JPH09502427A - オキシトシン拮抗薬活性を示すペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 式(I)を有するぺプチドが開示されている。（式中、Ｍｐａは、３−メルカプトプロピオン酸残基（-Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−）であり、Ｘは、Ｄ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）またはβ−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ｎａｌ）であり、Ｉｌｅは、イソロイシンであり、Ｙは、アロイソロイシン（ａｌｌｏＩｌｅ）、または（Ｓ）−２−アミノ−３−エチ−ペンタン酸（Ａｌａ（β−Ｅｔ₂））であり、Ａｓｎは、アスパラギンであり、α−Ａｂｕは、α−アミノ酪酸残基(II)であり、ＮａＭｅｏｒｎは、Ｎα−メチルーオルニチンである）。これらのぺプチドは医薬品の有効成分として、特に過度の子宮筋の収縮の治療用の医薬組成物に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 オキシトシン拮抗薬活性を示すペプチド 本発明は、オキシトシン拮抗薬活性を示す新規なペプチドに関する。これらの ペプチドは７個のアミノ酸残基からなり、分子内環構造を有している。それらは 、過度の子宮筋収縮を抑制するための医薬組成物における有効成分として用いる ことができる。これらのことが、苦痛を伴う月経および早産の背景となっている 。背景 バソトシン分子の位置１、２、４および８の修飾により類似体が得られ、これ らは、動物およびヒトの試験(Melin et al.，J．Endocrinol.，111，125，1986) のいずれにおいても子宮収縮を強力に抑制することが、既に示されている（ＥＰ −Ａ−０ １１２ ８０９号明細書）。これらの類似体は、オキシトシンまたは バソプレシンによって誘発される収縮を拮抗することが示されており、また臨床 試験では、一つの類似体は苦痛を伴う月経および早産に関連した過度の子宮収縮 を打ち消すことが示されている(Akerlund，Acta obst．Gynecol．Scand.，66，4 59，1987：Akerlund et al.，Br．J．0bst．Gynecol.，94，1040，1987)。上記 バソトシン類似体は副作用がまったくないが、それらは生物学的半減期が限定さ れているので、有効期間がかなり短い。分子の酵素安定性、従って作用の持続時 間が、単独投与の際には臨床上極めて重要である。これらのバソトシン類似体の 効果持続時間は比較的短く、治療投与量がかなり高いので、これらは今日までの ところは病院においてだけ静脈内投与されてきた。 オキシトシン拮抗薬を施設外での介護に利用できるようにするには、作用持続 時間および生物学的利用能に関する分子の特性を、経口および／または鼻内投与 などの非一非経口投与に適するようにする必要がある。これにより、分子の酵素 安定性、および分子が鼻や消化管粘膜などの生物学的膜を透過する能力について の特殊性が必要となる。 物理化学的特性の他に透過能にとって重要な一つの因子は、分子の大きさであ る。例えば、消化管粘膜を介する吸収は、分子の大きさが減少すると共に増加す ることがよく知られている。ＷＯ９２／００９９６号明細書には、８個のアミノ 酸から構成されている下垂体後葉ホルモンの誘導体は、口から摂取された後は９ 個のアミノ酸を有する対応の誘導体よりも良好な生物学的利用能を有することが 示されている。しかしながら、７個のアミノ酸から構成されている単独の誘導体 は、９個のアミノ酸を有する対照物質に匹敵する効力および作用持続時間の成績 を挙げたが、８個のアミノ酸を有する対応する誘導体の約３分の１弱い成績であ った。 本発明によるペプチドは７個のアミノ酸残基だけから構成されている。意外な ことには、これらは、比較的高い拮抗薬活性および、ＷＯ９２／００９９６号明 細書で試験した分子のいずれよりも実質的に長い作用持続時間を示す。 従って、鼻内または経口投与の後に血液への吸収が大きいことに対する可能性 は良好であり、このことは、鼻内および経口の動物モデルで２つの化合物（ペプ チド３および４）について確かめられている。発明の説明 本発明は、下記の式を有する新規なペプチドを含んでいる。 （式中、 Ｍｐａは、３−メルカプトプロピオン酸残基（−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−）で あり、 Ｘは、Ｄ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）または β−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ｎａｌ）であり、 Ｉｌｅは、イソロイシンであり、 Ｙは、アロイソロイシン（ａｌｌｏＩｌｅ）、または （Ｓ）−２−アミノ−３−エチル−ペンタン酸（Ａｌａ（β−Ｅｔ₂）） であり、 Ａｓｎは、アスパラギンであり、 ＮａＭｅＯｒｎは、Ｎα−メチル−オルニチンである）。 本発明の一つの様相は、医薬品における有効成分としての使用のための本発明 によるペプチドに関する。 本発明のもう一つの様相は、少なくとも１つの本発明によるペプチドを有効成 分として薬学上許容可能な添加剤および／または希釈剤、および必要に応じて増 強剤と組み合わせて含んでなる、医薬組成物に関する。薬学上許容可能な希釈剤 としては、好ましくは等張塩類溶液を用いることができる。他の薬学上許容可能 な添加剤については、これらは例えば米国薬局方等の文献に見出だすことができ 、これらの添加剤は、特定の投与経路に対する組成物の特定の形態に従って選択 されるべきである。用いることができる増強剤は、粘膜を介して薬物の吸収を促 進することが知られているあらゆる増強剤である。鼻内薬物投与における吸収増 強剤の例は、Journal of Controlled Release，24(1993)，201-208にMerkus，F. W.H.M.らによって開示されている。前記の吸収増強剤の中には、界面活性剤、胆 汁酸、フシデート類(fusidates)、リン脂質(fosfolipides)およびシクロデキス トリンがある。本発明による組成物は、静脈内、鼻内または経口投与に適する形 態とすることができる。経口投与に適する形態は、経口投与され、好ましくは主 と して腸で溶解し、有効成分が腸粘膜を通して吸収され得るようになっている層で コーティングされている錠剤であることができる。 本発明のこの様相の一態様は、過度の子宮筋収縮の治療における使用のための 本発明による医薬組成物に関する。 本発明の更にもう一つの様相は、過度の子宮筋収縮を中和する方法であって、 本発明による医薬組成物をこのような治療を必要とする女性に治療上有効量で投 与することによる方法に関する。 本発明によるペプチドは、子宮筋に特定の作用を有し、かつ作動薬作用並びに 抗利尿作用および血圧作用を全体として欠いており、その結果高い特異性を生じ 、これは起こり得る臨床的副作用が極めて少ないことを意味している。本発明によるペプチドの製造 本発明によるペプチドは、ペプチドの分野で周知の方法と同様にして製造する ことができる。 例えば、本発明による化合物は、Law，H.B．およびDu Vigneaud，V.，Journal of the American Chemical Society，82(1960)，4579-4581：Zhuze，A.L.，Jos t，K.，Kasafirek，E.、およびRudinger，J.，Collection of Czechoslovak Che mical Communications，29 (1964)，2648-2662およびLarsson，L.-E.，BLindeb erg，G．Melin,P./Pliska，V.，journal of Medicinal Chemistry, 21 (1978)， 352-356による変法などに記載されているように、液相でアミノ酸を互いにイン クリメント結合(incremental coupling)による常法で製造することができる。ア ミノ酸が互いに結合することによるいわゆるペプチド結合の形成は、出発材料と して固相を用い、これに最初のアミノ酸のＣ末端が結合した後、最初のアミノ酸 のＮ末端に次のアミノ酸のＣ末端が結合するなどによって行うこともできる。閉 環は、完全なペプチドを固相から解放する後または前に合成の最終段階として行 われる。下記の例では、このいわゆる固相法は、Merrifield，R.B.J．A m．Chem．Soc.，(1963), 85, 2149、Merrifield，R.B.，Biochemistry,(1964), 3， 1385、およびKoenig，W.，Geiger，R.，Chem．Ber,，(1970)，103 ,788の開 示内容に準じて用いた。合成の一般的説明 下記の例に開示されているペプチドは、固相法(j.M．Stewart，J.D．Young著 、Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Company)を用いて合成し た。 ペプチドは、液体クロマトグラフィ（逆相）を用いて精製した。定常相(stati onary phase)は、Kromasil^R、１３μまたは５μ、１００オングストローム、Ｃ_{1 8} またはＣ₈(EKA Nobel，スウェーデン)からなり、移動相は０．１％トリフルオ ロ酢酸を含むアセトニトリル／水であった。純粋な生成物を含む画分（ＨＰＬＣ 分析）をプールして、蒸発させ、生成物を水から凍結乾燥した。 ペプチドの純度および構造は、ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、およびＦＡＢ−ＭＳ によって決定した。 三官能性アミノ酸は、次のようにして保護した。 Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、 Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、 Ｆｍｏｃ−ｈｏｍｏＣｙｓ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯｔ−Ｂｕ）−ＯＨ、 Ｆｍｏｃ−ＮαＭｅＯｒｎ（Ｐｈｔ）−ＯＨ_o 上記の最後の２種類の誘導体は、市販されていない。 Ｆｍｏｃ−ｈｏｍｏＣｙｓ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯｔ−Ｂｕ）−ＯＨは、E．Proch azkaら、Collect．Czech．Chem．Commun.，1992,57，1335の公表内容に従って合 成した。 Ｆｍｏｃ−ＮαＭｅＯｒｎ（Ｐｈｔ）−ＯＨも同様に、R.M．Freidingerら、J ．0rg．Chem.，1983, 48, 77の公表内容に従って、対応するリジン誘導体として 合成した。 （Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−３−エチルーペンタン酸は、K．Erslerら、Collect ．Czech．Chem．Commun., 31, 1966，4563の公表内容に従って合成した。 （Ｒ，Ｓ）−２−アミノ−３−エチル−ペンタン酸およびアロイソロイシンの Ｆｍｏｃ誘導体は、P.B.W．Ten Kortenaarら、Int．J．Peptide Protein Res.， 1986，27，398の公表内容に従って合成した。 下記の略号を用いた。 ＴＢＴＵ＝２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３− テトラメチル−ウロニウム−テトラフルオロボレート、 ＭＢＨＡ＝４−メチル−ベンズヒドリルアミン、 Ｂｏｃ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル、 Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル、 ＮＭＰ＝Ｎ−メチルピロリドン、 ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸、 ＤＩＣ＝ジイソプロピルカルボジイミド、 ＨＯＢｔ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、 ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセン−７−エン、 ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド、 ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン、 Ｐｈｔ＝フタロイル、 Ｔｒｔ＝トリフェニルメチル（トリチル）。例１ ペプチド３ このペプチドは、固相上で混合Ｂｏｃ／Ｆｍｏｃ法に従って合成した。アミノ 酸の活性化は、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いて行なった。樹脂は、ローディングが ０．６５ミリモル／ｇのＭＢＨＡ型のものであり、それぞれの合成に０．３３ｇ を用いた。第一のアミノ酸をＮａＢｏｃで保護した。Ｂｏｃ基は、ジクロロメタ ン中５０％トリフルオロ酢酸で外した。残りの合成は、Ｆｍｏｃ法に従い、すな わちＮα−Ｆｍｏｃ保護したアミノ酸を、予め結合したアミノ酸の遊離アミノ基 に結合した。Ｎα−Ｆｍｏｃ基は、ＮＭＰ中２０％ピペリジンで外した。総ての アミノ酸が樹脂に結合したとき、樹脂をＮＭＰ中２０ピペリジン％で処理した後 、ジクロロメタン中５０％ＴＦＡで処理した。次いで、ペプチド鎖を、樹脂に結 合させたまま、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔで活性化することによりＤ−Ｔｒｐ²からｈ ｏｍｏＣｙｓ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＯＯＨ）⁶まで、すなわち位置１および２の間を環 化した。ペプチドを、８−０．２５−０．７５−１の割合の液状のフッ化水素− チオクレゾール−クレゾール−ジメチルスルフィドで、０℃で、樹脂から切断し た。フッ化水素を蒸発させた後、樹脂をジエチルエーテルに懸濁させ、濾過し、 更なるジエチルエーテルで洗浄した。沈殿したペプチドを、酢酸に溶解して、樹 脂から回収した。酢酸を蒸発させ、残渣を水から凍結乾燥した。凍結乾燥した生 成物をエタノールに溶解した後、ヒドラジン水和物をモル過剰量加えた。溶液を 一晩室温で攪拌した後、Ｈ₃Ｏ⁺で酸性にして蒸発させ、水から凍結乾燥した。生 成物を、上記と同様にして精製した。収量：４ｍｇ_o純度（ＨＰＬＣ）＝９５％ 。例２ ペプチド４ このペプチドは、固相上でＦｍｏｃ法によって合成した。アミノ酸の活性化は 、ＤＩＣ／ＨＯＢｔで行なった。樹脂は、ＲＡＭ−リンカーを有するＴｅｎｔａ Ｇｅｌ−Ｓ−型のものであった(Rapp Polymere S 30023)。Ｎα−Ｆｍｏｃ−基 は、ＤＭＦ中２％ＤＢＵで除去した。 ペプチドを樹脂から切断し、９５：２．５：２．５の割合のＴＦＡ／エタンジ チオール／アニソールで脱保護した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮した。ペ プチドを、ジエチルエーテルで沈殿させた。次いで、ペプチドをＤＭＦ中ＴＢＴ Ｕ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡで活性化することによって位置１および２の間を環化 した。環化の後、ヒドラジン水和物を加えることによって、ＮαＭｅＯｒｎ（Ｐ ｈｔ）を脱保護した。室温で一晩攪拌した後、溶液を中和して、蒸発させた。生 成物を上記と同様にして精製した。 収量：１１ｍｇ。 純度（ＨＰＬＣ）：９９％。例３ ペプチド５ このペプチドは、例２と同様の方法で合成した。上記と同様に行った精製にお いて、それぞれＡｌａ（β−Ｅｔ₂）のＲおよびＳ異性体を有する類似体を分離 した。Ｓ異性体（ペプチド５）は、Ｒ異性体の後に溶出した。 それぞれのペプチド類似体の鏡像異性体の形態を、最初に加水分解した後、ア ミノ酸を誘導体形成し、混合物をキラルカラム上でガスクロマトグラフィ法によ って分析することによって、決定した。 収量：１０ｍｇ、 純度（ＨＰＬＣ）：９８％。薬理試験 インビボ試験、ラット 自然発情期のSpraque Dawleyラット（２５０ｇ）をイナクチン（０．５ｍｇ／ １００ｇ体重、腹腔内(i.p.)）で麻酔した。 子宮筋層の活性を、子宮腔に固定して改変ロック溶液を満たしたカテーテルで 測定した。カテーテルを、Statham P23dカトランスデューサーに接続し、収縮を Grass ポリグラフ(7D 型)に記録した。拮抗薬試験、抑制用量（Ｉ．Ｄ．） ［Ｉ．Ｄ．＝作動薬の用量（ｘ）の半分の作 用に相当する作用まで作動薬の用量（２ｘ）を抑制する拮抗薬の用量］ 最初に、オキシトシンに対する用量−作用曲線（２．１０^-4〜５．１０^-3マイ クロモル／ｋｇ）を行った。１０〜３０ｍｇＨｇの管腔内収縮圧に相当する作用 を生じかつ用量−作用曲線の直線状部分にあるオキシトシンの用量（２ｘ）を選 択する。作用は、注射後１５分の間に測定した積分曲線の正味の値として測定す る。 次に、作動薬の作用（ｅｆｆ ｘ）を、その半分用量（ｘ）について計算する 。その後、拮抗薬（ペプチド１〜４）の少なくとも２種類の用量を、作動薬用量 （２ｘ）と組み合わせて注射する。抑制について、用量−作用曲線を補間するこ とによって、作動薬用量（ｘ）の作用（ｅｆｆ ｘ）に相当する拮抗薬の用量、 すなわちＩ．Ｄ．用量を得る。結果を、表Ｉに示す。拮抗薬試験、作用持続時間（持続時間、ｍｉｎ ０．７５） 作動薬の用量は、最 大効果の約５０％（ＥＤ₅₀）に相当する効果（この効果は、それぞれ作動薬およ び拮抗薬を投与した後１５分の間に測定して、収縮曲線を積分する）を生じるよ うに選択する（５．１０^-4〜５．１０^-3マイクロモル／ｋｇ）。 次に、作動薬の用量と組み合わせて、作動薬用量のみの効果の少なくとも５０ ％を抑制する拮抗薬の用量（ペプチド１〜３）０．８〜４．１０^-8モル／ｋｇを 投与する。次いで、作動薬の用量だけを２０分間隔で注射し、抑制作用を連続的 に減少させる。 補間することによって、抑制剤の投与から作動薬の効果の抑制の７５％が停止 するときまでの時間を得る。結果を、表Ｉに示す。 ペプチド１（参照）＝下記の式を有するＥＰ ０ １１２ ８０９号明細書によ るペプチド ペプチド２（参照）＝最大持続時間を有し、下記の式を有する ＷＯ ９２／００９９６号明細書による試験ペプチド ペプチド３（本発明）＝下記の式を有する本発明のペプチド ペプチド４（本発明）＝下記の式を有する本発明のペプチド ペプチド５（本発明）＝下記の式を有する本発明のペプチド 本発明によるペプチド３、４および５は、それぞれ参照物質であるペプチド１ および２に比較して実質的に作用持続時間が長くなり、効力が保持または改善さ れている（ＩＤ値が低くなる）ことは、表Ｉから明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ， ＵＳ (72)発明者 ニルソン，アンデルス スエーデン国ルンド、コルソケルスベーゲ ン、37 (72)発明者 トロイナル，ユェルシー スエーデン国バンケフロストランド、ステ ネレガタン、36

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 下記の式を有するペプチド。 （式中、 Ｍｐａは、３−メルカプトプロピオン酸残基（−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯ−）で あり、 Ｘは、Ｄ−トリプトファン（Ｄ−Ｔｒｐ）または β−（２−ナフチル）−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ｎａｌ）であり、 Ｉｌｅは、イソロイシンであり、 Ｙは、アロイソロイシン（ａｌｌｏＩｌｅ）、または （Ｓ）−２−アミノ−３−エチル−ペンタン酸（Ａｌａ（β−Ｅｔ₂）） であり、 Ａｓｎは、アスパラギンであり、 ＮａＭｅＯｒｎは、Ｎα−メチル−オルニチンである）。 ２． 医薬品の有効成分としての使用のための、請求の範囲第１項に記載のペ プチド。 ３． 有効成分として請求の範囲第１項に記載の少なくとも１つのペプチドを 薬学上許容可能な添加剤および／または希釈剤および必要に応じて増強剤と共に 含んでなる、医薬組成物。 ４． 鼻内投与に適する投与形態である、請求の範囲第３項に記載の医薬組成 物。 ５． 静脈内投与に適する投与形態である、請求の範囲第３項に記載の医薬組 成物。 ６． 経口投与に適する投与形態である、請求の範囲第３項に記載の医薬組成 物。 ７． 過度の子宮筋収縮の治療における使用のための、請求の範囲第３〜６項 のいずれか１項に記載の医薬組成物。 ８． 過度の子宮筋収縮を中和する方法であって、請求の範囲第３〜６項のい ずれか１項に記載の医薬組成物を、このような治療を必要とする女性に治療上有 効量で投与することを特徴とする、方法。