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JPH09510601A - Episomal expression vector for human gene therapy - Google Patents

Episomal expression vector for human gene therapy

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Publication number
JPH09510601A
JPH09510601A JP7513785A JP51378595A JPH09510601A JP H09510601 A JPH09510601 A JP H09510601A JP 7513785 A JP7513785 A JP 7513785A JP 51378595 A JP51378595 A JP 51378595A JP H09510601 A JPH09510601 A JP H09510601A
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JP
Japan
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replication
origin
cells
vector
antigen
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Pending
Application number
JP7513785A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
クーパー，マーク・ジェイ
Original Assignee
ケース・ウエスタン・リザーブ・ユニバーシティ
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Filing date
Publication date
Application filed by ケース・ウエスタン・リザーブ・ユニバーシティ filed Critical ケース・ウエスタン・リザーブ・ユニバーシティ
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Abstract

(57)【要約】 パポバウイルスの複製開始点およびパポバウイルスラージＴ抗原変異型を含むエピソームプラスミドは、ヒト細胞においてエピソームとして複製し、エピソームのコピー数に比例した遺伝子の発現レベルが得られる。リポソームまたは受容体仲介伝達システムと組み合わせて、パポバウイルス由来のエピソームプラスミドは、特に高レベルの遺伝子発現が必要とされる手法を使用するときに遺伝子治療において有用なベクターを提供する。   (57) [Summary] Episomal plasmids containing the papovavirus origin of replication and the papovavirus large T antigen variant replicate as episomes in human cells, yielding gene expression levels proportional to the episomal copy number. In combination with liposomes or receptor-mediated delivery systems, papovavirus-derived episomal plasmids provide useful vectors in gene therapy, especially when using techniques where high levels of gene expression are required.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト遺伝子治療用のエピソーム発現ベクター 本発明に至る研究は、国立衛生研究所より、認可第Ｐ３０ＣＡ４３７０３号に 一部支援されている。米国政府は、本発明に対して権利を保持する。 発明の背景 発明の分野 本発明は、哺乳動物中で効率的に複製するエピソームを高コピー数持ちおよび コードする遺伝子を高レベルで発現する安定な形質導入体を作りだすパポバウイ ルス由来のエピソームを目的とする。パポバウイルス由来のエピソームは、膀胱 癌細胞の増殖を調節するための遺伝子治療手段において有用である。 関連した技術についての概説 ヒト癌細胞に対する遺伝子治療の１つのアプローチは、優性な癌遺伝子および 増殖因子受容体の発現を阻害するアンチセンス配列を発現するベクターを導入す ることである。しかし、癌遺伝子が高レベルで発現している場合、アンチセンス の発現も同程度必要であり、これは特に安定な形質導入体中で多コピーになるこ とがある程度制限されている発現ベクターを使用する場合には、かなり技術的な 障害となる。レトロウイルスベクターで形質導入したヒト細胞は、安定な形質導 入体においては挿入されたレトロウイルスを１つまたは数コピーしか持たない。 反対に、エピソームプラスミドは、染色体とは別に複製するために安定な形質導 入体中で数百コピー蓄積できる。アンチセンス転写物を高レベルで発現するため の１つの方法は、ヒト細胞中で染色体とは別に複製できるエピソームプラスミド ベクターを使用することである。 ある種のヒト細胞中で複製できるエピソームベクターを作製する試みは、文献 で報告されている。エピソームプラスミドは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ ）（サーバー、ら．，１９８１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１：４８６− ４９６；ジマリオ、ら．，１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ， Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４０３０−４０３４）、ＳＶ４０（ツイ、ら．，１９８２， Ｃｅｌｌ．，３０：４９９−５０８）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ） （イエイツ、ら．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１２−８１５；マルゴ ルスキー，ら．，１９８８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２８３７−２ ８４７；ベルト、ら．，１９８９，Ｇｅｎｅ，８４：４０７−４１７；チテンダ ン、ら．，１９８９，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６３：３０１６−３０２５）、およびＢ Ｋウイルス（ＢＫＶ）（ミラネシ、ら．，１９８４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ １．，４：１５５１−１５６０）を含む、いくつかのＤＮＡウイルスから作製さ れている。これらのエピソームプラスミドは各々、ＤＮＡ複製のウイルス用の開 始点およびウイルス用の開始点にトランスに働き、形質導入した宿主細胞中でエ ピソームが複製できるようなウイルスの初期遺伝子を含む。 ＥＢＶ由来のエピソームは、ｃＤＮＡライブラリーを効率的にスクリーニング するのに使用されたが、ＥＢＶのシステムはリンパ細胞でない細胞型に対して適 用が制限されており（バイダル、ら．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ ｙｓ．Ａｃｔａ １０４８：１７１−１７７）、およびＥＢＶのレプリコンは、 多くの細胞型において活性でない。さらに、ＥＢＮＡ−１は、ヒトリンパ細胞を 死なせないいくつかのＥＢＶ遺伝子の１つであり、ＥＢＶ陰性ＢＪＡＢリンパ細 胞腫系列をＥＢＶＡ−１で形質導入すると、細胞の形質転換を示す軟寒天上上で の増殖を誘導する。（木下、１９９０、北海道医学雑誌、６５：３６２−３７５ ） さらに、ＥＢＮＡ−１（トランスアクチベーター）およびＯＲＩ−Ｐ（ＥＢＶ ＤＮＡ開始点）をコードするＥＢＶエピソームプラスミドで形質導入したＥＢ ＮＡ−１陰性細胞系列の安定な形質導入の効率は低く、エピソームでないプラス ミドに対して有意に高くはない（イエイツ、ら．，１９８５；バイタル、ら．， １９９０）。しかし、ＥＢＮＡ−１が形質導入に先だって細胞中において発現し ている場合に、続いてＯＲＩ−Ｐおよび選択マーカーを含むプラスミドで形質導 入すると、安定な形質導入効率が１０％まで上昇する（マルゴルスキー、ら．， １９８８；ベルト ら．，１９８９；イエイツ、ら．，１９８４，Ｐｒｏｃ．ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３８０６−３８１０；ルトファリア、 ら．，１９８９，Ｇｅｎｅ７６：２７−３９）。比較できる結果は、ＳＶ−Ｔを 高レベルで発現するＣＯＳ細胞クローンの関連したシステムにおいて知られてお り、この場合には一過性の形質導入においてＳＶ４０の開始点を含むプラスミド の効率的な複製が可能になる（ツイ、ら．，１９８２；リオ、ら．，１９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：２３−２８；チッテンダン、ら．，１９９１，Ｊ．Ｖｉ ｏｌ．６５：５９４４−５９５１）。 しかし、ＣＯＳ細胞のシステムにおいて、エピソームの複製は容易に進行し、 形質導入後４８時間で１０4個のエピソームのコピーが生じる。一過性の形質導 入においてエピソームの複製が効率的にもかかわらず、安定な形質導入の効率は 低いことが、これらの実験において示されている（チッテンダン、ら．，１９９ １；ロバート、ら．，１９８６，Ｃｅｌｌ，４６：７４１−７５２）。おそらく 、ほとんどの一過性の形質導入体は、エピソームによって仲介される細胞死によ り二次的に死ぬのであろう（チッテンダン、ら．，１９９１；ロバート、ら．， １９８６）。 しかし、ＳＶ４０ ＤＮＡ開始点を含むプラスミドでＣＯＳ細胞を形質導入す ると、エピソームプラスミドを持つ安定な形質導入体が得られ（ツイ、ら．，１ ９８２）、他のウイルスの複製制御領域の使用を含む、様々な方法によってエピ ソームの複製制御が容易になる。例えば、ＣＯＳ細胞クローン中での容易なエピ ソームの複製は、ＳＶ４０ ＤＮＡ開始点およびウシパピローマウイルス（ＢＰ Ｖ）レプリコンを含むプラスミドを使用することによって制御可能である（ロバ ート、ら．，１９８６；ロバート、ら．，１９８８、Ｃｅｌｌ５２：３９７−４ ０４）。これらの研究は、一過性の形質導入におけるＳＶ４０エピソームの複製 を調節にする２つのＢＰＶ配列（ＮＣＯＲ ＩおよびＮＣＯＲ ＩＩ）、および 読み枠Ｅ１における５’配列にコードされる第３のトランスにサプレスする因子 を同定している。ＳＶ４０ ＤＮＡ開始点およびＢＰＶの２１１３塩基対のＥｃ ｏＲＩ断片をコードするハイブリッドプラスミドは、ｐＳＶ−ＮＥＯより、安定 な形質導入効率は実質的に高い（ロバート、ら．，１９８６）。ＤＮＡホモロジ ー検索を行なったが、ＢＫＶまたはＳＶ４０レプリコンの中には同様なＮＣＯＲ 相同配列は同定できなかった。 従って、遺伝子治療に応用するための、哺乳動物細胞においてエピソームが制 御されて複製されるベクターが必要とされる。特に、細胞を形質転換せずにヒト 細胞においてエピソームを複製するベクターが必要とされる。 発明の概要 細胞を形質転換せずに哺乳動物細胞においてエピソームを生産するベクターを 提供することが本発明の目的である。 本発明のさらなる目的は、形質導入した細胞を形質転換することなく高コピー 数のエピソームを複製するベクター上にコードされた外来遺伝子を、エピソーム ベクターによって形質導入した哺乳動物細胞において発現させることによる、遺 伝子治療の方法を提供することである。 また、本発明の別の目的は、複製可能であるが形質転換能は陰性のパポバウイ ルスラージＴ抗原の変異型を提供することである。 これらおよび他の目的を達成するために、本発明は、好適にはＳＶ４０または ＢＫウイルスの開始点である少なくとも１つのパポバウイルスの複製開始点、お よび、複製開始点としての複製能に関与する結合部位を含むが野生型ｐ５３また は網膜芽細胞腫抑制因子（ＲＢ）遺伝子産物の少なくとも一方に、好適には両方 に対して結合しないようなパポバウイルスのラージＴ抗原の変異型をコードする ＤＮＡ配列で、ホモまたはヘテロなプロモーターにつながっているＤＮＡ配列を 含む複製可能でおよび形質転換能は陰性のベクターである哺乳動物ベクターを提 供する。ベクターの別の態様において、パポバウイルスラージＴ抗原の変異型を コードするＤＮＡ配列は、パポバウイルスの初期プロモーター、誘導可能なプロ モーター、またはホルモン制御下にあるプロモーターのいずれかにつながってい る。 別の態様において、本発明は、少なくとも１つのパポバウイルスの複製開始点 、複製開始点としての複製能に関与する結合部位を含むが野生型ｐ５３または網 膜芽細胞腫抑制因子の遺伝子産物の少なくとも一方に対して結合しないような、 パポバウイルスのラージＴ抗原の変異型をコードする第一ＤＮＡ配列、第一ＤＮ Ａ配列につなげた第一プロモーター、および第二プロモーターにつなげた外来遺 伝 子をコードする第二ＤＮＡ配列を含む、複製能をもつが形質転換能の陰性なベク ターで哺乳動物細胞を形質導入し；および形質導入した細胞において外来遺伝子 を発現することを含む哺乳動物細胞における外来遺伝子の発現方法を提供する。 この方法の好適な態様において、パポバウイルスの複製開始点はＢＫウイルスの 複製開始点またはＳＶ４０の複製開始点のいずれかであり、パポバウイルスラー ジＴ抗原の変異型は、ＳＶ４０およびＢＫウイルスの複製開始点の両方に結合す るが、野生型ｐ５３および網膜芽細胞腫抑制因子の遺伝子産物は結合しない変異 型ＳＶ４０ラージＴ抗原である。別の態様において、哺乳動物細胞をｉｎ ｖｉ ｔｒｏでベクターで形質導入し、それから細胞を哺乳動物中に導入して外来遺伝 子をｉｎ ｖｉｖｏで発現させる、またはベクターを哺乳動物中に投与してその 哺乳動物の細胞をｉｎ ｖｉｖｏで形質導入し、これらの細胞から外来遺伝子が 発現するようにする。 別の態様において、本発明は、ＳＶ４０の複製開始点として、野生型ｐ５３お よび網膜芽細胞腫抑制因子の遺伝子産物には結合しない、複製能に関する結合部 位を含むＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型をコードするＤＮＡ配列を提供する。好 適な態様において、そのＤＮＡ配列にコードされるＳＶ４０ラージＴ抗原の変異 型の１０７番目の残基はリジンで、４０２番目の残基はグルタミン酸である。 ヒト細胞において染色体外で複製する高度に効率的なエピソーム発現ベクター が開発された。本発明者らは、複製可能で、形質転換能の陰性なＳＶ４０ラージ Ｔ抗原変異は、ＳＶ４０のＤＮＡ開始点またはＢＫウイルスのＤＮＡ複製開始点 を含むプラスミドの複製を効率よく引き起こすことを示した。好適なベクターは 、ＳＶ４０と有意な相同性を示す小さなＤＮＡウイルスであるＢＫウイルス（Ｂ ＫＶ）に由来する。安定な膀胱癌細胞系列の形質導入体において同定されたＢＫ Ｖエピソームの特性は、これらのベクターは少なくとも５カ月のあいだ染色体外 で複製し；エピソームによって仲介される細胞死を誘導することなく安定な高コ ピー数（１５０コピー）になり；挿入（インテグレーション）の確率は非常に低 く；コピー数に比例して遺伝子を転写し；細胞分裂の際には娘細胞に効率的に転 移し；ヒルト(Hirt)上清ＤＮＡから細菌にシャトル可能で；および選択をかけな くとも数カ月の間膀胱癌細胞形質導入体中で存在することがわかった。これらの 特 性は、このベクターのシステムをヒト細胞に遺伝子を転移するのに使用可能であ ることを示している。 本発明は、ＳＶ４０またはＢＫＶのＤＮＡ開始点のような、パポバウイルスの ＤＮＡ複製開始点を含むプラスミドの複製を引き起こすパポバウイルスラージＴ 抗原の複製可能で形質転換能の陰性な変異を作製することによってエピソームベ クター技術に有意な利点をもたらす。他のＤＮＡ開始点トランス活性化因子（例 えばＥＢＮＡ−１）の複製可能で形質転換能の陰性な変異は、現在のところ得ら れていないので、このエピソーム発現システムは宿主細胞に形質転換を誘導せず に効率的にエピソームの複製を可能にする唯一の形態である。この利点により、 ヒト遺伝子治療への応用に対して安全で効率的なエピソームベクターの開発が可 能になる。このエピソームベクターシステムはまた、癌腫瘍進行測定の開発のよ うなｉｎ ｖｉｔｒｏにおける応用にも拡張でき、ｃＤＮＡライブラリークロー ニング用の効率的なエピソームベクターシステムおよびヒト細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏの異種遺伝子の発現の開発に対しても有意な利点を持つ。 図面の簡単な説明 図１ＡおよびＢは、ＢＫＶエピソームベクターであるｐＲＰ−ｃｎｅｏＸで安 定に形質導入したＨＴ−１３７６細胞のサザン解析を示す。細胞は、Ｇ４１８で 選択した７１日後に評価した。パネルＡ．３Ｘ１０5細胞からのヒルト(Hirt)Ｄ ＮＡをレーン１−４にのせ、示した制限酵素で消化した。ＢａｍＨＩで消化した ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸプラスミドを量を増加させて（５０−４００ｐｇ）レーン５ −９にのせた。パネルＢ．同様のＨＴ−１３７６／ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸからの安 定な形質導入体由来の全細胞ＤＮＡ（１０ｐｇ）をＢａｍＨＩで消化した（レー ン１）。レーン２は、ＢａｍＨＩで消化した５００ｐｇのｐＲＰ−ｃｎｅｏＸプ ラスミドである。両パネルのハイブリダイゼーション用のプローブは32Ｐでラベ ルしたｐＲＰ−ｃｎｅｏＸである。 図２は、ＢＫＶエピソーム（ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ、レーン１）およびエピソー ムでない（ｐＳＶ２ＮＥＯ，レーン２−４）発現ベクターで安定に形質導入した ＨＴ−１３７６細胞におけるネオマイシン耐性遺伝子のｍＲＮＡの発現を示す。 ハイブリダイゼーションプローブ：ネオマイシン耐性遺伝子（パネルＡ）、β− アクチン（パネルＢ）。 図３は、選択圧をはずしてからのｐＲＰ−ｃｎｅｏＸのＨＴ−１３７６細胞に おけるエピソームプラスミドとしての存続性を示す。Ｇ４１８存在下（７１日、 レーン１；１２２日、レーン２）または非存在下（１６日、レーン３；３４日、 レーン４；４７日、レーン５；６４日、レーン６）において増殖した３Ｘ１０5 個のＨＴ−１３７６ ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ形質導入体由来の、ＢａｍＨＩで消化 したヒルト上清ＤＮＡのサザン解析。ハイブリダイゼーション用のプローブは、32 ＰでラベルしたｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ（パネルＡ）またはｐＡＭ１（マルテンス 、ら．，１９７９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３５：３２７−３５１）の誘導 体であるｐＫＳＵ１から得たマウスミトコンドリアＤＮＡ（ＮＤ１）の32Ｐでラ ベルした３４３塩基対のＢａｍＨＩ断片である（パネルＢ）。 図４は、選択圧をはずしてからのＨＴ−１３７６ ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ形質導 入体におけるネオマイシン耐性遺伝子の発現の存続を示す。Ｇ４１８存在下（７ １日、レーン１；１２６日、レーン６；１５６日、レーン７）または非存在下（ １６日、レーン２；３４日、レーン３；４７日；レーン４；６４日、レーン５） におけるＨＴ−１３７６形質導入体由来のＲＮＡ２０μｇのノーザンブロット解 析。ハイブリダイゼーション用のプローブは、ネオマオシン耐性遺伝子（Ａ）の コード配列を含むｐＳＶ２ＮＥＯの32ＰでラベルしたＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩ Ｉ断片または32Ｐでラベルしたβアクチンプラスミド、ｐＨＦβＡ−１（グヌン ク、ら。、１９８３）（Ｂ）である。 図５は、複製可能で、形質転換能の陰性なＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ−Ｔ） 変異体における点突然変異の位置を示す。カッコで示した１０７／４０２−Ｔの ｐ５３およびＲＢの結合特性は予期される結果である。 図６は、ＳＶ−Ｔまたは１０７−Ｔで安定に形質導入した５６３７細胞の単一 細胞クローンのウエスタンブロット解析を示す。ｐＲｃ／ＣＭＶ．ＳＶ−Ｔ（レ ーン１−３）またはｐＲｃ／ＣＭＶ．１０７−Ｔ（レーン４−７）で形質導入し た５６３７細胞のクローンを示す。ブロットは、坑Ｔ抗原モノクローナル坑体ｐ ＡＢ４１６および化学蛍光発生システム（アマシャム）を使用して作製した。レ ーンごとに抽出物４０μｇをのせた。 図７。サザンブロット解析は、１０７−Ｔがプラスミドの染色体外で複製を引 き起こすことを示す（ＳＶ４０のＤＮＡ複製開始点を含むｐＳＶ２ＣＡＴ）。１ ０７−Ｔ ５６３７クローンのＣ１０（検出可能な発現無し）およびＥ１（高発 現）を、ｐＳＶ２ＣＡＴで形質導入し、ヒルト上清ＤＮＡを形質導入のおよそ４ 日後に調製した。約５Ｘ１０5細胞由来のヒルト上清ＤＮＡをレーンごとにのせ 、ＤｐｎＩで消化する前と後で上記に示したように評価した。ハイブリダイゼー ションのプローブは32ＰでラベルしたｐＳＶ２ＣＡＴである。 発明の詳細な記載 我々は、形質転換した一過性の上皮細胞（例えば、ＨＴ−１３７６膀胱癌細胞 系列）において効率的に複製するエピソームベクターを同定した。このベクター （ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ）は、ＳＶ４０の初期プロモーター制御下にあるマーカー 遺伝子およびＢＫＶの複製開始点を含む３．２ｋｂのＢＫＶ断片およびＢＫＶの 初期プロモーターの制御下にあるＢＫＶラージＴ抗原を含む。ＥＢＶエピソーム エレメントはＨＴ−１３７６一過的形質導入体中では活性でない一方、ＢＫＶエ ピソームはこれらの細胞において染色体外で複製する。さらに重要なことに、Ｂ ＫＶエピソームはＨＴ−１３７６細胞において何の細胞毒性も示さずに効率的に 複製でき、安定な形質導入体において高コピー数のエピソームが生じる。 このコンストラクトで安定に形質導入したＨＴ−１３７６細胞におけるＢＫＶ エピソームｐＲＰ−ｃｎｅｏＸのコピー数は、およそ細胞あたり１５０コピーで あった（実施例１参照）。このコピー数は、リンパ細胞腫系列におけるＥＢＶ由 来のエピソームがおよそ１０−５０コピーで、およびマウスＣ１２７細胞におけ るウシパピローマウイルス由来のエピソームが１０−８０コピーであることと比 較できる（サーバー、ら．，１９８１；ジマイオ、ら．，１９８２；イエイツ、 ら．，１９８５）。ＨＴ−１３７６形質導入体におけるｐＲＰ−ｃｎｅｏＸの高 コピー数は、何世代にも渡ってこれらＨＴ−１３７６形質導入体の子孫にｐＲＰ −ｃｎｅｏｘが効率的に転移するのに重要なようである。挿入（インテグレーシ ョン）用ベクターｐＳＶ２ＮＥＯまたはｐＲＰ−ｃｎｅｏＸのいずれで形質転換 し、 Ｇ４１８存在下または非存在下においてまいた、ＨＴ−１３７６細胞の軟寒天上 でクローンをつくる効率は本質的に同等であった。これらのデータは、ネオマイ シン耐性遺伝子の娘細胞へのエピソームの転移は、遺伝子がＨＴ−１３７６のゲ ノムＤＮＡに挿入された場合と同じ効率であることを示している。細胞分裂の間 多くのプラスミドのコピーがランダムに分離することを仮定すると、エピソーム を１コピーしか含まないという娘細胞の可能性は非常に小さいであろうことから 、この結果は、予測されなかったことではない。 我々のデータは、ＢＫＶエピソーム発現ベクターはＨＴ−１３７６細胞におい て形質導入した遺伝子を非常に高レベルで転写できることを示している。ｐＳＶ ２ＮＥＯを５コピー挿入（インテグレート）した形質導入体に比較して、ｐＲＰ −ｃｎｅｏＸ形質導入体における定常状態のネオマイシン耐性遺伝子の発現レベ ルはおよそ２０倍であった。ネオマイシン耐性遺伝子は、どちらの構造でもＳＶ ４０の初期プロモーターによって転写制御されているため、これらのデータは、 ＢＫＶエピソームベクターは、安定な形質導入体を作製するために宿主細胞ゲノ ム中に挿入（インテグレート）しなければならないプラスミドベクターよりも、 形質導入した遺伝子の発現が有意に高くなることを示している。この相違は、一 部には、ＨＴ−１３７６形質導入体におけるｐＳＶ２ＮＥＯ（５コピー）に比較 してｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ（１５０コピー）のコピー数が高いことによるのであろ う。 エピソームベクターの比較 ＢＫＶ由来のエピソームは、ＥＢＶ，ＢＰＶ，およびＳＶ４０由来のエピソー ムとは異なるいくつかの特徴を持つ。ＢＫＶおよびＳＶ４０のラージＴ抗原間の 有意なアミノ酸の相同性にも関わらず（マン、ら．，１９８４，Ｖｉｏｌ．，１ ３８：３７９−３８５）、ＢＫＶエピソームは安定な生育可能な形質導入体を生 み出す一方、ＳＶ４０に基ずくエピソームは非常に高コピー数複製するために典 型的に細胞死が起こる（ツイ、ら．，１９８２；ロバートら．，１９８６）。こ の結果は、これらの形質導入体に存在するＴ抗原のレベル、これらのウイルス由 来のＤＮＡ開始点の特性、またはＳＶ４０−ＢＰＶ由来のエピソームにおいて記 載された（ロバート、ら．，１９８６；ハンバー、ら．，１９８８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：４０１０−４１０４）ように、Ｄ ＮＡ複製を制御するＢＫＶエピソーム中のシス制御配列の存在といった相違によ る部分があるのかも知れない。 重要なことは、ｐＲＰ−ｃｎｅｏＸのコピー数は、細胞あたりおよそ１５０コ ピーの安定なプラトーに達するため、ＢＫＶエピソームは安定な形質導入体にお いて細胞周期１回につき１回複製するようである。安定なコピー数はまた、低い コピー数ではあるが同じように生存可能であり安定な形質導入体を生じる、ＥＢ ＶおよびＢＰＶ由来のエピソームの特徴である。しかし、ＥＢＶ由来のエピソー ム（イエイツ、ら．，１９８４；ハンバー、ら．，１９８８）とは逆に、ＢＫＶ エピソームのコピー数は選択圧なしで２カ月間増殖した後にも量が減少しないで 維持される。Ｇ４１８をぬいてから時間経過を追って調べたｐＲＰ−ｃｎｅｏＸ のコピー数の変動は（図３に示した）、エピソームの存在を維持するようにする 因子（細胞周期における効率的なエピソームの複製および、ＢＫＶラージＴ抗原 を発現する細胞に増殖の利点がある場合）およびエピソームのコピー数を減少さ せる因子（細胞分裂に際してエピソームが不等に分離されたり、または細胞内ヌ クレアーゼで破壊される場合）のあいだの動的相互作用を表わすのかもしれない 。ＢＫＶエピソームと比較して、ＢＰＶエピソームはまた、選択をかけない形質 導入したＣ１２７形質導入体において安定なコピー数が維持される（サーバー、 ら．，１９８１；ジマイオ、ら．，１９８２）。しかし、選択をかけない形質導 入体においてＢＫＶエピソームのコピー数がより高いことは、これらのエピソー ムを遺伝子治療に使用するための手法において利点である。 Ｉ．定義 本発明を記載するにあたり、以下の技術用語を以下の定義にしたがって使用す る。 ”ヘテロな”領域またはＤＮＡ構築物のドメインは、自然にはより大きな分子 とは結合しない、より大きなＤＮＡ分子の中の同定可能なＤＮＡ断片である。従 って、ヘテロな領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合には、遺伝子は、通常 元来の生物体ゲノムでは哺乳動物のゲノムＤＮＡと隣あわないＤＮＡと隣あう。 ヘ テロな領域の別の例は、コード配列それ自身が自然にはみられないような構築物 である（例えば、ゲノムのコード配列はイントロンを含むがイントロンを持たな いコード配列（ｃＤＮＡ）、または自然の遺伝子とは異なるコドンを持つ合成配 列）。アリル多様性または自然に起こる変異導入は、本明細書中で記載するヘテ ロなＤＮＡ領域には含まない。 ＤＮＡ”コード配列”は、適切な制御配列の制御下に置いたときにｉｎ ｖｉ ｖｏで転写されて翻訳されポリペプチドになるＤＮＡ配列のことである。ポリア デニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常コード配列の３’部位に位置する 。”プロモーター”は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼが結合でき、下流の（３’ 方向）コード配列の転写を開始するＤＮＡ制御領域である。細胞中のプロモータ ーの制御下にあるコード配列は、ポリメラーゼがプロモーターに結合した後にＲ ＮＡポリメラーゼによって転写され、コード配列はｍＲＮＡに転写されてそれか らコード配列にコードされるタンパク質に翻訳される。 細胞の”形質導入”は、外来遺伝子ＤＮＡを細胞膜の内側に導入するときに起 こる。”形質転換”は、一次細胞または有限回の分裂しか行なわない細胞系列の 細胞集団が不死になるとき、または不死の細胞系列がさらに腫瘍形成特性を獲得 したときに起こる。例えば、形質転換は、形質転換した細胞の軟寒天上において クローンを形成またはヌードまたはＳＣＩＤマウスで腫瘍を形成する能力によっ て検出する。”クローゾ”は、細胞分裂によって単一の細胞または共通の祖先に 由来する細胞集団である。 ”レプリコソ”は、ｉｎ ｖｉｖｏでＤＮＡ複製の自動単位として働く遺伝的 要素である（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）。 ”ベクター”は、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンで あり、つなげた断片の複製を行なうように他のＤＮＡ断片（ヘテロな断片）をつ なげられる。 ”エピソーム”は、細胞の染色体とは別に細胞中に存在する低分子量ＤＮＡ分 子である。エピソームは染色体の分裂複製とは独立に複製し、細胞分裂の際に細 胞内容物のランダムな分離の一部として娘細胞に転移される。”コピー数”は、 エピソームとして個々の細胞中に存在する倍化したＤＮＡ分子の数またはゲノム 中の倍化した配列の数である。細菌のエピソームは通常プラスミドと呼ばれる。 ”外来遺伝子”は、個々の宿主細胞のゲノムにはみられない遺伝子である。外 来遺伝子は、宿主と同一種または異なる種由来である。本発明は、細胞中で外来 遺伝子を発現するように意図した外来遺伝子を含むＤＮＡを使用した細胞の形質 導入について記載し、もちろんそのＤＮＡは外来遺伝子が要求された方向に発現 するのに必要な制御配列を含む。 実質的に相同的な２つのＤＮＡ配列は、例えば特別のシステムで提示された厳 しい条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験において互いにハイブリ ダイズする能力により同定できる。定義した適切なハイブリダイゼーションの条 件は、当該技術分野に従事する者の技術範囲内である。例えば、マニアチスら． ，上述；ＤＮＡクローニング、第Ｉ巻およびＩＩ巻上述；核酸ハイブリダイゼー ション、上述、参照。 ＩＩ．ベクターについての記載 Ａ．パポバウイルス パポバウイルスは、二重鎖ＤＮＡで、共有結合により閉じており、およそ５０ ００塩基対の環状ゲノムであり、３種のウイルスタンパク質を含む正二重面体キ ャプシドを持つ。パポバウイルスは、ヒト（ＢＫウイルスおよびＪＣウイルス） 、サル（サル小腔ウイルス（ＳＶ４０）およびリンパ細胞系パポバウイルス）、 ヒヒ（サル薬剤１２）、マウス（ポリオーマウイルスおよびＫウイルス）、ハム スター（ハムスターパポバウイルス）、ウサギ（ウサギ肝臓小腔ウイルス）、お よびセキセイインコ（セキセイインコヒナ病ウイルス）を含む、様々な宿主に感 染する。これらのウイルスは、核酸配列の比較に基ずいて関連が判断された。 ウイルスゲノムは、初期および後期転写領域に分けられ、複製開始点を１つ含 む。転写は、複製開始点の近くのプロモーターから始まり、２方向に進行する一 １つは初期転写物の方向でもう１つは後期転写物の方向。後期転写領域は、コー トタンパク質（ＶＰ１，ＶＰ２，およびＶＰ３）をコードする。初期転写領域は 、Ｔ抗原、特にウイルスＤＮＡ複製に機能するラージＴ抗原をコードする。ラー ジＴ抗原はまた、初期プロモーターの近くのウイルスＤＮＡに結合することによ っ て初期転写を下方制御し、ＤＮＡ合成に含まれる細胞内遺伝子を活性化し、組織 培養した一次細胞を形質転換する。 ウイルスＤＮＡは、核内において”ミニ染色体”として複製するが、ウイルス ＤＮＡは細胞の１回のＳ期において何度も複製できる。ウイルスＤＮＡの複製は 、ラージＴ抗原によって開始し、細胞内ＤＮＡ合成の刺激とは独立している。ラ ージＴ抗原は、複製開始点の隣のウイルスＤＮＡに結合し、ＤＮＡヘリックスを 解き、これはウイルスＤＮＡの複製に必要である。それから新しいウイルスＤＮ Ａが細胞内酵素によって合成される。 Ｂ．エピソーム増幅カセット 遺伝子治療の応用において高い発現を提供するために、エピソームベクターは 、形質導入した細胞を形質転換することなく染色体外で複製しなくてはならない 。本発明は、このようなパポバウイルスの複製に必須のエレメントを含む複製カ セットを提供する。複製カセットは（またはエピソーム増幅カセット）、１）パ ポバウイルスのＤＮＡ複製開始点（ＯＲＩ）；２）パポバウイルスラージＴ抗原 の複製可能な、形質転換に陰性な変異型；および３）変異Ｔ抗原の発現を引き起 こすプロモーターを含む。本発明の複製カセットが、環状ＤＮＡ分子において細 胞ＤＮＡ分子内の他のＤＮＡ配列と結合している場合、ＤＮＡ分子は、形質導入 の後に哺乳動物細胞によってエピソーム様に複製される。 ミラネシ、ら．，（１９８４）によって報告された最初のＢＫＶエピソームベ クターは、ＤＮＡ複製の開始点およびＢＫＶ初期プロモーターによって転写制御 されるＢＫＶラージＴ抗原を含む３．２ｋｂのＢＫＶ断片を含む。以下に示し、 実施例に例示したように、ＢＫＶ発現システムは、染色体とは別に複製する能力 は保持するが腫瘍は形成しない細胞において軟寒天上での増殖は誘導しないよう に本発明にしたがって修飾される。複製カセットの構成分は、以下の基準に従っ て選択し、および以下に記載した様にくみあわせる。 １．複製開始点 複製カセットにおける複製開始点は、パポバウイルスの１つのＯＲＩ配列から 選択する。これらの位置から開始したＤＮＡ複製は、同じウイルスのラージＴ抗 原による制御に感受性であり、および他のパポバウイルスのラージＴ抗原による 感受性は同程度またはさらに低くなる。 適合したラージＴ抗原の存在下において、パポバウイルス開始点はエピソーム の複製を引き起こす。開始点／ラージＴ抗原の組合せは、エピソームの複製を引 き起こすかどうかについて試験する必要がある。複製能力についての１つの簡単 な試験は、調べたい複製カセットとしてのラージＴ抗原を発現する細胞集団を調 べたい複製開始点を含むベクターで形質導入し、それからサザンブロットにより エピソームＤＮＡの合成について形質導入した細胞を検査する（例えば、実施例 ６Ｃ参照）。 特に好適には、ＢＫＶラージＴ抗原（ＢＫ−Ｔ）またはＳＶ−Ｔのいずれかに よりエピソームの複製を引き起こすことが示されているＢＫＶ開始点である。他 の好適な開始点は、ＳＶ４０，ＪＣウイルス、リンパ細胞系パポバウイルス、お よびサル薬剤１２を含む、霊長類において複製を引き起こすものである。ヒト細 胞においてエピソームの複製を引き起こすことが示されたパポバウイルスの複製 開始点は、本発明の複製カセットに適している。 ＢＫＶレプリコンは、ＨＴ−１３７６膀胱癌細胞系列において活性である一方 、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）レプリコンはこれらの細胞において機 能はない。ＢＫＶはヒト尿上皮細胞に対して栄養性を示し（アーサー、ら．，１ ９８６、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１５：２３０−２３４）、ＢＫＶ由来 のエピソームベクターは、ヒト膀胱癌細胞系列において効率的に複製する。ＳＶ ４０／ＢＫハイブリッドウイルス由来のエピソームは、腫瘍を形成しない５６３ ７膀胱細胞系列において染色体とは別に複製する。これらのデータは、エピソー ムのコンストラクトが由来するウイルスの組織栄養性から、エピソームコンスト ラクトが活性となる細胞型を予測できることを示唆している。 ２．ラージＴ抗原変異体 ＢＫＶエピソームの複製活性は、ＢＫ−Ｔの発現に依存する。ＢＫ−Ｔは、こ れまでかなり記載された不死および腫瘍形成の性質を持つ（シン、ら．，１９７ ５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２：４４３５−４４３ ９；クリスチャン、ら．，１９８７、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４７：６０６６ −６０７３；ミッチャロビツ、ら．，１９８７，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６１：２６４ ８−２６５４；ハナハン、ら．，１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２６５ −１２７５；デカプリオ、ら．，１９８８、Ｃｅｌｌ，５４：２７５−２８３； チェン、ら．，１９９０，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６４：３３５０−３３５７；チェン 、ら．，１９９２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，７：１１６７−１１７５）、ＳＶ４０ラ ージＴ抗原（ＳＶ−Ｔ）と７５％のアミノ酸における相同性がある（ヤング、ら ．，１９７９）。ＳＶ−Ｔと同様に、これらのＴ抗原が腫瘍形成特性を誘導する という初めに提唱された機構である（デカプリオ、ら．，１９８８；チェン、ら ．，１９９２）、ＢＫ−Ｔは野生型ｐ５３および網膜芽細胞腫（ＲＢ）抑制遺伝 子産物と結合しそれによって不活性化することができる（マン、ら．，１９８４ ；ダイソン、ら．，１９９０、Ｊ．Ｖｉｏｌ．６４：１３５３−１３５６）。Ｂ Ｋ−Ｔを発現するトランスジェニックマウスは、腎臓の腫瘍が発達しおよび胸腺 の増殖が無秩序になり（ダリンプル、ら．，１９９０，，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６４ ：１１８２−１１９１）、およびＢＫ−ＴはＮＩＨ ３Ｔ３細胞およびラット胎 児の腎臓細胞を形質転換できる（ナクシャトリー、ら．，１９８８、Ｊ．Ｖｉｏ ｌ．，６２：４６１３−４６２１）。それゆえ、野生型ＢＫ−Ｔを含むＢＫＶエ ピソームベクターは、ある腫瘍を形成しない細胞系列に対して腫瘍形成の特性を 与え、ベクターが培養中の細胞に軟寒天上の増殖を可能にするまたはｉｎ ｖｉ ｖｏで腫瘍への形質転換を誘導することが可能であることから、このようなエピ ソームベクターは遺伝子治療における使用に適さない。 しかし、ＳＶ−ＴおよびＢＫ−Ｔ間の有意な相同性から、この問題を解決する 特別な手法が導かれる。ＳＶ−Ｔはｉｎ ｖｉｔｒｏでＢＫＶ複製開始点に結合 でき、ＣＯＳ細胞においてＢＫＶ複製開始点を含むプラスミドの複製を刺激でき る（レイダー、ら．，１９８３，Ｖｉｏｌ．，１２９：２３９−２４５；デイリ ー、ら．，１９８９，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６３：３５６−３６５）。それ故、形質 転換特性を抑圧する複製可能なＳＶ−Ｔ変異は、形質転換することなくＢＫＶエ ピソームの複製を促進するＢＫ−Ｔの代用物として検討した。 複製可能で、形質転換の陰性なＳＶ−Ｔ変異 ＳＶ４０ ＤＮＡ開始点に結合するＳＶ−Ｔドメインは、実施例６の下に例示 したように、ＲＢおよびｐ５３結合ドメインとは離れている。３つの複製可能で 形質転換の陰性なＳＶ−Ｔ変異もまた例示する。第一のＳＶ−Ｔ変異は、１０７ −Ｔ（Ｋ１としても呼ばれる、カルデロン、ら．，１９８４，Ｖｉｏｌ．，１３ ９：１０９−１３７）であり、これはある細胞型において腫瘍は形成しないが複 製可能である（デカプリオ、ら．，１９８８；チェン、ら．，１９９０；チェン 、ら．，１９９２；カルデロン、ら．，１９８４；チェリングトン、ら．，１９ ８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：１３８０−１３８４）。１０７−Ｔ は、１０７番目のコドンがグルタミン酸のかわりにリジンに置換した結果、野生 型ＳＶ−Ｔと１塩基対異なる。１０７番目のコドンは、ＳＶ−ＴのＲＢ結合ドメ インの中にあり、１０７−ＴがＲＢに結合できないことが腫瘍を形成しない特徴 を説明するようである。しかし、１０７−ＴのＤＮＡ結合領域は、変化しておら ず、以下に示すように我々は１０７−ＴはＳＶ４０ ＤＮＡ開始点を含む試験用 プラスミドの複製を引き起こすことが可能であると決定した。 第二の変異体は４０２−Ｔであり、これは４０２番目のコドンがアスパラギン のかわりにグルタミン酸に置換している（リン、ら．，１９９１、Ｊ．Ｖｉｏｌ ．，６５：２０６６−２０７２）。４０２−Ｔ点突然変異は、ＳＶ−Ｔのｐ５３ 結合ドメインの中にあり、４０２−ＴはＲＢと結合でき、またＳＶ４０ ＤＮＡ 開始点の複製も引き起こすようであるけれども、野生型のｐ５３と結合できない 。４０２−Ｔは、ヒト二倍体繊維芽細胞系列Ｄ．５５１およびＷＩ−３８におい て腫瘍を形成しない（リン、ら．，１９９１、Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６５：６４４７ −６４５３）。 最後に、新規のＳＶ−Ｔ変異体は１０７−Ｔおよび４０２−Ｔに見いだされた 両方の点変異を含む（１０７／４０２−Ｔ）ように構築された。このＳＶ−Ｔ変 異体は、ｐ５３およびＲＢのいずれにも結合せず、腫瘍形成特性に関与する能力 は非常に低い。複製可能な１０７／４０２−Ｔは、特別価値がある。 野生型ｐ５３およびＲＢへの結合活性が異なる３つの異なるＳＶ−Ｔ変異をコ ードする挿入用ベクターを作製し、これらのＳＶ−Ｔ変異ベクターを腫瘍を形成 しない膀胱細胞系列中に形質導入した。単一の細胞クローンを、変異ＳＶ−Ｔ分 子を発現するが腫瘍を形成しないままであるものとして同定し、およびこれらの クローンのあるものはＳＶ４０ ＤＮＡ開始点を含むプラスミドの複製を引き起 こすことが示された。それゆえこの方法は、腫瘍を形成しない細胞において外来 遺伝子を効率的に発現するためのＳＶ４０レプリコンを保持するエピソームベク ターに使用するためのパポバウイルスラージＴ抗原の調節に成功した。 本発明の複製カセットによってコードされるラージＴ抗原は、複製可能でおよ び形質転換の陰性でなければならない、つまりＤＮＡ複製を誘導するが宿主細胞 を形質転換してはいけない。ＤＮＡ複製のトランスの活性化は、上記に記載した 様に、一過性のエピソーム形質導入体から抽出したヒルト上清または全細胞ＤＮ Ａのサザンブロット解析を使用して試験できる。 変異ラージT抗原の形質転換活性は直接分析でき（例えばNakshatriら、1988を 参照のこと）、または変異T抗原を発現する発現ベクターを形質導入した細胞は 、変異T抗原が形質転換陰性であるかどうかを決定するために、ソフトアガーの クローニング活性、またはヌードまたはSCIDマウスでの増殖を分析することがで きる。代わりになるべきものとして、変異抗原は野生型p53および野生型RBとの 非結合実験に基づいて選択する。一つの適当な分析法は、invitroで翻訳した変 異ラージT抗原タンパク質を調製し、それぞれp53またはRBに対する抗血清で免疫 沈降させる前に、これらのタンパク質およびそれらと複合体をつくっているどん なT抗原も免疫沈降させるために、それを本物の野生型p53またはRB（例えば、in vitro で翻訳するかまたはバキュロウィルスで調製したもの）と混合することに よって結合を測定する。免疫沈降物のウェスタンブロットは、ラージT抗原に対 する抗血清を用いて行い、それは結合に対して陽性な変異T抗原を検出する。 代わりとなる方法は、野生型p53およびRBを発現している哺乳動物細胞群（好 ましくはヒトの細胞株由来のもの）を、細胞がラージT抗原の変異体を発現する ように（例えばT抗原に対する抗血清への結合で検出される）発現ベクターで形 質導入する方法である。それから細胞を溶解させ、溶解物をp53またはRBに対す る抗血清で処理する。免疫沈降物は上述したように処理する。後者の分析法は、 例えば発現される変異T抗原の量が、存在するp53またはRBの量と極端に異なって いたり、または分析する細胞によって発現されるp53またはRBに僅かな変異が存 在する場合には偽陰性の可能性があるが、それはよりin vivoの状態に近い。 特に好ましい変異ラージT抗原は、上述したSV-T変異体の107/402-Tである。SV -Tの他の変異体および他のパポバウィルスのラージT抗原は文献に記載されてお り、さらなる変異体は周知の組換えDNA技術によって作製することができる。こ れらの変異体は、上記の分析によって決定されるように複製可能および形質転換 陰性である限りは、本発明の複製カセットとして適している。 ３．プロモーター 一般に、複製可能で形質転換陰性のパポバウィルスのラージT抗原は、異種ま たは同種のどちらかのプロモーターによって転写が制御される。異種のプロモー ターとは、通常哺乳動物のプロモーターおよび哺乳動物ウィルスのプロモーター のように哺乳動物細胞内で活性のあるプロモーターである。エピソームの増幅カ セットが遺伝子治療への適用のためのエピソームの発現ベクターの一部である場 合には、プロモーターはもちろん外来遺伝子の発現の標的となる細胞内で活性を もつように選択する。 CMVの即時型初期プロモーター(immediate early promoter)のエンハンサーの ようないくつかの異種のプロモーターはT抗原によって負に制御されず、その結 果T抗原の発現が最大限に増加し、それによってエピソームの複製が最大限にな る。これは高レベルの遺伝子発現が望ましいような遺伝子治療への適用のための 一過的な形質導入法に特に有利である。代わりとなるべきものとして、T抗原に よって負に制御される同種のパポバウィルスのプロモーターの利用によって、制 御の効かなくなったエピソームの複製を抑えることができ、その結果、制御され た安定な発現が得られる。このようなプロモーター/T抗原/複製起点の組み合わ せによって、形質導入された細胞内で高コピー数で安定なエピソームが提供され る。 代わりとなるべきものとして、エピソームの複製を制御できるように変異ラー ジT抗原の発現を制御するプロモーターを選択することができる。例えば、（メ タロチオネインのプロモーターのような）誘導可能なプロモーターが利用でき、 エピソームの複製は誘導物質の存在下で増幅される。代わりになるべきものとし て、発生の段階によって制御される遺伝子または組織特異的遺伝子（例えば乳漿 の酸性タンパク質遺伝子に対する胸部特異的プロモーター、Shoenebergerら、19 88，EMBO J.,7: 169-175）のためのプロモーターが、そのプロモーターが活性な ある細胞種に対してエピソームのコピー数の増幅を制限するために利用される。 その発現レベルがコピー数に比例するような外来遺伝子をもつエピソームを用い た遺伝子治療では、T抗原の発現を制御するプロモーターの選択によって治療に よる発現制御の測定法が提供される。 ４．カセットの挿入のためのベクター 概して、本発明の複製カセットが挿入されるベクターとは、特定のパポバウィ ルスの複製起点およびラージT抗原がベクターの複製を起こさせる哺乳動物細胞 に、どれもそのカセットおよび関連した外来遺伝子を持ち込むようなベクターで ある。もちろん、そのベクターは、哺乳動物細胞においてパポバウィルスの複製 起点からの複製を阻害し、または遺伝子治療への適用のためにベクターに挿入さ れたどのような外来遺伝子の発現も阻害するようなどのような配列も含まない。 適当なベクターは、哺乳動物細胞の形質導入への続いた使用のために、バクテリ ア培養液中で複製カセットを含む大量のベクターを産生するように、シャトルベ クターとして利用できるバクテリアのプラスミドを含む。他の適当なベクターは 、通常ウィルス由来で哺乳動物細胞に形質導入されることが知られていて、欠陥 があるかまたは変異のあるウィルスを含む、病原性がないかまたは限られた病原 性しかない周知の哺乳動物のベクターを含む（例えば、Hockら、1986，Nature,3 20 :275-277; Sorrentinoら、1992，Science,257:99-103; Bayleら、1993，Human Gene Therapy，4:161-170; Le Gal La Salleら、1993，Science,259:988-990; Quantinら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:2581-2584; Rosenfeldら、 1992，Cell，68:143-155、を参照のこと）。ベクターが哺乳動物ウィルスである ところでは、外来遺伝子のウィルスゲノムへの挿入がウィルスの伝染力を破壊し ないことがもちろん重要である。特定のベクターの選択には、エピソームの増幅 が望まれる特定の哺乳動物または特定の細胞種を考慮に入れ、当業者は当該技術 分野において利用可能な多くのベクターの中から、適したベクターを容易に選択 することができる（例えば、Sambrookら、1989，"Molecular Cloning:A Laborat ory Manual"; Millerら、1989，BioTechniques,7:980-990; Salmonsら、1993，H uman Gene Therapy，4:129-141; Stratford-Perricaudetら、1991，"Human Gene Transfer"中、Cohen-Haguenauerら編集、John Libbery Eurotest Ltd.219:51-6 1、を参照のこと）。 III.ベクターの作製法 A. 構成要素のDNA配列の供給源 様々なパポバウィルスのDNA配列は文献に記載されており、そこには複製起点 、初期プロモーター、およびラージT抗原をコードするDNA配列が含まれる（例え ば、(SV40のためには)Subramanianら、1977，J．Biol．Chem.，252:355-367; Re ddyら、1978，Science，200:494-502; Fiersら、1978，Nature，273:113-120; V an Heuverswynら、1978，Eur．J．Biochem.，100:51-60; （BKVのためには）Yan gら、1979，Science，206:456-461; Deyerleら、1989，J.Virol.，63:356-365; （ハムスターのパポバウィルスのためには）Delmasら、1985，EMBO J.，4:1279- 1286; (JCウィルスのためには)Frisqueら、1984，J．Virol.，51:458-469; （ポ リオーマのためには）Zhuら、1984，J．Virol.，51:170-180、を参照のこと）。 配列の多くを含むクローンは、Stratagene、Gibco-BRL Life Technologies、Uni ted States Biochemicals、およびPromegaのような業者から入手可能な様々な哺 乳動物のベクターに含まれている。BKウィルス、JCウィルス、Kウィルス、ポリ オーマウィルス、およびSV40の完全なゲノム配列を含むクローンは、American T ype Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852 ，U．S．A．(ATCC)より入手可能である。プロモーター、バクテリアの複製起点 、および様々なベクターもまた、組換えDNA操作に従事する当業者によってよく 理解されている他の供給元と同様に、上に列挙した商業的な供給元またはATCCか ら入手可能である。特定のタンパク質をコードする特異的な配列または制御配列 は、以下に記載されているような標準的な組換えDNA技術を用いて、これらのク ローンから得ることができる。哺乳動物の細胞内で発現する特定の外来遺伝子、 およびそれらをコードする配列のための材料元は、遺伝子治療に従事する当業者 にとって容易に分かることであろう。 B. ベクター構築のための組換え技法 本発明の実践には、別の方法で示されない限りは、当該技術分野の範囲内の慣 例的な分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を使用する。そのような技 術は、当業者によく理解されており、文献で十分に説明が為されている。例えば 、Maniatis，Fritsch & Sambrook，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982); "DNA Cloning: A Practical Apploach,"ＩおよびII巻(D．N．Glover編 集，1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J．Gait編集，1984); "Nucleic A cid Hybridization" (Hames & S.J．Higgins 編集，1984); "Animal Cell Cultu re" (R.I．Freshney 編集，1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRLPres s，1986); B．Perbal，"A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984)、お よびSambrookら、 "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (1989)、を参照 のこと。 パポバウィルスの複製起点に対応するDNA部分、パポバウィルスのラージT抗原 のコード配列、およびパポバウィルスの初期プロモーターは、BKウィルス、JCウ ィルス、Kウィルス、ポリオーマウィルス、およびSV40ウィルスを含む、ATCCか ら入手可能なものような容易に入手可能な組換えDNA材料から得ることができる 。特異的配列をもつDNA部分またはオリゴヌクレオチドは、化学的に合成するか 、またはいくつかの手段の中の一つを用いて単離することができる。望みの順に 望みの配列ドメインを含むより大きなDNA分子に会合させるのと同様に、望みのD NA配列を同定、増幅、および単離するための基本的な方法は、当該技術分野にお いて通常の知識を有する者によってよく知られている。例えば、Sambrookら，(1 989); B．Perbal，（1984）を参照のこと。好ましくは、パポバウィルスの複製 起点、ラージT抗原、および初期プロモーターに対応するDNA部分は、ポリメラー ゼ・チェーン反応（M.A．Innisら、"PCR Protocols: A Guide To Methods and A pplications," Academic Press，1990）を用いて個別に単離する。完全な配列は 、標準的な方法によって調製され、完全なコード配列へと組み立てられた重複し たオリゴヌクレオチトから組み立てられる。例えば、Edge（1981）Nature292:75 6; Nambairら、(1984)Science 223: 1299; Jayら、(1984)J．Biol．Chem.，259: 6311、を参照のこと。 組み立てた配列は、どのような適したベクターまたはレプリコンにもクローニ ングでき、そこで組み立てた配列を含まないベクターに対して実質的に独立した 構成要素として維持される。これによって、組み立てた配列の貯蔵庫か提供され 、部分的または完全な配列は、制限酵素を用いて貯蔵庫の材料中のDNAから切り 出したり、PCRによる増幅によって貯蔵庫から抽出することができる。数多くの クローニングベクターが当業者に知られており、適当なクローニングベクターの 選択は選ぶ側の問題である（例えば、Sambrookら、本明細書中に参考文献として 引用されている、を参照のこと）。適当なDNA配列につながった望みのDNA部分を 含むベクターの構築は、その部分に対して使用された技術と同様の技術によって 為される。これらのベクターは、遺伝子治療のための外来遺伝子、シャトルベク ター（原核生物の中間宿主と哺乳動物の最終的な宿主の間を行き来することから ）を作製するためのバクテリアの複製起点などをコードする部分のような、付加 的なDNA部分を含むように構築される。 限定した配列の変異タンパク質の構築および発現のための方法は、当該技術分 野においてよく知られている。パポバウィルスのラージT抗原の既知の変異体を コードするDNA配列は、化学的に合成するか、または野生型の配列からプライマ ー伸長、リンカー挿入、およびPCRを含むいくつかの方法の中の一つによって調 製することができる（例えばSambrookら、を参照のこと）。代わりになるべきも のとして、さらなる変異体は、野生型配列への付加、削除、および置換を含むこ れらの技法によって調製することができる。どちらの場合においても、変異体が 複製可能および形質転換陰性であることを確認するために、上述した分析によっ て変異体を調べるのが好ましい。調べる変異ラージT抗原タンパク質は、この（ 発現）ベクターで形質転換された宿主細胞の中で、そのDNA配列がRNAに転写され タンパク質へと翻訳されるように、ポリペプチドのコード配列をベクター中のプ ロモーターの制御下に置くことによって調製する。変異ラージT抗原タンパク質 は、変異T抗原をコードする配列を含む発現ベクターによって形質導入された増 殖中の宿主細胞によって、そのポリペプチドが発現される条件下で産生される。 適当な増殖の条件は当該技術分野の範囲内のことである。 C. 中間段階のベクター 好ましくは、複製のカセットを含むベクターはまた、機能的なバクテリアの複 製起点およびバクテリア内で機能する選択マーカーも含む（例えば、シャトルベ クター）。これらによって、複製カセットおよび何らかの関連外来遺伝子を含む 大量のベクターがバクテリアの培養液から回収できるところでは、貯蔵のための ベクターの安定な貯蔵庫を供給し、増幅を促進するためのバクテリア内でのベク ターのクローニングが可能となる。適当なバクテリアの複製起点および選択マー カーと同様に、その方法も当該技術分野でよく知られている（例えば、Sambrook ら、を参照のこと）。代わりとなるべきものとして、哺乳動物のウィルスベクタ ーは、周知の技法を用いて哺乳動物細胞培養液中で増幅することができる。ウィ ルスベクターまたはシャトルプラスミドベクターをもつバクテリア細胞を含む調 製物の貯蔵および標準化のための適当な方法は、当業者には容易に分かるだろう 。 D. ベクターの機能テスト 本発明の複製カセットを含むベクターは通常、それらが構築されてそのベクタ ーが複製可能をもちおよび形質転換活性が無いと確認された後に分析する。この 分析によって、ベクターに含まれる配列がその複製カセットが機能するのを妨げ ないことが保証される。複製能（即ち、変異ラージＴ抗原および複製起点の両方 が機能できること）は、通常、標的の細胞種の形質転換されていない一群の細胞 にベクターを形質導入し、サザンブロットによってエピソームDNAの産生をモニ ターすることによって分析する。複製分析から得られた安定な感染細胞は、ベク ターが細胞を形質転換していないことを確認するために、ソフトアガーでのクロ ーン化活性、またはヌードまたはSCIDマウスにおける腫瘍形成でさらに調べるこ とができる。安定な感染細胞由来のDNAに対するサザンブロットは、それらがベ クターをゲノムDNAに組み込んでいるか、またはベクターが安定なエピソームと して保持されているかを示すために利用される。 IV．ベクターの利用 A. 治療上の利用 遺伝子治療において利用するためのベクターは、エピソームの発現ベクターを 産生するように上述したような標準的な組換えDNA技術を用いて、本発明の複製 カセットを発現が望まれる外来遺伝子と共に適当な哺乳動物のベクターに挿入す ることによって構築する。続いて、細胞の生存能を保ち、細胞内でベクターがエ ピソームとして複製する条件下で、細胞をこれらのエピソームの発現ベクターで 形質導入する。エピソームの発現ベクターは様々な方法で患者に投与される。 一つの具体例では、細胞をinvitroにおいてエピソームの発現ベクターで形質 導入する。通常は適当な細胞は患者から得られ、例えば血液標品からは末梢血単 球が得られ、これらの細胞を患者に再導入する前にエピソームの発現ベクターで 形質導入する。代わりとなるべきものとして、患者の細胞群中の幹細胞を、患者 を多数の和合性の細胞を供給するために培養し、それから細胞を培養液中でエピ ソームの発現ベクターで形質導入する。続いて形質導入された細胞群を患者に再 導入する。 別の具体例では、エピソームの発現ベクターは本発明に従った複製カセットお よび外来遺伝子を含み、患者の哺乳動物に感染する哺乳動物のウィルスに基づい ている。ウィルスのエピソームの発現ベクターはそれが患者の細胞に感染するよ うなところで患者に投与され、そのエピソームの発現ベクターは続いて細胞内で エピソームとして複製する。 別の具体例では、エピソームの発現ベクターは、リポソームの、または受容体 を介した輸送システムと共に患者の哺乳動物に導入される（Felbnerら、1987,Pr oc．Natl．Acad．Sci USA 84:7413-7417、およびZhuら、1993，Science,261:209 -211、本明細書中に参考文献として引用されている）。一度患者の細胞がinvivo において形質導入されると、エピソームの発現ベクターは染色体外で複製する。 外来遺伝子の発現は一度細胞がエピソームの発現ベクターで形質導入されれば 起こる。通常は外来遺伝子は構成的に発現され、発現レベルはエピソームのコピ ー数によって制御される。別の具体例では、外来遺伝子の発現は先に記載した意 味において、変異ラージT抗原の発現は、正にまたは負に制御されているという よりは、プロモーターの制御下にある。外来遺伝子の制御に適したプロモーター の選択は、望ましい臨床結果に基づいて当業者にとって明白に分かる。 哺乳動物細胞で発現できる遺伝子は、どれも本発明に従って外来遺伝子として 形質導入ベクターに組み込むことができるが、より好ましい遺伝子は、標的細胞 群での発現が病気の進行を妨げる遺伝子である。例えば、エピソームの遺伝子治 療ベクターは、in vivoにおいて腫瘍細胞を殺すために免疫系を標的にするのに 利用できる。サイトカインcDNAを形質導入した腫瘍細胞株は癌のワクチンとして 使われて成功してきており（Connorら、1993，J．Exp．Med.，177:1127-1134;Go lumbekら、1991，Science,254:713; Porgadorら、1992，Cancer Res.,52:3678; Aokiら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA,89:3850）、in vivoにおける腫瘍 細胞の適当なエピソームのベクターによる形質導入は、腫瘍細胞内でのエピソー ムの複製が望ましい局所的な高濃度のサイトカインを効率良く産生し、それによ って免疫のエフェクター細胞を刺激するために、腫瘍細胞死を高めるだろう。そ のような一の実例は、in vivoにおいて膀胱癌細胞にリポソーム/DNA混合物の膀 胱内腔への直接の点滴注入によって、インターロイキン-2をコードするエピソー ムの発現ベクターを導入することである。別の実例は、in vivoにおいてエーロ ゾル化したリポソーム/DNA混合物の吸入によって、インターロイキン-6を肺癌細 胞に形質導入することである（非エピソーム系ベクターを用いた方法には、Stri blingら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:11277-11281、を参照のこと ）。癌細胞を殺す他の遺伝子治療法には、単純庖疹のチミジンキナーゼをコード するベクターの形質導入に続いたガンシクローバー処理のような、薬剤感受性を 付与する遺伝子の発現が含まれる（Culverら、1992，Science,256:1550-1552、 は挿入ベクターを用いた。挿入ベクターをエピソームの発現ベクターに換えるこ とによって感受性を付与する酵素の濃度が高まる）。患者の細胞による発現が病 気の進行を妨げるような他の外来遺伝子の配列は、当該分野において当然の知識 を有する者にとって明白になるであろう。 レトロウィルスのベクターに比べると、レトロウィルスは細胞当たりたった１ から数コピー挿入されるだけであるため、パポバウィルス由来のエピソームが多 コピーで存在することによってコードされる遺伝子の発現が増加する。その上、 エピソームのDNAは、挿入されたベクターからの発現が減少してしまうような位 置的な影響の問題もない。本発明のエピソームのベクターによって生み出される 高レベルの転写は、アンチセンスの転写産物の高レベルの発現が過剰に発現され た標的mRNAの翻訳を減少させるのに必要であるため、特にアンチセンスの実験に おいて有用である（Whitesellら、1991，Mol．Cell．Biol.，11:1360-1371）。 選択圧を解除した後のpRP-cneoX/HT-1376感染者におけるBKVエピソームの持続 性は、これらのベクターがヒトの組織内で妥当な期間維持されることを示唆して いる。一時的な期間でさえ、エピソームの複製は癌患者を治療するために効果的 なパポバウィルスのエピソームを利用するのに十分である。例えば、p53（Baker ら、1990，Science,249:912-915; shawら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，89:4495-4499）のようなアポトーシスを誘導することのできる野生型癌抑制遺 伝子は、形質導入された腫瘍細胞を殺すためにごく僅かな期間でも発現される必 要がある。同様に、化学治療剤に感受性の因子をコードする遺伝子の一過的な発 現は腫瘍細胞を殺すのに効果的であると思われ、それはガンシクローバー処理に よる結果として単純庖疹のチミジンキナーゼで、および5'-フルオロシトシン処 理の結果としてシトシン脱アミノ酵素で最近証明された（Culerら、1992,Scienc e,256:1550-1552; Mullerら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:33-37） 。さらに、インターロイキン-4のようなサイトカインの一過的な発現は、腫瘍細 胞を除去するために免疫システムを調節するのに効果的であると思われる（Golu mbekら、1991，Science,254，713-716）。 エピソームベクターの材料は、一般的に組換え細胞または形質導入された細胞 によって産生されて、通常は生理学的に融和性の水溶液である薬学的に受容でき る溶液または懸濁液、または当該分野で記述されているように、例えば米国特許 第4,446,128号、本明細書中に参考文献として引用されている、にあるように、 コートした錠剤、錠剤、カプセル、座薬、吸入噴霧剤、またはアンプルの中に入 れられて処方される。投与は経口て、直腸から、鼻腔内へ、または小胞（例えば 膀胱）への点滴注入、または例えば真皮中、皮下、筋肉内、または静脈内であり 得る注射を含むどのような適した手段でもよい。 ベクターを含む組成物は哺乳動物の標的細胞の実質的な部分に形質導入するの に十分な量で哺乳動物に投与する。量の決定にはベクターの感染性、in vitroに おける形質導入効率、患者の免疫反応等の考慮を必要とする。典型的な初期投与 量は、他の薬理剤の投与において一般になされるようにこの量は投与を行う臨床 医によって調節されるのだが、静脈内、皮下、小胞内、または吸入噴霧剤で投与 する場合には10-1000μg、口からの場合は100から1000μg、または組換えベクタ ーの105から1010プラーク形成ユニットであろう。通常、一度の投与で治療効果 を生み出すのに十分であるが、実質的な期間の間連続した反応を確かめるために は複数回の投与が必要だと思われる。本発明に従った処方および投与の適当な方 法のさらなる記述は、米国特許第4,592,002号、および第4,920,209号、本明細書 中に参考文献として引用されている、になされている。 B. 特許請求した組成物の別の利用法 本発明に従ったエピソームの発現ベクターはまたin vitroにおける利用もでき る。例えば、エピソームの発現ベクターは、哺乳動物細胞の培養液中で産生され るタンパク質の産生を、おそらくそれらは翻訳後にグリコシル化されなければな らないために（例えば因子VIII）、高めるのに用いることができる。産生細胞群 を、上記のように調製した複製カセットおよび望みのタンパク質をコードする外 来遺伝子を含むエピソームの発現ベクターで形質導入することによって、エピソ ームの増幅が産生細胞内で外来遺伝子を高コピー数にするために、望みのタンパ ク質の発現レベルが増加する。 本発明のエピソームの発現ベクターは、腫瘍の進行に関連した新規の可能性の ある優性の癌遺伝子および/または癌抑制遺伝子を同定するために研究に利用で きる。cDNAクローンを高レベルで構成的に発現することによって、この手段は新 規の遺伝子または現在のところ腫瘍形成には関与することが示されていない生物 学的経路を特徴づける遺伝子を同定することができる。さらに、この分析システ ムによって腫瘍抑制遺伝子に対するアンチセンスcDNAライブラリーのスクリーニ ングが可能となり、これによってこのクラスの遺伝子のメンバーを同定するため に必要な目下の仕事の集約的な方法を多いに単純化する。 これは、例えばソフトアガーでクローン化しないような非発癌性の膀胱の細胞 株を、発癌性で足場から独立した細胞株由来のcDNAで形質導入し、ソフトアガー 中で増殖する活性として感染細胞を表現型でスクリーニングすることによって達 成できる。非発癌性の細胞がソフトアガー中でクローン化するのを誘導する原因 となるcDNAは、次に膀胱の感染細胞由来のエピソームベクターをバクテリアに移 すことによって同定できる。続いて第２世代の形質導入の研究によって、候補と なる優性の癌遺伝子が非発癌性の膀胱細胞を十分に形質転換する活性を確認でき る。同様の方法で、アンチセンスの方向でスクリーニングした形質転換されてい ない細胞由来のcDNAライブラリーによって、理論上癌抑制遺伝子を同定すること ができる。 実施例 発明のより完全な理解を容易にするために、以下に多くの実施例を提供する。 しかしながら、発明の範囲は、例証だけが目的であるこれらの実施例に開示され ている特別の具体例に限定されるものではない。 実施例 1. BKVエピソームプラスミドはHT-1376細胞内で安定に複製できる プラスミド pRP-cCATXおよびpRP-cncoXは、DNA複製起点およびラージT抗原をコードする3. 2-kbのBKVの断片を含むBKVのエピソームプラスミドである（Grossiら、1988）。 pRP-cncoxがSV40の初期プロモーターによって発現誘導されるネオマイシン耐性 遺伝子[トランスポゾンTh5由来のホスホトランスフェラーゼ APH(3')II]をコー ドするのに対して、pRP-cCATXはSV40の初期プロモーターによって発現誘導され るクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（CAT）をコードしてい る。pSV2CAT/220.2はEBVのエピソーム要素を含むpSV2CATの派生物である（Haver ら、1989）。pSV2NEOはSV40の初期プロモーターによって発現誘導されるネオマ イシン耐性遺伝子をコードしている（SouthernおよびBerg、1982）。pSV2CATはS V40の初期プロモーターによって転写が制御されるCAT遺伝子をコードし、pSVOCA TはSV40の初期プロモーターを欠くpSV2CATの派生物である（Gormanら、1982）。 BKVのエピソームプラスミドが膀胱癌細胞内で安定に複製できるかどうかを評 価するために、HT-1376細胞を、BKVのDNA複製起点およびBKVのラージT抗原から 成る3.2kbのエピソーム要素を含むpSV2NEOの派生物であるpRP-cneoX（Grossiら 、1988，Arch．Virol.，102:275-283）で形質導入した。 形質導入および選別 60-mm皿の1.5×106の全細胞を、10μgのプラスミドDNAおよび3mlのOptimemに 溶解した40μgのリポフェクチン（Gibco-Bethesda Research Labs，Gaithersbur g，MD）を用いて形質導入した。6時間のインキュベーションに続いて、DMEMを最 終濃度10%になるように補足的な胎児ウシ血清と共に加えた。形質導入した2日後 、細胞をトリプシン消化し、6穴のプレートに植え、24時間後に200μgのG418を 選択を開始するために培地に加えた。 サザンブロット 形質導入された細胞から得られたDNAは、G418による選択の71日後にサザンブ ロットによって評価し、サザンブロットしたものは32P標識したpRP-cneoXでプロ ーブ探索した。低分子量DNA（Hirt上清DNA）はHirt，1967，J．Mol．Biol.,26:3 65-369、に記載されているように、HT-1376感染細胞から調製した。全細胞DNAは CsCl濃度勾配から分離し、先に記載されているように精製した（Davisら、1986, "Basic Methods In Molecular Biology"，Elsevier Science Publishing，NY， pp．130-135）。Hirt上清および消化した全細胞DNAは、0.7%のアガロースゲルで 電気泳動し、Nytran膜（Schleicher & Scheull，Keene，NH）にトランスファー し、32P標識したランダムプライムプローブでハイブリダイゼーションした後、6 5℃で0.2×クエン酸ナトリウム塩（SSC）/ 1.0%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） の最終強度になるまで洗浄した。 A. 安定した感染細胞におけるエピソームの複製 これらの安定な感染細胞から得られた低分子量DNA（Hirt上清DNA）をサザンブ ロット分析にかけ、以下の図１のパネルAに示したデータはエピソームプラスミ ドを示している。プラスミドのII型（ニックの入った環状のもの）、およびIII 型（スーパーコイル状のもの）がレーン1にはっきりと認められ、それはこれら の感染細胞内では遊離のプラスミドDNAが存在していることを示している。これ らのHirt上清におけるpRP-cneoXエピソームは、対照のプラスミドと同じサイズ であり、これはエピソームがHT-1376細胞に入れられた時の状態のままで、検出 可能な再配列または内部の欠失が起こっていないことを示している。 このプラスミドDNAが新たに複製したエピソームDNAであることを確認するため に、レーン2および3はHirt上清DNAがそれぞれDpnIおよびMboIで消化されたこと を示している（Pipasら、1983，Mol．Cell．Biol.，3:203-213）。DNAアデニン メチラーゼ（DAM）を持つバクテリアで合成したプラスミドDNA（インプットDNA ）の特徴である、両方のアデニン残基がメチル化されている時に、DpnIはGATC認 識部位を切断する。これとは対照的にヒトの細胞はDAM酵素を欠いているために 、Hirt上清DNAのMboIによる消化はエピソームが染色体外で複製することを示す 。DpnI消化後の制限断片の欠如およびMboI消化後のHirt上清DNAの完全切断によ って、これらの感染細胞内に存在するプラスミドDNAが新たに複製したエピソー ムDNAであることが確認できる。 B. HT-1376感染細胞には高コピー数のBKVエピソームが存在する 細胞当たりのエピソームのコピー数を決定するために、BamHI消化したHirt上 清DNA、および増加的な量（50-400pg）のBamHIで消化して直線化したpRP-cneoX プラスミドを含む標準曲線を、サザンブロット分析によって評価した（図1、パ ネルA、レーン4-9）。これらのバンドの濃度計による分析によって、3×105の細 胞当たり約500pgのpRP-cneoX、または細胞当たり約150コピーのエピソームが存 在することが示された。このコピー数は、他のエピソームベクターのほとんどに ついて報告されたものよりも高い。例えば、リンパ球細胞におけるEstein-Barr ウィルス由来のエピソームベクターの典型的なコピー数は、細胞当たりおよそ10 から50である（Yatesら、1985）。HT-1376細胞においてBKVエピソームが高コピ ー数であることは、そのようなベクターによってコードされる遺伝子の転写のた めの定常状態のレベルが非常に高くなり、このベクターが細胞分裂の間にこれら の膀胱の感染細胞の子孫に効率良く伝わることを示唆している。これらの可能性 のどちらも次に続く実験によって評価する。 C. pRP-cneoXがHT-1376のゲノムDNAに組み込まれる証拠はない pRP-cneoXもまたHT-1376のDNAに組み込まれるかどうかを評価するために、HT- 1376感染細胞から得られた全細胞DNAをBamHIで消化し、サザンブロット分析によ って評価した（図1、パネルA、レーン1）。対照のBamHI消化したpRP-cneoXプラ スミド（レーン２）と同じサイズである9.9kbの単一バンドは、直線化したエピ ソームプラスミドと一致する。9.9kbのバンドはまた、一列に並んだpRP-cneoXプ ラスミドによるものであるかも知れないが、本分析において他の制限断片が存在 しないことから、pRP-cneoXエピソームの組み込み（インテグレーション）の頻 度は、本分析の感度の限りでは非常に低いことが示唆される。低頻度のBKVエピ ソームの組み込みは、原癌遺伝子の偶然の挿入による活性化または挿入による腫 瘍抑制遺伝子の不活性化を制限するであろうから、この結果は重要である。 実施例２． pRP-cneoX形質導入細胞における定常状態でのネオマイシン耐 性遺伝子の転写レベルは、pSV2NEO形質導入細胞より20倍高い。 通常のプラス ミドベクターと較べ、BKVエピソームベクターを利用することで得られ得る利点 を評価するため、HT-1376細胞をpSV2NEOで処理した。このプラスミドはHT-1376 細胞内では外因性のラージT抗原が存在しないと染色体外で複製することができ ない。トランスフェクション後、ネオマイシン存在下で細胞の選択を行い、5か ら10クローンを3つの別々のプール（a、b、c）にまとめた。これらのプールから 得られたジェノミックDNAのサザン解析から、細胞当たりおよそ5コピーのpSV2NE Oが存在することが示唆された（データは示さない）。 BKVエピソーム由来発現ベクターが高レベルの転写を達成できるか評価する ため、pRP-cneoX及びpSV2NEOに感染させたHT-1376細胞の定常状態でのネオマイ シン耐性遺伝子のmRNAレベルをノザンブロット解析によって比較した。どちらの プラスミドにおいても、ネオマイシン耐性遺伝子の転写はSV40初期プロモーター によって制御されている。 ノザンブロット 細胞のトータルRNAをChirgwinらのCsClイソチオシアン酸法（1979,Biochem,18 :5294-5299）によって調製した。先に記載されているように（Cooper et al., 1990,Cell Growth Differen.,1:149-159）、細胞のトータルRNA20μgを1%アガロ ースホルムアミドゲルで電気泳動し、Nytranメンブレンにトランスファーし、32 P-ラベルしたランダムプライマーによるプローブでハイブリダイゼーションし、 65℃で最終塩強度0.1× SSC/1.0% SDSまで洗浄した。 図2のパネルAでは、pRP-cneoX形質導入細胞（レーン１）及びpSV2NEO形質導 入細胞（プールa、レーン2；プールb、レーン3；プールc、レーン4）のトータル RNA20μgを、pSV2NOのネオマイシン耐性遺伝子をコードするBamHI/HindIII断片 を放射線標識したものでプローブ探査した。各レーンにほぼ等量のmRNAが流され ていることを確認するため、このブロットを放射線標識したベータアクチンのプ ローブで再びプローブ探査した（図2、パネルB）。 これらのデータをデンシトメーターによって分析したところ、pSV2NEO形質 導入細胞に較べると、pRP-cneoXエピソーム形質導入細胞では定常状態のネオマ イシン耐性遺伝子の発現レベルがおよそ20倍高いことが示唆された。恐らくこの 差の一部は、感染したHT-1376細胞内でpSV2NEOのコピー数（５コピー）に較べて pRP-cneoXのコピー数（150コピー）が高いためである。これらのデータから、BK Vエピソーム由来発現ベクターは、安定した発現には挿入（インテグレーション ）が必要なプラスミド又はレトロウィルスベクターよりも実質的に高い転写レベ ルを実現できるということが示唆される。 実施例３． 細胞分裂を通じて、BKVエピソーム由来発現ベクターは形質導 入した膀胱細胞の子細胞に効率良く受け継がれる。 エピソーム由来発現ベクタ ーをcDNAライブラリーのスクリーニングに効果的に利用するためには、細胞分裂 を通して、エピソームが一つの形質導入細胞からその子細胞に効率的に受け継が れなくてはならない。細胞当たりのエピソームのコピー数が高ければ、効率的に 娘細胞に受け継がれることが予測される。なぜなら、その条件では全てのエピソ ームが一つの娘細胞に偏って分配されることは有り得ないからである。親細胞系 列のHT-1376は軟寒天中で増殖するので、感染したHT-1376細胞をネオマイシンの 存在下又は非存在下の軟寒天にまくことで、pRP-cneoXが娘細胞に受け継がれる 効率を直接的に評価することが可能であった。エピソームが娘細胞に効率的に受 け継がれる正の対照として、pSV2NEOを感染させたHT-1376（プールb）をネオマ イシンの存在下又は非存在下の軟寒天にまいた。この細胞ではネオマイシン耐性 遺伝子はHT-1376DNAに挿入（インテグレート）されている。 この結果を下の表1に示す。軟寒天中で、親細胞系のHT-1376はネオマイシン 非存在下で0.83%の効率でクローン形成し、200pg/mlのネオマイシン存在下では 増殖しない。この濃度では、これらの細胞は14日間培養することで死ぬことが先 に明らかにされている。ネオマイシンの存在下又は非存在下の軟寒天中での2種 類の形質導入細胞のクローン形成効率比は本質的に同じであり、細胞分裂を通し てエピソームが効率的に受け継がれることを示している。さらに、ネオマイシン の存在下又は非存在下で生じた軟寒天中でのpRP-cneoX形質導入HT-1376細胞のコ ロニーの大きさには差が無かった（データは示さない）。これは、BKVエピソー ムが効率的に受け継がれることを支持するさらなる証拠である。 実施例４． BKVエピソームは選択圧を除いた後も、形質導入した膀胱細胞 内に存在し続ける。形質導入したHT-1376細胞にpRP-cneoXが多コピーで存在する こと及びこれらの形質導入細胞の子細胞にこのエピソームが効率的に受け継がれ ることによって、選択圧が存在しなくても数週間あるいは数カ月の間、pRP-cneo Xがこれらの細胞内で保持されるという可能性が提起された。選択圧の非存在下 でのHT-1376細胞のpRP-cneoX保持性を評価するため、これらの形質導入細胞をG4 18を除去した完全培地で培養し、様々な時点でHirt上清DNAを調製してサザン解 析を行った。図3のレーン3から6では、G418の非存在下でそれぞれ16、34、47及 び64日培養した形質導入細胞のDNAを解析している。レーン2の試料は122日間選 択条件に置いた後G418存在下で培養した細胞のもので、比較の参考のためである 。これはG418除去の過程における34日目と同じ時点のものである。 パネルAのブロットは、放射線標識したpRP-cneoXでプローブ探査したもので ある。エピソームのコピー数のレベルは、G418を除去した16日を経ても本質的に 減少しないままに維持されている。続いて、34日の選択条件によって一時的に対 照のおよそ10%に減少している。意外にも、続いてエピソームのコピー数はG418 除去64日で増加し、対照のレベルにもどっている。 エピソームのコピー数の差が生じたのはHirt上清DNA調製がランダムで非効 率的なためなのかどうか評価するために、このブロットをミトコンドリアDNAの プローブでリハイブリダイゼーションした（パネルB）。各Hirt上清DNAに本質的 に等量のミトコンドリアDNAが見られることから、各レーンに同程度の数の細胞 からの抽出物が流されていることが示され、選択圧の非存在下で64日培養した後 にもpRP-cneoXのコピー数が実際に高いレベルに維持されていることが示されて いる。これらのデータにより、形質導入した膀胱細胞をG418非存在下で短期間培 養することでエピソームプラスミドDNAが失われることは無いということが示唆 される。 G418非存在下で2ケ月培養した後にもBKV由来のエピソームが高いコピー数で 維持される、という結果は予想されていなかった。なぜなら、通常EBV及びSV40 由来のエピソームは、2から4週間の選択圧非存在下の培養で安定な形質導入細胞 から失われるからである（Yates,et al.,1984;Hamber,et al.,1988;Chittenden, etal.,1991）。G418非存在下でもpRP-cneoXがHT-1376細胞内で保持されることを さらに確かめるため、このタイムコースにおけるネオマイシン耐性遺伝子の発現 を評価した（図4A）。エピソームのコピー数（図3A）と同様に、ネオマイシン耐 性遺伝子の発現は一時的に減少し、続いてG418除去64日で本質的に対照のレベル にまで回復するのが観察された。各レーンに等量のmRNAが流されていることは、 このブロットをベータアクチンのプローブで再びハイブリダイゼーションするこ とで示されている（図4B）。これらのデータにより、BKV由来のエピソームが選 択圧非存在下の膀胱癌細胞でも高いコピー数で保持されることが強く証明された 。 実施例５． BKV由来エピソームベクターはHT-1376膀胱細胞とバクテリアと の間でシャトルすることができる。通常のプラスミド又はウィルス由来のものと 較べたエピソーム由来発現ベクターの重要な利点は、エピソームを安定な形質導 入細胞からバクテリアのコンピテント細胞に移せることである。安定なHT-1376/ pRP-cneoX形質導入細胞から得たHirt上清DNAを使用し、大腸菌DH10Bのエレクト ロポレーションを行った。分析した12の小量調製物のうち、10個から再配列して いないプラスミドが得られた（データは示さない）。これは、図1の結果と一致 する。わずかな再配列のあった2個のコロニーについては、再配列が形質導入し た膀胱細胞内で起きたのか、又はバクテリア内に移した際に起きたのかは明らか ではない。 実施例６． 複製能はあるが形質転換能は無いSV40/BKV由来のハイブリッド エピソーム発現系の開発。 実施例1から5で使用されたBKV由来エピソームベクターは、DNA複製開始点及 びBKVラージT抗原（BK-T）を含む3.2kbのBKV断片から成り、このBK-Tの転写はBK V初期プロモーターによって制御されている。BK-Tが野生型のp53とRBとの複合体 を作る（Mann,et al.,1984;Dyson,et al.,1990)という機能のために、軟寒天中 での増殖が誘導されると予想された。以下に記載するように、BK-Tに代えて、複 製能はあり形質転換能の無いSV40の変異型ラージT抗原を用いることによって、 このベクター系に改良を加えた。この方法は成功し、高レベルのSV-T変異型蛋白 を発現する形質導入膀胱細胞のクローンは、非腫瘍性のままで、染色体外で複製 するためのSV40又はBKVの複製開始点を含むプラスミドを産生する。 野生型のSV-T及び各変異型SV-TをpRc/CMV発現ベクター（Invitrogen）にサ ブクローニングした。このベクターでは、SV-Tの発現は効率の良いCMVプロモー ターエンハンサーに制御されており、このプロモーターエンハンサーは調べた膀 胱細胞の系列全てで活性がある。加えて、SV-T蛋白質による負の制御（ダウンレ ギュレーション）が無いために、CMVプロモーターエンハンサーはこれらの研究 に適したものである。野生型及び変異型SV40ラージT抗原のcDNAを、pRc/CMV発現 ベクター（Invitrogen）のCMVプロモーターエンハンサー転写カセット内のマル チクローニングサイトに2段階方法でサブクローニングした。第一に、pRc/CMV.T 及びpRc/CMV.107-Tを作製した。先ず、野生型SV40ラージT抗原及び107-T（K1） 変異型（Kalderon,et al）をコードするcDNAをpSG5ベクターの唯一のBamHIサイ トにサブクローニングされた断片として入手した。これらのベクターをBamHIで 消化し、T抗原cDNAを含む断片をゲル精製し、3'端をDNAポリメラーゼ1のクレノ ウフラグメントでフィルインした。リン酸化されたXbaIリンカーを取り付け、続 いてXbaIによる消化を行い、ゲル精製した。次にT抗原cDNAクローンを、XbaI消 化し牛小腸アルカリフォスファターゼ処理したpRc/CMVにライゲーションした。T 抗原cDNAクローンの向きはXmnI及びPstIによる消化で決定した。 第二に、pRc/CMV.T及びpRc/CMV.107-Tに改良を加え、pRc/CMV.402-T 及びpR c/CMV.107/402-Tを作製した。SV40ラージT抗原のコドン402のアスパラギン酸を グルタミン酸に代えた変異体をコードするSV40のクローンはD.Simmons博士の研 究室から入手した。このクローンをHpaIで消化し、T抗原の1067塩基対のＣ端断 片をゲル精製した。同様に、pRc/CMV.T及びpRc/CMV.107-TをHpaIで消化し、6.4 キロベースの大きな断片をゲル精製した。402-Tから得られたＣ端側HpaI断片を 続いて牛小腸アルカリフォスファターゼ処理した親ベクターにつなぎ、pRc/CMV. 402-T 及びpRc/CMV.107/402-Tを作製した。T抗原cDNAクローンの向きはAlwNIに よる消化で決定した。 これらの構築物の部分的なDNA配列を解析した所、これらの変異型SV-Tが実 際に予想された点変異を持つことが確かめられた。図5に、複製能はあるが形質 転換能の無いSV40ラージT抗原（SV-T）変異型における点変異の位置を示す。カ ッコ内に示す、107/402-Tのp53及びRBに対する結合性は予想される結果である。 A. 非腫瘍性5637細胞系列における変異型ラージT抗原の発現。5637細胞系 列は非腫瘍性であり、p53及びRBに変異を持つので、野生型あるいは変異型のSV- T蛋白質のいずれでも、腫瘍形質を誘導しないと思われた。よって、5637を初期 の形質導入実験に使用した。脂質転換（リポフェクション）法（Felgner,et al. ,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84;7413-7417）を用いて、5637をpRc/CMV.SV-T 及びpRc/CMV.107-Tに感染させ、G418中で安定な形質導入細胞を選択し、クロー ニングシリンダーを用いて単一の細胞のクローンを単離した。下の図6に示され ているのは、典型的な単一の細胞のクローンを用いてSV-T及び107-Tの発現を見 たウェスタンブロット解析である。この実験では94kDの蛋白質が検出されている が、これは対照のC0S-7細胞で産生されたT抗原と同一の大きさである。3つのSV- Tクローン全てで、T抗原の発現レベルは中程度であった（レーン1から3）。4つ の107-Tクローンのうち3つ（レーン4、5及び7）では、T抗原の発現レベルは高か った。C10ではT抗原の発現は検出されなかった（レーン6）。変異型ラージT抗原 の発現 についても、pRc/CMV.402-T 及びpRc/CMV.107/402-Tに感染させた5637細胞にお いて同様の結果が得られた。 B. 変異型ラージT抗原の発現によって感受性細胞に腫瘍形質が誘導される ことは無い。SV-T及び107-Tに感染した5637細胞クローンの、軟寒天中での増殖 能、培養組織中でのフォーカス形成能、及びヌードマウスの腹部での腫瘍形成能 を評価した。3つの5637クローンがこの初期の研究に使用された（図6参照）。す なわち、ｃ４（SV-Tを発現する）、C10（107-Tを持つが発現しない）及びE1（10 7-Tを発現する）である。 軟寒天でのクローニング 形質導入細胞をトリプシン消化し、30ミクロンナイロンフィルター（Tetko, Lancaster,NY）を通して個々の細胞がばらばらになった懸濁液を作った。寒天培 地の下層は10%の胎児牛血清及び0.6%シープラーク(Seaplaque)アガロース（FMCB ioProducts,Rockland,ME）を低グルコースDMEMに加えたものである。上層は、103 から106の細胞を10%の胎児牛血清及び0.3%シープラークアガロースを加えた低 グルコースDMEM中に連続的に希釈したものである。直径が125μmより大きい細胞 塊（約50個の細胞）をコロニーとして数え、プレーティング後最低1カ月プレー トを観察した。これらのデータを下の図2に示した。 非腫瘍性である5637親細胞系列は軟寒天中では増殖せず、培養組織中でフォ ーカス形成をしない。そしてこれを接種したヌードマウスのうち腫瘍を形成した のは1/12のみで、それも潜伏期は長かった。C4は弱くSV-Tを発現するが、ヌード マウス中では非腫瘍性のままで、軟寒天中では増殖しない。興味深いことに、こ のクローンは顕微鏡下ではフォーカスを形成しているが、肉眼で観察できるフォ ーカスは形成しない。107-Tを持つが発現はしないクローンC10は、予測されたよ うに、非腫瘍性で5637親細胞系列と同一の外形を持っていた。高レベルで107-T を発現するE1はC4と同一の外形を持ち、顕微鏡で観察できるフォーカスは形成す るが、軟寒天中あるいはヌードマウス中では増殖しない。これらのデータにより 、足場非依存性あるいはヌードマウス中で腫瘍の形成を誘導すること無しに、非 腫瘍性膀胱癌細胞にT抗原蛋白質を発現させることに成功したことが示された。 野生型SV40T抗原の発現は、適当な受容細胞の軟寒天中での増殖を引き起こ す。T24細胞系列は野生型のRB（及び変異型のp53）を持つので、SV-Tあるいは40 2-Tの発現はRB蛋白質を不活性化すると考えられる。我々は、SV-T（A7）及び402 -T（G1）を弱く発現するT24細胞のクローンにおける腫瘍形質の性質の特徴を調 べた。T24親細胞系列は軟寒天中でクローン形成しないのに対し、A7及びG1はそ れぞれ0.10%±0.02%（標準誤差）及び0.12%±0.04%のクローン形成効率を持つ。 この結果により、これらの形質導入細胞で発現されるT抗原は形質転換能を保持 する、生物学的に機能のある分子であることが示唆される。対照的に、高レベル の107/402-Tを発現するT24の単細胞クローンは、軟寒天中で増殖しない。 C. 107-TはSV40のDNA複製開始点の複製を引き起こすことができる。SV-T及 び107-Tの予測された生物学的な機能は、SV40のDNA複製開始点の複製をひき起こ すという機能である。107-Tが複製を引き起こす活性を評価するため、5637クロ ーンのC10及びE1をSV40のDNA複製開始点を持つプラスミド、pSV2CATに感染させ た。感染4日後にHirt上清DNAを調製し、図7に示すようにエピソームの複製の有 無を評価した。染色体外での複製は、Hirt上清DNAがDpnI消化に部分的に耐性で あるかどうか決定することで調べられる。DNAアデニンメチラーゼを持つバクテ リア中で調製されたプラスミドDNAではGATCという配列のアデニン塩基がメチル 化されているのに対し、哺乳動物細胞ではこの酵素が無い。そのため、ヒトのDN AはDpnI消化に耐性である。図7で観察されるように、5637クローンのC10（107-T を持つが発現しない）から調製されたHirt DNAはエピソームの複製を起こすこと ができず、それはpSV2CATは効率的にDpnIによって消化されるためである。対照 的に、5637クローンのE1（107-Tを発現する）から調製されたHirt DNAは大部分 がDpnIによる消化に耐性であり、これらの形質導入細胞でpSV2CATが染色体外で 複製していることが示唆される。これらのデータにより、感染した膀胱細胞で発 現されたSV40ラージT抗原が生物学的に機能する分子であり、複製を引き起こす 活性を持つことが示された。 本発明はその特定の態様に関して記載したが、前述の記載事項と実施例は本 発明の範囲を例示するためのもので、その範囲を限定するものでは無いことは理 解されよう。他の側面、利点及び改良は、本発明の分野の当業者には自明のもの であろう。それらの側面及び応用は本発明の範囲内であり、これは添付の請求の 範囲によってのみ定まる。Detailed Description of the Invention                 Episomal expression vector for human gene therapy   The research leading to the present invention was approved by the National Institutes of Health under the authorization No. P30CA43703. Partly supported. The US Government has certain rights in this invention. BACKGROUND OF THE INVENTION Field of the invention   The present invention has a high copy number of episomes that replicate efficiently in mammals and Papovawi creates stable transductants that express high levels of the encoding gene Intended for episomes derived from ruth. The episome derived from papovavirus is the bladder It is useful in gene therapy tools to regulate the growth of cancer cells. Overview of related technologies   One approach to gene therapy for human cancer cells is to use dominant oncogenes and Introduce a vector expressing an antisense sequence that inhibits the expression of growth factor receptor Is Rukoto. However, if the oncogene is expressed at high levels, antisense Expression is required to the same extent, which can result in multiple copies in particularly stable transductants. When using an expression vector in which It becomes an obstacle. Human cells transduced with retroviral vectors show stable transduction. They have only one or a few copies of retrovirus inserted. In contrast, episomal plasmids are stable transducers because they replicate independently of the chromosome. Accumulate hundreds of copies in the body. For high-level expression of antisense transcripts One of the methods is an episomal plasmid that can replicate in human cells separately from the chromosome. Is to use a vector.   Attempts to create episomal vectors capable of replicating in certain human cells have been described in the literature. Reported in. The episomal plasmid is bovine papillomavirus (BPV ) (Server, et al., 1981, Mol. Cell. Biol., 1: 486- 496; Zimario, et al. , 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. , U. S. A. 97: 4030-4034), SV40 (Tsui, et al., 1982. Cell. , 30: 499-508), Epstein-Barr virus (EBV). (Yates, et al., 1985, Nature, 313: 812-815; Margot. Lusky, et al. , 1988, Mol. Cell. Biol. , 8: 2837-2 847; Belt, et al. , 1989, Gene, 84: 407-417; Chitender. N, et al. , 1989, J.A. Viol. , 63: 3016-3025), and B. K virus (BKV) (Milanesi, et al., 1984, Mol. Cell. Bio 1. , 4: 1551-1560). Have been. Each of these episomal plasmids is designed for viral replication of DNA replication. It acts in trans at the origin and at the origin for the virus and is It contains the viral early genes so that the pisome can replicate.   EBV-derived episomes efficiently screen cDNA libraries However, the EBV system is suitable for non-lymphoid cell types. Limited use (Vidal, et al., 1990, Biochem. Bioph ys. Acta 1048: 171-177), and EBV replicon are It is not active in many cell types. Furthermore, EBNA-1 induces human lymphocytes It is one of several EBV genes that cannot die and is EBV-negative BJAB lymphoma. Transduction of a blastoma line with EBVA-1 shows transformation of cells on soft agar. Induce the proliferation of. (Kinoshita, 1990, Hokkaido Medical Magazine, 65: 362-375. )   In addition, EBNA-1 (transactivator) and ORI-P (EBV   EB transduced with an EBV episomal plasmid encoding the DNA origin) The efficiency of stable transduction of NA-1 negative cell lines is low, not episomal plus Not significantly higher than Mido (Yates, et al., 1985; Vital, et al., 1990). However, EBNA-1 was not expressed in cells prior to transduction. And then transduced with a plasmid containing ORI-P and a selectable marker. When added, the stable transduction efficiency increases up to 10% (Margolsky, et al., 1988; Belt et al. , 1989; Yates, et al. , 1984, Proc. n atl. Acad. Sci. USA 81: 3806-3810; Rutphalia, Et al. , 1989, Gene 76: 27-39). The comparable result is SV-T Known in a related system of COS cell clones expressing at high levels In this case, a plasmid containing the start of SV40 in transient transduction Enables efficient replication of T. (Twi, et al., 1982; Rio, et al., 1985, Science 227: 23-28; Chittendan, et al. , 1991, J .; Vi ol. 65: 5944-5951).   However, in the COS cell system, episomal replication readily proceeds, 10 hours 48 hours after transductionFourEpicosomal copies are produced. Transient transduction Efficiency of stable transduction despite efficient episomal replication Low values have been shown in these experiments (Chittendan, et al., 199). 1; Robert, et al. , 1986, Cell, 46: 741-752). Probably , Most transient transductants are dependent on episome-mediated cell death. Will die secondarily (Chittendan, et al., 1991; Robert, et al., 1986).   However, transduction of COS cells with a plasmid containing the SV40 DNA origin Then, a stable transductant having an episomal plasmid was obtained (Tsui, et al., 1 982), by various methods, including the use of replication control regions of other viruses. It becomes easy to control the replication of the chromosome. For example, easy epi in COS cell clones. The replication of the some involves replication of the SV40 DNA origin and bovine papillomavirus (BP). V) can be controlled by using a plasmid containing the replicon (donkey Red, et al. , 1986; Robert et al. , 1988, Cell 52: 397-4. 04). These studies show that SV40 episome replication in transient transduction. Two BPV sequences (NCOR I and NCOR II) that regulate Factors that suppress the third trans, encoded by the 5'sequence in reading frame E1. Have been identified. SV40 DNA origin and Ec of 2113 base pairs of BPV The hybrid plasmid encoding the oRI fragment is more stable than pSV-NEO. Transduction efficiency is substantially higher (Robert, et al., 1986). DNA homology -I searched and found that the same NCOR was found in the BKV or SV40 replicon. No homologous sequence could be identified.   Therefore, episomes are regulated in mammalian cells for application in gene therapy. A vector that is controlled and replicated is required. Especially humans without transforming the cells Vectors that replicate episomes in cells are needed. Summary of the Invention   A vector that produces episomes in mammalian cells without transforming the cells It is an object of the present invention to provide.   A further object of the present invention is the high copy without transformation of the transduced cells. A foreign gene encoded on a vector that replicates several episomes By expressing in mammalian cells transduced with the vector, It is to provide a method of gene therapy.   Another object of the present invention is to replicate papovawi, which is replicable but negative in transforming ability. It is to provide a variant of the Rusrage T antigen.   To achieve these and other objectives, the present invention preferably provides SV40 or At least one papovavirus origin of replication that is the origin of the BK virus, And a wild-type p53 containing a binding site involved in replication ability as an origin of replication. Is at least one of the retinoblastoma suppressor (RB) gene products, preferably both Encodes a variant of the large T antigen of papovavirus that does not bind to DNA sequences that are linked to homo or hetero promoters A mammalian vector, which is a replication-competent and transforming-negative vector containing Offer. In another embodiment of the vector, the mutant form of the papovavirus large T antigen is The encoding DNA sequence is derived from the papovavirus early promoter, an inducible progenitor. Connected to either a motor or a promoter under hormonal control You.   In another aspect, the invention features at least one papovavirus origin of replication. , A wild-type p53 or omentum containing a binding site involved in replication ability as an origin of replication Such that it does not bind to at least one of the gene products of the membraneoblastoma suppressor, First DNA sequence encoding a variant form of the large T antigen of papovavirus, the first DN The first promoter linked to the A sequence, and the foreign body linked to the second promoter Biography A replication-competent, but transforming-negative vector containing a second DNA sequence encoding an offspring. Transfect mammalian cells; and foreign genes in the transduced cells A method for expressing a foreign gene in a mammalian cell, which comprises expressing In a preferred embodiment of this method, the papovavirus origin of replication is that of the BK virus. Either the origin of replication or the origin of replication of SV40, A variant form of the di-T antigen binds to both the SV40 and BK viral origins of replication. But not the wild-type p53 and retinoblastoma suppressor gene products Type SV40 large T antigen. In another embodiment, the mammalian cells are in vivo transduction with the vector in tro and then introducing the cells into a mammal The offspring are expressed in vivo, or the vector is administered into a mammal and Mammalian cells are transduced in vivo and foreign genes are introduced from these cells. To be expressed.   In another aspect, the present invention provides a wild-type p53 or SV40 origin of replication as an origin of replication. And a retinoblastoma suppressor gene product that does not bind to the gene product DNA sequences encoding variants of the SV40 large T antigen, including positions, are provided. Good In a suitable embodiment, the mutation of the SV40 large T antigen encoded by its DNA sequence The 107th residue of the type is lysine and the 402nd residue is glutamic acid.   A highly efficient episomal expression vector that replicates extrachromosomally in human cells Was developed. We have shown that the replication-competent, transforming-negative SV40 large The T antigen mutation is the origin of SV40 DNA or the origin of BK virus DNA replication. It was shown to efficiently cause replication of a plasmid containing The preferred vector is , BK virus, a small DNA virus showing significant homology with SV40 (B KV). BK identified in transductants of stable bladder cancer cell line V episomes are characterized by these vectors being extrachromosomal for at least 5 months. Replicated in; stable stable high co-expression without inducing episome-mediated cell death. The number of peaks is 150 (150 copies); the probability of insertion (integration) is very low. Transcription of genes in proportion to copy number; efficient transfer to daughter cells during cell division Transferable; shuttleable from Hirt supernatant DNA to bacteria; and without selection It was found to be present in bladder cancer cell transductants for at least several months. these Special Can be used to transfer genes into human cells using this vector system. Which indicates that.   The present invention relates to papovaviruses, such as the SV40 or BKV DNA origins. Papovavirus large T causing replication of a plasmid containing the origin of DNA replication Episomal vectors can be generated by creating replication-competent and transforming-negative mutations of the antigen. Brings significant advantages to Kuta technology. Other DNA origin transactivators (eg For example, replication-negative and transforming-negative mutations of EBNA-1) have not been obtained so far. , This episomal expression system does not induce transformation in host cells. It is the only form that allows efficient episomal replication. With this advantage, Allows development of safe and efficient episomal vectors for human gene therapy applications Become Noh. This episomal vector system is also useful in the development of cancer tumor progression measurement. It can be extended to in vitro applications such as cDNA library cloning. Efficient episomal vector system for cloning and in human cells It also has significant advantages for the development of heterologous gene expression in vitro. Brief description of the drawings   1A and B show the BKV episomal vector pRP-cneoX. 4 shows Southern analysis of HT-1376 cells routinely transduced. The cells are G418 It was evaluated 71 days after the selection. Panel A. 3 x 10FiveHirt D from cells NA was loaded in lanes 1-4 and digested with the indicated restriction enzymes. Digested with BamHI Lane 5 with increasing amounts of pRP-cneoX plasmid (50-400 pg). Put it on -9. Panel B. Similar safety from HT-1376 / pRP-cneoX Total cellular DNA (10 pg) from a constant transductant was digested with BamHI (leh). 1). Lane 2 is 500 pg pRP-cneoX plasmid digested with BamHI. It is Lasmid. The probes for hybridization on both panels32Label at P PRP-cneoX.   FIG. 2 shows BKV episome (pRP-cneoX, lane 1) and episode. Stable (pSV2NEO, lanes 2-4) expression vector 8 shows the expression of mRNA for the neomycin resistance gene in HT-1376 cells. Hybridization probe: Neomycin resistance gene (panel A), β- Actin (panel B).   Figure 3 shows HT-1376 cells of pRP-cneoX after removing the selective pressure. 2 shows the persistence as an episomal plasmid. In the presence of G418 (71 days, Lane 1; 122 days, lane 2) or in the absence (16 days, lane 3; 34 days, 3X10 grown in lane 4; 47 days, lane 5; 64 days, lane 6)Five Digested with BamHI from HT-1376 pRP-cneoX transductants Southern analysis of isolated Hilt supernatant DNA. The probe for hybridization is32 PRP-cneoX labeled with P (panel A) or pAM1 (Martens , Et al. , 1979, J. Am. Mol. Biol. , 135: 327-351) Of mouse mitochondrial DNA (ND1) obtained from the body pKSU132LA with P This is a 343 base pair BamHI fragment that has been labeled (panel B).   FIG. 4 shows HT-1376 pRP-cneoX transduction after removing the selective pressure. 5 shows the persistence of expression of the neomycin resistance gene in entry. In the presence of G418 (7 1 day, lane 1; 126 days, lane 6; 156 days, lane 7) or in the absence ( 16 days, lane 2; 34 days, lane 3; 47 days; lane 4; 64 days, lane 5) Northern blot analysis of 20 μg of RNA from the HT-1376 transductant in Analysis. The probe for hybridization is the neomaosin resistance gene (A) Of pSV2NEO containing the coding sequence32BamHI-HindII labeled with P I fragment or32Β-actin plasmid labeled with P, pHFβA-1 (Gunun Ku, la. , 1983) (B).   FIG. 5 shows SV40 large T antigen (SV-T) that is replicable and has a negative transformability. The position of the point mutation in the mutant is indicated. Of the 107 / 402-T shown in parentheses The binding properties of p53 and RB are the expected results.   FIG. 6 shows single 5637 cells stably transduced with SV-T or 107-T. Western blot analysis of cell clones. pRc / CMV. SV-T 1-3) or pRc / CMV. Transduced with 107-T (lanes 4-7) 5637 cell clones are shown. Blots are anti-T antigen monoclonal anti- body p Made using AB416 and chemifluorescence generation system (Amersham). Les 40 μg of the extract was loaded for each lane.   FIG. Southern blot analysis shows that 107-T induces extrachromosomal replication of the plasmid. (PSV2CAT including the origin of DNA replication of SV40). 1 07-T 5637 clones C10 (no detectable expression) and E1 (high production). Present) was transduced with pSV2CAT and hirt supernatant DNA was transduced with approximately 4 Prepared after a day. About 5 x 10FivePlace cell-derived hilt supernatant DNA in each lane , Before and after digestion with DpnI and evaluated as indicated above. Hybridize Probe32PSV2CAT labeled with P. Detailed description of the invention   We used to transform transient epithelial cells (eg, HT-1376 bladder cancer cells). We identified an episomal vector that replicates efficiently in (lineage). This vector (PRP-cneoX) is a marker under the control of the SV40 early promoter 3.2 kb BKV fragment containing the gene and the origin of replication of BKV and BKV Contains the BKV large T antigen under the control of the early promoter. EBV episome The element is not active in the HT-1376 transient transductant while the BKV Pisomes replicate extrachromosomally in these cells. More importantly, B KV episomes efficiently show no cytotoxicity in HT-1376 cells High copy number episomes are generated in replicable, stable transductants.   BKV in HT-1376 cells stably transduced with this construct The copy number of episomal pRP-cneoX is approximately 150 copies per cell. Yes (see Example 1). This copy number is due to EBV in the lymphoma lineage. Approximately 10-50 copies of the native episome and in mouse C127 cells Of bovine papillomavirus-derived episome is 10-80 copies Comparable (Server, et al., 1981; Jimio, et al., 1982; Yates, Et al. , 1985). High pRP-cneoX in HT-1376 transductants The copy number was pRP to the progeny of these HT-1376 transductants over many generations. -Cneox appears to be important for efficient translocation. Insert (Integration Vector) pSV2NEO or pRP-cneoX Then Soft agar of HT-1376 cells plated in the presence or absence of G418. The efficiencies of making clones were essentially the same. These data are Episomal transfer of the syn-resistance gene to daughter cells is a gene of HT-1376 gene. It shows that the efficiency is the same as when inserted into nom DNA. During cell division Assuming that many plasmid copies randomly segregate, episomes Since the probability of a daughter cell containing only one copy of , This result is not unexpected.   Our data show that the BKV episomal expression vector in HT-1376 cells It shows that transduced genes can be transcribed at very high levels. pSV Compared to the transductant in which 5 copies of 2NEO were inserted (integrated), pRP -Expression level of neomycin resistance gene in steady state in CneoX transductant Le was about 20 times. The neomycin resistance gene has an SV Since these are transcriptionally regulated by 40 early promoters, these data The BKV episomal vector is used in the host cell genome to create stable transductants. Rather than a plasmid vector that has to be inserted into the It shows that the expression of the transduced gene is significantly higher. This difference is In comparison with pSV2NEO (5 copies) in HT-1376 transductant And because of the high copy number of pRP-cneoX (150 copies). U. Episomal vector comparison   BKV-derived episomes are EBV, BPV, and SV40-derived episodes. It has several characteristics that make it different from MU. Between the large T antigens of BKV and SV40 Despite significant amino acid homology (Mann et al., 1984, Viol., 1 38: 379-385), BKV episomes produce stable viable transductants. On the other hand, the SV40-based episome replicates at an extremely high copy number Cell death typically occurs (Tui, et al., 1982; Robert et al., 1986). This The results showed that the levels of T antigen present in these transductants were Characterization of traditional DNA origins, or in episomes derived from SV40-BPV (Robert, et al., 1986; Humber, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4010-4104), D Due to differences such as the presence of cis-regulatory sequences in the BKV episome that regulate NA replication There may be a part that   Importantly, the copy number of pRP-cneoX is approximately 150 cells per cell. In order to reach a stable plateau of pea, the BKV episome is transformed into a stable transductant. And appears to replicate once per cell cycle. Stable copy number is also low EB, which is copy number but similarly viable and yields stable transductants Characteristic of episomes from V and BPV. However, episodes derived from EBV In contrast to Mu (Yates, et al., 1984; Humber, et al., 1988), BKV Episomal copy number did not decrease after 2 months of growth without selective pressure Will be maintained. PRP-cneoX examined over time after removing G418 Copy number variation (as shown in Figure 3) causes the episomal presence to be maintained Factors (Efficient Episomal Replication in the Cell Cycle and BKV Large T Antigen Cells that express EGF have a growth advantage) and episomal copy number Factors that cause unequal separation of episomes during cell division, or intracellular May represent dynamic interactions during (when destroyed by Crease) . Compared to BKV episomes, BPV episomes are also nonselective traits. A stable copy number is maintained in the introduced C127 transductant (server, Et al. , 1981; Jimio, et al. , 1982). However, transduction without selection The higher copy number of the BKV episome in the admission was due to these episodes. Is an advantage in the approach for using the gene for gene therapy. I. Definition   In describing the present invention, the following terminology will be used in accordance with the definitions set out below. You.   A “heterologous” region or domain of a DNA construct is naturally a larger molecule. Is a identifiable DNA fragment in a larger DNA molecule that does not bind to. Obedience Thus, when the heterologous region encodes a mammalian gene, the gene is usually In the original genome of an organism, it is adjacent to DNA that is not adjacent to mammalian genomic DNA. F Another example of a terror region is a construct where the coding sequence itself is not found in nature. (For example, a genomic coding sequence contains introns but no introns. Coding sequence (cDNA) or a synthetic sequence with codons different from those of the natural gene. Column). Allelic diversity or naturally-occurring mutagenesis is described in It is not included in the DNA region.   A DNA "coding sequence" is produced in vivo when placed under the control of appropriate control sequences. A DNA sequence that is transcribed and translated into a polypeptide in vo. Polia Denylation signals and transcription termination sequences are commonly located at the 3'site of coding sequences. . A "promoter" is a downstream (3 ' Direction) A DNA regulatory region that initiates transcription of a coding sequence. Promoter in cells The coding sequence under the control of the R Is it transcribed by NA polymerase and the coding sequence is transcribed into mRNA? To the protein encoded by the coding sequence.   "Transduction" of cells occurs when foreign gene DNA is introduced inside the cell membrane. Koru "Transformation" refers to the transformation of primary cells or cell lineages that undergo only a finite number of divisions. When a cell population becomes immortal, or an immortal cell line acquires additional oncogenic properties Happens when you do. For example, transformation may be carried out on soft agar of transformed cells. Depending on its ability to clone or form tumors in nude or SCID mice To detect. "Crozo" is a cell division that results in a single cell or common ancestor It is a cell population derived from.   "Replikoso" is a genetic gene that acts as an automatic unit of DNA replication in vivo. Element (eg, plasmid, chromosome, virus).   A "vector" is a replicon such as a plasmid, phage or cosmid. Yes, so that other DNA fragments (hetero fragments) can be Can be run.   "Episome" is a low-molecular weight DNA component that exists in a cell in addition to the cell's chromosome. I am a child. Episomes replicate independently of mitotic duplication of chromosomes and are subcellular during cell division. Transferred to daughter cells as part of the random separation of cell contents. "Number of copies" is Number or genome of doubled DNA molecules present in individual cells as episomes The number of doubled sequences in. Bacterial episomes are commonly called plasmids.   A "foreign gene" is a gene that is not found in the genome of an individual host cell. Outside The native gene is from the same or different species as the host. The present invention is Traits of cells using DNA containing a foreign gene intended to express the gene The introduction is described and, of course, the DNA is expressed in the direction required by the foreign gene. Contains the control sequences needed to do this.   Two DNA sequences that are substantially homologous may, for example, be the exact string presented by a particular system. Hybridize to each other in Southern hybridization experiments under favorable conditions. It can be identified by its ability to soy. Appropriate hybridization conditions defined The matter is within the technical scope of a person engaged in the technical field. For example, Maniatis et al. , Supra; DNA cloning, Volumes I and II supra; Nucleic acid hybridisation. See section above. II. Description about vector   A. Papova virus   Papovavirus is a double-stranded DNA that is covalently closed and contains approximately 50 A 00 base pair circular genome containing three viral proteins Has a capsid. Papovavirus is human (BK virus and JC virus) , Monkeys (simian luminal virus (SV40) and lymphoid papovavirus), Baboons (monkey drug 12), mice (polyoma virus and K virus), ham Star (hamster papovavirus), rabbit (rabbit liver cavity virus), Sensitive to a variety of hosts, including budgerigars and budgerigars To dye. These viruses were determined to be related based on comparison of nucleic acid sequences.   The viral genome is divided into early and late transcriptional regions and contains one origin of replication. No. Transcription begins at a promoter near the origin of replication and proceeds in two directions. One is in the direction of the early transcript and the other is in the direction of the late transcript. The late transcription region is Topoproteins (VP1, VP2, and VP3). The initial transfer area is , T antigen, particularly large T antigen that functions in viral DNA replication. Ra Di-T antigen is also associated with binding to viral DNA near the early promoter. Tsu Down-regulate early transcription, activate intracellular genes involved in DNA synthesis, The cultured primary cells are transformed.   Viral DNA replicates in the nucleus as a "minichromosome" DNA can replicate many times in one S phase of a cell. Viral DNA replication , Initiated by large T antigen and is independent of the stimulation of intracellular DNA synthesis. La -T antigen binds to the viral DNA next to the origin of replication and binds the DNA helix. Unraveled, this is required for viral DNA replication. Then the new virus DN A is synthesized by an intracellular enzyme.   B. Episome amplification cassette   In order to provide high expression in gene therapy applications, episomal vectors , Transduced cells must replicate extrachromosomally without transformation . The present invention provides a replication cassette containing elements essential for the replication of such papovavirus. Offer a set. The replication cassette (or episome amplification cassette) is 1) Origin of DNA replication (ORI) of pova virus; 2) papovavirus large T antigen 3) causing replication-negative, transformation-negative mutants of M. Includes a scraping promoter. The replication cassette of the present invention is used in circular DNA DNA molecules, when linked to other DNA sequences within the And then episomally replicated by mammalian cells.   Milanese et al. The first BKV episomal vector reported by S., (1984). Controls transcription by the origin of DNA replication and the BKV early promoter It contains a 3.2 kb BKV fragment containing the BKV large T antigen. Shown below, As illustrated in the examples, the BKV expression system has the ability to replicate separately from the chromosome. Do not induce proliferation on soft agar in cells that retain but do not form tumors According to the present invention. The components of the duplication cassette comply with the following standards. Select and combine as described below.   1. Replication starting point   The origin of replication in the replication cassette is derived from one ORI sequence of papovavirus. select. DNA replication initiated at these positions is dependent on the large T-antibody of the same virus. Sensitive to control by the primordial and by the large T antigen of other papovaviruses Sensitivity is similar or even lower.   In the presence of matched large T antigen, the papovavirus origin is episome Cause replication of. The origin / large T antigen combination triggers episomal replication. You need to test whether it happens. One easy about replication ability Various tests prepare a population of cells expressing large T antigen as the replication cassette of interest. Transduce with a vector containing the desired origin of replication and then by Southern blot Testing transduced cells for episomal DNA synthesis (see, eg, Examples 6C).   Particularly preferably, either BKV large T antigen (BK-T) or SV-T It is the BKV origin that has been shown to cause more episomal replication. other The preferred starting point for SV40, JC virus, lymphoid papovavirus, And monkey drug 12, which causes replication in primates. Human thin Replication of papovavirus has been shown to cause episomal replication in cells The starting point is suitable for the replication cassette of the invention.   Whereas the BKV replicon is active in the HT-1376 bladder cancer cell line The Epstein-Barr virus (EBV) replicon is functional in these cells. There is no ability. BKV is trophic to human urinary epithelial cells (Arthur, et al., 1 986, N.M. Engl. J. Med. , 315: 230-234), derived from BKV Episomal vector replicates efficiently in the human bladder cancer cell line. SV Episomes from the 40 / BK hybrid virus do not form tumors 563 Replicates separately from chromosomes in the 7 bladder cell lineage. These data are from the episode From the tissue trophicity of the virus from which the It suggests that lacto can predict which cell type will be active.   2. Large T antigen variant   The replication activity of the BKV episome depends on the expression of BK-T. This is BK-T With well-documented immortality and tumorigenic properties to date (Shin, et al., 197. 5, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 4435-443. 9; Christian et al. , 1987, Cancer Res. , 47: 6066 -6073; Michalovitz, et al. , 1987, J .; Viol. , 61: 264 8-2654; Hanahan et al. , 1989, Science, 246: 1265. -1275; decaprio, et al. , 1988, Cell, 54: 275-283; Chen, et al. , 1990, J.A. Viol. , 64: 3350-3357; Chen , Et al. , 1992, Oncogene, 7: 1167-1175), SV40 LA. Homology to 75% amino acid with Sage-T antigen (SV-T) (Young, et al. . , 1979). Similar to SV-T, these T antigens induce tumorigenic properties The first proposed mechanism was (DeCaprio, et al., 1988; Chen, et al. . , 1992), BK-T is a wild-type p53 and retinoblastoma (RB) suppressor gene. It is able to bind and thereby inactivate offspring products (Mann et al., 1984). Dyson, et al. 1990. Viol. 64: 1353-1356). B Transgenic mice expressing KT show that kidney tumors develop and thymus gland develops. The proliferation of the plants becomes disorganized (Dalimpur, et al., 1990, J. Viol., 64 : 1182-1191), and BK-T are NIH 3T3 cells and rat embryos. Can transform infant kidney cells (Nakshatri, et al., 1988, J. Vio) l. , 62: 4613-4621). Therefore, BKV E containing wild-type BK-T Pisomal vectors confer tumorigenic properties on certain non-tumorigenic cell lines. And the vector allows cells in culture to grow on soft agar or in vitro. Since it is possible to induce tumor transformation in vo, Sosomal vectors are not suitable for use in gene therapy.   However, the significant homology between SV-T and BK-T solves this problem. A special method is introduced. SV-T binds to the BKV origin of replication in vitro Able to stimulate replication of plasmids containing the BKV origin of replication in COS cells Raider, et al., 1983, Viol., 129: 239-245; ー, etc. , 1989, J.A. Viol. , 63: 356-365). Therefore, the trait A replicable SV-T mutation that suppresses the conversion property allows BKV vector to transform without transformation. It was investigated as a substitute for BK-T, which promotes the replication of pisome.   Replicable, transformation-negative SV-T mutations   The SV-T domain that binds to the SV40 DNA origin is illustrated below in Example 6. As such, it is separate from the RB and p53 binding domains. 3 replicas are possible Transformation negative SV-T mutations are also exemplified. The first SV-T mutation is 107 -T (also referred to as K1 Calderon, et al., 1984, Viol., 13 9: 109-137), which in some cell types does not form tumors but Can be manufactured (Decaprio, et al., 1988; Chen, et al., 1990; Chen) , Et al. , 1992; Calderon, et al. , 1984; Chelington, et al. , 19 88, Mol. Cell. Biol. , 8: 1380-1384). 107-T Replaces the 107th codon with lysine instead of glutamic acid. It differs from type SV-T by 1 base pair. The 107th codon is the RB binding domain of SV-T. A feature that is in the inn and that the inability of 107-T to bind to RB does not form tumors Seems to explain. However, the DNA-binding region of 107-T must be changed. However, as shown below, we used 107-T for testing with the SV40 DNA origin. It was determined that it was possible to cause replication of the plasmid.   The second variant is 402-T, which has asparagine at the 402nd codon. Instead of glutamic acid (Rin, et al., 1991, J. Viol . , 65: 2066-2072). The 402-T point mutation is p53 of SV-T. Is in the binding domain, 402-T can bind to RB, and also SV40 DNA It also seems to cause origin replication, but is unable to bind to wild-type p53 . 402-T is a human diploid fibroblast cell line D. 551 and WI-38 To form tumors (Lin, et al., 1991, J. Viol., 65: 6447). -6453).   Finally, a novel SV-T variant was found at 107-T and 402-T. It was constructed to contain both point mutations (107 / 402-T). This SV-T change The variant does not bind to either p53 or RB and is involved in the oncogenic properties Is very low. The replicable 107 / 402-T has special value.   Three different SV-T mutations with different binding activities to wild-type p53 and RB were cloned. Of the SV-T mutant vector to form a tumor Not transduced into the bladder cell line. Single cell clones were cloned into mutant SV-T Identified as those that express offspring but remain tumor free, and Some clones cause replication of a plasmid containing the SV40 DNA origin. It was shown to rub. Therefore, this method can Episomal vector carrying SV40 replicon for efficient gene expression The Papovavirus large T antigen has been successfully regulated for use in T.   The large T antigen encoded by the replication cassette of the present invention is replication competent and And transformation must be negative, that is, it induces DNA replication but the host cell Must not be transformed. Activation of trans of DNA replication was described above. Supernatant extracted from transient episomal transductants or whole cell DN A can be tested using Southern blot analysis.   The transforming activity of mutant large T antigens can be analyzed directly (see, eg, Nakshatri et al., 1988). , Or cells transduced with an expression vector expressing a mutant T antigen are , Soft agar to determine whether the mutant T antigen is negative for transformation It is possible to analyze cloning activity, or growth in nude or SCID mice. Wear. As an alternative, the mutated antigen should be associated with wild-type p53 and wild-type RB. Select based on non-binding experiments. One suitable analytical method isin vitroTranslated by Prepare different large T antigen proteins and immunize with antisera against p53 or RB, respectively What forms these proteins and complexes with them before settling T antigen is also immunoprecipitated, it isin in vitro Translated into or mixed with baculovirus) Thus the binding is measured. Western blots of immunoprecipitates were tested against large T antigen. Is used to detect mutant T antigens that are positive for binding.   An alternative method is to use mammalian cell populations expressing wild-type p53 and RB (preferred Cells (preferably from a human cell line), the cells express large T antigen variants. As in the expression vector (eg, detected by binding to antiserum against T antigen) It is a method of introducing quality. Then lyse the cells and target the lysate to p53 or RB. Treat with antiserum. The immunoprecipitate is processed as described above. The latter method is For example, the amount of mutant T antigen expressed is extremely different from the amount of p53 or RB present. Or there is a slight mutation in p53 or RB expressed by the cells being analyzed. If present, it may be a false negative, but it is closer to the in vivo condition.   A particularly preferred mutant large T antigen is 107 / 402-T of the SV-T mutant described above. SV Other variants of -T and other papovavirus large T antigens have not been described in the literature. Thus, further variants can be made by well known recombinant DNA technology. This These mutants are replication competent and transformed as determined by the analysis above. As long as it is negative, it is suitable as the replication cassette of the present invention.   3. promoter   In general, the replication-competent, transformation-negative papovavirus large T antigen is heterologous. Transcription is controlled by either promoters of the same type or the same species. Heterogeneous promotion Is usually a mammalian promoter and a mammalian viral promoter. Is a promoter that is active in mammalian cells. Episomal amplification power If the set is part of an episomal expression vector for gene therapy applications. In this case, the promoter must be active in the cell that is the target of expression of the foreign gene. Choose to have.   CMV immediate early promoter enhancer Some heterologous promoters, such as Fruit T antigen expression is maximally increased, which in turn maximizes episomal replication. You. This is for gene therapy applications where high levels of gene expression are desired. It is particularly advantageous for transient transduction methods. As an alternative, to T antigen Therefore, by using a promoter of the same type of papovavirus that is negatively regulated, It can suppress the replication of ineffective episomes, resulting in controlled And stable expression is obtained. Such promoter / T antigen / origin of origin combinations It provides high copy number, stable episomes in transduced cells. You.   As an alternative, the mutant mutant should be able to control episomal replication. A promoter that controls the expression of diT antigen can be selected. For example, Inducible promoters (such as the promoter of tarothionein) are available, Episomal replication is amplified in the presence of the inducer. As a substitute Genes regulated by the stage of development or tissue-specific genes (eg whey). , A breast-specific promoter for the acidic protein gene of Escherichia coli, Shoeneberger et al., 19 88, EMBO J.,7: 169-175), but the promoter is active Used to limit amplification of episomal copy number for certain cell types. Using an episome carrying a foreign gene whose expression level is proportional to copy number Gene therapy involves therapeutic selection by selecting a promoter that controls T antigen expression. A method of controlling expression by the method is provided.   4. Vector for cassette insertion   In general, the vector into which the replication cassette of the invention is inserted refers to a particular papovavirus. Mammalian cells in which the Rus origin of replication and large T antigen cause vector replication In addition, all of these are vectors that carry the cassette and related foreign genes. is there. Of course, the vector is capable of replicating papovavirus in mammalian cells. Inhibited replication from origin or inserted into vector for application in gene therapy. It does not include any sequences that would inhibit the expression of any foreign gene that was created. Appropriate vectors are suitable for subsequent use in transducing mammalian cells. Shuttle vector should be used to produce large quantities of the vector containing the replication cassette in culture. It contains a bacterial plasmid that can be used as a vector. Other suitable vectors are , Usually known to be transduced into mammalian cells of viral origin, and defective Non-pathogenic or limited pathogens, including virulent or mutated viruses Includes well known mammalian vectors of only sex (eg, Hock et al., 1986, Nature,Three 20 : 275-277; Sorrentino et al., 1992, Science,257: 99-103; Bayle et al., 1993, Human.  Gene Therapy,Four: 161-170; Le Gal La Salle et al., 1993, Science,259: 988-990; Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89: 2581-2584; Rosenfeld et al. 1992, Cell, 68: 143-155). Vector is a mammalian virus By the way, the insertion of a foreign gene into the viral genome destroys the infectivity of the virus. Of course it is important not to. Episomal amplification for specific vector selection Taking into account the particular mammal or particular cell type in which Easy selection of suitable vector from many vectors available in the field (Eg, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laborat. ory Manual "; Miller et al., 1989, BioTechniques,7: 980-990; Salmons et al., 1993, H. uman Gene Therapy,Four: 129-141; Stratford-Perricaudet et al., 1991, "Human Gene.  "Transfer", edited by Cohen-Haguenauer et al., John Libbery Eurotest Ltd.219: 51-6 1, see). III. Vector construction method   A. Source of component DNA sequences   The DNA sequences of various papovaviruses are described in the literature, where the origin of replication is included. , The early promoter, and a DNA sequence encoding large T antigen (eg, , (For SV40) Subramanian et al., 1977, J. Am. Biol. Chem., 252: 355-367; Re ddy et al., 1978, Science, 200: 494-502; Fiers et al., 1978, Nature, 273: 113-120; V an Heuverswyn et al., 1978, Eur. J. Biochem., 100: 51-60; (for BKV) Yan g et al., 1979, Science, 206: 456-461; Deyerle et al., 1989, J. Virol., 63: 356-365; (For hamster papovavirus) Delmas et al., 1985, EMBO J., 4: 1279-. 1286; (for the JC virus) Frisque et al., 1984, J. Am. Virol., 51: 458-469; (Po For Riomas) Zhu et al., 1984, J. Am. Virol., 51: 170-180). Clones containing many of the sequences are available from Stratagene, Gibco-BRL Life Technologies, Uni ted States Biochemicals, and various nurses available from vendors like Promega. Included in the dairy animal vector. BK virus, JC virus, K virus, poly A clone containing the complete genomic sequence of Omavirus and SV40 is American T ype Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 , U. S. A. (ATCC) available. Promoter, origin of bacterial replication , And various vectors are also well-known to those of skill in the art of recombinant DNA engineering. Commercial sources or ATCCs listed above, as well as other understood sources It is available from A specific or regulatory sequence that encodes a particular protein These clones using standard recombinant DNA techniques as described below. You can get it from a loan. A specific foreign gene expressed in mammalian cells, Sources of materials for and sequences encoding them are those skilled in the art of gene therapy. It will be easy for anyone to understand.   B. Recombinant techniques for vector construction   Practice of the present invention, unless otherwise indicated, is within the skill of the art. Uses exemplary molecular biology, microbiology, and recombinant DNA technology. Such a trick Techniques are well understood by those of skill in the art and are fully explained in the literature. For example , Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"  (1982); "DNA Cloning: A Practical Apploach," Volumes I and II (Edited by DN Glover) Shu, 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (edited by M.J. Gait, 1984); "Nucleic A cid Hybridization "(edited by Hames & S.J. Higgins, 1984);" Animal Cell Cultu re "(edited by R.I. Freshney, 1986);" Immobilized Cells and Enzymes "(IRLPres s, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984), And Sambrook et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (1989). That.   Large T antigen of papovavirus, the DNA part corresponding to the origin of replication of papovavirus The coding sequence of cv., And the early promoter of papovavirus are BK virus, JC ATCC, including virus, K virus, polyoma virus, and SV40 virus Can be obtained from readily available recombinant DNA material such as those available from . Is the DNA portion or oligonucleotide with a specific sequence chemically synthesized? , Or by one of several means. In order of hope As well as associating with a larger DNA molecule containing the desired sequence domain, the desired D Basic methods for identifying, amplifying, and isolating NA sequences are known in the art. Well known to those of ordinary skill in the art. For example, Sambrook et al., (1 989); B. See Perbal, (1984). Preferably, papovavirus replication The origin, large T antigen, and the DNA portion corresponding to the early promoter are Ze Chain Reaction (M.A. Innis et al., “PCR Protocols: A Guide To Methods and A pplications, "Academic Press, 1990). Duplicates prepared by standard methods and assembled into a complete coding sequence Assembled from oligonucleotite.For example, Edge (1981)Nature292: 75 6; Nambair et al. (1984)Science 223: 1299; Jay et al. (1984)J. Biol. Chem.,259: 6311,checking.   The assembled sequence can be cloned into any suitable vector or replicon. And independent of the vector that does not contain the sequence assembled there. Maintained as a component. This will provide you with a repository of assembled arrays Partial or complete sequences were cut from the DNA in the stock material using restriction enzymes. It can be extracted or extracted from storage by amplification by PCR. Many Cloning vectors are known to those skilled in the art, and suitable cloning vectors Choice is a matter of choice (eg Sambrook et al., Herein by reference). Cited, see). The desired DNA segment linked to the appropriate DNA sequence The construction of the containing vector is carried out by techniques similar to those used for that part. Done These vectors are used as foreign vectors for gene therapy, shuttle vectors. Tar (from going back and forth between the prokaryotic intermediate host and the final mammalian host) ) Addition, such as the portion encoding the bacterial origin of replication, etc. Is constructed to contain a specific DNA portion.   Methods for the construction and expression of limited sequence muteins are described in the art. Well known in the field. A known variant of the large T antigen of papovavirus The coding DNA sequence can be chemically synthesized or can be primed from a wild-type sequence. -Adjusted by one of several methods, including extension, linker insertion, and PCR. (See, eg, Sambrook et al.). Should be a substitute As such, additional variants may include additions, deletions, and substitutions to the wild type sequence. It can be prepared by these techniques. In both cases, the mutant To confirm that it is replicable and negative for transformation, It is preferred to examine the variants by The mutant large T antigen protein to be examined is In a host cell transformed with the expression vector, its DNA sequence is transcribed into RNA. The coding sequence for a polypeptide is encoded in a vector so that it is translated into a protein. Prepared by placing under control of Romano. Mutant large T antigen protein Are transduced with an expression vector containing a sequence encoding the mutant T antigen. It is produced by the host cell in culture under conditions in which the polypeptide is expressed. Suitable growth conditions are within the skill of the art.   C. Intermediate stage vector   Preferably, the vector containing the replication cassette also contains a functional bacterial replicator. It also contains an origin and a selectable marker that functions in bacteria (eg, shuttle vector). Actor). These include the replication cassette and any related foreign genes Where large amounts of vector can be recovered from bacterial cultures, Vectors in bacteria to provide a stable reservoir of vector and facilitate amplification. It is possible to clone the target. Suitable bacterial origins of replication and selection markers Like Kerr, its methods are well known in the art (eg, Sambrook). Et al.). As an alternative, the mammalian virus vector Can be amplified in mammalian cell culture using well known techniques. Wi Preparations containing bacterial cells containing a lucose vector or a shuttle plasmid vector. Appropriate methods for product storage and standardization will be readily apparent to those skilled in the art. .   D. Vector functional testing   Vectors containing the replication cassettes of the invention are usually constructed by construction of the vector. Is confirmed to be replicable and free of transforming activity and then analyzed. this Analysis showed that the sequences contained in the vector prevented the replication cassette from functioning. Guaranteed not to. Replication competence (ie, both the mutant large T antigen and the origin of replication) Is usually a non-transformed population of cells of the target cell type. The vector was transduced into and the Southern blot was used to monitor episomal DNA production. By analyzing. Stable infected cells obtained from replication analysis are Clone with soft agar to ensure that the strain has not transformed the cells. Further investigations for clonogenic activity or tumorigenesis in nude or SCID mice. Can be. Southern blots against DNA from stable infected cells showed that Vector into the genomic DNA or the vector is stable with episomes. It is used to indicate whether or not it is retained. IV. Use of vector   A. Therapeutic use   Vectors for use in gene therapy are episomal expression vectors Replication of the present invention using standard recombinant DNA techniques as described above to produce Insert the cassette into a suitable mammalian vector with the foreign gene whose expression is desired. Build by doing. Subsequently, the viability of the cell is maintained and the vector is Cells will be expressed with these episomal expression vectors under conditions that replicate as pisomes. Transduce. Episomal expression vectors can be administered to patients in a variety of ways.   In one embodiment, cellsin vitroWith an episomal expression vector in Introduce. Usually, the appropriate cells are obtained from the patient, for example from a blood preparation, peripheral blood Spheres were obtained and episomal expression vectors were used prior to reintroducing these cells into the patient. Transduce. As an alternative, the stem cells in the patient's cell population should be Cells are cultured to supply a large number of compatible cells, and the cells are then cultured in culture medium. Transduce with a some expression vector. The transduced cell population is then reintroduced into the patient. Introduce.   In another embodiment, the episomal expression vector is a replication cassette or replication cassette according to the invention. Based on a mammalian virus that infects the patient's mammal, including ing. The viral episomal expression vector will infect the patient's cells The episomal expression vector is then administered intracellularly to the patient. Replicates as an episome.   In another embodiment, the episomal expression vector is liposomal or a receptor. Introduced into a patient's mammal with a delivery system via the (Felbner et al., 1987, Pr. oc. Natl. Acad. Sci USA 84: 7413-7417, and Zhu et al., 1993, Science,261: 209 -211, incorporated herein by reference). Once the patient's cellsin vivo When transduced in, the episomal expression vector replicates extrachromosomally.   The expression of a foreign gene is once a cell is transduced with an episomal expression vector. Occur. Normally, foreign genes are expressed constitutively and the expression level is episomal copy. Controlled by the number. In another embodiment, expression of the foreign gene is as previously described. In taste, the expression of mutant large T antigen is said to be positively or negatively regulated. More, it is under the control of the promoter. Suitable promoter for controlling foreign genes The choice of will be obvious to the person skilled in the art based on the desired clinical result.   Any gene that can be expressed in mammalian cells is a foreign gene according to the present invention. More preferred genes that can be incorporated into a transduction vector are target cells Expression in groups is a gene that prevents disease progression. For example, episomal gene cure Therapeutic vectors target the immune system to kill tumor cells in vivo. Available. Tumor cell line transduced with cytokine cDNA as a cancer vaccine Has been used successfully (Connor et al., 1993, J. Exp. Med.,177: 1127-1134; Go lumbek et al., 1991, Science,254: 713; Porgador et al., 1992, Cancer Res.,52: 3678; Aoki et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA,89: 3850), tumor in vivo Transduction of cells with an appropriate episomal vector is an epithelial procedure in tumor cells. Efficiently produces local high concentrations of cytokines, which Will stimulate tumor cell death by stimulating immune effector cells. So One such example is the administration of liposome / DNA mixtures to bladder cancer cells in vivo. Interleukin-2 encoding episodes by direct instillation into the bladder lumen Is to introduce an expression vector for the virus. Another example is in vivo aero Interleukin-6 was administered to lung cancer cells by inhalation of a solified liposome / DNA mixture. Transduction of cells (for methods using non-episome-based vectors, see Stri bling et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89: 11277-11281, see ). Other Gene Therapy to Kill Cancer Cells Encode Herpes Simplex Thymidine Kinase Susceptibility to drug sensitivity, such as transfection of the vector Expression of conferred genes is included (Culver et al., 1992, Science,256: 1550-1552, Used an insertion vector. Replace the insertion vector with an episomal expression vector. And the concentration of the enzyme that imparts sensitivity increases). Expression by the patient's cells Sequences of other foreign genes that interfere with the progression of qi are well-known in the art. Will be apparent to those with.   Only one retrovirus per cell compared to retrovirus vectors Since only a few copies are inserted from the The presence of the copy increases expression of the encoded gene. Moreover, Episomal DNA is located at such a position that expression from the inserted vector is reduced. There is no problem of imposing influence. Produced by the episomal vector of the present invention High level transcription is overexpressed by high level expression of antisense transcripts. It is necessary to reduce translation of target mRNAs, especially in antisense experiments. (Whitesell et al., 1991, Mol. Cell. Biol.,11: 1360-1371).   Persistence of BKV episomes in pRP-cneoX / HT-1376 infected individuals after release of selective pressure Sex suggests that these vectors are maintained in human tissues for a reasonable period of time. I have. Episomal replication is effective for treating cancer patients, even during transient periods It is sufficient to utilize the episomes of various papovaviruses. For example, p53 (Baker Et al., 1990, Science,249: 912-915; shaw et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,89: 4495-4499), a wild-type tumor suppressor that can induce apoptosis The gene must be expressed for a very short period of time to kill the transduced tumor cells. It is necessary. Similarly, the transient expression of genes encoding factors sensitive to chemotherapeutic agents. It currently appears to be effective in killing tumor cells, which is useful for ganciber treatment. As a result, with herpes simplex thymidine kinase, and with 5'-fluorocytosine treatment. Have been recently demonstrated with cytosine deaminase as a result of the theory (Culer et al., 1992, Scienc. e,256: 1550-1552; Muller et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89: 33-37) . In addition, transient expression of cytokines such as interleukin-4 is associated with tumor cell Appear to be effective in regulating the immune system to eliminate cells (Golu mbek et al., 1991, Science,254, 713-716).   Materials for episomal vectors are typically recombinant or transduced cells. Produced by and is usually a physiologically compatible aqueous solution that is pharmaceutically acceptable Solution or suspension, or as described in the art, eg, US Patent No. 4,446,128, cited herein by reference, Keep in coated tablets, tablets, capsules, suppositories, inhalable sprays, or ampoules. Will be prescribed. Administration is orally, rectally, intranasally, or by vesicles (eg, Bladder), or, for example, in the dermis, subcutaneously, intramuscularly, or intravenously Any suitable means may be used including injection to obtain.   The composition containing the vector transduces a substantial portion of the mammalian target cells. To the mammal in an amount sufficient to Infectivity of the vector, in vitro It is necessary to consider the transduction efficiency, the immune response of the patient, etc. Typical initial dose The amount is as clinically used in the administration of other pharmacological agents, this amount is the clinical Administered by the doctor but administered intravenously, subcutaneously, intravesicularly, or by inhalation spray 10-1000 μg for oral, 100-1000 μg for oral, or recombinant vector Of 10FiveFrom 10TenIt may be a plaque forming unit. Usually, one-time treatment is effective To produce a continuous reaction for a substantial period of time Seems to require multiple doses. Suitable formulation and administration according to the invention Further description of the method can be found in U.S. Patent Nos. 4,592,002, and 4,920,209, herein. It is made in, cited as a reference in the.   B. Alternative uses of the claimed composition   The episomal expression vector according to the invention can also be used in vitro. You. For example, episomal expression vectors are produced in mammalian cell culture. Production of proteins that probably must be post-translationally glycosylated Can be used to enhance (for example, Factor VIII). Producing cell group To the replication cassette prepared as described above and encoding the desired protein. By transducing with an episomal expression vector containing the native gene, Because the amplification of the genome results in a high copy number of the foreign gene in the producing cell, the desired The expression level of cytoplasm increases.   The episomal expression vector of the present invention has novel potential associated with tumor progression. Used in research to identify a dominant oncogene and / or tumor suppressor gene Wear. This approach has been redesigned by constitutively expressing cDNA clones at high levels. Organisms of the gene or organisms not currently shown to be involved in tumorigenesis Genes that characterize the biological pathway can be identified. Furthermore, this analysis system Screening of an antisense cDNA library for tumor suppressor genes by To identify members of this class of genes It simplifies many of the current work-intensive tasks needed.   This is for example non-carcinogenic bladder cells that are not cloned with soft agar. The strain was transduced with cDNA from a carcinogenic, scaffold-independent cell line and soft agar Achieved by phenotypically screening infected cells for activity to grow in Can be achieved. Causes that induce non-carcinogenic cells to clone in soft agar The resulting cDNA will then transfer the episomal vector from the infected cells of the bladder to bacteria. Can be identified. Then, through a second-generation transduction study, The dominant oncogene could be confirmed to be capable of fully transforming non-carcinogenic bladder cells. You. Transformed in a similar manner, screened for antisense To theoretically identify tumor suppressor genes from a non-cell derived cDNA library Can be.                                  Example   To facilitate a more complete understanding of the invention, a number of examples are provided below. However, the scope of the invention is disclosed in these examples, which are for illustration purposes only. However, the present invention is not limited to the specific example.   Example 1. BKV episomal plasmid can be stably replicated in HT-1376 cells   Plasmid   pRP-cCATX and pRP-cncoX encode the origin of DNA replication and large T antigen 3. BKV episomal plasmid containing a 2-kb BKV fragment (Grossi et al., 1988). Neomycin resistance in which pRP-cncox is induced by the SV40 early promoter Coding the gene [phosphopotransferase APH (3 ') II derived from transposon Th5] In contrast, pRP-cCATX is induced by the SV40 early promoter. Chloramphenicol acetyltransferase (CAT) You. pSV2CAT / 220.2 is a derivative of pSV2CAT containing episomal elements of EBV (Haver Et al., 1989). pSV2NEO is a neoplasm expressed by the SV40 early promoter It encodes the isine resistance gene (Southern and Berg, 1982). pSV2CAT is S PSVOCA, which encodes the CAT gene whose transcription is regulated by the V40 early promoter T is a derivative of pSV2CAT lacking the SV40 early promoter (Gorman et al., 1982).   To evaluate whether the episomal plasmid of BKV can stably replicate in bladder cancer cells To titrate, HT-1376 cells were derived from the BKV origin of DNA replication and the BKV large T antigen. PRP-cneoX (Grossi et al., A derivative of pSV2NEO containing a 3.2 kb episomal element) , 1988, Arch. Virol.,102: 275-283).   Transduction and selection   1.5 x 10 in a 60-mm dish6Whole cells in 10 μg of plasmid DNA and 3 ml of Optimem. Dissolved 40 μg lipofectin (Gibco-Bethesda Research Labs, Gaithersbur g, MD). Following 6 hours of incubation, add DMEM It was added with supplemental fetal bovine serum to a final concentration of 10%. 2 days after transduction , Cells were trypsin digested, seeded in a 6-well plate, and after 24 hours 200 μg G418 Added to the medium to start the selection. Southern blot   The DNA obtained from the transduced cells was obtained in Southern blot 71 days after selection with G418. Lot-evaluated and Southern-blotted32Professional with P-labeled pRP-cneoX I searched. Low molecular weight DNA (Hirt supernatant DNA) is described in Hirt, 1967, J. Mol. Mol. Biol.,26: 3 Prepared from HT-1376 infected cells as described in 65-369. Whole cell DNA Separated from the CsCl gradient and purified as previously described (Davis et al., 1986,  "Basic Methods In Molecular Biology", Elsevier Science Publishing, NY, pp. 130-135). Hirt supernatant and digested total cellular DNA were loaded on a 0.7% agarose gel. Electrophoresis and transfer to Nytran membrane (Schleicher & Scheull, Keene, NH) Then326 after hybridization with P-labeled random primed probe 0.2 x sodium citrate (SSC) / 1.0% sodium dodecyl sulfate (SDS) at 5 ℃ Washed to the final strength of.   A. Episomal replication in stable infected cells   The low molecular weight DNA (Hirt supernatant DNA) obtained from these stable infected cells was For lot analysis, the data shown in panel A of Figure 1 below is episomal plasma Is shown. Type II of plasmid (nicked circle), and III The mold (supercoiled) is clearly visible in lane 1, which is these It is shown that free plasmid DNA is present in the infected cells. this PRP-cneoX episome in the Hirt supernatant of Which remains the same as when the episome was placed in HT-1376 cells, It shows that no possible rearrangements or internal deletions have occurred.   To confirm that this plasmid DNA is newly replicated episomal DNA In lanes 2 and 3, Hirt supernatant DNA was digested with DpnI and MboI, respectively. (Pipas et al., 1983, Mol. Cell. Biol.,Three: 203-213). DNA adenine Plasmid DNA synthesized by bacteria containing methylase (DAM) (input DNA ), DpnI recognizes GATC when both adenine residues are methylated. Cut the recognition part. In contrast, human cells lack the DAM enzyme Digestion of Hirt supernatant DNA with MboI indicates that episomes replicate extrachromosomally . Due to the lack of restriction fragments after DpnI digestion and the complete cleavage of Hirt supernatant DNA after MboI digestion. Thus, the newly replicated episodes of plasmid DNA present in these infected cells It can be confirmed that this is DNA.   B. HT-1376 infected cells have high copy number BKV episomes   To determine episomal copy number per cell, on BamHI-digested Hirt PRP-cneoX digested with clear DNA and increasing amounts (50-400 pg) of BamHI for linearization A standard curve containing the plasmid was evaluated by Southern blot analysis (Figure 1, pattern Nell A, lanes 4-9). A densitometer analysis of these bands yielded 3 x 10FiveDetail About 500 pg of pRP-cneoX per cell, or about 150 copies of episome per cell It was shown to exist. This copy number is comparable to most other episomal vectors Higher than that reported for. For example, Estein-Barr in lymphocytes The typical copy number of a viral-derived episomal vector is approximately 10 per cell. From 50 (Yates et al., 1985). High copy of BKV episomes in HT-1376 cells Is the number of genes involved in the transcription of the gene encoded by such a vector. The steady-state level for It is suggested that it is efficiently transmitted to the progeny of infected cells of the bladder. These possibilities Both are evaluated by the following experiments.   C. There is no evidence that pRP-cneoX integrates into HT-1376 genomic DNA   To assess whether pRP-cneoX also integrates into the DNA of HT-1376, HT- Total cellular DNA from 1376 infected cells was digested with BamHI and analyzed by Southern blot analysis. (FIG. 1, panel A, lane 1). Control BamHI digested pRP-cneoX plastic A single band of 9.9 kb, which is the same size as the Smid (lane 2), shows a linearized epi Matches the somal plasmid. The 9.9 kb band is also aligned with the pRP-cneoX Other restriction fragments may be present in this analysis, possibly due to rasmid Therefore, the frequency of pRP-cneoX episome integration (integration) It is suggested that the degree is very low as far as the sensitivity of this analysis. Infrequent BKV epi Incorporation of the some is activated by accidental insertion of a proto-oncogene or tumor by insertion. This result is important because it will limit the inactivation of the tumor suppressor gene.     Example 2. Steady-state resistance to neomycin in pRP-cneoX transduced cells Transcriptional levels of the sex gene are 20-fold higher than in pSV2NEO-transduced cells. Normal plus Advantages of using the BKV episomal vector over the mid vector HT-1376 cells were treated with pSV2NEO. This plasmid is HT-1376 Intracellularly it can replicate extrachromosomally in the absence of exogenous large T antigen Absent. After transfection, cells were selected in the presence of neomycin, and 10 clones were pooled in 3 separate pools (a, b, c). From these pools From Southern analysis of the genomic DNA obtained, approximately 5 copies of pSV2NE per cell were obtained. It was suggested that O was present (data not shown).     Evaluate whether BKV episome-derived expression vectors can achieve high levels of transcription Therefore, in the steady state neomyoma of HT-1376 cells infected with pRP-cneoX and pSV2NEO. The mRNA levels of syn-resistance genes were compared by Northern blot analysis. which Also in the plasmid, transcription of the neomycin resistance gene is regulated by the SV40 early promoter. Is controlled by.     Northern blot     Cell total RNA was analyzed by the CsCl isothiocyanate method of Chirgwin et al. (1979, Biochem,18 : 5294-5299). As described previously (Cooper et al., 1990, Cell Growth Differen.,1: 149-159), 1% agaro containing 20 μg of total cellular RNA Electrophoresed on sformamide gel, transferred to Nytran membrane,32 Hybridize with a probe using P-labeled random primers, Washed at 65 ° C to a final salt strength of 0.1 x SSC / 1.0% SDS.     In panel A of Figure 2, pRP-cneoX transduced cells (lane 1) and pSV2NEO transduced. Total of incoming cells (pool a, lane 2; pool b, lane 3; pool c, lane 4) BamHI / HindIII fragment encoding 20 μg of RNA encoding the neomycin resistance gene of pSV2NO Was probed with a radiolabeled product. Almost equal amounts of mRNA are flushed in each lane Radiolabeled beta-actin to confirm that the The probe was probed again in the lobe (Figure 2, Panel B).     Analysis of these data by a densitometer showed that the pSV2NEO trait Compared to transduced cells, pRP-cneoX episomal transduced cells had a steady-state neoplasm. It was suggested that the expression level of the isin resistance gene is about 20 times higher. Probably this Some of the differences were compared to the copy number of pSV2NEO (5 copies) in infected HT-1376 cells. This is because the copy number of pRP-cneoX (150 copies) is high. From these data, BK The V episome-derived expression vector can be inserted (integrated) for stable expression. Is substantially higher than the required plasmid or retroviral vector. It is suggested that this can be realized.     Example 3. BKV episome-derived expression vector transduces through cell division It is efficiently inherited by the child cells of the inserted bladder cells. Episome-derived expression vector To effectively use the clones for screening cDNA libraries, cell division Through which episomes are efficiently inherited from one transduced cell to its offspring. I have to do it. High episomal copy number per cell It is expected to be inherited by daughter cells. Because under that condition all episodes This is because there is no possibility that the genome will be unevenly distributed to one daughter cell. Parental cell line Rows of HT-1376 grow in soft agar, so infected HT-1376 cells should be treated with neomycin. PRP-cneoX is inherited by daughter cells by soaking in soft agar in the presence or absence It was possible to evaluate the efficiency directly. The episome is efficiently received by the daughter cells. As a positive control to be inherited, HT-1376 (Pool b) infected with pSV2NEO was neomatized. Dipped in soft agar in the presence or absence of isine. Neomycin resistance in this cell The gene is inserted (integrated) in HT-1376 DNA.     The results are shown in Table 1 below. In soft agar, parent cell line HT-1376 is neomycin Clones with 0.83% efficiency in the absence and in the presence of 200 pg / ml neomycin. Does not grow. At this concentration, these cells are expected to die after 14 days of culture. Has been revealed in. Two species in soft agar with and without neomycin The clonal efficiency ratios of transduced cells of the same class are essentially the same, and It shows that the episome is efficiently inherited. In addition, neomycin Of pRP-cneoX-transduced HT-1376 cells in soft agar produced in the presence or absence of There was no difference in the size of Ronnie (data not shown). This is a BKV episode This is further evidence to support the efficient inheritance of the system.     Example 4. BKV episomes are transduced bladder cells even after removing selective pressure. Continue to exist within. Multiple copies of pRP-cneoX are present in transduced HT-1376 cells And that the episomes are efficiently transmitted to the offspring of these transduced cells. Allows pRP-cneo for weeks or months even in the absence of selective pressure. The possibility that X is retained in these cells has been raised. In the absence of selective pressure To evaluate the retention of pRP-cneoX in HT-1376 cells in G4, these transduced cells were treated with G4 Culture in complete medium with 18 removed and prepare Hirt supernatant DNA at various time points for Southern digestion. The analysis was performed. Lanes 3 to 6 in Figure 3 show 16, 34, and 47 respectively in the absence of G418. And the DNA of transduced cells cultured for 64 days is analyzed. Samples in lane 2 selected for 122 days The cells were cultured in the presence of G418 after being placed under selective conditions and are for reference only. . This is the same time point as day 34 in the process of G418 removal.     The blot in panel A was probed with radiolabeled pRP-cneoX. is there. Episomal copy number levels were essentially 16 days after G418 was removed. It is maintained without decreasing. Then, depending on the selection conditions on the 34th, the It is reduced to about 10% of the light. Surprisingly, the episomal copy number was then G418 Increased at 64 days of removal, returning to control levels.     The difference in episomal copy number occurred because Hirt supernatant DNA preparation was random and ineffective. Use this blot for mitochondrial DNA to assess whether it is for efficiency. Rehybridized with probe (panel B). Essential for each Hirt supernatant DNA Since an equal amount of mitochondrial DNA is found in It was shown that the extract from Escherichia coli was washed away, and was cultured for 64 days in the absence of selective pressure. Also showed that the copy number of pRP-cneoX is actually maintained at a high level I have. These data allow the transduced bladder cells to be cultured for a short period in the absence of G418. It is suggested that the episomal plasmid DNA is not lost by feeding Is done.     High copy number of BKV-derived episomes even after 2 months culture in the absence of G418 The result of being maintained was not expected. Because usually EBV and SV40 -Derived episomes are stable transduced cells in culture in the absence of selective pressure for 2 to 4 weeks. (Yates, et al., 1984; Hamber, et al., 1988; Chittenden, et al., 1991). It was confirmed that pRP-cneoX was retained in HT-1376 cells even in the absence of G418. To further confirm, expression of the neomycin resistance gene in this time course Was evaluated (Fig. 4A). Similar to episomal copy number (Figure 3A), neomycin resistance Sex gene expression was temporarily reduced, followed by G418 depletion at 64 days, essentially at control levels. It was observed to recover up to. The fact that an equal amount of mRNA is flown in each lane means that Re-hybridize the blot with the beta-actin probe. And (Fig. 4B). Based on these data, BKV-derived episomes were selected. Strongly demonstrated to be retained at high copy number even in bladder cancer cells in the absence of selective pressure .     Embodiment 5 FIG. BKV-derived episomal vector is compatible with HT-1376 bladder cells and bacteria You can shuttle between. Ordinary plasmid or virus An important advantage of episomal expression vectors over episomal stable transduction is that The ability to transfer from the incoming cells to the bacterial competent cells. Stable HT-1376 / Using Hirt supernatant DNA obtained from pRP-cneoX transduced cells, E. coli DH10B was selected. I performed a population. Out of the 12 small aliquots analyzed, rearranged from 10 No plasmid was obtained (data not shown). This matches the results in Figure 1 I do. Two colonies with slight rearrangements were transduced with rearrangements. Whether it happened in the bladder cells or when transferred to bacteria is not.     Embodiment 6 FIG. A hybrid derived from SV40 / BKV that has replication ability but no transformation ability Development of episome expression system.     The BKV-derived episomal vector used in Examples 1 to 5 had a DNA replication origin and And a BKV large T antigen (BK-T) containing a 3.2 kb BKV fragment. The transcription of this BK-T is BK It is regulated by the V early promoter. BK-T wild-type complex with p53 and RB (Mann, et al., 1984; Dyson, et al., 1990) because of the function of Was expected to induce growth in. As described below, replace BK-T with a By using a mutant large T antigen of SV40 that has the ability to produce and does not have the ability to transform, Improvements were made to this vector system. This method was successful and produced high levels of SV-T mutant proteins. Clones of transduced bladder cells that express p53 remain non-neoplastic and replicate extrachromosomally To produce a plasmid containing the SV40 or BKV origin of replication.     The wild-type SV-T and each mutant SV-T were ligated to the pRc / CMV expression vector (Invitrogen). It was cloned. This vector allows efficient SV-T expression in CMV promotion. It is regulated by a target enhancer, and this promoter enhancer is Active in all bladder cell lineages. In addition, negative regulation by SV-T protein (downregulation) CMV promoter enhancer is used in these studies. Is suitable for. PRc / CMV expression of wild-type and mutant SV40 large T antigen cDNAs Vector (Invitrogen) CMV promoter enhancer It was subcloned into the chi-cloning site by the two-step method. First, pRc / CMV.T And pRc / CMV.107-T were prepared. First, wild-type SV40 large T antigen and 107-T (K1) The cDNA encoding the mutant form (Kalderon, et al) was cloned into the unique BamHI vector of the pSG5 vector. Obtained as a subcloned fragment. These vectors with BamHI After digestion, the fragment containing the T-antigen cDNA was gel-purified, and the 3'end was ligated with DNA polymerase 1 I filled in with Fragment. Attach the phosphorylated XbaI linker and continue. Digested with XbaI and gel purified. Next, the T antigen cDNA clone was cloned into XbaI It was ligated to pRc / CMV that had been treated with bovine small intestine alkaline phosphatase. T The orientation of the antigen cDNA clone was determined by digestion with XmnI and PstI.     Secondly, by improving pRc / CMV.T and pRc / CMV.107-T, pRc / CMV.402-T and pRc / CMV.402-T c / CMV.107 / 402-T was produced. Aspartic acid at codon 402 of SV40 large T antigen A clone of SV40 that encodes a mutant that substitutes for glutamic acid was developed by Dr. D. Simmons. I got it from the laboratory. This clone was digested with HpaI and C-truncated to 1067 base pairs of T antigen. The pieces were gel purified. Similarly, pRc / CMV.T and pRc / CMV.107-T were digested with HpaI to give 6.4 The large fragment of kilobase was gel purified. C-terminal HpaI fragment obtained from 402-T Subsequently, it was ligated to the parent vector treated with bovine small intestine alkaline phosphatase, and pRc / CMV. 402-T and pRc / CMV.107 / 402-T were prepared. The orientation of the T antigen cDNA clone is AlwNI It was decided by digestion.     Analysis of the partial DNA sequences of these constructs revealed that these mutant SV-T It was confirmed to have the expected point mutation. Figure 5 shows the traits with replication ability. The position of the point mutation in the SV40 large T antigen (SV-T) mutant having no conversion ability is shown. Mosquito The binding of 107 / 402-T to p53 and RB shown in parentheses is an expected result.     A. Expression of mutant large T antigen in the non-neoplastic 5637 cell line. 5637 cell line The row is non-neoplastic and has mutations in p53 and RB, so wild-type or mutant SV- None of the T proteins appeared to induce tumor traits. Therefore, initial 5637 Was used for the transduction experiment. Lipid conversion method (Felgner, et al. , 1987, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84; 7413-7417) and 5637 to pRc / CMV.SV-T And pRc / CMV.107-T and selected for stable transduced cells in G418. Single cell clones were isolated using a Ning cylinder. Shown in Figure 6 below Show the expression of SV-T and 107-T using a typical single cell clone. Western blot analysis. A 94 kD protein was detected in this experiment However, it is the same size as the T antigen produced in control C0S-7 cells. 3 SV- All T clones had moderate levels of T antigen expression (lanes 1 to 3). Four 3 of 107-T clones (lanes 4, 5 and 7) showed high T antigen expression levels. Was. No expression of T antigen was detected in C10 (lane 6). Variant large T antigen Expression of Also for 5637 cells infected with pRc / CMV.402-T and pRc / CMV.107 / 402-T. And similar results were obtained.     B. Expression of mutant large T antigen induces tumor phenotype in susceptible cells There is no such thing. Growth of 5637 cell clones infected with SV-T and 107-T in soft agar Ability, focus formation ability in cultured tissue, and tumor formation ability in the abdomen of nude mice Was evaluated. Three 5637 clones were used in this early study (see Figure 6). You That is, c4 (expressing SV-T), C10 (having 107-T but not expressing) and E1 (10 Expresses 7-T).     Cloning in soft agar     The transduced cells were trypsin digested and 30 micron nylon filter (Tetko, (Lancaster, NY) made a suspension in which individual cells were separated. Agar culture The lower layer of the ground is 10% fetal bovine serum and 0.6% Seaplaque agarose (FMCB ioProducts, Rockland, ME) in addition to low glucose DMEM. The upper layer is 10Three From 106Cells in 10% fetal bovine serum and 0.3% sea plaque agarose Glucose is serially diluted in DMEM. Cells larger than 125 μm in diameter Count clumps (about 50 cells) as colonies and play at least 1 month after plating Observed. These data are shown in Figure 2 below.     The 5637 parental cell line, which is non-neoplastic, does not grow in soft agar and does not grow in cultured tissue. Do not form a carcass. And formed tumors in nude mice inoculated with this It was only 1/12, and it had a long incubation period. C4 weakly expresses SV-T but is nude It remains non-neoplastic in mice and does not grow in soft agar. Interestingly, this Clones form foci under the microscope, but are visible to the naked eye. Does not form a carcass. Clone C10 with 107-T but not expressed was predicted As such, it was non-neoplastic and had the same appearance as the 5637 parental cell line. 107-T at high level E1, which expresses, has the same outer shape as C4 and does not form a focus that can be observed with a microscope. However, it does not grow in soft agar or in nude mice. With these data , Without anchorage independence or induction of tumor formation in nude mice. It was shown that the T antigen protein was successfully expressed in the neoplastic bladder cancer cells.     Expression of wild-type SV40 T antigen causes proliferation of appropriate recipient cells in soft agar You. Since the T24 cell line has wild-type RB (and mutant p53), SV-T or 40 Expression of 2-T is thought to inactivate the RB protein. We have SV-T (A7) and 402 To characterize the nature of the oncological traits in clones of T24 cells that weakly express -T (G1). Solid. The T24 parental cell line does not clone in soft agar, whereas A7 and G1 do. It has a clonogenic efficiency of 0.10% ± 0.02% (standard error) and 0.12% ± 0.04%, respectively. This result indicates that the T antigen expressed in these transduced cells retains transforming ability. It is suggested that it is a biologically functional molecule. In contrast, high level Single-cell clones of T24 expressing 107 / 402-T do not grow in soft agar.     C. 107-T can cause replication of the SV40 origin of DNA replication. SV-T and And the predicted biological functions of 107-T cause replication of the SV40 origin of DNA replication. It is a function called. To assess the activity of 107-T in causing replication, Infect C10 and E1 of the clone with pSV2CAT, a plasmid containing the SV40 origin of DNA replication. Was. Hirt supernatant DNA was prepared 4 days after infection, and episomal replication was observed as shown in Figure 7. Nothing was evaluated. Extrachromosomal replication indicates that Hirt supernatant DNA is partially resistant to DpnI digestion. Look up by deciding if there is. Bacte with DNA adenine methylase In the plasmid DNA prepared in the rear, the adenine base of the sequence GATC is methyl. However, this enzyme is absent in mammalian cells. Therefore, the human DN A is resistant to DpnI digestion. As observed in Figure 7, the 5637 clone C10 (107-T Hirt DNA prepared from (containing but not expressed) causes episomal replication However, pSV2CAT is efficiently digested by DpnI. Contrast In general, Hirt DNA prepared from 5637 clone E1 (expressing 107-T) Are resistant to digestion with DpnI and pSV2CAT is extrachromosomal in these transduced cells. It is suggested that they are replicating. These data show that the bladder cells infected with The revealed SV40 large T antigen is a biologically functional molecule that causes replication. It was shown to have activity.     Although the present invention has been described with respect to particular embodiments thereof, the foregoing description and examples It is to be understood that it is intended to exemplify the scope of the invention and does not limit the scope. Be understood. Other aspects, advantages and improvements will be apparent to those skilled in the art of the present invention. Will. Those aspects and applications are within the scope of the invention, which is defined by the appended claims. Determined only by range.

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Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．少なくとも１つのパポバウイルスの複製開始点、および該複製開始点の複製 能のための結合部位を含むが野生型ｐ５３産物または網膜芽細胞腫抑制因子遺伝 子産物の少なくとも一方には結合しないパポバウイルスラージＴ抗原の変異型を コードするＤＮＡ配列であってプロモーターに機能的につながれたもの、を含ん でなる、複製可能で形質転換の陰性な哺乳動物ベクター。 ２．パポバウイルスの複製開始点が、ＢＫウイルスの複製開始点およびＳＶ４０ の複製開始点から選択される、請求項１に記載のベクター。 ３．ラージＴ抗原の変異型が、ＢＫウイルスの複製開始点およびＳＶ４０の複製 開始点の両方に対する複製可能な結合部位を含む、請求項２に記載のベクター。 ４．パポバウイルスラージＴ抗原の変異型が、野生型ｐ５３へ結合せずおよび網 膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物にも結合しない、請求項１に記載のベクター。 ５．さらに細菌の複製開始点を含む、請求項１に記載のベクター。 ６．プロモーターが誘導可能である、請求項１に記載のベクター。 ７．プロモーターが構成的である、請求項１に記載のベクター。 ８．プロモーターがホルモンの制御下にある、請求項１に記載のベクター。 ９．以下を含む哺乳動物細胞における外来遺伝子の発現方法： （ａ）少なくとも１つのパポバウイルスの複製開始点、該複製開始点の複製能 のための結合部位を含むが野生型ｐ５３産物または網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子 産物の少なくとも一方には結合しないパポバウイルスラージＴ抗原の変異型をコ ードする第一ＤＮＡ配列であって上述の哺乳動物細胞において機能する第一プロ モーターにつながれたもの、および哺乳動物細胞において機能する第二プロモー ターにつながれた外来遺伝子をコードする第二ＤＮＡ配列を含む、複製能を有す るが形質転換能の陰性なベクターで哺乳動物細胞を形質導入すること；および （ｂ）形質転換した細胞において外来遺伝子を発現させること。 １０．パポバウイルスの複製開始点が、ＢＫウイルスの複製開始点およびＳＶ４ ０の複製開始点から選択される、請求項９に記載の方法。 １１．ラージＴ抗原の変異型が、ＢＫウイルスの複製開始点およびＳＶ４０の複 製開始点の両方に対する複製のための結合部位を含む、請求項１０に記載の方法 。 １２．パポバウイルスラージＴ抗原の変異型が、野生型ｐ５３へ結合せずおよび 網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物にも結合しない、請求項９に記載の方法。 １３．複製能をもつが形質転換能の陰性なベクターが細菌の複製開始点をさらに 含む、請求項９に記載の方法。 １４．第一プロモーターが誘導可能である、請求項９に記載の方法。 １５．第一プロモーターが構成的である、請求項９に記載の方法。 １６．第一プロモーターがホルモンの制御下にある、請求項９に記載の方法。 １７．外来遺伝子がｉｎ ｖｉｖｏで発現する、請求項９に記載の方法。 １８．哺乳動物細胞が哺乳動物の体内にありベクターを哺乳動物に投与する、請 求項９に記載の方法。 １９．ＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型が、野生型ｐ５３へ結合せずおよび網膜芽 細胞腫抑制因子遺伝子産物にも結合しない、請求項１０、１７または１８に記載 の方法。 ２０．ＳＶ４０の複製開始点の複製可能な結合部位を含むが野生型ｐ５３および 網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物に結合しないＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型を コードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。 ２１．ＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型の１０７番目の残基がリジンで、４０２番 目の残基がグルタミン酸である、請求項２０に記載のＤＮＡ分子。 ２２．ＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型がＢＫウイルスの複製開始点の複製可能な 結合部位もまた含む、請求項２０に記載のＤＮＡ分子。 ２３．野生型ｐ５３へ結合せずおよび網膜芽細胞腫抑制因子遺伝子産物にも結合 しないが、ＢＫウイルスの複製開始点に結合することによってＤＮＡ複製を活性 化するＳＶ４０ラージＴ抗原の変異型をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子 。[Claims] 1. At least one papovavirus origin of replication and replication of the origin of replication Wild-type p53 product or retinoblastoma suppressor gene containing a binding site for activity A mutant form of papovavirus large T antigen that does not bind to at least one of the child products Including a coding DNA sequence operably linked to a promoter A mammalian vector that is replicable and negative for transformation. 2. The origin of replication of papovavirus is the origin of replication of BK virus and SV40. The vector according to claim 1, which is selected from the replication origins of. 3. Large T-antigen variants show replication of BK virus origin of replication and SV40 The vector of claim 2, which contains a replicable binding site for both of the origins. 4. A mutant form of papovavirus large T antigen does not bind to wild-type p53 and reticulates. The vector according to claim 1, which also does not bind to the membrantoblastoma suppressor gene product. 5. The vector of claim 1, further comprising a bacterial origin of replication. 6. The vector according to claim 1, wherein the promoter is inducible. 7. The vector according to claim 1, wherein the promoter is constitutive. 8. The vector according to claim 1, wherein the promoter is under the control of a hormone. 9. Methods of expressing foreign genes in mammalian cells, including:   (A) Replication origin of at least one papovavirus and replication ability of the replication origin P53 product or retinoblastoma suppressor gene containing a binding site for A mutant form of papovavirus large T antigen that does not bind to at least one of the products is Is a first DNA sequence that encodes a first DNA sequence that functions in the mammalian cells described above. Those linked to motors and secondary promoters that function in mammalian cells. Replication-competent, including a second DNA sequence encoding a foreign gene linked to the target Transducing a mammalian cell with a vector that is negative but transformable; and   (B) expressing a foreign gene in transformed cells. 10. The origin of replication of papovavirus is the origin of replication of BK virus and SV4 10. The method of claim 9, selected from 0 origins of replication. 11. A variant of the large T antigen is associated with the replication origin of SV40 and the replication origin of BK virus. 11. The method of claim 10, comprising binding sites for replication for both origins of production. . 12. The mutant form of papovavirus large T antigen does not bind to wild-type p53 and 10. The method of claim 9, which also does not bind to the retinoblastoma suppressor gene product. 13. A replication-competent but transforming-negative vector further enhances the bacterial origin of replication. 10. The method of claim 9, comprising. 14． 10. The method of claim 9, wherein the first promoter is inducible. 15. 10. The method of claim 9, wherein the first promoter is constitutive. 16. 10. The method of claim 9, wherein the first promoter is under hormonal control. 17． The method according to claim 9, wherein the foreign gene is expressed in vivo. 18. If the mammalian cells are in the body of the mammal and the vector is administered to the mammal, The method according to claim 9. 19. Mutant form of SV40 large T antigen does not bind to wild-type p53 and retinoblasts 19. The cell tumor suppressor gene product, which also does not bind, according to claim 10, 17 or 18. the method of. 20. Contains a replication-competent binding site of the SV40 origin of replication, but contains wild-type p53 and Mutant form of SV40 large T antigen that does not bind to retinoblastoma suppressor gene product A DNA molecule containing a coding DNA sequence. 21. The 107th residue of the variant form of SV40 large T antigen is lysine and the 402nd residue. The DNA molecule according to claim 20, wherein the residue of the eye is glutamic acid. 22. Mutant form of SV40 large T antigen is capable of replication at the origin of replication of BK virus 21. The DNA molecule according to claim 20, which also comprises a binding site. 23. No binding to wild-type p53 and also to retinoblastoma suppressor gene product But activates DNA replication by binding to the origin of replication of BK virus Molecule containing a DNA sequence encoding a mutated form of SV40 large T antigen .
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