JPH09505721A - インターロイキン６レセプターアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、IL-6レセプターアンタゴニストとして作用し、それにより天然に存在するIL-6の通常の機能を阻害するインターロイキン６(IL-6)変異タンパク質クラスを提供する。これらのIL-6レセプターアンタゴニストは、好ましくは、１つまたはそれ以上の変異を、アミノ酸145-163を含有するサイトII領域に含むIL-6分子である。本発明はまた、IL-6レセプターアンタゴニストを薬学的に受容可能なキャリアとともに含有する薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、敗血症および多発性骨髄腫のようなIL-6関連疾患を治療する方法であって、IL-6レセプターアンタゴニストを患者に投与することを包含する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン６レセプターアンタゴニスト発明の分野 本発明は、免疫および宿主防御機構の制御の分野にある。さらに特定すると、 本発明は、インターロイキン６とその２つのレセプタータンパク質との間の相互 作用を妨害するインターロイキン６変異タンパク質クラスの発見に関する。本発 明は、このような変異タンパク質のインターロイキン６関連疾患の制御および予 防への使用にも関する。発明の背景 インターロイキン６(IL-6)は、宿主防御機構中で中心的な役割を果たす多機能 性のサイトカインである。Heinrichら、Biochem．J.，265，621(1990)；Van Sni ck，J．Annu．Rev．Immunol.，8，253(1990)；およびHiranoら、Immunol．Today ，11，443(1990)。しかし、種々のヒト炎症、自己免疫、および腫瘍性疾患にお いて、異常なIL-6の生成が観察され、そしてこれらの疾患の病原においてある役 割を果たすと示唆されている。Hiranoら、前出；Sehgal，Proc．Soc．Exp．Biol ．Med.，195，183(1990)；Grau，Eur．Cytokine Net，1，203(1990)；Bauerら、 Ann．Hematol.，62，203(1991)；Campbellら、J．Clin．Invest.，7，739，(199 1)；およびRoodmanら、J．Clin．Invest.，89，46(1992)。従って、IL-6生物活 性のインヒビターは、疾患におけるその役割を研究する ために有用であり、そして広く治療に対して適用され得る。 IL-6の過剰生成は、敗血症に包含され(Starnes，Jr.ら、J．Immunol.，145，4 185(1990))、そして多発性骨髄腫疾患、または形質細胞性白血病にも関与してい る(Kleinら、Blood，78，1198(1991))。他の疾患は、骨吸収(骨粗鬆症)(Roodman ら、J．Clin．Invest.，89，46(1992)；Jilkaら、Science，257，88-91(1992)) 、悪液質(Strassmanら、J．Clin．Invest.，89，1681(1992))、乾癬、メサンギ ウム増殖性糸球体腎炎、腎細胞癌、カポジ肉腫、慢性関節リウマチ、高ガンマグ ロブリン血症(Grauら、J．Exp．Med．172，1505(1990))、キャッスルマン病、Ig Mガンモパシー、心臓粘液腫、および自己免疫インシュリン依存性糖尿病(Campbe llら、J．Clin．Invest.，87，739(1991))を包含する。 IL-6は、標的細胞の表面上の少なくとも２つの特異的なレセプターとの相互作 用を介して機能する。Tagaら、J．Exp．Med.，166，967(1987)；およびCoulieら 、Eur．J．Immunol.，17，1435(1987)。これらの２つのレセプター鎖についての cDNAをクローニングした。そして、それらは、２つの膜貫通糖タンパク質：80kD aのIL-6レセプター(「IL-6R」)および「gp130」と呼ばれる130kDaの糖タンパク質を コードする。Yamasakiら、Science，241，825(1988)；およびHibiら、Cell，63 ，1149(1990)。IL-6は、以下の単一の機構でこれらの糖タンパク質と相互作用す る。第１に、IL-6Rは、シグナルを生じさせずに低い親和性(Kd＝約１nM)でIL-6 に結合する。Tagaら、 Cell，58，573(1989)。IL-6/IL-6R複合体は、続いてgp130と会合し、これはシグ ナルを変換する。Hibiら、前出；およびTagaら、前出。gp130自体は、溶液中でI L-6に対する親和性は有していないが、膜上でIL-6/IL-6R複合体を安定化させ、 よってIL-6の高い親和性結合(Kd＝約10pM)が得られる。Hibiら、前出。最近、gp 130が、オンコスタチンＭ(oncostatin M)に対する低親和性のレセプターであり 、そしてLIFレセプターに対する親和性コンバーターであることもまた分かった( Gearingら、Science，255，1434(1992))。 成熟ヒト(ｈ)IL-6は、２つのジスルフィド結合（Cys₄₅とCys₅₁およびCys₇₄とC ys84)を含む185アミノ酸ポリペプチドである。Clogstonら、Arch．Biochem．Bio phys.，272，144(1989)。最初の28残基は、生物活性に影響を与えずに欠失され 得る。Brakenhoffら、J．Immunol.，143，1175(1989)。hIL-6の生物学的活性は 、構造依存性であるらしい。大きな内部欠失は、分子の構造全体を崩壊させ、そ して活性を完全に失わせる。Snouwaertら、J．Immunol.，146，585(1991)；およ びFontaineら、Gene，104，227(1991)。２番目の(１番目ではない)ジスルフィド 結合の保持は、特にヒト細胞株を含むバイオアッセイにおいては、臨界的である 。Snouwaertら、J．Biol．Chem.，266，23097(1991)。活性に対する領域臨界は 、残基Ile₃₀からAsp₃₅(Brakenhoffら、前出；Fontaineら、前出；およびArcone ら、FEBS Letters，288，197(1991)を参照のこと)、Ala₁₅₄からThr₁₆₄(Idaら、B iochem．Bilophys．Res．Co mmun.，165，728(1991)；およびNishimuraら、FEBS Letters，281，167(1991)を 参照のこと)、およびArg₁₈₃からMet₁₈ EBS Letters，273，95(1990)を参照のこと)を含む。個々の残基の置換分析は、 活性およびIL-6Rへの結合の両方について重要であるLeu₁₅₉、Met₁₆₂、およびLeu₁₆₆ に関与した(Nishimuraら、前出を参照のこと)。正電荷およびα-ヘリックス Ｃ ttickenら、FEBS Letters，282，265，(1991)。 IL-6の活性を中和する１つの方法は、IL-6への抗体の使用である。IL-6に対す る中和モノクローナル抗体(MAb)は、IL-6分子上の２つの異なるエピトープの認 識に基づき、部位Ｉおよび部位IIと呼ばれる２つのグループに分け得る。部位Ｉ は、IL-6分子のアミノ末端およびカルボキシ末端の両方で構成されている構造エ ピトープである；アミノ末端部分は、アミノ酸Ile₃₀〜Asp₃₅を含む；一方カルボ キシ末端部分は、臨界アミノ酸Arg₁₈₃〜Met₁₈₅を含む。部位IIは、臨界アミノ酸 Ala₁₅₄〜Thr₁₆₃を含む。Brakenhoffら、前出、(1990)。 IL-6活性を中和する他の方法は、特定のレセプター-アンタゴニストを有する リガンド-レセプターを阻害することである。この一般的なアプローチの方法の 可能性は、インターロイキン１に対する天然に存在するレセプター-アンタゴニ ストにより近年証明された。Hannumら、Nature，343，336-340(1990)。 しかし、天然のレセプター-アンタゴニストは、IL-6に対してこれまで同定され ていなかった。アンタゴニストの性質を有するhIL-6変異体も全く発見されてい なかった。本発明は、IL-6レセプターアンタゴニストとして作用するhIL-6変異 体を構成するMAbとの部位Ｉおよび部位IIの働きから集めた情報を用いる。 発明の要旨 本発明は、IL-6Rに結合するIL-6における部位Ｉの役割、およびIL-6/gp130の 相互作用における部位IIの役割の発見に関する。IL-6レセプターモデルによると 、通常IL-6Rに結合するIL-6変異体、およびgp130と相互作用しない続いて形成さ れるIL-6変異体/IL-6R複合体は、レセプター-アンタゴニストとして機能する。 本発明者らは本明細書において、部位II領域での置換変異体を、種々のIL-6バイ オアッセイにおいて残基の生物活性について分析した。単離した変異体の１つは 、ヒト細胞とのアッセイにおいて1,000〜10,000倍の比活性の低下を示し、そし て３つのヒトアッセイのうち２つにおいて野生型組換え(r)hIL-6の活性を特異的 に拮抗し得た。 本発明の第１の目的は、新規に発見された薬剤としての、IL-6のアンタゴニス トである分子の新規に同定されたクラスを提供することである。 本発明のさらなる目的は、IL-6レセプターアンタゴニストをコードするオリゴ ヌクレオチド配列を提供することである。 本発明の他の目的は、IL-6関連疾患、特に敗血症および多発性骨髄腫の治療の ための薬学的組成物を提供することである。 従って、本発明の１つの局面において、IL-6レセプターアンタゴニスト分子の グループが提供される。好ましい実施態様では、IL-6レセプターアンタゴニスト は、１つ以上の部位II変異を含むIL-6分子である。 本発明の他の局面において、IL-6レセプターアンタゴニストおよび薬学的に受 容可能なキャリアを含有する薬学的組成物が提供される。 本発明のさらなる局面において、IL-6関連疾患の治療方法が提供され、上記方 法は、敗血症を治療するに有効な量のIL-6レセプターアンタゴニストおよび薬学 的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を、このような治療を必要とす る患者に投与する工程を包含する。好ましい実施態様では、IL-6関連疾患は、敗 血症および多発性骨髄腫である。 図面の簡単な説明 図１は、種々のIL-6変異体のクマシーブルー染色SDS-ポリアクリルアミドゲル を示す。レーンは、(１)rhIL-6 HGF7；(２)rhIL-6 T₁₆₃P；(３)rhIL-6 Q₁₆₀E，T₁₆₃ Pである。矢印は、成熟rhIL-6の移動位置を示す。 図２は、ヒト細胞株との種々のアッセイにおける野生型IL-6および２種のIL-6 変異体の用量反応曲線を示す。(Ａ)は、 CESS細胞によるIgG1の合成量を示す；(Ｂ)は、HepG2細胞によるC1エステラーゼ インヒビターの産生量を示す；そして(Ｃ)は、ヒト骨髄腫細胞株XG-1によるトリ チウム化されたチミジンの取り込み量を示す。 図３は、(Ａ)CESSアッセイ；および(Ｂ)HepG2アッセイにおける野生型IL-6活 性に対する組換えヒトIL-6 Q₁₆₀E，T₁₆₃Pの阻害を示す。 図４は、IL-6 Q₁₆₀E，T₁₆₃Pを用いたおよび用いない、野生型IL-6の存在下で の、HepG2細胞によるC1エステラーゼインヒビターの産生量を示す。 図５は、IL-6 Q₁₆₀E，T₁₆₃Pを用いたおよび用いない、培地、野生型IL-6(５ng /ml)、またはガンマインターフエロン(1ng/ml)の存在下での、HepG2細胞によるC 1エステラーゼインヒビターの産生量を示す。 図６は、rhIL-6 HGF7およびIL-6 Q₁₆₀E，T₁₆₃Pを用いて、IL-6レセプター産生 細胞(IL-6Rをコードする発現ベクターでトランスフェクトしたNIH-3T3線維芽細 胞)に対するIL-6結合の阻害を比較している。 発明の詳細な説明 本明細書に記載された発明は、以前に公開された研究および係属中の特許出願 を明示している。例として、このような研究は、科学論文、特許、または係属中 の特許出願から構成される。前述または以下で引用のこれらの出版物および出願 の全ては、本明細書中に参考として援用されている。あらゆる類似または等価の 方法および材料が、本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい 方法および材料が、現在記載されている。定義： 本明細書で用いる用語「インターロイキン６」または「IL-6」は、IL-6、および天 然IL-6の生物学的特徴を保持しているフラグメント、欠失、付加、置換、変異、 およびそれらの改変を意味する。特に断らない限りは、この用語はヒトIL-6を意 味する。 本明細書で用いる用語「IL-6関連疾患」は、IL-6の過剰生成に関連した疾患を意 味し、これは、敗血症、多発性骨髄腫疾患(形質細胞性白血病)、骨吸収(骨粗鬆 症)、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、腎細胞癌、カポジ肉腫、 慢性関節リウマチ、高ガンマグロブリン血症、キャッスルマン病、IgM ガンモパ シー、心臓粘液腫、および自己免疫糖尿病を包含する。 本明細書で用いる用語「IL-6レセプターアンタゴニスト」は、IL-6の正常な機能 を妨げる分子を意味する。それは(１)急性相タンパク質生成のIL-6誘発の阻害； (２)骨髄腫および形質細胞腫成長のIL-6誘発の阻害；および(３)ヒトＢ細胞によ る免疫グロブリン合成のIL-6誘発の阻害のような、インビトロでのバイオアッセ イにおいて、野生型IL-6分子の特異的な阻 害により決定される。特定のIL-6レセプターアンタゴニストが、決定配列のポリ ペプチドである場合、本発明はまた、その用語が、決定されたポリペプチドの生 物学的特徴を保持するフラグメント、欠失、付加、置換、変異およびそれらの変 形を包含することを考慮している。 タンパク質における「変異」は、それをコードするDNAのヌクレオチド配列の 変化により、その一次構造を変化させる。これらの変異は、対立遺伝子変異体を 包含する。「改変」タンパク質は、タンパク質のグリコシル化または脂質化(lipid ation)様式、または一次、二次、または三次構造を変化させる翻訳後事象の結果 として、非改変タンパク質とは異なる。タンパク質の一次構造の変化もまた、欠 失、付加、または置換から生じ得る。「欠失」は、一つ以上の内部アミノ酸残基が 欠けたポリペプチドとして定義される。「付加」は、野生型に比べて一つ以上の付 加された内部アミノ酸残基を有するポリペプチドとして定義される。「置換」は、 一つ以上のアミノ酸残基が他の残基に置き換わることから生じる。タンパク質「 フラグメント」は、上記ポリペプチドに関連するタンパク質が一次配列の一部分 に一致する一次アミノ酸配列からなるポリペプチドである。 好ましい「置換」は、同類置換であり、すなわち、残基は別の一般型に置き換わ っている。十分に理解されているように、天然に存在するアミノ酸は、酸性、塩 基性、中性、および極性、あるいは、中性および非極性に下位分類され得る。さ ら に、コード化アミノ酸のうち３つは、芳香族である。一般的に好ましくは、決定 されたIL-6レセプターアンタゴニストとは異なるコード化ペプチドが、置き換え られるアミノ酸のグループと同じグループに由来のアミノ酸に対する置換コドン を含む。従って、一般的に、塩基性アミノ酸Lys、Arg、およびHisは、相互に置 き換え可能である；酸性アミノ酸AspおよびGluは、相互に置き換え可能である； 中性極性アミノ酸Ser、Thr、Cys、Gln、およびAsnは、相互に置き換え可能であ る；非極性脂肪族アミノ酸Gly、Ala、Val、Ile、およびLeuは、互いに関して保 存性である(が、大きさのため、GlyおよびAlaがより密接に関連し、そしてVal、 Ile、およびLeuがより密接に関連している)、そして、芳香族アミノ酸Phe、Trp 、およびTyrは相互に置き換え可能である。 IL-6レセプターアンタゴニストポリペプチドが、合成で作成される場合、DNA により自然にコードされていないアミノ酸による置換もまた生じ得ることを、さ らに注意すべきである。例えば、代替残基は、式NH₂(CH₂)_nCOOHで、ｎが２〜６ であるオメガアミノ酸を含む。これらは、中性の非極性アミノ酸であり、サルコ シン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、およびノ ルロイシンである。フェニルグリシンは、Trp、Tyr、またはPheに置換し得る； シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは中性で極性であり、シクロヘキシル アラニンは中性で非極性であり、システイン酸は酸性であり、そしてオルニチン は塩基性である。プロリンは、 ヒドロキシプロリンで置換され得、そして構造付与特性を保持し得る。 タンパク質の「生物学的特徴」は、関与する生物の生物学的プロセスにおけるタ ンパク質の構造的または生化学的機能を意味する。IL-6レセプターアンタゴニス トの生物学的特徴の例は、以下を包含する：(１)野生型IL-6により誘発されるCE SS細胞によるIgG₁合成の阻害；(２)野生型IL-6により誘発されるHepG2細胞によ るC1エステラーゼインヒビター合成の誘導；(３)IL-6応答性細胞上での活性を欠 くIL-6レセプターへの結合能力；(４)IL-6レセプターへの結合に対する野生型IL -6との競合；および（５）標的細胞上での野生型IL-6の生物学的活性の阻害。 本明細書で用いる「部位Ｉ」は、モノクローナル抗体MAb CLB.IL-6/8により認識 される、IL-6分子上の構造エピトープを意味する(Brakenhoffら、J．Immunol.， 145，561(1990)を参照のこと)。エピトープは、IL-6分子のアミノ末端部分およ びカルボキシ末端部分の両方を含む：アミノ末端部分は、アミノ酸Ile₃₀-Asp₃₅ を含む；一方カルボキシ末端部分は、臨界アミノ酸Arg₁₈₃-Met₁₈₅を含む。「部位 II」は、臨界アミノ酸Ala₁₅₄-Thr₁₆₃、およびモノクローナル抗体MAb CLB.IL-6/1 6により認識されるIL-6分子上の構造エピトープに対応する他の領域を含む(Brak enhoffら、J．Immunol.，145，561 (1990)を参照のこと)。IL-6レセプターアンタゴニストの調製 IL-6レセプターアンタゴニストは、Merrfieldらの方法により、合成で生成さ れ得る。IL-6レセプターアンタゴニストは、米国特許第4,966,852号に示される ように、組換えで生成され得る。例えば、タンパク質に対するcDNAは、原核生物 または真核生物中で発現させるためにプラスミド中に取り込まれ得る。米国特許 第4,847,201号（これは、その全体が本明細書中に参考として援用されている)は 、特定のDNA配列を有する微生物の形質転換およびそれらの発現についての詳細 を提供する。当業者に公知の他の参考文献が多くあり、それらは、微生物を用い るタンパク質の発現の詳細を提供する。それらの多くは、Sambrookら、Molecula r Cloning，Cold Spring Harbor Press(第２版、1989)のように、米国特許第4,8 47,201号に引用されている。 以下は、微生物におけるIL-6レセプターアンタゴニストの形質転換および発現 に関する大要である。IL-6レセプターアンタゴニストDNA配列は、pUNC13またはp BR3822のようなプラスミド中に取り込まれ得る。これらのプラスミドは、Boehri nger-Mannheimのような会社から市販されている。一旦、IL-6レセプターアンタ ゴニストDNAがベクター中へ挿入されると、それは適切な宿主中にクローニング され得る。DNAは、Mullisに対する米国特許第4,683,202号、およびMullisらに対 する米国特許第4,683,195号に示されたような技術により増幅され得る。発現ベ クターがE．coliのような宿主中に形質転換され た後、細菌が培養され得、そしてタンパク質が発現され得る。細菌は、好ましい 原核微生物であり、E．coliが、特に好ましい。本発明で有用な好ましい微生物 は、E．coli K-12株MM294であり、これは1984年２月14日にブダペスト条約の規 定により、受諾番号39607号で、アメリカンタイプカルチャーコレクション、123 01 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852，United States of America( 以下「ATCC」と呼ぶ)に寄託されている。あるいは、IL-6レセプターアンタゴニス トは、哺乳動物細胞中へ導入され得る。これらの哺乳動物細胞は、CHO、COS、C1 27、Hep G2、SK Hep、バキュロウイルス、および感染昆虫細胞を含み得る(上記 で引用した米国特許第4,847,201号もまた参照のこと)。Pedersenら、J．Biol．C hem.，265，16786-16793(1990)もまた参照のこと。 代表的には、組換えタンパク質の生成についての特別な詳細は、以下を含む：適切な宿主、制御系、および方法 第１に、成熟タンパク質(ここで用いたものは、全ての変異タンパク質を含む) ；プレタンパク質；あるいは、その活性を破壊しない付加配列、または活性タン パク質を与える制御された条件(ペプチダーゼでの処理のような)下で切断された 付加配列へのIL-6レセプターアンタゴニストタンパク質の融合をコードするDNA が得られる。配列がイントロンによりとぎれていない場合は、それはいかなる宿 主にもおける発現に適切 である。イントロンがある場合、発現は哺乳動物、またはそれらをプロセッシン グし得る他の真核系において得られ得る。この配列は、切除可能でそして回収可 能な形態であるべきである。次いで、切除したまたは回収したコーディング配列 は、複製可能な発現ベクター中の適切な制御配列と作動可能に連結して配置され る。ベクターは、適切な宿主を形質転換するために用いられ、そして、形質転換 された宿主は、組換えIL-6レセプターアンタゴニストの生成に効果的な好ましい 条件下で培養される。 ゲノムまたはcDNAフラグメントが得られ、そして適切な宿主中で直接用いられ る。種々の宿主中で作動可能な発現ベクターのための構築物は、以下に説明する ように、適切な複製および制御配列を用いて作製される。標準的に利用されない ものである場合、適切な制限部位が、これらのベクター中へ挿入する切除可能な 遺伝子を提供するために、コーディング配列の末端に付加され得る。 制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、遺伝子の発現に用いる宿主 細胞の型に依存する。一般的に、原核、酵母、または哺乳動物細胞が、現在宿主 として有用である。適切な翻訳後プロセッシングを行い得る宿主系が好ましい。 従って、一般的に原核宿主が、組換えタンパク質の生成について、最も効率的で そして便利であるが、真核細胞、および特に哺乳動物細胞は、それらのプロセッ シング能力、例えば適切なグリコシル化様式を形成する能力について、好ましい 。 さらに、天然のシグナル配列は、哺乳動物細胞により認識され、従って、分泌が 可能となり、そしてそれにより精製がさらに簡単になることが充分確信される。制御配列および相当宿主 原核細胞は、最も頻繁に、E．coliの種々の株により代表される。しかし、桿 菌(例えば、枯草菌(Bacillus subtilis))、種々の種のシュードモナス、または 他の細菌株のような他の微生物株も用いられ得る。このような原核系において、 複製部位および宿主との適合性を有する種由来の制御配列を含むプラスミドベク ターが用いられる。例えば、E．coliは、代表的に、Bolivarら、Gene，2，95(19 77)によるE．coli種由来のプラスミドであるpBR322の誘導体を用いて形質転換さ れる。pBR322は、アンピシリン遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み 、従って、所望のベクターの構築において保持または破壊のいずれかを行い得る マーカーを、さらに提供する。一般に用いられる原核性制御配列は、本明細書中 で、転写開始のためのプロモーターを、リボソーム結合部位配列とともに、必要 に応じてオペレーターと含むと定義されている。それは、ベータ-ラクタマーゼ( ペニシリナーゼ)、およびラクトース(lac)プロモーター系(Changら、Nature，19 8，1056(1977))；トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddelら、Nucleic Aci ds Res.，8，4057(1980))；T7プロモーター(Studierら、Meth．Enzymol.，185， 60(1990))；およびλ由来 のP_LプロモーターおよびN-遺伝子リボソーム結合部位(Shimatakeら、Nature，29 2，128(1981))のような、一般的に用いられるプロモーターを含む。これは、198 7年12月８日発行の米国特許第4,711,845号に説明のように、運搬可能な制御カセ ットとして有用にされている。しかし、原核生物との適合性がある、いずれもの 利用可能なプロモーター系が用いられ得る。 細菌に加えて、酵母のような真核微生物もまた、宿主として用いられ得る。多 くの他の株が一般的に利用可能であるが、Saccharomyces cerevisiaeの実験室株 であるBaker酵母が、最もよく用いられる。酵母での発現に適切なプラスミドベ クターの例は、Broach，Meth．Enz.，101，307(1983)；Stinchcombら、Nature， 282，39(1979)；およびTschempeら、Gene，10，157(1980)；およびClarkeら、Me th．Enz.，101，300(1983)に示されている。酵母ベクターのための制御配列は、 解糖系酵素の合成のためのプロモーターを含む(Hessら、J．Adv．Enzyme Reg.， 7，149(1968)；Hollandら、Biochemistry，17，4900(1978))。当該分野で公知の 別のプロモーターは、３-ホスホグリセレートキナーゼに対するプロモーター(Hi tzemanら、J．Biol．Chem.，255，2073(1980))、ならびにグリセルアルデヒド-3 -ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラ ーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-ホスフェートイソメラーゼ、３- ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオ ースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコ キナーゼのような他の解糖系酵素に対するプロモーターを含む。生育条件に制御 される、転写におけるさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデ ヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する 分解酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用の原因となる酵素に対す るプロモーター領域である(Holland、前出)。ターミネーター配列は、コーディ ング配列の3'末端にあるのが望ましいとも考えられている。このようなターミネ ーターは、酵母由来の遺伝子中のコーディング配列の後の3'非翻訳領域中で見い だされる。例示したベクターの多くは、プラスミドpeno46を含むエノラーゼ遺伝 子由来(Hollandら、J．Biol．Chem.，256，1385(1981))、またはYEp13から得たL EU2遺伝子由来(Broachら、Gene，8，121(1978))の制御配列を含む。しかし、酵 母適合性プロモーター、複製起点、および他の制御配列を含むあらゆるベクター が適切である。 当然、多細胞生物由来の真核宿主細胞培養物中で、ポリペブチドをコードして いる遺伝子を発現させることも可能である。例えば、Tissue Culture，1973，Cr uzおよびPatterson編、Academic Pressを参照のこと。有用な宿主細胞株は、ネ ズミ骨髄腫N51；VERO、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS 、C127、Hep G2、SK Hep、バキュロウイルス、および感染昆虫細胞を包含する。 このような細胞のための発 現ベクターは、通常、哺乳動物細胞との適合性を有するプロモーターおよび制御 配列を含む。このようなプロモーターおよび制御配列としては、例えば、シミア ンウイルス40(SV40)由来の一般的に用いられている初期プロモーターおよび後期 プロモーター(Fiersら、Nature，273，113(1978))、他のウイルスプロモーター( ポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス、またはトリ肉腫ウイ ルス由来のプロモーターのような)、あるいは免疫グロブリンプロモーターおよ び熱ショックプロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般 的な局面は、Axelにより、1983年８月16日発行の米国特許第4,399,216号に記載 されている。「エンハンサー」領域は、発現の最適化において重要であることもま た明らかである；これらは、一般的に、プロモーター領域の上流に見いだされる 配列である。必要であれば、複製起点はウイルス供給源から得られ得る。しかし 、染色体への組み込みは、真核生物中でのDNA複製のための共通の機構である。 現在、植物細胞もまた宿主として利用可能であり、そしてノパリンシンターゼプ ロモーターのような植物細胞との適合性を有する制御配列およびポリアデニル化 シグナル配列(Depickerら、J．Mol．Appl．Gen.，1，561(1982))が利用可能であ る。植物細胞の形質転換のための方法およびベクターは、1985年11月７日公開の PCT公開第WO85/04899号に記載されている。 本明細書中でのクローニングおよび発現において有用な宿主株は、以下である ： クローニングおよび配列決定のために、ならびに大多数の細菌のプロモーター の制御下での構築物の発現のために、E．coli株MM294を、E．coli Genetic Stoc k Center GCSC #6135から得た。P_LN_RBSプロモーターの制御下での発現のために 、E．coli株K12 MC1000ラムダ溶原菌、N₇N_53CI857 SusP80（1983年12月２日にブ ダペスト条約の規定により、受諾番号39531号でATCCに寄託されている株）が用 いられ得る。E．coli DG116も用いられ得、これは、1987年４月７日にブダペス ト条約の規定により、受諾番号53606号でATCCに寄託されている。 M13ファージ組換え体のために、E．coli K12株DG98のような、ファージ感染に 感受性のE．coli株が用いられ得る。DG98株は、1984年７月13日にブダペスト条 約の規定により、受諾番号39768号でATCCに寄託されている。 哺乳動物発現は、COS-A2細胞、COS-7、CV-1、ネズミ骨髄腫N51、VERO、HeLa細 胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS、C127、Hep G2、SK Hep、バキ ュロウイルス、および感染昆虫細胞において行われ得る。昆虫細胞に基づく発現 は、Spodoptera frugiperdaにおいて行われ得る。形質転換 用いる宿主細胞に依存して、形質転換が、このような細胞に適切な標準的な技 術を用いて行われる。Cohen、Proc．Nat'l．Acad．Sci．(USA)，69，2110(1972) により記載されるように、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、実質的 な細胞壁障壁を含む原核細胞または他の細胞に対して用いられる。Agrobacteriu m tumefaciensでの感染(Shawら、Gene，23，315(1983))は、特定の植物細胞に対 して用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Grahamら、 Virology，52，546(1987)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。酵母への形質 転換は、Van Solingenら、J．Bact.，130，946(1977)、およびHsiaoら、Proc．N at'l．Acad．Sci．(USA)，76，3829(1979)の方法に従って行われる。ベクター構築 所望のコーディング配列および制御配列を含む適切なベクターの構築には、当 該技術分野で良く理解されている標準の連結手法および制限手法を用いる。単離 されたプラスミド、DNA配列、または合成オリゴヌクレオチドを、切断し、処理 し、そして所望の形態で再連結する。 部位特異的DNA切断を、当該技術分野で一般的に理解される条件下で適切な制 限酵素(または酵素)で処理することにより行う。これらの条件の特定のものは、 これらの市販の制限酵素の製造者に特定されている。例えば、New England Biol absの製品カタログを参照のこと。一般的に、約１μgのプラスミドまたはDNA配 列が、約20μlのバッファー溶液中の１ユニットの酵素により切断される。本明 細書中の実施例では、代表的には、過剰の制限酵素を用いて、DNA基質の完全な 切断を保証する。約37℃で約１時間〜２時間のインキュベーション 時間が実行可能であるが、改変が許容され得る。それぞれのインキュベーション 後、タンパク質をフェノール／クロロホルム抽出(そして次いでエーテル抽出を 行い得る)で除去し、核酸をエタノール沈澱で水性画分から回収した。所望であ れば、切断されたフラグメントのサイズ分離を、ポリアクリルアミドゲル電気泳 動またはアガロースゲル電気泳動により標準の手法を用いて行い得る。サイズ分 離の一般的な記載は、Methods of Enzymology，65,499-560(1980)に見出される 。 合成オリゴヌクレオチドは、Matteucciら、J.Am.Chem.Soc.，103，3185-3191( 1981)のトリエステル法により、または自動化された合成法を用いて調製され得 る。一本鎖のキナーゼ処理を、アニーリングの前または標識のために、過剰(例 えば１nmoleの基質に対して約10ユニット)のポリヌクレオチドキナーゼを用いて 、50mM トリス，pH7.6，10mM MgCl₂，５mM DTT，１〜２mM ATPの存在下で行った 。キナーゼ処理がプローブの標識のためである場合、ATPは高比活性γ-³²Ｐを含 む。 連結を、15〜30μl容量で、以下の標準の条件および温度で行う：20mM トリス 塩酸、pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT，33μg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、10mM 〜50mM NaCl、および40μM ATP、0.01〜0.02(Weiss)ユニットのT4 DNAリガーゼ で０℃(「付着末端」連結用)か、または1mM ATP、0.3〜0.6(Weiss)ユニットのT4 DNAリガーゼで14℃(「平滑末端」連結用)のいずれかで行う。分子間「付着末端 」連結は通常33〜100μg/mlの全DNA濃度(５〜100nMの全最終濃度)で行われる。 分子 間平滑末端連結は(通常10倍〜30倍モル過剰のリンカーを用いる)１μMの全最終 濃度で行われる。 「ベクターフラグメント」を用いるベクター構築では、通常、ベクターフラグ メントを５'リン酸除去し、ベクターの再連結を防止するために細菌のアルカリ ホスファターゼ(BAP)で処理する。BAP切断を、ベクター１μgあたり約１ユニッ トのBAPを用いて60℃で約１時間、Na²⁺およびMg²⁺の存在下、約150mMのトリス中 pH８で行う。核酸フラグメントを回収するために、調製物をフェノール／クロロ ホルムで抽出し、エタノール沈澱させる。あるいは、再連結を、不用のフラグメ ントの付加的な制限酵素切断により２重に切断されたベクター中で防止し得る。DNA配列の改変 配列改変を必要とするcDNAまたはゲノムDNA由来のベクターの一部分について は、部位特異的なプライマーに指示された変異誘発を用いる。この手法は、現在 当該技術分野で標準であり、制限されたミスマッチを除いて変異誘発される一本 鎖ファージDNAに相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、 所望の変異を示す。簡単に述べると、合成オリゴヌクレオチドをファージに相補 的な鎖の直接合成にプライマーとして用いて、そして得られる二本鎖DNAをファ ージを支持(support)する宿主細菌に形質転換する。形質転換された細菌の培養 物をトップアガー中にプレート化し、ファージを 宿す単一細胞からのプラーク形成を可能にする。 理論的には、新しいプラークの50％は、一本鎖として、変異型を有するファー ジを含み得：50％は元の配列を有し得る。キナーゼ処理した合成プライマーと正 確にマッチするハイブリダイゼーションを可能にする温度で、プラークをハイブ リダイズさせるが、その温度では元の鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーショ ンを防止するに充分である。次いでプローブを用いてハイブリダイズするプラー クを釣り上げ、培養し、そしてDNAを回収する。 構築物の確認 プラスミド構築について正しい連結が行われていることを、まずE.coli株MM29 4または他の適切な宿主を連結混合物で形質転換することにより確認した。得ら れた形質転換体を、アンピシリン、テトラサイクリン、または他の抗生物質への 耐性により、あるいはプラスミド構築物の態様に依存する他のマーカーを用いて 当該技術分野で理解されるように選択した。次いで形質転換体由来のプラスミド を、Clewellら、Proc．Nat'l．Acad．Sci．(USA)，62，1159(1969)の方法に従っ て、続いて必要に応じてクロラムフェニコール増幅(Clewel J．Bacteriol，110, 667(1972))で調製した。単離されたDNAを、Messingら、Nucleic Acids Res.，9 ，309(1981)によりさらに記載されるような、Sangerら、Proc．Nat'l．Acad．Sc i．(USA)，74，5463(1977)のジデオキシ法により、またはMaxamら、 Methods in Enzymology，65，499(1980)の方法により、制限分析および/または 配列決定する。 IL-6レセプターアンタゴニストの精製 IL-6レセプターアンタゴニストをE.coliのような細菌中で産生し、続いて精製 し得る。一般的に、例えば、米国特許第4,511,502号；4,620,948号；4,929,700 号；4,530,787号；4,569,790号；4,572,798号；および4,748,234号に示される手 法が用いられる。これらの特許は、本明細書中にその全体が参考として援用され ている。代表的には、異種タンパク質(すなわち、IL-6レセプターアンタゴニス ト)が、細菌中の屈折体(refractile body)中で産生される。このタンパク質を回 収および精製するために、細胞を溶解し、屈折体を遠心分離して細胞残渣から分 離する(培地のイオン強度を低下させ、精製を簡素化することについての米国特 許第4,748,234号を参照のこと)。その後、IL-6レセプターアンタゴニストを含む 屈折体を少なくとも一度変性させ(代表的には、非還元環境中で)、そしてタンパ ク質を酸化して、適切な時間、適切なバッファー溶液中で再生させる。IL-6レセ プターアンタゴニストを、哺乳類細胞由来IL-6レセプターアンタゴニストについ ての上記の方法のような種々のクロマトグラフィー法により、バッファー溶液か ら精製し得る。好ましくは、IL-6レセプターアンタゴニストを、抗IL-6モノクロ ーナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製する。さらに 、米国特 許第4,929,700号示された方法を用い得る。製剤および投与 IL-6レセプターアンタゴニストを、敗血症、および多発性骨髄腫を含むIL-6関 連疾患を治療および予防する治療上有効な濃度で投与する。この目的(goal)を達 成するために、IL-6レセプターアンタゴニストは、好ましくは静脈内注射で投与 される。この投与を達成する方法は当業者に公知である。 患者に投与する前に、製剤成分をIL-6レセプターアンタゴニストに加え得る。 液体製剤が好ましい。例えば、これらの製剤成分には、油類、ポリマー、ビタミ ン、炭水化物、アミノ酸、塩類、バッファー、アルブミン、界面活性剤、または バルク薬剤を包含し得る。好ましくは、炭水化物には、単糖類、二糖類、または 多糖類のような糖または糖アルコール、あるいは水溶性グルカンが包含される。 糖またはグルカンには、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコー ス、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキスト ラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプ ン、ヒドロキシエチルスターチ、およびカルボキシメチルセルロース、またはそ れらの混合物が包含される。スクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は、 -OH基を有するＣ₄からＣ₈の炭水化物として定義され、ガラクチトール、イノシ トール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびア ラビトールが包含される。マンニトールが最も好ましい。上記のこれらの糖また は糖アルコールは、別個にまたは組合せて用いられ得る。糖または糖アルコール は水性調製物中に可溶である限り用いられる量に決まった制限はない。好ましく は、糖または糖アルコールの濃度は、1.0w/v％と7.0w/v％との間、より好ましく は2.0w/v％と6.0w/v％との間である。好ましくは、アミノ酸には、左旋性(L)形 態のカルニチン、アルギニン、およびベタインが包含される；しかし、他のアミ ノ酸が加えられ得る。好ましいポリマーには、平均分子量が2,000と3,000との間 にあるポリビニルピロリドン(PVP)、または平均分子量が3,000と5,000との間に あるポリエチレングリコール(PEG)が包含される。組成物中でバッファーを用い て、凍結乾燥前または再構築後の溶液中のpH変化を最小限に押さえることもまた 好ましい。ほとんどの生理学的なバッファーが用いられ得るが、クエン酸バッフ ァー、リン酸バッファー、コハクバッファー、およびグルタミン酸バッファー、 またはそれらの混合物が好ましい。最も好ましいのはクエン酸バッファーである 。好ましくは、この濃度は0.01M〜0.3Mである。製剤に加え得る界面活性剤は、E P出願第270,799号、および第268,110号に示される。 さらに、IL-6レセプターアンタゴニストはポリマーに共有結合することにより 化学的に修飾され得、例えばその循環半減期を増加する。好ましいポリマー、お よびペプチドにそれらを付着する方法は、米国特許第4,766,106号；4,179,337号 ； 4,495,285号；および4,609,546号に示され、これらは本明細書中にその全体が参 考として援用されている。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオール およびポリエチレングリコール(PEG)である。PEGは室温で水溶性であり、一般式 ：R(O-CH₂-CH₂)_nO-Rを有する。ここで、Rは、水素、またはアルキルまたはアル カノール基のような保護基である。好ましくは、保護基は、１個と８個との間の 炭素を有し、より好ましくはメチルである。記号nは、正の整数であり、好まし くは１と1,000との間であり、より好ましくは、２と500との間である。PEGは好 ましくは、1000と40,000との間、より好ましくは2000と20,000との間、最も好ま しくは3,000と12,000との間の平均分子量を有する。好ましくはPEGは少なくとも １つの水酸基を有し、より好ましくはそれは末端水酸基である。この水酸基が、 好ましくは活性化されてインヒビター上の遊離のアミノ基と反応する。しかし、 反応基のタイプと量は変化し得、共有結合した本発明のPEG/IL-6レセプターアン タゴニストを達成することが理解され得る。 水溶性ポリオキシエチル化ポリオールがまた、本発明において有用である。こ れらには、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、 ポリオキシエチル化グリセロール(POG)などが包含される。POGが好ましい。１つ の理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動 物およびヒト中で、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドで天然に存 在する骨格と同一で あるからである。従って、この分枝は、必ずしも体内では外来因子として見られ るわけではない。POGは、PEGと同じ範囲の好ましい分子量を有する。POGの構造 は、Knaufら、J．Bio．Chem.，263，15064-15070(1988)に示され、POG/IL-2複合 体の考察は米国特許第4,766,106号に見出され、両方とも本明細書中にその全体 を参考として援用している。 液体の薬学的組成物が調製された後、分解を防止し、滅菌状態を保持するため に凍結乾燥することが好ましい。液体組成物の凍結乾燥方法は当業者に公知であ る。使用直前に、この組成物を滅菌希釈液(例えば、リンゲル液、蒸留水、また は滅菌食塩水)で再構成し得、これらはさらに追加の成分を含有し得る。再構成 において、この組成物は、好ましくは当業者に公知のこれらの方法を用いて被験 体に投与される。 罹患個体への投与 上記のように、IL-6レセプターアンタゴニストは、敗血症および多発性骨髄腫 を包含するIL-6関連疾患のヒト患者を治療するのに有用である。一般的に、敗血 症患者は、菌血症に関連する、高熱(38.5℃を超える)または低体温(35.5℃未満) 、低血圧、頻呼吸(20呼吸/分を超える)、頻脈(100拍/分を超える)、白血球増加 症(15,000細胞/mm³を超える)、および血小板減少症(100,000血小板/mm³未満)を 特徴とする。IL-6レセプターアンタゴニストは、患者が敗血症である疑い(フィ ブリノーゲンが20％を超えて低下、またはフィブリン分解産物の出現、 患者の体温上昇、および敗血症に関連する白血球増加症および高血圧の診断)が あるとすぐ投与されるべきである。また上記のように、好ましい経路は、静脈内 投与である、一般的に、IL-6レセプターアンタゴニストは、１μg/kgと20mg/kg との間、より好ましくは20μg/kgと10mg/kgとの間、最も好ましくは、１mg/kgと ７mg/kgとの間で与えられる。好ましくは、ボーラス用量として与えられ、ボー ラス用量後４〜６時間の間循環レベルを10〜20倍増加する。持続注入がまた、ボ ーラス用量後用いられ得る。その場合、IL-6レセプターアンタゴニストは、５μ g/kg/分と20μg/kg/分との間、より好ましくは７μg/kg/分と15μｇ/kg/分との 間の用量で注入され得る。 敗血症を治療するために用いられる場合、IL-6レセプターアンタゴニストは、 敗血症を治療するために有効な他の薬剤と組合せて与えられ得る。例えば、以下 の薬剤を、IL-6レセプターアンタゴニストと組合せて投与し得る：潜伏する細菌 感染を治療し得る抗生物質；細菌の細胞壁成分に対するモノクローナル抗体；敗 血症経路に含まれるサイトカインに複合化され得るレセプター；LFA-1のような 細胞接着分子に対する抗体；および一般的に、敗血症経路中のサイトカインまた は補体タンパク質と相互作用し得、これらの効果を低減し、そして敗血症または 敗血症性ショックを緩和する任意の薬剤またはタンパク質。 IL-6レセプターアンタゴニストはまた、LIF、オンコスタチンM、CNTF、IL-11 を含む他の類似の調節サイトカインと組合 せて投与され得る。 本発明に有用な抗生物質には、以下の一般的なカテゴリーにある抗生物質：β ラクタム環(ペニシリン)、グリコシド結合したアミノ糖(アミノグリコシド)、マ クロ環状ラクトン環(マクロライド環)、ナフタセンカルボキサミドのポリ環状誘 導体(テトラサイクリン)、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド(バ シトラシン、グラミシジン、およびポリミキシン)、共役二重結合系を有する大 きな環(ポリエン)、スルファニルアミド由来のサルファ剤(スルフォンアミド)、 5-ニトロ-2-フラニル基(ニトロフラン)、キノロンカルボン酸(ナリジクス酸)、 および多くの他の薬剤が含有される。他の抗生物質および上記の特定の抗生物質 のより多くの変型が、Encyclopedia of Chemical Technology、第３版、Kirk-Ot hymer(編)、第２巻、782-1036頁(1978)および第３巻、１-78頁、Zinsser、Micro Biology、第17版、Joklikら(編)235-277(1980)、またはDorland's Illustrated Medical Dictionary、第27版、W.B.Saunders Company(1988)中に見出し得る。 IL-6レセプターアンタゴニストとともに投与され得るモノクローナル抗体には 、グラム陰性細菌エンドトキシン遮断性モノクローナル抗体と題するLarrickら のPCT WO88/03211、およびLarrickらの1992年４月30日に出願された米国特許第0 7/876,854号に見出される抗体が含まれる。両出願は、敗血症を治療するために 有用であり、そしてE.coliの細菌細胞壁上の種々の抗原に結合する特異的なモノ クローナル抗体を開示し ている。特に好ましいモノクローナル抗体は、ブタペスト条約の規定に基づいて 1987年５月19日にATCCに寄託されたハイブリドーマにより産生されたモノクロー ナル抗体であり、受託番号は、HB9431である。 IL-6レセプターアンタゴニストと結合し得る他の薬剤には、敗血症経路に含ま れるサイトカインに対するモノクローナル抗体、例えばIL-6またはM-CSFに対す るモノクローナル抗体、(1989年12月15日に出願されたCreaseyらの米国特許出願 第07/451,218号を参照のこと)およびTNFに対するモノクローナル抗体(Ceramiら 、米国特許第4,603,106号を参照のこと)が含まれる。成熟TNFプロホルモンをそ れを産生した細胞から切り出すタンパク質のインヒビター(1989年８月16日に出 願したKrieglerらの米国特許出願第07/395,253号を参照のこと)。1990年５月１ 日に出願されたHaskillらの米国特許出願第07/517,276号に示されるようなIL-1 のアンタゴニスト。1992年３月１６日に出願されたWarrenらの米国特許出願第07 /494,624号に示されるような、インヒビンのようなIL-6サイトカイン発現のイン ヒビター、およびIL-1のような種々のサイトカインのレセプターに基づくインヒ ビター。補体に対する抗体もまた用いられ得る。 一般的に、IL-6レセプターアンタゴニストは、TNF、IL-1、または他のサイト カインによりもたらされる組織因子の過剰制御(up-regulation)のために起こる これらの疾患に有用であり得る。 本発明は、特に有利な実施態様を行う以下の実施例に参考として例示される。 しかし、これらの実施態様は例示であり、いかなるようにも本発明を制限するよ うに解釈されるべきではない。 実施例 材料および方法 抗体およひサイトカイン IL-6特異的なMAbの産生および精製が、以前に詳細に記載されている(Brakenho ffら、(1990)を参照のこと)。これらの実験を通して標準として用いられた野生 型rIL-6調製物は、HGF7プラスミドを保持するE.coliから精製される(Brakenhoff ら、J.Immunol.，139，4116(1987)を参照のこと)。HGF7は、９つのアミノ酸のβ -ガラクトシダーゼ由来のリーダーに続く４つのグリシン、アスパラギン酸残基 、および成熟IL-6のArg₁₇-Met₁₈₅から構成されるIL-6融合タンパク質をコードす る。HGF7の精製は、Brakenhoffら(1990)に以前に記載されている。B9アッセイで 測定された精製rhIL-6 HGF7の比活性は、約10⁹U/mgである。組換えIFN-γは、Ge nentechから得た(San Francisco、Californla)。 細胞株およびベクター 発現ベクター、pUK-IL-6の構築は、Brakenhoffら、1989に記載されている。ベ クターの発現はE.coli DH5α(GIBCO BRL)宿主中で生じた。 実施例１ IL-6変異体の調製 Ａ．IL-6変異体ライブラリーの調製 Trp₁₅₈付近のIL-6領域のランダム変異誘発を行い、IL-6の生物活性に重要であ り得る残基を同定した。ベクター、pUK-IL-6を、Gln₁₅₃-Thr₁₆₃残基でランダム 置換を有するrhIL-6変異体のライブラリー構築に用いた。pUK-IL-6中にサブクロ ーニングするに適切な所望の置換を有する制限フラグメントが、重複伸長PCRに より２ステップで得られた(Hoら、Gene，77，51(1989)を参照のこと)。第一のPC R反応では、pUK-IL-6をテンプレートとして用いた。IL-6中の単一のXbaI部位か らアミノ酸Thr₁₆₃までにわたるフラグメント１を、配列番号１の配列を有する５ 'プライマー(A)(IL-6コーディング領域のヌクレオチド(nts)477-498(Brakenhoff ら、前出、1987を参照のこと))と、配列番号２の配列を有する３'プライマー(B) (Gln₁₅₃-Thr₁₆₃残基に対応するnts 537-570)とを組合せることにより得た。プラ イマーＢにおいて無作為に点在した置換体を得るために、Derbyshireら、Gene， 46，145(1986)の記載の類似のアプローチが用いられた。」３つの他のモノマー と各ヌクレオチドリザーバーとを混入(contaminate)する代わりに、オリゴ合成 機(Applied Biosystems 381A型、Warrington,．UK)の５番目のチャンネルをオリ ゴ合成の間用いた：各合成ステップの間、100mMの野生型ヌクレオチドを含むチ ャンネルと1.25mMのそれぞれ４つのdNTPを含む５番目のチャンネルとの両方を１ ： １の比で混合した。これは34のオリゴ長を有し、オリゴあたり、約36％の単一の 変異、36％の複数の変異、および28％の未変異を生じる。Gln₁₅₃からBanII部位 までにわたるフラグメント２は、プライマーＢと同じ様式で合成された、プライ マーＢに相補的な５'プライマーＣ(配列番号３)(nts 538-571)を用いることによ って得られた。このオリゴは、３'プライマーＤ(配列番号４)(nts 609-629)と組 合わせた。PCRを、製造者(Perkin Elmer Cetus)により特定されるように、10ng のテンプレートDNAおよび100ngの各プライマーを用いることにより、Taqポリメ ラーゼで行った(50℃で２分間アニール、65℃で2.5分間伸長、95℃で1.5分間変 性；30サイクル)。第１のPCR反応後、フラグメント１および２を低融解アガロー スから精製し、そしてそれぞれ約100ngをプライマーＡおよびＤでの第２のPCR反 応でテンプレートとして供した。フェノール/CHCl₃抽出後、第２のPCR生成物をX baIおよびBanIIで消化し、ゲル精製し、そしてXbaI-BanIIで消化したpUK-IL-6中 にサブクローニングした。E.coli DH5αへの形質転換操作に続いて、約1,000個 のコロニーが得られた。DNA操作手順を、Brakenhoffら、1989、およびBrakenhof fら、1990に記載のように行った。選択された変異体のヌクレオチド配列(下記参 照)が、「Sequenase」キット(Unied States Biochemical Corporation，Clevela nd，OH)を用いることにより、dsDNA上のcDNA由来オリゴヌクレオチドプライマー で得られた。 Ｂ．IL-6変異体の調製およびスクリーニング 続いて変異体を、ELISAで部位Iに特異的なMAb(MAb CLB.IL-6/8)へ結合し、か つ部位IIに特異的なMAb(MAb CLB.IL-6/16)へ結合しないことについて選択し、そ してこの表現型を有する変異体をコードするプラスミドのヌクレオチド配列を決 定した。400個のアンピシリン耐性コロニーは、100μlのLC amp培地(最終濃度10 0μg/mlのアンピシリンを添加した、１リットルあたり、10gのバクトトリプトン 、５gの酵母抽出物、８gのNaCl、および２mlのトリスベース)を含む、96ウエル 平底マイクロタィタープレート(NUNC)のウエル中に楊枝で釣り上げられた。37℃ で一晩培養した後、細菌を１mg/mlまでリゾチームを添加して溶解し、さらに37 ℃で30分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.02％Tween-20 、0.2％ゼラチンでの粗抽出物の1/10希釈液の１つを、プラスチックにコーティ ングしたMAb CLB.IL-6/8または16、および検出抗体としてビオチン化ポリクロー ナルヤギ抗rhIL-6を用いたサンドイッチELISAで反応性を直接試験した。結合し たポリクローナル抗rhIL-6を、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体化ストレプト アビジン(Amersham，Amersham UK)で検出した。同様に調製したpUK-IL-6を有す るE.coliの抽出物を陽性コントロールとして用いた。続いてMAb CLB.IL-6/8陽性 /MAb CLB.IL-6/16陰性変異体のうち、Xbal-Banllフラグメントのヌクレオチド配 列を決定した。ELISA手順およびポリクローナル抗体のビオチン化は、Brakenhof fら、1990、前出、およびHelleら、 J.Immunol.Methods，138，47(1991)に詳細に記載されている。 表１に示すように、MAb CLB.IL-6/16のエピトープは、Gln₁₅₅、Asn₁₅₆、Trp_{15 8} 、およびThr₁₆₃の単一の置換により崩壊する。２重置換変異体または３重置換 変異体は、Ala₁₅₄、Leu₁₅₉、Gln₁₆₀、およびMet₁₆₂残基もまた、MAb CLB.IL-6/1 6のエピトープに重要であり得ることを示唆している。 Ｃ．IL-6変異体の生物活性 続いて種々の変異体タンパク質の粗抽出物の生物活性を、B9アッセイおよびCE SS細胞によるIgG1産生の両方で測定した。B9アッセイは、Aardenら、Eur.J.Immu nol.，17，1411(1987)およびHelleら、Eur.J.Immunol.，18，1535(1988)に記載 されるようにrhIL-6および変異体のネズミハイブリドーマ成長因子活性を測定す る。CESSアッセイは、rhIL-6変異体のＢ細胞刺激因子２の活性を、基本的にはPo upartら、EMBO J.，6，1219(1987)に記載されているように測定した。簡単に述 べると、CESS細胞(96ウエル平底マイクロタイタープレート内の、IMDM-５％ FC S-Trf中での６×10³細胞/200μlウエル)を、rhIL-6またはrhIL-6変異体含有サン プルの系列希釈液と３重測定で、４日間インキュベートした。この細胞によるIL -6誘導IgG1産生を、ヒトIgG1に特異的なマウスMAb(MH161-1M、Department of Im mune Reagents，Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Tra nsfusion Service(CLB)，Amsterdam，The Netherlands)を、西洋ワサビペルオキ シダーゼ複合体化ヒトIgG特異的ネズミMAb(MH16-1 ME，CLB)と組み合わせて用い 、ヒト血清を標準(HOO-1234，CLB)として用いることにより、サンドイッチELISA で測定した。ELISA手順は上記のようであった。 MAb CLB.IL-6/8陽性/MAb CLB.IL-6/16陰性変異体の生物活性を測定するために 、変異体構築物を有するE.coli DH5αの一晩培養物を250mlのLC amp培地で１:50 に希釈し、そして続 いてOD550が1.5となるまで培養した。細菌を遠心分離により採取し、５mlの溶解 バッファー(PBS、１％ Tween-20、10mM EDTA、２mM PMSF)中に再懸濁し、そして 超音波により溶解した。続いてrhIL-6を含む封入体を溶解するために、SDSを１ ％まで加えた。室温で１時間インキュベーション後、SDS不溶性物質を遠心分離 で除去した(13,000gで15分間)。 このSDS可溶化物質の生物活性を、1/1000希釈から始めてB9アッセイおよびCES Sアッセイで直接測定した。これらの調製物のIL-6変異体濃度を、0.1％のSDSの 存在下で、Sepharose４Ｂ(Pharmacia LKB)に結合したIL-6特異的MAb CLB.IL-6/7 と¹²⁵I-rhIL-6 HGF7とを用いて、競合阻害ラジオイムノアッセイ(RIA)により測 定した。標準として、未標識のrhIL-6 HGF7を用いた。MAb CLB.IL-6/7は、熱変 性およびSDS変性したIL-6に結合し、そしてpepscan分析(Fontaineら、Gene，104 ，227(1991)、およびArconeら、FEBS Letters，288，197(1991)を参照のこと)に より測定されるように、IL-6のTh₁₄₃-Ala₁₄₆残基を認識する。 表１に示すように、変異体は全て、ネズミB9ハイブリドーマ増殖アッセイで生 物学的に活性であった。しかし、B9アッセイでは非常に活性であるが、ヒトCESS 細胞においてrhIL-6Thr₁₆₃Pro(rhIL-6 T₁₅₃P)単一変異体調製物およびrhIL-6 Gl n₁₆₀Glu、Thr₁₆₃Pro(rhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃P)２重変異体調製物について活性は検出 されなかった。（タンパク質に続く用語X_nYは、残基nでのアミノ酸Xがアミノ酸Y に置換されていること を意味し、ここで、XおよびYは、通常、天然に存在するアミノ酸についての３文 字省略または１文字省略を用いる。） Ｄ．２つのIL-6変異体の発現および精製 上記のB9アッセイでは活性であり、CESSアッセイでは不活性である２つの変異 体の役割を確認するため、ベクターpUK-IL-6 T₁₆₃PおよびpUK-IL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃P 由来のIL-6 cDNA挿入物をNcoIおよびBamHIで切り出し、そしてNcoI-BamHIで消化 したpET8c中にサブクローニングした。プラスミドDNAを、pET8c構築物を有するE .coli DH5αから調製し、そしてE.coli BL21(DE3)に形質転換した。続いて、こ れらの発現プラスミドを有するE.coli BL21(DE3)をLC amp培地中でOD550が0.6に なるまで培養し、そして発現を0.5mM IPTG(Sigma)の添加により誘導した。３時 間の誘導期間の後、この細菌を遠心分離により採取し、そしてIL-6変異体を、基 本的にはArconeら、Eur.J.Biochem.，198，541(1991)の記載にいくらか改変を加 えて精製した。簡単に述べると、遠心分離の後、細菌を培養容量の1/20の10mM トリス-HCl pH7.4、２mM PMSFに再懸濁し、-20℃で凍結した。融解後、細菌を超 音波により溶解した。次いで超音波溶解物を、スクロース緩衝剤(40％スクロー ス、10mMトリス-HCl pH7.4)に加え、47,000gで１時間遠心分離した。次にペレッ トの封入体を、PBS、 0.5％Tween-20、10mM EDTA、２mM PMSFで一度洗浄し、６M グアニジン-HCl、25mM トリス塩酸、pH7.4(0.4g湿重量/リットル)に溶解した。 20容量の25 mMトリス-HCl pH8.5に対して２回透析した後、凝集物を11,000gで１時間遠心分 離することにより除去し、そしてAmicon YM10 Filtration unit(Amicon Corp.， Danvers，MA)で透析物を30倍に濃縮した。次いで濃度物をFPLC(Pharmacia LKB) に装備したfast Q Sepharose 陰イオン交換カラムに直接加えた。続いて、結合 したrhIL-6変異体を25mM トリス-HCl pH8.5中のNaClの直線濃度勾配で溶出し、 約l00mMのNaClで溶出された。続いて、変異体を滅菌濾過し、-70℃で保存した。 タンパク質濃度を、調製物の吸光度の測定、およびBSAを標準として用いるBradf ord法(Anal.Biochem.，72，248(1976))の両方により測定した。IL-6の10mg/ml溶 液のOD₂₈₀を10と仮定すると、BradfordとOD₂₈₀とは最も良く相関した。 図１は、変異体調製物のクマシーブルー染色SDS-ポリアクリルアミドゲルを示 す。変異体は成熟rhIL-6とほぼ同じ分子量に移動した。最終精製ステップ後、rh IL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃P調製物中に２つのバンドが観察された。 ウエスタンブロッテ ィング後、両バンドはIL-6に特異的なMAbに認識され、下方バンドは上方バンド の分解生成物であることが示唆される（データは示さず）。 Ｅ．２つのIL-6変異体の生物活性 これらの２つの変異体の生物活性を、CESSアッセイおよびIL-6についての２つ の他の利用可能なバイオアッセイ（HepG2アッセイおよびXG-1アッセイ）の両方 で試験した。 HepG2アッセイは、Zurawら、Ｊ.Immunol.，265，12664(1990)により記載され たような、HepG2細胞によるClエステラーゼインヒビター(C1 inh.)生成の誘導を 介してrhIL-6変異体の肝細胞刺激活性を測定する。コンフルエント（５％FCS、 ５×10-⁵Mの2-ME、ペニシリン(100 IU)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、およ びヒトトランスフェリン(20μg/ml；Behringwerke、Marburg、Germany)を添加し たIscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM)(IMDM-5% FCS-Trf)中で、0.5mlウエル(Cos ter)中に５×10⁵細胞)にまで培養した後、HepG2細胞を２回洗浄し、そして２組 で、rhIL-6またはrhIL-6変異体の系列希釈液で、同じ培地中で48時間刺激した。 いくつかの実験では、細胞を24時間後再び洗浄し、刺激を24時間繰り返した。こ の手順の結果、高刺激率を生じた。インキュベーション期間後、続いてC1 inh. 合成を、Sepharose4Bに結合した抗C1 inh．MAb RIIと¹²⁵I標識ヒツジポリクロー ナル抗C1 inh．IgGとを用いて、正常ヒト血漿を標準として、Nuijensら、Ｊ.Cli n.Invest.，84,443(1989)およびElderingら、J.Biol.Chem.，263，11776(1988) に記載のように、サンドイッチRIAにより測定した。 XG-1アッセイは、基本的にはJourdanら、J．Immunol.，147,4402(1991)に記載 されるように、ヒト骨髄腫細胞株XG-1でのIL-6活性を測定する。簡単に述べると 、細胞を２回洗浄し、IMDM-５％ FCS-Trf中37℃で４時間インキュベートし、そ して再び洗浄した。続いて、96ウエル平底マイクロタイタープレート中の、200 μlのIMDM-５％ FCS-Trf中、10⁴細胞/ウエルを rhIL-6またはrhIL-6変異体の系列希釈液と３組で３日間インキュベートした。こ の培養期間の後、7.4 kBqの[³H] チミジン(74 Gbq/mmol)で４時間細胞を標識し 、核に取り込まれた放射活性をカウントすることにより、細胞増殖を測定した。 図２ａ〜ｃは、ヒト細胞株を用いる３つの異なるアッセイでの変異体の代表的 な用量反応曲線を示す。表２では、ヒトアッセイでの変異体の比活性が、（ネズ ミ）B9アッセイでの比活性とともに野生型rhIL-6 HGF7の比活性と比較して示さ れている。図２aでの実験では、精製したrhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃Pの２重変異体もま たCESS細胞によるIgG1合成を誘導しなかったことが示される。しかし、いくつか の実験では（例えば、図３ａを参照のこと）、バックグラウンドのIgG1産生の少 しの増加が観察された。図２bに示すように、急性期タンパク質C1エステラーゼ インヒビター(C1 inh.)の弱い誘導が、高濃度の変異体で再現性良く観察された が、このプラトーレベルは野生型rhIL-6 HGF7に比較して非常に低かった。しか し、ヒト骨髄腫細胞株XG-1の増殖の誘導(Jourdanら、前出、および図２cを参照 のこと)における２重変異体の比活性は野生型IL-6に比較して約1,000倍低減した が、ほとんど同じプラトーレベルに達した。B9細胞では、rhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃Pの 比活性は10倍低減したに過ぎない（表２）。rhIL-6 T₁₆₃Pは、全てのアッセイに おいて２重変異体よりさらに活性であり、CESSアッセイおよびHepG2アッセイに おいてプラトーが低減した。XG-1細胞におけるrhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃P変異体の活性 は、MAb CLB.IL-6/8により阻 害され得るが、MAb CLB.IL-6/16には阻害され得ないため、それは野生型rhIL-6 による混入によるものではなかった（データは示さず）。 Ｆ．２つのIL-6変異体のIL-6レセプターアンタゴニスト活性 これらの変異体のこの細胞株における野生型rhIL-6 HGF7の活性を拮抗する能 力について試験した。図３aおよびbに、rhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃Pが、CESS細胞および HepG2細胞における野生型IL-6活性を完全に阻害したことが示される。これらの 実験では、CESSアッセイおよびHepG2アッセイでのIL-6活性の50％阻害は、これ は、rhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃Pのそれぞれ約50ng/mlおよび１μg/mlで観察された。細 胞に刺激を与えるために用い たrhIL-6 HGF7の20倍および200倍の濃度に対応する。100％阻害は、２点変異体 が野生型よりそれぞれ1,000倍および3,600倍過剰に用いられる場合に観察された 。XG-1細胞では、阻害効果は観察されなかった。rhIL-6 T₁₆₃Pの拮抗活性は検出 され得なかった（データは示さず）。図４は、HepG2アッセイでのIL-6活性にお けるrhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃Pの阻害効果が高濃度のrhIL-6 HGF7により逆転され得た ことを示し、このことは、rhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃PによるIL-6レセプター結合の競合 阻害を示唆する。同様の結果が、CESS細胞で見出された（データは示さず）。 HepG2細胞は、IL-6およびIFN-γの両方に応答して、別個のメカニズムを介し てC1 inh.を合成し得る（Zurawら、前出を参照のこと）。２重変異体による阻害 の特異性をさらに示すために、rhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃PがHepG2細胞によるIFN-γ誘 導性C1 inh.合成を阻害し得るかどうかを試験した。図５に示すように、５ng/ml のrhIL-6 HGF7により誘導されるC1エステラーゼインヒビター合成は、バックグ ラウンドレベルにまで阻害されたが、１ng/mlのIFN-γにより誘導されるC1 inh. 合成は、損なわれなかった。 Ｇ．２つのIL-6変異体のIL-6R結合 rhIL-6 Q₁₆₀E,T₁₆₃Pが、さらに部位Iの特異的なMAb CLB.ＩL-6/8により認識さ れ得、そしてCESS細胞およびHepG2細胞で野生型IL-6活性を拮抗し得たという事 実により、80kDa結合部 位は完全なままであることが示唆された。この仮説を検討するために、80kDa IL -6レセプター(Rose-Johnら、Ｊ.Biol.Chem.，266，3841(1991))をコードしてい る発現ベクターでトランスフェクトされたNIH-3T3線維芽細胞へのこの変異体の 結合を、競合阻害アッセイでの野生型rhIL-6の結合と比較した。図７は、２重変 異体では、細胞への¹²⁵I-rhIL-6の結合の阻害においてrhIL-6 HGF7より効果が約 ４倍低かったことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ Ｃ０７Ｋ 14/54 ＡＤＶ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＡＤＵ // Ｃ１２Ｎ 1/21 9051−4Ｃ ＡＢＧ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｈ Ｕ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 ブレイケンホフ，ジャスト ピージェイ. オランダ国 エヌエル―1053 エーダブリ ュー アムステルダム，ウェンズラウアー ストラート 35 エイチエス (72)発明者 アーデン，ルシエン エイ. オランダ国 エヌエル―1151 シーブイ ブローク イン ウォーターランド，ノー アメーアウェグ 10

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１５９位で置換されたアミノ酸がバリンではなく、１６２位で置換された アミノ酸がアラニンではない条件下で、成熟IL-6タンパク質の１５４位〜１６３ 位に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とす るIL-6タンパク質を含有する、インターロイキン６(IL-6)レセプターアンタゴニ ストであって、ここで該アミノ酸置換は、該IL-6レセプターアンタゴニストをIL -6レセプター(IL-6R)に結合させてIL-6/IL-6R複合体を形成させるが、該複合体 がシグナルの変換に関与するのを阻害する、IL-6レセプターアンタゴニスト。 ２．前記１６３位のアミノ酸がプロリンである、請求項１に記載のIL-6レセプ ターアンタゴニスト。 ３．前記１６０位のアミノ酸がグルタミン酸である、請求項１に記載のIL-6レ セプターアンタゴニスト。 ４．前記１６３位のアミノ酸がプロリンであり、そして前記１６０位のアミノ 酸がグルタミン酸である、請求項１に記載のIL-6レセプターアンタゴニスト。 ５．Thr₁₆₃からPro₁₆₃への置換およびGln₁₆₀からGlu₁₆₀への置換からなる群よ り選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することを特徴とする、イ ンターロイキン６(IL-6)タンパク質。 ６．アミノ酸置換、Thr₁₆₃からPro₁₆₃への置換を有するこ とを特徴とする、請求項５に記載のIL-6タンパク質。 ７．アミノ酸置換、Gln₁₆₀からGlu₁₆₀への置換を有することを特徴とする、請 求項５に記載のIL-6タンパク質。 ８．２つのアミノ酸置換、Thr₁₆₃からPro₁₆₃への置換およびGln₁₆₀からGlu₁₆₀ への置換を有することを特徴とする、請求項５に記載のIL-6タンパク質。 ９．請求項１に記載のIL-6レセプターアンタゴニストおよび薬学的に受容可能 なキャリアを含有する薬学的組成物。 １０．前記IL-6レセプターアンタゴニストが請求項２に記載のIL-6レセプター アンタゴニストである、請求項９に記載の薬学的組成物。 １１．前記IL-6レセプターアンタゴニストが請求項３に記載のIL-6レセプター アンタゴニストである、請求項９に記載の薬学的組成物。 １２．前記IL-6レセプターアンタゴニストが請求項４に記載のIL-6レセプター アンタゴニストである、請求項９に記載の薬学的組成物。 １３．前記IL-6レセプターアンタゴニストが請求項６に記載のIL-6タンパク質 である、請求項９に記載の薬学的組成物。 １４．前記IL-6レセプターアンタゴニストが請求項７に記載のIL-6レセプター アンタゴニストである、請求項９に記載の薬学的組成物。 １５．前記IL-6レセプターアンタゴニストが請求項８に記載のIL-6レセプター アンタゴニストである、請求項９に記載 の薬学的組成物。 １６．インターロイキン６(IL-6)関連疾患の治療方法であって、該IL-6関連疾 患を治療するに有効である量の請求項１に記載のIL-6レセプターアンタゴニスト および薬学的に受容可能なキャリアを含有する薬学的組成物を、このような治療 を必要としている患者に投与することを包含する、治療方法。 １７．前記IL-6レセプターアンタゴニストが、請求項２に記載のIL-6レセプタ ーアンタゴニストである、請求項１６に記載の方法。 １８．前記IL-6レセプターアンタゴニストが、請求項３に記載のIL-6レセプタ ーアンタゴニストである、請求項１６に記載の方法。 １９．前記IL-6レセプターアンタゴニストが、請求項４に記載のIL-6レセプタ ーアンタゴニストである、請求項１６に記載の方法。 ２０．前記IL-6レセプターアンタゴニストが、請求項６に記載のIL-6レセプタ ーアンタゴニストである、請求項１６に記載の方法。 ２１．前記IL-6レセプターアンタゴニストが、請求項７に記載のIL-6レセプタ ーアンタゴニストである、請求項１６に記載の方法。 ２２．前記IL-6レセプターアンタゴニストが、請求項８に記載のIL-6レセプタ ーアンタゴニストである、請求項１６に記載の方法。 ２３．前記IL-6関連疾患が敗血症である、請求項１６に記載の方法。 ２４．前記IL-6関連疾患が多発性骨髄腫である、請求項１６に記載の方法。