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JPH09502379A - Improved cross-linking of natural tissues - Google Patents

Improved cross-linking of natural tissues

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Publication number
JPH09502379A
JPH09502379A JP8502508A JP50250896A JPH09502379A JP H09502379 A JPH09502379 A JP H09502379A JP 8502508 A JP8502508 A JP 8502508A JP 50250896 A JP50250896 A JP 50250896A JP H09502379 A JPH09502379 A JP H09502379A
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JP
Japan
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biological tissue
tissue
glutaraldehyde
solution
cross
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Pending
Application number
JP8502508A
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Japanese (ja)
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エム ウィリアム ザ セカンド マーシュ
トーマス エル オードランド
ケマル シャンケレリ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
St Jude Medical LLC
Original Assignee
St Jude Medical LLC
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Publication date
Application filed by St Jude Medical LLC filed Critical St Jude Medical LLC
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、生物組織を、低濃度の架橋試薬で処理することに関する。 (57) Summary The present invention relates to treating biological tissue with low concentrations of cross-linking reagents.

Description

【発明の詳細な説明】 天然組織の改良された架橋 発明の技術分野 本発明は、架橋剤、例えばグルタルアルデヒドを用いて、生物組織、例えば心 臓弁を加工することに関する。 発明の背景 移植前に人工器官(bioprosthetic)組織を製造することは、代表的には、これ が、その後のインビボ酵素分解に対して安定であるように処理することを含む。 代表的には、この処理は、架橋分子、特にコラーゲンを、組織上および／または 組織中に含む。種々のアルデヒドが、このために用いられており、これらには、 グリオキサール、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドが含まれる。しか し、グルタルアルデヒドは、通常、いくぶん特別の薬剤である。その理由は、こ れが、水性条件下で、生理的ｐＨで用いられるからである。組織の架橋に加えて 、グルタルアルデヒドは、良好な滅菌剤であり、移植後の組織の抗原性を低下さ せる。 さらに、グルタルアルデヒドの使用は、一層良好な熱安定性、一層良好な可撓 性（従来の架橋手法と比較して）および増大した耐久性を有する組織を製造する にあたり、有益であることが示された。 しかし、また、グルタルアルデヒドは、細胞毒性を有する−−低濃度のグルタ ルアルデヒドでさえも、組織を洗浄して、残留グルタルアルデヒド除去すること が必要である。生物組織を架橋するのに代表的に用いられる濃度−−約０．６％ ｖ／ｖ、０．２％程度に低い濃度が、首尾よく用いられたとしても−−において 、グルタルアルデヒドの毒性は、問題外である。 発明の要約 本発明は、低濃度の架橋剤を用いて、コラーゲン生物組織、例えばブタ心臓弁 を架橋させるかまたは固定する、優れた方法を提供する。架橋剤の残留レベルは 低下する一方、処理した組織の耐久性および可撓性は、維持または増強される。 この方法は、水性放出系を用いるため、これにより、潜在的に毒性であるのみ ならず、コラーゲン含有物質（即ち、静脈、動脈、心臓弁等）を脱水、変性また は破壊する、有機溶媒、例えばアセトンを用いることが回避される。低濃度グル タルアルデヒド固定の他の特性には、以下のものが含まれる：１）比較的高い程 度の分子内結合が、一層柔軟な組織を提供する。心臓弁に関しては、これは、改 善された血行力学を意味する；血管移植組織に関しては、これは、一層大きい痙 攣耐性を意味する。２）比較的高い程度の短鎖分子内架橋（コラーゲンストラン ドに沿って）。これはまた、組織に、コラーゲンタンパク質マトリックスにおい て鎖分断反応を生じることが知られている原因からの保護を提供する。これは、 高濃度のグルタルアルデヒドにおいて優勢である、長鎖分子間架橋（コラーゲン ストランドの間）とは対照的である。３）石灰化に対する耐性。人工器官生成物 、例えば人工器官心臓弁の石灰化は、多くの因子が寄与する、極めて複雑なプロ セスである。これらの１つは、石灰化が、残留遊離グルタルアルデヒドの存在下 で発生する傾向があることである。代表的に、低濃度のグルタルアルデヒド中で の固定により、組織中の残留グルタルアルデヒドの量は減少する。さらに、石灰 化はまた、組織の割れ目付近に現れる傾向がある一方、低濃度架橋から生じた、 比較的柔軟な組織は、長時間にわたり、破裂または亀裂を発生する傾向が小さい 。 本発明は、多くの血管補綴に適する一方、特に、直径が小さい血管の交換の分 野に価値がある。本発明は、冠動脈通路バイパス方法において、特に、患者が、 前に、冠動脈交換手術を受けており、適切な伏在静脈または内胸動脈が、前の摘 出により、もはや存在しない際に、有用である。本発明に従って行われる補綴は 、伏在移植組織の開存性と等しいかまたはこれより良好な開存性を有するため、 このような補綴を用いることにより、伏在静脈の摘出の必要性が解消する。本発 明はまた、組織の微小血管の交換、例えば手または足中の血管に適用することが できる。 図面の簡単な説明 図１は、０．０１％グルタルアルデヒド中で架橋したウシ頸動脈の引張強さ値 と、０．０５％グルタルアルデヒド中で架橋したウシ頸動脈の引張強さ値とを比 較した図である。 図２は、０．０１％グルタルアルデヒド中で架橋したウシ頸動脈の縫合保持値 と、０．０５％グルタルアルデヒド中で架橋したウシ頸動脈の縫合保持値とを比 較した図である。 図３は、ウシ正中動脈の引張および縫合保持強さにおける、種々の固定条件の 影響を示す図である。 図４は、ウシ正中動脈の破裂強さにおける、種々の固定条件の影響を示す図で ある。 図５ａおよび５ｂは、それぞれ、低濃度グルタルアルデヒド分子内架橋および 高濃度グルタルアルデヒド分子間架橋の間の差異を示す図である。 図６は、０．５％グルタルアルデヒド中で架橋した小葉の小葉収縮温度と、０ ．０５％グルタルアルデヒド中で架橋した小葉の小葉収縮温度とを比較した図で ある。 図７は、圧力降下における電子ビームの影響を示す図である。 図８は、有効オリフィス面積に対する電子ビームの影響を示す図である。 図９は、大動脈根組織(root tissue)に関して、収縮温度対固定時間を示す図 である。 発明の詳細な説明 本発明の方法は、生物組織を、約０．１容量％未満の架橋溶液、好ましくは約 ０．０１〜約０．０９９容量％の固定溶液中に暴露することにより、生物組織を 処理または加工することを含む。本発明の好適例において、固定溶液は、グルタ ルアルデヒドを含む緩衝溶液である。 本明細書中で用いる「生物組織」は、種々の動物種、代表的には哺乳類から由 来する、コラーゲンを有する物質を意味する。生物組織は、代表的には、移植に 適する柔軟な組織、例えば人工器官組織等であるが、本発明はこれには限定され ない。特定例には、心臓弁、特にブタ心臓弁；大動脈根、壁および／または小葉 ；心膜、好ましくはウシ心膜等、並びに心膜から由来する生成物、例えば心膜パ ッチ；結合組織から由来した材料、例えば硬膜；同種移植片組織、例えば大動脈 同種移植片および伏在バイパス移植片；腱、靱帯、皮膚パッチ；血管、特にウシ 動脈および静脈、並びにヒトへそ組織、例えば静脈；骨等が含まれるが、これら には限定されない。本発明に従って加工するのに適するものとして知られている かまたは知られる、他の任意の生物に由来する材料は、本発明の範囲内である。 本発明において、源から外植された生物組織を、任意適切の方法により加工し 、続いて架橋剤に暴露することができる。代表的に、生物組織を注意深く洗浄し 、次に、濾過したタンパク質分解酵素コンセントレートで処理して、消化させ、 これにより、生物組織から、抗原性組織をほとんど除去する。天然の組織を用い る際には、洗浄段階は、代表的には、組織から、外膜および不所望な脂肪および 筋肉組織を除去することを含む。 本明細書中の、生物組織を架橋剤に暴露するとは、生物組織を架橋剤と接触さ せる、任意の方法をいう。本発明の好適例において、組織を架橋剤に暴露すると は、組織を、架橋剤中に浸漬することをいう。 組織を、所与の濃度の架橋剤、例えばアルデヒド、例えばグルタルアルデヒド の溶液中に浸漬する際には、組織の間隙内のグルタルアルデヒドの濃度は、周囲 の溶液と平衡に達し，従って、組織は、真に、低濃度架橋を受ける。しかし、グ ルタルアルデヒドを噴霧器により提供する際には、モノマーグルタルアルデヒド が、基質の表面に直接堆積する。蒸発前の溶液の初期濃度に関係なく、純粋なグ ルタルアルデヒドは、組織と接触する。従って、組織中の濃度を制御するのは、 不可能ではないにしても、極めて困難である。 本発明において代表的に用いられるグルタルアルデヒドは、例えば、エレクト ロン マイクロスコピー サイエンスィズ(Electron Microscopy Sciences)（ア メリカ合衆国ペンシルヴェニア州フォートワシントン）から市場で入手できる、 生物階級(biological grade)５０％溶液である。このような市場で入手できるグ ルタルアルデヒドはまた、他の種々の階級、純度および／または濃度で入手でき る。ある生物階級のグルタルアルデヒドは、代表的には、付加的な精製を必要と しないが、最終架橋溶液を、孔の大きさが０．２μの親水性膜フィルターを通過 させて、すべての生物学的汚染物を除去するのが望ましい。 本発明において、生物組織を、適切な緩衝液中にグルタルアルデヒドを含む固 定溶液に、暴露することができる。本発明の実施に用いるのに適する緩衝液は、 生理学的に受け入れられるｐＨを維持するのに十分な緩衝能を有し、生物組織に 顕著な害を与えず、および／または処理工程を妨害しないものである。例示的な 緩衝液には、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、および有機緩衝液、例えばＮ−（２− ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ ）またはモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；およびホウ酸塩、炭酸水 素塩、炭酸塩、カコジル酸塩またはクエン酸塩を含む緩衝液が含まれるが、これ らには限定されない。好ましい固定溶液は、クエン酸緩衝液に溶解した、０．１ ％ ｖ／ｖ未満のグルタルアルデヒド溶液である。 本発明の代表的なプロトコルにおいて、生物組織を、固定溶液に、生物組織中 および生物組織上のコラーゲンの架橋を発生させるのに十分な時間および温度で 暴露することができる。例えば，生物組織を、約４〜約３７℃、好ましくは約２ ０℃の温度の緩衝グルタルアルデヒド溶液に、約６〜約８、好ましくは約６．３ 〜約６．５のｐＨで，約１０日以内、好ましくは約２〜約５日間、暴露すること ができる。 本発明において、当業者は、処理プロトコルにおける若干のパラメータを変化 させて、特定の目的を達成することができることは、認識している。これらのパ ラメータには、グルタルアルデヒド濃度、溶液組成、ｐＨおよびイオン強度、生 物組織をグルタルアルデヒドに暴露する時間および温度、並びに組織対溶液の容 積の比率、並びに初期固定中の生物組織の形状が含まれるが、これらには限定さ れない。本発明はこれによっては限定されない。 代表的には、架橋した生物組織を、次に、例えば任意の適切なすすぎまたは洗 浄物質を用いてすすぐ。好適例において、洗浄剤は、無菌の生理食塩水である。 この組織を、多量の無菌の生理食塩水で、約２４時間、または組織中の残留加 工化学物質の濃度が、有毒であると考えられるレベル（約１ｐｐｍ）以下となる まで、すすぐことができる。 また、当業者は、本発明が、付加的な加工を含むことも認識している。例えば 、架橋した生物組織を、１種以上の抗石灰化(anticalcification)剤、１種以上 の 汚染微生物数減少剤、少なくとも１種の洗浄溶液および１種以上の滅菌剤または プロトコルに暴露することができる。さらに、以下に一層詳細に示すように、本 発明に従って架橋した生物組織を、最終的に滅菌するまで、約１年以上貯蔵する ことができる。例示的な付加的加工を、以下に一層詳細に示す。 汚染微生物数減少 本発明の例には、架橋した生物組織を、１種以上の汚染微生物数減少剤に、代 表的には約１０時間以内、好ましくは約２〜約４時間にわたり暴露することが含 まれる。例えば、前記したようにグルタルアルデヒドで処理したブタ心臓弁を、 次に、約１〜５％のグルタルアルデヒド、約１〜６％のホルムアルデヒドおよび 約１５〜２５％のエタノールを含む緩衝溶液に暴露することができる。代表的な 緩衝液には、ＰＢＳ，ＨＥＰＥＳ，リン酸塩およびクエン酸塩緩衝液が含まれる 。 中間の貯蔵 本発明の例には、架橋した生物組織を、最終的に滅菌するまで、約１年以上貯 蔵することが含まれる。例えば、本発明に従って、グルタルアルデヒドで架橋し たブタ心臓弁を、一時的に、室温で、ＰＢＳ、クエン酸塩等で緩衝した、０．５ ％グルタルアルデヒド溶液中に貯蔵することができる。 抗石灰化処理 本発明の例には、架橋した組織を、移植後に生物組織の石灰化を低減させるか または防止するように設計された、１種以上の試薬に暴露することが含まれる。 多くの抗石灰化試薬が、業界において知られている。例えば、架橋した生物組織 を、アルコールおよび／またはアルミニウム塩に暴露して、石灰化を低減させる かまたは防止することができる。例示的な方法において、架橋した生物組織を、 約５０％より多量の低級脂肪族アルコールを含む溶液中に、生物組織が、石灰化 に対して耐性となるのに十分な時間、代表的には、約９６時間以内にわたり、浸 漬することができる。 アルコールは、好ましくは、低級脂肪族アルコール（Ｃ1〜Ｃ3）、例えば、メ タノール、エタノール、プロパノールまたはイソプロパノールである。好適例に おいて、アルコールは、エタノールである。 アルコール処理を実施する時間の長さは、当業者が変化させることができる。 生物組織を、アルコールの液体処理溶液中に浸漬する本発明の例において、例示 的な暴露時間は、好ましくは、約２４〜９６時間である。 本発明の他の例において、抗石灰化剤は、多価金属カチオン、例えばアルミニ ウムまたは鉄の塩を含むことができる。例えば、架橋した生物組織を、約０．１ 〜約０．００１ＭのＡｌＣｌ3を含む溶液中に、生物組織が、石灰化に対して耐 性となるのに十分な時間にわたり、浸漬することができる。 本発明において、架橋した生物組織を、好ましくは、石灰化防止および／また は無菌を維持するのに十分な量のアルコール−グルタルアルデヒド溶液中に貯蔵 することができる。例えば、生物組織を、代表的には約６０％を超える、好まし くは約６０〜約８０％のアルコールおよび約０．５％未満、好ましくは約０．２ 〜０．５％のグルタルアルデヒドを含む、グルタルアルデヒド含有緩衝アルコー ル溶液中に貯蔵することができる。 次に、石灰化を防止し、および／または架橋した生物組織を、容器内に配置す るかまたは収納することができる。本発明の好適例において、生物組織を、最終 の容器内の生理食塩水中に収納、密封し、次に定期的に滅菌する。収納は、好ま しくは、滅菌、貯蔵および／または輸送に適する容器内への配置を意味する。 容器は、ガラスあるいはポリマープラスチック、例えばポリプロピレン、ポリ エチレンおよび／またはエポキシ製とすることができる。本発明は、容器のタイ プに限定することは意図しておらず、シールを用いることができ；他の材料、混 合物、配合物および／またはコポリマーを用いることができる。 次に、架橋し、収納した生物組織を、以下に示すように滅菌するか、あるいは これを、滅菌するまで約１年以内、またはそれ以上貯蔵することができる。本発 明において、貯蔵には、長期間貯蔵、例えば６か月、１２か月あるいは約５年以 内またはそれ以上が含まれる。 滅菌 本発明の方法はまた，組織を滅菌することを含む。本明細書中で用いられる「 滅菌」は、生物組織を、加速された電子、即ち電子ビーム（ｅビーム）の滅菌ビ ームに暴露することを意味する。ｅビームを含む粒子ビームは、好ましくは、直 接衝撃、即ち一方向のみからの衝撃を含み、単一側または複数側輻射を含む。本 発明に従って架橋した生物組織を、好ましくは生物組織を収納した後に滅菌する ことができる。適切な滅菌プロトコルには、Ｘ線またはγ線、ｅビーム等が含ま れるが、これらには限定されない。架橋した組織を滅菌する好ましい方法は、生 理食塩水中に収納した生物組織を、加速した電子に暴露することである。例えば 、生物組織を、材料の寸法に依存して、約２５キログレイ（ｋＧｙ）の線量が達 成されるまで、または約１〜１０分間、電子ビームに暴露することができる。 ｅビーム加工の、従来のγ線にまさる主要な利点は、エネルギーを制御された 方法により加えることができる高速または加工速度であり、これにより、通常、 滅菌費用が低下する。 本発明において、生物組織を処理するには、組織を、ｅビームに、滅菌を実施 するのに十分に暴露する。さらに、本発明は、ｅビームにより滅菌された生物組 織を提供し、形成した生物組織は、向上した性能特性を示す。本発明の方法およ び組織は、さらに、感染性の危険が低下したという利点を有し、無菌の取扱プロ トコルの必要性を解消する。さらに、一層少ない試薬を用い、および／または一 層少ない加工を必要とする、本発明の方法および組織は、労働、試薬、時間およ び人員における費用を低下する。 ｅビーム滅菌は、有毒な滅菌化学物質の必要性を解消することにおいて有効で ある。さらに、ｅビーム滅菌に必要な輻射の量によっては、生物組織は顕著に劣 化することはなく、従って、耐久性が向上した移植可能な組織が提供される。 γ線の線量率は、約１１０グレイ／分であり、ｅビームの線量率は、約７８０ ０グレイ／分である。従って、暴露時間は、γ線に関しては、驚異的に大きく、 これは、滅菌を実施するのに、長時間にわたり、低い線量を必要とする。γ線と は対照的に、ｅビームにより生じた高い線量率により、酸素の生物組織中への拡 散が、組織およびポリマーの分解に寄与しうる遊離基形成反応にあずかるのに不 十分な速度で促進される。これは、生物組織を、輻射前に容器内に配置すること を含む例において好都合である。その理由は、組織と容器との両方におけるポリ マー分解が最小となるからである。 さらに、ｅビームの線量率が、γ線より高いため、滅菌の一層高い加工速度、 一般的には、一層高い程度の重要性を達成することができる。 相対的な用語で、γ線は、同一の物質中に、１０ＭｅＶの電子より約１０倍深 く、材料中に浸透する。 γ線は、滅菌される物質の原子内の電子の励起を誘発する。一方、電子ビーム は、材料の外部に、高エネルギー電子を提供し、これが物質に浸透し、次に、電 子を動き出させる。 ｅビームの線量率が比較的高いため、酸素は、物質の分解を生じうる酸化反応 にあずかるのに必要な速度で、物質中に拡散することができない。 さらに、容器と組織との両方の分解が防止されることにより、最後の滅菌、即 ち、最後の密閉した容器内の組織の滅菌が可能である。従って、本発明は、費用 がかかる無菌取扱技術の必要性を解消し、容器が無傷である限り、即ち組織が用 いられる状態にあるまでは、確実な無菌を提供する。 高エネルギー電子がこの表面を通るため、これらの電子は物質の原子内電子と 衝突する。これらの電子は、順次、反跳し衝突してさらに多くの電子を動きださ せ、その結果比較的わずかな表面を通る電子から、主としてイオンおよびフリー ラジカルの生成により、その物質にエネルギーを届ける多数の電子を生じる。こ の工程は、強化と称するもので、これによりこの表面下の深いところに一層高い 線量が送達され、ここでは一次ビームおよびその反跳電子はもはやイオン化を生 じさせない。 本発明によれば、Ｅビーム放射の量は生物組織を滅菌するのに十分な量であり 、またいくつかの好適例では、最終的容器に包装した生物組織を滅菌するのに十 分な量である。当業者であれば、特定の組織に適切な滅菌のための線量および時 間を認識し、決定することができ、さらに用いる促進剤の特性に基づかせること ができる。 代表的に、この生物組織の片側に電子線を暴露させ、放射の滅菌線量を吸収さ せる。吸収した放射線量をキログレイ(Kgy)として表す。１キログレイは、１キ ログラムの物質当たりに堆積した１千ジュールのエネルギーに等しい。例えば、 生物組織を曝して約25Kgy 以上の線量を達成することができる。 効果的な滅菌は、例えば、照射バッチ中に適切な生物学的指標を含ませること 、またはこの組織を培地に接触させ、この培地をインキュベーションしてこの組 織 の無菌性を測定するような、通常の微生物学的技術を用いて容易に決定すること ができる。また、線量を、放射線吸収色素フィルムを用いて決定することもでき る。かかるフィルムは、通常ガンマフィールド中で、ナショナルスタンダードを 参照することにより較正する。 また、照射による生物組織の分解を、周知の通常の試験および基準、例えば、 収縮温度 Ts の減少；酵素による攻撃に対する感受性、例えば、コラゲナーゼ； 分解生成物の抽出性、例えば、コラーゲンフラグメント；および引張強度のよう な物理的特性の減少を用いて決定することもできる。 本発明による代表的な手順では、生物組織内および生物組織上でコラーゲンの 架橋を誘発するのに十分な時間および温度で、生物組織を固定液に曝すことがで きる。例えば、生物組織を緩衝化したグルタルアルデヒド溶液に、約４℃〜約37 ℃、好ましくは約20℃；約６〜約８のpH、好ましくは 6.3〜6.5 ；さらに約10日 までの期間、好ましくは約２〜約５日間、曝すことができる。 これらの上述した工程は、組み合わせることで、他の方法を用いて製造した人 工器官よりも高強度で高柔軟性の、抗原性が低下した、さらに一層取扱の容易な 人工器官を製造する。 長期保存 本発明の他の好適例では、本発明に従い架橋した、生物組織を約 0.5％のグル タルアルデヒドの溶液中で包装することができる。無菌技術を用いて、無菌の、 生理学的食塩水（例えば、 0.9％の塩化ナトリウム）で、この生物組織を入念に 水洗することができる。食塩水洗浄の目的は、この組織の表面上およびこの組織 の間隙空間中に存在する残留グルタルアルデヒドの濃度を減少させることにあり 、これにより患者の中毒応答の可能性を最小にする。この生物組織を、プラスチ ックまたは重合体の容器に入れ、無菌の食塩水を満たし、さらに覆うかまたは封 をすることができる。この生成物の覆いは、移植の時まで開かない永久的なシー ルであるべきである。 本発明は、生物組織の強度、柔軟性に関し優れた組織を提供し、抗原性を低下 させる。これらの特徴は、生物組織を移植するのに必要な緊張の多い方法、およ び身体により拒絶される可能性を考慮すると、特に好ましい。いくつかの生物組 織を移植する方法に関して、生物組織は、耐キンク性、良好な縫合糸穿刺性、お よび縫合孔を容易に封ずることができる能力を有しなければならない。縫合の保 持、すなわち、引張力に耐える能力は、高くなければならない。付加的に、この 移植片は、起こりうる高収縮圧に対抗し、動脈瘤形成に対して防御できるように 、高い耐破壊性を有しなければならない。不十分にしか強くなく、および／また は、余りに抗原性である移植片は、潜在的に患者に対して致命的であることがあ る。 本発明により製造した人工器官をキットとして包装し、好ましくは 0.9％のNa Cl溶液中で無菌の、湿式で包装することができる。かかる付加的要素の選択は、 当業者の技術的範囲にある。 実施例実施例１ 新鮮な組織（例えば、血管、心臓、心臓弁、または心膜）を、地方の加工施設 (processing facility)（ウシ、ブタ、ヒツジ、等）から入手し、氷上の生理学 的食塩水（ 0.9％の塩化ナトリウム）に入れた。この組織は直ちに解剖するか、 あるいは新鮮な無菌食塩水に入れ、一昼夜冷蔵した。無関係の組織、例えば、脂 肪組織、骨格筋、心筋層、骨、気管、等をこの関心のある組織から慎重に除去し た。次いでこの組織を再び洗浄し、新鮮な無菌食塩水に浸漬した。 この技術は、種々に変化させたグルタルアルデヒドの濃度範囲に従って行うが 、約0.03％v/v の濃度が、放射線防護の特性を提供し、さらに架橋時間が製造計 画の範囲内でほどよく合致した。10.0リッターの50mMクエン酸塩緩衝剤で処理し た0.03％(v/v)のグルタルアルデヒドについて： 工程１） 50mMのクエン酸塩緩衝液を、次の組成で調製した（10リッター）： 9.0リッターの無菌の、脱イオン化した水に： 140.0グラムのクエン酸ナトリウム 5.0グラムのクエン酸一塩基酸 38.6グラムの塩化ナトリウムを加え この溶液の体積を無菌の、脱イオン化した水で10.0リッターにする 工程２） 工程１で調製した50mMクエン酸塩緩衝溶液の9.0 リッターに、6.0 ミリリ ッターの50％生物学的等級グルタルアルデヒドを添加する この溶液の体積を工程１で調製した50mMクエン酸塩緩衝溶液で10.0リッタ ーにする。 工程３） この溶液のpHを塩酸または水酸化ナトリウムで6.40±0.05に調整する。 次いで、この組織を、架橋反応用に、室温（20〜25℃）で、このグルタルアル デヒド溶液中に浸漬する。固定時間の進行に伴い、収縮温度曲線の形（図９参照 ）で示すように、架橋数が増加する。ポリグルタルアルデヒド架橋の形態で組織 によりグルタルアルデヒドが消費されるので、溶液中のグルタルアルデヒドの濃 度が減少する。したがって、架橋反応中に時々この固定液を補給するのが望まし いことがある。大部分の架橋が初期に形成されるので、この溶液を反応の開始後 約８時間、次いでその後毎日交換するのが望ましい。 溶液中のグルタルアルデヒドの濃度に基づいて、約24〜120時間の範囲の時間 、組織をグルタルアルデヒド溶液に曝す。一般に、高濃度のグルタルアルデヒド は短時間の固定に対応し；低濃度のグルタルアルデヒドは長時間の固定に対応す る。0.03％溶液に対しては、組織の間隙内の架橋結合密度を最大にするのに、約 72時間の暴露時間で十分である。このことは約80〜89℃の収縮温度に対応し、用 いる組織の種類に依存する。 この架橋反応を終えてから、この組織を、２％(v/v)のグルタルアルデヒド、 ３％(v/v)のホルムアルデヒド、および20％(v/v)のエチルアルコールを含む滅菌 剤溶液に入れる。この多成分滅菌剤は、水洗および包装に先立ち、この組織上の あらゆる残留汚染微生物数を減少させる。 次いで、この組織を十分な量の無菌食塩水で入念に水洗し、プロセッシング化 学物質の存在を最小にする。この洗浄には代表的に24時間にわたる40リッターま たは50リッターのアリコートを用いる必要がある。暴露時間は慎重に監視すべき である。その理由は、この組織からの残留物の拡散が時間に依存する現象だから である。最終的水洗の後、この組織を無菌容器（バルブジャー、血管移植バイア ル、等）に入れ、無菌食塩水を満たす。次いで、この包装に永久的に封をする。 注意すべきことに：多成分滅菌剤を用いた汚染微生物数を減少させる処理に続く 組織の取扱いすべてを、Ｅビーム滅菌に先立ち汚染の広がりを最小にするよう、 できるだけ無菌的に行うべきである。実施例２ ２つの同一の実験を行い、異なる濃度のグルタルアルデヒドがウシ頸動脈血管 人工器官の物理学的特性に及ぼす影響を評価した。動脈を冷却した、無菌食塩水 （ 0.9％塩化ナトリウム）に入れた。無関係の組織、例えば、脂肪組織、骨、軟 骨、結合組織、等を血管組織から取り除いた。これらの血管をクエン酸塩で緩衝 化したフィシン溶液を用い、酵素により消化して、平滑筋組織の特定部分を除去 した。これらの動脈を入念に水洗し、グルタルアルデヒドを含む２つのタンクの うちの１つに入れ、組織のコラーゲン成分を架橋した。１つのタンクには、50mM のクエン酸塩で緩衝化した0.01％のグルタルアルデヒドが含まれ、他のタンクに は、50mMのクエン酸塩で緩衝化した0.05％のグルタルアルデヒドが含まれていた 。0.01％溶液中の動脈を約５日間架橋させ、0.05％溶液中の動脈を約２日間架橋 させた。架橋反応を終えて、滅菌工程として、すべての動脈を50mMのクエン酸塩 で緩衝化した２％グルタルアルデヒド溶液に入れた。 次いで、組織試料の放射引張強度および縫合保持強度について評価した。放射 引張強度試験には、架橋した頸動脈の一部を切断すること、縦方向の切開を行う こと、および「Instron 」のような装置で機能不全が起こるまでこの組織を放射 方向に引っ張ることが含まれる。縫合保持強度試験には、外科的な縫合のループ 、例えば、5-0 PTFE含浸ポリエステル縫合糸を、組織試料を通して切断した横断 面の端部から特定の距離をおいて挿入することが含まれる。この距離は、刺傷サ イズ、おそらく、例えば、約３mmである。この縫合糸を、この組織が「Instron 」のような装置で機能不全を起こすまで引っ張る。引張強度および縫合保持強度 試験の結果を、それぞれ、図１および２に示す。 引張強度試験の結果は、固定液濃度の変動に原因がある組織の強度において何 ら有意差がないことを示した。見掛け上の広い誤差線は、生物組織に見出される 固有の多様性に起因する。 縫合保持強度において、両濃度についての強度は、バッチ２でバッチ１より一 層低い傾向があると思われた。このことは、おそらく酵素による消化処理が異な る結果であると考えられる。各フィチン溶液は、酵素活性がわずかに異なる。換 言すれば、バッチ２について調製した消化のための溶液が、バッチ１について調 製した溶液よりもわずかに高い酵素活性を有していたと考えられる。しかし、バ ッチ内の強度の差はごくわずかである。実施例３ 種々の濃度のグルタルアルデヒドが、ウシ正中動脈血管人工器官のいくつかの 物理学的特性に及ぼす効果を評価するために、実験を行った。組織の処理は、架 橋工程まで、実施例２に記載したのと同一にした。これらの消化した血管を架橋 用の３つのタンクのうちの１つに入れた。タンク１には、50mMのクエン酸塩で緩 衝化した0.01％のグルタルアルデヒドが含まれ、タンク２には、50mMのクエン酸 塩で緩衝化した 0.075％のグルタルアルデヒドが含まれ、またタンク３には、50 mMのクエン酸塩で緩衝化した 2.0％のグルタルアルデヒドが含まれていた。これ らの動脈を、架橋反応が完了するまでか、または約４日間、各々のタンクに残し た。架橋反応が完了してから、タンク１および２からの半分の動脈を、滅菌工程 として、50mMのクエン酸塩で緩衝化した２％のグルタルアルデヒド溶液に加えた 。他の半分は、最初の溶液に残した。24時間後、すべての動脈を40％のエチルア ルコールを含む個々のガラスバイアルに入れ、覆った。次いで、各群からの試料 について次の：放射引張強度試験、縫合保持強度試験、および破裂強度試験を行 った。 図３に示すように、放射引張強度および縫合保持強度は、この実験の各々の条 件で処理した組織について極めて類似していた。極値（0.01％および 2.0％）が 特に興味深い。その理由は、このデータがその範囲の一層低い限界を示すからで ある。このデータは、高濃度の固定により高い熱安定性が得られ、高強度が得ら れると主張する極めて一般的な工業上の概念と矛盾する。これらの結果、ならび に、図６の収縮温度データは、このことがあてはまらない。0.01％／２％群が、 他の群より顕著に低い引張強度を有するという事実は、アーチファクトであると 考えられる。２％グルタルアルデヒドを用いたその後の処理が、むしろ、組織を 強化し、組織を弱めることがないと考えられる。 図４には、破裂強度試験の結果を示す。この図では、血管人工器官試料を破裂 するまで水で膨張させる。破壊時の内圧を破裂強度として記録する。さらに、極 値を見ると、低グルタルアルデヒド試験群を通常の２％架橋の１／200濃度のグ ルタルアルデヒドで固定しても、結果はほとんど同一である。実施例４ 図5aおよび5bは、それぞれ、低グルタルアルデヒド固定により製造した短鎖分 子内架橋の形成および高グルタルアルデヒド固定により製造した長鎖分子間架橋 の形成を示す簡略図である。これらの図は、分子内架橋の存在下に、ペプチド結 合が放射線暴露により開裂したとしても、コラーゲン鎖の完全性の大部分が維持 され得ることを示す補助となる。 得られた試料の収縮温度、または変性温度を測定することにより、組織の架橋 結合密度を分析することができる。低グルタルアルデヒドで架橋した組織は、一 層高い分子内架橋結合密度を形成し、このことは、通常の固定組織よりも高い収 縮温度により表すことができる。この関係を、15個のブタ大動脈弁の小葉の２つ の群を 0.5％または0.05％グルタルアルデヒドで架橋することにより示す。収縮 温度を示差走査熱量計により測定し、それらの結果を図６に含める。実施例５ 実験は、Ｅビーム照射に曝した、グルタルアルデヒド架橋組織が、高い血流力 学性能特性、例えば、屈撓性を有することを示した。増加した可撓性の証拠は、 心臓弁を横断する圧力低下（弁の流入側から流出側への圧力の変化）を測定する ことにより提供し、その結果を図７に示す。また、高い屈撓性を、図８に示すよ うに、有効なオリフィス面積、血液が流れる断面積を測定することにより示す。 これらの試験結果は、心臓弁をＥビーム放射に曝すことにより、非放射弁よりも 容易に、しかも広範囲に開放する傾向がある一層柔軟な小葉になることを示す。 このことは、レシピエントに短期間の、および長期間の利点を与える。その理由 は、一層広い有効オリフィス面積により、一層多くの心拍出量が得られ、したが って、心臓活動の効率を高め、結果として起こる石灰化および弁の破壊をもたら す尖の破損(cuspal fracture)が発生する傾向を減少させる。 ８つの心臓弁を実施例１に示すようにグルタルアルデヒドで架橋し、Ｅビーム 放射に曝した。心臓弁をＥビーム照射にかける前の心臓弁を横断する圧力低下を 、心臓弁をＥビーム放射にかけた後の圧力低下と比較した。図７には、インビト ロ流量試験機で定常状態において試験した場合、圧力低下が減少したことを図示 する。対照点として、直線の、妨げられていない管は、零である。 図８には、心臓弁をＥビーム放射に曝す前後の有効オリフィス面積を比較し、 有効オリフィス面積がＥビーム放射後に増加することを示す。 有効オリフィス面積の決定は、脈拍複製システム(Pulse Duplicator System) 中に試験弁を配置することにより行った。脈拍複製機は、試験弁を含むシミュレ ーションした心臓内の戦略上の位置での圧力および流速を測定することにより、 多数の弁関連関数を計算することができる。 有効オリフィス面積(EOA)を次のように定義する： EOA＝ Qrms /(51.6 √ΔP)、cm2 で表し、 式中、 Q rms ＝陽圧低下の期間中に得た二乗平均流速、ml／秒 ΔP ＝平均陽圧低下、mmHg 照射した組織心臓弁膜における高い血行動態を支持する理論には、コラーゲン 三重らせんを無傷に保つ分子結合の破壊が含まれる。この技術により提供される 分子内架橋は、放射によりコラーゲン独自の構造的骨格が弱められるので、コラ ーゲンバックボーンに対する補強としてはたらく。十分な分子内架橋の存在下の 、25kGy の線量は、組織を一層屈撓性にするのに十分なまでタンパク質骨格を弱 め、しかも組織の性能が改善する。 同様の結果が、これらの２つの実験を繰り返す度に得られた。正確な機構は知 らないが、分解反応がコラーゲン分子内で起こると理論付けることができる。コ ラーゲン鎖を相互に保持する結合は、組織をＥビーム放射にかけると壊れると考 えられる。しかし、分子内グルタルアルデヒド架橋の存在は、コラーゲン分子の 一次構造を無傷に保ち、そのため柔軟な組織の完全性を維持すると考えられる。実施例６ 生物組織を滅菌する方法としての放射の主要な研究は、生成物の長期の耐久性 に及ぼす効果である。FDA は目下、組織弁が加速摩耗試験機上での20億回の心周 期に耐える能力を示すことを要求している。このことは、約５年の実時間と解釈 される。将来のある時点で、同一の試験の38億回の周期を要求されることがある 。 Ｅビーム放射が組織弁の耐摩耗性に及ぼす効果を決定するために、試験を行っ た。４つの群の弁を試験した： 第１群 0.03％のグルタルアルデヒド中で架橋した； 0.5％のグルタルアルデヒド中に貯蔵した（Ｅビーム陰性対象）。 第２群 0.03％のグルタルアルデヒド中で架橋した； 残留物を除去するために水洗した； 0.9％の塩化ナトリウム中に貯蔵した Ｅビーム滅菌した、25kGy 。 第３群 0.03％のグルタルアルデヒド中で架橋した； 抗石灰化法で処理した； 残留物を除去するために水洗した； 0.9％の塩化ナトリウム中に貯蔵した Ｅビーム滅菌した、25kGy 。 第４群 0.5％のグルタルアルデヒド中で架橋した； 残留物を除去するために水洗した； 0.9％の塩化ナトリウム中に貯蔵した Ｅビーム滅菌した、25kGy （濃縮陰性対照）。 この実験の結果を以下の表１に示す。これらの結果は、対照弁（第１および第 ４群）に比較して、組織弁をＥビーム放射に曝すことが、38億９千万回の心周期 でのインビトロ試験後の耐久性に、負の効果を及ぼさないことを明白に示してい る。実際に、最良の摩耗データを示す群は、抗石灰化用の処理後に、Ｅビームに 曝した群であった。 実施例７ 血管移植人工器官、例えば、動脈の外膜、脂肪組織および筋肉組織を剥ぎ、活 性化プロテアーゼ中で消化する。このストリッピングし浄化した動脈を、制御し た塩基性pHでコハク酸無水物で処理して、この動脈の表面上に負電荷を生じさせ る。次いで、負に荷電した動脈を、クエン酸塩緩衝液中の約 0.005〜約５％の範 囲の濃度のグルタルアルデヒドで処理し、架橋により動脈を固定し強化すること ができる。好ましい濃度は、約0.01％以下である。本発明によれば、低濃度のグ ルタルアルデヒドは、低濃度のグルタルアルデヒドおよび高濃度のグルタルアル デヒド濃縮物を用いて架橋した移植生成物の質的な比較評価結果に基づく、代表 的に一層柔軟で屈撓性の生成物を生じる。質的には、低濃度のグルタルアルデヒ ドを用いて架橋した移植生成物の高いたわみ性は、移植片の曲率半径を評価する ことにより示し；この半径は、低濃度のグルタルアルデヒド中で固定した生成物 において、高濃度のグルタルアルデヒド中で固定した生成物よりも小さい。 次いで、固定した移植片を、約１％〜約４％の範囲、好ましくは約２％の濃度 でグルタルアルデヒドを用いて滅菌することができる。 この工程の組み合わせは、高強度、高耐久性、高たわみ性、および低血栓形成 性を有する人工器官を生成する。 本発明における消化工程には、活性化プロテアーゼを用いて、移植片の表面か ら抗原性物質を除去することが含まれる。タンパク質分解酵素、フィシンを血管 調製の浄化工程の一部として用いることが知られているが、本発明の方法では、 活性化プロテアーゼを用いることにより本来の移植人工器官からの、抗原性組織 の一層効果的な除去が提供される。消化工程後に残留するものは、コラーゲンマ トリックスである。実施例８ 収集後、この移植片をプロテアーゼ、好ましくは活性化プロテアーゼ中で消化 し、この移植片から抗原性物質を除去する。好適例では、活性化プロテアーゼは フィシンであり、さらに好ましくは、フィシン濃縮物にシステインを添加するこ とにより活性化した濾過したフィシンである。好適例では、クエン酸およびクエ ン酸ナトリウムを含む緩衝液を使用するが、他の緩衝液を用いることもできる。 本発明の実施に用いるフィシンの特定量は、用いるフィシンの活性に依存する 。 その理由は、酵素の活性レベルに変動があるのが通常だからである。用いるフィ シンの異なる活性レベルを整えるために、移植片を製造するのに必要なフィシン の正確な量を代表的に調整し、その都度一定の容量測定の活性を達成するように 、移植片を製造する；すなわち、移植片製造に用いるべきフィシンの特定量の決 定には、代表的に、フィシンの活性を評価し、記された活性に従って、使用する フィシンの量を調整することが必要である。代表的に本発明に従って用いるフィ シンの濃度は、約20リッターの反応容積に対し約65グラムのフィシンを添加する ことになる。好適例では、消化溶液のフィシン活性は、約 9.8ミリモルNPZG／リ ッター分である。 消化中には、温度およびpHを監視すべきである。一例において、30℃および50 ℃の間の範囲の温度、より好ましくは40℃±２℃の温度とすべきである。pHは、 ５および７の間の範囲、より好ましくは、 6.3±0.1 の範囲にすべきである。使 用する消化時間は絶対的ではないが、いかなる抗原性物質をも除去するのに十分 なものとするべきである；代表的に、２〜３時間で十分である。次いで、移植片 を蒸留水中で数回洗浄すべきである。好適例では、移植片を４回水洗する。消化 を、停止浴中、好ましくは塩化ナトリウムを含む停止浴中で終了させる。好適例 では、塩化ナトリウムの濃度は 0.1％である。次いで、移植片を再び、好ましく は４回水洗する。実施例９ 止血鉗子を用いて、リングスタンドから１つの動脈を吊るす。清浄な鋏で、こ の動脈から外膜、脂肪組織、および筋肉組織を剥ぐ。この動脈を清浄な 0.9％の 塩化ナトリウムを含む氷上の清浄なビーカーに入れる。すべての動脈を剥ぐまで 上記の工程を繰り返す。 縫合糸で側面の枝状血管(side branch)を血行を止める。できるだけ主動脈の 近くで３重の外科結びにより止める。結節近くの過剰な側面枝状血管を切り取る 。すべての側面枝状血管を結んだ後、リングスタンドからこの動脈を取り除く。 大容量のシリンジに 0.9％塩化ナトリウム溶液を満たし、適切な液漏れ試験器 具をガラス製注射器の先端に装着する。止血鉗子を用いて、この動脈の一端を締 める。シリンジの先端を動脈の他端に挿入する。一方の手を用いて、この動脈の 端部をこのシリンジの先端に確保し、この動脈の管腔に食塩水をゆっくり注入し 液漏れを検出する。3-0 、4-0 、または5-0 縫合糸を用いてどんな液漏れをも止 める。縫合糸を３重の外科結びにより縛る。この動脈がシリンジに適切な圧力を かける条件下に液漏れがなくなるまで、動脈中の漏れ口を縫合し続ける。縫合し た動脈を清浄な 0.9％の塩化ナトリウムを含む氷上の清浄なビーカーに入れる。 所望の数の動脈を縫合するまで上記工程を繰り返す。 H2O に 420グラムのクエン酸ナトリウムおよび14.4グラムのクエン酸を溶解し 、この容積を21リッターに調整する。pHを測定し、必要なら 6.3に調整する。全 体のクエン酸濃度は、95.4％のナトリウム塩および 4.6％の酸の形態を有する71 .3mMである。 反応容器を 17.32リッターのフィシン緩衝液で満たし、混合機を回す。このタ ンク中にヒーターコイルを入れ、熱水を循環させて、この緩衝液を40℃に加熱し 始める。糸を通したホースバーブ器具(threaded hose barb fitting)をこれらの 動脈に挿入し、それらを固定するためにケーブルタイを用いる。これらの動脈を 、この糸を通した器具を用いてこの移植マニホルドに取り付ける。この移植マニ ホルドを相互に、さらに移植マニホルド支持アセンブリに、３／８″×２″ステ ンレススチールのペグを用いて取り付け、反応容器に入れる。各マニホルドを通 る1.05リッター／分の流速を有すポンプを始動させる。反応容器温度が40℃で安 定してから、活性化フィシン濃縮液を添加する。 濃縮フィシン溶液を85グラム／リッターのシグマ社ラテックス粉末と当量にす る。40℃の水振盪機浴中のフラスコに 2.8リッターのフィシン緩衝液を入れる。 約65グラムのフィシン粉末が必要である。このフィシン粉末を40℃の緩衝液中で 溶解し、５ミクロンの「Gelman Acro 50A 」濾過機により濾過する。 フラスコに2.68リッターの濾過した酵素濃縮物を秤取り、40℃の水浴に入れる 。６グラムのL-システインを計り、活性化のために酵素濃縮物に添加する。５分 後、この酵素濃縮物を反応容器に添加し、消化を開始する。消化は、２1/2時間 行う。温度を40℃＋／−２℃に維持し、pHを監視して、 6.3＋／−0.1 に保つべ きである。 これらの動脈を定期的に試験する。過度のキンクを除去して、マニホルドの全 域で流量を一様に配分する。これらの動脈は、外見上20分内にピンク色から銀色 に変化する。消化中に管腔はわずかに拡がり、これらの動脈の長さが約35％増加 する。消化の終点で４回の完全な水洗を行う。 停止浴に関して、２０ｇの亜塩素酸ナトリウムを、２０リットルのＨ2Ｏ中に 溶解した。ポンプおよびかきまぜ機を閉鎖した。排出弁を開き、タンクを空にし た。排出弁を閉じ、反応器に、２０リットルのＨ2Ｏを充填した。ポンプおよび かきまぜ機を作動させ、数分間放置して平衡させた。洗浄を合計４回繰り返した 。 ポンプおよびかきまぜ機を閉鎖し、排出弁を開いて、タンクを空にした。排出 弁を閉じ、反応器に、停止浴溶液を充填した。ポンプおよびかきまぜ機を作動さ せた。停止浴を１５〜２０分間作動させて、すべての残留酵素を不活性化した。 反応器の内容物を排出し、完全な洗浄を４回実施した。 １６８０．２ｇの炭酸水素ナトリウムをＨ2Ｏ中に溶解し、希釈して２０リッ トルとした。ポンプおよびかきまぜ機を閉鎖し、最後の洗浄液を、タンクから排 出させた。反応器に、２０リットルの炭酸水素塩溶液を充填した。ポンプおよび かきまぜ機を作動させ、１５分間放置して平衡させた。 １４２．８ｇの無水コハク酸を秤量した。無水物の１／２を、反応器に、平衡 させた時期の１５分後に加えた。結晶を溶液中に分散させて、かきまぜ機が、こ れらを、タンク中に混合することができるようにした。第２の半分の無水物を、 第１の添加の３０分後に加えた。この充填には、さらに６０〜９０分を要した。 結晶がすべて溶解し、気泡がもはや溶液中に形成しなくなった際に、充填を完了 した。充填を実施した後、ポンプおよびかきまぜ機を停止し、タンクの内容物を 排出し、完全な洗浄を４回実施した。 ８．０リットルのＨ2Ｏを計量し、清浄なカーボイ中に配置した。１１２．０ ｇのクエン酸ナトリウムを秤量し、カーボイに加えた。４．０ｇのクエン酸を秤 量し、カーボイに加えた。カーボイ中に、電磁かきまぜ棒を配置した。カーボイ を、かきまぜプレート(stir plate)上に配置し、固体がすべて溶解するまで混合 した。クエン酸塩濃度は、５０ｍＭであり、これは、９５．２％のクエン酸ナト リウムと、４．８％のクエン酸とからなっていた。 １．６ミリリットルの５０％グルタルアルデヒドを計量し、クエン酸緩衝液に 加え、この間、これを、尚、かきまぜプレート上に配置した。溶液を放置して、 １０〜１５分間平衡させた。ｐＨを試験し、６Ｍ ＮａＯＨまたは６Ｍ ＨＣｌ を用いて、必要であるように６．４０＋／−０．０５に調整した。 清浄な固定タンクを、排気フードの下に配置した。固定台を、固定タンク（標 準バッチに関して２のレベル）中に配置した。０．０１％のグルタルアルデヒド 溶液を、カーボイから固定タンクに移動した。架橋条件を約１２０時間以内維持 し、グルタルアルデヒド溶液を周期的に、即ち２４時間おきに装入した。 マニホールドを反応器から取り出した。清浄なはさみを用いて、動脈を、相並 んだ尺側分岐の末端側で切断した。動脈を、脱イオン水のビーカー中に配置した 。前記段階を、すべての動脈が、マニホールドから除去されるまで繰り返した。 １つの移植片を、ビーカーから取り出した。移植片を、全長方向に(fully len gth-wise）延伸した。移植片を、適切な大きさのマンドレル上に配置し、これを 、全長方向に延伸した。移植片を有するマンドレルを、固定タンク中の固定台上 の箇所中に配置した。前記段階を、すべての移植片が、マンドレル上に配置され 、固定タンク中に配置されるまで繰り返した。時刻を固定タンク中に記録し、タ ンクを覆った。 移植片を、固定溶液中に２４時間配置した際に、新たなバッチの０．０１％グ ルタルアルデヒドを調製し、この溶液を、清浄な固定タンク中に移動した。固定 台全体（移植片を含む）を、現存の固定タンクから、新鮮なグルタルアルデヒド 溶液へと移動した。古いグルタルアルデヒドを廃棄した。タンク中に、新鮮なグ ルタルアルデヒドを、排気フードの下で配置した。固定タンクを覆った。この溶 液を、後に２４時間おきに交換した。 ７．６８リットルの脱イオン水を計量し、清浄なカーボイ中に配置した。１１ ２．０ｇのクエン酸ナトリウムを秤量し、カーボイに加えた。４．０ｇのクエン 酸を秤量し、カーボイに加えた。カーボイを、かきまぜプレート上に配置し、固 体がすべて溶解するまで混合した。クエン酸塩濃度は、５０ｍＭであり、これは 、９５．２％のクエン酸ナトリウムと、４．８％のクエン酸とからなっていた。 ３２０ミリリットルの５０％グルタルアルデヒドを計量し、クエン酸緩衝液に 加え、この間、これを、尚、かきまぜプレート上に配置した。溶液を放置して、 １０〜１５分間平衡させた。ｐＨを試験し、６Ｍ ＮａＯＨまたは６Ｍ ＨＣｌ を用いて、必要であるように６．４０＋／−０．０５に調整した。グルタルアル デヒド溶液を、清浄な固定タンクに移動し、その後、滅菌工程を実施した。 約１２０時間の固定の後、移植片を、２％グルタルアルデヒド溶液中に移動し た。固定タンクを排気フードの下に配置した。固定タンクを覆った。移植片を放 置して、２％グルタルアルデヒド溶液中に、４〜５時間維持した。 実施例１０ 生物組織を、以下のようにして製造することができる： １．個々の組織弁を、クエン酸（ｐＨ６．４において）またはＨＥＰＥＳ（ｐ Ｈ７．４において）のいずれかで緩衝した、０．０１％、０．０２％、０．０３ ％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％または０． ０９％のグルタルアルデヒドに、２０℃で、２、４、５、７、９または１０日間 暴露する。 次に、架橋した生物組織を、水性緩衝液中の、２％グルタルアルデヒド、３％ ホルムアルデヒドおよび２０％エタノールの多成分滅菌剤中で初期滅菌すること ができる。次に、初期滅菌した生物組織を、随意に０．１Ｍ ＡｌＣｌ3を含む エタノールで抽出し（６０％エタノール）、生理食塩水で２４時間洗浄すること ができる。 次に、生物組織を、生理食塩水溶液中に収納し、組織をｅビームに暴露するこ とにより、最終滅菌する。 本発明を、例示および実施例により若干詳細に記載したが、本発明において、 種々の修正および代替の形態が可能であり、本明細書中に記載した特定の例に限 定されるものではないことを理解されたい。これらの特定例は、本発明を限定す ることを意図するものではない一方、本発明の本意および範囲内のすべての修正 、同等の形態および代替の形態をも含むことを意図することを理解されたい。Description: IMPROVED CROSSLINKING OF NATURAL TISSUE Field of the Invention The present invention relates to the processing of biological tissue, such as heart valves, with a cross-linking agent, such as glutaraldehyde. Background of the Invention Producing bioprosthetic tissue prior to implantation typically involves treating it so that it is stable to subsequent in vivo enzymatic degradation. Typically, this treatment comprises cross-linking molecules, especially collagen, on and / or in the tissue. Various aldehydes have been used for this purpose, including glyoxal, formaldehyde and glutaraldehyde. However, glutaraldehyde is usually a somewhat special drug. The reason is that it is used at physiological pH under aqueous conditions. In addition to tissue cross-linking, glutaraldehyde is a good sterilant, reducing tissue antigenicity after implantation. In addition, the use of glutaraldehyde has been shown to be beneficial in producing tissue with better thermal stability, better flexibility (compared to traditional cross-linking approaches) and increased durability. Was done. However, glutaraldehyde is also cytotoxic--even at low concentrations of glutaraldehyde it is necessary to wash the tissue to remove residual glutaraldehyde. At concentrations typically used to cross-link biological tissues-about 0.6% v / v, concentrations as low as 0.2% have been successfully used-the toxicity of glutaraldehyde is , Out of the question. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides an excellent method of cross-linking or fixing collagen biological tissue, such as porcine heart valves, using low concentrations of cross-linking agents. The residual level of crosslinker is reduced while the durability and flexibility of the treated tissue is maintained or enhanced. Since this method uses an aqueous release system, it is therefore not only potentially toxic, it also dehydrates, denatures or destroys collagen-containing substances (ie veins, arteries, heart valves, etc.), organic solvents such as The use of acetone is avoided. Other properties of low concentration glutaraldehyde immobilization include: 1) A relatively high degree of intramolecular binding provides a softer tissue. For heart valves, this means improved hemodynamics; for vascular grafts, this means greater resistance to spasm. 2) A relatively high degree of short chain intramolecular crosslinking (along collagen strands). It also provides the tissue with protection from what is known to cause chain scission reactions in the collagen protein matrix. This is in contrast to long chain intermolecular crosslinks (between collagen strands), which predominate at high concentrations of glutaraldehyde. 3) Resistance to calcification. Calcification of prosthetic products, such as prosthetic heart valves, is a highly complex process contributed by many factors. One of these is that calcification tends to occur in the presence of residual free glutaraldehyde. Fixation in low concentrations of glutaraldehyde typically reduces the amount of residual glutaraldehyde in the tissue. In addition, calcifications also tend to appear near tissue crevices, while the relatively soft tissues resulting from low-concentration crosslinking are less prone to rupture or fissure over time. While suitable for many vascular prostheses, the present invention is particularly valuable in the field of replacing small diameter blood vessels. The present invention is useful in coronary artery bypass procedures, especially when the patient has previously undergone coronary artery replacement surgery and the appropriate saphenous vein or internal thoracic artery is no longer present due to a previous extraction. is there. Since prostheses made in accordance with the present invention have a patency equal to or better than that of the saphenous implant, the use of such a prosthesis eliminates the need for saphenous vein extraction. To do. The invention can also be applied to the replacement of microvessels in tissue, for example blood vessels in the hand or foot. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 compares tensile strength values for bovine carotid arteries crosslinked in 0.01% glutaraldehyde with those for bovine carotid arteries crosslinked in 0.05% glutaraldehyde. FIG. FIG. 2 compares the suture retention value of bovine carotid artery crosslinked in 0.01% glutaraldehyde with the suture retention value of bovine carotid artery crosslinked in 0.05% glutaraldehyde. FIG. 3 is a diagram showing the influence of various fixation conditions on the tensile strength and suture retention strength of bovine median arteries. FIG. 4 is a diagram showing the influence of various fixation conditions on the rupture strength of bovine median arteries. Figures 5a and 5b show the difference between low concentration glutaraldehyde intramolecular crosslinking and high concentration glutaraldehyde intermolecular crosslinking, respectively. FIG. 6 shows leaflet contraction temperature of leaflets cross-linked in 0.5% glutaraldehyde and 0. FIG. 6 compares leaflet shrinkage temperature of leaflets cross-linked in 05% glutaraldehyde. FIG. 7 is a diagram showing the influence of the electron beam on the pressure drop. FIG. 8 is a diagram showing the influence of the electron beam on the effective orifice area. FIG. 9 is a diagram showing contraction temperature vs. fixation time for aortic root tissue. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The method of the present invention comprises the step of exposing biological tissue to less than about 0.1% by volume crosslinking solution, preferably from about 0.01 to about 0.099% by volume fixative solution. Includes treating or processing tissue. In a preferred embodiment of the invention, the fixative solution is a buffer solution containing glutaraldehyde. As used herein, "biological tissue" means a substance having collagen derived from various animal species, typically mammals. The biological tissue is typically a soft tissue suitable for transplantation, such as a prosthetic tissue, but the present invention is not limited thereto. Specific examples include heart valves, especially porcine heart valves; aortic roots, walls and / or lobules; pericardium, preferably bovine pericardium, etc., and products derived from pericardium, such as pericardial patches; connective tissue derived Materials such as dura; allograft tissues such as aortic allografts and saphenous bypass grafts; tendons, ligaments, skin patches; blood vessels, particularly bovine arteries and veins, and human navel tissue such as veins; bones and the like. Included, but not limited to. Materials from any other organism known or known to be suitable for processing in accordance with the present invention are within the scope of the present invention. In the present invention, the explanted biological tissue can be processed by any suitable method and subsequently exposed to a cross-linking agent. Typically, the biological tissue is carefully washed, then treated with a filtered proteolytic enzyme concentrate and digested, which removes most of the antigenic tissue from the biological tissue. When using native tissue, the washing step typically involves removing adventitial and unwanted fat and muscle tissue from the tissue. As used herein, exposing biological tissue to a cross-linking agent refers to any method of contacting biological tissue with the cross-linking agent. In the preferred embodiment of the present invention, exposing the tissue to a crosslinking agent means immersing the tissue in the crosslinking agent. When immersing the tissue in a solution of a given concentration of a cross-linking agent, such as an aldehyde, such as glutaraldehyde, the concentration of glutaraldehyde in the interstices of the tissue reaches equilibrium with the surrounding solution, and thus the tissue is , Truly, undergoes low concentration crosslinking. However, when glutaraldehyde is provided by the atomizer, the monomeric glutaraldehyde deposits directly on the surface of the substrate. Regardless of the initial concentration of the solution before evaporation, pure glutaraldehyde comes into contact with the tissue. Therefore, controlling concentration in tissues is extremely difficult, if not impossible. Glutaraldehyde, which is typically used in the present invention, is a biological grade 50% solution commercially available from, for example, Electron Microscopy Sciences (Fort Washington, PA, USA). is there. Such commercially available glutaraldehyde is also available in various other grades, purities and / or concentrations. Some bio-grade glutaraldehydes typically require no additional purification, but the final cross-linking solution is passed through a hydrophilic membrane filter with a pore size of 0.2μ to allow all biological biology. It is desirable to remove static contaminants. In the present invention, biological tissue can be exposed to a fixative solution containing glutaraldehyde in a suitable buffer. Buffers suitable for use in the practice of the present invention have sufficient buffer capacity to maintain a physiologically acceptable pH, do not cause significant harm to biological tissue, and / or interfere with processing steps. It is a thing. Exemplary buffers include phosphate buffered saline (PBS), and organic buffers such as N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N '-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES) or morpholinepropanesulfonic acid. (MOPS); and buffers including, but not limited to, borate, bicarbonate, carbonate, cacodylate or citrate. A preferred fixative solution is less than 0.1% v / v glutaraldehyde solution in citrate buffer. In an exemplary protocol of the invention, biological tissue can be exposed to the fixative solution for a time and at a temperature sufficient to cause cross-linking of collagen in and on the biological tissue. For example, biological tissue may be added to a buffered glutaraldehyde solution at a temperature of about 4 to about 37 ° C., preferably about 20 ° C., at a pH of about 6 to about 8, preferably about 6.3 to about 6.5. Exposure can be within 10 days, preferably for about 2 to about 5 days. In the present invention, one of ordinary skill in the art will recognize that certain parameters in the processing protocol may be varied to achieve particular goals. These parameters include glutaraldehyde concentration, solution composition, pH and ionic strength, time and temperature of exposing biological tissue to glutaraldehyde, and tissue-to-solution volume ratio, and shape of biological tissue during initial fixation. However, the present invention is not limited to these. The present invention is not limited thereby. Typically, the crosslinked biological tissue is then rinsed, eg, with any suitable rinse or wash material. In a preferred example, the detergent is sterile saline. The tissue can be rinsed with a large volume of sterile saline for about 24 hours, or until the concentration of residual processing chemicals in the tissue is below what is considered toxic (about 1 ppm). One of ordinary skill in the art will also recognize that the present invention includes additional processing. For example, exposing the crosslinked biological tissue to one or more anticalcification agents, one or more contaminating microbial count reducing agents, at least one wash solution and one or more sterilizing agents or protocols. it can. Moreover, as will be shown in more detail below, the biological tissue cross-linked according to the present invention can be stored for up to about a year or more until finally sterilized. Exemplary additional processing is shown in more detail below. Contamination Microorganism Reduction In the examples of the present invention, the cross-linked biological tissue may be exposed to one or more contaminating microorganism count reducing agents, typically within about 10 hours, preferably for about 2 to about 4 hours. included. For example, a porcine heart valve treated with glutaraldehyde as described above is then exposed to a buffer solution containing about 1-5% glutaraldehyde, about 1-6% formaldehyde and about 15-25% ethanol. be able to. Representative buffers include PBS, HEPES, phosphate and citrate buffers. Intermediate Storage Examples of the present invention include storing the cross-linked biological tissue for about 1 year or more until final sterilization. For example, in accordance with the present invention, glutaraldehyde cross-linked porcine heart valves can be temporarily stored at room temperature in a 0.5% glutaraldehyde solution buffered with PBS, citrate, etc. Anticalcification Treatment Examples of the present invention include exposing crosslinked tissue to one or more reagents designed to reduce or prevent calcification of biological tissue after implantation. Many anticalcification reagents are known in the art. For example, cross-linked biological tissue can be exposed to alcohol and / or aluminum salts to reduce or prevent calcification. In an exemplary method, the cross-linked biological tissue is placed in a solution containing greater than about 50% lower aliphatic alcohol for a period of time sufficient for the biological tissue to become resistant to calcification, typically Can be soaked for up to about 96 hours. The alcohol is preferably a lower aliphatic alcohol (C 1 ~ C Three ), For example, methanol, ethanol, propanol or isopropanol. In a preferred example, the alcohol is ethanol. The length of time the alcohol treatment is performed can be varied by those skilled in the art. In the example of the present invention in which biological tissue is immersed in a liquid treatment solution of alcohol, the exemplary exposure time is preferably about 24-96 hours. In another example of the invention, the anticalcification agent may include a salt of a polyvalent metal cation, such as aluminum or iron. For example, cross-linked biological tissue may be treated with about 0.1 to about 0.001 M AlCl Three The biological tissue can be soaked in the solution containing A for a time sufficient to be resistant to calcification. In the present invention, the cross-linked biological tissue can be preferably stored in an alcohol-glutaraldehyde solution in an amount sufficient to maintain anticalcification and / or sterility. For example, the biological tissue typically contains greater than about 60% alcohol, preferably about 60 to about 80% alcohol and less than about 0.5% glutaraldehyde, preferably about 0.2 to 0.5%. , Can be stored in a buffered alcoholic solution containing glutaraldehyde. The calcification-preventing and / or cross-linked biological tissue can then be placed or housed in a container. In a preferred embodiment of the invention, biological tissue is placed in saline in a final container, sealed, and then periodically sterilized. Storage preferably means placement in a container suitable for sterilization, storage and / or transportation. The container can be made of glass or polymeric plastic, such as polypropylene, polyethylene and / or epoxy. The present invention is not intended to be limited to the type of container and seals can be used; other materials, mixtures, formulations and / or copolymers can be used. The cross-linked and housed biological tissue can then be sterilized as shown below, or it can be stored for up to about one year or more before sterilization. In the present invention, storage includes long term storage, for example 6 months, 12 months or up to about 5 years or more. Sterilization The method of the present invention also includes sterilizing the tissue. As used herein, "sterilization" means exposing biological tissue to a sterilized beam of accelerated electrons, or electron beams (e-beams). Particle beams, including e-beams, preferably include direct impact, ie impact from only one direction, and include single-sided or multi-sided radiation. The biological tissue cross-linked according to the present invention can be sterilized, preferably after housing the biological tissue. Suitable sterilization protocols include, but are not limited to, X-ray or γ-ray, e-beam, etc. A preferred method of sterilizing cross-linked tissue is to expose biological tissue contained in saline to accelerated electrons. For example, biological tissue can be exposed to an electron beam until a dose of about 25 kilograys (kGy) is achieved, or for about 1-10 minutes, depending on the dimensions of the material. A major advantage of e-beam processing over conventional gamma rays is the high speed or processing speed at which energy can be applied in a controlled manner, which usually reduces sterilization costs. In the present invention, to treat biological tissue, the tissue is exposed to e-beam sufficient to effect sterilization. Further, the present invention provides e-beam sterilized biological tissue, the formed biological tissue exhibiting improved performance characteristics. The methods and tissues of the present invention further have the advantage of reduced risk of infectivity, obviating the need for sterile handling protocols. Moreover, the methods and organizations of the present invention, which use less reagents and / or require less processing, reduce labor, reagents, time and personnel costs. E-beam sterilization is effective in eliminating the need for toxic sterile chemicals. In addition, the amount of radiation required for e-beam sterilization does not significantly degrade biological tissue, thus providing implantable tissue with improved durability. The gamma ray dose rate is about 110 gray / min and the e-beam dose rate is about 7800 gray / min. Therefore, the exposure time is surprisingly large with respect to gamma radiation, which requires a long and low dose to perform sterilization. In contrast to gamma rays, the high dose rate produced by the e-beam causes the diffusion of oxygen into biological tissues at a rate insufficient to undergo free radical forming reactions that can contribute to the degradation of tissues and polymers. Be promoted. This is advantageous in instances involving placement of biological tissue within the container prior to radiation. The reason is that polymer degradation in both the tissue and the container is minimal. Furthermore, since the dose rate of e-beam is higher than that of γ-ray, a higher processing speed of sterilization, generally higher degree of importance, can be achieved. In relative terms, gamma rays penetrate into the same material about 10 times deeper than a 10 MeV electron. Gamma rays induce the excitation of electrons within the atoms of the substance to be sterilized. The electron beam, on the other hand, provides high-energy electrons to the outside of the material, which penetrate the material, which in turn drives the electrons. Due to the relatively high dose rate of the e-beam, oxygen cannot diffuse into the material at the rate necessary to participate in the oxidation reactions that can result in decomposition of the material. Furthermore, the prevention of disintegration of both the container and the tissue allows for a final sterilization, ie the sterilization of the tissue in the final sealed container. Thus, the present invention eliminates the need for costly aseptic handling techniques and provides reliable sterility as long as the container is intact, ie, until the tissue is ready for use. Since high-energy electrons pass through this surface, they collide with intraatomic electrons of matter. These electrons, in turn, recoil and collide, causing more electrons to move, resulting in the large number of electrons that deliver energy to the material, primarily through the formation of ions and free radicals, from the electrons that pass through the relatively few surfaces. Produces electrons. This process, called enhancement, delivers higher doses deeper below this surface, where the primary beam and its recoil electrons no longer cause ionization. According to the present invention, the amount of E-beam radiation is sufficient to sterilize biological tissue, and in some preferred embodiments, sufficient to sterilize biological tissue packaged in the final container. is there. One of ordinary skill in the art can recognize and determine the dose and time for sterilization that is appropriate for a particular tissue and can be further based on the characteristics of the enhancer used. Typically, one side of this biological tissue is exposed to an electron beam to absorb a sterile dose of radiation. The absorbed radiation dose is expressed as Kgy. One kilogray equals one thousand joules of energy deposited per kilogram of material. For example, biological tissue can be exposed to achieve doses above about 25 Kgy. Effective sterilization typically involves the inclusion of appropriate biological indicators in the irradiation batch, or contacting the tissue with a medium and incubating the medium to determine the sterility of the tissue. Can be readily determined using the microbiological techniques of. The dose can also be determined using a radiation absorbing dye film. Such films are usually calibrated in the gamma field by reference to national standards. Also, the degradation of biological tissue by irradiation is well known and routinely determined by, for example, shrinkage temperature T s Can also be determined using susceptibility to attack by enzymes such as collagenase; extractability of degradation products such as collagen fragments; and reduction of physical properties such as tensile strength. In a representative procedure according to the present invention, the biological tissue can be exposed to the fixative for a time and at a temperature sufficient to induce cross-linking of collagen in and on the biological tissue. For example, in a glutaraldehyde solution buffered with biological tissue, at a temperature of about 4 ° C to about 37 ° C, preferably about 20 ° C; a pH of about 6 to about 8, preferably 6.3 to 6.5; Can be exposed for about 2 to about 5 days. These steps described above are combined to produce a prosthesis that is stronger, more flexible, less antigenic, and easier to handle than prostheses produced using other methods. Long Term Storage In another preferred embodiment of the invention, biological tissue cross-linked according to the invention may be packaged in a solution of about 0.5% glutaraldehyde. The biological tissue can be washed thoroughly with sterile, physiological saline (eg, 0.9% sodium chloride) using aseptic techniques. The purpose of saline lavage is to reduce the concentration of residual glutaraldehyde present on the surface of the tissue and in the interstitial spaces of the tissue, thereby minimizing the likelihood of a patient toxic response. The biological tissue can be placed in a plastic or polymer container, filled with sterile saline, and further covered or sealed. The product envelope should be a permanent seal that does not open until the time of implantation. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a tissue excellent in strength and flexibility of biological tissue and reduces antigenicity. These features are particularly preferred in view of the tense methods required to transplant biological tissue and the potential for rejection by the body. For some methods of implanting biological tissue, the biological tissue must have kink resistance, good suture puncture, and the ability to easily seal suture holes. The retention of the suture, i.e. the ability to withstand tensile forces, must be high. Additionally, the implant must be highly puncture resistant to counter possible high contraction pressures and protect against aneurysm formation. Grafts that are poorly strong and / or too antigenic can be potentially fatal to the patient. The prosthesis produced according to the invention can be packaged as a kit, preferably sterile, wet packaged in 0.9% NaCl solution. Selection of such additional elements is within the skill of one in the art. Example Example 1 Fresh tissue (eg, blood vessels, heart, heart valves, or pericardium) was obtained from a local processing facility (cattle, pigs, sheep, etc.) and physiological saline on ice (0.9% Sodium chloride). The tissue was immediately dissected or placed in fresh sterile saline and refrigerated overnight. Irrelevant tissues such as adipose tissue, skeletal muscle, myocardium, bone, trachea, etc. were carefully removed from this tissue of interest. The tissue was then washed again and immersed in fresh sterile saline. This technique is performed according to variously varied concentration ranges of glutaraldehyde, but a concentration of about 0.03% v / v provides radiation protection properties, and the cross-linking time is reasonably well within the manufacturing schedule. . For 0.03% (v / v) glutaraldehyde treated with 10.0 liters of 50 mM citrate buffer: Step 1) 50 mM citrate buffer was prepared with the following composition (10 liters): 9.0 liters To sterile, deionized water: 140.0 grams of sodium citrate 5.0 grams of citric acid monobasic acid 38.6 grams of sodium chloride and bring the volume of this solution to 10.0 liters of sterile, deionized water Step 2) Add 6.0 milliliters of 50% biological grade glutaraldehyde to 9.0 liters of the 50 mM citrate buffer solution prepared in step 1 to a volume of 10.0 liters with the 50 mM citrate buffer solution prepared in step 1. To Step 3) Adjust the pH of this solution to 6.40 ± 0.05 with hydrochloric acid or sodium hydroxide. The tissue is then immersed in the glutaraldehyde solution at room temperature (20-25 ° C) for the crosslinking reaction. As the fixed time progresses, the number of crosslinks increases as shown by the shape of the shrinkage temperature curve (see FIG. 9). As the glutaraldehyde is consumed by the tissue in the form of polyglutaraldehyde crosslinks, the concentration of glutaraldehyde in the solution is reduced. Therefore, it may be desirable to replenish this fixative from time to time during the crosslinking reaction. Since most of the crosslinks are formed early, it is advisable to replace this solution about 8 hours after the start of the reaction and then daily thereafter. The tissue is exposed to the glutaraldehyde solution for a time period ranging from about 24-120 hours, depending on the concentration of glutaraldehyde in the solution. In general, high concentrations of glutaraldehyde correspond to short-term fixation; low concentrations of glutaraldehyde correspond to long-term fixation. For a 0.03% solution, an exposure time of about 72 hours is sufficient to maximize the crosslink density in the tissue interstices. This corresponds to a contraction temperature of about 80-89 ° C and depends on the type of tissue used. After completing the cross-linking reaction, the tissue was treated with a sterilant solution containing 2% (v / v) glutaraldehyde, 3% (v / v) formaldehyde, and 20% (v / v) ethyl alcohol. Put in. The multi-component sterilant reduces the number of any residual contaminating microorganisms on the tissue prior to rinsing and packaging. The tissue is then thoroughly rinsed with a sufficient volume of sterile saline to minimize the presence of processing chemicals. This wash typically requires the use of a 40 liter or 50 liter aliquot over 24 hours. The exposure time should be carefully monitored. The reason is that the diffusion of residues from this tissue is a time-dependent phenomenon. After the final wash, the tissue is placed in a sterile container (valve jar, vascular graft vial, etc.) and filled with sterile saline. The package is then permanently sealed. Note: All tissue handling following treatment with multi-component sterilants to reduce the number of contaminating organisms should be as sterile as possible to minimize the spread of contamination prior to E-beam sterilization. . Example 2 Two identical experiments were performed to assess the effect of different concentrations of glutaraldehyde on the physical properties of bovine carotid vascular prostheses. The arteries were placed in cold, sterile saline (0.9% sodium chloride). Irrelevant tissues such as adipose tissue, bone, cartilage, connective tissue, etc. were removed from vascular tissue. These vessels were enzymatically digested with a citrate-buffered ficin solution to remove specific portions of smooth muscle tissue. These arteries were carefully washed with water and placed in one of two tanks containing glutaraldehyde to crosslink the collagen component of the tissue. One tank contained 0.01% glutaraldehyde buffered with 50 mM citrate and the other tank contained 0.05% glutaraldehyde buffered with 50 mM citrate. Arteries in 0.01% solution were crosslinked for about 5 days and arteries in 0.05% solution were crosslinked for about 2 days. After the crosslinking reaction was completed, all arteries were placed in a 2% glutaraldehyde solution buffered with 50 mM citrate as a sterilization step. The tissue samples were then evaluated for radiative tensile strength and suture retention strength. Radial tensile strength tests include cutting a section of the bridged carotid artery, making a longitudinal incision, and pulling this tissue radially until failure of a device such as the "Instron" occurs. included. The suture retention strength test involves inserting a loop of surgical suture, such as a 5-0 PTFE impregnated polyester suture, at a specified distance from the end of the cross section cut through the tissue sample. This distance is a sting size, perhaps about 3 mm, for example. The suture is pulled until the tissue fails with a device such as the "Instron". The results of the tensile strength and suture retention strength tests are shown in Figures 1 and 2, respectively. The results of the tensile strength test showed that there was no significant difference in the strength of the tissues due to the fluctuation of the concentration of the fixative. The broad line of error is due to the inherent diversity found in biological tissue. In suture retention strength, the strength for both concentrations appeared to tend to be lower in batch 2 than in batch 1. This is probably the result of different enzymatic digestion. The phytin solutions differ slightly in enzyme activity. In other words, it is believed that the digestion solution prepared for Batch 2 had slightly higher enzyme activity than the solution prepared for Batch 1. However, the difference in strength within the batch is negligible. Example 3 Experiments were conducted to evaluate the effect of different concentrations of glutaraldehyde on some physical properties of bovine median arterial vascular prosthesis. The tissue treatment was the same as described in Example 2 up to the crosslinking step. These digested vessels were placed in one of three tanks for crosslinking. Tank 1 contains 0.01% glutaraldehyde buffered with 50 mM citrate, Tank 2 contains 0.075% glutaraldehyde buffered with 50 mM citrate, and Tank 3 contains Contained 2.0% glutaraldehyde buffered with 50 mM citrate. These arteries were left in their respective tanks until the crosslinking reaction was complete or for about 4 days. After the cross-linking reaction was completed, half of the arteries from tanks 1 and 2 were added as a sterilization step to a 2% glutaraldehyde solution buffered with 50 mM citrate. The other half was left in the first solution. After 24 hours, all arteries were placed in individual glass vials containing 40% ethyl alcohol and covered. The samples from each group were then subjected to the following: radiative tensile strength test, suture retention strength test, and burst strength test. As shown in Figure 3, the radiative tensile strength and suture retention strength were very similar for the tissues treated in each condition of this experiment. Extremes (0.01% and 2.0%) are of particular interest. The reason is that this data shows a lower limit of the range. This data is inconsistent with the very general industrial concept of claiming that high concentrations of fixation provide high thermal stability and high strength. This is not the case for these results, as well as the shrinkage temperature data in FIG. The fact that the 0.01% / 2% group has a significantly lower tensile strength than the other groups is considered an artifact. It is believed that subsequent treatment with 2% glutaraldehyde rather strengthens and does not weaken the tissue. FIG. 4 shows the results of the burst strength test. In this figure, a vascular prosthesis sample is expanded with water until it ruptures. The internal pressure at break is recorded as the burst strength. Furthermore, looking at the extreme values, the results are almost the same when the low glutaraldehyde test group is fixed with the normal 2% cross-linked 1/200 concentration of glutaraldehyde. Example 4 5a and 5b are simplified diagrams showing the formation of short chain intramolecular crosslinks produced by low glutaraldehyde immobilization and the formation of long chain intermolecular crosslinks produced by high glutaraldehyde immobilization, respectively. These figures help to show that in the presence of intramolecular crosslinks, the majority of collagen chain integrity can be maintained even if the peptide bond is cleaved by radiation exposure. The crosslink density of the tissue can be analyzed by measuring the shrinkage temperature or denaturation temperature of the obtained sample. Tissues cross-linked with low glutaraldehyde form higher intramolecular cross-linking densities, which can be manifested by higher shrink temperatures than normal fixed tissues. This relationship is shown by cross-linking two groups of 15 porcine aortic valve leaflets with 0.5% or 0.05% glutaraldehyde. Shrinkage temperature was measured by a differential scanning calorimeter and the results are included in FIG. Example 5 Experiments have shown that glutaraldehyde crosslinked tissues exposed to E-beam irradiation have high hemodynamic performance properties, eg, flexibility. Evidence of increased flexibility is provided by measuring the pressure drop across the heart valve (change in pressure from the inflow side to the outflow side of the valve), the results of which are shown in FIG. Further, high flexibility is shown by measuring an effective orifice area and a cross-sectional area through which blood flows, as shown in FIG. These test results show that exposing the heart valve to E-beam radiation results in a more flexible leaflet that tends to open more easily and widely than a non-radiative valve. This provides the recipient with short-term and long-term benefits. The reason is that a larger effective orifice area results in more cardiac output, thus increasing the efficiency of cardiac activity and resulting cuspal fracture resulting in calcification and valve destruction. Reduce the tendency to occur. Eight heart valves were cross-linked with glutaraldehyde as shown in Example 1 and exposed to E-beam radiation. The pressure drop across the heart valve before the heart valve was subjected to E-beam irradiation was compared to the pressure drop after the heart valve was subjected to E-beam irradiation. FIG. 7 illustrates that the pressure drop was reduced when tested in a steady state on an in vitro flow tester. As a control point, a straight, unobstructed tube is zero. FIG. 8 compares the effective orifice area before and after exposing the heart valve to E-beam radiation and shows that the effective orifice area increases after E-beam irradiation. The determination of the effective orifice area was done by placing the test valve in the Pulse Duplicator System. The pulse replicator can calculate a number of valve-related functions by measuring pressure and flow velocity at strategic locations within the simulated heart, including test valves. The effective orifice area (EOA) is defined as: EOA = Q rms /(51.6 √ΔP), cm 2 , Q in the formula rms = Mean flow velocity obtained during positive pressure reduction, ml / sec ΔP = Mean positive pressure reduction, mmHg The theory underlying the high hemodynamics in tissue-valvular tissue illuminated by mmHg is the molecular binding that keeps the collagen triple helix intact. Includes the destruction of. The intramolecular crosslinks provided by this technique act as a reinforcement to the collagen backbone, as radiation weakens the collagen's own structural scaffold. A dose of 25 kGy in the presence of sufficient intramolecular crosslinks weakens the protein scaffold sufficiently to make the tissue more flexible, yet improves tissue performance. Similar results were obtained each time these two experiments were repeated. Although the exact mechanism is not known, it can be theorized that the degradation reaction occurs within the collagen molecule. The bonds that hold the collagen chains together are believed to break when the tissue is subjected to E-beam radiation. However, it is believed that the presence of intramolecular glutaraldehyde crosslinks keeps the primary structure of the collagen molecule intact, thus maintaining the integrity of the soft tissue. Example 6 A major study of radiation as a method of sterilizing biological tissue is its effect on the long-term durability of the product. The FDA currently requires tissue valves to exhibit the ability to withstand 2 billion cardiac cycles on an accelerated wear tester. This translates into about 5 years of real time. At some point in the future, 3.8 billion cycles of the same test may be required. Tests were conducted to determine the effect of E-beam radiation on the abrasion resistance of tissue flaps. Four groups of valves were tested: Group 1 crosslinked in 0.03% glutaraldehyde; stored in 0.5% glutaraldehyde (E-beam negative control). Group 2 crosslinked in 0.03% glutaraldehyde; washed with water to remove residues; stored in 0.9% sodium chloride E-beam sterilized, 25 kGy. Group 3 crosslinked in 0.03% glutaraldehyde; treated with anticalcification method; washed with water to remove residues; E-beam sterilized, stored in 0.9% sodium chloride, 25 kGy. Group 4 crosslinked in 0.5% glutaraldehyde; washed with water to remove residues; stored in 0.9% sodium chloride E-beam sterilized, 25 kGy (concentrated negative control). The results of this experiment are shown in Table 1 below. These results indicate that exposure of the tissue flap to E-beam radiation compared to control flaps (Groups 1 and 4) was associated with a higher endurance after in vitro testing at 3.89 billion cardiac cycles. It clearly shows that it has no negative effect. In fact, the group showing the best wear data was the group exposed to E-beam after the treatment for anticalcification. Example 7 Vascular graft prostheses such as adventitia, adipose tissue and muscle tissue of arteries are stripped and digested in activated proteases. The stripped and cleared arteries are treated with succinic anhydride at a controlled basic pH to produce a negative charge on the surface of the arteries. The negatively charged arteries can then be treated with glutaraldehyde in citrate buffer at concentrations ranging from about 0.005 to about 5% to cross-link the arteries to fix and strengthen them. A preferred concentration is about 0.01% or less. According to the present invention, low concentrations of glutaraldehyde are typically more flexible, based on qualitative comparative evaluation of implant products crosslinked with low concentrations of glutaraldehyde and high concentrations of glutaraldehyde. This produces a flexible product. Qualitatively, the high flexibility of implant products cross-linked with low concentrations of glutaraldehyde was demonstrated by assessing the radius of curvature of the implant; this radius was determined by fixation with low concentrations of glutaraldehyde. The product is smaller than the product fixed in high concentration of glutaraldehyde. The fixed implant can then be sterilized with glutaraldehyde at a concentration in the range of about 1% to about 4%, preferably about 2%. This combination of steps produces a prosthesis that has high strength, high durability, high flexibility, and low thrombus formation. The digestion step in the present invention involves removing the antigenic substance from the surface of the graft using an activated protease. Although it is known to use the proteolytic enzyme, ficin, as part of the purification process of blood vessel preparation, the method of the present invention uses an activated protease to further enhance antigenic tissue from the original transplant prosthesis. Effective removal is provided. What remains after the digestion step is the collagen matrix. Example 8 After harvest, the graft is digested with a protease, preferably an activated protease, to remove the antigenic material from the graft. In a preferred embodiment, the activated protease is ficin, more preferably filtered ficin activated by adding cysteine to the ficin concentrate. In the preferred embodiment, a buffer containing citric acid and sodium citrate is used, although other buffers can be used. The particular amount of ficin used in the practice of the present invention will depend on the activity of ficin used. The reason is that there is usually variation in the activity level of the enzyme. In order to tailor the different activity levels of ficin used, the implant was manufactured to typically adjust the exact amount of ficin required to produce the implant, each time achieving a constant volumetric activity. That is, determining a particular amount of ficin to be used in implant production typically requires assessing the activity of ficin and adjusting the amount of ficin used according to the noted activity. Typically, the concentration of ficin used according to the invention will add about 65 grams ficin for a reaction volume of about 20 liters. In a preferred embodiment, the digestive solution has a ficin activity of about 9.8 mmol NPZG / liter. Temperature and pH should be monitored during digestion. In one example, there should be a temperature range between 30 ° C and 50 ° C, more preferably a temperature of 40 ° C ± 2 ° C. The pH should be in the range between 5 and 7, more preferably in the range 6.3 ± 0.1. The digestion time used is not absolute, but should be sufficient to remove any antigenic material; typically 2-3 hours is sufficient. The graft should then be washed several times in distilled water. In a preferred example, the implant is washed 4 times with water. The digestion is terminated in a stop bath, preferably a stop bath containing sodium chloride. In the preferred embodiment, the concentration of sodium chloride is 0.1%. The implant is then rinsed again, preferably 4 times with water. Example 9 Suspend one artery from the ring stand using hemostats. Peel the adventitia, adipose tissue, and muscle tissue from the artery with clean scissors. Place the artery in a clean beaker on ice containing clean 0.9% sodium chloride. Repeat the above steps until all arteries have been stripped. Sutures stop blood circulation in the side branch. Stop with a triple surgical knot as close as possible to the main artery. Cut off excess lateral branch vessels near the nodule. After ligating all lateral branch vessels, remove this artery from the ring stand. Fill a large syringe with 0.9% sodium chloride solution and attach the appropriate leak test device to the tip of a glass syringe. Tighten one end of this artery with hemostats. Insert the tip of the syringe into the other end of the artery. Using one hand, secure the end of this artery at the tip of this syringe and slowly inject saline into the lumen of this artery to detect leaks. Stop any leaks with 3-0, 4-0, or 5-0 sutures. The suture is tied with a triple surgical knot. Continue to suture the leak in the artery until the artery is leak free under the condition of proper pressure on the syringe. Place the sutured artery in a clean beaker on ice containing clean 0.9% sodium chloride. The above steps are repeated until the desired number of arteries have been sutured. H 2 Dissolve 420 grams of sodium citrate and 14.4 grams of citric acid in O2 and adjust the volume to 21 liters. Measure pH and adjust to 6.3 if necessary. The total citric acid concentration is 71.3 mM with 95.4% sodium salt and 4.6% acid form. Fill the reaction vessel with 17.32 liters of Ficin buffer and turn the mixer. Put a heater coil in the tank and circulate hot water to start heating the buffer to 40 ° C. Threaded hose barb fittings are inserted into these arteries and cable ties are used to secure them. The arteries are attached to the graft manifold using the threaded instrument. The implant manifolds are attached to each other and to the implant manifold support assembly using 3/8 "x 2" stainless steel pegs and placed in the reaction vessel. Start the pump with a flow rate of 1.05 liters / minute through each manifold. After the reaction vessel temperature stabilizes at 40 ° C, add the activated ficin concentrate. Equalize the concentrated ficin solution with 85 grams / liter of Sigma latex powder. Add 2.8 liters of ficin buffer to the flask in a water shaker bath at 40 ° C. About 65 grams of ficin powder is required. The ficin powder is dissolved in 40 ° C. buffer and filtered through a 5 micron “Gelman Acro 50A” filter. Weigh 2.68 liters of filtered enzyme concentrate in a flask and place in a 40 ° C. water bath. Weigh 6 grams of L-cysteine and add to the enzyme concentrate for activation. After 5 minutes, the enzyme concentrate is added to the reaction vessel and digestion is started. Digestion is 2 1 / 2 Do time. The temperature should be maintained at 40 ° C +/- 2 ° C and the pH monitored and maintained at 6.3 +/- 0.1. These arteries are examined regularly. Excessive kinks are removed to evenly distribute the flow rate across the manifold. These arteries change from pink to silver in appearance within 20 minutes. The lumen slightly expands during digestion, increasing the length of these arteries by approximately 35%. At the end of digestion, perform four thorough water washes. For the stop bath, add 20 g sodium chlorite and 20 liters H 2. 2 Dissolved in O. The pump and stirrer were closed. The drain valve was opened and the tank emptied. Close the discharge valve and add 20 liters of H 2 Filled with O. The pump and stirrer were turned on and left to equilibrate for a few minutes. Washing was repeated 4 times in total. The pump and agitator were closed, the drain valve was opened and the tank emptied. The drain valve was closed and the reactor was charged with stop bath solution. The pump and stirrer were activated. The stop bath was activated for 15-20 minutes to inactivate any residual enzyme. The contents of the reactor were drained and thoroughly washed 4 times. 1680.2 g of sodium hydrogen carbonate to H 2 It was dissolved in O and diluted to 20 liters. The pump and agitator were closed and the final wash was drained from the tank. The reactor was charged with 20 liters of bicarbonate solution. The pump and stirrer were activated and left to equilibrate for 15 minutes. 142.8 g of succinic anhydride was weighed. Half of the anhydride was added to the reactor 15 minutes after the equilibration period. The crystals were dispersed in the solution so that the stirrer could mix them into the tank. The second half of the anhydride was added 30 minutes after the first addition. This filling took an additional 60-90 minutes. The filling was completed when all the crystals had dissolved and no more bubbles formed in the solution. After performing the filling, the pump and the agitator were stopped, the contents of the tank were drained, and a thorough washing was performed 4 times. 8.0 liters of H 2 O was weighed and placed in a clean carboy. 112.0 g of sodium citrate was weighed and added to the carboy. 4.0 g of citric acid was weighed and added to the carboy. An electromagnetic stirring rod was placed in the carboy. The carboy was placed on a stir plate and mixed until all solids had dissolved. The citrate concentration was 50 mM, which consisted of 95.2% sodium citrate and 4.8% citric acid. 1.6 ml of 50% glutaraldehyde was weighed and added to the citrate buffer, during which it was still placed on the stir plate. The solution was left to equilibrate for 10-15 minutes. The pH was tested and adjusted to 6.40 +/- 0.05 with 6M NaOH or 6M HCl as needed. A clean stationary tank was placed under the exhaust hood. The fixture was placed in a fixture tank (2 levels for standard batch). The 0.01% glutaraldehyde solution was transferred from the carboy to a fixed tank. The crosslinking conditions were maintained within about 120 hours and the glutaraldehyde solution was charged periodically, ie every 24 hours. The manifold was removed from the reactor. The artery was cut distal to the side-by-side ulnar branch using clean scissors. The artery was placed in a beaker of deionized water. The above steps were repeated until all arteries had been removed from the manifold. One implant was removed from the beaker. The grafts were fully length-wise stretched. The implant was placed on an appropriately sized mandrel, which was stretched along its length. The mandrel with the implant was placed in a location on a stationary platform in a stationary tank. The above steps were repeated until all implants were placed on the mandrel and placed in a fixed tank. The time was recorded in a fixed tank and the tank was covered. A new batch of 0.01% glutaraldehyde was prepared when the implants were placed in fixative solution for 24 hours and the solution was transferred to a clean fixative tank. The entire immobilization platform (including implants) was transferred from the existing immobilization tank to fresh glutaraldehyde solution. Discard the old glutaraldehyde. Fresh glutaraldehyde was placed in the tank under an exhaust hood. The fixed tank was covered. This solution was later replaced every 24 hours. 7.68 liters of deionized water were weighed and placed in a clean carboy. 11 2.0 g of sodium citrate was weighed and added to the carboy. 4.0 g of citric acid was weighed and added to the carboy. The carboy was placed on a stir plate and mixed until all solids had dissolved. The citrate concentration was 50 mM, which consisted of 95.2% sodium citrate and 4.8% citric acid. 320 ml of 50% glutaraldehyde was weighed and added to the citrate buffer, during which it was still placed on the stir plate. The solution was left to equilibrate for 10-15 minutes. The pH was tested and adjusted to 6.40 +/- 0.05 with 6M NaOH or 6M HCl as needed. The glutaraldehyde solution was transferred to a clean fixed tank, followed by a sterilization process. After fixation for about 120 hours, the grafts were transferred into a 2% glutaraldehyde solution. A stationary tank was placed under the exhaust hood. The fixed tank was covered. The grafts were left to stand in a 2% glutaraldehyde solution for 4-5 hours. Example 10 Biological tissue can be produced as follows: Individual tissue flaps were buffered with either citric acid (at pH 6.4) or HEPES (at pH 7.4), 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08% or 0. Exposure to 09% glutaraldehyde at 20 ° C. for 2, 4, 5, 7, 9 or 10 days. The cross-linked biological tissue can then be initially sterilized in a multi-component sterilant of 2% glutaraldehyde, 3% formaldehyde and 20% ethanol in aqueous buffer. The initially sterilized biological tissue is then optionally treated with 0.1M AlCl. Three It can be extracted with ethanol containing (60% ethanol) and washed with physiological saline for 24 hours. The biological tissue is then placed in saline solution and terminally sterilized by exposing the tissue to e-beam. While the present invention has been described in some detail by way of illustration and example, various modifications and alternative forms of the invention are possible and are not limited to the specific examples described herein. I want you to understand. While these particular examples are not intended to limit the invention, it is understood that they are intended to include all modifications, equivalents and alternatives within the spirit and scope of the invention. I want to.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 オードランド トーマス エル アメリカ合衆国 ミネソタ州 55014 リ ノレイクス ディアーウッド レイン 6367 (72)発明者 シャンケレリ ケマル アメリカ合衆国 ミネソタ州 55082 ス ティル ウォーター ニール アヴェニュ ー ノース 7979────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, MW, SD, SZ, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, C H, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, GB, GE , HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LT, LU, LV, MD, MG, MN, MW, N O, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG , SI, SK, TJ, TT, UA, UG, UZ, VN (72) Inventor Aetherland Thomas El             55014 Li, Minnesota, United States             Norakes Deerwood Rain             6367 (72) Inventor Shankeleri Kemal             55082, Minnesota, United States             Till Water Neil Avenue             ー North 7979

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．生物組織を処理するにあたり、 生物組織を、約０．２容量％未満の架橋溶液に暴露することを特徴とする、生 物組織の処理方法。 ２．架橋溶液が、グルタルアルデヒドであることを特徴とする請求の範囲１記載 の方法。 ３．架橋溶液が、約０．０１〜約０．０９９容量％のグルタルアルデヒドである ことを特徴とする請求の範囲１記載の方法。 ４．生物組織がコラーゲン物質であることを特徴とする請求の範囲１記載の方法 。 ５．生物組織を、ウシ心膜、ブタ大動脈弁、硬膜、ヒトへそ静脈、種々の哺乳類 源から由来する管組織および心臓弁同種移植片から成る群から選択することを特 徴とする請求の範囲４記載の方法。 ６．さらに、架橋した生物組織を、汚染微生物数減少剤に暴露することを特徴と する請求の範囲１記載の方法。 ７．さらに、架橋した生物組織を、抗石灰化試薬に暴露することを特徴とする請 求の範囲１記載の方法。 ８．架橋した生物組織を、少なくとも１種のアルミニウム塩、少なくとも５０％ のエタノールを含む溶液またはこれらの組み合わせから成る群から選択された、 抗石灰化溶液に暴露することを含むことを特徴とする、請求の範囲７記載の方法 。 ９．さらに、架橋した生物組織を滅菌することを含むことを特徴とする請求の範 囲１記載の方法。 １０．さらに、架橋した生物組織を滅菌することを含むことを特徴とする請求の 範囲６記載の方法。 １１．さらに、架橋した生物組織を滅菌することを含むことを特徴とする請求の 範囲８記載の方法。 １２．架橋した生物組織の滅菌が、架橋した生物組織を、電子ビーム粒子衝撃に 暴露することを含むことを特徴とする請求の範囲９記載の方法。 １３．約０．２重量％未満の架橋溶液に暴露し、約８０〜約９０℃の収縮温度を 有する生物組織を有することを特徴とする、安定化した生物組織。 １４．組織を約０．２容量％未満の架橋溶液に暴露し、架橋した組織を滅菌する ことを特徴とする、移植用の組織の製造方法。 １５．組織を約０．２容量％未満の架橋溶液に暴露し、この組織を電子ビームに 暴露することを特徴とする、組織の収納方法。 １６．約０．２容量％未満の架橋溶液に暴露した生物組織を有することを特徴と する、生物組織。 １７．生物組織を、約０．０１〜約０．０９９容量％のグルタルアルデヒドに暴 露したことを特徴とする請求の範囲１６記載の生物組織。 １８．生物組織を、約０．０１〜約０．０９９容量％のグルタルアルデヒドに暴 露することを特徴とする，生物組織の処理方法。 １９．生物組織を、約０．０１〜約０．０９９容量％のグルタルアルデヒドに暴 露し、この生物組織を、少なくとも１種のアルミニウム塩、少なくとも５０％の エタノールを含む溶液またはこれらの組み合わせから成る群から選択された、抗 石灰化溶液に暴露することを含むことを特徴とする、生物組織の処理方法。 ２０．約０．０１〜約０．０９９容量％のグルタルアルデヒドに暴露した生物組 織を有することを特徴とする、生物組織。[Claims] 1. When processing biological tissue,   A biological tissue characterized by exposing the biological tissue to less than about 0.2% by volume of a crosslinking solution. A method of processing a physical structure. 2. The cross-linking solution is glutaraldehyde, according to claim 1. the method of. 3. The crosslinking solution is about 0.01 to about 0.099% by volume glutaraldehyde. The method according to claim 1, wherein: 4. The method according to claim 1, wherein the biological tissue is a collagen material. . 5. Biological tissue can be obtained from bovine pericardium, porcine aortic valve, dura, human navel vein, various mammals. A source selected from the group consisting of vascular tissue and heart valve allograft. The method according to claim 4, which is a characteristic. 6. Further, the method is characterized in that the cross-linked biological tissue is exposed to a pollutant microbial count reducing agent. The method according to claim 1, wherein 7. In addition, a contract characterized by exposing the cross-linked biological tissue to an anticalcification reagent. The method of claim 1 wherein 8. Crosslinked biological tissue, at least one aluminum salt, at least 50% Selected from the group consisting of a solution containing ethanol or a combination thereof, Method according to claim 7, characterized in that it comprises exposure to an anticalcification solution. . 9. The scope of the claims further comprises sterilizing the cross-linked biological tissue. The method described in box 1. 10. The method further comprising sterilizing the crosslinked biological tissue. The method according to range 6. 11. The method further comprising sterilizing the crosslinked biological tissue. The method according to range 8. 12. Sterilization of cross-linked biological tissue protects the cross-linked biological tissue from electron beam particle bombardment. 10. The method of claim 9 including exposing. 13. Exposure to less than about 0.2% by weight cross-linking solution and shrinking temperatures of about 80 to about 90 ° C. Stabilized biological tissue, characterized in that it has biological tissue. 14． Sterilize the crosslinked tissue by exposing the tissue to less than about 0.2% by volume crosslinking solution A method for producing a tissue for transplantation, which comprises: 15. Exposing the tissue to an electron beam by exposing the tissue to less than about 0.2% by volume crosslinking solution. A method for storing tissue characterized by exposing. 16. Characterized by having less than about 0.2% by volume of biological tissue exposed to the crosslinking solution. Yes, biological tissue. 17． Biological tissue was exposed to about 0.01 to about 0.099% by volume glutaraldehyde. The biological tissue according to claim 16, which is exposed. 18. Biological tissue was exposed to about 0.01 to about 0.099% by volume glutaraldehyde. A method for treating biological tissue, characterized by exposing. 19. Biological tissue was exposed to about 0.01 to about 0.099% by volume glutaraldehyde. Expose the biological tissue to at least one aluminum salt, at least 50% An anti-oxidant selected from the group consisting of solutions containing ethanol or combinations thereof. A method of treating biological tissue, comprising exposing to a calcification solution. 20. Organisms exposed to about 0.01 to about 0.099% by volume glutaraldehyde Biological tissue characterized by having a weave.
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