JPH09508781A

JPH09508781A - リンパ球活性化抗原ｈｂ１５：免疫グロブリン上科の一種

Info

Publication number: JPH09508781A
Application number: JP5518620A
Authority: JP
Inventors: テダー，トーマス，エフ．; ゾー，リァングージ
Original assignee: ダナーファーバーキャンサーインステテュートインコーポレイテッド
Priority date: 1992-04-17
Filing date: 1993-04-14
Publication date: 1997-09-09
Anticipated expiration: 2022-09-12
Also published as: EP0636176B1; EP0636176A1; US5316920A; JP3973167B2; BR9306344A; CA2118309A1; JP2007159580A; NO943915L; AU4104893A; NO943915D0; WO1993021318A1; DE69326759T2; CA2118309C; AU685745B2; DE69326759D1; ATE185600T1

Abstract

(57)【要約】リンパ球活性化抗原ＨＢ１５、並びにＨＢ１５をコードするヒトｃＤＮＡおよび遺伝子配列が開示される。ＨＢ１５は検出可能なレベルでは循環白血球によって発現されないが、組織間では固有の発現パターンを有する。ＨＢ１５は皮膚のランゲルハン氏細胞および他の樹状突起細胞(dendritic cells)の亜集団によって専ら発現される。さらにまた、ＨＢ１５と反応する抗体、および抗ＨＢ１５抗体またはＨＢ１５機能に対する他の拮抗物質を免疫疾患、疾病または症候群の治療に用いる方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】名称リンパ球活性化抗原ＨＢ１５：免疫グロブリン上科の一種発明の分野本発明は、ヒトリンパ球活性化抗原をコードする核酸配列、特にリンパ球活性化抗原ＨＢ１５をコードする配列およびこれらの配列によってコードされる蛋白およびポリペプチドに関する。本発明の基となった研究の一部分は合衆国政府の基金によって行われた。したがって合衆国政府は本発明について一定の権利を有する。発明の背景免疫応答を調節する多くの細胞表面分子は、免疫グロブリン（Ｉｇ）で見出される保存構造の特徴と類似するものを含む。これらの分子は、共通の前駆体から進化したように思われ、したがって大きな上科のメンバーである遺伝子によってコードされる（Williamsら、Annu．Rev．Immunol．88:381-405(1988)）。Ｉｇ上科の仲間の多くは、細胞−細胞粘着およびシグナル誘発に関与する。この種類の殆どのものが多数の直線的に集合したＩｇ様のドメインを含むが、一方、いくつかの蛋白は単一のＩｇ様ドメインを含むことが認識された。細胞−細胞粘着に関与することが分かっている、または推定される単一のＩｇ様ドメイン蛋白は、ＣＤ８α(Littmanら、Cell 40:237(1985))、ＣＤ８β(Johnsonら、Nature 323:74(1986))、ＣＤ７(Aruffo ら、EMBO J．6:3313(1987))、Ｔｈｙ−１(Will iams ら、Science 216:696(1982))、ＣＤ２８(Aruffo ら、Proc．Natl．Acad．S ci.，USA 84:8573(1987))、ＣＴＬＡ−４(Brunetら、Nature 328:267(1987))および末梢ミエリン鞘の構造蛋白であるＰｏ（Lemke ら、Cell 40:501(1985)）を含む。さらに、他のものは多分子集合シグナル誘発複合体を形成するＢおよびＴリンパ球の抗原受容体（レセプター）と関係するが、これらは、ＣＤ３γ、δおよびε鎖（Goldら、Nature 321:431-434(1986);van den Elsenら、Nature 312 :413-418(1984)）、Ｂ２９(Hermansonら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 85: 6890(1988))およびｍＢ１(Sakaguchiら、EMBO J．7:3457-3464(1988))を含む。リンパ球に見出される蛋白を含む２種のＩｇ様ドメインは専ら細胞の活性化に関係し、細胞−細胞相互反応の仲介に関与することが分かっている。ＣＤ２８は非活性化ＴおよびＢリンパ球よりも活性化されたそれらでより多く発現され（Turkaら、J．Immunol．144:1646(1990)）、ＣＴＬＡ−４は、全てではないにしても殆ど活性化ＴおよびＢリンパ球によって発現される（Brunetら、Natu re328:267(1987)；Harper ら、J．Immunol.147:1037-1044(1991)）。活性化Ｂ細胞によって発現されるＢ７分子のためのＴ細胞レセプターとしてのＣＤ２８の役割は、ＣＴＬＡ−４と同様(Linsley ら、J．Exp．Med.，174:561-569(1991))であることが最近確認された(Linsleyら、Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 87:5031- 503(199)；Freeman ら、J．Immunol．143:2714-2722(1989))。ＣＤ２８およびＢ７同様、殆どのＩｇ様ドメイン含有レセプターは他の細胞上に存在するＩｇ上科の他の種類と相互に作用する。発明の要旨ヒトリンパ球ライブラリーからクローニングされたｃＤＮＡを分析し、活性化リンパ球によって発現される新規な細胞表面糖蛋白（ＨＢ１５と称する）をコードすることを示す。ｃＤＮＡによってコードされる成熟１８６アミノ酸蛋白は、単一の細胞外Ｖ型免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、膜貫通（トランスメンブレン）ドメインおよび３９アミノ酸細胞質ドメインを含んでいた。ノザンブロット分析によって、ＨＢ１５は、類リンパ芽球細胞株によって発現される〜１．７、２．０および２．５ｋｂの３種のｍＲＮＡ転写物に由来することが明らかにされた。ＨＢ１５と反応するモノクローナル抗体（単クローン性抗体）を製造し、ＨＢ１５が単一鎖のＭr４５０００の細胞表面糖蛋白として発現されることを示すために用いた。ＨＢ１５発現は、類リンパ芽球細胞株および有糸分裂促進剤（ミトゲン）活性化リンパ球に特異的であった。ＨＢ１５は循環白血球では検出可能な程度には発現されなかった。免疫組織学的な分析によって、ＨＢ１５は組織間で固有の発現パターンを有することが明らかにされたが、発現は専ら造血組織で見出され、小胞間細胞（innterfollicular cells）では分散的に、さらに被膜帯(mantle zone)および胚中心細胞では弱く発現される。特有なことには、ＨＢ１５はまた皮膚内のランゲルハン氏細胞(Langerhan's cells)および循環樹状突起細胞(dendritic cells)によっても発現される。したがって、ＨＢ１５糖蛋白はＩｇ上科の新種の典型である。ＨＢ１５蛋白またはその部分（その特異的なドメイン、リガンド結合フラグメントもしくは免疫特異的フラグメントの何れかを含む）をコードするｃＤＮＡ配列を複製可能な発現ベクターに組み込み、適切な宿主（例えば細菌、酵母、または真核細胞培養）をこのベクターで核酸感染（トランスフェクト）させることができる。また別に、ＨＢ１５蛋白またはその部分をコードするゲノムＤＮＡフラグメントをその場で(in situ)利用することができる。発現蛋白もしくはポリペプチド、またはそれの拮抗物質は哺乳類の免疫機能を調節するために用いることができる。また、発現生成物は、ＨＢ１５または、その特異的ドメインもしくはそのフラグメントのいずれかを含む部分に対する抗体を産生させるために免疫原として用いることができる。したがって、本発明は、一般にリンパ球活性化抗原（ＨＢ１５）、またはその特異的ドメイン、リガンド結合フラグメントもしくは免疫特異的フラグメントのいずれかを含む該蛋白の部分をコードする核酸分離物；コードされたＨＢ１５蛋白または、その特異的ドメイン、リガンド結合フラグメントおよび免疫特異的フラグメントを含む該蛋白の部分；ＨＢ１５またはＨＢ１５リガンドの存在を検出する方法；ＨＢ１５またはＨＢ１５リガンド機能に対する拮抗物質を同定または開発する方法；免疫疾患に罹患している患者の診断または治療方法；ＨＢ１５またはそのフラグメントを発現している細胞およびＨＢ１５またはそのフラグメントと反応する抗体を同定または分離する方法を特徴とする。また別の特徴は、天然には見出しえない種々のアミノ酸配列もしくは糖付加を有するＨＢ１５誘導体、そのような誘導体をコードする核酸分離物、および厳しい条件下でＨＢ１５遺伝子とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドプローブである。本明細書で用いられるように、”ＨＢ１５に対する拮抗物質”という用語は、ＨＢ１５と相互作用し、さらにその機能と干渉する物質（例えばＨＢ１５と反応する抗体）、またはＨＢ１５と結合するリガンドを含む。”同定する” という用語は、物質の確認を必要とする他の行為、例えば分離または精製を含むことを意図している。”分離”または”実質的に精製された”という用語は、それが調製されまたは天然に生じた環境から分離されまたは単離された核酸または蛋白配列を指す。そのような核酸または蛋白配列はキメラハイブリッドの形であってもよい。このキメラハイブリッドは本発明の核酸配列または蛋白配列の機能を他の種と結合させるために役立つ。”免疫特異的フラグメント”という用語は、提示蛋白の決定基に対して特異的な抗体と反応する提示蛋白のフラグメントを指す。ＨＢ１５蛋白、免疫特異的もしくはリガンド結合フラグメントまたは、該蛋白の特異的ドメイン、またはＨＢ１５機能と干渉するＨＢ１５に対する他の拮抗物質は、免疫反応もしくは細胞相互反応の発生もしくは進行を修飾もしくは抑制するために治療的に、またはＨＢ１５を発現している細胞に薬剤、毒素もしくは画像化剤を送達するために用いることができる。ＨＢ１５ｃＤＮＡは、これらの蛋白もしくはペプチドを製造するために；関連蛋白もしくはポリペプチド（例えば、関連動物種からの同種ポリペプチドおよび同一種からの異種分子）をコードする核酸分子を同定するために；または形質転換細胞もしくは非細胞系のいずれかで同様な機能を有する他の新規なキメラ分子を構築するために用いることができる。さらに、ＨＢ１５ｃＤＮＡは、ＨＢ１５蛋白の発現を抑制するために逆方向（アンチセンス）オリゴヌクレオチドを合成するために用いることができる。細胞によるＨＢ１５の機能、産生またな発現の検定は、選択的にＨＢ１５蛋白と反応する単クローン性抗体の開発によって可能になる。本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施例の記載および請求の範囲から明らかとなろう。図面の簡単な説明図１は、ＨＢ１５ｃＤＮＡクローンの構造および制限部位の位置を示す。図２は、ＨＢ１５のｃＤＮＡヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。図３は、ＨＢ１５の細胞外ドメインの構造の仮説モデルを示す。図４Ａおよび４Ｂは、ＨＢ１５を発現している３つの類リンパ芽球細胞株で得られた免疫蛍光の結果を示す。図５Ａ−５Ｆは、ＨＢ１５発現の免疫組織化学分析を示す。好ましい実施例の説明リンパ球活性化抗原、ＨＢ１５は、類リンパ組織および皮膚ランゲルハン氏細胞で専ら発現する。図１を参考にして、多数のｃＤＮＡクローンに由来するヌクレオチド配列から推定されるＨＢ１５蛋白の構造的特徴は、それがＩｇ上科の新規な種類であることを明瞭に示している。ＨＢ１５の予測構造は、ただ１個の細胞外Ｉｇ様ドメイン、トランスメンブレンドメインおよびほぼ４０個のアミノ酸の細胞質ドメインをもつ典型的な膜糖蛋白のそれである。ｐＨＢ１５ｃＤＮＡによる細胞株のトランスフェクションで該蛋白の細胞表面発現が生じ、免疫沈降させた蛋白のＭ_rはｃＤＮＡトランスフェクト細胞（〜４５０００）とＨＢ１５⁺Ｒａｊｉ細胞（〜４００００）の両方で同じであったので、ＨＢ１５の完全なコード領域が認識された可能性が高い。さらにまた、ＨＢ１５は単一鎖分子として発現され、しかもその測定Ｍ_rがコアー蛋白の予測サイズの２倍であったので、ＨＢ１５は顕著な翻訳後プロセッシングを受ける可能性が高い。ＨＢ１５はまたＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、マウス前−Ｂ細胞株およびヒト赤白血病株を含むｃＤＮＡトランスフェクト細胞の表面に発現されたので、表面発現は、ＴおよびＢ細胞抗原レセプターに付随するＩｇ様蛋白とともに生じる分子複合体の他の成分の発現に左右されない蓋然性が高い。ＨＢ１５アミノ酸配列と先に同定された蛋白との比較では、細胞外Ｉｇ様ドメインとＩｇ上科の他の種類との類似性を除いて、顕著な同種性は明らかではなかった。ＨＢ１５Ｉｇ様ドメインは、図２に示すようにドメインのＶセットで認められる多くの保存された特徴を含んでいた（Williamsら、Ann．Rev．Im munol．88:381-405(1988)）。Ｉｇドメインの同種性に基づき、ＨＢ１５はＣｙｓ１６とＣｙｓ８８を連結するジスルフィド結合を持っている可能性が高い。したがって、２個のＣｙｓ残基の間に７１個のアミノ酸が存在し、これはＶ関連ドメインにとって適切なサイズであろう（Williamsら、上掲書）。８、８１および１１０位の残基の間にもさらにジスルフィド結合形成の可能性がある。なぜならば、これらＣｙｓは同様に細胞外ドメインに存在するからである。さらに、ＨＢ１５は予測される膜上ドメイン内の１４４位に位置するＣｙｓ残基を有する。Ｃｙｓ残基はまた、ＣＤ３δおよびＣＤ７の同一の位置にも存在するが、このことは幾つかの機能的な重要性、おそらく脂肪質アシル化のための部位としての重要性を提唱する（Kaufman ら、J．Biol．Chem．259:7230-7238(1984)；Roseら、Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA，81:2050-2054(1984)）。ＨＢ１５細胞質尾部はＣＤ７のそれと大きさが同じであるが（Aruffoら、EMBO J．6:3313(1987)）、既知蛋白とアミノ酸配列の類似性は共有していない。しかしながら、このドメイン内の５個のＳｅｒ／Ｔｈｒ残基は燐酸化の潜在的部位として機能する。したがって、ＨＢ１５は、先に報告された構造と明白な関連性を共有しない新規なリンパ球細胞表面抗原であるように思える。ＨＢ１５細胞外ドメインは、少なくとも２つのエクソンによってコードされるものの典型的なＩｇ様ドメインとは異なる。部分的なゲノムＤＮＡ配列の分析によって、Ｉｇ様ドメインの半分は単一のエクソンによってコードされ、推定膜上ドメインもまた別個のエクソンによってコードされるということが明らかにされた（図２）。Ｉｇ様ドメインが１つ以上のエクソンによってコードされえることは、Ｉｇ上科のいくつかの種類で認められている。これらにはＰｏ蛋白 (Lemke ら、Neuron，1:73-83(1988))、ＣＤ４(Littmanら、Nature，325:453-455 (1987))およびＮ−ＣＡＭ(Owensら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:294-298( 1887))が含まれる。この発見は、Ｉｇドメインは複製とその後に起こる結合によって進化した原型ハーフドメインから生じたのであろうという構造分析を支持する。しかしながら、上記遺伝子およびＨＢ１５遺伝子の各々は、ジスルフィド結合の保存Ｃｙｓ残基をコードする配列の間の異なる位置にイントロンを含んでいる（Williamsら、Annu．Rev．Immunol．88:381-405(1988)）。この発見は、イントロンはその後で挿入され、これらドメインの各々の進化のより新しい時点で原型Ｉｇ様ドメインを遮断したのであろうという考えを支持する。ＨＢ１５と反応する２種の単クローン性抗体は他の殆どの造血細胞上のＨＢ１５を検出することができなかったので、ＨＢ１５の発現は一般にリンパ球に制限されるらしい。殆どの胸腺細胞および循環リンパ球は検出可能な細胞表面ＨＢ１５を発現しないので、ＨＢ１５発現はリンパ球発生において後期の事象であるかもしれない。しかしながら、ミトゲンによって活性化された後、末梢リンパ球は、３日目から５日目（増殖が最大となる期間）に最高レベルの細胞表面ＨＢ１５を発現した。ＨＢ１５は、特に培養または活性化後に単球によって低レベルで発現されるかもしれないが、発現のレベルは低く、Ｆｃレセプター仲介抗体結合の結果生じるのかもしれない。多くのＴおよびＢ細胞株もまたＨＢ１５を発現するが、発現は一般に低レベルである。興味深いことには、細胞株による細胞表面ＨＢ１５発現は、最高増殖期間（例えば培養に栄養補給が行われた後一日目）に最高になる。これらの結果は、ＨＢ１５は類リンパ球の最大増殖のために重要であるか、または細胞の最大増殖はこの抗原の発現に必須であるということを示している。これは、ＨＢ１５は造血組織の胚中心細胞によって発現されるという観察と一致している。にもかかわらず、２２種類の異なる組織の免疫組織学的な分析によって、ＨＢ１５発現は類リンパ球に限定されているように見える。ただ１つの例外は、皮膚ランゲルハン氏細胞がＨＢ１５を発現するという発見であった。この制限的発現のユニークな型式は、この蛋白の構造分析と相まってＨＢ１５は新規に同定されたリンパ球活性化抗原であることを示唆する。Ｉｇ上科の他の種類とのＨＢ１５の構造類似性は、Ｉｇ様ドメインは免疫系および神経系でしばしば種々の同型および異型の相互反応に関与するので、ＨＢ１５は細胞性反応に関与するかもしれないことを示唆する。これらの相互反応は、その後の細胞表面下の事象の引き金となる結合機能または粘着を含む。重要な機能的特徴は、通常同種好性または異種好性結合がＩｇ関連分子間で生じるということで、これは向かい合う膜表面の分子間でしばしば生じる。これら他の蛋白に対するＨＢ１５の構造的関連性は、活性化後のリンパ球または他のＨＢ１５⁺細胞型の同型または異型相互作用のいずれかにおけるこのリンパ球活性化蛋白の役割を示唆しているのかもしれない。図２に開示する特定のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は対応物の代表例で、本発明の開示に従うことによって直接さらに簡便に得られる関連ヒト遺伝子の代表例である。例えば、開示した核酸配列とヒト細胞からの遺伝的物質との厳格な条件下での交差ハイブリダイゼーションは容易に実施でき、同等なヒトの配列をえることができる。同様な態様で、変性オリゴヌクレオチドも開示したアミノ酸配列またはその部分から容易に合成することができ、周知の増幅技術のいずれか、例えばポリメラーゼ・チェーン・リアクションを用いて増幅し、ヒトの同等な配列と結合するプローブを得ることができる。同等な配列によってコードされる蛋白またはポリペプチドが製造できる。開示した蛋白またはペプチドに対する抗体もまた作製でき、同様なエピトープを有するヒトおよび他の哺乳類のペプチドと交差反応させるために用いることができる。このように分離した、開示蛋白またはペプチドのそれと同様な抗体反応性パターンを有するこれらペプチドは、開示した蛋白またはペプチドの同等物であると考えられる。以下の実施例は、本発明の利点を詳述し、さらに、同一物を製造し用いるにつき通常の技術を有する者を補助するために提供される。これらの実施例は本開示の範囲を制限することをあらゆる面において意図するものではない。実施例ＩＨＢ１５ｃＤＮＡクローンの分離と性状およびＨＢ１５蛋白の性状Ｂ類リンパ芽球細胞株ＲａｊｉおよびＴ細胞株Ｈ−ＳＢ２の標識ｃＤＮＡを用いて、ヒト扁桃腺ｃＤＮＡライブラリーを種々のハイブリダイゼーションでスクリーニングした。分離された２６１個のＲＡＪＩ⁺Ｈ−ＳＢ２^-ｃＤＮＡクローンのうちの２つ、ｐＢ１０（〜２．５ｋｂ）およびｐＢ１２３（〜１．２ｋｂ）は互いにハイブリダイズしたが、既知のＢ細胞表面抗原をコードするｃＤＮＡ（Tedderら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:208(1988)）とはハイブリダイズしなかった。このｍＲＮＡの発現を、Ｂ細胞株（NALM-6，Namalwa，Daudi， SBおよびRaji）、Ｔ細胞株(Hut-78，H-SB2およびMOLT-3）および赤白血病株（K5 62）から分離したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを用いたノザンブロット分析によって調べた。ｐＢ１２３ｃＤＮＡは、ＳＢおよびＲａｊｉの〜１．７、〜２．０および〜２．５ｋｂの３種類のｍＲＮＡと強力にハイブリダイズした。ＤａｕｄｉおよびＮａｍａｌｗａ細胞はこのｍＲＮＡを低レベルで発現した。さらにこのブロットのオートラジオグラフィー（７日間）によって、ＮＡＬＭ−６、Ｈｕｔ−７８およびＭＯＬＴ−３細胞はまたこれら３種のｍＲＮＡを発現するがその程度はずっと低く、さらにＨ−ＳＢ２ＲＮＡとの微かなハイブリダイゼーションが検出されるということが明らかにされた。これらの結果は、白血球亜集団内のこの遺伝子の段階的発現を示唆している。これらｃＤＮＡについての制限地図を作製し、それらのヌクレオチド配列を求めた。両方のｃＤＮＡは重なり合い、最も長い５’配列を有するｐＢ１２３ｃＤＮＡともに、その５’末端に開放読み枠を含んでいた。いずれのクローンも翻訳開始部位を含まないので、ｐＢ１０ｃＤＮＡ挿入物をさらに１３個の交差ハイブリダイズｃＤＮＡをヒト扁桃腺ライブラリーから分離するために用いた。制限地図とヌクレオチド配列決定によって、このｃＤＮＡのうち１２個がオーバーラップし、１個のｃＤＮＡは最長の５’配列を含んでいた。このクローン（ｐＨＢ１５と呼ぶ）の制限地図およびヌクレオチド配列は図１に示す。完全な長さのｃＤＮＡクローンは、ＥｃｏＲＩ消化およびサブクローニングによって除去される３’末端の〜５００ｂｐを含む可能性が高い。他の別個のｃＤＮＡの８クローンは同じＥｃｏＲＩ生成フラグメントを有し、ＥｃｏＲＩ部位は、配列決定されたすべてのｃＤＮＡにおいて同一のヌクレオチド部位に位置していた。ｐＨＢ１５ｃＤＮＡは６２５ｂｐの開放読み枠を、非翻訳配列を表す主要なｃＤＮＡ部分とともに含んでいた。ＨＢ１５の決定ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列は図２に示す。成熟蛋白を生成するための予測切断部位は縦矢印で示す。アミノ酸配列の上に示した数字は推定成熟蛋白のアミノ酸残基部位を示し、右側の数字はヌクレオチド部位を示す。アミノ酸は、単一文字コードで表し、＊は終了コドンを表す。疎水性特性を有するヌクレオチド表記翻訳領域には下線を施してある。潜在的Ｎ−結合糖化反応結合部位を示すアミノ酸には下線を施してある。ポリ（Ａ）付加シグナル配列は波線で示す。Ｃｙｓ残基は円で囲み、Ｉｇ様ドメインでしばしば保存されるアミノ酸は（＋）で示す。ヌクレオチド配列の下の矢尻は、別のＤＮＡクローンで確認されたエクソン／イントロン境界を示す。最初に示されたＡＴＧは、提唱されている翻訳開始コンセンサス配列、（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧと一致するので（Kozakら、Cell 44:283-292(1986)）、おそらく翻訳の開始コドンであろう。異なるｍＲＮＡ種は特質的なポリ（Ａ）付加部位、ＡＡＴＡＡＡの使用によって生じる可能性が高い。なぜならば、１つは、３’非翻訳領域の中央のヌクレオチド１２４８位に見出されたからである（図２）。このポリ（Ａ）付加部位はｐＢ１２３ｃＤＮＡで機能を有する。なぜならばそれはポリ（Ａ）テールを伴っていたからである。ポリ（Ａ）付加部位またはテールは、ｐＨＢ１５ｃＤＮＡのおそらく３’末端を表している〜５５０ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントには認められなかった。ｃＤＮＡライブラリー（長さが〜３．０ｋｂ）から分離された、ｐＢ１２３ｃＤＮＡとハイブリダイズする１クローンは、他のｃＤＮＡで認められたものと同一の２２９ｂｐおよび１０７ｂｐのセグメントを有する固有の配列をもっていた。これらの領域は、エクソン境界を区切るコンセンサス５’および３’ スプライス配列(Aebiら、Trends Genet．3:102-107(1987))に対応する隣接配列を有するが、これは、この変種ｃＤＮＡはイントロンと２つのエクソンを含んでいるということを示している。このクローンによって認識された３つのスプライス結合部位は図２に示す。ＨＢ１５蛋白の予測される長さは２０５アミノ酸であった（図２）。しかしながら、ｐＢ１２３ｃＤＮＡはヌクレオチド５００位でコドンＡＡＧを失っていた。したがって、この蛋白はいくつかの場合においてアミノ酸１個分短いであろう。これは、このコドンが潜在的なスプライス部位と接しているので、１個のコドンを含んだりまたは失ったりすることになる特異的なエクソン／イントロン境界におけるスプライシングにより生じるかもしれない。同様な現象は、Ｉｇ上科の１種をコードするＣＤ１９においてもまた認められた（Zhouら、Immuno genetics，35:102-111(1992)）。カイトらの方法（Kyteら、J．Mol．Biol．157: 105-(1982)）によるアミノ酸配列のハイドロパシー分析によって、強い疎水性の２つの領域が明らかになった。１９アミノ酸の第一の疎水性部分は、この蛋白のアミノ末端の典型的なシグナルペプチドを表している。フォンヘインのアルゴリズム（von Heijne、Nucleic Acids Res．14:4683-4690(1986)）によって、もっとも可能性が高い成熟蛋白のアミノ末端は、アミノ酸１９に続くＴｈｒであろうと予測される。２２アミノ酸の第二の疎水性領域は、おそらくトランスメンブレン領域を表している。３つの潜在的なＮ−結合糖化結合部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）は細胞外ドメインに見出された。したがって、コアー蛋白の予測される分子量は〜２０５００であろう。６個のＣｙｓ残基はＨＢ１５の細胞外ドメインに見出され、１個は推定膜部分ドメインに認められた。１６位および８８位のこれらの残基の１対はＩｇ様ドメインを表している（Williamsら、Annu．Rev．Immunol．88:381-405(198 8)）。このドメインは、Ｉｇ様ドメインのＶセットの証明となる特徴的なアミノ酸の多くを含んでいた。蛋白同定源蛋白配列データベース(Protein Identificat ion Resource Protein Sequence Database)を用いた蛋白配列のコンピューター検索によって、いずれの蛋白もＩｇ上科の幾つかの種類以外とはＨＢ１５と顕著な配列相同性を共有しないことが示された。Ｉｇ重鎖Ｖドメインのβ型折り畳みシートの提唱配列に基づいて、ＨＢ１５の細胞外ドメイン構造の仮説モデルが与えられる（図３参照）。Ｃｙｓ残基は黒丸で表され、異なるエクソンによってコードされるアミノ酸は別々に斜線を施した円で示されている。数字は図２の場合のように予想されるアミノ酸残基位を表している。実施例２ＨＢ１５と反応する単クローン性抗体の製造ＮＳ−１ミエローマ細胞とｐＨＢ１５ｃＤＮＡトランスフェクトＣＯＳ細胞免疫マウス由来の脾細胞との融合によってハイブリドーマを生成した。ＨＢ１５ｍＲＮＡ陽性細胞株と間接免疫蛍光分析で反応するが、ＨＢ１５陰性細胞株とは反応しない単クローン性抗体を分離した。これらの抗体のうち２種、抗ＨＢ１５ａ（ＩｇＧ_2b）および抗ＨＢ１５ｂ（ＩｇＧ₃）はまた、ｐＨＢ１５ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞と反応したが、ＣＤ１９ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞(Tedderら、J．Immunol．143:712-717(1989))または発現ベクターのみでトランスフェクトした細胞とは反応しなかった。さらに、これらの抗体はヒト赤白血病細胞株（Ｋ５６２）およびマウス前Ｂ細胞株（３００．１９、ｐＨＢ１５ｃＤＮＡで安定的にトランスフェクトされている）とは反応した。この抗体は、未トランスフェクト親細胞株、ベクターのみでトランスフェクトした細胞；またはＣＤ１９、ＣＤ２０（Tedderraら、Proc．Natl．Acad．Sci.US A，85:208(1988)）もしくはＬＡＭ-１（Tedderら、J．Exp．Med.，170:123-133( 1989)）ｃＤＮＡトランスフェクト細胞とは反応しなかった。すべての場合に、抗ＨＢ１５ａおよび抗ＨＢ１５ｂの反応性は同一であった。実施例ＩＩＩＨＢ１５発現の検出細胞表面ＨＢ１５の免疫沈降反応抗ＨＢ１５ａ単クローン性抗体を精製しビーズに結合させ、表面をヨウ素化した細胞株の洗剤可溶化抽出物からＨＢ１５を免疫沈降させるために用いた。他の細胞株よりＨＢ１５の発現レベルが高いので、至適結果は、Ｋ５６２− ＨＢ１５細胞株（ｐＨＢ１５ｃＤＮＡをトランスフェクトしたＫ５６２細胞）を用いて得られた。抗ＨＢ１５ａ単クローン性抗体は、〜４５０００Ｍ_rの単一の広いバンドとして移動する蛋白を特異的に免疫沈降させた。免疫沈降物質を還元または非還元条件下で移動させたとき、同様な結果が得られた。同様な蛋白がＲａｊｉ細胞株から免疫沈降したが、Ｍ_rは〜４００００であった。したがって、ＨＢ１５は、細胞表面に非共有結合的に結合した単一鎖分子として発現されていた。ＨＢ１５は活性化リンパ球によって発現された。フローサイトメトリー分析を用いて間接免疫蛍光染色でＨＢ１５表面抗原の組織分布を調べた。ＨＢ１５メッセージを発現していなかった２つの細胞株を、レトロウイルスベクターｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（Ｘ）のＢａｍＨ１部位でサブクローニングしたｐＨＢ１５ｃＤＮＡでトランスフェクトした。図４を参考に、ＨＢ１５を発現している３つの類リンパ芽球細胞株で得られた免疫蛍光の結果を示す。無地のヒストグラムは細胞のＨＢ１５ａ抗体との反応性を示し、斜線付きのヒストグラムは、非反応性コントロール抗体で得られた免疫蛍光染色のバックグラウンドレベルを示している。調べた３３の細胞株の間では、ＨＢ１５は、Ｂ細胞株（Raji、Daudi．Namalwa、Arent、BJAB、SB、Jijoy、AkataおよびSLAを含む）およびＴ細胞株（Jurkat、H-9、Rex、H-SB2およびHut-78を含む）によって検出可能なレベルで発現していた。しかしながら、ＨＢ１５発現は一般に低くさらに一定ではなかった。最も高い細胞表面発現レベルは、細胞を分割し、したがって最大限に増殖させた場合に得られた。検出可能なレベルのＨＢ１５を発現しなかった細胞株は、Ｋ５６２；Ｂ細胞株(NALM-6およびRamos)；Ｔ細胞株（MOL T-3、RPM18405、PEER、MOLT-14、CEMおよびHPB-ALL；骨髄単球細胞株（HL60）；天然キラー細胞株（YT）；大腸癌株（Colo-205およびHT29）；肺細胞株(NCI-H69 およびNCI-H82)；前立腺株(PC3)；メラノーマ株(MEWO)；および乳癌細胞株（ZRT 5.1、MCF7およびBT20）を含む。正常な血液白血球によるＨＢ１５の発現もまた調べた。しかしながら、ＨＢ１５の細胞表面発現は、１５例の血液サンプルの循環リンパ球、天然キラー細胞または単球では顕著なレベルでは検出されなかった。したがって、ＨＢ１５は細胞活性化後に発現されるという可能性を、有糸分裂促進剤のコンカナバリンＡ(ConA)、アメリカヤマゴボウミトゲン、フィトヘマグルチニン−Ｐまたはフォルボールエステル(PMA)を用いてＴリンパ球増殖を誘発することによって調べた。ＨＢ１５の発現は、培養開始後２、８、１２、２４、４８、７２、１２０および２４０時間で調べた。ＨＢ１５発現の出現は細胞増殖と並行していたが、最適発現は培養開始後３日目から５日目であった。また、誘発されたＨＢ１５発現量は、いずれの特定の有糸分裂促進剤とも相関していなかったが、有糸分裂シグナルの強さとより相関していた。すなわち細胞表面発現はより大型の芽細胞で専ら認められた。したがって、ＨＢ１５は活性化後のリンパ球で発現した。ＨＢ１５発現の免疫組織分析ＨＢ１５のリンパ球特異性および組織分布もまたヒトの種々の組織の免疫組織分析によって調べた。基本的には、抗ＨＢ１ａ単クローン性抗体を胸腺、扁桃腺、脾臓、リンパ節、腎臓、腎孟および尿管、ファロピウス管、肝臓、膵臓、胃、乳房、肺臓、食道、骨格筋、皮膚、子宮、唾液腺、甲状腺、副腎腺、心臓、虫垂、結腸を染色するために用いた。殆どの場合、ＨＢ１５発現はリンパ球特異的のようで、非リンパ球組織では顕著な反応は認められなかった（図５Ａ− ５Ｆを参照）。扁桃腺およびリンパ節では（図５Ａ）、ＨＢ１５は小胞内領域の分散細胞（Ｔ細胞帯）によって相応に強く発現した（図５Ｃ）。これらの細胞の幾つかはリンパ芽球であったかもしれないが、それらは休止リンパ球より大型のようであり、さらにＣＤ１表面分子を発現していたので（図５Ｄ）、殆どは有指状突起細網細胞(interdigitating reticulum cells)（樹状突起細胞の亜集団）であった。また、胚中心（ＧＣ；図５Ａおよび５Ｂ）および小胞被膜帯（ＦＭ；図５Ａ）内の幾つかの細胞（５０−８０％）はリンパ球の形態を有し、弱くＨＢ１５⁺であった。脾臓では、ＨＢ１５⁺細胞は専ら白髄に限られ、一方赤髄は殆ど陰性のままであった。さらにまた、白髄中のこれら大型の分散した陽性細胞は有指状突起細網細胞またはリンパ芽球である可能性が高い。胸腺皮質はＨＢ１５陰性で、一方、髄質細胞の小細胞亜集団（おそらく胸腺細胞）は陽性であった（図５Ｅ）。他の非造血組織と異なり、皮膚の分析によって、ランゲルハン氏細胞（樹状突起細胞の亜集団）の特徴的な分散枝状形態を有するいくつかの細胞がＨＢ１５を検出可能レベルで発現することを明らかにした。すべての非造血組織間（ここでは炎症浸潤が明瞭であった）では、少しの分散リンパ球がＨＢ１５を発現していることが認められた。循環樹状突起細胞はまたＨＢ１５⁺であるが、頻度が低いので容易には検出されない可能性が高い。同様に、樹状突起細胞の悪性対応物はまたＨＢ１５を発現する可能性が高く、ホジキン症由来の悪性細胞株で有指状突起細網細胞の典型である可能性が高い（Schaadtら、Int．J．Cancer，2 6 :723-731(1980)）Ｌ４２８細胞株はＨＢ１５陽性であるので、この分子は悪性細胞の診断マーカーとして用いることができる可能性がある。実験手順ｃＤＮＡクローンの分離特異的なハイブリダイゼーションによるｃＤＮＡクローンの分離は既に報告された（Tedderら、Mol．Immunol．25:1321-1330(1988)）。１つのクローン、ｐＢ１２３を精製し、ニックトランスレーションで標識し(Rigdyら、J．Mol ．Biol．113:237-251(1977))、さらに報告（Zhouら、Immunogenetics，35:102-1 11(1992)）のようにλｇｔ１１（Weisら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83:563 9-5643(1986)）で同じヒト扁桃腺ｃＤＮＡライブラリーをもう一度スクリーニングすることによって同種のｃＤＮＡを分離するために用いた。陽性プラークを分離しクローニングして、さらにＥｃｏＲＩによって挿入物を除去し、ｐＳＰ６５（Meltonら、Nucleic Acids Res.，12:7035-7056(1984)）でサブクローニングした。制限地図をマニアーティスらの報告（Maniatisら、Molecular Cloning：A L aboratory Manual(1982)）のように作製し、サンガーらの方法（Sangerら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，74:5463-5467(1977)）を用いてヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチドおよび蛋白配列のコンピューター検索は、蛋白同定リソースデータ(Protein Identification Resource Data(GenBank release 66 & Swi ss-Prot-16))を用いて実施した。−１のギャップペナルティーは、１ギャップまたは欠失が生じた配列の各ヌクレオチドまたはアミノ酸についての配列相同性分析で調べた。ＲＮＡブロット分析報告（Maniatisら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982) ）のようにポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを分離した。ノザンブロット分析では、２μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡをグリオキサールで変性させ、１．１％のアガロースゲルの電気泳動で分画し、ニトロセルロースに移した(Thomas、Methods Enzymol.，100 :255(1983))。プローブとして用いたｐＢ１２３ｃＤＮＡ挿入物を分離し、ニックトランスレーション(Rigbyら、J．Mol．Biol．113:237-251(1977))を行い、報告（Wahlら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，76:3683-3687(1979)）のようにフィルターを用いてハイブリダイズさせた。非常に厳しい条件のハイブリダイゼーションでは、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド、４×ＳＳＣ、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸ナトリウム、４２℃を用いた。フィルターは、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄した。ＲＮＡサイズは、標準物として同一ゲルで流した２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡとの比較によって決定した。同じブロットをまた、身元不詳であるが全ｍＲＮＡが無傷でさらにこの発現ｍＲＮＡと同じ量であることが明らかなハウスキーピングｍＲＮＡとハイブリダイズさせた。ゆるやかな厳格度のハイブリダイゼーションの条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性分断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で一晩の反応であった。細胞ヒューマン・プロテクション・コミッティー・オブ・ダナファーバー・キャンサー・インスティテュート（Human Protection Committee of Dana-Far ber Cancer Institute）によって承認されたプロトコルによってヒト血液を得、フィコールハイパーク濃度勾配遠心で単核球を分離した。完全培地（１５％ウシ胎児血清、抗生物質およびグルタミン補充ＲＰＭＩ−１６４０）中の単核球（１０⁶／ｍｌ）をフィトヘマグルチニン−Ｐ（２μｇ／ｍｌ、Difco、デトロイト、ミシガン）、ＣｏｎＡ（１０μｇ／ｍｌ、Gibco/BRL、ベセスダ、メリーランド）またはフォーボルミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（１０ｎｇ／ｍｌ、シグマ、セントルイス、ミズーリー）で、報告(Tedderら、J．Immunol．144:5 32-540(1990))のように刺激した。表示時間でリンパ球を採集し、完全培地で１回洗浄し、下記のように直ちに免疫蛍光染色用に部分標本を採取した。修飾ＣＤＭ８ベクター(Aruffoら、EMBO J．6:3313(1987)；Tedderら、J．Immunol．143:712-717(1989))にサブクローニングしたｐＨＢ１５ｃＤＮＡ挿入物で、報告されたようにＤＥＡＥ−デキストラン法（Aruffoら、EMBO J．6: 3313(1987)）を用いてＣＯＳ細胞をトランスフェクトした。細胞表面発現は、４８時間後に間接免疫蛍光で調べた。レトロウイルスベクターｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（Ｘ）(Cepkoら、Cell，37:1053-1062(1984))のＢａｍＨ１部位に正確な方向性でクローニングされたｐＨＢ１５ｃＤＮＡを用いて、安定なｃＤＮＡトランスフェクト細胞が産生された。エレクトロポレーションによってネズミ前−Ｂ細胞株（300.19）およびヒト赤白血病細胞株（K562）をこのベクターでトランスフェクトし、その後Ｇ４１８(Gibco/BRL)を用いて安定な核酸感染体（トランスフェクタント）を選別した。ＨＢ１５を発現している細胞を単クローン性抗体と反応させ、続いて抗マウスＩｇ被覆プレート上で選り分けることによって、さらにＨＢ１５発現細胞を多くした。１０％ウシ胎児血清および抗生物質含有ＲＰＭＩ１６４０で細胞株を増殖させた。すべての細胞株培養を分析前日に分割し、対数増殖期にした。ｍＡｂ製造ＮＳ−１ミエローマ細胞と、ＨＢ１５ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で繰り返し免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞とを融合させて、報告(Tedderら、J．Immunol．144:532-540(1990))のように抗ＨＢ１５単クローン性抗体を生成した。各ハイブリドーマを２回クローニングし、腹水液を生成するために用いた。ｍＡｂのアイソタイプはアマーシャム社（アーリントンハイツ、イリノイ）製マウス単クローン性抗体アイソタイピングキットを用いて決定した。免疫蛍光分析細胞を４℃に保ち分離後直ちに調べた。生細胞の間接免疫蛍光分析を細胞を３回洗浄した後実施した。続いて細胞を免疫染色用の至適濃度に希釈した腹水液としての各ｍＡｂとともに氷上で２０分保温した。ヒト白血球と反応しないアイソタイプ適合ネズミ抗体を陰性コントロールとして用いた。洗浄後、フルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Southern Biotechno logy Associates、バーミンガム、アラバマ）で、細胞を４℃２０分処理した。エピックスプロフィル(Epics Profile)フローサイトメトリー（コールターエレクトリクス、ハイアレー、フロリダ）によって単色免疫蛍光分析を実施した。各サンプルに付き１万個の細胞を調べた。免疫沈降分析細胞を２回洗浄し、食塩水に再浮遊させ、報告のように（Thompsonら、Biochem.，26:743-750(1987)）ヨードゲン(iodogen)法によって標識した。洗浄後、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００およびプロテアーゼインヒビター含有緩衝液１ｍｌ中で記載(Tedderら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:208(1988)) の通り細胞を溶解した。製造元の支持に従い、直接アフィゲル（Affigel）（バイオラッド、リッチモンド、バージニア）にゲル１ｍｌにつき２ｍｇのｍＡｂの割合で直接結合させた抗ＨＢ１５ａ単クローン性抗体またはマウスＩｇ（陰性コントロールとして）を用いて、免疫沈降を実施した。細胞溶解物は、５０μｌ（５０％ｖ／ｖ）のネズミＩｇ被覆ビーズを用いて４℃で２時間２回予備沈降させた。細胞溶解物はさらに一晩予備沈降させた。その後、予備沈降させた溶解物の半分を２５μｌの抗ＨＢ１５ａ単クローン性抗体被覆ビーズまたはネズミＩｇ被覆ビーズとともに４℃１８時間一定の撹拌で保温した。免疫沈降物を洗浄し、記載（Tedderら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:208(1988)）の通りＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サンプルの半分は５％の２−メルカプトエタノールの存在下（還元状態））で分析した。Ｍrは予め染色された標準分子量マーカー（Gibco/BTRL）を用いて決定した。免疫組織化学コーデルら（Cordellら、J．Histochem．Cytochem．31:219-229(1984 )）の記載のように修飾ＡＰＡＡＰ法を用いて、全組織を染色した。基本的には、スライドをまず単クローン性抗体で保温し、続いてウサギ抗マウス（架橋）抗体による保温工程を行った。その後、アルカリホスファターゼで予備保温した、アルカリホスファターゼに対する単クローン性抗体で処理した。この方法の感度を高めるために、表面のホスファターゼ分子の数を１層または２層の架橋抗体および抗ホスファターゼ抗体を用いることによって増加させた。結合ホスファターゼ分子を基質として新フクシンを用いて可視化した（Cordellら、J．Histochem ．Cytochem．31:219-229(1984)）。用途ＨＢ１５蛋白もしくはその免疫特異的フラグメント、またはその抗体もしくはＨＢ１５機能に対する他の拮抗物質は、種々の免疫疾患、疾病または症候群の診断または治療に用いることができる。そのような目的のために、可溶性外部ドメインがしばしば用いられるであろう。これは典型的には（しかし必ずしも必然的ではないが）、例えばデキストランもしくはポリアミノ酸担体またはＨＢ１５フラグメント融合蛋白および担体分子を用いて多価状態で重合化されているであろう。また別にリポゾームを治療用賦形剤として用いることができ、その場合には、トランスメンブレンドメインおよび、好ましくは細胞質ドメインの少なくとも幾らかがまた含まれるであろう。例えば、ランゲルハン氏細胞は、皮膚の第一次免疫応答細胞で、Ｔ細胞に抗原を提示し、接触過敏を誘導する役割を果たすので、さらに、ＨＢ１５はランゲルハン氏細胞によって発現され、抗原提示に関与するので、ヒトの皮膚疾患、例えば乾癬、自己免疫疾患。臓器移植およびエイズの病理発生に関与する可能性が高い。したがって、ＨＢ１５機能の拮抗物質は、これら疾患の治療について重要な治療剤を提供することができる。同様に、ＨＢ１５はリンパ球活性化のための付随分子として機能する可能性があるので、ＨＢ１５抗原、そのフラグメントまたはドメインは、免疫反応を増大させる作用薬として用いることができる。より具体的には、樹状突起細胞はヒト免疫不全ウイルス（エイズの原因微生物）の一次標的である。インビボではエイズウイルスの８０％は樹状突起細胞、特にランゲルハン氏細胞、循環樹状突起細胞および有指状突起細網細胞によって産生されることが最近提唱された（Langhoffら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 88:7998-8002(1991)）。また、殆どの感染は粘膜表面を介して生じるが、その場合、樹状突起細胞がまず感染すると考えられる。したがって、本試薬は、エイズまたはエイズ関連疾患の有望な予防または治療のための重要な手段を提供する。一定の病的状態のモニターのために、患者の血液血清中の内因性可溶性ＨＢ１５量を定量することが推奨できるであろう。正常状態または病的な状態でいくつかのレセプターが放出されることが知られていることに基づいて、ＨＢ１５もまた細胞表面から酵素的過程によって失われるという可能性がある。また、定量的な検出は、白血球の活性化もしくは白血球機能の変化の診断および／または検出のために、ＨＢ１５の異常発現または発現低下について白血球を識別する方法において有用であろう。さらに、組換え体治療剤の製造中に産生されるレセプターまたはそのフラグメントの量を定量する能力も利点であろう。ＨＢ１５レベルの定量は当業者に既知の多数の分析方法を用いて実施できるが、これらの方法は、ＨＢ１５に対して作製した単クローン性抗体を用いる酵素結合免疫検定を含む。同様に、一定の臨床状態の治療では、内因性可溶性ＨＢ１５またはＨＢ１５⁺細胞を患者の血液から除去することが推奨されるであろう。これは、開示したＨＢ１５の外部ドメインに対して作製された抗体または他の結合剤を含む免疫選別カラムを用いることによって、現存のオンラインおよびオフライン技術を用いて実施できる。現時点では、ヒトの非小胞性樹状突起細胞のための特異的なマーカーは存在しない。ＨＢ１５単クローン性抗体をＨＢ１５⁺細胞の識別のために使用することによって、この蛋白を発現している細胞を非関連細胞集団から分離および精製することが可能になった。ＨＢ１５単クローン性抗体は、有指状突起細胞肉腫またはこの抗原を発現する他の悪性細胞型の評価および診断にもまた有用であろう。したがって、ＨＢ１５基剤薬は免疫治療または免疫画像化について適切であろう。さらに、ＨＢ１５機能の分析は、このレセプターの生理学的役割におけるさらに進んだ研究で用いることができる。例えば、予備実験では、混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖（Ｔ細胞活性化検定）は、抗ＨＢ１５単クローン性抗体の存在によって部分的に抑制される。この機能分析は、Ｔ細胞機能の開始における樹状突起細胞または単球のＨＢ１５分子の役割を提示する。これまで本発明を好ましい実施例と合わせて記載したが、前述の記載の読後、当業者は種々の変更、同等物の置き換え、並びに前述の組成および方法に対するその他の変更を実施することができるであろう。したがって、本発明に対するレターズパテントによって付与される保護は、添付の請求の範囲およびその同等物に含まれる範囲によってのみ制限されるであろう。寄託以下のハイブリドーマは１９９２年３月１７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。性状ＡＴＣＣ番号抗ＨＢ１５ａハイブリドーマ細胞株、ＨＢ１５ａＨＢ１０９８７抗ＨＢ１５ｂハイブリドーマ細胞株、ＨＢ１５ｂＨＢ１０９８８出願人の譲受け人、Ｄａｎａ−ＦａｒｂｅｒＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，はＡＴＣＣが該寄託の永久に保存できる寄託所であり、特許が付与された場合、公衆がそれを容易に入手できることを明言する。このように寄託した物質の公衆の入手に関する全ての制限は、特許付与の際に完全に取り除かれる。特許出願中に、３７ＣＦＲ１．１４および３５ＵＳＣ１２２の下にそれに対して権利を有すると長官が認めた者は、該物質を入手することができる。該寄託物質は、そのサンプルの最も最近の供給の要請後少なくとも５年間、さらにいずれの場合においても寄託の日から少なくとも３０年間または特許の有効期間の間（いずれか期間の長い方）は、活力を保持し、かつ汚染されないよう必要な全ての注意をもって維持されるであろう。出願人の譲り受け人は、該寄託所が、要請時に該寄託物の条件のためにサンプルを供給できない場合は、該寄託物を置き換える義務を負うことを承認する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年３月２９日【補正内容】請求の範囲１．配列番号：２で述べたＨＢ１５蛋白の細胞外ドメインをコードする配列を含む分離核酸。２．配列番号：２に示した全ＨＢ１５配列をコードする配列を含む、請求の範囲第１項の核酸。３．配列番号：２の残基１−１１３に対応するアミノ酸配列をコードする、請求の範囲第１項の核酸。４．配列番号：２に示したアミノ酸配列をコードする、請求の範囲第１項の核酸。５．配列番号２で述べたＨＢ１５蛋白のトランスメンブレンドメインをコードする配列を含む分離核酸。６．配列番号：２の残基１１４−１２５に対応するアミノ酸配列をコードする、請求の範囲第５項の核酸。７．配列番号２で述べたＨＢ１５蛋白の細胞質ドメインをコードする配列を含む分離核酸。８．配列番号：２の残基１２６−１８６に対応するアミノ酸配列をコードする、請求の範囲第７項の核酸。９．ＨＢ１５蛋白の哺乳類相同物をコードする分離核酸であって、当該核酸が、配列番号：１に示したコード配列を含むＤＮＡプローブと厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリダイズすることができ、さらに当該相同物がヒトＨＢ１５蛋白で観察された組織分布を有する分離核酸。１０．当該相同物の細胞外ドメインをコードする請求の範囲第９項の核酸の部分を含む分離核酸。１１．当該相同物のトランスメンブレンドメインをコードする請求の範囲第９項の核酸の部分を含む分離核酸。１２．当該相同物の細胞質ドメインをコードする請求の範囲第９項の核酸の部分を含む分離核酸。１３．請求の範囲第１項から１２項のいずれか１項の核酸を含む組換え体ベクター。１４．請求の範囲第１３項のベクターで形質転換した培養細胞。１５．未形質転換形の当該細胞は当該核酸によってコードされる蛋白を発現しない、請求の範囲第１４項の細胞。１６．請求の範囲第１５項の細胞を形質転換させた核酸の発現を可能にする条件下で培養することを含む、組換え体核酸の発現方法。１７．請求の範囲第１４項の培養細胞をＨＢ１５蛋白の産生を可能にする条件下で保温し、さらに該保温細胞からＨＢ１５蛋白を回収することを含む、ＨＢ１５蛋白の製造方法。１８．ＨＢ１５の組織分布パターンを有するＨＢ１５蛋白またはその部分をコードする配列番号：１に示した核酸配列と相補的な配列を有する核酸と、厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリダイズすることができる、長さが約２０ヌクレオチドより大きいポリヌクレオチド。１９．該厳しい条件が、２０％ホルムアミド、１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、５０ｍＭ燐酸ナトリウムおよび１０％硫酸デキストランを含有するハイブリダイゼーション溶液を含む、請求の範囲第１８項のポリヌクレオチド。２０．約５０ヌクレオチドより大きい、請求の範囲第１８項のポリヌクレオチド。２１．約１００ヌクレオチドより大きい、請求の範囲第２０項のポリヌクレオチド。２２．当該部分がＨＢ１５細胞外ドメインを含む、請求の範囲第１８項のポリヌクレオチド。２３．当該部分が配列番号：２のアミノ酸１−１１３を含む、請求の範囲第２２項のポリヌクレオチド。２４．転写制御配列に機能的に連結された請求の範囲第１８項のポリヌクレオチドで形質転換された培養細胞。２５．未形質転換形の当該細胞は当該ポリヌクレオチドでコードされる蛋白を発現しない、請求の範囲第２４項の細胞。２６．請求の範囲第２４項の細胞を当該ポリペプチドの産生に有効な条件下で培養し、さらに当該ポリペプチドを回収することを含む、請求の範囲第１８項のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの製造方法。２７．請求の範囲第１項から１２項および第１８項から２３項のいずれか１項の核酸によってコードされるポリペプチド。２８．請求の範囲第２７項のポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチド。２９．ＨＢ１５相同物の分離方法であって、当該方法が、請求の範囲第１項の当該核酸を、ＨＢ１５相同物をコードする核酸分子を含むと思われる核酸分子集団と、当該集団内の当該ＨＢ１５相同物をコードする核酸分子を同定するために十分なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせ、当該ＨＢ１５相同物をコードする当該核酸分子を分離することを含む分離方法。３０．当該核酸分子集団がネズミ組織から得られる、請求の範囲第２９項の方法。３１．請求の範囲第２９項または３０項の方法によって得られた核酸。３２．請求の範囲第３１項の核酸と厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリダイズすることができる核酸分離物。３３．請求の範囲第３２項の核酸によってコードされ、さらにＨＢ１５の組織分布パターンを有するポリペプチド。３４．請求の範囲第３３項のポリペプチドの配列を有するポリペプチド。３５．請求の範囲第２７項または３３項のポリペプチドと結合する単クローン性抗体。３６．ＨＢ１５蛋白と結合する単クローン性抗体。３７．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０９８７として寄託された細胞株によって産生される抗体によって認識されるＨＢ１５エピトープと結合する単クローン性抗体。３８．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０９８８として寄託された細胞株によって産生される抗体によって認識されるＨＢ１５エピトープと結合する単クローン性抗体。３９．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０８９７として寄託された細胞株によって産生される単クローン性抗体。４０．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０８９８として寄託された細胞株によって産生される単クローン性抗体。４１．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０８９７として寄託されたハイブリドーマ細胞株。４２．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０８９８として寄託されたハイブリドーマ細胞株。４３．請求の範囲第３５項−４０項の抗体を細胞集団と反応させ、さらに当該抗体が結合する細胞を分離することを含む、ＨＢ１５発現細胞を分離する方法。４４．細胞集団に発現される表面ＨＢ１５の量を定量する方法であって、当該方法が、ＨＢ１５と結合する抗体を、少なくともその幾つかが表面抗原を有すると思われる細胞集団と、当該抗体が表面ＨＢ１５と結合することが可能な条件下で反応させ；当該抗体が結合する細胞を検出し；さらに、結合抗体量を定量することを含む定量方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ０７Ｋ 14/705 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｎ 5/10 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｐ 15/02 0276−2Ｊ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｑ 1/68 9282−4Ｂ 15/00 ＣＧ０１Ｎ 33/53 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＢ 33/566 9454−4Ｃ 49/02 Ａ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．図２に示したアミノ酸配列を有するＨＢ１５蛋白の細胞外Ｉｇ様ドメイン、トランスメンブレンドメインまたは細胞質ドメインをコードし、さらにＨＢ１５の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列の相補物と厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリダイズすることができる核酸分離物。２．当該核酸がＤＮＡである、請求の範囲第１項の核酸分離物。３．当該核酸がＲＮＡである、請求の範囲第１項の核酸分離物。４．該核酸が図２に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求の範囲第１項の核酸分離物。５．該核酸が、ＨＢ１５決定基に特異的な単クローン性抗体によって認識されるポリペプチドをコードする、請求の範囲第１項の核酸分離物。６．ＨＢ１５の細胞外Ｉｇ様ドメインおよびトランスメンブレンドメインをコードする核酸を含む、請求の範囲第１項の核酸分離物。７．トランスメンブレンドメインおよび細胞質ドメインを含まないＨＢ１５の細胞外Ｉｇ様ドメインをコードする核酸を含む、請求の範囲第１項の核酸分離物。８．細胞外Ｉｇ様ドメインおよび細胞質ドメインを含まないＨＢ１５のトランスメンブレンドメインをコードする核酸を含む、請求の範囲第１項の核酸分離物。９．細胞外Ｉｇ様ドメインおよびトランスメンブレンドメインを含まないＨＢ１５の細胞質ドメインをコードする核酸を含む、請求の範囲第１項の核酸分離物。１０．ＨＢ１５細胞外Ｉｇ様ドメイン、ＨＢ１５トランスメンブレンドメインおよびＨＢ１５細胞質ドメインをコードする核酸を有し、その場合、ＨＢ１５細胞質ドメインをコードする核酸が異種細胞質ドメインと置き換えられている、請求の範囲第１項の核酸分離物。１１．ＨＢ１５細胞外Ｉｇ様ドメイン、ＨＢ１５トランスメンブレンドメインおよびＨＢ１５細胞質ドメインをコードする核酸を有し、その場合、ＨＢ１５トランスメンブレンドメインをコードする核酸が異種トランスメンブレンドメインと置き換えられている、請求の範囲第１項の核酸分離物。１２．ＨＢ１５細胞外Ｉｇ様ドメイン、ＨＢ１５トランスメンブレンドメインおよびＨＢ１５細胞質ドメインをコードする核酸を有し、その場合、ＨＢ１５トランスメンブレンドメインをコードする核酸が異種トランスメンブレンドメインと置き換えられている、請求の範囲第１項の核酸分離物。１３．図２に示したアミノ酸配列を有するＨＢ１５蛋白の細胞外Ｉｇ様ドメイン、トランスメンブレンドメインまたは細胞質ドメインをコードし、さらにＨＢ１５の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列の相補物と厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリダイズすることができる核酸分離物を含む組換え体発現ベクター。１４．請求の範囲第１３項の組換え体発現ベクターで形質転換した細胞を含む組成物。１５．図２に示したアミノ酸配列を有するＨＢ１５蛋白の細胞外Ｉｇ様ドメイン、トランスメンブレンドメインまたは細胞質ドメインをコードし、さらにＨＢ１５の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列の相補物と厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリダイズすることができる核酸分離物で宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養し、さらに、該細胞培養から当該ＨＢ１５蛋白を回収することを含む、ＨＢ１５蛋白の製造方法。１６．図２に示した核酸配列の相補物と厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリダイズすることができる約１０ｂｐよりも大きい核酸配列。１７．当該核酸がＤＮＡである請求の範囲第１６項の核酸配列。１８．当該核酸がＲＮＡである請求の範囲第１６項の核酸配列。１９．該厳しい条件が、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）；５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルツ溶液、１０％硫酸デキストランおよび２０μｇ／ｍｌの変性分断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩保温することである、請求の範囲第１６項の核酸配列。２０．図２に示したアミノ酸配列を有するＨＢ１５蛋白をコードする核酸配列と結合し、当該ＨＢ１５蛋白をコードする当該核酸の転写を遮断することができる、請求の範囲第１６項の核酸配列。２１．当該配列がゲノム配列である請求の範囲第１６項の核酸配列。２２．当該配列が生物学的に活性なフラグメントである請求の範囲第１６項の核酸配列。２３．当該フラグメントがＨＢ１５蛋白のコード領域由来である、請求の範囲第２２項の核酸配列。２４．担体蛋白をコードする核酸に連結された請求の範囲第１６項の核酸配列。２５．当該連結された、担体蛋白をコードする核酸が非ヒト供給源由来である、請求の範囲第２４項の核酸配列。２６．当該配列が約１０ｂｐより大きい図２の核酸配列のフラグメントを含む、請求の範囲第１６項の核酸配列。２７．当該配列が約２０ｂｐより大きい図２の核酸配列のフラグメントを含む、請求の範囲第１６項の核酸配列。２８．当該配列が約５０ｂｐより大きい図２の核酸配列のフラグメントを含む、請求の範囲第１６項の核酸配列。２９．当該配列が約１００ｂｐより大きい図２の核酸配列のフラグメントを含む、請求の範囲第１６項の核酸配列。３０．当該配列がＨＢ１５細胞外Ｉｇ様ドメインを含む請求の範囲第１６項の核酸配列。３１．適切な制御配列と機能的に連結された、請求の範囲第１６項の核酸分子の少なくとも１本の鎖で形質転換した細胞。３２．適切な制御配列と機能的に連結された、請求の範囲第１６項の核酸分子の少なくとも１本の鎖で形質転換される、請求の範囲第１６項の核酸を発現しない細胞。３３．請求の範囲第１６項の核酸によってコードされるポリペプチドの製造方法であって、当該ポリペプチドの製造に有効な条件下で請求の範囲第３２項の細胞を培養し、さらに当該ポリペプチドを回収することを含む、当該ポリペプチド製造方法。３４．請求の範囲第１項の核酸分離物によってコードされるポリペプチド。３５．請求の範囲第３４項のポリペプチドの配列を有するポリペプチド。３６．請求の範囲第１６項の核酸分離物によってコードされるポリペプチド。３７．請求の範囲第３６項のポリペプチドの配列を有するポリペプチド。３８．担体分子と結合した請求の範囲第３５項または３７項のポリペプチド。３９．請求の範囲第１項の核酸分離物と交差ハイブリダイズする核酸配列の分離方法であって、請求の範囲第１項の核酸分離物を提供し；核酸分子集団を提供し；当該分離物を当該集団とハイブリダイズし；さらに、当該分離物と交差ハイブリダイズする核酸を分離する工程を含む当該核酸配列分離方法。４０．当該分離物が交差ハイブリダイズする当該核酸をクローニングする工程をさらに含む、請求の範囲第３９項の方法。４１．当該クローニングした核酸の配列を当該核酸分離物の配列と比較し、さらに別のクローン化核酸配列の分離およびクローニングを継続し、当該別のクローン化核酸の配列を当該分離物の配列と比較する工程をさらに含む、請求の範囲第４０項の方法。４２．請求の範囲第４項の核酸と相同で、さらにヒト以外の動物種由来の核酸の分離方法であって、当該方法が、請求の範囲第４項の核酸分離物を提供し；ヒト以外の動物種由来の核酸分子集団を提供し；当該分離物を当該集団とハイブリダイズし；当該分離物が交差ハイブリダイズする核酸を分離しクローニングし；当該クローン化核酸の配列を当該核酸分離物の配列と比較し；さらに、また別のクローン化核酸配列の分離およびクローニングを継続し、さらに当該別のクローン化核酸の配列と当該核酸分離物の配列との比較を、当該別のクローン化核酸の配列が当該核酸分離物の配列と実質的にオーバーラップするまで継続するという工程を含む核酸分離方法。４３．当該分離された核酸がネズミの核酸集団由来である請求の範囲第４２項の方法。４４．請求の範囲第４２項の方法によって分離された核酸。４５．請求の範囲第４３項の方法によって分離された核酸。４６．請求の範囲第４４項の核酸と厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリダイズすることができる核酸。４７．請求の範囲第４５項の核酸と厳しいハイブリッド形成条件下でハイブリダイズすることができる核酸。４８．請求の範囲第４４項の核酸によってコードされ、さらにＨＢ１５の生物活性を有するポリペプチド。４９．請求の範囲第４８項のポリペプチドの配列を有するポリペプチド。５０．請求の範囲第４５項の核酸によってコードされ、さらにＨＢ１５の生物活性を有するポリペプチド。５１．請求の範囲第５０項のポリペプチドの配列を有するポリペプチド。５２．請求の範囲第３５項または３７項のポリペプチドと反応する抗体。５３．機能的な分子を生成するために請求の範囲第３５項または３７項のポリペプチドと特異的に結合する分子と反応する抗体。５４．請求の範囲第５２項の抗体を細胞集団と反応させ、さらに当該抗体が結合する細胞を分離することを含むＨＢ１５発現細胞の同定方法。５５．請求の範囲第５２項の抗体を細胞集団と反応させ、さらに当該抗体が結合する細胞を検出することを含むＨＢ１５発現細胞の同定方法。５６．放射性核種、常磁性アイソトープまたは放射線不透過性標識で標識したＨＢ１５またはリガンド結合ＨＢ１５フラグメントと反応する単クローン性抗体を含む、ヒト患者の病的状態を画像化するための画像化剤。５７．細胞集団で発現されるＨＢ１５量の定量方法であって、該方法が請求の範囲第５２項の抗体を当該細胞集団と反応させ；当該抗体が結合する細胞を検出し；さらに、当該細胞集団に結合する当該抗体の量を定量することを含むＨＢ１５の定量方法。５８．請求の範囲第５２項の抗体を当該ＨＢ１５蛋白を発現する細胞集団と反応させることを含むＨＢ１５蛋白機能の遮断方法。５９．癌、組織損傷または免疫疾患を罹患しているヒト患者に、非毒性医薬担体中のＨＢ１５機能に対する作動薬または拮抗薬の治療量を投与することを含む、当該患者の治療方法。６０．癌、組織損傷または免疫疾患を罹患しているヒト患者に、非毒性医薬担体中の請求の範囲第３５項または３７項のポリペプチドの治療量を投与することを含む、当該患者の治療方法。６１．当該ポリペプチドに結合するリガンドを同定するための、請求の範囲第３５項または３７項のポリペプチドの使用。６２．当該ポリペプチドと特異的に結合する分子と結合し、機能的な分子を生成するリガンドを同定するための、請求の範囲第３５項または３７項のポリペプチドの使用。６３．請求の範囲第６１項の手法を用いて同定されたリガンド。６４．請求の範囲第６２項の手法を用いて同定されたリガンド。６５．当該拮抗薬がリガンドまたはその部分を含み、請求の範囲第６１項または６２項の手法を用いて同定される、請求の範囲第５９項の方法。６６．当該拮抗薬が請求の範囲第５２項または５３項の抗体を含む、請求の範囲第５９項の方法。６７．当該作動薬または拮抗薬が請求の範囲第３５項または３７項のポリペプチドを含む、請求の範囲第５９項の方法。６８．当該作動薬または拮抗薬が、担体分子に結合された請求の範囲第３５項または３７項のポリペプチドを含む、請求の範囲第５９項の方法。６９．ＨＢ１５蛋白と反応するヒト単クローン性抗体。７０．当該単クローン性抗体が、マウス単クローン性抗体由来の可変領域セグメントおよびヒト抗体由来の他の領域を有するキメラ化単クローン性抗体である、請求の範囲第６９項の単クローン性抗体。７１．抗ＨＢ１５ａ単クローン性抗体。７２．抗ＨＢ１５ａ単クローン性抗体によって認識されるＨＢ１５エピトープを認識する単クローン性抗体。７３．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０９８７として寄託されたハイブリドーマ細胞株。７４．抗ＨＢ１５ｂ単クローン性抗体。７５．抗ＨＢ１５ｂ単クローン性抗体によって認識されるＨＢ１５エピトープを認識する単クローン性抗体。７６．ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ１０９８８として寄託されたハイブリドーマ細胞株。