGGGATC GAGGTACGAA 720 TCACCTGTTG TTCAACATGT TGCCTGGAGG TCCCCCAGAT TATAACACAG CCCTGGATGT 780 CCCCAGAGAC AGGGCCCTGT TGGCTGGTGG CGGCTTTTCT ACGTGGACTT ACCGGCAAGG 840 CTACGATGTC AGCATTCCTG TCTATAGTCC ACTGTCAGCT GAGGTGGATC TTCCAGAGAA 900 AGGACCAGGT CCACGGCAAT ACTTCCTCCT GTCATCTCAG GTGGGTCTCC ATCCTGAGTA 960 CAGAGAGGAC CTAGAAGCCC TCCAGGTCAA ACATGGAGAG TCAGTGTTAG TACTCGATAA 1020 ATGCACCAAC CTCTCAGAGG GTGTCCTTTC TGTCCGTAAG CGCTGCCACA AGCACCAGGT 1080 CTTCGATTAC CCACAGGTGC TACAGGAGGC TACTTTCTGT GTGGTTCTTC GTGGAGCTCG 1140 GCTGGGCCAG GCAGTATTGA GCGATGTGTT ACAAGCTGGC TGTGTCCCGG TTGTCATTGC 1200 AGACTCCTAT ATTTTGCCTT TCTCTGAAGT TCTTGACTGG AAGAGAGCAT CTGTGGTTGT 1260 ACCAGAAGAA AAGATGTCAG ATGTGTACAG TATTTTGCAG AGCATCCCCC AAAGACAGAT 1320 TGAAGAAATG CAGAGACAGC TCTTCATGGA ACCAGTCAGG AGAGAGAACT GGTCAGCTGC 1380 TAATCACCAA ATGAACTCCC TGATCTGGCC TAGGGAACAG TGGGATTCAC AGATTATCAA 1440 TGACCGGATC TATCCATATG CTGCCATCTC CTATGAAGAA TGGAATGACC CTCCTGCTGT 1500 GAAGTGGGGC AGCGTGAGCA ATCCACTCTT CCTCCCGCTG ATCCCACCAC AGTCTCAAGG 1560 GTTCACCGCC ATAGTCCTCA CCTACGACCG AGTAGAGAGC CTCTTCCGGG TCATCACTGA 1620 AGTGTCCAAG GTGCCCAGTC TATCCAAACT ACTTGTCGTC TGGAATAATC AGAATAAAAA 1680 CCCTCCAGAA GATTCTCTCT GGCCCAAAAT CCGGGTTCCA TTAAAAGTTG TGAGGACTGC 1740 TGAAAACAAG TTAAGTAACC GTTTCTTCCC TTATGATGAA ATCGAGACAG AAGCTGTTCT 1800 GGCCATTGAT GATGATATCA TTATGCTGAC CTCTGACGAG CTGCAATTTG GTTATGAGGT 1860 CTGGCGGGAA TTTCCTGACC GGTTGGTGGG TTACCCGGAT CGTCTGCATC TCTGGGACCA 1920 TGAGATGAAT AAGTGGAAGT ATGAGTCTGA GTGGACGAAT GAAGTGTCCA TGGTGCTCAC 1980 TGGGGCAGCT TTTTATCACA AGTATTTTAA TTACCTGTAT ACCTACAAAA TGCCTGGGGA 2040 TATCAAGAAC TGGGTAGATG CTCATATGAA CTGTGAAGAT ATTGCCATGA ACTTCCTGGT 2100 GGCCAACGTC ACGGGAAAAG CAGTTATCAA GGTAACCCCA CGAAAGAAAT TCAAGTGTCC 2160 TGAGTGCACA GCCATAGATG GGCTTTCACT AGACCAAACA CACATGGTGG AGAGGTCAGA 2220 GTGCATCAAC AAGTTTGCTT CAGTCTTCGG GACCATGCCT CTCAAGGTGG TGGAACACCG 2280 AGCTGACCCT GTCCTGTACA AAGATGACTT TCCTGAGAAG CTGAAGAGCT TCCCCAACAT 2340 TGGCAGCTTA TGAAACGTGT CATTGGTGGA GGTCTGAATG TGAGGCTGGG ACAGAGGGAG 2400 AGAACAAGGC CTCCCAGCAC TCTGATGTCA GAGTAGTAGG TTAAGGGTGG AAGGTTGACC 2460 TACTTGGATC TTGGCATGCA CCCACCTAAC CCACTTTCTC AAGAACAAGA ACCTAGAATG 2520 AATATCCAAG CACCTCGAGC TATGCAACCT CTGTTCTTGT ATTTCTTATG ATCTCTGATG 2580 GGTTCTTCTC GAAAATGCCA AGTGGAAGAC TTTGTGGGCA TGCTCCCAGA TTTAAATCCA 2640 GCTGAGGCTC CCTTTGTTTT CAGTTCCATG TAACAATCTG GAAGGAAACT TCACGGACAG 2700 GAAGACTGCT GGAGAAGAGA AGCGTGTTAG CCCATTTGAG GTCTGGGGAA TCATGTAAAG 2760 GGTACCCAGA CCTCACTTTT AGTTATTTAC ATCAATGAGT TCTTTCAGGG AACCAAACCC 2820 AGAATTCGGT GCAAAAGCCA AACATCTTGG TGGGATTTGA TAAATGCCTT GGGACCTGGA 2880 GTGCTGGGCT TGTGCACAGG AAGAGCACCA GCCGCTGAGT CAGGATCCTG TCAGTTCCAT 2940 GAGCTATTCC TCTTTGGTTT GGCTTTTTGA TATGATTAAA ATTATTTTTT ATTCCTTTTA 3000 AAA 3003

【０１０９】（２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ： ７２８アミノ酸 （Ｂ）タイプ： アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： １本 （Ｄ）トポロジー： 線形 （ｉｉ）分子タイプ： ぺプチド （ｉｉｉ）ハイポセティカル： なし （ｉｖ）アンチセンス： なし （ｖ）フラグメントの型： Ｎ−末端 （ｖｉ）起源： （ｘｉ）配列の記載： 配列番号２： Met Cys Ala Ser Val Lys Tyr Asn Ile Arg Gly Pro Ala Leu Ile Pro 1 5 10 15 Arg Met Lys Thr Lys His Arg Ile Tyr Tyr Ile Thr Leu Phe Ser Ile 20 25 30 Val Leu Leu Gly Leu Ile Ala Thr Gly Met Phe Gln Phe Trp Pro His 35 40 45 Ser Ile Glu Ser Ser Asn Asp Trp Asn Val Glu Lys Arg Ser Ile Arg 50 55 60 Asp Val Pro Val Val Arg Leu Pro Ala Asp Ser Pro Ile Pro Glu Arg 65 70 75 80 Gly Asp Leu Ser Cys Arg Met His Thr Cys Phe Asp Val Tyr Arg Cys 85 90 95 Gly Phe Asn Pro Lys Asn Lys Ile Lys Val Tyr Ile Tyr Ala Leu Lys 100 105 110 Lys Tyr Val Asp Asp Phe Gly Val Ser Val Ser Asn Thr Ile Ser Arg 115 120 125 Glu Tyr Asn Glu Leu Leu Met Ala Ile Ser Asp Ser Asp Tyr Tyr Thr 130 135 140 Asp Asp Ile Asn Arg Ala Cys Leu Phe Val Pro Ser Ile Asp Val Leu 145 150 155 160 Asn Gln Asn Thr Leu Arg Ile Lys Glu Thr Ala Gln Ala Met Ala Gln 165 170 175 Leu Ser Arg Trp Asp Arg Gly Thr Asn His Leu Leu Phe Asn Met Leu 180 185 190 Pro Gly Gly Pro Pro Asp Tyr Asn Thr Ala Leu Asp Val Pro Arg Asp 195 200 205 Arg Ala Leu Leu Ala Gly Gly Gly Phe Ser Thr Trp Thr Tyr Arg Gln 210 215 220 Gly Tyr Asp Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Glu Val 225 230 235 240 Asp Leu Pro Glu Lys Gly Pro Gly Pro Arg Gln Tyr Phe Leu Leu Ser 245 250 255 Ser Gln Val Gly Leu His Pro Glu Tyr Arg Glu Asp Leu Glu Ala Leu 260 265 270 Gln Val Lys His Gly Glu Ser Val Leu Val Leu Asp Lys Cys Thr Asn 275 280 285 Leu Ser Glu Gly Val Leu Ser Val Arg Lys Arg Cys His Lys His Gln 290 295 300 Val Phe Asp Tyr Pro Gln Val Leu Gln Glu Ala Thr Phe Cys Val Val 305 310 315 320 Leu Arg Gly Ala Arg Leu Gly Gln Ala Val Leu Ser Asp Val Leu Gln 325 330 335 Ala Gly Cys Val Pro Val Val Ile Ala Asp Ser Tyr Ile Leu Pro Phe 340 345 350 Ser Glu Val Leu Asp Trp Lys Arg Ala Ser Val Val Val Pro Glu Glu 355 360 365 Lys Met Ser Asp Val Tyr Ser Ile Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Gln 370 375 380 Ile Glu Glu Met Gln Arg Gln Leu Phe Met Glu Pro Val Arg Arg Glu 385 390 395 400 Asn Trp Ser Ala Ala Asn His Gln Met Asn Ser Leu Ile Trp Pro Arg 405 410 415 Glu Gln Trp Asp Ser Gln Ile Ile Asn Asp Arg Ile Tyr Pro Tyr Ala 420 425 430 Ala Ile Ser Tyr Glu Glu Trp Asn Asp Pro Pro Ala Val Lys Trp Gly 435 440 445 Ser Val Ser Asn Pro Leu Phe Leu Pro Leu Ile Pro Pro Gln Ser Gln 450 455 460 Gly Phe Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Asp Arg Val Glu Ser Leu Phe 465 470 475 480 Arg Val Ile Thr Glu Val Ser Lys Val Pro Ser Leu Ser Lys Leu Leu 485 490 495 Val Val Trp Asn Asn Gln Asn Lys Asn Pro Pro Glu Asp Ser Leu Trp 500 505 510 Pro Lys Ile Arg Val Pro Leu Lys Val Val Arg Thr Ala Glu Asn Lys 515 520 525 Leu Ser Asn Arg Phe Phe Pro Tyr Asp Glu Ile Glu Thr Glu Ala Val 530 535 540 Leu Ala Ile Asp Asp Asp Ile Ile Met Leu Thr Ser Asp Glu Leu Gln 545 550 555 560 Phe Gly Tyr Glu Val Trp Arg Glu Phe Pro Asp Arg Leu Val Gly Tyr 565 570 575 Pro Asp Arg Leu His Leu Trp Asp His Glu Met Asn Lys Trp Lys Tyr 580 585 590 Glu Ser Glu Trp Thr Asn Glu Val Ser Met Val Leu Thr Gly Ala Ala 595 600 605 Phe Tyr His Lys Tyr Phe Asn Tyr Leu Tyr Thr Tyr Lys Met Pro Gly 610 615 620 Asp Ile Lys Asn Trp Val Asp Ala His Met Asn Cys Glu Asp Ile Ala 625 630 635 640 Met Asn Phe Leu Val Ala Asn Val Thr Gly Lys Ala Val Ile Lys Val 645 650 655 Thr Pro Arg Lys Lys Phe Lys Cys Pro Glu Cys Thr Ala Ile Asp Gly 660 665 670 Leu Ser Leu Asp Gln Thr His Met Val Glu Arg Ser Glu Cys Ile Asn 675 680 685 Lys Phe Ala Ser Val Phe Gly Thr Met Pro Leu Lys Val Val Glu His 690 695 700 Arg Ala Asp Pro Val Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Pro Glu Lys Leu Lys 705 710 715 720 Ser Phe Pro Asn Ile Gly Ser Leu 725

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＥＸＴ２のヌクレオチド配列および推定アミ
ノ酸配列（配列番号１および２）を示す。

【図２】 ＥＸＴ２のヌクレオチド配列および推定アミ
ノ酸配列（配列番号１および２）を示す。

【図３】 ＥＸＴ２のヌクレオチド配列および推定アミ
ノ酸配列（配列番号１および２）を示す。

【図４】 ＥＸＴ２のヌクレオチド配列および推定アミ
ノ酸配列（配列番号１および２）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 チャオ・ホン・ファン アメリカ合衆国60647イリノイ州シカゴ、 ノース・サクラメント・アベニュー2636番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）配列番号２のアミノ酸からなるポリ
   ペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なく
   とも９６％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号２と同じアミノ酸をコードする遺伝コー
   ドの重複性によるポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドと相補性
   のポリヌクレオチド；からなる群より選択されるポリヌ
   クレオチドからなる単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示すヌクレオチドからなる
   請求項２記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号２に示すアミノ酸からなるポリ
   ペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオチ
   ド。
6. 【請求項６】 請求項２に記載のＤＮＡからなるベクタ
   ー。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のベクターからなる宿主
   細胞。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の宿主細胞から、前記し
   たＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現するこ
   とからなるポリペプチドの産生法。
9. 【請求項９】 細胞が請求項６に記載のベクターに含ま
   れるヒトｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを
   発現するように該細胞を該ベクターで形質転換またはト
   ランスフェクションすることからなるポリペプチドを発
   現する細胞の産生法。
10. 【請求項１０】 配列番号２のアミノ酸配列に対して少
    なくとも９６％同一であるアミノ酸配列からなるポリペ
    プチド。
11. 【請求項１１】 配列番号２に示すアミノ酸配列からな
    るポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    るアゴニスト。
13. 【請求項１３】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    る抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    るアンタゴニスト。
15. 【請求項１５】 治療上有効量の請求項１０記載のポリ
    ペプチドを患者に投与することからなるＥＸＴ２の必要
    性を有する患者の治療法。
16. 【請求項１６】 該ポリペプチドをコードするＤＮＡを
    患者に与え、該ポリペプチドをin vivoで発現させるこ
    とにより該治療上有効量のポリペプチドを投与する請求
    項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 治療上有効量の請求項１６記載のアン
    タゴニストを患者に投与することからなるＥＸＴ２ポリ
    ペプチド阻害の必要性を有する患者の治療法。
18. 【請求項１８】 請求項１０記載のポリペプチドをコー
    ドする核酸配列における突然変異を測定することからな
    る該ポリペプチドの発現に関係する疾患または疾患の疑
    いを診断する方法。
19. 【請求項１９】 宿主から由来する試料中の請求項１０
    記載のポリペプチドのレベルを分析することからなる疾
    患の診断方法。
20. 【請求項２０】 請求項１０記載のポリペプチドに対す
    るレセプターと結合し、それを活性化または阻害する化
    合物の同定法であって、 化合物の結合に応じて検出可能なシグナルを提供できる
    第二の成分を伴う該ポリペプチドに対するレセプターを
    表面に発現している細胞を、レセプターへの結合を可能
    とする条件下、スクリーニングすべき化合物と接触さ
    せ、 該化合物とレセプターとの相互反応から生じるシグナル
    の存在または不存在を検出して、化合物がレセプターと
    結合し、活性するか、阻害するかを測定することからな
    る方法。