JPH09502885A

JPH09502885A - シスプラチン耐性遺伝子及びその利用

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Publication number: JPH09502885A
Application number: JP7526230A
Authority: JP
Inventors: 志郎横山
Original assignee: 志郎横山
Priority date: 1994-04-08
Filing date: 1994-08-22
Publication date: 1997-03-25
Also published as: NZ271140A; US5858674A; AU7467894A; CA2163526A1; US6046044A; US5846725A; EP0707649A1; US5858780A; US5646011A; WO1995027784A1

Abstract

(57)【要約】シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍のシスプラチン耐性の増大を細胞に与えることの出来る単離された核酸を開示する。この発明の核酸は、更に、重金属例えばカドミウム及び銅に対する耐性を細胞に与えることが出来る。この発明の核酸によりコードされた単離された蛋白質をも又開示する。この発明のこれらの単離された核酸及び蛋白質は、例えば腫瘍を有しシスプラチンで治療を受けている患者の非悪性細胞にシスプラチン耐性を与えるために有用である。或は、細胞のシスプラチン耐性は、細胞を、この発明の蛋白質の活性を阻害する薬剤と接触させることにより阻止して、例えば、腫瘍細胞のシスプラチン耐性を逆向させることが出来る。この発明は又、細胞のシスプラチン耐性を阻止する物質及びシスプラチンの化学増感剤である物質を同定するための方法をも開示する。この発明は、更に、この発明の核酸及び蛋白質を用いてシスプラチン耐性の腫瘍を同定するための方法をも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】シスプラチン耐性遺伝子及びその利用発明の背景化学療法剤シスプラチン（シス−ジアミンジクロロ白金又はＣＤＤＰ）は、１９６８年に細胞毒性を有することが発見され、広く世界中で多くの腫瘍、特に固形腫瘍例えば卵巣癌、精巣癌並びに頭部及び頚部の癌の治療に用いられている。この白金薬剤は、ＤＮＡのプラチネーションにより作用し、それによりＤＮＡを架橋（鎖間及び鎖内の両方）し且つ細胞プロセスを混乱させると考えられている。シスプラチンの臨床効果は、シスプラチン耐性癌細胞の出現により制限される。ある種の癌は、本来的な若しくは天然のシスプラチン耐性を示し、初期化学療法に対してすら緩解を受けない。他の腫瘍は初期治療には良く応答するが再発時には薬剤に対して減少した応答を示す。この型の耐性は、シスプラチンを用いた治療の後で生じ、獲得耐性と呼ばれる。シスプラチン耐性を予防し、克服し若しくは逆転させる能力は、悪性疾患の治療に対して大きな利益となるであろう。シスプラチン耐性の機構を同定するための試みが為されたが、この機構は解明されないままになっている。様々な研究において、シスプラチン耐性は、この薬物の減少した細胞内蓄積、増大したＤＮＡ修復機能及び／又は細胞内チオールによる増大した薬剤無毒化と関連した（可能なシスプラチン耐性の機構の総説は、例えば、Andrews,P.A.及びHowell,S.B.(1990)Cancer Cells 2: 35-43; Kelley,S.L.及びRozcncweig,M.(1989)Eur.J.Clin.Oncol.25:1135-1140; Perez,R.P.等(1990)Pharmacol.Ther.48:19-27;及びTimmer-Bosscha,H．等(1992) Br.J.Cancer 66:227-238 を参照されたい）。細胞内チオールによる薬剤の無毒化に関する役割は、増大したグルタチオン及びメタロチオネインレベルを有するある種の癌細胞株においてシスプラチン耐性の関係のためであると仮定された（ Godwin,A.K．等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci．USA 89:3070-3074;及びKelley,S.L ．等(1988)Science241:1813-1815を参照されたい）。シスプラチン耐性表現型の獲得を特定の遺伝子と関係付ける試みも為された。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びメタロチオネインの遺伝子を細胞株にトランスフェクトしてそれらの細胞にシスプラチン耐性を与えることが試みられた。ＧＳＴは細胞にシスプラチン耐性を与えると報告されたが、増大された耐性のレベルは１．５〜３．０倍の範囲に過ぎなかった（Miya zaki,M．等(1990)Biochem.Biophys．Res.Commun．166:1358-1364;及びPuchalski ,R.B.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci．USA 87:2443-2447を参照されたい）。他の研究は、メタロチオネイン遺伝子での細胞のトランスフェクションが細胞にシスプラチン耐性を与えるがやはり増大した耐性のレベルは５倍未満であることを報告した（Kelley,S.L ．等(1988) Science 241:1813-1815を参照されたい）が、その他の研究は、メタロチオネイン遺伝子での細胞のトランスフェクションに際してシスプラチン耐性の増大を見出さなかった（Morton,K.A.等(1993) J.Pharmacol.Exp.Ther.267:697 -702;及びKoropatnick,J.及びPearson,J.(1993)Molec.Pharmacol.44:44-50を参照されたい）。他の研究において、ｃ−ｍｙｃ遺伝子でトランスフェクトした細胞がシスプラチン耐性を獲得したと報告されたが、やはり増大した耐性レベルは非常に低かった（即ち、３倍未満）。アントラサイクリン類（例えば、ドキソルビシン、エピポドフィロトキシン、及びビンカアルカロイド）に対する腫瘍細胞の多剤耐性は、２つの異なる遺伝子［その一方は、Ｐ−糖蛋白質（Roninson，I.B.等(1984)Nature309:626-628;及び Riordan，J.R．等(1985) Nature 316:817-819を参照）をコードし、他方は、ＭＲＰ（Cole,S.P.C.等(1992) Science 258:1650-1654を参照）をコードする］の１つの増大された発現と関係していることが見出された。ｍｄｒ１遺伝子（Ｐ− 糖蛋白質をコード）又はＭＲＰ遺伝子での細胞のトランスフェクションは、細胞に多剤耐性を与えることが出来る（Gros，P.等(1986) Nature 323:728-731;及び Cole，S.P.C.(1984)Cancer Res．54:357-361を参照されたい）。しかしながら、Ｐ−糖蛋白質もＭＲＰも細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与えることは出来ず、それ故に、腫瘍細胞において認められるシスプラチン耐性を説明するものではない。上記の何れの研究も、腫瘍細胞の内因性の若しくは獲得したシスプラチン耐性を納得のゆくようには説明しない。従って、細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与え得るシスプラチン耐性決定遺伝子は同定されないままであると結論することが出来る。発明の要約この発明は、細胞内で発現されるその細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与えることの出来る単離された核酸分子に関するものである。好適具体例において、この発明の核酸の細胞中での発現は、その細胞に、シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を与える。更に好ましくは、耐性は少なくとも１０〜１５倍に増大される。従って、この発明の核酸は、シスプラチン耐性決定遺伝子として機能する。この発明は、少なくとも部分的に、シスプラチン耐性の卵巣癌細胞株からの特異的なｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによるｃＤＮＡの単離並びに、それのシスプラチン耐性との関係及び細胞に導入されたときにシスプラチン感受性細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与えるその能力の両方の発見に基づいている。この発明の核酸は、更に、細胞に、重金属例えばカドミウム及び銅に対する耐性を与えることが出来る。一具体例において、この発明の核酸は、SEQ ID NO:１で示したヌクレオチド配列又はそれと実質的に同じであるヌクレオチド配列を含む。この発明は、シスプラチン感受性細胞にシスプラチン耐性を与えることの出来る単離された核酸、それとアンチセンスである核酸、この発明の核酸を含む組換え発現ベクター（センス又はアンチセンス）、この発明の組換え発現ベクターを含む宿主細胞並びにこの発明の核酸を含むトランスジェニック及び相同組換え非ヒト動物を提供する。この発明は、更に、細胞内で発現されるとその細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与えることの出来る単離された蛋白質にも関係する。好適具体例において、この発明の蛋白質は、細胞中で発現されたときにその細胞に少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を与えることが出来る。更に好ましくは、耐性は少なくとも１０〜１５倍増加する。この蛋白質は、更に、細胞中で発現されたときに、重金属例えばカドミウム及び銅に対する耐性を細胞に与えることが出来る。一具体例において、この蛋白質は、SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列又は実質的にそれと同じアミノ酸配列を含む。この発明は、シスプラチン感受性細胞にシスプラチン耐性を与え得る単離された蛋白質、この発明の蛋白質に結合する抗体及びこの発明の抗体を含む製薬組成物を提供する。この発明の抗体は、検出可能な物質又は毒性若しくは治療活性を有する物質で標識することが出来る。この発明は、更に、細胞のシスプラチンに対する耐性を阻止するための方法に関係する。従って、この発明の方法を用いて、腫瘍細胞のシスプラチン耐性を阻止することが出来、それにより、シスプラチンをそれらの細胞に対して治療用に用いることが可能となる。これらの方法は、シスプラチン耐性細胞を、細胞にシスプラチン耐性を与える蛋白質の活性を阻止する薬剤に接触させることを含む。好ましくは、この蛋白質は、細胞に、感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を与える。１つの具体例において、この蛋白質の活性を阻止する薬剤は、この蛋白質をコードする核酸に対してアンチセンスである核酸である。他の具体例において、この薬剤は、この蛋白質に結合する分子例えば抗体である。この抗体は、更に、毒性若しくは治療活性を有する物質で標識することが出来る。更に他の具体例において、この薬剤は、この蛋白質の活性を阻害する小分子例えば薬物である。この方法は、更に、細胞をシスプラチンと接触させて細胞の成長を阻止することを含み得る。この発明は、更に、細胞にカドミウム及び銅耐性を含む重金属に対する耐性を与えるための方法に関係する。この方法は、重金属の成長阻害効果から細胞（例えば、シスプラチンで治療を受けている患者の非悪性のシスプラチン感受性細胞）を保護するのに有用である。この方法は、細胞にシスプラチン耐性好ましくはシスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を与え得る核酸（その細胞中での発現に適した形態）を細胞中に導入することを含む。１つの具体例において、この発明の核酸を用いてシスプラチン耐性を与える。他の具体例においては、SEQ ID NO:１の核酸と相同であるミトコンドリアＮＤ１遺伝子を用いてシスプラチン耐性を与える。この発明の他の面は、シスプラチン耐性細胞に対して細胞毒性であるか又はシスプラチンの化学増感剤である物質を同定するために用いることの出来るスクリーニングアッセイを含む。これらの方法は、シスプラチン耐性細胞（例えば、シスプラチン耐性腫瘍細胞）に対する治療用に用いてそれらの細胞の生育を阻止することが出来る物質を同定するために有用である。これらの方法においては、細胞にシスプラチン耐性を与える核酸を細胞に導入してシスプラチン耐性細胞を創る。この核酸は、この発明の核酸（例えば、SEQ ID NO:１）又はミトコンドリアのＮＤ１遺伝子であってよい。次に、シスプラチン耐性細胞を試験すべき物質と接触させる。シスプラチンの化学増感剤を同定するための方法においては、細胞を試験すべき物質の存在下又は不在においてシスプラチンと接触させる。次いで、その細胞に対する試験物質の細胞毒性又は試験物質を伴うシスプラチンの細胞毒性を測定する。これらのスクリーニングアッセイにおいて用いる細胞は、例えば、イン・ビトロでこの発明の核酸でトランスフェクトした細胞であってよい。或は、これらの細胞は、この発明の核酸を有するトランスジェニック動物内の細胞であってよく、これらの物質をトランスジェニック動物に投与することが出来る。この発明は又、シスプラチン耐性腫瘍細胞を同定するための方法をも提供する。一具体例において、この方法は、腫瘍細胞からの核酸（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を、この発明の核酸とハイブリダイズする核酸プローブと接触させ、シスプラチン感受性細胞と比較して腫瘍細胞からの核酸に対するプローブの増大したハイブリダイゼーションに基づいてシスプラチン耐性腫瘍細胞を同定することを含む。他の具体例において、この方法は、腫瘍細胞の試料をこの発明の蛋白質に結合する分子（例えば、抗体）と接触させ、ここに、この分子は検出可能な物質（例えば、蛍光マーカー、放射性同位体又は酵素）で標識したものであり、そして、腫瘍細胞に結合した物質を腫瘍細胞のシスプラチン耐性の指標として検出することを含む。図面の簡単な説明図１は、ｃＤＮＡ６２を単離するために用いたディフェレンシャルｃＤＮＡライブラリースクリーニングの図式表示である。図２は、ライブラリースクリーニングのためのｃＤＮＡを調製するために用いた「ショットガン」ＰＣＲ法の図式表示である。図３Ａは、ＨＡＣ２／Ｐ細胞株（レーン１）及びＨＡＣ２／０．４細胞株（レーン２）におけるｃＤＮＡ６２の発現を示すノーザンブロットの写真である。図３Ｂは、次の細胞におけるｃＤＮＡ６２の発現を示すノーザンブロットの写真である：デキサメタゾンの不在におけるトランスフェクトしてないＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン１）；デキサメタゾン存在下のトランスフェクトしてないＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン２）；デキサメタゾン不在におけるｐＭＡＭｎｅｏでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン３）；デキサメタゾン存在下のｐＭＡＭｎｅｏでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン４）；デキサメタゾン不在におけるｐＭＡＭｎｅｏ６２Ｆ−１−３でトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン５）；デキサメタゾン存在下のｐＭＡＭｎｅｏ６２Ｆ−１−３でトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン６）。図４は、下記の肺癌細胞株におけるｃＤＮＡ６２の発現を示すノーザンブロットの写真である：Ｌ２３１（レーン１）；Ｌ２３１／ＣＤＤＰ耐性（レーン２）；ＰＣ７（レーン３）；ＰＣ７／ＣＤＤＰ耐性（レーン４）；ＰＣ９（レーン５）；ＰＣ９／ＣＤＤＰ耐性（レーン６）；ＰＣ１４（レーン７）；ＰＣ１４／ＣＤＤＰ耐性（レーン８）。図５は、下記のヒト組織におけるｃＤＮＡ６２の発現を示すノーザンブロットの写真である：心臓（レーン１）；脳（レーン２）；胎盤（レーン３）；肺（レーン４）；肝（レーン５）；骨格筋（レーン６）；腎臓（レーン７）；膵臓（レーン８）；脾臓（レーン９）；胸腺（レーン１０）；前立腺（レーン１１）；精巣（レーン１２）；卵巣（レーン１３）；小腸（レーン１４）；大腸（レーン１５）；末梢血液白血球（レーン１６）。図６は、１６ＳｒＲＮＡ−ｔＲＮＡ^Leu-ＮＤＩ−ｔＲＮＡ^Ile遺伝子を含むヒトミトコンドリアＤＮＡのヌクレオチド配列（下段行；Anderson，S.等、(1981) Nature 290:457-465）と比較したｃＤＮＡ６２のヌクレオチド配列（上段行；SE Q ID NO:１）を示す。ミトコンドリアＤＮＡについては、ｃＤＮＡ６２と比較して異なるヌクレオチドのみを示してある。ｃＤＮＡ６２のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列（SEQ ID NO:２）もヌクレオチド配列の下に示してある。図７は、ｃＤＮＡ６２によりコードされる蛋白質の疎水性を示すグラフである。正の指数は、疎水性を示し、他方、負の指数は親水性を示す。図８は、組換え発現ベクターｐＭＡＭｎｅｏ６２Ｆ及びＰＭＡＭｎｅｏ６２Ｔの構築を示す図式表示である。発明の詳細な説明この発明は、細胞中で発現した場合にその細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与える核酸及び蛋白質に関係する。この発明は、少なくとも部分的に、シスプラチン耐性決定遺伝子の単離に基づくものである。実施例に記載したように、シスプラチン耐性の卵巣癌細胞株から、ディフェレンシャルｃＤＮＡライブラリースクリーニングによってｃＤＮＡを単離した。このｃＤＮＡ（ここでは、ｃＤＮＡ６２として言及する）は、幾つかのシスプラチン耐性癌細胞株において、それらの非耐性の親細胞株と比較して一層高レベルで発現され且つ、シスプラチンに一層感受性である組織に比べて一層シスプラチン耐性であるヒト組織において一層高レベルで発現される。従って、ｃＤＮＡ６２の発現は、シスプラチン耐性と関連している。更に、シスプラチン感受性細胞におけるｃＤＮＡ６２又はそのコード領域の発現は、その細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与えることが出来る（例えば、感受性細胞の１８倍増）。更に、ｃＤＮＡ６２は、それが発現される細胞にカドミウム及び銅に対する耐性を与えることが出来る（例えば、カドミウム及び銅について、それぞれ、感受性細胞の１５倍及び４倍増）。従って、ｃＤＮＡ６２は、シスプラチン耐性が重金属耐性の一種であるとすれば、重金属耐性決定遺伝子と考えることが出来る。従って、この発明の目的のために、用語「重金属」は、シスプラチン、カドミウム及び銅を含むものとする。この発明の他の面は、単離した核酸、アンチセンス核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、トランスジェニック及び相同組換え非ヒト動物、単離した蛋白質、抗体及びシスプラチン耐性を阻止し若しくは与える方法に関連する。この発明の種々の面を下記において説明する。Ｉ．単離した核酸この発明の一つの面は、単離した核酸であってその核酸が発現される細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与える核酸に関係する。薬剤（例えば、シスプラチン）に対する細胞の「耐性」とは、感受性細胞と比較して高濃度の薬物に、細胞障害を伴わずに耐える細胞の能力をいう。それ故、細胞のシスプラチン耐性を、適当なシスプラチン感受性細胞と比較して測定する。例えば、薬物に継続的にさらした細胞のシスプラチン耐性を、薬物耐性細胞が由来する親の感受性細胞と比較して測定することが出来る。或は、シスプラチン耐性を与える核酸を導入した細胞のシスプラチン耐性を、その核酸を発現していない同じ細胞のシスプラチン感受性と比較して測定することが出来る。薬物に継続的にさらすことによりイン・ビボで薬物耐性にした天然の腫瘍細胞のシスプラチン耐性を、同じ腫瘍細胞を最初に薬物にさらしたときのシスプラチン感受性に比較して測定することが出来る。薬剤（例えば、シスプラチン）に対する細胞の耐性は、典型的には、対照の感受性細胞に対するＩＣ₅₀（５０％の細胞生育阻止に必要な薬剤濃度）の増加として定量する。この発明の核酸は、その核酸が発現されている細胞にシスプラチン感受性細胞と比較して高レベルのシスプラチン耐性を与えることが出来る。核酸の「発現」とは、その核酸を含むヌクレオチド配列のＲＮＡへの転写のことをいう。この発明の目的のために、高レベルのシスプラチン耐性とは、シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を意味するものとする。一層好ましくは、耐性の増加は少なくとも１０倍である。更に好ましくは、耐性の増加は少なくとも１５倍である。この発明の核酸は、更に、それが発現されている細胞に、カドミウム感受性細胞に比較してカドミウム耐性を与えることが出来る。好ましくは、カドミウム耐性の増加は少なくとも３倍、一層好ましくは少なくとも５倍、更に好ましくは８倍である。この発明の核酸は、更に、それが発現される細胞に、銅感受性の細胞と比較して銅耐性を与えることが出来る。好ましくは、銅耐性の増加は少なくとも２倍、一層好ましくは少なくとも３倍、更に好ましくは４倍である。この発明は、単離した核酸を提供する。用語「単離した」とは、組換えＤＮＡ技術により生成する場合には細胞性物質又は培養培地を実質的に含まない核酸をいい、化学合成する場合には化学前駆体その他の化学物質を実質的に含まない核酸のことをいう。「単離した」核酸は又、その核酸が由来した生物中で天然においてその核酸と隣接している配列（即ち、その核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含まない。用語「核酸」は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むものとし且つ二本鎖であっても一本鎖であってもよい。好適具体例において、高レベルのシスプラチン耐性を与え得るこの発明の核酸は、SEQ ID NO:１に示した核酸配列（即ち、ｃＤＮＡ６２のヌクレオチド配列であり、図６にも示してある）を含む。pBluescript SK- プラスミッド中の完全長のｃＤＮＡ６２（ｃＤＮＡ６２Ｆ）をブダペスト条約の規定に従って、日本国茨城県筑波市在、生命工学工業技術研究所に寄託し、寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−４６２９を与えられた。他の具体例において、この核酸は、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列のコード領域を含む。SEQ ID NO:１のコード領域は、ヌクレオチド１５９９からヌクレオチド１８４７にまで及ぶ。他の具体例において、この核酸は、SEQID NO:２に示したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする。実施例３で論じるように、ｃＤＮＡ６２のヌクレオチド配列（SEQ ID NO:１）は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の一部からｔＲＮＡ^Leu遺伝子及びＮＤ１遺伝子を通ってｔＲＮＡ^Ile遺伝子まで及ぶミトコンドリアＤＮＡのヌクレオチド配列と約９９％同一である。これらの２つの配列を図６において比較する。ヒトミトコンドリアＤＮＡのヌクレオチド配列は、Anderson，S 等(1981)Nature 290:457-465に開示されている。部分的に、ｃＤＮＡ６２とミトコンドリアＤＮＡのヌクレオチド配列が違っていることから、ｃＤＮＡ６２は核のＤＮＡ中の遺伝子によりコードされるものと考えられる。従って、種々の具体例において、この発明の核酸は、天然において核のゲノムＤＮＡ中に位置するヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含み、それにより、ミトコンドリアＤＮＡ中に存在するヌクレオチド配列例えばミトコンドリアＮＤ１遺伝子を排除する。SEQ ID NO:１のオープンリーディングフレームは、８３アミノ酸（SEQID NO:２に示す）をコードし、８４位に停止コドンを有する。このアミノ酸配列は、ミトコンドリアＮＤ１蛋白質のＮ末端の８３アミノ酸に対応するが、これはミトコンドリアにおけるＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ複合体の成分である。しかしながら、ミトコンドリアＮＤ１ｍＲＮＡ転写物においては８４位のアミノ酸がトリプトファンとして翻訳され、従って、このミトコンドリアＮＤ１蛋白質は８３位を超えて伸長する。従って、SEQ ID NO:２の８３アミノ酸の蛋白質はこのミトコンドリアＮＤ１遺伝子の翻訳によっては生成しないが、それでもこの蛋白質は細胞にシスプラチン耐性を与えることが出来る（実施例４参照）。ミトコンドリアＤＮＡ様の配列を有するヒトの核ＤＮＡにおける分子構造が、この分野において記載されている（例えば、Nomiyama H 等 (1985) Nucl．Acids Res．5:1649-1658を参照されたい）。この発明が、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列に実質的に類似するヌクレオチド配列を有し、又はSEQID NO:２に示したアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする高レベルのシスプラチン耐性を与えることの出来る核酸を含むことは認められよう。この用語「実質的に類似する」は、ヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して、SEQ ID NO:１及びSEQID NO:２に開示された配列と僅かに異なるヌクレオチド及びアミノ酸配列を意味し、例えば、相同な核酸は、実質的に同じ活性（例えば、細胞にシスプラチン耐性を与える能力）を有する実質的に同じポリペプチドを現実の配列として実質的に同じ様式で生成するように機能する。ヌクレオチド又はアミノ酸配列を、核酸又はそれにコードされる蛋白質の機能に影響を与えずに置換し又は改変することが出来ることは予想される。例えば、遺伝コードの縮重は、幾つかのアミノ酸を１つより多くのトリプレットコドンによって指定することを可能にする（例えば、ＣＡＵ及びＣＡＣは、両者ともヒスチジンをコードする）。従って、SEQ ID NO:１のヌクレオチドの変化（特に、コドンの第３塩基の変化）は、コードされるアミノ酸に影響しない「サイレント」突然変異をＤＮＡ中に生じ得る。これらのサイレント突然変異は、１つの集団中に自然に生じ得るものであり（ＤＮＡ多型）又は、標準的組換えＤＮＡ技術により導入することが出来る。更に、SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列における変化を生ずるＤＮＡ配列多型が自然の対立遺伝子変異により集団内に存在し又は、蛋白質の機能的活性を変えずに、標準的技術により創られ得ることは当業者に認められるべきである。従って、SEQ ID NO:１に実質的に類似する核酸配列を有するか又はSEQ ID NO:２に実質的に類似するアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする核酸であって、細胞に少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を与える能力を保持する核酸は、この発明に含まれるものである。他の具体例において、この発明の核酸は、高緊縮（high stringency ）又は低緊縮条件下で第２の核酸とハイブリダイズする。この第２の核酸は、SEQ ID NO: １に示したヌクレオチド配列を含み又はSEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする。「高緊縮及び低緊縮条件」は、当業者に公知であり、又はCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，N.Y.(1989) ，6.3.1-6.3.6中に見出すことが出来る。例えば、フィルターハイブリダイゼーションにおいて、緊縮条件を、典型的には、フィルターを適当なハイブリダイゼーション条件下で核酸プローブとインキュベートした後にフィルターを洗浄する間に調整する。フィルターの洗浄の間に、非特異的若しくは不完全にハイブリダイズした核酸は、洗浄条件の緊縮度を高めるとフィルターから除去される。緊縮条件は、典型的には、塩濃度を変える（例えば、標準クエン酸ナトリウム緩衝液ＳＳＣの濃度を変える）ことにより及び／又は温度を変えることにより調整する。典型的低緊縮条件は、室温（例えば、約２２℃ ）で約２．０×ＳＳＣである。典型的高緊縮条件は、約５０〜６５℃で約０．２ ×ＳＳＣである。この発明の核酸は、シスプラチン耐性細胞株から単離することが出来る。かかる細胞株の一例は、ＨＡＣ２／０．４であり、これは、実施例１に記載のようにして生成した。他の適当な細胞株を、典型的には数週間から数か月の期間にわたって濃度を増大させるシスプラチンの存在下で非耐性細胞を段階的に選択することによって生成することが出来る。細胞のシスプラチン耐性の増倍度は、耐性細胞が由来した親細胞株と比較して評価する（例えば、耐性細胞株についてのシスプラチンのＩＣ₅₀対親細胞株のＩＣ₅₀）。この発明の核酸は、実施例１に詳細に記載のように、ディフェレンシャルｃＤＮＡライブラリースクリーニングによってシスプラチン耐性細胞株（例えば、ＨＡＣ２／０．４）から単離することが出来る。簡単に言えば、ＨＡＣ２／０．４細胞からの全ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築する。このライブラリーをプレートし、レプリカフィルターの２セットを標準法により調製する。次いで、フィルターの１セットを、ＨＡＣ２／０．４ｍＲＮＡから（例えば、実施例１に記載の「ショットガンＰＣＲ」法によって）調製したｃＤＮＡでスクリーニングし且つ他のフィルターのセットを、親ＨＡＣ２／Ｐ細胞株のｍＲＮＡから調製した等量のｃＤＮＡを用いてスクリーニングする。このライブラリーをスクリーニングするために用いるｃＤＮＡは、典型的には放射性標識を用いて標識する。標準的手順によりハイブリダイゼーション結果を可視化した後に、ＨＡＣ２／ＰｃＤＮＡと比較してＨＡＣ２／０．４ｃＤＮＡとの増大したハイブリダイゼーションを示すｃＤＮＡクローンをこのライブラリーから選択する。これらのｃＤＮＡは、ＨＡＣ２／Ｐ細胞と比較してＨＡＣ２／０．４において過剰発現されたｍＲＮＡから誘導される。ディフェレンシャルｃＤＮＡライブラリースクリーニング法の説明については、 King，C.R.等、J.Biol.Chem.254,6781(1979)；Van der Bliek，A.M.等、Mol.Cel1l.Biol.6,1671(1986)を参照されたい。この発明の核酸は又、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列に基づいて標準的分子生物学技術によっても単離することが出来る。例えば、SEQ ID NO:１の全部又は部分に対応するヌクレオチド配列を有する標識した核酸プローブを用いて、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが出来る。例えば、上記のようなシスプラチン耐性細胞株から作成したｃＤＮＡライブラリーを、SEQ ID NO:１の全部又は部分を含むプローブを用いてスクリーニングすることが出来る。或は、この発明の核酸を、その核酸をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて選択的に増幅することによって単離することが出来る。例えば、ｍＲＮＡをシスプラチン耐性細胞株から（例えば、Chirgwin等 (1979)Biochemistry，18，5294 -5299 のグアニジニウム−チオシアネート抽出手順によって）単離することが出来、逆転写酵素（例えば、メリーランド、Bethesda在、Gibco/BRL から入手可能なMolo ney MLV 逆転写酵素、又はフロリダ、St.Petersburg在、Seikagaku America，Inc．から入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を用いてｃＤＮＡを調製することが出来る。合成オリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲで用いるために、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列に基づいてデザインすることが出来る。この発明の核酸をｃＤＮＡ（或は、ゲノムＤＮＡ）から、これらのオリゴヌクレオチドプライマー及び標準ＰＣＲ増幅技術を用いて増幅することが出来る。そのように増幅した核酸を適当なベクター中にクローン化し、ＤＮＡ配列分析によって特性決定することが出来る。この発明のＲＮＡを、この発明のｃＤＮＡをそのｃＤＮＡの転写を与えてＲＮＡ分子を生成する適当なベクター中にクローン化することによって単離することが出来る。例えば、ｃＤＮＡをベクター中のバクテリオファージプロモーター例えばＴ７プロモーターの下流にクローン化することが出来、そのｃＤＮＡをＴ７ポリメラーセを用いてイン・ビトロで転写することが出来る。その結果生成したＲＮＡを標準的技術によって単離することが出来る。この発明の核酸、例えばオリゴヌクレオチドを、標準技術を用いて化学合成することも出来る。ペプチド合成と同様に市販のＤＮＡ合成装置において完全自動化された固相合成を含むポリデオキシヌクレオチドを化学合成する種々の方法が知られている（例えば、Itakura等、米国特許第４，５９８，０４９号；Caruthe rs 等、米国特許第４，４５８，０６６号；及びItakuta 、米国特許第４，４０１，７９６及び４，３７３，０７１号を参照されたい）。この発明の単離した核酸又はそのオリゴヌクレオチド断片は、当業者が、生物材料例えば腫瘍細胞試料中の相補的ヌクレオチド配列の検出において利用するためのヌクレオチドプローブを構築することを可能にする。かかる分子プローブを診断に用いてシスプラチン耐性腫瘍細胞を同定することが出来る。ヌクレオチドプローブを検出手段として適当なシグナルを与え且つ検出に有用であるために十分な半減期を有する放射性元素例えば³²Ｐ、³Ｈ、¹⁴Ｃ等で標識することが出来る。プローブを標識するのに用い得る他の物質には、特異的標識抗体によって認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識抗原に特異的な抗体及び化学発光性化合物が含まれる。適当な標識を、検出すべき核酸へのプローブのハイブリダイゼーション及び結合の速度並びにハイブリダイゼーションに利用可能なヌクレオチドの量に関して選択することが出来る。核酸プローブを用いて、例えば、慣用のドットブロット、ノーザンハイブリダイゼーション又はイン・シトゥー（in situ ）ハイブリダイゼーション手順において、生物試料例えば診断目的の腫瘍バイオプシーの細胞からの全細胞ＲＮＡ又はポリ（Ａ） ⁺ ＲＮＡ中のｍＲＮＡをプローブすることが出来る。更に、この発明の核酸のヌクレオチド配列に基づいてデザインしたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによって、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを増幅して細胞試料（例えば、腫瘍細胞試料）における核酸の発現を検出し且つ定量することが出来る。II．アンチセンス核酸この発明は又、細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与えることの出来る核酸に対してアンチセンスである核酸にも関係する。「アンチセンス」核酸は、「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列例えばワトソン−クリックの塩基対合の規則に従って形成された蛋白質をコードするｍＲＮＡ配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することが出来る。ｍＲＮＡの配列に相補的なアンチセンス配列は、ｍＲＮＡのコード領域中に見出される配列に相補的であってよく又はｍＲＮＡの５’若しくは３ ’非翻訳領域に相補的であってよい。SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列のコード領域は、ヌクレオチド１５９９〜１８４７を含む。好ましくは、アンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの開始コドンの前の領域若しくは開始コドンに及ぶ領域又は３’非翻訳領域中の領域に対して相補的である。アンチセンス核酸は、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列に基づいてデザインすることが出来る。示した核酸のコード領域又は非翻訳領域の配列に相補的な配列を有する核酸をデザインする。この発明のアンチセンス核酸を、当業者に公知の手順を用いる化学合成及び酵素的ライゲーション反応を利用して構築することが出来る。アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を、天然のヌクレオチド又は分子の生物学的安定性を増大し若しくはアンチセンス及びセンス核酸の間で形成される二本鎖の物理的安定性を増大するようにデザインした様々な改変ヌクレオチドを用いて化学合成することが出来、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを用いることが出来る。或は、核酸をアンチセンス配置（即ち、挿入した核酸から転写されるＲＮＡが、興味のある標的核酸に対してアンチセンス配置になる）で内部にサブクローン化した発現ベクターを用いて、アンチセンス核酸を生物学的に生成することが出来る。アンチセンス発現ベクターは、高効率の制御領域の制御下でアンチセンス核酸が生成される組換えプラスミッド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの形態であってよい（その能力は、ベクターを導入した細胞型によって測定することが出来る）。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の制御の検討は、Weintraub，H．等、Antisens e RNA as a molecular tool for genetic analysis，Reviews- Trends in Genet ics，Vol.1(1) 1986 を参照されたい。この発明のアンチセンス核酸は、細胞にシスプラチン耐性を与える蛋白質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の発現を阻止し、それによりその蛋白質の発現を減少させるのに有用である。かかる蛋白質の発現を減らすことは、アンチセンス核酸を導入した細胞のシスプラチン耐性を阻止し又は逆転させるための手段として利用することが出来る。アンチセンス核酸を、培養においてシスプラチン耐性細胞に導入してこの発明の蛋白質の発現を阻止することが出来る。１種以上のアンチセンス核酸例えばオリゴヌクレオチドを培養培地中の細胞に典型的には約２００μｇ／ｍｌで加えることが出来る。この発明の蛋白質の発現が阻止された培養シスプラチン耐性細胞は、シスプラチン耐性の阻止された細胞に対する潜在的治療剤の効力を試験するのに有用である。この発明のアンチセンス核酸又はそのオリゴヌクレオチドは又、遺伝子治療において患者におけるシスプラチン耐性を逆転させ又は阻止するために利用することも出来る。例えば、アンチセンス配列を用いてシスプラチン耐性の悪性細胞を化学療法剤に感受性にすることが出来る。アンチセンス核酸の患者への投与は、アンチセンス核酸がアンチセンスＲＮＡの連続的産生を与える組換え発現ベクター中に含まれるときに最も効果的であり得る。アンチセンス核酸又はそのオリゴヌクレオチドを含む組換え体分子を、送達用ビヒクル例えばリポソーム、レトロウイルスベクター若しくはアデノウイルスベクターを用いてイン・ビボで直接組織中に導入することが出来る。患者中の関心のある細胞（例えば、シスプラチン耐性腫瘍細胞）を標的とすることの出来る送達用ビヒクルを選択することが出来る。一具体例において、この発明のアンチセンス核酸は、SEQ ID NO:１の核酸と結合するが、ミトコンドリアＤＮＡとは結合しない。ｃＤＮＡ６２とミトコンドリアＤＮＡ（この２つの配列を図６において比較する）間のヌクレオチド配列不同の範囲に及ぶアンチセンス核酸、例えばオリゴヌクレオチドをデザインすることが出来る。従って、このアンチセンス核酸は、配列においてｃＤＮＡ６２に対応する核酸とミトコンドリア核酸とを識別することが出来る。かかるアンチセンス核酸は、細胞においてミトコンドリアのＮＤ１蛋白質の機能を混乱させずにシスプラチン耐性を阻止するのに有用であり得る。他の具体例において、この発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補性領域を有する一本鎖核酸例えばｍＲＮＡを開裂することの出来るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。シスプラチン耐性を与えるこの発明の核酸に対する特異性を有するリボザイムを、この発明の核酸のヌクレオチド配列に基づいてデザインすることが出来る。例えば、活性部位の塩基配列がシスプラチン耐性決定ｍＲＮＡ中の開裂されるべき塩基配列に相補的なテトラヒメナＬ−１９ＩＶＳＲＮＡの誘導体を構築することが出来る。例えば、Cech等、米国特許第４，９８７，０７１号及びCech等、米国特許第５，１１６，７４２号を参照されたい。或は、この発明の核酸を用いて、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択することが出来る。例えば、Bartel，D.及びSzostak,J.W.(1993) Scien ce 261,1411-1418を参照されたい。III．組換え発現ベクターこの発明の核酸を、公知の方法で、宿主における核酸の十分な発現を確実にする組換え発現ベクターに取込ませることが出来る。この発明の組換え発現ベクターは、この発明の核酸を「その核酸の宿主細胞における発現に適した」形態で含み、これは、これらの組換え発現ベクターが、発現のために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の制御配列をその核酸に機能的に結合して含むことを意味する。機能的に結合してとは、核酸がその核酸のＲＮＡへの転写を与える様式で制御配列に結合されることを意味することを意図する。従って、組換え発現ベクターを用いて、宿主細胞においてＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を発現させることが出来、一層典型的には、宿主細胞においてそのＲＮＡによりコードされる蛋白質を発現するために用いられる。用語「制御配列」は、当分野で認められており、プロモーター、エンハンサー及び他の制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。かかる制御配列は、当業者に公知であり、Goeddel，GeneExpression Technology: Methods in Enz ymology 185，Academic Press，カリフォルニア、San Diego（1990）に記載されている。発現ベクターのデザインがトランスフェクトされるべき宿主細胞の選択及び／又は発現させることを望む蛋白質の型等の因子に依存し得ることは理解されるベきである。かかる発現ベクターを用いて、細胞をトランスフェクトし、それにより、この発明の核酸によりコードされる蛋白質若しくはペプチドを生成し又はアンチセンス核酸を生成することが出来る。この発明の組換え発現ベクターを、原核生物又は真核生物細胞中でのコードされた蛋白質の発現用にデザインすることが出来る。例えば、蛋白質を大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス使用）、酵母細胞又は哺乳動物細胞において発現させることが出来る。他の適当な宿主細胞は、Goeddel，Gene Expressi on Technology: Methods in Enzymology 185，Academic Press，カリフォルニア、San D iego (1990)中に見出すことが出来る。原核生物中の蛋白質の発現は、最もしばしば大腸菌において、融合若しくは非融合蛋白質の何れかを指示する構成的若しくは誘導可能なプロモーターを含むベクターを用いて行なわれる。融合ベクターは、それらの中にコードする蛋白質に幾つかのアミノ酸を、通常組換え蛋白質のアミノ末端に加える。かかる融合ベクターは、典型的には、次の３つの目的に役立つ：１）組換え蛋白質の発現を増大させる；２）組換え蛋白質の溶解度を増大させる；及び３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換え蛋白質の精製を助成する。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合部位と組換え蛋白質との接合点に蛋白質分解による開裂部位を導入して融合蛋白質の精製後に組換え蛋白質を融合部位から分離することを可能にする。かかる酵素及びそれらの同起源の認識配列には、Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトースＥ結合蛋白質又はプロテインＡを標的組換え蛋白質に融合させるｐＧＥＸ（オーストラリア国、Melbourne 在、Amrad Corp．）、ｐＭＡＬ（マサチューセッツ、Beverly 在、 New England Biolabs ）及びｐＲＩＴ５（ニュージャージー、Piscataway在、Pharmacia ）が含まれる。誘導可能な非融合発現ベクターには、ｐＴｒｃ（Amann等（1988）Gene 69:301-315 ）及びｐＥＴシリーズのベクター（Studier 等、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185，Academic Pre ss，カリフォルニア、San Diego（1990）60-89）が含まれる。ｐＴｒｃにおいて、標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｃ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主のＲＮＡポリメラーゼによる転写に依存する。ｐＥＴベクターにおいては、挿入された標的遺伝子の発現は、同時発現されるウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎｌ）により媒介されるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ０融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により、Ｔ７ｇｎｌを有する常在性λファージから、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下で供給される。大腸菌における組換え蛋白質の発現を最大にする１つの戦略は、その蛋白質を組換え蛋白質を蛋白質分解により開裂する能力の欠損した宿主細菌において発現させることである（Gottesman，S.，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185，Academic Press，カリフォルニア、San Diego（1990）119-128）。他の戦略は、発現ベクターに挿入すべき核酸の核酸配列を変えて各アミノ酸に対する個々のコドンを高度に発現される大陽菌蛋白質において優先的に用いられているものにすることである（Wada等（1992）Nuc.Acids Res.20:2111- 2118）。この発明の核酸配列のかかる変更は、標準的ＤＮＡ合成技術により行なうことが出来る。酵母S.cerivisae における発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Baldari 等、(1987)Embo J.6:229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan及びHerskowitz(1 982)Cell 30:933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz 等(1987)Gene 54:113-123 ）及びｐＹＥＳ２（カリフォルニア、SanDiego在、Invitrogen Corporation）が含まれる。培養昆虫細胞（ＳＦ９細胞）における蛋白質の発現のための利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Smith 等、(1983)Mol.Cell Biol．3 :2156-2165）及びｐＶＬシリーズ（Lucklow,V.A.及びSummers,M.D.(1989)Virolo gy 170:31-39）が含まれる。この発明の核酸の哺乳動物細胞における発現は、哺乳動物用発現ベクターを用いて達成される。哺乳動物用発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Seed,B.(1987 )Nature 329:840）及びｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman 等(1987)EMBO J.6:187-195）が含まれる。哺乳動物細胞中で用いる場合に、これらの発現ベクターの制御機能はしばしばウイルス性物質により与えられる。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロイウルス及び最も頻繁にシミアンウイルス４０から導かれる。一具体例において、ＰＭＡＭｎｅｏ発現ベクター（Clontechより市販されている）を用いる。ＰＭＡＮｎｅｏベクターにおいては、そのベクターに導入された核酸は、ＭＭＴＶＬＴＲ及びＳＶ４０からのポリアデニル化シグナルの制御下にある。更に、ネオマイシン耐性を与える遺伝子がこのベクターによりコードされている。他の具体例において、組換え発現ベクターは、特定の細胞型における核酸の発現を優先的に指示することが出来る。これは、発現ベクターの制御機能が、ベクターに含まれる核酸の特定の細胞型における優先的発現を与える制御配列により与えられ、それにより、コードされる蛋白質の組織又は細胞型特異的な発現を与えることを意味する。組織特異的な制御要素は当分野において公知である。この発明の組換え発現ベクターは、プラスミッドであってよい。更に、この発明の組換え発現ベクターは、ウイルス性核酸中に導入された核酸の発現を与えるウイルス又はその部分であってよい。例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスを用いることが出来る。この発明は、更に、発現ベクター中にアンチセンス配置でクローン化されたこの発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子の転写により、この発明の核酸例えばSEQID NO:１のヌクレオチド配列を含む核酸に対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を与える様式で制御配列に機能的に結合される。様々な細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンス核酸に機能的に結合された制御配列例えばウイルス性プロモーター及び／又はエンハンサーを選択することが出来、或は、上記のように、組織又は細胞型特異的なアンチセンスＲＮＡの発現を指示する制御配列を選択することが出来る。IV．宿主細胞この発明の組換え発現ベクターを細胞に導入することが出来、それにより、この発明の「宿主細胞」を創ることが出来る。用語「宿主細胞」は、この発明の組換え発現ベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトした原核及び真核細胞を含むことを意図する。「でトランスフォームした」、「でトランスフェクトした」、「トランスフォーメーション」及び「トランスフェクション」は、当分野で公知の多くの技術の１つによって核酸（例えば、ベクター）を細胞に導入することを含むことを意図する。原核細胞を、例えばエレクトロポレーション又は塩化カルシウム媒介のトランスフォーメーションにより核酸でトランスフォームすることが出来る。核酸を、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクション等の従来技術によって哺乳動物細胞に導入することが出来る。宿主細胞をトランスフォームし及びトランスフェクトするための適当な方法は、Sambrook等（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版、Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)）及び他の実験書中に見出すことが出来る。上記のような技術によりこの発明の組換え発現ベクターでトランスフォームされる宿主細胞の数は、用いた組換え発現ベクターの型及び用いたトランスフォーメーション技術の型に依存する。哺乳動物細胞に導入されたプラスミッドベクターは、典型的には、低い頻度でのみ宿主細胞のＤＮＡにインテグレートされる。これらのインテグラントを同定するために、一般に選択可能マーカー（即ち、抗生物質に対する耐性）を含む遺伝子を関心ある遺伝子と共に宿主細胞中に導入する。好適な選択可能マーカーには、ある種の薬剤、例えばＧ４１８及びヒグロマイシンに対する耐性を与えるものが含まれる。選択可能マーカーは、関心ある核酸とは別個のプラスミッドに導入することが出来、一層好ましくは、同じプラスミッドに導入する。この発明の核酸及び選択可能マーカーの遺伝子を含む１つ以上の組換え発現ベクターでトランスフォームした宿主細胞を、選択可能マーカーを用いて細胞を選択することにより同定することが出来る。例えば、選択可能マーカーがネオマイシン耐性を与える遺伝子（実施例で用いるプラスミッドｐＭＡＭｎｅｏに含まれるもの等）をコードするならば、トランスフォーマント宿主細胞をＧ４１８で選択することが出来る。選択可能マーカー遺伝子を取込んだ細胞は生存し、他方、その他の細胞は死ぬ。実施例に示したように、この発明の核酸は、感受性細胞にトランスフェクトした際に、その細胞に重金属（例えば、シスプラチン、カドミウム及び銅）耐性を与えるとが出来る。従って、この発明の宿主細胞を調製する場合には、独立の選択可能マーカー（ネオマイシン耐性等）を用いずに、重金属を選択剤として利用することが可能である。それ故に、この発明の核酸を、その核酸を導入した細胞の選択可能マーカーとして用いることが出来る。例えば、ｍｄｒ１遺伝子の選択可能マーカーとしての利用を記載した米国特許第５，１６６，０５９号及びCroop 等、米国特許第５，１９８，３４４号を参照されたい。細胞は、１種以上の重金属にさらすことにより選択される。例えば、この発明の核酸（例えば、組換え発現ベクター中）を、関心ある遺伝子を含む第２の核酸と共に細胞に導入する（別個のベクターで又は一層好ましくは同じベクターで）。次いで、トランスフォーマント宿主細胞を、それらの獲得した重金属耐性に基づいて選択する。選択された重金属耐性細胞は、通常関心ある遺伝子と同時インテグレートされたこの発明の核酸を含む。更に、細胞の選択において用いる重金属の濃度を徐々に増すことによって、導入された核酸の一層高いコピー数を有するトランスフォーマントを得ることが可能である（この発明の核酸及び関心ある遺伝子の両方を含む）。それ故、この発明の核酸は又、増幅可能マーカーとしても有用である。この発明の宿主細胞を用いてこの発明の核酸によりコードされた単離された蛋白質、即ち、細胞にシスプラチン耐性を与える蛋白質を調製することが出来る。従って、この発明は、細胞にシスプラチン耐性を与える単離された蛋白質を調製する方法を提供する。この方法は、この発明の宿主細胞を適当な培地中で、細胞にシスプラチン耐性を与える蛋白質が形成されるまで培養し、次いで、その蛋白質を単離することを含む。宿主細胞を培養するための適当な培地は、当分野において公知である。例えば、必要な添加物例えば血清、アミノ酸、緩衝剤、抗生物質等を補ったＲＰＭＩ−１６４０又はＤＭＥＭ。蛋白質を、その蛋白質を発現している宿主細胞から、硫安沈澱及び分画カラムクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等）を含む当分野の標準的手順によって単離することが出来る。一般には、「酵素精製及び関連技術」Mehods in Enzymology，22，233-577(1971)を参照されたい。Ｖ．単離された蛋白質この発明は、細胞内で発現されるとその細胞に高レベルのシスプラチン耐性を与えることの出来る単離された蛋白質を提供する。この発明の目的のために、高レベルのシスプラチン耐性とは、シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を意味することを意図する。一層好ましくは、この耐性の増加は、少なくとも１０倍である。更に一層好ましくは、この耐性の増加は少なくとも１５倍である。この発明の蛋白質は、更に、それが発現された細胞に、カドミウム感受性細胞と比較してカドミウム耐性を与えることが出来る。好ましくは、このカドミウム耐性の増加は、少なくとも３倍、一層好ましくは少なくとも５倍、更に一層好ましくは８倍である。この発明の蛋白質は、更に、それが発現された細胞に、銅感受性細胞と比較して銅耐性を与えることも出来る。好ましくはこの銅耐性の増加は、少なくとも２倍、一層好ましくは少なくとも３倍、更に一層好ましくは４倍である。「単離された」蛋白質とは、組換えＤＮＡ技術により生成した場合には細胞性物質又は培養培地を実質的に含まず、或は、化学合成した場合には化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まない蛋白質をいう。好適具体例において、この発明の蛋白質は、SEQID NO:２に示したアミノ酸配列を含む。高レベルのシスプラチン耐性を細胞に与えることが出来且つ核ＤＮＡ中に存在するヌクレオチド配列によりコードされる他の蛋白質も又、この発明により包含される。他の具体例において、この発明の蛋白質は、SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列と実質的に類似するアミノ酸配列を含む。上記の第Ｉ節でこの発明の核酸について記載したように、「実質的に類似する」アミノ酸配列とは、 SEQ ID NO:２に開示した配列と僅かの又は取るに足りない配列変化を有するアミノ酸配列を含むことを意図する。即ち、相同な蛋白質は、SEQ ID NO:２を含む蛋白質と実質的に同じ様式で機能する（例えば、その蛋白質が発現される細胞に少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を与えることが出来る）。更に他の具体例において、この発明の蛋白質は、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列を有する第２の核酸と高緊縮又は低緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる。他の具体例において、この発明の蛋白質は、SEQ ID NO0:２に示したアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする第２の核酸と高緊縮又は低緊縮条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされる。一具体例において、この発明の蛋白質は、免疫原性である。この発明の蛋白質の免疫原性部分も又、この発明の範囲内にある。免疫原性部分は、典型的には、蛋白質の表面に露出した蛋白質領域、例えば親水性領域を包含する。SEQ ID NO: ２の蛋白質の疎水性を分析して図７にグラフ化してプロットしてある。この分析は、３つの親水性ストレッチ：アミノ酸１９〜２３、アミノ酸２７〜３３及びアミノ酸５２〜６０を示している。従って、これらの親水性領域を包含するペプチドが免疫原性であることはありそうなことであり、この発明に包含される。この発明の蛋白質は、適当な宿主細胞における発現により当分野で公知の技術を用いて単離することが出来る。適当な宿主細胞には、原核又は真核の微生物若しくは細胞株、例えば酵母、大腸菌及び昆虫細胞が含まれる。上記のこの発明の組換え発現ベクターを用いて、上記のようにこの発明の蛋白質を単離するために、宿主細胞中でその蛋白質を発現させることが出来る。或は、この蛋白質若しくはその部分を、蛋白質化学において周知の技術、例えば固相合成（Merrifield(1964)J.Am.Chem.Assoc.85:2149-2154）又は均質溶液中での合成（Houbenweyl(1987)Methods of Organic Chemistry， E.Wansch編、15巻Ｉ及びII、Thieme，Stuttgart）を用いて、化学合成により調製することが出来る。VI．抗体この発明の蛋白質又はその部分を用いて、これらの蛋白質に結合する抗体を調製することが出来る。抗体という用語は、ここで用いる場合、すべての抗体及びこの発明の蛋白質又はそのペプチドとやはり特異的に反応する抗体の断片を含むことを意図する。抗体は、従来技術を用いて断片化することが出来る。例えば、Ｆ(ab')₂断片を、抗体をペプシンで処理することにより生成することが出来る。その結果生成したＦ(ab')₂断片を処理して、ジスルフィド橋を還元してＦab’断片を生成することが出来る。従来の方法を用いて抗体（ポリクローナル又はモノクローナル抗体）を調製することが出来る。例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ハムスター又はラット）を、哺乳動物において抗体応答を誘発する蛋白質又はペプチドの免疫原形態を用いて免疫化することが出来る。蛋白質又はペプチドに免疫原性を与えるための技術には、キャリアーへの結合又は他の当分野で周知の技術が含まれる。例えば、蛋白質又はペプチドを、アジュバントの存在下で投与することが出来る。免疫化の進行を、血漿又は血清中の抗体力価の検出により監視することが出来る。この免疫原を抗原として使用して標準的ＥＬＩＳＡ又は他のイムノアッセイを用いて抗体レベルを評価することが出来る。免疫化の後に、抗血清を得ることが出来、もし所望であればその血清からポリクローナル抗体を単離することが出来る。モノクローナル抗体を生成するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から採取し、標準的体細胞融合手順によってミエローマ細胞と融合してこれらの細胞を不滅化してハイブリドーマ細胞を産出することが出来る。かかる技術は、当分野で周知である。例えば、Kohler及びMilstein（Nature(1975)256:495-49 7）により最初に開発されたハイブリドーマ技術、並びに、他の技術、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor等（1983）Immunol.Today 4:72）及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole等 Mo noclonal Antibodies in Cancer Therapy(1985)Allen R.Bliss,Inc.，77-96頁）。ハイブリドーマ細胞を、蛋白質又はペプチドと特異的に反応する抗体の産生について免疫化学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することが出来る。この発明の蛋白質又はそのペプチドに対して反応性の特異的抗体若しくは抗体断片を生成する他の方法は、免疫グロブリン遺伝子又はその部分（細菌において発現される）をコードする発現ライブラリーをこの発明の蛋白質又はペプチドでスクリーニングすることである。例えば、完全なＦab断片、ＶＨ領域及びＦＶ領域を、ファージ発現ライブラリーを用いて細菌中で発現させることが出来る。例えば、Ward等 (1989)Nature 345:544-546;Huse等(1989)Science 246:1275-1281及びMcCafferty 等(1990)Nature 348:552-554 を参照されたい。或は、ＳＣＩＤ−ｈｕマウスを用いて抗体又はその断片を生成することが出来る。非ヒト患者において生成した抗体をヒトの治療に用いる場合、それらは様々な程度で外来として認識され、免疫応答が患者内で生じ得る。この問題を最小化し又は排除するための一つのアプローチは、全般的免疫抑制に好適なものであるが、キメラ抗体誘導体即ち非ヒト動物可変領域とヒト定常領域を結合した抗体分子を生成することである。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラットその他の種の抗体からの抗原結合ドメインとヒト定常領域を含む。キメラ抗体を作成するための様々なアプローチが記載されており、それらを利用してこの発明の蛋白質に結合する免疫グロブリン可変領域を含むキメラ抗体を作成することが出来る。例えば、Morrison等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851; Takeda等(1985)Na ture 314:452; Cabilly 等、米国特許第４，８１６，５６７； Boss等、米国特許第４，８１６，３９７；Tanaguchi 等、欧州特許出願ＥＰ１７１４９６；英国特許ＧＢ２１７７０９６Ｂを参照されたい。かかるキメラ抗体は、対応する非キメラ抗体よりもヒトにおいて低免疫原性であることが予想される。ヒトの治療目的のために、更に、この発明のモノクローナル抗体又はキメラ抗体を、ヒト可変領域キメラを生成することによりヒト化することが出来、可変領域の部分、特に抗原結合ドメインの保存されたフレームワーク領域をヒト起源とし、超可変領域のみを非ヒト起源とすることが出来る。かかる改変免疫グロブリン分子は、当分野で公知の幾つかの技術（例えば、Teng等(1983)Proc.Natl.Acad .Sci.U.S.A.,80:7308-7312; Kozbor等、(1983)Immunology Today,4:7279; Olsso n等(1982)Meth.Enzymol.,92:3-16 ）によって作成することが出来るが、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０６１９３又はＥＰＯ２３９４００の教示によって作成するのが好ましい。ヒト化抗体を、例えば、英国、ミドルセックス、Twickenham，HollyRoad在、 Scotgen Limitedによって商業的に生成することが出来る。免疫原性を減じたヒト化抗体は、ヒト患者における免疫療法に好適である。ヒト化抗体を用いる免疫療法は、恐らく、任意の付随した免疫抑制の必要性を減じるであろうし、慢性病状態又は反復抗体治療を必要とする状態の治療について増大した長期の効力を生じ得る。この発明のポリクローナル又はモノクローナル抗体を検出可能な物質とカップルさせることが出来る。「カップルさせる」という語は、検出可能な物質を物理的に抗体に結合させることを意味することを意図する。適当な検出可能な物質には、種々の酵素、置換基、蛍光物質、発光物質及び放射性物質が含まれる。適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーセ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適当な置換基複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ、適当な蛍光物質の例には、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、適当な放射性物質の例には ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ又は ³Ｈが含まれる。この発明の抗体は又、毒性又は治療活性を有する物質にカップルさせることも出来る。毒性を有する物質の例には放射性核種及び毒素例えばジフテリア毒素及びリシン又はその弱毒化誘導体が含まれる。毒性物質なる語には、細胞毒性細胞例えばマクロファージ、好中球、エオシン好性細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞及び大型顆粒リンパ球も含むことを意図する。抗体を細胞毒性細胞上のＦｃレセプターにより細胞毒性細胞にカップルさせることが出来ることは認められよう。治療活性を有する物質の例は、メトトレキセート等の化学療法剤である。本発明は、熟練者に、この発明の蛋白質に結合する二特異性抗体及び４量体抗体複合体を製造することを可能にする。二特異性抗体は、ハイブリッドハイブリドーマを形成することによって製造することが出来る。ハイブリッドハイブリドーマは、Staerz及びBevan（Proc.Natl．Acad．Sci．USA(1986)83:1453及びImmunologyT oday(1986)7:241 ）に開示されたような当分野で公知の手順を用いて調製することが出来る。一般に、ハイブリッドハイブリドーマは、この発明の蛋白質に結合することの出来る第１のモノクローナル抗体を産生する第１の細胞株と検出可能な物質又は毒性若しくは治療活性を有する物質に結合し得る第２のモノクローナル抗体を産生する第２の細胞株とを融合させることによって形成される。二特異性抗体は又、Staerz等（Nature(1985)314:628 ）及びPerez 等（Nature(1985)31 6:354）により開示されたような手順を用いる化学的手段によって構築することも出来る。４量体抗体複合体は、この発明の蛋白質に結合し得る第１のモノクローナル抗体及び検出可能な物質又は毒性若しくは治療活性を有する物質に結合し得る第２のモノクローナル抗体を調製することによって製造することが出来る。第１及び第２の抗体は、第１の動物種からのものである。第１及び第２の抗体を、ほぼ等モル量の第２の動物種の抗体又はそのＦａｂ断片（これらは、第１の動物種の抗体のＰｃ断片に対するものである）と反応させる。次いで、形成された４量体を単離する（４量体抗体複合体の製造方法の説明は、Lansdorpの米国特許第４，８６８，１０９を参照されたい）。前に論じたように、SEQ ID NO:２の蛋白質は、ミトコンドリアＮＤ１蛋白質の最初の８３アミノ酸に対応する。一具体例において、この発明の抗体は、ミトコンドリアＮＤ１蛋白質に結合しない（即ち、この抗体は、SEQ ID NO:２の蛋白質とミトコンドリアＮＤ１蛋白質とを識別することが出来る）。例えば、SEQ ID N O:２の蛋白質のＣ末端のユニークなコンホメーション（ＮＤ１蛋白質中には見出されない）を認識する抗体（例えば、モノクローナル抗体）を、標準的技術により生成し、SEQID NO:２の蛋白質には結合し得るがＮＤ１蛋白質には結合し得ないその能力によって選択することが出来る。この発明の蛋白質に結合するこの発明の抗体（モノクローナル抗体、二特異性抗体及び４量体抗体複合体を含む）を、シスプラチン耐性腫瘍を有する患者に投与して、例えばその腫瘍を検出し又は治療することが出来る（例えば、抗体を毒性又は治療活性物質にカップルさせた場合）。従って、この発明は、この発明の抗体及び製薬上許容し得るキャリアーを含む製薬組成物を提供する。用語「製薬上許容し得るキャリアー」とは、ここで用いる場合、希釈剤例えば塩溶液及び緩衝剤水溶液を含むことを意図する。製薬上許容し得るキャリアーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）を含む溶剤又は分散媒、又はそれらの適当な混合物であってよい。注射用途に適した製薬組成物には、無菌水溶液（水溶性の場合）又は分散及び無菌注射溶液又は分散を即座に調製するための無菌粉末が含まれる。抗体を非経口投与以外によって投与するためには、抗体をその不活性化を防ぐ物質で被覆するか又は該物質と同時投与する必要がある。酵素阻害剤には、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート及びトラシロールが含まれる。通常の貯蔵及び使用条件下において、これらの調製物は、微生物の成育を防ぐために防腐剤を含むことが出来る。VII．トランスジェニック動物及び相同組換え動物この発明の核酸を用いて、トランスジェニック動物又は相同組換え動物を生成することが出来、それらは又、治療上有用な試薬のスクリーニングにおいて有用である。トランスジェニック動物は、その動物又はその動物の先祖に、出生前例えば胎児期に導入されたトランスジーンを含む細胞を有する動物である。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中にインテグレートされ且つ成熟動物のゲノム中に維持されて、それにより、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型又は組織においてコードされた遺伝子生成物の発現を指示するＤＮＡである。従って、一具体例において、この発明は、細胞にシスプラチン耐性を与える核酸を発現するようにトランスフェクトされた細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する。好ましくは、非ヒト動物は、限定はしないが、マウスである。トランスジェニック動物は、例えば、蛋白質をコードする核酸を、受精した卵母細胞の雄性前核に、例えばマイクロインジェクションによって導入し（典型的には、適当な制御要素例えばエンハンサーにリンクさせる）、その卵母細胞を偽妊娠の雌養育動物中で発生させることによって創ることが出来る。例えば、シスプラチン耐性を与える核酸を発現するトランスジェニック動物（例えば、マウス）を、SEQ ID NO:１に示した単離した核酸を用いて作成することが出来る。イントロンの配列及びポリアデニル化シグナルをもトランスジーン中に含ませて、そのトランスジーンの発現効率を増大させることが出来る。これらの単離した核酸を、一種以上の特定の細胞型において、コードされた蛋白質の発現を指示する制御配列に結合させることが出来る。トランスジェニック動物（特に、マウス等の動物）を生成する方法は、当分野において慣用的となっており、例えば、米国特許第４，７３６，８６６及び４，８７０，００９及びHogan,B 等、(1986)A Laboratory Manual，（ニューヨーク、Cold Spring Harbor在、Cold Spring Harbor研究所）に記載されている。トランスジェニック創出動物を用いて、トランスジーンを有する更なる動物を繁殖させることが出来る。この発明のトランスジェニック動物を用いて、シスプラチン耐性の分子的基礎を研究することが出来る。この発明のトランスジェニック動物を用いて、シスプラチン耐性の発生を阻止し、遅延させ又は逆転させる能力について物質を試験することが出来る。トランスジェニック動物を、未処理の対照用トランスジェニック動物と並行してその物質で処理することが出来る。この発明のトランスジェニック動物からの細胞を、標準的組織培養技術を用いて培養することが出来る。特に、この発明の組換え分子を有する細胞を培養して、シスプラチン耐性を阻止し、遅延させ又は逆転させる能力について物質を試験するのに利用することが出来る。この発明の単離した核酸を用いて、更に、非ヒト相同動物を創ることが出来る。用語「相同組換え動物」とは、ここで用いる場合、相同組換えにより修飾された遺伝子を含む動物を記述することを意図している。相同組換え事象は、完全に遺伝子を混乱させて、機能的遺伝子生成物はもはや生成し得ない（しばしば、「ノックアウト」動物と呼ばれる）か、又は相同組換え事象は、遺伝子を修飾して、未だ機能的であるが、改変された遺伝子生成物を生成する。従って、相同組換えを用いて、改変されたシスプラチン耐性決定遺伝子を欠くか又は含む動物を生成することが出来る。好ましくは、非ヒト動物はマウスである。例えば、この発明の単離した核酸を用いで、シスプラチン耐性決定遺伝子において組換え事象が起きた相同組換えマウスを創ることが出来る。一具体例において、この発明は、 SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列を含む改変された遺伝子を有する細胞を含む非ヒト相同組換え動物を提供する。相同組換えされた核酸を有する動物を創るために、内在性フランキングＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ配列により隣接される内在性ＤＮＡ配列に置き換わるべきＤＮＡ配列を含むベクターを製造する（例えば、Thomas,K.S．及びCapecchi,M.R.( 1987)Cell 51:503を参照されたい）。このベクターを胎児幹細胞株に導入し（例えば、エレクトロポレーションによる）、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同組換えされた細胞を選択する（例えば、Li,E．等(1992)Cell 69:915 を参照されたい）。次いで、選択した細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入して、凝集キメラを形成する（例えば、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Ce lls,E.J.Rovertson 編、(IRL,Oxford,1987)中のBradley,A.，A Practical Appro ach,113-152頁を参照されたい）。次いで、キメラ胎児を適当な偽妊娠の雌養育動物中に移植し、分娩日まで育てることが出来る。この相同組換えＤＮＡを生殖細胞中に有する子孫を用いて、すべての細胞がこの相同組換えＤＮＡを含む動物を繁殖させることが出来る。VIII．発明の方法この発明の一つの面は、細胞のシスプラチン耐性を阻止する方法に関係する。例えば、この方法を用いて、問題の腫瘍細胞のシスプラチン耐性を阻止し、それによりこの腫瘍細胞に対するシスプラチンの治療効果を増大させることが出来る。従って、シスプラチン耐性を阻止する好適細胞型は、腫瘍細胞である。特に、シスプラチン耐性を示す固形腫瘍、例えば、卵巣、精巣並びに頭部及び頚部の腫瘍を、この方法の適用の標的細胞とすることが出来る。この方法は、シスプラチン感受性細胞と比較して好ましくは少なくとも５倍、１０倍又は１５倍のシスプラチン耐性を細胞に与える細胞により発現された蛋白質の活性を阻害する薬剤と細胞を接触させることを含む。好ましくは、細胞にシスプラチン耐性を与えるこの蛋白質は、SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列又は実質的にそれと類似のアミノ酸配列を含む。或は、この蛋白質は、この発明の蛋白質の他の具体例を構成することが出来る（第Ｖ節に記載の通りである）。 SEQ ID NO:２の蛋白質は、アミノ酸配列において、ミトコンドリアＮＤ１蛋白質のＮ末端８３アミノ酸に対応しているので、ＮＤ１蛋白質がシスプラチン耐性に関与し得ると予想するのは妥当なことである。従って、他の具体例において、この活性が阻害される蛋白質は、ミトコンドリアＮＤ１蛋白質である。用語「ミトコンドリアＮＤ１蛋白質」とは、ミトコンドリアＤＮＡ中にコードされ且つＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ複合体の成分である蛋白質を記述することを意図している。ヒトＮＤ１蛋白質のアミノ酸配列は、Anderson，S. 等(1981)Nature 290:457-465 に開示されている。他の種からのＮＤ１蛋白質のアミノ酸配列は、Bibb,M.J．等(1981)Cell 26:167-180（マウス）；Anderson,S ．等(1982)J.Mo1lBiol.156:683-717(ウシ)；Roe,B.A．等(1985)J.Biol.Chem.260 :9759-9774（アフリカツメガエル）；及びJacobs,H.T．等(1988)J.Mol.Biol.202 :185-217（ウニ）に開示されている。この方法の一具体例において、この蛋白質の活性を阻害する薬剤は、この蛋白質をコードする核酸にアンチセンスである核酸である。このアンチセンス核酸を細胞中に導入して、この蛋白質の活性を阻害する（第II節で一層詳細に説明）。アンチセンス核酸は、この蛋白質をコードするｍＲＮＡの翻訳を邪魔することにより細胞におけるこの蛋白質の発現を阻害することが出来る。或は、この蛋白質をコードするｍＲＮＡを開裂するリボザイムを用いてこの蛋白質の産生を阻止することが出来る。他の具体例において、この蛋白質の活性を阻害する薬剤は、この蛋白質に結合する分子である。好適分子は、抗体又はその断片である。分子（例えば、抗体）は、この蛋白質に結合して、この蛋白質の機能を邪魔する。この蛋白質に結合する分子（例えば、抗体）を、毒性又は治療活性を有する物質とカップルさせることが出来る。「毒性又は治療活性を有する物質」なる語は、ここで用いる場合、その作用が細胞を破壊し得る分子例えば放射性同位体、毒素（例えば、ジフテリア毒素又はリシン）又は化学療法剤、並びにその作用が他の細胞を破壊し得る細胞例えば細胞毒性細胞を含むことを意図する。シスプラチン耐性細胞に結合する分子は、毒性又は治療活性を有する物質に直接カップルさせることが出来（例えば、リシン結合したモノクローナル抗体）、或は、その物質に間接的に結合させることが出来る。例えば、腫瘍細胞と細胞毒性細胞とを架橋させることの出来る二特異性抗体を使用し、それにより、その腫瘍細胞の溶解を促進することが出来る。二特異性抗体は、細胞毒性細胞のＦｃレセプターに結合することにより腫瘍細胞と細胞毒性細胞とを架橋することが出来る。更に別の具体例において、細胞のシスプラチン耐性を阻止する薬剤は、この蛋白質の活性を阻害する低分子例えば薬物である。シスプラチン耐性を阻止する低分子を、この発明により提供されるようなスクリーニングアッセイにより同定することが出来、又、合理的薬物デザインの原理に基づいて創ることが出来、例えば、この発明の蛋白質の活性を阻害し得る分子をこの蛋白質の構造に基づいてデザインすることが出来る。この細胞のシスプラチン耐性を阻止する方法を、患者にイン・ビボで用いることが出来る。用語「患者」とは、ヒト及び他の哺乳動物例えばサル、イヌ、ネコ、ラット、ウサギ、マウス及びこれらのトランスジェニック種を含むことを意図する。例えば、アンチセンス核酸を、この分野でイン・ビボ遺伝子治療において用いられている技術により、例えばレトロウイルス若しくはアデノウイルスベクター、リポソームカプセル化又は腫瘍部位への直接的注射により、細胞（例えば、腫瘍細胞）にイン・ビボで送達することが出来る。シスプラチン耐性蛋白質に結合する抗体その他の分子を、注射例えば静脈注射又は腫瘍部位への注射によって細胞にイン・ビボで送達することが出来る。シスプラチン耐性の低分子インヒビターを、適当な経路例えば静脈投与又は経口投与によって患者に送達することが出来る。或は、この方法を用いて、細胞のシスプラチン耐性を、例えば細胞をアンチセンス発現ベクターでトランスフェクトするか又は細胞をこの蛋白質と結合する抗体と共にインキュベートすることによりイン・ビトロで阻止することが出来る。これらの細胞をイン・ビトロで用いて、例えば、シスプラチン耐性蛋白質の他の薬剤（例えば、他の重金属）に対する交差耐性への寄与を測定し、シスプラチン耐性が阻止された細胞に対して細胞毒性である条件（例えば、他の薬剤）を同定することが出来る。この方法は、更に、細胞をシスプラチンに接触させてその細胞の成育を阻止することを含む。シスプラチン耐性蛋白質の活性の阻害の後に、細胞は、再びシスプラチンの効果に感受性となる。従って、シスプラチンを用いて細胞の成育を阻止することが出来る。患者においては、シスプラチンをその患者に投与することが出来る。イン・ビトロの細胞については、それらの細胞をシスプラチンと共に培養することが出来る。この発明の他の面は、細胞に重金属耐性を与える方法である。一具体例において、重金属はシスプラチンである。他の具体例において、重金属はカドミウムである。更に他の具体例において、重金属は銅である。この方法は、重金属感受性細胞を、重金属への曝露による細胞毒性から保護するのに有用である。例えば、腫瘍を有する患者内の非悪性のシスプラチン感受性細胞を、その患者がシスプラチンで治療される際に、細胞毒性から保護することが出来る。この方法は、シスプラチン感受性細胞と比較して高レベルのシスプラチン耐性を細胞に与える核酸をその細胞中に導入することを含む。好ましくは、シスプラチン耐性の増加は少なくとも５倍、一層好ましくは１０倍、更に一層好ましくは１５倍である。細胞に導入すべき好適核酸は、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列又はそのコード領域を含む。しかしながら、この発明の核酸の他の具体例（第Ｉ節に記載した通り）を用いることは出来る。例えば、核酸は、SEQ ID NO: １と実質的に類似するヌクレオチド配列を含むことが出来、SEQ ID NO:２と実質的に類似するアミノ酸配列を有する蛋白質をコードすることが出来、又は、SEQ ID NO:１の核酸と高緊縮若しくは低緊縮条件下でハイブリダイズすることが出来る。 SEQ ID NO:１の核酸とミトコンドリアＮＤ１遺伝子との間に高度の相同性（図６に示した通り）があるならば、ミトコンドリアＮＤ１遺伝子がそれが発現された細胞に重金属耐性を与え得ることを予想するのは妥当なことである。従って、一具体例において、細胞にシスプラチン耐性を与える核酸は、ミトコンドリアＮＤ１遺伝子である。用語「ミトコンドリアＮＤ１遺伝子」とは、ミ卜コンドリアＤＮＡ中に存在し且つＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ複合体の成分をコードする遺伝子を記述することを意図する。好ましくは、ミトコンドリアＮＤ１遺伝子は、ヒトＮＤ１遺伝子であり、そのヌクレオチド配列は、Anderson，S.等(1981)Nature 290:457-465 に開示されている。他の種からのＮＤ１遺伝子のヌクレオチド配列は、Bibb,M.J．等(1981)Cell26:167 -180（マウス）；Anderson,S．等(1982)J．Mol.Biol.156:683-717（ウシ）; Roe ,B.A．等(1985)J.Biol.Chem.260:9759-9774 （アフリカツメガエル）；及びJaco bs,H.T．等(1988)J.Mol.Biol.202:185-217 （ウニ）に開示されている。細胞に導入する核酸は、「その細胞中でのその核酸の発現に適した形態」であり、これは、その核酸が１つ以上の制御配列に、その細胞内でのＲＮＡへの転写を与える様式で機能的に結合されることを意味する。好適具体例において、核酸は組換え発現ベクター中にある（前記の第III節に記載の通り）。核酸を、前記の第IV節にこの発明の宿主細胞の生成に関して記載したような標準的トランスフェクション技術によって細胞中に導入することが出来る。この方法は、細胞のシスプラチン耐性が望まれる状況において有用である。例えば、化学療法剤の主な投与量制限因子は、それらの正常細胞並びに腫瘍細胞に対する細胞毒性である。シスプラチン耐性腫瘍を有する患者において、シスプラチンの投与量を増すことは、シスプラチンの正常細胞に対する毒性により妨げられ得る。シスプラチンの副作用は、骨髄毒性及び腎毒性を増すことであることが知られている。従って、細胞にシスプラチン耐性を与えることによってシスプラチン（及び他の重金属）の効果から非耐性の正常細胞を保護することは、主要な臨床上の重要事である。この発明の核酸を、当分野でイン・ビボ遺伝子治療用に用いられている技術によって、例えばレトロウイルス若しくはアデノウイルスベクター、リポソームカプセル化、又は標的部位へ（例えば、腎毒性阻止のために腎臓へ、又は骨髄毒性阻止のためにミエロイド細胞若しくはその前駆細胞へ）の直接的注射を用いて、患者の細胞にイン・ビボで導入することが出来る。或は、細胞を生体外で改変して患者へ戻すことが出来る。例えば、化学療法剤の効果を受け易い造血幹細胞を患者から分離し、この発明の核酸でイン・ビトロでトランスフェクトして（標準的トランスフェクション技術による）、患者に再導入することが出来る。この発明により提供された方法によって重金属耐性が与えられた細胞は、更に、重金属（例えば、シスプラチン）耐性細胞に対して有効な治療剤のスクリーニングアッセイにおいて有用である。これらの薬剤には、それら自身が体生細胞に対して細胞毒性である薬剤又は他の治療剤の化学増感剤が含まれる。ここで用いる場合、「化学増感剤」とは、耐性細胞に対する治療剤の効力を増大させ及び／又は細胞の治療剤に対する耐性を減少させる物質をいう。例えば、ベラパミルは、Ｐ糖蛋白質媒介の多剤耐性の化学増感剤である（多剤耐性細胞は、ベラパミルの存在下で、アントラサイクリン類の細胞毒性効果を一層受け易い）。これらのスクリーニング方法を用いて、例えば、シスプラチン耐性腫瘍を有する患者において（即ち、自然若しくは獲得耐性によりシスプラチンがもはや有効な治療剤でない状況において）、治療上有用であり得る物質を同定することが出来る。従って、この発明は、シスプラチン耐性細胞に対して細胞毒性である物質を同定するための方法を提供する。この方法は、細胞中に、その細胞にシスプラチン耐性（好ましくは、シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５、１０又は１５倍のシスプラチン耐性の増加）を与える核酸を導入し、それにより、シスプラチン耐性細胞を創り、そのシスプラチン耐性細胞を試験すべき物質と接触させ、そしてその物質のその細胞に対する細胞毒性を測定することを含む。好適核酸は、重金属耐性を細胞に与える方法に関して上述した通りである。例えば、一具体例において、この核酸は、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列又はそのコード領域を含む。他の具体例において、この核酸は、ミトコンドリアＮＤ１遺伝子を含む。更に、この発明のこれらの核酸の他の具体例も、この方法に包含される。細胞に対する物質の毒性を、標準的技術、例えば実施例に記載したＭＴＴアッセイによって測定することが出来る。イン・ビトロで培養した細胞を、スクリーニングアッセイにおいて用いることが出来、例えば、細胞を物質の存在下で培養することによりその物質と接触させることが出来る。或は、この細胞は非ヒトトランスジェニック動物中の細胞であってよく、試験すべき物質をその非ヒトトランスジェニック動物に投与することが出来る（即ち、「細胞を・・・・と接触させ」なる語はその物質を動物に投与することを含むことを意図している）。トランスジェニック動物の場合において、この発明の核酸を動物又はその先祖に胎児期に導入する（例えば、受精卵母細胞中に導入し、その卵母細胞を標準的技術により動物に発生させる）。この発明は、更に、シスプラチンの化学増感剤である物質を同定するための方法を提供する。この方法において、細胞にシスプラチン耐性を与える核酸をその細胞に導入することによりシスプラチン耐性細胞を創る。シスプラチン耐性細胞を創るための好適核酸は上記の通りである。次いで、このシスプラチン感受性細胞を、試験すべき物質の存在下及び非存在下においてシスプラチンと接触させ、そしてその細胞のシスプラチンに対する耐性を、試験すべき物質の存在下及び非存在下において測定する。シスプラチンの化学増感剤である物質を、その物質が細胞のシスプラチン耐性を阻止する能力に基づいて同定する。細胞に対するシスプラチンの細胞毒性は、標準的技術、例えばＭＴＴアッセイにより測定することが出来る。イン・ビトロで培養した細胞をこのスクリーニングアッセイで用いることが出来、例えばその細胞をシスプラチン及び試験すべき物質と共に培養することによりシスプラチン及び試験すべき物質と接触させることが出来る。或は、この細胞は非ヒトトランスジェニック動物中の細胞であってよく、シスプラチン及び試験すべき物質をその非ヒトトランスジェニック動物に投与することが出来る（即ち、「細胞を・・・・と接触させ」なる語は、シスプラチン及びこの物質を動物に投与することを含むことを意図している）。或は、この発明のスクリーニング方法（即ち、シスプラチン耐性細胞に対して細胞毒性である物質を同定し又はシスプラチンの化学増感剤を同定するための方法）は、シスプラチンに連続的にさらされることによりシスプラチン耐性となった癌細胞株（例えば、実施例１に記載したようにして創ったもの）を用いて行なうことが出来る。従って、この発明のスクリーニング方法は、この発明により提供されるＨＡＣ２／０．４細胞株を用いても実施出来る。このＨＡＣ２／０．４細胞株を、ブダペスト条約の規定に従って、日本国、茨城県、筑波市在、生命工学工業技術研究所に寄託し、寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−４６２８を与えられた。ＨＡＣ２／０．４に対して細胞毒性である物質を同定するために、この細胞株を試験すべき物質と共にインキュベートし、この物質の細胞株に対する細胞毒性を測定することが出来る。シスプラチンの化学増感剤を同定するために、ＨＡＣ２／０．４細胞株を、試験すべき物質の存在下及び非存在下において、シスプラチンと共にインキュベートし、この細胞株に対するシスプラチンの細胞毒性を測定することが出来る。この発明は、更に、シスプラチン耐性腫瘍細胞を同定するための方法を提供する。一具体例において、この方法は、腫瘍細胞試料からの核酸（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）をこの発明の核酸とハイブリダイズするヌクレオチドプローブと接触させ、このヌクレオチドプローブのシスプラチン耐性でない細胞に比べてこれらの腫瘍細胞からの核酸に対する増大したハイブリダイゼーションに基づいてシスプラチン耐性腫瘍細胞を同定することを含む。好ましくは、このヌクレオチドプローブは、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列又はそのオリゴヌクレオチド断片にハイブリダイズする。標準的ハイブリダイゼーション技術、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＮアーセ保護、ドットブロットハイブリダイゼーション、イン・シトゥーハイブリダイゼーション等を用いることが出来る。この方法は、腫瘍細胞試料から逆転写酵素−ＰＣＲによりこの発明の核酸を増幅することの出来るオリゴヌクレオチドプライマーの利用を含む。腫瘍細胞内のこの発明の核酸へのプローブのハイブリダイゼーションの増加を、定性的に（例えば、ハイブリダイゼーションブロット上のバンドサイズにより）測定することが出来、又は、例えば定量ＰＣＲによって定量的に測定することが出来る。他の具体例において、この方法は、腫瘍細胞を、この発明の蛋白質に結合する分子と接触させ（この分子は、検出可能な物質で標識しておく）、腫瘍細胞に結合したその検出可能な物質をシスプラチン耐性腫瘍細胞の指標として検出することを含む。この蛋白質に結合するための好適分子は、抗体である。一具体例において、この抗体は、ミトコンドリアＮＤ１蛋白質に結合しない。即ち、SEQ ID N O:２の蛋白質とＮＤ１蛋白質とを識別する抗体（第VI節に記載）を用いることが出来る。検出可能な物質例えば蛍光マーカー、酵素又は放射性マーカーで標識した抗体を用いて、腫瘍試料中の又はイン・ビボのシスプラチン耐性腫瘍細胞を同定することが出来る。この発明の抗体例えばモノクローナル抗体をシスプラチン耐性について試験すべき腫瘍細胞と共にインキュベートすることによりシスプラチン耐性腫瘍細胞を同定することが出来る。この抗体の腫瘍細胞への結合は、その腫瘍細胞上にこの発明の蛋白質が存在することを示す。腫瘍細胞に結合する抗体のレベルを正常対照細胞に結合する抗体のレベルと比較することが出来、正常細胞と比較して腫瘍細胞に対する抗体の増大した結合をシスプラチン耐性の指標として用いることが出来る。抗体の細胞（例えば、試験すべき腫瘍細胞又は正常対照細胞）への結合をその抗体を標識する検出可能な物質を検出することによって測定する。この検出可能な物質を直接抗体にカップルさせることが出来、或は、抗体に結合し得る他の分子にカップルさせることが出来る。例えば、ウサギＦｃ領域を有するこの発明の抗体（例えば、ウサギの免疫化により調製）は、ウサギＦｃ領域に対する第２抗体を用いて検出することが出来る（第２抗体は、検出可能な物質にカップルさせておく）。シスプラチン耐性腫瘍細胞を腫瘍試料においてイン・ビトロで、又はイン・ビボで検出することが出来る。例えば、患者から取り出した腫瘍組織を腫瘍試料として用いることが出来る。試料は、直ちに使うことも出来るし、−２０℃より低温で保存することも出来る。従って、組織切片例えば患者から取り出した腫瘍組織の凍結乾燥した又は新たに凍結させた切片を腫瘍試料として使用することが出来る。顕微鏡のスライドガラス上の腫瘍切片を、標準的免疫化学技術を用いて抗体と反応させ、又は標準的イン・シトゥーハイブリダイゼーション技術によって核酸と反応させることが出来る。更に、腫瘍細胞の単離細胞浮遊液が達成可能ならば、腫瘍細胞を抗体と反応させて、フローサイトメトリーにより分析することが出来る。或は、シスプラチン耐性腫瘍細胞を、腫瘍を有する患者においてイン・ビボで検出することが出来る。標識した抗体を患者内に導入し、腫瘍に結合した抗体を検出することが出来る。例えば、抗体を放射性マーカーで標識することが出来、その患者内の存在及び位置を標準的映像化技術によって検出することが出来る。シスプラチン耐性腫瘍を同定するために用いる試薬、例えばこの発明の核酸に特異的なヌクレオチドプローブ及び／又はこの発明の蛋白質と結合する抗体を、診断用キットに取り入れることが出来る。このキットは、試料を比較する標準を含むことが出来る。種々の試薬を適当な容器にてこのキット中に含めることが出来、このキットには、それらの容器用のホルダーを含めることが出来る。この診断用キットには、このキットの使用のための指示マニュアルを含めることが出来る。この発明を、更に、下記の実施例により説明する。しかしながら、これらの実施例は、単に、この発明の例を説明することを意図するものであり、この発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。この出願中で引用したすべての参考文献及び公表された特許及び特許出願の内容を、参考として、本明細書中に援用する。実施例１：ディフェレンシャルｃＤＮＡライブラリースクリーニング及びシスプラチン耐性細胞株中で優先的に発現されるｃＤＮＡの単離シスプラチン耐性細胞株中で優先的に発現されるｃＤＮＡを、ディフェレンシャルｃＤＮＡライブラリースクリーニング法を用いて単離した。そのプロトコールを図１に図式的に要約し、下記に詳細に説明する。シスプラチン耐性細胞株の樹立卵巣癌細胞株（ＨＡＣ／Ｐ）を、未治療の患者から得た。ＨＡＣ２／Ｐは、接着成長を示し、細胞学的には腺癌細胞型であった。親のＨＡＣ２／Ｐ細胞株のシスプラチン耐性サブクローン（ＨＡＣ２／０．４）を下記のように樹立した。親細胞株の単離細胞浮遊液をトリプシン処理により作成した後に、それらの細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（ニューヨーク、Grand Island 在、Gibco）にて１×１０³ 細胞／ｍｌの濃度まで希釈した。希釈した細胞浮遊液の１ｍｌのアリコートを、０．０１μｇ／ｍｌの初期濃度でシスプラチンを有する６ウェルプレート（ペンシルベニア、Horsham 在、Linbo）にプレートした。７日後にコロニーを観察したときに、単一コロニーを単離してシスプラチン濃度を増した別の皿にて増殖させた。このクローン化手順を繰り返して耐性サブ系統を樹立した。単離したクローンを、高濃度のシスプラチンに、最終的に０．４μｇ／ｍｌのシスプラチン濃度で成長するクローンが得られるまで４週間さらした。ＨＡＣ２／０．４をＲＰＭＩ−１６４０ベースの培養培地にて、５％ＣＯ₂ の加湿大気中で３７℃にて培養した。ＨＡＣ２／０．４のシスプラチン耐性表現型は、シスプラチンの非存在下で培養した場合でも５か月より長く安定であった。ＨＡＣ２／０．４を用いるディフェレンシャルクローニング実験を、シスプラチン非存在下での培養の１週間後に行なった。ＨＡＣ２／０．４細胞株を、ブダペスト条約の規定に従って、日本国、茨城県、筑波市在、生命工学工業技術研究所に寄託して、寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−４６２８を与えられた。ｃＤＮＡの調製及びＨＡＣ２／０．４ｃＤＮＡライブラリーの構築ＨＡＣ２／Ｐ及びＨＡＣ２／０．４（各５×１０⁷ 細胞）からの全ＲＮＡを、市販のＲＮＡ単離用キット（Stratagene）を用いて調製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、標準的方法を用いてオリゴ（ｄｔ）セルロースクロマトグラフィーにより得た。オリゴ（ｄｔ）プライムしたｃＤＮＡを、単離したポリ（Ａ）＋ＲＮＡから、市販のｃＤＮＡ合成キット（Amersham製、ｃＤＮＡ合成システムPlus）を用いて調製した。これらのｃＤＮＡを、４μｌのライゲーション用ストック溶液［６６ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭＭｇＣｌ₂ 、１０ｍＭジチオスレイトール］、２μｌの１０ｍＭＡＴＰ及び１μｌのＴ４ＤＮＡリガーセ（Takaraより購入）を含む１０μｌの反応容積にて、２０ｐモルのＥＮＢアダプター（Takaraより購入）にライゲートした。ライゲーションの後に、これらのｃＤＮＡを、ＮＨ₄ ＯＡｃ／イソプロピルアルコールで沈殿させ、７０％エタノールで洗い、そしてＨ₂ Ｏに溶解させた。これらのＥＮＢアダプターを付けたｃＤＮＡを、１０μｌのリン酸化ストック緩衝液［１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、２０ｍＭ２−メルカプトエタノール］、１ μｌの１０ｍＭＡＴＰ及び５０単位のキナーゼ（Takaraより購入）を含む１６ μｌの反応容積に加えて、リン酸化のために３７℃で５０分間インキュベートした。リン酸化後に、これらの試料を、フェノール／クロロホルムで抽出し、ＮＨ₄ ＯＡｃ／イソプロピルアルコールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄してＴＥ緩衝液中に溶解させた。各細胞株からの全ＣＤＮＡの半分をガラスビーズ（Gene Cleanキット； Bio101）を用いてゲル精製した。ＥＮＢアダプターを有するＨＡＣ２／０．４からのｃＤＮＡの１／５容を、λZAPII クローニングキット（Stratageneより購入）を用いて、λZAPII にライゲートし、Gigapack Gold（Stratageneより購入）を用いてパッケージした。ＨＡＣ２／０．４からのｃＤＮＡの力価は、約１０⁶ 組換え体であった。ＥＮＢアダプターを有するＨＡＣ２／Ｐ及びＨＡＣ２／０．４からの別のｃＤＮＡの１／５容を、更にプローブを調製するために（下記参照）、ＳａｕＩＩＩ−Ａｌ（Takaraより購入）で消化した。ｃＤＮＡプローブの調製ライブラリースクリーニング用のｃＤＮＡプローブを、図２に図式的に要約し、下記に詳述する「ショットガン」ＰＣＲ法によって調製した：合成アダプターを、配列5'-GATCTCGTTCGCTTCGTCTGTCT-3’（GATC(-)と呼ぶ；SEQ ID NO:３）のオリゴヌクレオチドを配列5'-AGACAGACGAAAGCGAACGA-3’（SEQ ID NO:４）の相補的オリゴヌクレオチドに、各鎖５７０ｐモルの濃度でアニールさせることにより構築した。アダプターを、１０μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Takaraより購入）、２０μｌのＰＮＫストック溶液［２５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭ２−メルカプトエタノール］、２μｌの１００ｍＭＡＴＰを含む１００μｌの反応容積中で、その５’末端をキナーゼ処理した。これらのオリゴヌクレオチドは、ABI ＤＮＡシンセサイザーにて合成した。ＳａｕＩＩＩ−Ａｌで消化したＥＮＢアダプターを有するＨＡＣ２／Ｐ及びＨＡＣ２／０．４からのｃＤＮＡ（上記のように調製）を、このＳａｕＩＩＩ−Ａｌ部位を含む合成アダプターに、４μ ｌのライゲーション用ストック緩衝液［３３０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、３３ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５０ｍＭジチオスレイトール］、２μｌの１０ｍＭＡＴＰ及び１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Takaraより購入）を含む２０μｌの全反応容積中でライゲートした。ＰＣＲによるｃＤＮＡ（アダプターに結合）の増幅を、ＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmer Cetus）中で、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒のプライマーアニーリング及び７２℃で３分間の重合の連続３０サイクルにより行なった。 GATC(-)オリゴヌクレオチド（予め上記のアダプター構築にて調製）を、１０μ ｌのＰＣＲストック溶液［１００ｍＭトリス（ｐＨ９）、５００ｍＭＫＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１５ｍＭＭｇＣｌ₂ ］、２μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、１５０ｐモルのGATC(-)プライマー及び１μｌのAmplitaq（Promega ）を含む１００μ ｌの反応容積中でプライマーとして用いた。増幅後に、ＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動で分析したところ、常例的にスメアーパターンを与えた。ＰＣＲ生成物を、下記のプラークハイブリダイゼーションでプローブとして使用するためにガラスビーズ（Gene Cleanキット；Bio 101 ）を用いて精製した。ディフェレンシャルライブラリースクリーニングＨＡＣ２／０．４（１０⁶ 組換え体）（上記のように調製）からのｃＤＮＡライブラリーのパッケージ後に、ファージ溶液を、ＳＭ緩衝液にて希釈し、１０³ プラーク／１５ｃｍ皿の密度で大腸菌pBluescript コンピテント細胞（Stratage neより購入）上にプレートした。リフトを４重にナイロンフィルター（Hybond⁺ 、Amershamより購入）上に取った。フィルターを０．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨで５分間及び１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭトリスＨＣｌで２０分間よく洗った。フィルターを、ＵＶ固定により架橋し、ブロッキング溶液（ECL;直接ヌクレオチド標識及び検出システム、Amersham）で予備ハイブリダイゼーションした。ディフェレンシャルクローニング用に、２連のフィルターを、それぞれＨＡＣ２／Ｐ及びＨＡＣ２／０．４からの１０ｎｇ／ｍｌの標識プローブ（予め上記のようにＰＣＲにより調製）を含む同じ溶液で４時間４２℃でハイブリダイゼーションした（ECL;直接ヌクレオチド標識及び検出システム、Amersham）。プローブは、製造者の指示に従って標識した。１０⁵ の組換え体ファージをプレートしてスクリーニングした。ハイブリダイゼーション後に、これらのフィルターを、 Kodak XAR フィルムを用いてオートラジオグラフィーにかけた。ＨＡＣ２／０．４ｃＤＮＡを過剰発現しているがＨＡＣ２／ＰｃＤＮＡは過剰発現してない陽性プラークを取り出し、更なる２ラウンドのスクリーニングにより精製した。陽性クローンを、pBluescript プラスミッドとして、製造者(Stratagene)の指示に従ってレスキューした。実施例２：ＨＡＣ２／０．４ライブラリーのディフェレンシャルスクリーニングにより単離したｃＤＮＡ６２の発現実施例１に記載のＨＡＣ２／Ｐ及びＨＡＣ２／０．４からのｃＤＮＡプローブでのＨＡＣ２／０．４ｃＤＮＡライブラリーのディフェレンシャルスクリーニングは、ｃＤＮＡ６２と呼ばれるｃＤＮＡクローンの単離をもたらした。pBluescr ipt SK^-プラスミッド中の完全長ｃＤＮＡ６２（ｃＤＮＡ６２Ｆ）を、ブダペスト条約の規定に従って、日本国、茨城県、筑波市の生命工学工業技術研究所に寄託して、寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−４６２９を受けた。ｃＤＮＡ６２をノーザンブロット実験においてプローブとして用いて、シスプラチン感受性及び耐性の癌細胞株並びにヒト組織におけるｃＤＮＡ６２の発現を測定した。ノーザン分析用に、４μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡを１％アガロース、２．２Ｍホルムアルデヒドゲル上の電気泳動により分離し、ナイロンフィルター（Hybond⁺、Amershamより購入）上にブロットした。これらのフィルターを、ブロッキング溶液中で（プラークフィルターハイブリダイゼーションについて上述したように）４２℃で１２時間予備ハイブリダイズさせ、同じ溶液中で、標識した完全長のｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、洗浄溶液中で室温で１０分間（２回）及び２０×ＳＳＣ中で室温で１０分間洗浄し、Kodak XAR フィルムを用いてオートラジオグラフィーにかけた。ｃＤＮＡ６２の発現を、卵巣癌及び肺癌細胞株において試験した。図３Ａは、卵巣癌細胞株ＨＡＣ２／Ｐ（レーン１）及びそのシスプラチン耐性誘導体ＨＡＣ２／０．４（レーン２）におけるｃＤＮＡ６２の発現を示す（ｃＤＮＡ６２は、後者からクローン化された）。この結果は、シスプラチン耐性のＨＡＣ２／０．４株における増大したｃＤＮＡ６２の発現を示している。図４は、４つのシスプラチン耐性誘導体細胞株：Ｌ２３１／Ｒ（レーン２）、ＰＣ７／Ｒ（レーン４）、ＰＣ９／Ｒ（レーン６）及びＰＣ１４／Ｒ（レーン８）並びにそれらの各親細胞株（それぞれ、レーン１、３、５及び７）におけるｃＤＮＡ６２の発現を示している。この結果は、ｃＤＮＡ６２の発現が４つのシスプラチン耐性細胞株の内の３つ（Ｌ２３１／Ｒ、ＰＣ９／Ｒ及びＰＣ１４／Ｒ）においてそれらの親株より高まっていることを示す。従って、試験した５つのシスプラチン耐性癌細胞株の内４つは、それらの親細胞株に比較して増大したｃＤＮＡ６２の発現を示した。ｃＤＮＡ６２の発現を、正常ヒト組織においても、Human Multiple Tissue No rthern Blot I 及び II（Clontechより購入）及び標識したｃＤＮＡ６２（プローブ）を用いて、ノーザン分析により試験した。この結果を図５に示すが、ここでの２．４ｋｂのバンドがｃＤＮＡ６２に対応している。比較的高レベルのｃＤＮＡ６２発現が、脳（レーン２）、腎臓（レーン７）、結腸（レーン１５）、膵臓（レーン８）及び肝臓（レーン５）において見られる。これらの組織の悪性腫瘍は、シスプラチンに対する低感受性を有することが知られている。比較において、比較的低レベルのｃＤＮＡ６２が、胎盤（レーン３）、卵巣（レーン１３）及び肺組織（レーン４）において見られ、これらは、胎盤絨毛癌、卵巣腺癌及び肺癌のシスプラチンに対する比較的大きい感受性に相関している。従って、細胞株及び組織におけるｃＤＮＡ６２の発現パターンを調べるこれらの研究の結果は、ｃＤＮＡ６２の発現がシスプラチン耐性と関連していることを示している。実施例３：ｃＤＮＡ６２の配列分析ｃＤＮＡ６２を、ファージから直接pBluescript プラスミッドとして切り出した。このｃＤＮＡインサートは約２．６ｋｂの長さであった。完全なｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を、オートシーケンサー（ABIModel 373A）を用いて、標準的ダイターミネーション法により決定した。両鎖についての更なる配列情報を、標準的ジデオキシチェーンターミネーション法により得た。ｃＤＮＡ６２のヌクレオチド配列を図６及びSEQID NO:１に示す。ｃＤＮＡ６２配列を、相同性についてSwiss データライブラリーの配列と比較した。この分析により、ｃＤＮＡ６２が、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子からｔＲＮＡ^Leu 遺伝子及びＮＤ１遺伝子を通ってｔＲＮＡ^Ile 遺伝子に及ぶヒトミトコンドリアＤＮＡ断片に９９．６％相同性であることが示された（但し、ｃＤＮＡ６２は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の最初の３４塩基対を欠く）。このｃＤＮＡ６２のヌクレオチド配列を、図６においてミトコンドリアＤＮＡの配列と比較する。ｃＤＮＡ６２は、１５９８塩基対の５’非翻訳領域及びその後の８３アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（１５９９〜１８４７ヌクレオチド）及び停止コドンを有する。対照的に、ｃＤＮＡ６２における停止コドンに対応する位置は、ミトコンドリアＮＤ１遺伝子では、トリプトファン残基をコードしている（即ち、核ｍＲＮＡにおけるＵＧＡは停止コドンとして翻訳されるがミトコンドリアｍＲＮＡにおいてはＴｒｐとして翻訳される）。従って、ミトコンドリアＮＤ１転写物の翻訳は、アミノ酸８３を超えて伸長し、ｃＤＮＡ６２によりコードされる蛋白質はＮＤ１蛋白質の最初（Ｎ末端）の８３アミノ酸に対応する。ｃＤＮＡ６２において、アミノ酸の位置８４の停止コドンに続くヌクレオチド配列（即ち、ヌクレオチド１８４８〜２５６４）は、３’非翻訳配列である。ｃＤＮＡ６２によりコードされる蛋白質の疎水性を、図７にグラフ化してプロットしてある。この疎水性分析により、細胞膜に配置される蛋白質と一致する幾つかの疎水性ストレッチが示された。実施例４：ｃＤＮＡ６２は、宿主細胞にシスプラチン耐性を与える組換え発現ベクターの構築宿主細胞中でｃＤＮＡ６２を発現させるために、完全長ｃＤＮＡ及びこのｃＤＮＡのコード領域をそれぞれ発現ベクターＰＭＡＭｎｅｏ（Clontechより購入）中にサブクローン化した。ＰＭＡＭｎｅｏにおいて、挿入されたｃＤＮＡ配列は、５’末端でデキサメタゾン誘導可能なＭＭＴＶ−ＬＴＲに、３’末端でＳＶ４０ポリアデニル化配列に結合されている。このベクターは又、このプラスミッドでトランスフェクトした細胞のＧ４１８での選択を可能にするネオマイシン耐性をコードする配列をも含む。完全長構築物について、pBluescript 中のｃＤＮＡ６２の２．６ｋｂＳｍａＩ−ＸｈｏＩ断片をゲル精製して、ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩで切断したＰＭＡＭｎｅｏ中にライゲートした（ＰＭＡＭｎｅｏのＮｈｅＩオーバーハングはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ Takaraより購入）を用いて埋めた）。これは、ＰＭＡＭｎｅｏ６２Ｆ構築物を与えた。ｃＤＮＡ６２のコード領域の発現については、pBluescript 中のｃＤＮＡ６２をＨｉｎｃＩＩで切断し、生じた断片をゲル精製した。次いで、このＨｉｎｃＩＩ断片をＨａｐＩＩで切断して鈍端化した。この断片は、ほぼヌクレオチド１５３３〜１８８０に対応し、ｃＤＮＡ６２のコード領域（ヌクレオチド１５９９〜１８４７）を包含する。この断片を、ＮｈｅＩで切断して鈍端化したＰＭＡＭｎｅｏ中にクローン化した。これは、ＰＭＡＭｎｅｏ６２Ｔ構築物を与えた。これらの２つの発現ベクターＰＭＡＭｎｅｏ６２Ｆ及びＰＭＡＭｎｅｏ６２Ｔを、図８に図式的に示す。トランスフェクションＮＩＨ３Ｔ３細胞（５×１０⁵ ）を、１０ｃｍ皿中で１８時間、標準的リン酸カルシウム法によりトランスフェクトした。トランスフェクタントは、５μｇの完全長ｃＤＮＡ６２プラスミッド（ＰＭＡＭｎｅｏ６２Ｆ）、切り詰められたｃＤＮＡ６２プラスミッド（ＰＭＡＭｎｅｏ６２Ｆ）又は対照用ベクター（ＰＭＡＭｎｅｏ）を含んだ。トランスフェクションの最後に、これらの細胞をＰＢＳで一回洗い、成長培地ＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清を供給して、２４時間インキュベートした後にトリプシン処理して分離した。分離の２４時間後に、Ｇ４１８（Sigma より購入）を、０．４ｍｇ／ｍｌで加えた。選択を１０〜１４日間続け、その時点で幾つかのコロニーが明白であった。これらのコロニーを単離してＧ４１８を含む成長培地にて発達させ、ＭＴＴアッセイを用いるシスプラチン耐性の分析に用いた。トランスフェクトした又はしてない細胞におけるｃＤＮＡ６２の発現を、ノーザン分析により試験した。これらの結果を図３Ｂに示す。デキサメタゾンの非存在下（レーン１）又は存在下（レーン２）におけるトランスフェクトしてないＮＩＨ３Ｔ３細胞、デキサメタゾンの非存在下（レーン３）又は存在下（レーン４）における親ｐＭＡＭｎｅｏプラスミッドでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞、並びにデキサメタゾンの非存在下におけるｐＭＡＭｎｅｏ６２ＦでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン５）は、すべて低い又は検出不能なレベルのｃＤＮＡ６２の発現を示している。対照的に、デキサメタゾン存在下のｐＭＡＭｎｅｏ６２ＦでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン６）は、ずっと強いレベルのｃＤＮＡ６２の発現を示している。類似の結果が、デキサメタゾンでの誘導の際にｐＭＡＭｎｅｏ６２ＴでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞において見られた。ＭＴＴアッセイｃＤＮＡ６２発現ベクター又はｐＭＡＭｎｅｏ親ベクターでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞のシスプラチン感受性を、ＭＴＴアッセイを用いて試験した。これらの細胞株を、プレーティングの４８時間前に、挿入ｃＤＮＡの発現のための濃度２．０μＭのデキサメタゾンを用いずに又は用いて予備処理した。これらの細胞（１×１０³ 細胞／ウェルの密度）を、９６ウェルプレート中に、種々の濃度のシスプラチンの存在下で、１８０μｌの培地中にプレートした。３７ ℃で４日間のインキュベーションの後に、ウェルから培地を出来るだけ完全に吸引した。２００μｌのジメチルスルホキシドを各ウェルに加えた。次いで、これらのプレートをプレートシェーカーにて５分間激しく揺り動かし、光学密度を T itertek Multiscan MCC プレートリーダーを用いて読んだ。ｐＭＡＭｎｅｏでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞の非存在（−）又は存在下における対照及びトランスフェクトした細胞株のシスプラチン感受性を、デキサメタゾンのｃＤＮＡ６２発現ベクター（＋）でトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞のそれに対してＩＣ₅₀（細胞成長を対照の５０％に減少させる薬物の濃度）として表す。結果を表に示す。ｐＭＡＭｎｅｏ６２Ｆプラスミッドでトランスフェクトし、デキサメタゾンで誘導した細胞は、デキサメタゾンの非存在下のトランスフェクトしてないＮＩＨ３Ｔ３細胞に比べて約１８倍のシスプラチン耐性を示した。同様に、ｐＭＡＭｎｅｏ６２Ｔプラスミッドでトランスフェクトし、デキサメタゾンで誘導した細胞は、デキサメタゾン非存在下のトランスフェクトしてないＮＩＨ３Ｔ３細胞に比べて約１０倍のシスプラチン耐性を示した。従って、完全長ｃＤＮＡ６２及びｃＤＮＡ６２のコード領域の両者とも、宿主細胞で発現された場合に、高レベル（即ち、５倍増より大）のシスプラチン耐性を与えることが出来る。実施例５：ｃＤＮＡ６２は、カドミウム及び銅耐性を宿主細胞に与えるｃＤＮＡ６２でトランスフェクトした細胞の重金属感受性を試験するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、実施例４に記載のように、デキサメタゾンの存在下又は非存在下で種々の濃度のカドミウム又は銅と共に培養した。細胞毒性を、実施例４に記載したＭＴＴアッセイにより測定し、その結果を表２にＩＣ₅₀値として表して示す。ｐＭＡＭｎｅｏ６２Ｆプラスミッドでトランスフェクトし、デキサメタゾンで誘導した細胞は、デキサメタゾンの非存在下でトランスフェクトしてないＮＩＨ３Ｔ３細胞に比べて約１５倍のカドミウム耐性及び４倍の銅耐性を示した。従って、シスプラチン耐性の付与に加えて、ｃＤＮＡ６２は、他の重金属例えば銅及びカドミウムに対する高レベルの耐性を宿主細胞に与えることが出来る。実施例６：抗癌剤に対するｃＤＮＡ６２媒介の耐性の特異性ｃＤＮＡ６２でトランスフェクトした細胞の他の抗癌剤に対する感受性を試験するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞トランスフェクタントを、実施例４に記載したように、デキサメタゾンの存在下又は非存在下において、種々の濃度のＣＢＤＣＡ、アドリアマイシン、メルファラン又はＣＰＴ−１１と共にインキュベートした。細胞毒性を実施例４に記載したＭＴＴアッセイにより測定し、その結果をＩＣ₅₀値として表して表３に示す。ｐＭＡＭｎｅｏ６２Ｆプラスミッドでトランスフェクトし、デキサメタゾンで誘導した細胞は、メルファランに対する耐性において統計的に有意の増加を示した（デキサメタゾン非存在下のトランスフェクトしてないＮＩＨ３Ｔ３細胞より約８倍強い耐性）が、ＣＤＢＣＡ、アドリアマイシン又はＣＰＴ−１１に対する耐性においては増加を示さなかった。これらの結果は、ｃＤＮＡ６２により宿主に与えられる耐性に特異性があることを示している。同等物当業者は、ここに記載したこの発明の特定の具体例に対する多くの同等物認め、又は常例的実験を用いて確認することが出来るであろう。かかる同等物は、後述の請求の範囲に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 16/18 8517−4ＨＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/02 9358−4Ｂ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/02 21/08 7823−4Ｂ 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/02 7823−4Ｂ 1/18 1/04 9453−4Ｂ 1/68 Ａ 1/18 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/574 Ｄ 1/68 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/00 ＨＧ０１Ｎ 33/574 9284−4Ｃ 39/395 Ｎ // Ａ６１Ｋ 39/00 9284−4ＣＡＤＵＤ 39/395 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＡＤＵ 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞内で発現するとその細胞に、シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を与える単離した核酸であって、その核酸が天然において核のゲノムＤＮＡ内に位置するヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、上記の単離した核酸。２．シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも１０倍増のシスプラチン耐性を細胞に与える、請求項１に記載の核酸。３．シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも１５倍増のシスプラチン耐性を細胞に与える、請求項１に記載の核酸。４．更に、細胞にカドミウム感受性細胞と比較してカドミウム耐性を与える、請求項１に記載の核酸。５．更に、細胞に銅感受性細胞と比較して銅耐性を与える、請求項１に記載の核酸。６．SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸。７．高緊縮又は低緊縮条件下で、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列を含む第２の核酸とハイブリダイズする、請求項１に記載の核酸。８．SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸。９．SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列のコード領域に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の核酸。１０．細胞内で発現するとその細胞にシスプラチン耐性を与える単離した核酸であって、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列を含む、上記の単離した核酸。１１．SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列のコード領域を含む、請求項１０に記載の核酸。１２．請求項１に記載の核酸に対してアンチセンスである単離した核酸。１３．コード領域に対してアンチセンスである、請求項１２に記載の核酸。１４．非コード領域に対してアンチセンスである、請求項１２に記載の核酸。１５．請求項１０に記載の核酸に対してアンチセンスである、単離した核酸。１６．コード領域に対してアンチセンスである、請求項１５に記載の核酸。１７．非コード領域に対してアンチセンスである、請求項１５に記載の核酸。１８．請求項１に記載の核酸を宿主細胞中での蛋白質の発現に適した形態で含む組換え発現ベクター。１９．請求項１０に記載の核酸を宿主細胞中での蛋白質の発現に適した形態で含む組換え発現ベクター。２０．請求項１０に記載の核酸を、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列に対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の宿主細胞中での発現に適した形態で含む組換え発現ベクター。２１．請求項１８に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。２２．請求項１９に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。２３．請求項２０に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。２４．請求項２２に記載の宿主細胞を適当な培地中で細胞にシスプラチン耐性を与える蛋白質が形成されるまで培養してその蛋白質を単離することを含む、細胞にシスプラチン耐性を与える単離した蛋白質の製造方法。２５．細胞内で発現するとその細胞に、シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を与える単離した蛋白質であって、その蛋白質が天然において核のゲノムＤＮＡ内に位置するヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列によりコードされる、上記の単離した蛋白質。２６．シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも１０倍増のシスプラチン耐性を与える、請求項２５に記載の蛋白質。２７．シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも１５倍増のシスプラチン耐性を与える、請求項２５に記載の蛋白質。２８．蛋白質が発現される細胞に、カドミウム感受性細胞と比較して、更にカドミウム耐性を与える、請求項２５に記載の蛋白質。２９．蛋白質が発現される細胞に、銅感受性細胞と比較して、更に銅耐性を与える、請求項２５に記載の蛋白質。３０．SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列に実質的に類似するアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の蛋白質。３１．細胞内で発現するとその細胞にシスプラチン耐性を与える単離した蛋白質であって、SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列を含む、上記の単離した蛋白質。３２．免疫原性である、請求項３１に記載の蛋白質又はその部分。３３．請求項２５に記載の蛋白質に結合する抗体又はその断片。３４．請求項３１に記載の蛋白質に結合する抗体又はその断片。３５．モノクローナル抗体である、請求項３４に記載の抗体。３６．ミトコンドリアＮＤ１蛋白質に結合しない、請求項３５に記載の抗体。３７．検出可能な物質にカップルされた、請求項３５に記載の抗体。３８．検出可能な物質を、蛍光物質、酵素及び放射性物質よりなる群から選択する、請求項３７に記載の抗体。３９．毒性又は治療活性を有する物質にカップルされた、請求項３５に記載の抗体。４０．請求項３３に記載の抗体及び製薬上許容し得るキャリアーを含む、製薬組成物。４１．請求項３４に記載の抗体及び製薬上許容し得るキャリアーを含む、製薬組成物。４２．請求項１０に記載の核酸を含む細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。４３．マウスである、請求項４２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。４４．請求項１０に記載の核酸を含む改変遺伝子を有する細胞を含む非ヒト相同組換え動物。４５．マウスである、請求項４４に記載の非ヒト相同組換え動物。４６．シスプラチン耐性卵巣癌細胞株ＨＡＣ２／０．４（寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−４６２８）。４７．細胞により発現されてその細胞にシスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を与える蛋白質の活性を阻害する薬剤にその細胞を接触させることを含む、細胞のシスプラチン耐性を阻止する方法。４８．蛋白質がSEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列又は実質的にそれと類似するアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。４９．蛋白質がミトコンドリアＮＤ１蛋白質を含む、請求項４７に記載の方法。５０．蛋白質の活性を阻害する薬剤がその蛋白質をコードする核酸に対してアンチセンスである核酸であり、このアンチセンス核酸を細胞中に導入する、請求項４７に記載の方法。５１．蛋白質の活性を阻害する薬剤がその蛋白質に結合する分子である、請求項４７に記載の方法。５２．蛋白質に結合する分子が抗体又はその断片である、請求項５１に記載の方法。５３．抗体又はその断片が毒性又は治療活性を有する物質に結合された、請求項５２に記載の方法。５４．蛋白質の活性を阻害する薬剤が薬物である、請求項４７に記載の方法。５５．細胞が腫瘍細胞である、請求項４７に記載の方法。５６．細胞をシスプラチンと接触させてその細胞の成長を阻止することを更に含む、請求項４７に記載の方法。５７．シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を細胞に与える核酸をその細胞中に導入することを含み、その核酸が細胞内での発現に適した形態である、細胞に重金属耐性を与える方法。５８．核酸が、SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列又は実質的にそれと類似するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項５７に記載の方法。５９．核酸が、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列又はそのコード領域を含む、請求項５７に記載の方法。６０．核酸が、ミトコンドリアＮＤ１遺伝子を含む、請求項５７に記載の方法。６１．核酸が、組換え発現ベクターを含む、請求項５７に記載の方法。６２．重金属がシスプラチンである、請求項５７に記載の方法。６３．重金属がカドミウム又は銅である、請求項５７に記載の方法。６４．シスプラチン耐性細胞に対して細胞毒性である物質を同定するための方法であって、ａ）シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を細胞に与える核酸を細胞に導入してシスプラチン耐性細胞を創り、その核酸はその細胞内での発現に適した形態であり、ｂ）そのシスプラチン耐性細胞を試験すべき物質と接触させ、そしてｃ）その細胞に対するその物質の細胞毒性を測定することを含む、上記の方法。６５．核酸が、SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列又は実質的にそれと類似するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６４に記載の方法。６６．核酸が、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列又はそのコード領域を含む、請求項６４に記載の方法。６７．核酸が、ミトコンドリアＮＤ１遺伝子を含む、請求項６４に記載の方法。６８．核酸が、非ヒトトランスジェニック動物中にあり、試験すべき物質をその非ヒトトランスジェニック動物に投与する、請求項６４に記載の方法。６９．シスプラチンの化学増感剤である物質を同定するための方法であって、ａ）シスプラチン感受性細胞と比較して少なくとも５倍増のシスプラチン耐性を細胞に与える核酸を細胞に導入してシスプラチン耐性細胞を創り、その核酸はその細胞内での発現に適した形態であり、ｂ）このシスプラチン耐性細胞を、試験すべき物質の存在下又は非存在下でシスプラチンと接触させ、ｃ）その細胞のシスプラチン耐性を、試験すべき物質の存在下又は非存在下で測定し、そしてｄ）シスプラチンの化学増感剤である物質を、その物質のその細胞のシスプラチン耐性を阻止する能力によって同定することを含む、上記の方法。７０．核酸が、SEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列又はそれと実質的に類似するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６９に記載の方法。７１．核酸が、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列又はそのコード領域を含む、請求項６９に記載の方法。７２．核酸が、ミトコンドリアＮＤ１遺伝子を含む、請求項６９に記載の方法。７３．細胞が非ヒトトランスジェニック動物中にあり、シスプラチン及び試験すべき物質をその非ヒトトランスジェニック動物に投与する、請求項６９に記載の方法。７４．シスプラチン耐性腫瘍細胞を同定するための方法であって、ａ）腫瘍細胞からの核酸を、SEQ ID NO:１に示したヌクレオチド配列を含む核酸又はそのオリゴヌクレオチド断片とハイブリダイズするヌクレオチドプローブと接触させ、ｂ）そのヌクレオチドプローブの腫瘍細胞からの核酸とのハイブリダイセーションを検出し、そしてｃ）シスプラチン耐性腫瘍細胞を、シスプラチン感受性細胞からの核酸と比べて腫瘍細胞からの核酸に対するヌクレオチドプローブの増大したハイブリダイゼーションに基づいて同定することを含む、上記の方法。７５．シスプラチン耐性腫瘍細胞を同定するための方法であって、ａ）腫瘍細胞を、検出可能な物質で標識した分子と接触させ、この分子はSEQ ID NO:２に示したアミノ酸配列を含む蛋白質と結合し、ｂ）この分子の腫瘍細胞への結合を、この検出可能な物質を検出することにより測定し、そしてｃ）シスプラチン耐性腫瘍細胞を、シスプラチン感受性細胞へのこの分子の結合に比べて腫瘍細胞へのこの分子の増大された結合に基づいて同定することを含む、上記の方法。７６．分子が、抗体又はその断片である、請求項７５に記載の方法。