JPH09511239A - 微生物ストレスタンパク質のペプチド断片、および炎症性疾患の治療および予防のためのそれらから作られる医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 自己免疫疾患、例えば糖尿病、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症および重症性筋無力症を含む炎症性疾患、または腫瘍もしくは移植拒絶による炎症性応答の予防または治療のために有用であるペプチドが、提供される。このペプチドは、保存された哺乳動物のストレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク質のアミノ酸配列の一部分を含有しており、そのペプチドでは、微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも２５％であり、そして、少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列の同一性が少なくとも３０％であり、該部分が、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープにおける同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する少なくとも５個のアミノ酸を含み、そのエピトープが、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む。これらのペプチドから得られたヌクレオチド配列、発現系、抗体および診断組成物が、同様に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物ストレスタンパク質のペプチド断片、および炎症性疾患 の治療および予防のためのそれらから作られる医薬組成物 発明の分野 本発明は、微生物および哺乳動物において保存された相同体をもつストレスタ ンパク質のアミノ酸配列の一部分を含有するペプチドであって、関節炎および他 の炎症性疾患に対して免疫化することができ、そして／またはそのような疾患を 治癒することができるペプチド、ならびにそのようなペプチドをコードしている ヌクレオチド配列、そのようなペプチドを発現する細胞および微生物、そしてそ のようなペプチドを含有する医薬および診断組成物に関する。 背景 ストレスタンパク質は、非ウイルス性感染に対して免疫を与えたり、または免 疫寛容を誘導することに有用であると記述されている。WO89/12455は、自己免疫 疾患、特に、類リウマチ関節炎に対する免疫予防のための微生物ストレスタンパ ク質を含むワクチンを開示している。 アジュバント関節炎（ＡＡ）は、ヒトのリウマチ様関節炎（ＲＡ）または反応 性関節炎の広く研究されたモデルである。ＲＡを起こす病原性機構がまだ不明で あるので、広範な使用は、実験的な齧歯類の関節炎モデルについて行われる。Ｌ ｅｗｉｓラットは、ＩＦＡ中に懸濁された熱殺菌Ｍ．ツベルクロシス（Ｍ．ｔｕ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ）（Ｍｔ）（アジュバント関節炎またはＡＡ）（１）、連 鎖球菌細胞壁（ＳＣＷ−関節 炎）、コラーゲンＩＩ型およびリポイド系アミンＣＰ２０９６１を含む種々の関 節炎原性調製物の投与による関節炎にかかりやすい。ＡＡ誘導の細胞的基礎は、 関節炎ラットからの脾細胞を用いて、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）ラットにその病気 を受動的に伝達することによって例証された（２）。Ｍｔ−反応性Ｔ細胞クロー ンＡ２ｂの投与による照射ナイーブラットにおける病気の誘導が報告された（３ ，４）。Ａ２ｂのＡｇ特異性は、ミコバクテリアの６５ｋＤａ熱ショックタンパ ク質（ｈｓｐ６５）の残基１８０〜１８８として同定された（５）。 欧州特許出願公開第262710号は、アミノ酸配列１７１〜２４０またはミコバク テリアｈｓｐ６５のそれらの部分に対応するペプチドを含む、自己免疫疾患に対 するワクチンを記している。欧州特許出願公開第322990号は、ｈｓｐ６５の配列 １８０−１８８に基づく類似のワクチンを記述している。ｈｓｐ６５のアミノ酸 配列１８０〜１８６に対応する変異ペプチドおよびそのような変異ペプチドに反 応性のＴ細胞が、Wo-A-9204049に開示されている。Wo-A-9403208によれば、ヒト ｈｓｐ６５の配列４５８〜４７４および４３７〜４４８、ならびにミコバクテリ アの類似体４３０〜４４６から得られる合成ペプチドは、弱い免疫原性抗原の免 疫原性を増強する。 ｈｓｐ６５だけを用いる免疫化によってＡＡを誘導する試みは、不成功である ことが証明された（５，６）。その代わりに、このアプローチは、続いて試みら れた全Ｍｔを用いるＡＡの誘導に対する耐性を確認した。この防御効果は、ｈｓ ｐ６５に特異的なＴ細胞によって仲介されると信じられる（７）。ミコバクテリ アｈｓｐ６５を用いる予備免疫化は、続いて、連鎖球菌細胞壁（８）、コラーゲ ンＩＩ型（６，９）、または ＣＰ２０９６１（６）およびプリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）（１０）のような 合成アジュバントを用いて誘導された別の型の実験的関節炎に対して防御を確実 にすると報告されている。 ミコバクテリアのｈｓｐ６５は、進化を通じて高度に保存されている熱ショッ クタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーに属し、そして哺乳動物の相同体、Ｐ１も しくはｈｓｐ６０と４８％の同一アミノ酸を共有する（１１）。哺乳動物ｈｓｐ ６０の発現は、種々のストレス刺激に対する生理的応答として上方制御されるこ とが知られており、そしてＲＡ（１２）または若年性慢性関節炎（ＪＣＡ，引用 文献１３）をもつ患者の炎症を起こした滑液中で高められることが分かった。 発明の記述 本発明は、炎症性疾患の予防および治療のための防御性エピトープは、領域が 微生物と哺乳動物の間で高度に保存されているストレスタンパク質の比較的短い 領域（アミノ酸約５〜１５個）に位置するという発見に基づいている。防御性エ ピトープにおける高度の同一性に加えて、そのタンパク質は、より一般的に、微 生物と哺乳動物の間で高度に保存されている。 用語「ストレスタンパク質」は、そのような炎症またはストレス状態の部位に 生存する細胞中で、炎症または他のストレス刺激の間に合成レベルの上昇を示す 酵素またはタンパク質を表すために、ここでは使用される。通常は、ストレスタ ンパク質は、例えば、細胞中で調節および代謝機能を発揮するために、構成的に 発現される。この記述で、「微生物ストレスタンパク質」は、哺乳動物ストレス タンパク質の微生物相同体として理解されるべきである。炎症は、感染、自己免 疫疾患、腫瘍成長、 移植拒絶または組織損傷に起因するであろう。他のストレス刺激は、上昇した温 度（４５℃まで）、薬物、重金属、外因性有機物質、オキシダント、細菌毒素、 ＬＰＳ、ストレス誘導リポタンパク質、分裂促進因子（ＰＨＡ，ＣｏｎＡ）およ びサイトカイン、例えばＩＬ１、ＩＬ２、ＴＮＦα，ＩＮＦαとβ、ＩＬ６およ びＩＬ１２を含む。 合成の上昇は、細胞によるそのようなタンパク質の分泌または放出レベルの上 昇、あるいは免疫系への提示レベルの上昇をみちびくことができる。合成の上昇 は、例えば、ｍＲＮＡレベルの上昇を測定するためのノザンブロッティングによ るか、あるいは細胞タンパク質を定量するための標準的アッセイを用いるか、タ ンパク質に特異的な抗体によるウエスタンブロッティングを用いることによりタ ンパク質の増加量を測定することによって検出できる。 ストレスタンパク質の保存は、微生物と哺乳動物のタンパク質の間で、全アミ ノ酸配列の同一性が、アミノ酸の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも４０ ％を示すものとして定義される。さらに、例えば１００までの少なくとも７５個 の連続するアミノ酸の領域が、微生物と哺乳動物の相同体の間で、アミノ酸の少 なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、そしてより好ましくは少なくと も５０％の配列同一性をもたねばならない。適用されてもよいさらなる基準は、 微生物と哺乳動物の相同体が、アミノ酸の少なくとも４０％、好ましくは少なく とも５０％、そしてより好ましくは少なくとも６０％の配列同一性をもつ、約１ ５までの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の少なくとも５つの領域を示すこ とである。 防御性ペプチドは、微生物のストレスタンパク質のＴ細胞エピトープ における同じアミノ酸として同じ相対的位置にある少なくとも５個のアミノ酸を 含む配列から得られるが、そのエピトープは、対応する哺乳動物のストレスタン パク質アミノ酸と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む。 かくして、本発明によるペプチドは、少なくとも、ストレスタンパク質のＴ細 胞エピトープに対応するアミノ酸５個を含む。さらに、本ペプチドは、微生物の ストレスタンパク質から得られても得れなくても、他の配列を含んでもよい。好 ましくは、本ペプチドは、ストレスタンパク質の完全なアミノ酸配列を含まない で、不十分な相同性をもつ少なくとも１種のエピトープを欠如している。かくし て、本ペプチドは、好ましくは、このエピトープが、対応する哺乳動物のストレ スタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも３個未満、特に４個未満の連続す るアミノ酸を含む場合には、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープに対応す る少なくとも５個のアミノ酸、特に少なくとも８個のアミノ酸の切片を含まない 。切り取られた切片は、例えば３０または５０個のアミノ酸までを含んでもよい 。また、そのような相同性の低いエピトープの２つ以上が、好ましくは、本発明 によるペプチドには存在しなくてもよい。 微生物および微生物体（ｍｉｃｒｏｂｅ）は、細菌のみならず原生動物および 真核生物寄生体を含む。哺乳動物は、ヒト、マウスおよびラットを含む。 ストレスタンパク質の例は、ストレスに誘導される酵素および非酵素タンパク 質を含む。 ストレスに誘導される酵素の特定の例は、アルドラーゼ、ヒト・アルドラーゼ と６０％相同性をもつＰ．ファルシパルム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐ ａｒｕｍ ）の４１ｋＤａタンパク質、ヒト・Ｇ−３−ＰＤと７０％相同性をもつ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−３−ＰＤ）、住血吸虫 抗原カテプシンＢおよびミオシン、ヒトの対応物と７１％相同性をもつエチノコ ッカス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）のシクロフィリン、スーパーオキシドジス ムターゼ（ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）とヒトのものの間で５ ０％以上の相同性）、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼである。さら に、ストレスに誘導される酵素は、例えば、Ｌｙｓ−ｔＲＮＡシンテターゼ、ス ーパーオキシドジスムターゼ（Ｚｎ−，Ｃｕ−およびＭｎ−依存性）、ｌｏｎ− プロテアーゼ、エノラーゼ、ユビキチン複合酵素（ＵＢＣ４およびＵＢＣ５）、 金属プロテイナーゼ：コラゲナーゼおよびストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓ ｉｎ）ヒト軟骨ｇｐ−３９（Hakala et al.，J．Biological Chem．268: 25803- 25810; 1993）およびオルニチンデカルボキシラーゼを含む。 スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）では、関節炎における防御力が、Ka kimotoら（Clin．Exp．Imm．94: 241-246，1993）によって発見された。ゼラチ ン複合ＳＯＤは、関節炎を抑制したが、一方、ピラン重合体に複合したＳＯＤは 、抑制しなかった。タンパク質としてのゼラチンは、Ｔ細胞エピトープを担持し 、ピラン重合体は担持しないので、保存ＳＯＤ分子への免疫応答は、発見された 関節炎抑制効果を説明できる。 非酵素タンパク質は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）、例えば、ミコバクテ リアｈｓｐ６５、ｈｓｐ６０（ＧｒｏＥＬ）、ＤｎａＪ、ｈｓｐ７０ファミリー （ＤｎａＫ）、ユビキチン、ｈｓｐ１０（ＧｒｏＥＳ） 、低分子量ＨＳＰ（２０〜３０ｋＤａ）、ｈｓｐ４７、ｈｓｐ５６、ＴＣＰ−１ （Ｔ複合体ペプチド）、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１０４／１１０を含む。 非酵素ストレスタンパク質のさらなる例として、ヒストンＨ３（J．Immun．14 2 : 1512，1989），ヒストンＨ２Ａ、キネシン関連タンパク質、酸性リボソーム タンパク質、クリスタリン、カルレチクリン（Kichalak et al.，Biochem．J．2 85 : 681-692）およびクラミジア（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ）の１８ｋＤａヒストン 様タンパク質が、挙げられてもよい。 １８ｋＤａクラミジア・ヒストン様タンパク質、ストレスに誘導される微生物 抗原は、反応性関節炎をもつ患者において、Ｔ細胞によって認識されることが示 された。自己免疫疾患の実験モデルで、細菌抗原への曝露が、防御的免疫応答に 導くことが発見された。ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐ ｅｒｔｕｓｓｉｓ ）もしくはミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ）は、実験的自己免疫脳脊髄炎（Ｅ ＡＥ）に対する防御を誘導できる（Lehman，Ben-Nun，J．Autoimm．5: 675，199 2）。Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）は、ラットにおける糖尿病を防御するであ ろう（M.W.J．Sadelain et al.，J．Autoimmun．3: 671-680; 1990）。 かくして、本発明は、炎症性疾患に対して防御を与えるペプチドに関しており 、そのペプチドは、保存された哺乳動物ストレスタンパク質の対応物をもつ微生 物タンパク質に対するＴ細胞エピトープの少なくとも一部分に対応する。 哺乳動物タンパク質それ自体の配列に基づくペプチドは、適切ではなく、その 理由は、そのようなエピトープの免疫原性の場合には、これら は、哺乳動物自己タンパク質全部を認識する防御応答を引き出さない潜在性エピ トープを構成するからであろう。この理由は、天然にプロセッシングされた自己 タンパク質のエピトープへの応答は、胸腺のネガティブ選択または抹梢（ｐｅｒ ｉｐｈｅｒａｌ）寛容にかけられるであろうという事実にあると信じられる。炎 症における防御効果は、実際に、哺乳動物の自己タンパク質に対する比較的低い 親和力の交差反応性応答を誘導する、微生物（相同性）エピトープを提示するペ プチドに限定されるであろう。そのような低親和力応答では、ネガティブ選択ま たは抹梢寛容は、存在しないであろう。 また、本発明は、前記定義のペプチドを生産する方法を提供するが、それは、 次の段階： ａ）微生物と哺乳動物の相同体の間の全体のアミノ酸配列の同一性が、少なくと も２５％、好ましくは少なくとも４０％あり、少なくとも７５個の連続するアミ ノ酸の領域の、微生物と哺乳動物の相同体の間の配列同一性が、少なくとも３０ ％、好ましくは少なくとも４０％またはちょうど５０％あり、そして少なくとも １０個の連続するアミノ酸の少なくとも５つの領域の、微生物と哺乳動物の相同 体の間の配列同一性が、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％または ちょうど６０％ある、保存された哺乳動物ストレスタンパク質相同体をもつ微生 物タンパク質を選択すること； ｂ）該ストレスタンパク質の一連の少なくとも４個の連続するアミノ酸が、選択 された微生物タンパク質の一連のアミノ酸および哺乳動物ストレスタンパク質の 対応する一連のアミノ酸両方と同一である、該ストレスタンパク質の同じアミノ 酸として同じ相対的位置に存在する少なくと も５個のアミノ酸を含むペプチドを調製すること； ｃ）研究下の集団の各個体すべてによる必要はないが、１個以上の各個体による Ｔ細胞応答によって立証されるように、調製されたペプチドをＴ細胞エピトープ の存在についてスクリーニングすること； を含む方法である。 本ペプチドを開発するためのこの方法は、高度に保存された酵素グリセルアル デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３−ＰＤ）に関して例示できる： １）タンパク質配列の整列。 使用される微生物タンパク質のアミノ酸配列が、まず、配列番号：２および３お よび図１４のＧ３−ＰＤタンパク質について示されるように、哺乳動物（例えば ラット）相同体の配列とともに整列させれる。 ２）相同性基準にしたがうエピトープの選択。 細菌の配列が、哺乳動物のタンパク質配列内の同じ相対的位置における対応する 残基と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む領域が検索される（ 例えば、領域２−５，７−１４，７６−７９，９２−９７，１１６−１２１，１ ３０−１３４，１４７−１５８なと、３２１−３２５まで、配列番号：２および ３および図１４、参照）。次いで、合成ペプチドが、微生物の配列（アミノ酸５ 〜３０個）と同一になるように調製されるが、各ペプチドは、これらの同一領域 の少なくとも４個のアミノ酸と重複している（例えば、ペプチド５０−７９、９ ２−１２１，１３０−１３４，１６７−１７８，３２１−３３３）。 ３）選択された配列のＴ細胞エピトープ特性の決定。 このように選ばれた合成ペプチドは、例えば次のような操作によって、 細菌Ｇ３−ＰＤタンパク質分子中の個々のエピトープを同定するために使用され る。 ａ）細菌Ｇ３−ＰＤタンパク質全体による免疫化の後、ペプチドに対するＴ細胞 応答が追跡され、個々のＴ細胞エピトープが、選ばれたペプチド内に含有されて いるか否かを決定される。 さらに、保存細菌タンパク質への免疫は、細菌抗原による初期感作によって既に 存在していると思われるので、エピトープは、前以ての免疫化なしに、ペプチド に対する二次のＴ細胞応答を直接イン・ビトロでスクリーニングすることによっ て検出できる。 ｂ）あるいはまた、これらのペプチドによる免疫化によって、微生物Ｇ３−ＰＤ タンパク質に対する配列に特異的なＴ細胞応答を誘導するそれらの能力は、それ らのＴ細胞エピトープの特性を明らかにするであろう。可能性のあるエピトープ の前以ての予測は、既知のＭＨＣ（ＨＬＡ）結合特性を基になされる。 あらゆる場合におけるイン・ビトロのスクリーニング法は、標準のリンパ球増殖 アッセイの使用によって遂行できる。あるいは、Ｔ細胞活性化の他の兆候は、サ イトカインの生産、Ｃａ２＋フラックス、細胞体拡大、および細胞表面マーカー の増加または変化として測定できる。 Ｔ細胞エピトープの特定は、患者、健康な個人および／または予防接種され／特 異的に免疫された個体においてすることができる。 ４）相同な自己タンパク質と交差反応するＴ細胞を誘導する選ばれたエピトープ の能力を決定する。 確定した微生物エピトープを用いてイン・ビトロで活性化されたＴ細胞は、次に 、相同な自己タンパク質（ラット・モデルにおいては、ストレ スを受けた細胞または組織からの組み換えタンパク質または精製タンパク質とし てか、あるいはストレスを受けた抗原提示細胞上の高レベルのＭＨＣ−ペプチド 複合体としてかのいずれかの、ラットＧ３−ＰＤ）または相同ペプチドを用いて 再刺激することができる。活性化（３の記述参照）のいずれの兆候も、自己タン パク質と微生物エピトープの交差反応性の指標として受け取ることができる。初 発試験は、自己タンパク質の相同配列に基づく合成ペプチドを用いて実施できる が、単離された形でも細胞上に発現された形でもいずれにおいても、タンパク質 自体との交差反応性の最終的証明が、潜在性エピトープを排除するために得られ ねばならない。 本発明によるペプチドは、例えば、ミコバクテリウム・ツベルクロシスの熱シ ョックタンパク質ｈｓｐ６５のＴ細胞エピトープの少なくとも一部分に対応する ことができる。例えばＬｅｗｉｓラットでは、ｈｓｐ６５のＴ細胞エピトープは 、配列番号：１に示されるミコバクテリアのｈｓｐ６５配列の、アミノ酸残基そ れぞれ９１−１００，１７６−１９０，２１６−２２５，２２６−２３５，２５ ６−２６５，３８６−４００，３９６−４０５，４４６−４５５および５１１− ５２０によってほぼ特定される領域に位置する。上記以外のＴ細胞エピトープの 存在も排除されない。 配列番号：１の配列２５６−２７０に対応するペプチドによるラットの免疫化 は、アジュバント関節炎（ＡＡ）の７日後の誘導に対して強い防御を誘導するこ とが分かった。配列番号：１の配列８６−１００に対応するペプチドによる免疫 化は、穏やかな防御を誘導したが、一方、他のエピトープに対応するペプチドに よる免疫化は、アジュバント関節炎 に対して防御をほとんどもしくは全く誘導することがなかった。 また、ｈｓｐ６５免疫ラットから最初に生成され、エピトープ２５６−２６５ に特異的なＴ細胞株Ｈ．５２は、ミコバクテリウム・ツベルクロシスの投与時に ｉ．ｖ．注射された場合、ＡＡ発症に対して防御効果を示した。 このことから次のことが結論される。すなわち、微生物ｈｓｐ６５中の防御ペ プチドは、対応する哺乳動物ｈｓｐ６０のアミノ酸と同一である少なくとも４個 の連続するアミノ酸を含有している微生物ｈｓｐ６５のＴ細胞エピトープにおい て、少なくとも５個のアミノ酸が、同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在す る位置に置かれているということである。ヒト、ラット、マウスおよびミコバク テリアのｈｓｐ６０／ｈｓｐ６５アミノ酸配列は、図１３の一文字コードにおい て示される。「対応する哺乳動物ｈｓｐ６０アミノ酸と同一」は、問題のアミノ 酸が、ヒト、ラットまたはマウスいずれかのｈｓｐ６０において同じ位置に存在 するアミノ酸と同一であることを意味すると理解される。 ペプチドは、具体的には、配列番号：１の配列８１−１００および２４１−２ ７０の１つにおいて同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する５個のアミノ 酸をもち、より具体的には、配列番号：１の配列８４−９５および２５６−２６ ５の１つにおいて同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する少なくとも５個 のアミノ酸をもつものである。好適には、ペプチドは、ｈｓｐ６５Ｔ細胞エピト ープのアミノ酸と同じ相対的位置をもつ少なくとも６個か、ちょうど７個のアミ ノ酸を含む。これらのエピトープは、特に、対応する哺乳動物ｈｓｐ６０のアミ ノ酸と同一である少なくとも４個の連続するアミノ酸をもつものである。適切な ペプチドの例は、配列［Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ］、［Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ］および［Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ］を含む。特に、ペプチドは、ｈｓｐ６５のアミノ酸配列の５〜３０個 のアミノ酸を含む。ｈｓｐ６５アミノ酸は、スペーサー配列または融合ペプチド 配列のような他の配列に結合されていてもよい。 ペプチドは、糖尿病、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症お よび重症性筋無力症のような自己免疫疾患を含む炎症性疾患の治療および予防の ために適切である。また、移植拒絶を起こす炎症過程も、ペプチドによって抑制 されるであろう。 また、本発明は、前記ペプチドの免疫学的性質を示すが、１つ以上の化学的改 変を含むペプチド類似体に関する。そのようなペプチド類似体は、また、ペプチ ド疑似体とも言われ、例えば、本質的に同じ側鎖基が存在するが、骨格が、ＣＨ ＝ＣＨ，ＣＯ−Ｏ，ＣＯ−ＣＨ₂もしくはＣＨ₂−ＣＨ₂のようなその他の基によ るアミド基（ＣＯ−ＮＨ）の置換のような改変を含む、前記ペプチドのアミノ酸 残基に対応する単位からなることができる。他の改変、例えば、類似の天然もし くは非天然アミノ酸によるアミノ酸の置換も考えられる。これに関して、「類似 の」は、ほぼ同じサイズ、電荷および極性もつことを意味し；したがって、脂肪 族アミノ酸アラニン、バリン、ノルバリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイ シンおよびメチオニンが、類似と考えることができ；同様に、リジン、アルギニ ン、オルニチン、シトルリン、アスパラギンおよびグルタミンのような塩基性な いし中性の極性アミノ酸が、本目的のために類似であり；同じことが、アスパラ ギン、アスパラギン酸、グルタミン、 グルタミン酸、セリン、ホモセリンおよびスレオニンのような酸性ないし中性の 極性アミノ酸に適用される。 前記ペプチドは、そのままで使用されても、またはそれらの抗原性もしくは免 疫原性を増強する配列に結合されてもよい。そのような配列は、トキソイドもし くは免疫グロブリンの一部を含んでもよい。また、ペプチドは、ＭＨＣ分子との 複合体として使用されても、そして／またはリポソーム中に組み込まれてもよい 。また、ペプチドは、免疫刺激のためのベクターとしての他の分子または全細胞 に共有結合されてもよい。ペプチドは、単量体、二量体もしくは多量体の形で存 在してもよい。 また、本発明は、前記ペプチドをコードしているヌクレオチド配列にも関する 。そのようなヌクレオチド配列は、ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープに対 応する領域をコードしている１５個以上のヌクレオチドを含有してもよい。スト レスタンパク質のヌクレオチド配列は、既知であるか、または慣用の手段で決定 できる。例として、ｈｓｐ６５をコードしているミコバクテリウム・ツベルクロ シス遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号：１に示される。適切なヌクレオチ ド配列の例は、配列番号：１の配列２７１−２８５，７６６−７８０および７６ ９−７８３、および縮重配列そしてこれらの配列とハイブリダイズする配列を含 む。本発明によるヌクレオチド配列は、そのままで使用されても、またはイン・ ビボで免疫するペプチドを産生するためにのワクチン材料として、ベクター配列 に組み込まれてもよい（「裸のＤＮＡアプローチ」）。 また、本発明により提供されるものは、プロモーター配列および他の調節配列 の作動制御下で、ストレスタンパク質をコードしている配列の一部分に対応する ヌクレオチド配列を含む前記ペプチドを発現できる発 現系である。その発現系は、ベクター有機体、または細胞、特に真核細胞中に存 在することができ、そして大規模に本発明によるペプチドを生産するために使用 できる。 また、本発明は、前記ペプチドを用いる免疫刺激によって活性化されるオート ロガスＴ細胞またはＴ細胞レセプターを発現している他の細胞、またはそのよう なＴ細胞由来のそれらの部分を提供する。 また、本発明は、前記ペプチドに向けられる抗体、特にモノクローナル抗体に 関する。抗体は、既知の方法を用いて、例えばハイブリドーマ技術によって生産 できる。抗体は、受動ワクチンとしても、診断道具としても使用される。 さらにまた、本発明は、前記ペプチド、またはそのようなペプチドに対応し、 そして／またはそのようなペプチドをコードしているヌクレオチド配列、発現系 、細胞（真核）もしくは微生物を含有する、自己免疫疾患、糖尿病、関節炎疾患 、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症および重症性筋無力症を含む炎症性疾 患の予防または治療のために適切な医薬組成物に関する。その組成物は、ワクチ ンの剤形であってもよく；次にまた、それは、常用アジュバント、例えばＡｌｕ アジュバント、Ｉｓｃｏｍ，フロイントの完全もしくは不完全アジュバントまた は他のアジュバント、そして／またはキャリアー材および他の添加物を含有でき る。 組成物は、特に、発症しつつあるか発症した炎症性疾患を治癒するために適切 な医薬品の剤形で存在してもよく；それは、常用の添加物および添加剤を含有す る。治療用組成物として、それは、また、前記ペプチドに対する抗体を含有して もよい。本発明によるワクチンおよび薬物は、 例えば、非経口、経口または経鼻投与に適切な剤形であってもよい。 また、本発明は、前記ペプチドに基づく診断手段および方法、あるいはそれら が、炎症部位におけるペプチド（エピトープ）配列の特異的発現を測定するため に使用できるような対応する抗体またはヌクレオチド配列（プローブ）に関する 。また、ペプチドが、診断目的のために、Ｔ細胞増殖またはＴ細胞のサイトカイ ン産生を測定するアッセイに使用される方法も、考えられる。 この記述において使用される略語： ＡＡ： アジュバント関節炎 Ａｇ： 抗原 ＡＰＣ： 抗原提示細胞 ＤＤＡ： 臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム Ｄｈｂｔ： ３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３− ベンゾトリアジン ＦＡＣＳ： 蛍光標示式細胞分取器 ＦＣＳ： ウシ胎児血清 ＦＩＴＣ： フルオレセインイソチオシアネート Ｆｍｏｃ： ９−フルオレニルメトキシカルボニル Ｈｏｂｔ： Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール ｈｓｐ６０： 哺乳動物の６０ｋＤａ熱ショックタンパク質 ｈｓｐ６５： ミコバクテリアの６５ｋＤａ熱ショックタンパク質 ＩＦＡ： 不完全フロイントアジュバント ＪＣＡ： 若年性慢性関節炎 ２−ＭＥ： ２−メルカプトエタノール ＭＨＣ： 主要組織適合遺伝子複合体 Ｍｔ： 熱殺菌ミコバクテリウム・ツベルクロシス ＰＡＬ： ペプチドアミドリンカー（商標） ＰＢＳ： リン酸塩緩衝化生理食塩水 Ｐｆｐ： ペンタフルオロフェニル ＰＰＤ： Ｍ．ツベルクロシスの精製タンパク質誘導体 ＰＬＮＣ： 感作リンパ節細胞 ＲＡ： リウマチ性関節炎 ＴＣＧＦ： Ｔ細胞成長因子 ＴｄＲ： ［³Ｈ］チミジン 材料および方法 動物： 雄の近交系Ｌｅｗｉｓラット（ＲＴ１ Ｂ¹ ＭＨＣハプロタイプ） は、The University of Limburg，Maastricht，The Netherlandsから得られた。 ラットは、各実験の開始時には５〜８週令であった。 抗原およびアジュバント： 熱殺菌ミコバクテリウム・ツベルクロシス菌株Ｈ ３７Ｒａ（Ｍｔ）は、Difcoから得られた。Ｍ．ツベルクロシスの精製タンパク 質誘導体（ＰＰＤ）およびＭ．ボビスの精製組み換えｈｓｐ６５（Ｍ．ツベルク ロシスｈｓｐ６５と同一である）は、親切にもDr．J.D.A．van Embden，Nationa l Institute of Public Health and Environmental Protection，Bilthoven，Th e Netherlandsによって提供された。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ，D ifco）および臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ，Eastman Koda k，Rochester，NY，引用文献１８）が、アジュバントとして使用された。ＤＤＡ は、ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍｌの懸濁液として調製され、そして音波処 理して、免疫化の前にＡｇ溶液と１：１に混合されるゲルを作成した。 合成ペプチド： ペプチドは、自動同時多ペプチド合成（ＳＭＰＳ）によって 調製された。ＳＭＰＳの開始は、既述の標準オートサンプラー（Ｇｉｂｓｏｎ ２２１）を用いて起こされた（１９）。簡単に言えば、ペプチドの同時合成のた めに、６倍モル過剰のＰｆｐ−活性化アミノ酸（セリンおよびスレオニンではＤ ｈｂｔ）および触媒としてのＨｏｂｔを用いる標準Ｆｍｏｃ化学作用が使われた 。ペプチドは、６ｍｇ樹脂／ペプチド（０．３３ｍｅｑ／ｇＰＡＬ樹脂、Millip ore）からＣ−末端アミドとして得られた。Ｍｔ・ｈｓｐ６５（２０）およびラ ットｈｓｐ６０（２１）の配列を基に、２つのペプチドパネルが合成された。ペ プチドは、各々隣接するペプチドと１０個のアミノ酸が重複した１５量体（すな わち、１−１５，６−２０，１１−２５など）であった。かくして、各タンパク 質の各々可能性のある１１量体の配列が、１個のペプチド内に含まれた。 免疫化および感作リンパ節細胞集団： ラットは、Ｍｔまたはｈｓｐ６５のい ずれかで免疫された。Ｍｔは、ＩＦＡもしくはＤＤＡ中５ｍｇ／ｍｌに懸濁され 、１００μｌが、各後足しょに注射された（すなわち、５００μｇ／足しょ、１ ｍｇ／ラット）。ｈｓｐ６５（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）は、ＤＤＡと１：１に混 合され、１００μｌが注射された（すなわち、５０μｇ／足しょ、１００μｇ／ ラット）。１０〜２１日後、分泌している（ｄｒａｉｎｉｎｇ）膝窩筋のリンパ 節が、採取され、砕かれ、３回洗浄され、そして感作リンパ節細胞（ＰＬＮＣ） 源として使用された。対照実験では、非免疫ラットからの脾細胞およびリンパ節 、そしてＩＦＡまたはＤＤＡ／ＰＢＳのみで免疫されたラットからのＰＬ ＮＣが使用された。 合成ペプチドを用いる免疫化および感作リンパ節細胞： ラットは、ＰＢＳ／ ＤＤＡ中合成ペプチド５０μｇを用いて、各後足しょにおいて免疫された（すな わち、５０μｇ／足しょ、１００μｇ／ラット）。１０日後、分泌している膝窩 筋のリンパ節が、採取され、砕かれ、３回洗浄され、そして感作リンパ節細胞（ ＰＬＮＣ）源として使用された。ある実験では、ＰＬＮＣは、Ｍｔ免疫化後３５ 〜４２日のＡＡラットからプールされる鼠径部および膝窩筋のリンパ節として得 られた。 組織培養試薬： ５％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシ リン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべてGibco製）および５ｘ１０^{- 5} Ｍ２−ＭＥを補足したＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ，Gib co）が、培養基として使用された。細胞集団は、補足物なしのＩＭＤＭ中で洗浄 された。 Ｔ細胞増殖アッセイ： ＰＬＮＣは、２００μｌ平底ミクロタイターウェル（ Costar）中、抗原添加または無添加で、１ウェル当たり２ｘ１０⁵細胞において 、３並列で培養された。最初の実験では、ＰＬＮＣは、濃度５および２０μｇ／ ｍｌの各ペプチド、および一定濃度範囲にわたるＭｔ、ｈｓｐ６５およびＰＰＤ に対する応答性に関して試験された。コンカナバリンＡ（２μｇ／ｍｌ）は、Ｔ 細胞増殖に対するポジティブ対照として使用された。培養物は、加湿された５％ ＣＯ₂雰囲気下で３７℃９６時間、培養された。培養物は、最後の１６時間［³Ｈ ］ＴｄＲ（Amersham，U.K.， １μＣｉ／ウェル）を用いてパルスラベルされ、 そしてＴｄＲ取り込みが、液体シンチレーションβカウンターを用いて測定され た。Ｔ細胞株を用いるアッセイは、照射（３０Ｇｙ）された同 系の補助細胞（３ｘ１０⁵脾細胞／ウェルまたは１０⁶胸腺細胞／ウェルのいずれ か）とともに２ｘ１０⁴系統細胞／ウェルを用いて行われた。結果は、３並列培 養の１分間当たりの平均カウント（ｃｐｍ）として表された。Ａｇに対する応答 が低い場合の実験では、刺激指数（Ｓ．Ｉ．＝Ａｇ添加の平均ｃｐｍ−Ａｇ無添 加の平均ｃｐｍ）が、２を超え、そしてＳｔｕｄｅｎｔのｔ試験が、ｐ＜０．０ １を与えたならば、応答は、有意と考えられた。 Ｔ細胞株： ミコバクテリアのｈｓｐ６５またはペプチドに特異性をもつＴ細 胞株は、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣまたはＭｔ−ＰＬＮＣのいずれかのバルク刺激に よって生成された。ＰＬＮＣは、Ａｇ１０μｇ／ｍｌ存在下で２％正常ラット血 清（ＮＲＳ）を補足した培養基中、５ｘ１０⁶／ｍｌで培養された。３日後、生 存細胞が、ｆｉｃｏｌＩ−ｉｓｏｐａｑｕｅ勾配を用いて収穫され、そしてさら に４日間、培養基＋５％ＦＣＳおよび５％ＴＣＧＦ（ＣｏｎＡ−活性化ラット脾 臓上澄液）において培養された。最初の刺激後７日に、細胞株は、培養基＋ＮＲ Ｓ中の照射脾臓補助細胞およびＡｇにより再刺激された。細胞株は、この７日の 再刺激サイクルにおいて維持された。 短期のエピトープ特異的Ｔ細胞株は、また、合成ペプチドで免疫されたラットか ら生成された。ペプチド−ＰＬＮＣは、ペプチド１０μｇ／mlの存在下で上記の ように培養された。 モノクローナル抗体： 抗−ＭＨＣモノクローナル抗体は、ｈｓｐ６５および ペプチドに対する応答のＭＨＣ−限定を決定するために増殖アッセイに添加され た。ＯＸ６（抗−ＲＴ１．Ｂ，クラスＩＩ）、ＯＸ１７（抗−ＲＴ１．Ｄ，クラ スＩＩ）、ＯＸ１８（抗−ＲＴ１．Ａ，クラス Ｉ）およびＵＤ１５（抗−クロラムフェニコール対照抗体）が、使用された。す べての抗体は、マウスＩｇＧ１であった。 ＦＡＣＳ分析： ＦＡＣＳ分析は、表現型Ｔ細胞株に対して使用された。細胞 は、Ｒ７３（抗−αβＴＣＲ）、Ｗ３／２５（抗−ＣＤ４）またはＯＸ８（抗− ＣＤ８）、すべてのマウスＩｇＧ１抗体とともに培養された。第２段階の染色は 、ＦＩＴＣ−複合ヒツジ抗−マウスＩｇ（Becton，Dickinson）を用いて行った 。細胞は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ分析器を用いて 分析された。 実験的関節炎の誘導および臨床評価： 関節炎は、尾の基部に単回皮内注射に よって誘導された。ＡＡは、ＩＦＡ１００μｌ中に懸濁されたＭｔ０．５ｍｇを 用いて誘導された。ＣＰ２０９６１関節炎は、軽鉱油（Sigma）１００μｌ中Ｃ Ｐ２０９６１ ２ｍｇを用いて誘導された。ラットは、関節炎の臨床徴候につい て毎日検査された。関節炎の重篤度は、関節の腫脹、紅斑および変形の程度に基 づき各足に０〜４をスコアすることによって評価された。かくして、最大可能な 関節炎スコアは、１６であった。 ｈｓｐ６５ペプチドおよびエピトープに特異的Ｔ細胞株による関節炎の変調： ミコバクテリアのｈｓｐ６５に存在する８種のＴ細胞エピトープに対応する合 成ペプチドが、関節炎の発症における防御効果について試験された。ラットは、 関節炎誘導前７日に、各々のペプチド１００μｇを用いて免疫された。ペプチド は、１０ｍｇ／ｍ１ＤＤＡ（５０μｌ／足しょ）で各後足しょでにおいて免疫さ れた。対照のラットは、ＰＢＳ／ＤＤＡのみを受けた。また、エピトープ特異的 Ｔ細胞株は、関節炎誘導時点で、細胞株の静脈内投与によって防御活性を試験さ れた。Ｔ 細胞株は、イン・ビトロで照射脾臓ＡＰＣおよび特異的ペプチドによって再刺激 された。４日後、Ｔ細胞芽球が、ｆｉｃｏｌｌ勾配によって収穫され、洗浄され 、そして第２回のｆｉｃｏｌｌ勾配にかけられて、すべての混入しているＡＰＣ を除かれた。Ｔ細胞は、洗浄培地で２回そしてＰＢＳで２回洗浄され、最後にＰ ＢＳ中に２．５ｘ１０⁷／ｍｌで懸濁された。Ｍｔ２００μｌ（すなわち、５ｘ １０⁶）の注射直前に、Ｔ細胞は、尾静脈にｉ．ｖ．注射された。 結果 Ｍｔ、ＰＰＤおよびｈｓｐ６５に対する初期感作リンパ節細胞の応答。 ｈｓｐ６５による免疫化は、ｈｓｐ６５に対する応答性を感作した。また、Ｐ ＰＤ（生来のｈｓｐ６５を含有する）は、組み換えｈｓｐ６５による免疫化が、 生来のミコバクテリアｈｓｐ６５を認識するＴ細胞を活性化したことを示すＴ細 胞増殖を誘導した。ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣは、ＤＤＡ／ＰＢＳ−ＰＬＮＣに比較 してＭｔに対する応答性の増大を示した。ｈｓｐ６５に対するｈｓｐ６５−ＰＬ ＮＣ増殖応答は、培養物へのＯＸ６モノクローナル抗体の添加によって効果的に 阻害されたので、このことは、応答が、ＲＴ１．Ｂ¹ ＭＨＣクラスＩＩ分子に 顕著に（全体的ではなくても）限定されることを指している（図２）。有意な阻 害は、抗−ＲＴ１．Ｄ、抗−ＲＴ１．Ａまたは抗−クロラムフェニコール・イソ タイプ対照ｍＡｂｓを用いては見られなかった。 ｈｓｐ６５による免疫化に続くｈｓｐ６５Ｔ細胞エピトープの同定。 ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣが、ｈｓｐ６５の完全配列をカバーしているペプチドの パネルに対する応答性に関して分析された（図３ａ）。数種のペプチドは、有意 な増殖を誘導したので、これは、７種のエピトープの 存在を示唆する。応答の大きさの項において、分子の３領域（残基１７６−１９ ０，２１１−２３０および２２１−２４０）が、「強力な（ｄｏｍｉｎａｎｔ） 」Ｔ細胞エピトープを含むとみられたが、一方、領域８６−１００，２５１−２ ７０，３９６−４１０および５０６−５２５は、「準強力な（ｓｕｂｄｏｍｉｎ ａｎｔ）」または弱い（ｍｉｎｏｒ）エピトープを含んでいた。これらのエピト ープの４種（２１１−２３０，２２１−２４０，２５１−２７０および５０６− ５２５）については、隣接して重複するペプチドに対する応答が見られ、コアエ ピトープが、それぞれ２１６−２２５，２２６−２３５，２５６−２６５および ５１１−５２０内にあることを示唆した。 ペプチト１７６−１９０は、ＡＡ−関連エピトープ１８０−１８８を含有した 。また、合成ペプチド１８０−１８８が、試験された。それは、応答を誘導する が、比較的長い１７６−１９０ペプチドよりも低いレベルにおいてであることが 分かり、これは、最小のエピトープが、ＰＬＮＣレベルではほとんど有効な刺激 を与えないことを示した。 ＰＬＮＣ応答は、免疫後１０，１４および２１日に試験された。応答は、１０ 日目に最強であり、時間とともに下降した。強さのパターンは、一定して残り、 そして別のペプチドに対する「新しい」応答は、２１日目には観察されなかった 。最初の実験は、数匹の免疫ラットからのプールされたＰＬＮＣを使用した。個 々のラットの応答性を試験する実験は、応答性のパターンにおいて、ラット間の 差異を示さなかった。また、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣを刺激したペプチドは、未感 作の脾細胞およびＤＤＡ／ＰＢＳ−ＰＬＮＣにおいて試験され、そして刺激活性 をもたないことが分かったが、このことは、ｈｓｐ６５による免疫化が、ペプチ ドに 誘導される応答には初期感作を必要とすることを示唆した。 また、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣが、ラットｈｓｐ６０の完全配列をカバーしてい るペプチドのパネルに対する応答を試験された。ラットｈｓｐ６０のいずれも、 免疫後１０または１２日に試験されたｈｓｐ６５−ＰＬＮＣにおいて有意な応答 を誘導しなかった。 ＰＬＮＣレベルで同定されたｈｓｐ６５Ｔ細胞エピトープの存在を確認するた めに、短期Ｔ細胞株が、ｈｓｐ６５によるバルク刺激によって１０日目のｈｓｐ ６５−ＰＬＮＣから確立された。最初の再刺激後７日に、これらの細胞株は、ｈ ｓｐ６５ペプチドの完全パネルに対して試験された（図３ｂ）。得られた応答パ ターンは、最初のＰＬＮＣ集団のパターンに類似していた。３種の強力なエピト ープ、１７６−１９０，２１６−２２５および２２６−２３５は、すべて強い応 答を誘導し、そしてエピトープ２５６−２６５，３９６−４１０および５１１− ５２０も、また認識された。ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣを刺激できなかった２種のエ ピトープ（３８６−４００および４４６−４６０）は、ｈｓｐ６５−特異的な細 胞株を刺激した。 全Ｍ．ツベルクロシスによる免疫化に続くｈｓｐ６５エピトープに対 するＴ細胞応答。 Ｍｔ−ＰＬＮＣが、ｈｓｐ６５ペプチドに対する応答について試験され、全Ｍ ｔによる免疫化が、前記ｈｓｐ６５エピトープに対する応答性を初期感作できた かどうか決定した。Ｍｔ／ＩＦＡによる免疫化（すなわちＡＡ−誘導法）は、ｈ ｓｐ６５ペプチドに対する有意な応答を、常には誘導できなかった。Ｍｔ／ＩＦ Ａ免疫化は、ｈｓｐ６５に対する低レベルの反応性のみを誘導したので（図１） 、ＤＤＡと混合されたＭｔ により免疫されたラットからのＰＬＮＣが試験された。この方法（１ラット当た りＭｔ５００μｇまたは１ｍｇを用いる）は、ｈｓｐ６５に対する反応性の増大 、およびｈｓｐ６５ペプチドに対する有意な応答を示すＰＬＮＣを生産した（図 １および４ａ）。その応答パターンは、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣを用いて得られた パターンとは相異した。エピトープ１７６−１９０は、強力であるように見え、 エピトープ２１６−２２５，２２６−２３５，２５６−２６５および５１１−５ ２０は、弱く、そしてエピトープ８６−１０５および３９６−４１０に対する応 答は欠如した（図４ａ）。 確定したｈｓｐ６５エピトープに特異的なＴ細胞株の解析。 Ｔ細胞株は、個々の合成ペプチドによるｈｓｐ６５−ＰＬＮＣの再刺激によっ て生成された。応答が、２種の重複しているペプチドに対して検出されたエピト ープでは、細胞株は、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣの最も強い増殖を誘導したペプチド （例えば、エピトープ２１６−２２５では、ペプチド２１１−２２５が使用され た）を用いて生成された。これは、８種のＴ細胞株をもたらした。表Ｉは、各エ ピトープに対する応答パターンを総括し、そして各ペプチドに特異的なＴ細胞株 を命名する。ペプチド３８６−４００に特異的な細胞株は、確立されなかった。 少なくとも４回のイン・ビトロの再刺激の後、各細胞株が、特異的なペプチド、 ｈｓｐ６５、ＭｔおよびＰＰＤに対する応答性を試験された。自己ｈｓｐ６０と の交差反応性を試験するために、各細胞株は、また対応するラットｈｓｐ６０ペ プチドに対して試験された（図５）。 すべての細胞株は、ｈｓｐ６５およびそれらの特異的ペプチド、そして１つの 例を除いてすべてにおいて、重複しているペプチドに応答した。 残基２１１と２３５の間の４種の重複するペプチドが、刺激性であった。かくし て、４種の別々なエピトープが、この領域に存在すること可能性があった。しか しながら、ペプチド２１６−２３０および２２１−２３５に対して生成されたＴ 細胞株は、それぞれペプチド２１１−２２５および２２６−２４０に、より強く 応答したので、これは、２種のエピトープ：前記２１６−２２５および２２６− ２３５のみの存在を示唆した。また、ペプチド１７６−１９０に特異的な細胞株 Ｈ．３６は、関節炎を起こすＴ細胞クローンＡ２ｂによって認識されると先に述 べられた残基１８０−１８８を含むペプチドに応答したが、これは、これらの２ 種の細胞株が、同じコアエピトープを認識することを示唆する。 残基２５６−２６５に特異的な細胞株Ｈ．５２は、ラットｈｓｐ６０の相同ペ プチドに明瞭な応答を示した。したがって、ラットｈｓｐ６０ペプチドに対する 応答は、ｈｓｐ６５−ＰＬＮＣまたはｈｓｐ６５に特異的な細胞株を用いて検出 できなかったにも拘わらず、交差反応性Ｔ細胞認識は、このエピトープ特異的細 胞株用いて例証できた。ミコバクテリアのペプチドは、ラットのペプチドよりも ５〜１０倍高レベルの増殖を誘導した。このことは、何故、ラットのペプチドが 、ミコバクテリアのペプチドに対する応答が弱かったようなＰＬＮＣレベルでは 認識されず、そして刺激活性においていかに減退しても、検出レベル以下の応答 をもたらすことができたかという理由を説明するであろう。Ｈ．５２によって認 識されるコアエピトープは、そのエピトープのＣ−末端に置かれるラットｈｓｐ ６０配列とは異る唯一の残基３個を含む（表Ｉ参照）。すべて他のＴ細胞株は、 ラットｈｓｐ６０ペプチドに対して応答できなかった。かくして、この研究によ って同定されたミコバクテリアｈｓｐ ６５における９種のＴ細胞エピトープについて、ただ１種のみが、ラットｈｓｐ ６０と交差反応性を示した。 ペプチドに特異的か、またはｈｓｐ６５に特異的なすべてのＴ細胞株が、Ｔ細 胞表現型およびＭＨＣ−限定に関して解析された。ＦＡＣＳ解析は、全Ｔ細胞株 が、αβ ＴＣＲ⁺ ＣＤ４⁺ ＣＤ８^-であることを明らかにした。ＭＨＣ−限 定は、増殖アッセイにおいてｈｓｐ６５もしくはペプチド（１μｇ／ｍｌ）に誘 導される応答を阻害する、抗ＭＨＣ−モノクローナル抗体（１０μｌ／ｍｌ）の 能力を評価することによって決定された。抗ＲＴ１．Ｂの添加は、すべての細胞 株の増殖を７０％超低下したが、一方、抗ＲＴ１．Ｄもしくは抗ＲＴ１．Ａは、 有意な効果をもたなかった（図６）。かくして、すべての細胞株は、ＲＴ１ Ｂ¹ −限定であった。 ｈｓｐ６５ペプチドによる免疫化は、エピトープに特異的なＴ細胞応 答を初期感作する。 合成ペプチドによるラットの免疫化が、ｈｓｐ６５エピトープに対するＴ細胞 反応性を初期感作することに効果的であるか否かを決定するために、個々のＴ細 胞エピトープを含む各ペプチド１００μｇによる免疫化に続いて、イン・ビトロ の増殖応答が試験された。免疫後１０日目に単離されたＰＬＮＣが、免疫ペプチ ド、重複するペプチド、およびｈｓｐ６５に対する応答について試験された（表 ＩＩ）。ＰＬＮＣ応答は、９種のペプチドの７種による免疫後に観察された。応 答は、ペプチド３８６−４００および５１１−５２５による免疫後には見られな かった。 バルク刺激は、試験された９種のペプチドの８種に対するＴ細胞株を生成した 。これらの８種の細胞株は、４回のイン・ビトロの再刺激の後、 特異性が試験された（表ＩＩ）。すべてが、免疫ペプチドに対して、そしてある 程度ｈｓｐ６５に対して応答した。また、細胞株は、重複するペプチドに対する 応答性を試験され、そして１つの場合以外はすべてにおいて、ｈｓｐ６５全体に よる免疫後同じエピトープに対して前以て生成されたＴ細胞株に対して、同一の 応答パターンを示した。これらの知見は、ｈｓｐ６５または合成ペプチドによる 免疫化によってイン・ビボで活性化されたＴ細胞が、同じコアエピトープを認識 することを示唆する。 ｈｓｐ６５により免疫されたラットから生成された８６−１００ペプチドに特 異的なＴ細胞株は、ペプチド８６−１００および９１−１０５に応答した（すな わち、それは、９１−１００のコアエピトープを認識した）。また、８６−１０ ０ペプチドによる免疫後生成されたＴ細胞株は、ペプチド８１−９５および９１ −１０５に応答した。このことは、１つは残基８６−９５を認識し、他の１つは 残基９１−１００を認識する２種のＴ細胞集団の存在を示唆した。興味あること には、残基８６−９５をカバーするミコバクテリアｈｓｐ６５およびラットｈｓ ｐ６０の配列は、同一である。したがって、その細胞株は、ラットｈｓｐ６０の ８１−９５および８６−１００に対応するペプチドに対する応答して増殖した。 かくして、ｈｓｐ６５の８６−１００ペプチドによる免疫化は、自己ｈｓｐ６０ 中のエピトープに対する応答性を初期感作できた。 また、細胞株Ｈ．５２（ｈｓｐ６５による免疫ラットから生成され、エピトー プ２５６−２６５を認識する）も、高度に相同なラットｈｓｐ６０の２５６−２ ７０ペプチド（前記、参照）に応答した。したがって、ペプチドで免疫されたラ ットから得られた２５６−２７０特異的Ｔ細胞 株も、またラット２５６−２７０に応答した（表ＩＩ）。また、この細胞株は、 ３７℃で培養された比較対照ＡＰＣにおいて、熱ショック（照射前に４２℃で１ 時間）を受けた同系のＡＰＣに対する「自己反応性」応答の増大を示した（表Ｉ ＩＩ）。このことは、ＡＰＣによる内因性ｈｓｐ６０の発現増加が、Ｔ細胞認識 のためにＭＨＣと共同してこの交差反応性エピトープの提示をもたらすことを示 唆した。 本発明に記載のペプチドのヒトにおける最初の試験は、両ペプチド２５６−２ ７０および８６−１００が、ある種の自己免疫病患者においてＴ細胞増殖応答を 誘導できることを示した。かくして、今や、ラットの確定したＴ細胞エピトープ 自体が、ある種の個体（ある種のＨＬＡタイプ）における治療的介入に使用でき た。 関節炎に対するｈｓｐ６５ペプチドの予防接種能の解析。 ＡＡの発症に及ぼす各エピトープを含む合成ペプチドによる前免疫化の影響が 、解析された（図７）。エピトープに特異的なＴ細胞を初期感作した８種のペプ チドが、試験された。ラットは、ＭｔによるＡＡ誘導７日前に、ペプチド１００ μｇを用いて免疫された。 ペプチド２５６−２７０による前免疫化は、ＡＡ発症に対して明らかな防御効 果をもたらした。２５６−２７０での前免疫化の後、平均最大関節炎スコアは、 ＰＢＳで前免疫された対照ラットの平均最大スコア１１．５に比べて１．７（５ 回の別実験における２４匹のラット）であった。２５６−２７０により前免疫さ れたラット２４匹について、１２匹は、関節炎の臨床徴候を生じたが、それは対 照ラットで生じたものよりも軽度であった。また、最初の関節炎後に、持続する 永久関節変形を蒙った対照ラットは、生き続けたけれども、ＡＡを発症した２５ ６−２７０ で前免疫されたラットは、永久変形を全く生じなかった。ｈｓｐ６５Ｔ細胞エピ トープを含む他のペプチドによる前免疫化は、ペプチド８６−１００の弱い効果 を除いては、ＡＡの発症に有意な効果をもたなかった。 前免疫ラットからのＰＬＮＣが、Ｍｔ投与後４２日に、ｈｓｐ６５エピトープ に対する応答性を試験された（図８）。ＰＢＳ／ＤＤＡのみで前免疫されたラッ トからのＰＬＮＣは、ペプチド１７６−１９０（ＡＡに関連する１８０−１８８ エピトープを含有している）に対して有意な応答を示したが、確定したｈｓｐ６ ５エピトープの他のいずれにも応答しなかった。個々のｈｓｐ６５ペプチドで前 免疫されたラットからのＰＬＮＣは、すべて、増殖の程度には差があるけれども 免疫ペプチドに対する応答を示した。かくして、ペプチド２１１−２２５および ４４６−４６０による前免疫化は、強い応答を誘導したけれども、ペプチド２５ ６−２７０（ＡＡに対して防御した）による前免疫化は、限界的なＰＬＮＣ応答 を誘導したに過ぎなかった。ＡＡに関連するエピトープを含むペプチド１７６− １９０に対する応答は、１つの例外はあったがすべてのＰＬＮＣ集団（そして１ ７６−１９０による前免疫化後、増加した）において見出だされた。ペプチド２ ５６−２７０による前免疫化によってＡＡを防御されたラットからのＰＬＮＣは 、１７６−１９０に対する応答の完全欠如を示した。 交差反応性２５６−２６５エピトープに特異的なＴ細胞株の投与は、 ＡＡに対する防御を与える。 ＡＡに及ぼすエピトープに特異的なＴ細胞株の影響が、試験された（図９）。 Ｔ細胞株は、ＡＡ誘導のためのＭｔと同時にラットに投与された（１ラット当た り５ｘ１０⁶Ｔ細胞を尾静脈にｉ．ｖ．注射）。２回の 実験において、２５６−２６５エピトープを認識する細胞株Ｈ．５２の投与は、 明らかに、ＰＢＳを注射されている対照動物に比較してＡＡの重篤度を低下した 。Ｔ細胞株Ｈ．３６，Ｈ．４３およびＨ．４６（それぞれエピトープ１８０−１ ８８、２１６−２２５および２２６−２３５に特異的）もまた試験されたが、Ａ Ａ発症に有意な効果をもたなかった。 細胞株Ｈ．５２の防御効果が、細胞株のイン・ビトロ再刺激から持ち込まれた 残存している２５６−２７０ペプチドの投与の結果ではないことを確認するため に、細胞株Ｈ．４６が、ペプチド２５６−２７０ １０μｇ／ｍｌの存在下で特 異的ペプチド（２２６−２４０）を用いて再刺激された。得られる２２６−２３ ５に特異的なＴ細胞芽球の投与は、ＡＡを防御できなかった。 ペプチド２５６−２７０による前免疫化は、また、ＣＰ２０９６１に 誘導される関節炎に対して予防接種する。 ＡＡを強く防御する唯一のｈｓｐ６５ペプチドは、ラットｈｓｐ６０の対応す る配列に対するＴ細胞反応性を誘導した２５６−２７０であることが発見された 。この発見は、自己反応性Ｔ細胞が、関節炎に対するｈｓｐ６５で誘導される防 御を説明することを示唆した。次に、この機構が、他の化合物によって誘導され 、ミコバクテリアの使用によらない関節炎を防御するよう期待されるであろう。 それ故、ペプチド２５６−２７０の、ＣＰ２０９６１に誘導されるモデルにおけ る防御の誘導能が試験された。ＣＰ２０９６１は、リポイド系アミンであるので 、この関節炎原性調製物が、ｈｓｐ６５の２５６−２７０との潜在的交差反応性 をもつ抗原成分を含む可能性はない。ｈｓｐ６５の２５６−２７０による前免疫 化は、ＣＰ２０９６１に誘導される関節炎に対して強力にラッ トを防御したが、対照ペプチド（ｈｓｐ６５の２１１−２２５）は防御しなかっ た（図１０）。かくして、ｈｓｐ６５・２５６−２７０による前免疫化は、ＡＡ およびＣＰ２０９６１に誘導される関節炎（多分、関節炎原性接種物の成分とし てのミコバクテリアの投与によらない機構をへる）を防御できる。 ラットｈｓｐ６０（２５６−２７０）は、関節炎に対して予防接種で きない。 ＡＡに対する防御を与えるｈｓｐ６５・２５６−２７０およびこのペプチドに 特異的なＴ細胞による前免疫化は、また、ラットのｈｓｐ６０・２５６−２７０ 配列に基づく高度に相同なペプチドに応答したので、ラットのペプチドが、同様 の防御効果について試験された（図１１）。防御は、ミコバクテリアｈｓｐ６５ ・２５６−２７０による前免疫化後に観察されたが、ラットｈｓｐ６０・２５６ −２７０によっては観察されなかった。この差異に関する説明は、ラットｈｓｐ ６０・２５６−２７０による前免疫化が、適当なＴ細胞応答を初期感作しないか らであろう。このことを探究するために、本発明者らは、ラット２５６−２７０ （Ｒ．２５６−２７０）で免疫されたＰＬＮＣからペプチドに特異的なＴ細胞株 を生成し、そしてこの細胞株の応答と、ミコバクテリア２５６−２７０（Ｍ．２ ５６−２７０）で免疫されたＰＬＮＣからの細胞株の応答とを比較した（図１２ ）。Ｍ．２５６−２７０に対して生成された細胞株は、Ｍ．２５６−２７０、Ｍ ．２５１−２６５およびより短い「コア」ペプチドＭ．２５６−２６５を表すペ プチドに応答し、そしてＲ．２５６−２７０および（弱く）Ｒ．２５６−２６５ と交差反応した。これに対して、Ｒ．２５６−２７０に対して生成された細胞株 は、Ｒ．２５６ −２７０には応答したが、Ｍ．２５６−２７０またはＲ．２５６−２６５および Ｍ．２５６−２６５には応答しなかった。また、この細胞株が、ＡＰＣのみに高 い「自己反応性」応答を示したことは、ＡＰＣが、既に自己ｈｓｐ６０エピトー プを発現していたことを示唆する。 かくして、Ｍ．２５６−２７０による免疫化は、Ｒ．２５６−２７０と交差反 応するＴ細胞応答を初期感作したが、Ｒ．２５６−２７０による免疫化は、Ｍ． ２５６−２７０と交差反応しないラットに特異的なＴ細胞応答を初期感作した。 Ｒ．２５６−２７０に特異的な細胞株が、Ｒ．２５１−２６５またはＲ．２５６ −２６５に応答しなかったという事実は、Ｒ．２５６−２７０の５個のＣ−末端 残基の１個以上が、この細胞株の刺激に重要であることを示唆する。これらの５ 個の残基のどれも、ミコバクテリアの配列と同一性を持ち合わせておらず、これ が、多分、Ｍ．２５６−２７０に対する応答性の欠如を説明するであろう。 さらにまた、抗ＭＨＣｍＡｂを用いて、Ｍ．２５６−２７０およびＲ．２５６ −２７０に対して生成されたＴ細胞株は、異なるＭＨＣ−限定をもつことが分か った。Ｍ．２５６−２７０に特異的な細胞株のペプチド誘導増殖は、ＯＸ６抗Ｒ Ｔ１．ＢｍＡｂによって阻害されたが、一方、Ｒ．２５６−２７０に特異的な細 胞株は、ＯＸ１７抗ＲＴ１．ＤｍＡｂによって阻害された。 考察 ＩＦＡ中の熱殺菌ＭｔによるＬｅｗｉｓラットの免疫化が、ＡＡを誘導する（ １）ことが、ミコバクテリアｈｓｐ６５の残基１８０−１８８に対するＴ細胞応 答に関連することが報告された（５）。反対に、ｈｓ ｐ６５による免疫化は、まだ未解明のＴ細胞仲介機構によって、続いてのＡＡを 誘導する試みに対して防御する（５，６）。ＬｅｗｉｓラットＴ細胞によって認 識されるｈｓｐ６５内のエピトープは、この明細書において同定された。Ｍｔか ｈｓｐ６５のいずれかによる免疫化に続く、Ｔ細胞集団中のこれらのエピトープ に対する応答性が比較された。 組み換えミコバクテリアｈｓｐ６５によるラットの免疫化は、ｈｓｐ６５のＭ ＨＣクラスＩＩ（ＲＴ１．Ｂ¹）−限定認識を初期感作した。完全なｈｓｐ６５ 配列をカバーしている重複ペプチドに対するｈｓｐ６５−ＰＬＮＣ応答の解析は 、７種のＴ細胞エピトープを同定した。ｈｓｐ６５による単回のイン・ビトロ再 刺激に続いて、２種のさらなるエピトープが同定された。かくして、Ｌｅｗｉｓ ラットＴ細胞は、ミコバクテリアｈｓｐ６５中の９種のエピトープを認識する。 ＩＦＡ中に懸濁されたＭｔによる免疫化（ＡＡ誘導操作に使用されたように） は、ｈｓｐ６５ペプチドに対するＰＬＮＣ応答を初期感作しなかった。しかしな がら、Ｍｔ／ＤＤＡ免疫化は、ｈｓｐ６５ペプチドに対する有意な応答を誘導し た。重要なことは、ＡＡが、Ｍｔ／ＩＦＡ免疫化に続いてのみ発症し、そしてＭ ｔ／ＤＤＡ免疫化後には発症しないことである（Ｓ．Ｍ．Ａ，未発表観察）。か くして、ＤＤＡがアジュバントとして使用される場合の、ｈｓｐ６５に特異的な Ｔ細胞の活性化増進が、この違いを説明するかもしれない。Ｍｔ／ＩＦＡおよび Ｍｔ／ＤＤＡで免疫されたラットからのＴ細胞は、ｈｓｐ６５によるイン・ビト ロの再刺激後は、同一の応答パターンを示したので、これは、Ｍｔ／ＩＦＡが、 比較的低レベルではあるがｈｓｐ６５のＴ細胞認識を初期感作することを示唆し ている。 ｈｓｐ６５エピトープの強さのパターンは、ｈｓｐ６５またはＭｔ全体による 免疫化により異なった。ｈｓｐ６５免疫化は、３種の共に強力なエピトープ：１ ７６−１９０、２１６−２２５および２２６−２３５をもたらした。Ｍｔ免疫化 の後は、エピトープ１７６−１９０が、エピトープ２１６−２２５とともに強力 であるように現れ、そして２２６−２３５は、２５６−２６５および５１１−５ ２０とともに弱かった。１７６−１９０エピトープの強さは、Ｍｔ−ＰＬＮＣが 、Ｍｔ Ｈｓｐ６５により再刺激された時に、より一層顕著であったが、Ｍｔ免 疫化は、エピトープ８６−１００および３９６−４１０に対する応答を初期感作 しなかった。 本発明者らは、同定された９種のエピトープの８種について特異的なαβＴＣ Ｒ⁺ＣＤ４⁺，ＲＴ１．Ｂ¹−限定Ｔ細胞株を生成した。これらの８種のＴ細胞株 の２種、Ｈ．３６およびＨ．４６（それぞれ１７６−１９０および２２６−２３ ５を認識する）は、Ｍｔに対して強く応答したが、一方その他は、比較的弱く応 答した。このことは、Ｍｔによる免疫化の後の強力な１７６−１９０と両立する 。Ｍｔ調製物中に存在する比較的少量のｈｓｐ６５が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に 高い親和力をもつｈｓｐ６５エピトープへのＴ細胞応答の集中をもたらすのであ ろう。他のＡｇ特異性をもつＴ細胞株の増殖を阻害すべき、ｈｓｐ６５エピトー プを含むペプチドの能力を試験する予備実験は、ペプチド１７６−１９０が、ペ プチド２１１−２２５または２２６−２４０よりもＲＴ１．Ｂ¹分子に対して高 い親和力をもつかもしれないことを示唆する（データ未掲載）。かくして、Ａｇ 濃度が、限定される場合（すなわち、Ｍｔ免疫化の後）には、Ｔ細胞エピトープ の強さは、それらの相対的ＭＨＣ 結合親和力に、より一層依存するであろうが、実際は、大量の特異抗原（１ラッ ト当たり５０〜１００μｇｈｓｐ６５）による免疫化の後は、相対的な強さは、 簡単に、ＭＨＣに対する親和力の作用とは言えないであろう。明らかに、無傷の ｈｓｐ６５分子の抗原プロセッシングは、イン・ビボでの初期感作の間に生成さ れるペプチド断片を決定するであろうし、そして天然にプロセッシングされた断 片は、本研究で使用された合成１５量体と同一ではないであろう。また、ｈｓｐ ６５の分子的背景（すなわち、組み換え単量体ｈｓｐ６５か、またはＭｔ調製物 中の多量体の生来のタンパク質か）は、抗原プロセッシングに影響するし、また エピトープ認識のパターンに影響するであろう。 重要なことは、Ｍｔ免疫化に続く強力なｈｓｐ６５エピトープ、１７６−１９ ０は、関節炎原性のＴ細胞クローンＡ２ｂによって認識されると既に報告された １８０−１８８を含有している。したがって、ＡＡ誘導操作は、ＡＡに関連する エピトープに対してゆがめられたＴ細胞応答をもたらす。ＰＬＮＣ応答では、よ り長い１７６−１９０ペプチドは、最小の１８０−１８８ペプチドより強い増殖 応答を誘導した。これは、以前の研究が、１８０−１８８に対するポリクローナ ル応答を解析していた（７，２２）ので、意味のある発見である。ＭＨＣクラス ＩＩ分子の結合グルーブに見いだされる天然にプロセッシングされたペプチドの 長さは、１３〜２５個のアミノ酸として記載されている（２３，２４）。かくし て、９量体１８０−１８８と比較して、ＲＴ１．Ｂ¹分子と１５量体１７６−１ ９０とのより安定な相互作用は、刺激活性の増強を説明できるであろう。 本研究で定義された９種のｈｓｐ６５Ｔ細胞エピトープのうち、１種 は、ラットｈｓｐ６０と交差反応性であった。いかなるラットｈｓｐ６０ペプチ ドに対する有意な応答も、ｈｓｐ６５かＭｔのいずれかによる免疫化後のＰＬＮ Ｃレベルにおいて観察されなかったけれども、２５６−２６５エピトープに特異 的なＴ細胞株Ｈ．５２は、対応するラットｈｓｐ６０ペプチドに応答した。した がって、この領域は、７個の同一残基および他の３つの位置における保存置換に よって高度に保存される(ミコバクテリア：ＡＬＳＴＬＶＶＮＫＩ、ラット:ＡＬ ＳＴＬＶＬＮＲＬ)。領域２４３−２６５は、１８／２３同一残基および５つの 保存置換をもつミコバクテリアと哺乳動物のｈｓｐ６０の間で高度な同一性を示 す（１１）。 本発見は、関節炎の実験モデルにおいて、ｈｓｐ６５による前免疫化のＴ細胞 に仲介される防御効果への重要な洞察を提供するが、それには３つの可能性ある メカニズムが提案された。第１には、以前のデータは、ｈｓｐ６５による前免疫 化が、ＡＡに関連する１８０−１８８エピトープに対する応答を下方制御するで あろうことを示唆した（２２）。１７６−１９０は、ｈｓｐ６５免疫化の後では 共に強力なエピトープであるので、本研究の結果は、このことを指示しない。 第２には、前免疫化後のＴ細胞（１種以上のｈｓｐ６５エピトープを認識する ）の活性化の増大は、続いてのチャレンジにおいてＡＡが発症する前に、Ｍｔの より有効な認識とクリアランスをもたらすであろう。ｈｓｐ６５による免疫化が 、Ｍｔによる免疫化に比べて（認識されるエピトープ数および応答の大きさとい う両観点で）、ｈｓｐ６５エピトープ認識の改良をもたらすことが分かった。こ れらの相異は、そのような防御機構のための基礎を形成するであろう。 ミコバクテリアｈｓｐ６５と哺乳動物ｈｓｐ６０の間で観察されるエピトープ のＴ細胞認識の報告（１４−１７）は、ｈｓｐ６５による前免疫化が、交差反応 性エピトープを認識するＴ細胞を活性化するという第３の仮説に導いた（１６） 。関節内の炎症の間に上方制御された後の自己ｈｓｐ６０の認識が、次に、炎症 過程を制御し、慢性的関節炎の発症を防ぐのであろう。もし、この仮説が正しけ れば、関連するＴ細胞エピトープ（Ｌｅｗｉｓラットを用いるモデルでは）は、 残基２５６−２６５でなければならない。何故ならば、これは、ｈｓｐ６５免疫 化後に認識される唯一の交差反応性エピトープであるからである。興味あること には、エピトープ２５６−２６５は、Ｍｔ／ＩＦＡ免疫化によっては、わづかに 認識されるだけであった。また、細胞株Ｈ．５２は、Ｍｔには弱く応答した。そ れ故、ＡＡ誘導操作は、このエピトープに特異的なＴ細胞を活性化することにあ まり働かない。 ｈｓｐ６５による前免疫化は、ＡＡのみならず、ミコバクテリアなしで誘導さ れる関節炎（６−１０）、そしていかなる外因性タンパク質の添加なしに、プリ スタン（１０）およびＣＰ２０９６１（６）に誘導される関節炎においても防御 をする。それ故、これらのモデルにおける病原性メカニズムは多分異なるであろ うが、すべてが、ｈｓｐ６５による前免疫化によって防ぐことができる。このこ とを考えると、Ｍｔ全体の認識を必要としないが、ミコバクテリアｈｓｐ６５と ラットｈｓｐ６０の交差反応性Ｔ細胞認識を必要とする仮説は、使用される関節 炎原性薬剤とは無関係な単一メカニズムによって説明できる防御として、もっと も魅力的であるように見える。自己ｈｓｐ６０のＴ細胞認識もまた、ヒト関節炎 症状への抵抗性に関連するであろう。自己ｈｓｐ６０に対する Ｔ細胞反応性は、ＲＡ（２５）およびＪＣＡ（２６）をもつ患者において報告さ れてきた。この興味ある進展は、本研究のＨ．５２Ｔ細胞株によって認識される 高度に保存された領域（２４３−２６５）中の交差反応性エピトープを認識した 、ＪＣＡ患者からの２種のＣＤ４⁺Ｔ細胞クローンについての報告であり、そし てその供与患者が、病気からの回復をもったという報告であった（１７）。また 、自己ｈｓｐ６０のこの領域中のエピトープも、健康なヒト供与体からのＣＤ４⁺ ＣＴＬによって認識された（１４）。 ｈｓｐ６５に対するＴ細胞反応性が、防御機構に関与していると信じられる。 ラットは、ＭｔによるＡＡ誘導の前７日に、各エピトープを含む合成ペプチドを 用いて前免疫された。このアプローチは、ペプチド２５６−２７０によって前免 疫されたラットにおける衝撃的防御効果に導いた。試験された他のペプチドのい ずれも、ＡＡ発症には何の影響も示さなかった。初めてｈｓｐ６５による免疫ラ ットから生成され、そしてエピトープ２５６−２６５に特異的なＴ細胞株Ｈ．５ ２もまた、Ｍｔ投与時にｉ．ｖ．注射された場合、ＡＡ発症に防御効果を示した 。細胞株Ｈ．５２の接種は、ＡＡに対する完全な防御を誘導しなかったが、関節 炎の重篤度を明らかに低下させた。Ｈ．５２によって示される低速度の成長に応 じて実施された本研究において移植された少数の細胞（他の研究における５ｘ１ ０⁷〜１０⁸と比較して５ｘ１０⁶）は、完全な防御効果を誘導するには不十分だ ったであろう。 ペプチド１７６−１９０（ＡＡに関連する１８０−１８８エピトープを含む） による前免疫化が、ＡＡ発症に何の効果ももたなかったという発見は、ペプチド １８０−１８８による前免疫化が、ＡＡに対する効果 的防御を誘導するというこれまでの報告とは逆である。この違いの可能な説明は 、採用された異なる前免疫化の方法にある。本発明者らは、アジュバントとして ＤＤＡを用いて、Ｍｔ免疫化７日前に足しょにおいてペプチドで免疫したが、一 方、以前の研究は、３５、２０および５日前のＩＦＡ中ペプチドによりｉ．ｐ． で免疫した。ＩＦＡ中のペプチドによるｉ．ｐ．免疫化は、エピトープに特異的 なＴ細胞寛容を誘導するために使用されたけれども、このアプローチは、ナイー ブ（ｎａｉｖｅ）ラットに防御を伝達できる１８０−１８８に特異的なＴ細胞を 誘導すると報告された。これらの知見は、再現できなかった。 Ｍｔ免疫化の時点で１８０−１８８に特異的なＴ細胞株Ｈ．３６を投与するこ とによる防御効果は見いだされなかった。これは、１８０−１８８による免疫ラ ットからの脾臓Ｔ細胞または１８０−１８８に特異的なＴ細胞株Ａ２およびＡ２ ｃを移植することによる、これまでに報告された防御効果とは異なる。それ故、 Ｈ．３６の移植は、ＡＡの重篤度を増進しないし、そして本発明者らは、照射ラ ットにおける細胞株のＡＡ誘導能を試験しなかったけれども、Ｈ．３６は、防御 活性よりもむしろＡＡ誘導活性をもつ「Ａ２ｃ様」細胞株であろう。あるいはま た、本研究において移植された低い細胞数は、再び、防御効果を誘導するには十 分ではなかったのであろう。 細胞株Ｈ．５２は、ラットｈｓｐ６０の２５６−２７０配列を認識することが 示された。同様に、ペプチド２５６−２７０（ペプチド免疫化１０日後のラット 、およびＭｔ投与４２日後の防御されたラットの両方から生成された）により免 疫されたラットから得られた短期Ｔ細胞株は、対応するラットｈｓｐ６０ペプチ ドに応答した。また、これらの細胞株 は、熱ショックＡＰＣに対する小さいが有意な応答を示したことは、内因性の自 己ｈｓｐ６０エピトープが、ｈｓｐ６０レベルが上方制御された場合に、Ｔ細胞 認識のためにＭＨＣクラスＩＩと共同して提示されることを示している。 かくして，ミコバクテリアｈｓｐ６５の２５６−２７０による免疫化は、ＡＡ 発症を防御し、そしてラットｈｓｐ６０中に共有されるエピトープに応答できる Ｔ細胞を活性化した。この知見は、ｈｓｐ６５による前免疫化がＬｅｗｉｓラッ トを関節炎から防御するメカニズムが、ラットｈｓｐ６０と共有されるエピトー プを認識するＴ細胞の活性化に基づいているという仮説に対する支持を与える。 次いで、炎症部位（関節）において、ＭＨＣクラスＩＩを発現している細胞によ って提示される高いレベルの自己エピトープを、これらのＴ細胞が認識すること は、炎症過程の制御に関する抗原に特異的なメカニズムを提供するであろう。こ のメカニズムは、ミコバクテリア成分を認識すべき「防御性」Ｔ細胞を必要とせ ず、それ故、細菌由来の関節炎原を用いないモデルに対する、ｈｓｐ６５に誘導 される抵抗性を説明するための魅力的な単一メカニズムを提供する。Ｌｅｗｉｓ ラットにおけるもっとも注目されるこれらのモデルは、ＣＰ２０９６１により誘 導されるモデルであって、ＣＰ２０９６１は、リポイド系アミンであり、そのた めにｈｓｐ６５との可能性ある抗原交差反応性をもたない。事実、ペプチド２５ ６−２７０は、ＣＰ２０９６１に誘導されるモデルに対して防御を与えることが 発見された。 ラット２５６−２７０による前免疫化は、ＡＡを防御することができなかった 。Ｍ．２５６−２７０およびＲ．２５６−２７０によって免疫 されたラットから得られたＴ細胞株は、２種の別個のエピトープを認識した。Ｍ ．２５６−２７０による免疫化は、交差反応性のコアエピトープ２５６−２６５ に特異的なＲＴ１．Ｂ¹−限定Ｔ細胞を誘導した。Ｒ．２５６−２７０による免 疫化は、ラットに独特なコアエピトープ２６１−２７０に特異的なＲＴ１．Ｄ¹ −限定Ｔ細胞を誘導した。かくして、ここで観察された防御効果は、ＲＴ１．Ｂ¹ と共同して２５６−２６５エピトープのＴ細胞認識を必要とした。Ｍ．２５６ −２７０免疫化後のＲ．２５６−２７０に対する相対的に弱い応答は、Ｒ．２５ ６−２７０、ＲＴ１．Ｂ¹およびＴＣＲの３分子相互作用が、相対的に低い親和 力をもっていたことを示唆する。Ｒ．２５６−２７０に特異的なＴ細胞株の強い 増殖応答は、Ｒ．２５６−２７０、ＲＴ１．Ｄ¹、ＴＣＲ相互作用が、高い親和 力をもっているであろうことを示唆する。ラットに独特なＲ．２６１−２７０エ ピトープは、潜在性であろう（すなわち、ＡＰＣによる内因性ｈｓｐ６０のプロ セッシングの後、ＭＨＣクラスＩＩとともに発現されず、それ故、潜在的防御性 のＴ細胞による認識には利用されない）。もしそうであれば、このエピトープに 高い親和力をもつＴ細胞は、胸腺においてネガティブには選択されないであろう し、そしてＲ．２５６−２７０による免疫化後のＴ細胞応答を増強して、防御性 の２５６−２６５エピトープに対する効果的応答の発生を防ぐであろう。もし、 ２つの相互作用の異なる親和力が、Ｒ．２５６−２７０に対するＲＴ１．Ｂ¹よ りも高い結合親和力をもつＲＴ１．Ｄ¹から得られるならば、「決定基捕捉（ｄ ｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｃａｐｔｕｒｅ）」（Deng et al.，J．Exp．Med．178: 1675-1680）の形式が、この効果を説明できるであろう。Ｒ．２５６−２７０と Ｍ．２５６−２７０に対する両方のＭＨ ＣクラスＩＩ分子の結合親和力の解析が、これを明らかにするであろう。かくし て、治療上の応用は、内因的にプロセッシングされた自己ｈｓｐ６０に対する相 対的に低い親和力の交差反応性応答を誘導する、細菌のｈｓｐ６０エピトープの 使用を要求するかもしれない。天然にプロセッシングされた内因性ｈｓｐ６０の エピトープに対する応答は、胸腺選択および末梢寛容という正常なメカニズムに よって調節されるであろうから、合成ペプチドとして投与された場合強く免疫原 性となる自己ｈｓｐ６０エピトープはいずれも、十分に潜在性であるかもしれな い。 図の説明 図１： Ｍｔもしくはｈｓｐ６５による免疫化は、ｈｓｐ６５のＴ細胞認識を 初期感作する。ｈｓｐ６５、Ｍｔ／ＩＦＡもしくはＭｔ／ＤＤＡにより免疫され たラットからの１０日目のＰＬＮＣが、ｈｓｐ６５、ＰＰＤおよびＭｔに対して 広い濃度範囲（２０μｇ／ｍｌ、ここに示されるように最大応答を与えた）にわ たって試験された。非免疫脾細胞およびＰＢＳ／ＤＤＡにより免疫されたラット からのＰＬＮＣが、ネガティブ対照として使用された（ＩＦＡによる免疫ラット からのＰＬＮＣは、ＰＢＳ／ＤＤＡ−ＰＬＮＣと同じ応答パターンを示した）。 すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。 図２： 抗ｈｓｐ６５ＰＬＮＣ応答の抗ＭＨＣｍＡｂ阻害。 １０日目のｈｓｐ６５−ＰＬＮＣが、ＲＴ１．Ｂ（ＯＸ６）、ＲＴ１．Ｄ（ＯＸ １７）およびＲＴ１．Ａ（ＯＸ１８）に特異的なｍＡｂ１０μｇ／ｍｌの存在下 で、一定範囲のｈｓｐ６５用量とともに培養された。抗ｃｍｐ＝ＵＤ１５抗クロ ラムフェニコール、イソタイプの対照抗体。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未 満であった。 図３： ｈｓｐ６５による免疫化に続くミコバクテリアｈｓｐ６５ペプチドに 対する応答。 ｈｓｐ６５ペプチドの完全パネルに対する応答が、１０日目のｈｓｐ６５−ＰＬ ＮＣ（図３ａ）、または同じｈｓｐ６５−ＰＬＮＣ集団から生成されたｈｓｐ６ ５に特異的なＴ細胞株（図３ｂ）を用いて解析された。ペプチドは、５および２ ０μｇ／ｍｌにおいて試験された（２０μｇ／ｍｌがここで示される）。ｈｓｐ ６５、ＰＰＤおよびＭｔ（２０μｇ／ｍｌ）に対する応答は、すべて、（ａ）で は６０，０００ｃｐｍおよび （ｂ）では１５０，０００ｃｐｍを超えていた。有意な応答を誘導するペプチド が、同定された。重複しているペプチドが、刺激性である場合には、より強い応 答を与えるペプチドが同定された。この実験の結果は、３回のさらなる実験にお いて再現された。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。 図４： Ｍｔ全体による免疫化に続くミコバクテリアｈｓｐ６５ペプチドに対 する応答。 ｈｓｐ６５ペプチドの完全パネルに対する応答が、Ｍｔ／ＤＤＡによる免疫ラッ トからの１０日目のＰＬＮＣ（図４ａ）、またはｈｓｐ６５かＭｔによる再刺激 によってＭｔ／ＩＦＡ−ＰＬＮＣから生成されたＴ細胞株（図４ｂ）を用いて解 析された。ペプチドは、５および２０μｇ／ｍｌにおいて試験された（２０μｇ ／ｍｌがより強い応答を与え、ここで示される）。ｈｓｐ６５、ＰＰＤおよびＭ ｔ（２０μｇ／ｍｌ）に対する応答は、すべて、（ａ）では４０，０００ｃｐｍ および（ｂ）では１５０，０００ｃｐｍを超えていた。有意な応答を誘導するペ プチドが、強調された。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。 図５： 確定されたｈｓｐ６５エピトープに特異的なＴ細胞株の応答。Ｔ細胞 株が、ラットｈｓｐ６０ペプチド、ｈｓｐ６５およびＭｔに対応する重複するｈ ｓｐ６５ペプチドに対する応答について、一定範囲のＡｇ濃度にわたって試験さ れた（１０μｇ／ｍｌがここで示される）（図５．１〜５．４）。すべての細胞 株が、ＰＰＤに対して応答し、他のエピトープを含む対照ｈｓｐ６５ペプチドに 対しては応答しなかった。すベてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった。 図６： Ｔ細胞株応答の抗ＭＨＣｍＡｂ阻害。 エピトープ特異的およびｈｓｐ６５特異的なＴ細胞株が、ＲＴ１．Ｂ（ＯＸ６） 、ＲＴ１．Ｄ（ＯＸ１７）およびＲＴ１．Ａ（ＯＸ１８）に特異的なｍＡｂ１０ μｇ／ｍｌの存在下で、照射されたＡＰＣおよびＡｇ（エピトープに特異的な細 胞株に対する特異的ペプチドまたはｈｓｐ６５に特異的な細胞株に対するｈｓｐ ６５）１μｇ／ｍｌとともに培養された。抗ｃｍｐ＝ＵＤ１５抗クロラムフェニ コール、イソタイプの対照抗体。すべてのＳ．Ｅ．Ｍ．は、２０％未満であった 。 図７： ｈｓｐ６５ペプチドを用いる前免疫化によるＡＡ発症の変調。 ラットは、尾の基部にｉ．ｄ．注射されるＩＦＡ １００μｌ中Ｍｔ５ｍｇを用 いるＡＡ誘導の７日前に、各合成ペプチド１００μｇまたはＤＤＡ中ＰＢＳを用 いて、後足しょにおいて免疫された（図７．１〜７．４）。５匹のラットが、各 々の前免疫化群において使用された。関節炎スコアは、Ｍｔ注射後８日から毎日 評価された。 図８： ペプチドで前免疫されたＡＡラットのＰＬＮＣ応答。 ラットは、図７において記載のように前免疫化そしてＭｔによる免疫化が行われ た。ＰＬＮＣ（プールされた鼠径部および膝窩筋ＬＮ）は、Ｍｔ免疫後４２日に 単離され、そして確定されたＴ細胞エピトープを含むｈｓｐ６５ペプチド（２０ μｇ／ｍｌ）に対する応答を試験された。すべてのＰＬＮＣが、ｈｓｐ６５、Ｍ ｔに応答した（応答は、すべて５０，０００ｃｐｍを超えていた）。すべてのＳ ＥＭは、２０％未満であった。 図９： エピトープに特異的なＴ細胞株を用いるＡＡの変調。 ラットは、尾の基部にｉ．ｄ．注射されるＩＦＡ １００μｌ中Ｍｔ５ｍｇを用 いるＡＡ誘導の時点に、ＰＢＳ中５ｘ１０⁶Ｔ細胞か、またはＰＢＳのみをｉ． ｖ．投与された。５匹のラットが、各群において使用 された。関節炎スコアは、Ｍｔ注射後８日から毎日評価された。細胞株Ｈ．４６ （２２６−２３５に特異的）およびＨ．５２（２５６−２６５に特異的）を用い る結果が示される。細胞株Ｈ．３６およびＨ．４３（それぞれ、エピトープ１８ ０−１８８および２１６−２２５に特異的）の注射は、ＡＡには有意な効果をも たなかった（データ未掲載）。 図１０： ｈｓｐ６５ペプチドを用いる前免疫化によるＣＰ２０９６１誘導Ａ Ａの変調。 ラットは、尾の基部にｉ．ｄ．注射される鉱油１００μｌ中ＣＰ２０９６１ ２ ｍｇを用いるＡＡ誘導の７日前に、各合成ペプチド（２１１−２２５または２５ ６−２７０）１００μｇまたはＤＤＡ中ＰＢＳを用いて、後足しょにおいて免疫 された。５匹のラットが、各々の前免疫化群において使用された。関節炎スコア は、Ｍｔ注射後８日から毎日評価された。 図１１： ラットｈｓｐ６０（２５６−２７０）による前免疫化は、ＡＡを防 御しない。 ラットは、尾の基部にｉ．ｄ．注射されるＩＦＡ１００μｌ中Ｍｔ５ｍｇを用い るＡＡ誘導の７日前に、各合成ペプチド１００μｇまたはＤＤＡ中ＰＢＳを用い て、後足しょにおいて免疫された。５匹のラットが、各々の前免疫化群において 使用された。関節炎スコアは、Ｍｔ注射後８日から毎日評価された。対照ペプチ ド（ｈｓｐ６５ ２１１−２２５）による前免疫化は、ＡＡ発症に何ら影響しな かった（データ未掲載）。 図１２： ｈｓｐ６５（２５６−２７０）およびラットｈｓｐ６０（２５６− ２７０）による免疫化は、別個のエピトープに対するＴ細胞株応答を初期感作す る。 ラットは、ＤＤＡ中Ｍ．２５６−２７０またはＲ．２５６−２７０のいずれかを 用いて、後足しょにおいて免疫された。７日後ＰＬＮＣが、単離され、そして免 疫されたペプチドを用いてイン・ビトロで再刺激された。得られたＴ細胞株（Ｍ ．２５６−２７０を認識する細胞株Ｐ．ｍ５２またはＲ．２５６−２７０を認識 する細胞株Ｐ．ｒ５７）は、照射された同系の脾臓ＡＰＣの存在下で、ミコバク テリアおよびラットペプチドに対する応答を試験された。すべてのＳＥＭは、２ ０％未満であった。 図１３： 単文字コードにおけるヒト、ラット、マウスおよびＭ．ボビス（Ｍ ．Ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５（ｈｓｐ６０）の多配列 の整列。 整列は、４種のタンパク質配列についてなされた。星印＊は、完全保存アミノ酸 を示す。ドット・は、良好に保存された、すなわち同一ではないが類似のアミノ 酸を示す。 一致する長さ： ５７３ 同一残基： ２５４（４４．３％） 類似残基： ２１１（３６．８％） 整列のために使用された配列の説明 ［１］Ｐ６０＄ＨＵＭＡＮ サイズ： ５７３残基 ＤＥ ミトコンドリアマトリックス・タンパク質Ｐ１前駆体（Ｐ６０リンパ 球タンパク質）（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ相同体）（ＨＵＣＨＡ６０）（熱ショッ クタンパク質６０）（ｈｓｐ６０）。 ＯＳ ＨＵＭＡＮ(ホモ・サピエンス(Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ))。 ［２］Ｐ６０＄ＲＡＴ サイズ： ５４７残基 ＤＥ ミトコンドリアマトリックス・タンパク質Ｐ１（Ｐ６０リン パ球タンパク質）（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ相同体）（熱ショックタンパク質６０ ）（ｈｓｐ６０）。 ＯＳ ＲＡＴ（ラタス・ノルベジクス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕ ｓ ）） ［３］Ｐ６０＄ＭＯＵＳＥ サイズ： ５５５残基 ＤＥ ミトコンドリアマトリックス・タンパク質Ｐ１前駆体（Ｐ６０リンパ 球タンパク質）（Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ相同体）（熱ショックタンパク質６０） （ｈｓｐ６０）（断片）。 ＯＳ ＭＯＵＳＥ(マス・マスクルス(Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ))。 ［４］Ｐ６０＄Ｍ．ＴＵＢ サイズ： ５４０残基 ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅ ｒｃｕｌｏｓｉｓ ）／ミコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ）ＢＣＧ ｈｓｐ６０

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年２月１２日 【補正内容】 WO 88/06591は、Ｍ．ツベリクロシスのｈｓｐ６５の配列２３１−２４５を含 む、ミコバクテリア感染に対するワクチンに使用するためのミコバクテリアのペ プチドを開示している。ｈｓｐ６５の配列１１２−１３２を含むミコバクテリア 抗原を用いるＴ細胞エピトープのマッピングは、EMBO J．6，1245-1249(1987)に 記載されている。ヒトのＴ細胞認識におけるミコバクテリアｈｓｐ６５の配列２ １１−２２５、２３１−２４５およびその他の役割が、J．Immunol．141，2749- 2754(1988)に報告されている。WO 90/10449は、インスリン依存真性糖尿病の治 療における、ミコバクテリアの配列４１０−４３２に対応するヒトｈｓｐ６５の 配列の使用を教示している。 ｈｓｐ６５だけを用いる免疫化によってＡＡを誘導する試みは、不成功である ことが証明された（５，６）。その代わりに、このアプローチは、続いて試みら れた全Ｍｔを用いるＡＡの誘導に対する耐性を確認した。この防御効果は、ｈｓ ｐ６５に特異的なＴ細胞によって仲介されると信じられる（７）。ミコバクテリ アｈｓｐ６５を用いる前免疫化は、続いて、連鎖球菌細胞壁（８）、コラーゲン ＩＩ型（６，９）、またはＣＰ２０９６１（６）およびプリスタン（ｐｒｉｓｔ ａｎｅ）（１０）のような合成アジュバントを用いて誘導された別の型の実験的 関節炎に対して防御を確実にすると報告されている。 ミコバクテリアのｈｓｐ６５は、進化を通じて高度に保存されている熱ショッ クタンパク質のｈｓｐ６０ファミリーに属し、そして哺乳動物の相同体、Ｐ１も しくはｈｓｐ６０と４８％の同一アミノ酸を共有する（１１）。哺乳動物ｈｓｐ ６０の発現は、種々のストレス刺激に対する生理的応答として上方制御されるこ とが知られており、そしてＲＡ（１２）または若年性慢性関節炎（ＪＣＡ，引用 文献１３）をもつ患者の炎症を起こした滑液中で高められることが分かった。 発明の記述 本発明は、炎症性疾患の予防および治療のための防御性エピトープが、領域が 微生物と哺乳動物の間で高度に保存されているストレスタンパク質の比較的短い 領域（アミノ酸約５〜１５個）に位置するという発見に基づいている。防御性エ ピトープにおける高度の同一性に加えて、そのタンパク質は、より一般的に、微 生物と哺乳動物の間で高度に保存されている。 用語「ストレスタンパク質」は、そのような炎症またはストレス状態 の部位に生存する細胞中で、炎症または他のストレス刺激の間に合成レベルの上 昇を示す酵素またはタンパク質を表すために、ここでは使用される。通常は、ス トレスタンパク質は、例えば、細胞中で調節および代謝機能を発揮するために、 構成的に発現される。この記述で、「微生物ストレスタンパク質」は、哺乳動物 ストレスタンパク質の微生物相同体として理解されるべきである。炎症は、感染 、自己免疫疾患、腫瘍成長、移植拒絶または組織損傷に起因するであろう。他の ストレス刺激は、上昇した温度（４５℃まで）、薬物、重金属、外因性有機物質 、オキシダント、細菌毒素、ＬＰＳ、ストレス誘導リポタンパク質、分裂促進因 子（ＰＨＡ，ＣｏｎＡ）およびサイトカイン、例えばＩＬ１、ＩＬ２、ＴＮＦα ，ＩＮＦαとβ、ＩＬ６およびＩＬ１２を含む。 合成の上昇は、細胞によるそのようなタンパク質の分泌または放出レベルの上 昇、あるいは免疫系への提示レベルの上昇をみちびくことができる。 請求の範囲 １． 保存された哺乳動物のストレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク 質のアミノ酸配列の一部分に対応するペプチドであって、微生物と哺乳動物の相 同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも２５％であり、少なくとも７５個 の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列の同一性が少な くとも４０％であり、該部分が、少なくとも５個のアミノ酸が、該ストレスタン パク質のＴ細胞エピトープにおける同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一で ある、５〜３０個のアミノ酸を含み、該エピトープおよび該部分が、対応する哺 乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同一である少なくとも４個の連続するア ミノ酸を含む、ペプチド。 ２． 微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも４ ０％であり、そして少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳 動物の相同体間の配列の同一性が少なくとも５０％である、請求の範囲１記載の ペプチド。 ３． 該ストレスタンパク質が、熱ショックタンパク質およびストレスに誘導 される酵素から選ばれる、請求の範囲１または２記載のペプチド。 ４． 該熱ショックタンパク質が、配列番号：１に示されるミコバクテリウム ・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） の熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５（Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧの熱 ショックタンパク質と同一）である、請求の範囲３記載のペプチド。 ５． ペプチドが、配列番号：１の配列８１−１００および２４１− ２７０の１つにおいて、同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である少なく とも５個のアミノ酸を含む、請求の範囲４記載のペプチド。 ６． ペプチドが、配列番号：１の配列８４−９５および２５６−２６５の１ つにおいて、同じ相対的位置の対応するアミノ酸と同一である少なくとも５個の アミノ酸を含む、請求の範囲５記載のペプチド。 ７． ［−暫定的に削除−］ ８． 該部分が、エピトープが、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミ ノ酸と同一である少なくとも３個未満、特に４個未満の連続するアミノ酸を含む 、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープに対応する５〜５０個のアミノ酸の １つ以上の切片を含まない、請求の範囲１〜６のいずれか１つに記載のペプチド 。 ９． アミノ酸残基の１個以上が、類似のサイズ、電荷および極性をもつアミ ノ酸の残基によるか、または１つ以上の骨格の改変において得られるアミノ酸疑 似体により置換されている、請求の範囲１〜８のいずれか１つに記載のペプチド 。 １０．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチドを生産する方法であ って、次の段階： ａ）微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が、少なくとも２５ ％であり、そして少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動 物の相同体間の配列同一性が、少なくとも３０％である、保存された哺乳動物ス トレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク質を選択すること； ｂ）少なくとも５個のアミノ酸が、該ストレスタンパク質における同じ相対的位 置の対応するアミノ酸と同一である少なくとも５〜３０個のア ミノ酸を含み、該ストレスタンパク質の少なくとも４個の連続するアミノ酸のあ る列が、選択された微生物タンパク質のアミノ酸のある列および哺乳動物ストレ スタンパク質のアミノ酸の対応する列の両方と同一である、ペプチドを調製する こと； ｃ）調製されたペプチドを、Ｔ細胞エピトープの存在についてスクリーニングす ること、を含む方法。 １１．請求の範囲１〜８のいずれか１つに記載のペプチドをコードしているヌ クレオチド。 １２．請求の範囲１〜８のいずれか１つに記載のペプチドを発現することがで きる発現系。 １３．請求の範囲１２記載の発現系を含む微生物または真核細胞。 １４．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチドを用いる免疫刺激に よって活性化された、Ｔ細胞またはそれからＴ細胞レセプターを発現している細 胞。 １５．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチドに対して産生された 抗体。 １６．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチド、請求の範囲１１記 載のヌクレオチド配列、請求の範囲１２記載の発現系、請求の範囲１３または１ ４記載の細胞、または請求の範囲１５記載の抗体を含有する、自己免疫疾患、例 えば糖尿病、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症および重症性 筋無力症を含む炎症性疾患の治療または予防のために適切な医薬組成物。 １７．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチドまたは請求の範囲１ ５記載の抗体を含有する、自己免疫病を含む炎症性疾患を検出 するために適切な診断組成物。 【図１４】 【図１４】 【図１４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＰ 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 16/12 48/00 ＡＢＡ 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ０７Ｈ 21/04 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｃ０７Ｋ 7/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 16/12 9282−4Ｂ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＰ 15/09 ＡＢＧ Ｇ０１Ｎ 33/53 ＡＡＢ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＪ (31)優先権主張番号 ９４２０２９２７．３ (32)優先日 1994年10月10日 (33)優先権主張国 オーストリア（ＡＴ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 バン・エデン， ウイレム オランダ・エヌエル−3723エイチビー ビ ルトホーフエン・ゼストデイークセベーク 399

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 保存された哺乳動物のストレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク 質のアミノ酸配列の一部分に対応するペプチドであって、微生物と哺乳動物の相 同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも２５％であり、少なくとも７５個 の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動物の相同体間の配列の同一性が少な くとも３０％であり、該部分が、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープにお ける同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する少なくとも５個のアミノ酸を 含み、そのエピトープが、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミノ酸と同 一である少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、ペプチド。 ２． 微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が少なくとも４ ０％であり、そして少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳 動物の相同体間では、配列の同一性が少なくとも５０％である、請求の範囲１記 載のペプチド。 ３． 該ストレスタンパク質が、熱ショックタンパク質およびストレスに誘導 される酵素から選ばれる、請求の範囲１または２記載のペプチド。 ４． 該熱ショックタンパク質が、配列番号：１に示されるミコバクテリウム ・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ） （＝Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧ）の熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５ である、請求の範囲３記載のペプチド。 ５． ペプチドが、配列番号：１の配列８１−１００および２４１−２７０の １つにおいて、同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する少なくとも５個の アミノ酸を含む、請求の範囲４記載のペプチド。 ６． ペプチドが、配列番号：１の配列８４−９５および２５６−２６５の１ つにおいて、同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する少なくとも５個のア ミノ酸を含む、請求の範囲５記載のペプチド。 ７． ペプチドが、微生物タンパク質のアミノ酸配列の５〜３０個のアミノ酸 を含む、請求の範囲１〜６のいずれか１つに記載のペプチド。 ８． 該部分が、エピトープが、対応する哺乳動物のストレスタンパク質アミ ノ酸と同一である少なくとも３個未満、特に４個未満の連続するアミノ酸を含む 、該ストレスタンパク質のＴ細胞エピトープに対応する５〜５０個のアミノ酸の １つ以上の切片を含まない、請求の範囲１〜６のいずれか１つに記載のペプチド 。 ９． アミノ酸残基の１個以上が、類似のサイズ、電荷および極性をもつアミ ノ酸の残基によるか、または１つ以上の骨格の改変において得られるアミノ酸疑 似体により置換されている、請求の範囲１〜８のいずれか１つに記載のペプチド 。 １０．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチドを生産する方法であ って、 ａ）微生物と哺乳動物の相同体間の全アミノ酸配列の同一性が、少なくとも２５ ％であり、そして少なくとも７５個の連続するアミノ酸の領域の微生物と哺乳動 物の相同体間の配列同一性が、少なくとも３０％である、保存された哺乳動物ス トレスタンパク質相同体をもつ微生物タンパク質を選択する工程； ｂ）該ストレスタンパク質の少なくとも４個の連続するアミノ酸のある列が、選 択された微生物タンパク質のアミノ酸のある列および哺乳動物ストレスタンパク 質のアミノ酸の対応する列の両方と同一である、該ス トレスタンパク質の同じアミノ酸として同じ相対的位置に存在する少なくとも５ 個のアミノ酸を含むペプチドを調製する工程； ｃ）調製されたペプチドを、Ｔ細胞エピトープの存在についてスクリーニングす る工程、を含む方法。 １１．請求の範囲１〜８のいずれか１つに記載のペプチドをコードしているヌ クレオチド。 １２．請求の範囲１〜８のいずれか１つに記載のペプチドを発現することがで きる発現系。 １３．請求の範囲１２記載の発現系を含む微生物または真核細胞。 １４．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチドを用いる免疫刺激に よって活性化された、Ｔ細胞またはそれからＴ細胞レセプターを発現している細 胞。 １５．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチドに対して産生された 抗体。 １６．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチド、請求の範囲１１記 載のヌクレオチド配列、請求の範囲１２記載の発現系、請求の範囲１３または１ ４記載の細胞、または請求の範囲１５記載の抗体を含有する、自己免疫疾患、例 えば糖尿病、関節炎疾患、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症および重症性 筋無力症を含む炎症性疾患の治療または予防のために適切な医薬組成物。 １７．請求の範囲１〜９のいずれか１つに記載のペプチドまたは請求の範囲１ ５記載の抗体を含有する診断組成物。