JPH09504111A

JPH09504111A - Ｇａｌ４−受容体構築体の新規な使用

Info

Publication number: JPH09504111A
Application number: JP7518075A
Authority: JP
Inventors: エム．エバンズ，ロナルド; ウメソノ，カズヒコ; ブラムバーグ，ブルース; エヌ．ランガラジャン，プンディ
Original assignee: ザソールクインスチチュートフォアバイオロジカルスタディズ
Priority date: 1993-12-30
Filing date: 1994-12-29
Publication date: 1997-04-22
Also published as: AU5837496A; EP0737314A1; EP0737314A4; EP0743520A2; AU700646B2; WO1995018380A1; CA2182908A1; EP0743520A3; CA2180271A1; AU1436695A; JPH09275988A

Abstract

(57)【要約】本発明によれば，酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが導入されたステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバーの少なくともリガンド結合部位からなるキメラ受容体が機能性ホモダイマーを形成できることが発見された．このようなホモダイマーは，たとえばステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリー受容体のオーファンメンバーのリガンドを決定するためのアッセイ，共通のリガンドに応答する複数個の受容体の中から特定のステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物の同定等に有用である．

Description

【発明の詳細な説明】ＧＡＬ４- 受容体構築体の新規な使用謝辞本発明は米国立衛生研究所によって付与された助成金ＨＤ27183 号による政府援助によって行われた．政府は本発明に一定の権利を有する．発明の分野本発明は細胞内受容体およびそれらのリガンドに関する．特定の態様においては，本発明は細胞内受容体に対するリガンド（またはリガンド前駆体）として機能する化合物の同定方法に関する．他の態様においては，本発明は１つの共通のリガンドに応答する複数個の受容体の中から特定の受容体タンパク質に選択的な化合物を同定する方法に関する．さらに別の態様においては，本発明は新規なキメラ細胞内受容体およびそれらの使用に関する．発明の背景真核生物の分子生物学における中心的な課題は，依然として特定の遺伝子制御を誘発する分子および機構の解明である．この課題への科学的な取り組みの一部として，多くの研究が特定の遺伝子制御を誘発できるリガンド（すなわち外因性誘導因子）を同定する努力に向けられてきた．遺伝子制御の細目については，多くがなお今後の研究に待たねばならないが，リガンドが細胞内受容体およびホルモンレスポンスエレメント（ＨＲＥ）として知られている部分的ＤＮＡ配列を包含する細胞内成分と共同して働くことにより遺伝子転写を修飾していることは知られている．ステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリー受容体のメンバーがさらに同定されるに従い，このような新たに発見された受容体に対する外因性の誘導因子［すなわち，天然に存在する（または合成の）誘導因子］の探索が，遺伝子制御の細目を突き止める努力の重要な部分となってきたのである．細胞内受容体と直接または間接的に相互作用し，それによってホルモン応答性遺伝子の転写に影響する化合物が同定されれば，たとえば，治療的応用に重大な価値が考えられる．更なる新規な細胞内受容体（すなわち，ステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリー受容体のメンバー）の同定が続いている．しかしながら，これらの新規な受容体に対する一次リガンドは，容易には同定できない場合が多い．したがって，このような受容体に対するリガンドの迅速な同定方法があれば，大いに価値がある．リガンドが同定されている細胞内受容体の中には，１つの共通のリガンドに応答する受容体がいくつかある［たとえば，レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）とレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）はいずれもレチノイン酸の存在に応答し，グルココルチコイド受容体（ＧＲ）と鉱質コルチコイド受容体（ＭＲ）はともにグルココルチコイド等の存在に応答するなど］．１つの共通のリガンドに応答するすべての受容体サブタイプではなく，その１つのみによって誘導される過程を修飾するため，単一のサブタイプに選択的なリガンドを発見する努力に多大な労力が注がれてきた．しかしながら，数種の異なる受容体サブタイプに対する単一リガンドの作用間の差を識別することは難しい．したがって，単一のサブタイプに選択的な化合物の同定方法があれば，これもきわめて有用である．最近，一部の細胞内受容体はステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリー受容体の他のメンバーと会合した場合（すなわち，ヘテロダイマーとして）にのみ転写制御に機能することが発見された．しかしながら，特定の受容体によって影響される生理学的過程が明らかにされるまでは，オーファン受容体がホモダイマーとして機能するのかまたはパートナーを必要とする（機能性ヘテロダイマーを形成できるように）のかを決定することは不可能である．したがってオーファン受容体（すなわち，リガンドがまだ同定されていない受容体）の特性解明を，そのオーファン受容体が機能性受容体の生成にパートナーを必要とするかどうかを決定することなく単純化できる手段があれば，それもきわめて有用である．本発明の理解および実施に役立つ他の情報は，共通して譲渡された米国特許第 5,071,773 号および4,981,784 号，ならびに1989年 3月17日付出願の米国特許出願第325,240 号，1989年6 月22日付出願の第370,407 号および1989年11月16日付出願の第438,757 号に見出すことができる．それらはすべて，引用により，その全体が本明細書に導入される．発明の簡単な説明本発明によれば，本発明者らは，ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバーの内部に酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが組込まれてなるキメラ受容体が機能性ホモダイマーを形成できることを発見した．このようなホモダイマーは，たとえば，ステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリー受容体のオーファンメンバーに対するリガンドを決定するためのアッセイにおいて，１つの共通リガンドに応答する複数個の受容体の中から特定のステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物を同定するためなどに有用である．このようなアッセイは，適当なリガンドの存在によって誘発される応答系がアッセイに使用される細胞に対して内因性ではないことから，広い動的範囲ときわめて低いバックグラウンドシグナルを示す．応答は，試験細胞中に存在する可能性がある内因性受容体からの競合はなく，本発明のキメラ受容体が活性化される場合にのみ得られる．本発明の他の実施態様によれば，細胞内受容体に対するリガンドもしくはリガンド前駆体に変換可能な化合物，または非−リガンド活性化経路を介して受容体を誘導できる他の化合物の同定方法が提供される．本発明のさらに他の実施態様によれば，適当な前駆体化合物を細胞内受容体に対するリガンド（または非−リガンド活性化経路を介して受容体を誘導できる他の化合物）に変換できる化合物（たとえば酵素）の同定方法が提供される．本発明のさらに他の実施態様によれば，上述の変換を促進することができる細胞系（またはその活性分画）の同定方法が提供される．図面の簡単な説明図１はＧＡＬ４−受容体融合タンパク質の調製に使用されるベクターｐＣＭＸ −ＧＡＬ４のＧＡＬ４コード部分の制限地図である．図２は配列番号：４に記載するリンカーの制限地図である．図３は，全トランスレチノイン酸の存在下における各種ｈＲＡＲα構築体の用量反応曲線である．図中，◇は非修飾ｈＲＡＲα，◆はキメラ受容体ＧＲＲ（すなわち，アミノ末端ドメインはグルココルチコイド受容体に由来し，ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインはＲＡＲに由来するキメラ受容体），□はキメラ受容体ＧＧＲ（すなわち，アミノ末端ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインはＧＲに由来し，リガンド結合ドメインはＲＡＲに由来するキメラ受容体），■はＧＡＬ４− ｈＲＡＲαを表す．発明の詳細な説明本発明によれば，ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのオーファンメンバーに対するリガンドまたはリガンド前駆体を決定する方法において，上記オーファンメンバーの修飾型を含有する細胞をそのオーファンメンバーに対する推定リガンドと接触させ（この場合，上記オーファンメンバーの上記修飾型はＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを上記オーファンメンバー内に導入することにより作成され，また上記細胞はレポーター遺伝子に操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する），ついでレポーター遺伝子産物の発現をモニターする，ことからなる方法が提供される．本発明の実施に際して使用される修飾受容体には所望により，１または２以上の外因性トランスアクティベーションドメイン，たとえば米国特許第5,217,867 号に記載されているτ₁またはτ₂トランスアクティベーションドメインを含有させてもよい．この米国特許は引用によりその全体が本明細書に導入される．本発明のアッセイ法は，上記オーファン受容体に対するレスポンスエレメントがまだ同定されていない場合および／またはインビボにおいてホモダイマーもしくはヘテロダイマーとして機能する上記受容体の能力が未知な場合，とくに有用である．すなわち，本発明の他の実施態様では，ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質をホモダイマー形成可能にする方法において，上記受容体タンパク質にＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを導入することからなる方法が提供される．本明細書中で使用される「ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバー（すなわち，細胞内受容体）に対するリガンドまたはリガンド前駆体」の語は，（その非修飾型においてまたはその「活性」型への変換後）細胞の内部で受容体タンパク質に結合し，それによってリガンド／受容体複合体を創製し，その結果適切なホルモンレスポンスエレメントを活性化することができる物質または化合物を意味する．リガンドはしたがって，ホルモンレスポンスエレメントの制御下に維持される遺伝子の遺伝子転写を修飾する働きがある化合物であり，ホルモン，増殖物質，増殖を調節する非ホルモン物質等が包含される．リガンドにはステロイドまたはステロイド様ホルモン，レチノイド，甲状腺ホルモン，医薬的に活性な化合物等が包含される．個々のリガンドは多数の受容体に結合する能力をもつ場合がある．したがって，本明細書中で使用される「推定リガンド」の語は，関心のあるオーファン受容体に結合してこのようなオーファン受容体によって認識されるレスポンスエレメントの制御下に維持される遺伝子の転写を修飾する能力をもつことが想定される化合物，たとえばステロイドまたはステロイド様ホルモン，医薬的に活性な化合物等を意味する．既知のリガンドの例としては，全トランスレチノイン酸（レチノイン酸受容体に対するリガンド），9-シス- レチノイン酸（レチノイドＸ受容体に対するリガンド），デキサメサゾン（グルココルチコイド受容体に対するリガンド），甲状腺ホルモン（甲状腺ホルモン受容体に対するリガンド），1,25- ジヒドロキシビタミンＤ₃（ビタミンＤ₃受容体に対するリガンド）等がある．既知のリガンド前駆体の例には，全トランスレチノイン酸（これは9- シス-レチノイン酸に変換できる），25- ヒドロキシビタミンＤ₃（1,25- ジヒドロキシビタミンＤ₃に変換できる），β- カロテン，生物活性脂質（たとえば，リノール酸またはアラキドン酸のような脂肪酸）等が包含される．本明細書中で使用される「ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバー」（「核受容体」または「細胞内受容体」としても知られる）の語は，リガンド依存性転写因子として働くホルモン結合タンパク質を意味する．特異的なリガンドがまだ同定されていないステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバーは本明細書においては「オーファン受容体」と呼ばれる．これらのホルモン結合タンパク質は特定のＤＮＡ配列に結合する固有の能力をもっている．結合後，リガンド／オーファン受容体複合体は，標的遺伝子（すなわち，特定のＤＮＡ配列と会合する遺伝子）の転写活性を調整する機能を果たすことになる．受容体「サブタイプ」および受容体「クラス」の語を区別しておくことは有用である．たとえば，レチノイド応答性受容体は，すべてがレチノイド化合物に応答性である受容体の「クラス」を構成する．同様に，甲状腺ホルモン受容体は甲状腺ホルモンに応答性の受容体の「クラス」を構成する．各クラスは多様なサブタイプ，すなわち異なる組織分布，ネイティブリガンドに対する異なる親和性，ネイティブリガンドと接触した場合の活性化の異なる性質などを有するクラスの特定のメンバーに分割できる．受容体の一部のクラスは，明らかに異なるタイプの受容体のサブファミリーを包含する．すなわち，たとえばレチノイドクラスの受容体はレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の両者を包含するが，これらの２つの異なるサブファミリーには明瞭な差異がある．たとえば，ＲＡＲサブファミリーの各メンバーは特定の第一のホルモンレスポンスエレメント（ＨＲＥ）に応答し，またＲＸＲサブファミリーの各メンバーは特定の第二のＨＲＥ（第一のＨＲＥとは明瞭に異なる）に応答する．したがって，本発明の一態様によれば，１つの共通リガンドに応答する複数個の受容体（すなわち，同一サブファミリーの異なるサブタイプ，または同一クラスのメンバーであるがサブファミリーは異なる）の中から特定のステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物を同定する方法において，ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを上記複数個の受容体タンパク質それぞれの内部に導入して，複数個の修飾受容体タンパク質を生成させ，上記修飾受容体タンパク質の一つを含有する細胞を上記修飾受容体タンパク質に対する推定選択的リガンドと接触させ（この場合，上記細胞はレポーター遺伝子と操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する），レポーター遺伝子産物の発現をモニターし，ついで，上記複数個の修飾受容体タンパク質のすべてのメンバーについて個々に上記接触が行われるまで，他の修飾受容体タンパク質との上記接触およびモニター工程を反復し，その後，１つの共通リガンドに対して応答する上記複数個の受容体の中から１つの特定のステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物を同定する，ことからなる方法が提供される．１つの共通リガンドに応答する受容体は多数あり，したがって上記の方法によって検討される複数個の受容体は１つの共通リガンドに応答する受容体の多重サブタイプ，たとえばＲＡＲの各種サブタイプおよび／またはＲＸＲの各種サブタイプ，ＰＰＡＲの各種サブタイプ，ＣＯＵＰの各種サブタイプ等から選択することができる．このような化合物は，たとえばステロイドまたはステロイド様ホルモン応答性の疾患状態の処置に有用である．本明細書において用いられる「ステロイドまたはステロイド様ホルモン応答性疾患状態」の表現は，（ｉ）通常ステロイドまたはステロイド様ホルモンの発現制御には支配されない遺伝子産物（または遺伝子産物の部分）が，転座により，ステロイドまたはステロイド様ホルモン応答性配列の制御下に置かれている疾患状態，または（ii）第一のステロイドまたはステロイド様ホルモンによるステロイドまたはステロイド様ホルモンの発現制御に支配されている第一の遺伝子産物（または遺伝子産物の部分）が転座により，第二のステロイドまたはステロイド様ホルモン応答性配列の制御下に置かれている疾患状態，または（iii）通常ステロイドまたはステロイド様ホルモンの発現制御に支配されている遺伝子産物（または遺伝子産物の部分）の異常遺伝子産物の発現に関連する疾患状態，または（iv）通常その発現がステロイドまたはステロイド様ホルモンの発現制御下に維持されている遺伝子産物の異常レベルの発現に関連する疾患状態，または（ｖ）通常その存在がステロイドまたはステロイド様ホルモンの発現制御下に維持されている受容体の異常レベルに関連する疾患状態，または（vi）通常その存在がステロイドまたはステロイド様ホルモンの発現制御下に維持されているリガンドの異常レベルに関連する疾患状態を意味する．本明細書中で使用される「１つの共通リガンドに応答する複数個の受容体の中からの特定のステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物」の表現は上記ステロイドまたはステロイド様ホルモン応答性疾患状態に関連する受容体サブタイプと，同一の受容体クラスの他のサブタイプもしくはサブファミリーとよりも有意に高度に相互作用する化合物，すなわち，その転写活性化性の調整において１つの受容体サブタイプ（またはサブファミリー）に対して優先的選択性をもつ化合物を意味する．リガンドと特異的受容体サブタイプ（またはサブファミリー）の間の相互作用に適用される「有意に高度」の用語は，標的疾患状態の処置において，同一の受容体クラスの他のサブタイプ（またはサブファミリー）によって誘導される経路の活性化の場合よりも有意に高い治療係数（すなわち効力対毒性比）を有するリガンドを意味する．治療化合物の毒性は，所望の受容体サブタイプ（またはサブファミリー）以外の受容体サブタイプ（またはサブファミリー）と治療化合物の非選択的相互作用によって起こる場合が多い．したがって，本発明は，ホルモン治療に通常伴う副反応の発生を劇的に減少させる手段を提供するものである．ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのすべてのメンバーのＤＮＡ結合ドメインは類似し，66〜68個のアミノ酸残基からなり，９個のシステインを包含する約20個の不変アミノ酸残基を有する．スーパーファミリーのメンバーは，ヒトグルココルチコイド受容体（アミノ酸 421 〜486 ），エストロジェン受容体（アミノ酸185 〜250 ），鉱質コルチコイド受容体（アミノ酸603 〜668 ），ヒトレチノイン酸受容体α１（アミノ酸88〜 153 ）のような既知ステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインの部分である上記不変アミノ酸残基を含むタンパク質として同定することができる．スーパーファミリーメンバーのＤＮＡ結合ドメインの高度に保存されたアミノ酸は以下の通りである．（式中，ＸはＤＮＡ結合ドメイン内の非保存アミノ酸を示し，星印を付したアミノ酸残基はほぼ普遍的に保存されているが，同定されたホルモン受容体の一部にその変異が見いだされている残基であり，またカッコで囲んだ残基は任意残基である（したがって，ＤＮＡ結合ドメインは最小で66アミノ酸長であるが，数個の付加的残基を含有することもできる）．ステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーの受容体の典型的メンバーには，グルココルチコイド受容体，鉱質コルチコイド受容体，プロゲステロン受容体，アンドロゲン受容体，ビタミンＤ₃受容体等のステロイド受容体，それに加えてＲＡＲα，ＲＡＲβ，ＲＡＲγ等，さらにＲＸＲα，ＲＸＲβ，ＲＸＲγ等のようなレチノイド受容体，ＴＲα，ＴＲβ等のような甲状腺ホルモン受容体，ならびにそれらの構造および性質によって，上に定義されたスーパーファミリーのメンバーと考えられる他の遺伝子産物が包含される．オーファン受容体の例にはＨＮＦ４［たとえば，Sladekら，Genes & Development 4: 2353-2365（1990）参照］，ＣＯＵＰファミリーの受容体［たとえば，Miyajimaら，Nucleic Acids Research 16:11057-11074 (1988)，Wangら，Nature 340:163-166（1989）参照．さらに Mlodzikら，Cell 60: 211-224（1990）および Ladias ら，Science 251: 561-565（1991）に記載されているＣＯＵＰ様受容体およびＣＯＵＰ同族体を包含する］，ウルトラスピラクル受容体［たとえば，Oro ら，Nature 347: 298-30 1(1990) 参照］，ＰＰＡＲ［たとえば，Dreyerら，Cell 68: 879-887（1992）参照］等が包含される．本明細書に述べるように，ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは，本発明においてオーファン受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体の同定，および複数個のステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質の中からの特定のステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物の同定に利用される．酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインはその少なくとも最初の74個のアミノ酸から構成される［たとえば Keeganら，Science 231: 699-704(1986) 参照］．ＧＡＬ４タンパク質の最初の90個またはそれ以上のアミノ酸を用いることが好ましく，酵母ＧＡＬ４の最初の147 個のアミノ酸残基が現時点ではとくに好ましい．本発明の実施に使用されるＧＡＬ４フラグメントはステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質内の多くの任意の位置に組み込むことができる．たとえば，ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインはステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質のアミノ末端に導入することが可能であり，またＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインはステロイド／甲状腺ホルモン受容体のネイティブなＤＮＡ結合ドメインを置換してもよく，またＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインはステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質のカルボキシ末端に導入されてもよく，また本技術分野の熟練者によれば容易に決定できる他の位置に導入することもできる．したがって，たとえば，本質的にはＧＡＬ４のアミノ酸残基１〜147 と，さらに上記ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質のリガンド結合ドメインから構成される（すなわち，上記受容体のリガンド結合ドメインのみを含有し，そのＤＮＡ結合ドメインおよびそのアミノ末端ドメインは実質的に存在しない）修飾受容体タンパク質を調製することができる．本発明による同定方法は，修飾受容体とレポータープラスミドを適当な宿主細胞中で試験化合物の存在下に培養する機能バイオアッセイ系の使用を包含する．活性化された受容体−リガンド複合体の存在を決定するため，ついでレポーター遺伝子の転写の証明（たとえば発現）がモニターされる．したがって機能バイオアッセイ系では２つのプラスミド，「発現」プラスミドと「レポーター」プラスミドが利用される．発現プラスミドは，オーファンステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質の所望の修飾型をコードするＤＮＡを含有し，それを適当な宿主細胞内において発現できる任意のプラスミドとすることができる．レポータープラスミドは，操作性レポーター遺伝子に機能性に連結された操作性のＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する任意のプラスミドとすることができる．典型的なＧＡＬ４レスポンスエレメントは，たとえば，Webster ら，Cell 52: 169-178（1988）に記載されている 17 ＭＸのようなパリンドローム17- マー：を含有するレスポンスエレメントならびにそれらの誘導体である．適当なレスポンスエレメントの他の例には，Hollenberg & Evans，Cell 55: 899-906（1988）または Websterら，Cell 54: 199-207（1988）に記載されているレスポンスエレメントが包含される．典型的なレポーター遺伝子としては，クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ），ルシフェラーゼ（ＬＵＣ），β- ガラクトシダーゼ（β- ｇａｌ）等を挙げることができる．典型的なプロモーターにはシミアンウイルス（ＳＶ）プロモーターまたはその修飾型（たとえば△ＳＶ），チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター，乳癌ウイルス（ＭＴＶ）プロモーターまたはその修飾型（たとえば△ＭＴＶ）等が包含される［たとえば，Mangelsdorf ら，Nature 345: 224- 229(1990)，Mangelsdorfら，Cell 66: 555-561 (1991)，Berger ら，J.Steroid Biochem．Molec.Biol．41: 733-738（1992）参照］．プラスミドｐＧＭＣＡＴ，ｐＧＨＣＡＴ，ｐＴＫ- ＧＡＬ_p ３- ＬＵＣ，△ＭＴＶ- ＧＡＬ_p ３- ＬＵＣ， △ＭＴＶ- ＧＡＬ_p ３- ＣＡＴ等は，操作性レポーター遺伝子に機能性に連結された操作性ホルモン応答性プロモーター／エンハンサーエレメントを含有するレポータープラスミドの例であり，したがって上述の機能バイオアッセイに用いることができる（これらのプラスミドの調製に関する詳細は例２参照）．ｐＧＭＣＡＴにおいては操作性ホルモン応答プロモーター／エンハンサーエレメントはＭＴＶＬＴＲであり，ｐＧＨＣＡＴにおいてはそれは増殖ホルモンプロモーターの機能性部分である．ｐＧＭＣＡＴおよびＧＨＣＡＴの両者においては操作性レポーター遺伝子はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の細菌性遺伝子である．本明細書において「操作性レポーター遺伝子に機能性に連結された操作性レスポンスエレメント」の表現に用いられる「操作性」の語は，それぞれのＤＮＡ配列（「ＧＡＬ４レスポンスエレメント」および「レポーター遺伝子」の語によって表される）が操作性であること，すなわちそれらの意図された目的のために作動することを意味し，「機能性」の語は２つのセグメントが連結されたのち，リガンド−受容体複合体によって適当に活性化されると，「ＧＡＬ４レスポンスエレメント」が「点灯」または他の方法で活性化されたという事実の結果としてレポーター遺伝子が発現されることを意味する．上述の機能バイオアッセイの実施に際しては，発現プラスミドとレポータープラスミドが適当な宿主細胞中にコトランスフェクトされる．トランスフェクトされた宿主細胞はついで，試験化合物がレポータープラスミドのＧＡＬ４レスポンスエレメントに操作性に連結されたプロモーターの活性化を起こすことができるかどうかを決定するために，試験化合物の存在下および不存在下に培養される．その後，トランスフェクトされ培養された宿主細胞がレポーター遺伝子配列の産物の誘導（すなわち存在）についてモニターされる．本発明の実施に際しての使用が意図される機能バイオアッセイには，任意の細胞系が適当な「宿主」として使用できる．したがって，従来技術のアッセイ系の要件とは異なり，本発明の方法を実施する場合には受容体−陰性細胞を使用する必要はない．本発明の実施に使用される修飾受容体は試験細胞中においてＧＡＬ４レスポンスエレメントから転写を開始できる唯一の種であることから，試験細胞によるネイティブな受容体の発現はバックグランドレベルに寄与しない．したがって，本発明のバイオアッセイはきわめて選択的である．本発明の実施に際して使用が意図される細胞には，トランスフォームされた細胞，トランスフォームされていない細胞，新生物細胞，様々な細胞タイプの初代培養細胞等が包含される．本発明の実施に際して使用できる典型的な細胞には，シュナイダー細胞，ＣＶ−１細胞，ＨｕＴｕ80細胞，Ｆ９細胞，ＮＴＥＲＡ２細胞，ＮＢ４細胞，ＨＬ-60 細胞，293 細胞，Ｈｅｌａ細胞，酵母細胞等が包含される．機能バイオアッセイ系における使用に好ましい宿主細胞はＣＯＳ細胞およびＣＶ−１細胞である．ＣＯＳ−１（ＣＯＳと呼ぶ）細胞はサルの腎臓細胞でありＳＶ40Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発現するが，ＣＶ−１細胞はＳＶ40Ｔａｇを発現しない．ＣＯＳ−１誘導系中のＴａｇの存在は導入された発現プラスミドを複製可能にし，アッセイ期間中に産生される受容体の量の相対的増加を生じる．ＣＶ− １細胞はそれらがとくに遺伝子トランスファー研究に便利で，感受性でかつ特徴が十分明らかにされた宿主細胞系を提供することから，現時点では好ましい．上述の細胞（またはその分画）は生理学的に活性な化合物と接触させる場合，生理学的条件下に維持される．「生理学的条件」が約37℃の温度での等張性，水性栄養培地であることは，本技術分野の熟練者には自明の通りである．本発明の他の実施態様によれば，ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質のアンタゴニストをスクリーニングする方法において，（ｉ）ホルモン受容体アゴニストの転写活性化活性を阻害する能力の測定が求められている少なくとも１種の化合物をその濃度を上昇させて，および（ii）所望により，上記ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質またはその機能性修飾型に対する少なくとも１種のアゴニストを含有する試験細胞を培養し［この場合上記試験細胞は（ｉ）ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを含有するステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質の修飾型またはその機能性修飾型を発現する外因性ＤＮＡ，および（ii）レポーター遺伝子に操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する］，ついでホルモン受容体アゴニストによる転写の活性化を阻害する上記化合物の能力を指示する上記培養培地中における上記化合物の濃度の関数としての，上記細胞内における上記レポーター遺伝子の転写の証拠をアッセイすることからなる方法が提供される．このような培養に使用される培地には試験される受容体に対するアゴニストを包含させてもよく，また受容体は構成的であってもよく（すなわち，活性化のためにアゴニストの存在を必要としない），またこのような試験に使用される培地には固定濃度のアゴニストを添加することもできる．本発明の上述のアッセイは，バックグラウンドが低く，動的範囲が広い．本発明のさらに他の実施態様によれば，細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体に変換できるか，または第二の化合物の，細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体へのトランスフォーメーションを行うことができるか，または細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができることを特徴とする生物活性化合物を同定する方法において，（１）細胞または細胞分画を，上記の生物活性化合物と生理学的条件下に接触させ，（２）細胞，細胞分画および／または上記接触が行われた培地を分画化し，ついで，（３）上記各分画を，上述のＧＡＬ４受容体キメラ構築体をコードするＤＮＡおよびレポーターをコードするＤＮＡに操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と上記各分画を培養する機能アッセイに付し，レポーター遺伝子の発現をモニターして活性化された受容体−リガンド複合体の存在を決定する，ことからなる方法が提供される．細胞内受容体に対するリガンドおよびリガンド前駆体の例は上に掲げた．細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができる化合物には，受容体と化合物の直接相互作用が関与しない別の生化学的経路によって，受容体のアクティベーターとして作用する化合物が包含される．このような化合物の例には，ドパミン，脂肪酸，クロフィブリン酸，外来異物等がある．本発明の別の実施態様に関して上述したように，本発明のこの実施態様の実施に際しても広範囲の多様な細胞の使用が想定される．本発明のこの実施態様における使用が意図される細胞分画には，多様な細胞下分画たとえば，核分画，サイトゾル分画，膜分画等が包含される．上述の接触が行われる細胞，細胞分画および／または培地の分画化は，本技術分野の熟練者によれば容易に決定できる様々な方法で実施できる．たとえば，発酵肉汁は水性および／または有機培地に抽出し，多様な物理的分離技術，たとえば標準カラムクロマトグラフィー，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離，超遠心分離（たとえば，密度勾配または等密度バンド法），薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等によってさらに分画化，精製される．本発明の同定方法には機能バイオアッセイ系の使用が包含され，この場合，上述の分画は上述のＧＡＬ４受容体キメラ構造体をコードするＤＮＡおよびレポーターコードＤＮＡに操作性に連結しているＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と培養され，活性化された受容体−リガンド複合体の存在を決定するために，レポーター遺伝子産物の発現がモニターされる．したがって，機能バイオアッセイ系は２種のプラスミド，すなわち「発現」プラスミドおよび「レポーター」プラスミドを使用する．発現プラスミドは，適当な宿主細胞内で上述のＧＡＬ４−受容体キメラ構造体（またはその変異体）を含有し，それを発現できる任意のプラスミドである．レポータープラスミドは操作性レポーター遺伝子に機能性に連結された操作性ＧＡＬ４応答性プロモーター／エンハンサーエレメントを含有する任意のプラスミドである．本発明のこの実施態様の実施に際しての使用に適当な典型的レポーター遺伝子は本発明の別の実施態様に関連して上述した通りである．細胞内受容体すなわちステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリー受容体のメンバーに対するリガンドの機能を好ましい形態で測定するために機能バイオアッセイ系を用いる場合には，プラスミドにはａｍｐ遺伝子のような選択的マーカーを担わせることになる．さらに，好ましい形態においては，レポータープラスミドは適当なホルモン応答性プロモーター／エンハンサーエレメントたとえば，ＭＴＶＬＴＲまたは増殖ホルモンプロモーターの機能性部分を含有させる．ＳＶ40複製起点（ｏｒｉ）を含有する発現プラスミドはＳＶ40Ｔａｇを発現する任意の宿主細胞内において高コピー数に増殖することができる．したがって，ＳＶ40”ｏｒｉ”を有する発現プラスミドは，ＣＯＳ細胞内では複製できるが，ＣＶ−１細胞内では複製できない．高コピー数によって得られる発現の増大は望ましいものではあるが，それは「シス−トランス」バイオアッセイ系の操作性に必須ではない．バイオアッセイに通常用いられる発現ベクターは一般的にきわめて効率的であるから，アッセイは実際上任意の宿主中で実施できる．したがって，本発明の他の実施態様に関して上述したように，任意の細胞系が本発明のこの実施態様における使用が意図される機能バイオアッセイに対し，適当な「宿主」として使用することができる．上述の機能バイオアッセイに基づいて，ステロイドまたはステロイド様化合物による受容体の活性化（またはアゴニストの存在下でのこのような活性化の試験化合物による阻害）を調べることができる．本発明のさらに他の実施態様によれば，生物活性化合物の，（Ａ）細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体，または，（Ｂ）第二の化合物の細胞内受容体（単数または複数）に対するリガンドまたはリガンド前駆体へのトランスフォーメーションを促進する種，または（Ｃ）細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができる種，への変換を促進できる細胞系を同定する方法において，（１）細胞をその細胞の生存度の維持に適当な条件下で生物活性化合物と接触させ，（２）細胞および細胞が保持される培地を分画化し，（３）上記分画のそれぞれを，各分画が上述のＧＡＬ４受容体キメラ構築体をコードするＤＮＡ，およびレポーターコードＤＮＡに操作性に連結したＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と培養される機能バイオアッセイに付し，活性化された受容体−リガンド複合体の存在を測定するためにレポーター遺伝子の発現をモニターし，ついで（４）上記生物活性化合物の，上記機能バイオアッセイにおける機能性産物への変換を促進する細胞系を同定する，ことからなる方法が提供される．本発明のさらに他の実施態様によれば，生物活性化合物の，（Ａ）細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体，または，（Ｂ）第二の化合物の，細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体へのトランスフォーメーションを促進する種，または（Ｃ）細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができる種，への変換を促進できる酵素または非酵素性活性を同定する方法において，（１）生物活性化合物を所望の変換を促進するのに適当な条件に付し，（２）工程（１）の反応生成物を，各分画が上述のＧＡＬ４受容体キメラ構築体をコードするＤＮＡ，およびレポーターコードＤＮＡに操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と培養される機能バイオアッセイに付し，活性化された受容体−リガンド複合体の存在を測定するためにレポーター遺伝子の発現をモニターし，ついで，（３）上記生物活性化合物の，上記機能アッセイにおいて所望の活性を与える機能性産物への変換を促進する条件を同定する，ことからなる方法が提供される．生物活性化合物の所望の変換を促進するのに適当な条件には，所望の活性を含む可能性のある細胞分画と接触させること，生物活性化合物を温度の変動，ｐＨ変化，紫外線照射，または生物活性化合物の活性の修飾を行うことができる可能性をもつ他の任意の化学的または物理的暴露に付すことが包含される．次に本発明を，以下の非限定的実施例を参照することによって，さらに詳細に説明する．例１ＧＡＬ４−受容体融合タンパク質の調製ＧＡＬ４−受容体融合タンパク質の発生に有用な基本ベクターは，ｐＣＭＸ− ＧＡＬ４と呼ばれる（配列番号：２参照）．このベクターはＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインと，それに続くクローンニングに有用なポリリンカー配列をコードする．親の発現ベクターｐＣＭＸは，Umesono ら，Cell 65: 1255-1266（1991）に記載されており，ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４のＧＡＬ４部分は，Sadowski & Ptashne， Nucleic Acids Res.17:7539 (1989)に記載されているプラスミドｐＳＧ424 に由来する．一般に，ＧＡＬ４−受容体リガンド結合ドメイン融合体はＧＲ−ＲＡＲキメラのような変異受容体ｃＤＮＡクローンを利用して調製される［たとえば Giguere ら，Nature 330: 624-629 (1987)参照］．これらの変異受容体ｃＤＮＡはそのＤＮＡ結合ドメインの末端に，Giguere ら（前出）に記載されているように，共通のＸｈｏＩ部位をコードする．このために，適合するＳａｌＩ部位をポリリンカ −配列中にコードする新規なｐＣＭＸ−ＧＡＬ４ベクターを調製した（ＧＡＬ４配列中にはＸｈｏＩ部位がある）：ＳａｌＩ部位：Ｇ’ＴＣＧＡＣＸｈｏＩ部位：Ｃ’ＴＣＧＡＧこれは，受容体リガンド結合ドメインのＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインへの効率的なトランスファーを可能にする．この方法により，多数のキメラ種が発生されている．たとえば，ＧＡＬ４−ｈＲＡＲα，ＧＡＬ４−ｈＴＲβ，ＧＡＬ４−ｈＧＲ，ＧＡＬ４−ｈＥＲＲ１，ＧＡＬ４−ｈＥＲＲ２，ＧＡＬ４−ｈＸＲ２（ｈＸＲ２は現在係属中の出願一連番号第07/761,068に記載されている），ＧＡＬ４ −ｍＸＲ５（ｍＸＲ５は現在係属中の出願一連番号第07/761,068に記載されている），ＧＡＬ４−ｈＶＤＲ，ＧＡＬ４−ｈＲＸＲα等である．たとえば，ｈＲＡＲα ｃＤＮＡは，以下のように，唯一のＸｈｏＩ部位をコードするように変異させた（Giguere ら，前出参照）．この変異させたＲＡＲα ｃＤＮＡをついでＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し，ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ消化物にライゲートし（配列番号：４に掲げた「新しい」リンカーを含有し，配列番号：４に掲げたリンカーは配列番号：２に掲げた構築体中にその残基479 〜532 の代わりに挿入される），関連部分に（式中，「ＤＢＤ」はＤＮＡ結合ドメイン，「ＬＢＤ」はリガンド結合ドメインを意味する）の配列を有する構築体を製造した．上に言及したタイプの変異体がＧＡＬ４−含有キメラ体の構築に利用できない場合には，単に関心受容体のＤＮＡ結合ドメインの下流の任意の便利な制限酵素部位（すなわち，ＤＮＡ結合ドメインの保存されているＧｌｙ−Ｍｅｔ残基の下流の最初の約30個のアミノ酸残基内，すなわち，配列番号：１に示した最後の２個の残基の30個残基以内）を探してそのカルボキシ端末配列を利用することができる．別法として，ＰＣＲベースの突然変異誘発を利用して所望の制限部位をＤＮＡセグメントに付加することもできる．たとえばステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリー受容体の任意のメンバーのリガンド結合ドメインに対して相補性のプライマーを設計することができる．このようなプライマーは，ＰＣＲにより，与えられた受容体の所望部分を増幅させることができる．プライマーの末端に所望の制限部位を付加することにより，ＰＣＲによって合成された各コピーが，その末端にそのような制限酵素部位をもつことを確実にすることができる［Scha rf， Cloning with PCR．In: PCR Protocols (Innis ら編)，Academic Press In c．(SanDiego，CA) 84-91（1990）］．続いて，フラグメントは，両酵素で消化し，同一のまたは適合性の酵素で消化されたｐＣＭＸ−ＧＡＬ４にライゲートすることができる．すなわち，たとえば，ニワトリＲＡＲβのリガンド結合ドメインは，アミノ酸 147 〜154 および 447〜452 に相補性のプライマーによりＰＣＲを用いて増幅させることができる．ＳａｌＩ部位は５’末端に，またＮｈｅＩ部位は３’末端に付加させることができる．増幅後，フラグメントは，ＳａｌＩおよびＮｈｅＩで消化し，ついでｐＣＭＸ−ＧＡＬ４（ＳａｌＩおよびＮｈｅＩで予め消化．配列番号：４に掲げたポリリンカー包含ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４ｎを使用）にライゲートすることができる．例２レポーター構築体の調製以下の実施例においては，様々なレポーター構築体が用いられる．それらは以下のようにして調製される．ＴＫ−ＬＵＣ：ＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター配列をＨｉｎｄIIIおよびＸｈｏＩ消化によって Hollenberg & Evans，Cell 55: 899-906 (1988)に記載のＭＴＶ −ＬＵＣプラスミドから取出し，単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター［Luckow & Schutz，Nucleic Acids Res．15: 5490（1987）に記載されているプラスミドｐＢＬＣＡＴ２から単離される転写開始部位ｍに対して−105 〜＋51］のＨｉｎｄIII−ＸｈｏＩフラグメントでクローン化し，親の構築体ＴＫ−ＬＵＣを発生させた．ｐＴＫ−ＴＲＥｐ２−ＬＵＣ：レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）結合部位をコードする二本鎖パリンドローム甲状腺ホルモンレスポンスエレメント（ＴＲＥｐ）オリゴヌクレオチドの２つのコピーを，ＴＫ−ＬＵＣのＴＫプロモーターの上流ＨｉｎｄIII部位にクローン化した．ｐＴＫ−ＧＡＬｐ３−ＬＵＣ：ＧＡＬ４結合部位をコードする二本鎖17ＭＸオリゴヌクレオチドの３つのコピーを，ＴＫ−ＬＵＣのＴＫプロモーターの上流にＨｉｎｄIII部位でクローン化した． △ＭＴＶ−ＧＡＬｐ３−ＣＡＴ：ＧＡＬ４結合部位をコードする二本鎖17ＭＸオリゴヌクレオチドの３つのコピーを，Hollenberg & Evans，前出に記載されている△ＭＴＶ−ＣＡＴプラスミド中のＨｉｎｄIII部位にクローン化した． △ＭＴＶ−ＧＡＬｐ３−ＬＵＣ：ＧＡＬ４結合部位をコードする二本鎖17ＭＸオリゴヌクレオチドの３つのコピーを，Hollenberg & Evans，前出に記載されている△ＭＴＶ−ＬＵＣプラスミドのＨｉｎｄIII部位にクローン化した．△ＭＴＶ−ＬＵＣプラスミドは，Hollenberg & Evans，前出に記載されているように，もはやホルモンに応答しない突然変異ＭＴＶ−ＬＴＲプロモーターをコードする．ＣＭＸ−βＧＡＬ：大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のコード配列を，プラスミドｐＣＨ110 ［Hallら，J.Mol.Appl.Genet．2: 101-109（1983）参照］からＨｉｎｄIIIおよびＢａｍＨＩによる消化で単離し，ｐＣＭＸ真核細胞発現ベクターにクローン化した（Umesono ら，前出参照）．例３受容体選択性アゴニストのスクリーニングアッセイＣＶ−１細胞を，96ウエルプレート中で，ＣＭＸ−ＧＡＬ−ｈＲＡＲαおよびｔｋ−ｇａｌ_p ｘ３−ｌｕｃによって，コトランスフェクトした．96ウエルあたりのＤＮＡの通常量は，１μg のＣＭＸ−ＧＡＬ−ｈＲＡＲα，５μg のｔｋ− ｇａｌ_p ｘ３−ｌｕｃ，４μg のＣＭＸ−βＧＡＬである．通常，トランスフェクションは三重に実施する．ついでプレートを37℃で一夜インキュベートする．細胞を新鮮培地で２回洗浄する．アゴニストの系列稀釈の１つの濃度を含有する新鮮培地を各ウエルに添加する．通常のアゴニスト稀釈系列は 10 ^-5Ｍ〜10^-1 ¹ Ｍの範囲とする．各アゴニストについて溶媒対照を設ける．細胞は37℃で１〜２日間インキュベートする．細胞を緩衝食塩溶液で２回濯ぐ．ついで 200μl の溶解緩衝液を添加して細胞をインシトゥで溶解させる．室温で30分間インキュベートしたのち，細胞溶解物の 40 μl アリコートをルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイおよびβ−ガラクトシダーゼトランスフェクション対照用に96ウェルプレートに移す［Heyman ら，Cell 68: 397-406（1992）参照］．データは，相対光単位（ＲＬＵ）／β- ガラクトシダーゼの O.D．単位／分で表した．三重実験の結果を各濃度について平均し，正規化ＲＬＵ対アゴニスト用量または誘導倍率対アゴニスト用量としてプロットする．特定の受容体に対するアゴニストの選択性は，その受容体の活性化を他の類似受容体を用いて同一アゴニストによって認められる活性化と比較して測定する．特定のアゴニストによって誘発される活性化を，同一の受容体で最大濃度の全トランスレチノイン酸によって誘発される活性化の百分率として表すのが有用な場合が多い．本例は，本発明の方法が，多数の化合物および／または細胞系について，リガンドの存在または試験細胞系が培地成分から機能性リガンドを産生させる能力を測定するためのスクリーニングに容易に適用できることを証明する．例４各種ｈＲＡＲα構築体の用量反応エフェクタープラスミド，レポータープラスミドおよびβ−ガラクトシダーゼ対照プラスミドを，ＣＶ−１細胞に，約 1:5.4 の比で，リポソーム仲介法により，ＤＯＴＡＰ（Boehringer Manheim）を製造業者の説明書に従って用い無血清培地（たとえば Life Technologies，Gaithersberg，MD 製Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）中でコトランスフェクトする．約18時間後，細胞を新鮮なＯｐｔｉ−ＭＥＭで２回洗浄し，全トランスレチノイン酸を培地に図３に示す最終モル濃度になるように添加する．24時間インキュベートしたのち，細胞をリン酸緩衝食塩溶液（ｐＨ 7.2 ）で濯ぎ，溶解させる．アリコートについてルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイする．ルシフェラーゼ活性は１分間のインキュベーションあたりのβ−ガラクトシダーゼの光学密度単位に正規化する．データは，溶媒単独でインキュベートした同一構築体に対する誘導倍率として表３に示す．用いられた受容体：レポーターの組合せは以下の通りである．ＣＭＸ−ＧＡＬ−ｈＲＡＲα１（ｈＲＡＲαのリガンド結合ドメインはＧＡＬ４のアミノ酸 1〜173 に融合）とｐＴＫ−ＧＡＬｐ３−ＬＵＣ；ＲＳ−ＧＧＲ（ヒトグルココルチコイド受容体αのアミノ末端とＤＮＡ結合ドメインをｈＲＡＲαのリガンド結合ドメインに融合）とＭＴＶ−ＬＵＣ；ＲＳ−ＧＲＲ（ヒトグルココルチコイド受容体αのアミノ末端ドメインをｈＲＡＲαのＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインに融合）とｐＴＫ−ＴＲＥｐ２−ＬＵＣ；およびＣＭＸ−ｈＲＡＲａ１とｐＴＫ−ＴＲＥｐ２−ＬＵＣ．図３を見れば，本発明のキメラ受容体はアゴニスト型アッセイにおいて，非修飾受容体または従来技術で使用されているキメラ受容体（たとえば，ＧＲＲまたはＧＧＲ）に比較して，はるかに高い応答性を示すことが明らかである．本発明をその一部の好ましい実施態様を参照しながら詳細に説明したが，修飾および変化は記載され請求された精神および範囲内に包含されることを理解すべきである．配列の要約配列番号：１は，ステロイド／甲状腺ホルモンスーパーファミリーの受容体のメンバーのＤＮＡ結合ドメインのコンセンサスアミノ酸配列である．配列番号：２は，ＧＡＬ４−受容体融合タンパク質の調製に有用なベクターの核酸配列（および推定アミノ酸配列）であって，本発明の実施に有用なＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインをコードする典型的なセグメントを包含する．配列番号：３は，配列番号：２の核酸配列の推定アミノ酸配列である．配列番号：４は，本発明のキメラ構築体の調製に有用なリンカーの核酸配列である．配列番号：５は，本発明の実施に有用なＧＡＬ４レスポンスエレメントの核酸配列である．

【手続補正書】【提出日】１９９６年８月１９日【補正内容】『請求の範囲１．ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのオーファンメンバーに対するリガンドもしくはリガンド前駆体を決定する方法において，上記オーファンメンバーの修飾型を含む細胞をそのオーファンメンバーに対する推定リガンドと接触させ，この場合，上記オーファンメンバーの上記修飾型はＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを上記オーファンメンバーに付加することによって生成され，また上記細胞はレポーター遺伝子に操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有し，ついで，レポーター遺伝子産物の発現をモニターする，ことからなる方法．２．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４のアミノ酸残基 1〜147 からなる「請求項１」に記載の方法．３．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはオーファンメンバーのアミノ末端に付加される「請求項１」に記載の方法．４．共通のリガンドに応答する複数個のステロイド／甲状腺ホルモン受容体の中から１つの特異的ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物を同定する方法において，ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを上記複数個の受容体タンパク質それぞれに付加して，複数個の修飾受容体タンパク質を生成させ，上記の修飾受容体タンパク質の１つを含有する細胞を個々に，上記修飾受容体タンパク質に対する推定選択的リガンドと，上記複数個の修飾受容体タンパク質のすべてのメンバーが個々に接触を受けるまで接触させ，この場合，上記細胞はレポーター遺伝子に操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有し，レポーター遺伝子産物の発現をモニターし，ついで，共通のリガンドに応答する上記複数個の受容体の中から１つの特異的ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物を同定する，ことからなる方法．５．上記複数個の受容体タンパク質は共通のリガンドに応答する受容体の多重サブタイプからなる「請求項４」に記載の方法．６．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４の少なくとも最初の74個のアミノ末端アミノ酸残基からなる「請求項４」に記載の方法．７．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインは受容体タンパク質のアミノ末端に導入される「請求項４」に記載の方法．８．ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質のアンタゴニストをスクリーニングする方法において，（ｉ）ホルモン受容体アゴニストの転写活性化活性を阻害する能力の測定が求められている少なくとも１つの化合物の濃度を上昇させ，および（ii）任意に，上記ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質もしくはその機能性修飾型に対する少なくとも１つのアゴニスト，を含有する試験細胞を培養し，ここで，上記試験細胞は（ｉ）ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを含有するステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質の修飾型またはその機能性修飾型を発現する外因性ＤＮＡおよび本来の受容体タンパク質の本来のＤＮＡ結合ドメイン，ならびに（ii）レポーター遺伝子に操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有し，ついで，ホルモン受容体アゴニストによる転写の活性化を阻害する上記化合物の能力を指示する上記培養培地中の上記化合物の濃度の関数としての上記細胞内における上記レポーター遺伝子の転写の証明をアッセイする，ことからなる方法．９．ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質をホモダイマー形成可能にする方法において，ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを上記受容体タンパク質に付加することからなる方法． 10．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４の少なくとも最初の74個のアミノ末端アミノ酸残基からなる「請求項９」に記載の方法． 11．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインは受容体タンパク質のアミノ末端に導入される「請求項９」に記載の方法． 12．細胞内受容体に対するリガンドもしくはリガンド前駆体に変換できるか，または第二の化合物の，細胞内受容体のリガンドもしくはリガンド前駆体へのトランスフォーメーションを行うことができるか，または細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができることを特徴とする生物活性化合物を同定する方法において，（１）細胞または細部分画を上記生物活性化合物と生理学的条件下において接触させ，（２）細胞，細胞分画および／または上記接触が行われた培地を分画化し，そして（３）上記各分画を，酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが付加されたステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバーからなるキメラ受容体をコードするＤＮＡ，およびレポーターコードＤＮＡに操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と各分画を培養する機能アッセイに付し，レポーター遺伝子の発現をモニターして活性化された受容体−リガンド複合体の存在を測定する，ことからなる方法． 13．生物活性化合物の，（Ａ）細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体，または，（Ｂ）第二の化合物の，細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体へのトランスフォーメーションを促進する種，または，（Ｃ）細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができる種，への変換を促進できる細胞系を同定する方法において，（１）細胞をその細胞の生存度の維持に適当な条件下に生物活性化合物と接触させ，（２）細胞および細胞が保持された培地を分画化し，（３）上記各分画を，酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが付加されたステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバーからなるキメラ受容体をコードするＤＮＡ，およびレポーターコードＤＮＡに操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と各分画を培養する機能アッセイに付し，レポーター遺伝子の発現をモニターして活性化された受容体−リガンド複合体の存在を測定し，（４）上記生物活性化合物の，上記機能バイオアッセイにおいて機能性な産物への変換を促進する細胞系を同定する，ことからなる方法． 14．生物活性化合物の，（Ａ）細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体，または，（Ｂ）第二の化合物の，細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体へのトランスフォーメーションを促進する種，または（Ｃ）細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができる種，への変換を促進できる酵素または非酵素活性を同定する方法において，（１）生物活性化合物を所望の変換を促進するために適当な条件に付し，（２）工程（１）の反応生成物を，酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが付加されたステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバーからなるキメラ受容体をコードするＤＮＡ，およびレポーターコードＤＮＡに操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と各分画を培養する機能バイオアッセイに付し，レポーター遺伝子の発現をモニターして活性化された受容体−リガンド複合体の存在を決定し，（３）上記生物活性化合物の，上記機能アッセイにおいて所望の活性を与える機能性の産物への変換を促進する条件を同定する，ことからなる方法．』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/532 Ｚ 33/532 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者ウメソノ，カズヒコアメリカ合衆国 92037 カリフォルニア州ラジョラ，プロスペクトストリート 1295，スウィートシー (72)発明者ブラムバーグ，ブルースアメリカ合衆国 92122 カリフォルニア州サンディエゴ，ナンバー 122，レボンドライブ 3435 (72)発明者ランガラジャン，プンディエヌ. インド国 560 079 バンガロアー，バサウエスワラナガー，セブンスエイメイン，ナンバー 111

Claims

【特許請求の範囲】１．ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのオーファンメンバーに対するリガンドもしくはリガンド前駆体を決定する方法において，上記オーファンメンバーの修飾型を含む細胞をそのオーファンメンバーに対する推定リガンドと接触させ（この場合，上記オーファンメンバーの上記修飾型はＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを上記オーファンメンバー内に導入することによって生成され，また上記細胞はレポーター遺伝子に操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する），ついで，レポーター遺伝子産物の発現をモニターする，ことからなる方法．２．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４のアミノ酸残基１〜147 からなる「請求項１」に記載の方法．３．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはオーファンメンバーのアミノ末端に導入される「請求項１」に記載の方法．４．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはオーファンメンバーのＤＮＡ結合ドメインを置換する「請求項１」に記載の方法．５．共通のリガンドに応答する複数個のステロイド／甲状腺ホルモン受容体の中から１つの特異的ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物を同定する方法において，ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを上記複数個の受容体タンパク質それぞれに導入して，複数個の修飾受容体タンパク質を生成させ，上記の修飾受容体タンパク質の１つを含有する細胞を上記修飾受容体タンパク質に対する推定選択的リガンドと接触させ（この場合，上記細胞はレポーター遺伝子に操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する），レポーター遺伝子産物の発現をモニターし，ついで，上記複数個の修飾受容体タンパク質のすべてのメンバーについて個々に上記接触が行われるまで，上記接触およびモニター工程を異なる修飾受容体タンパク質で反復し，その後，共通のリガンドに応答する上記複数個の受容体の中から１つの特異的ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質に選択的な化合物を同定する，ことからなる方法．６．上記複数個の受容体タンパク質は共通のリガンドに応答する受容体の多重サブタイプからなる「請求項５」に記載の方法．７．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４の少なくとも最初の74個のアミノ末端アミノ酸残基からなる「請求項５」に記載の方法．８．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインは受容体タンパク質のアミノ末端に導入される「請求項５」に記載の方法．９．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインは受容体タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを置換する「請求項５」に記載の方法． 10．上記修飾受容体タンパク質は本質的にＧＡＬ４のアミノ酸残基１〜147 と上記ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質のリガンド結合ドメインからなる「請求項５」に記載の方法． 11．ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質のアンタゴニストをスクリーニングする方法において，（ｉ）ホルモン受容体アゴニストの転写活性化活性を阻害する能力の測定が求められている少なくとも１つの化合物の濃度を上昇させ，および（ii）任意に，上記ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質もしくはその機能性修飾型に対する少なくとも１つのアゴニスト，を含有する試験細胞を培養し［この場合，上記試験細胞は（ｉ）ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを含有するステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質の修飾型またはその機能性修飾型を発現する外因性ＤＮＡ，および（ii）レポーター遺伝子に操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する］，ついで，ホルモン受容体アゴニストによる転写の活性化を阻害する上記化合物の能力を指示する上記培養培地中の上記化合物の濃度の関数としての上記細胞内における上記レポーター遺伝子の転写の証明をアッセイする，ことからなる方法． 12．ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質をホモダイマー形成可能にする方法において，ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを上記受容体タンパク質中に導入することからなる方法． 13．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４の少なくとも最初の74個のアミノ末端アミノ酸残基からなる「請求項12」に記載の方法． 14．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインは受容体タンパク質のアミノ末端に導入される「請求項12」に記載の方法． 15．ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインは受容体タンパク質のＤＮＡ結合ドメインを置換する「請求項12」に記載の方法． 16．上記修飾受容体タンパク質は本質的にＧＡＬ４のアミノ酸残基１〜147 と上記ステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質のリガンド結合ドメインからなる「請求項12」に記載の方法． 17．細胞内受容体に対するリガンドもしくはリガンド前駆体に変換できるか，または第二の化合物の，細胞内受容体のリガンドもしくはリガンド前駆体へのトランスフォーメーションを行うことができるか，または細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができることを特徴とする生物活性化合物を同定する方法において，（１）細胞または細部分画を上記生物活性化合物と生理学的条件下において接触させ，（２）細胞，細胞分画および／または上記接触が行われた培地を分画化し，ついで（３）上記各分画を，酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが導入されたステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバーからなるキメラ受容体をコードするＤＮＡ，およびレポーターコードＤＮＡに操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と各分画を培養する機能アッセイに付し，レポーター遺伝子の発現をモニターして活性化された受容体−リガンド複合体の存在を測定する，ことからなる方法． 18．生物活性化合物の，（Ａ）細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体，または，（Ｂ）第二の化合物の，細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体へのトランスフォーメーションを促進する種，または，（Ｃ）細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができる種，への変換を促進できる細胞系を同定する方法において，（１）細胞をその細胞の生存度の維持に適当な条件下に生物活性化合物と接触させ，（２）細胞および細胞が保持された培地を分画化し，（３）上記各分画を，酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが導入されたステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバーからなるキメラ受容体をコードするＤＮＡ，およびレポーターコードＤＮＡに操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と各分画を培養する機能アッセイに付し，レポーター遺伝子の発現をモニターして活性化された受容体−リガンド複合体の存在を測定し，（４）上記生物活性化合物の，上記機能バイオアッセイにおいて機能性な産物への変換を促進する細胞系を同定する，ことからなる方法． 19．生物活性化合物の，（Ａ）細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体，または，（Ｂ）第二の化合物の，細胞内受容体に対するリガンドまたはリガンド前駆体へのトランスフォーメーションを促進する種，または（Ｃ）細胞内受容体のその活性型へのトランスフォーメーションを行うことができる種，への変換を促進できる酵素または非酵素活性を同定する方法において，（１）生物活性化合物を所望の変換を促進するために適当な条件に付し，（２）工程（１）の反応生成物を，酵母ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインが導入されたステロイド／甲状腺ホルモン受容体タンパク質スーパーファミリーのメンバーからなるキメラ受容体をコードするＤＮＡ，およびレポーターコードＤＮＡに操作性に連結されたＧＡＬ４レスポンスエレメントを含有する宿主細胞と各分画を培養する機能バイオアッセイに付し，レポーター遺伝子の発現をモニターして活性化された受容体−リガンド複合体の存在を決定し，（３）上記生物活性化合物の，上記機能アッセイにおいて所望の活性を与える機能性の産物への変換を促進する条件を同定する，ことからなる方法．