JPH09501233A

JPH09501233A - 液体試料中のテストステロンを検出し定量するための試薬及び方法

Info

Publication number: JPH09501233A
Application number: JP7506008A
Authority: JP
Inventors: アダムジーク，マシエイ; チエン，ヨン−イー; ウオーリング，ジヨン・エー; ジエイムズ，ブライアン・デイー; アートリツプ，シヤロン・ジー
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1993-08-03
Filing date: 1994-08-01
Publication date: 1997-02-04
Anticipated expiration: 2019-08-25
Also published as: US5851781A; US5559210A; US5491071A; DE69428998D1; ES2168310T3; CA2167321C; DE69428998T2; EP0712497A1; US5581002A; WO1995004283A1; CA2167321A1; AU7714294A; ATE208502T1; JP3557210B2; EP0712497B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規の免疫原、該免疫原から産生した抗体、及び検査試料中のテストステロンを検出し定量するイムノアッセイで有用な標識された試薬を開示する。これらの試薬を用いるイムノアッセイ及びこれらの試薬の合成方法も開示する。イムノアッセイは、好ましくは、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）及び蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）である。前記新規の免疫原及び標識された試薬を製造するための新規の出発材料も開示する。該新規の出発材料から新規の免疫原及び標識された試薬を製造する方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】液体試料中のテストステロンを検出し定量するための試薬及び方法発明の分野本発明は、新規の免疫原、該免疫原から産生した抗体、及び検査試料中のテストステロンを検出し定量するイムノアッセイで有用な標識試薬を開示する。これらの試薬を用いるイムノアッセイ及びこれらの試薬の合成方法も開示する。イムノアッセイは、好ましくは、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）及び蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）である。前記新規の免疫原及び標識試薬を製造するための新規の出発材料も開示する。該新規の出発材料から新規の免疫原及び標識試薬を製造する方法も開示する。発明の背景アンドロゲンは、二次性徴を刺激し、雄の二次性徴を発現させる化合物である。一般にテストステロンと呼ばれる１７β−ヒドロキシアンドロスト−４−エン −３−オンは、雄の精巣の間質（ライディッヒ）細胞中で合成される。成人期のライディッヒ細胞中でのテストステロン合成は、主に下垂体黄体形成ホルモン（ＬＨ）の量によって制御される。雌の場合は、テストステロン生合成源が三つ存在する。副腎及び卵巣は少量のテストステロンを分泌し、アンドロステンジオンの末梢代謝による分は、正常な雌のテストステロン日産量の５０〜６０％に相当する。テストステロンは血流中に２種類の形態で存在する。即ち、約９９％のテストステロンは血漿タンパク質に結合しており、残りが結合していない。少なくとも３種類の血清タンパク質がテストステロンと結合する。各タンパク質は異なる親和性をもってテストステロンと結合する。該ホルモンは、生理学的濃度では、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）と称する低キャパシティー高親和性βグロブリンに多く結合する。より少量がアルブミン及びコルチゾル結合グロブリンに結合する。テストステロンの構造式及び番号付け法は下記の通りである：テストステロンは主に肝臓で代謝される。テストステロンを代謝することができる酵素が、皮膚及び細網内皮系で同定された。主なテストステロン代謝経路は二つ同定されている。１７−ケトン経路では、１７β−ヒドロキシ基が酸化されてケトンになる。その結果、弱いアンドロゲンであるアンドロステンジオンが形成される。この経路では、生理活性が殆どない中間代謝産物が形成される。第二の経路である１７−ヒドロキシ経路では、まずＡ環で変化が生じる。この経路では、１７β−ヒドロキシ基は変化しない。これは重要なことである。なぜなら１７β−ヒドロキシ基は、アンドロゲンステロイド及びその中間代謝産物の薬効に必要なものだからである。従って、この代謝経路では、かなりのアンドロゲン活性を有する中間代謝産物が生成される。臨床的有用性テストステロンの測定は性機能低下状態の評価に有用である。雄のテストステロン減少の一般的原因としては、性機能低下、睾丸摘出、エストロゲン療法、クラインフェルター症候群、下垂体機能低下症、睾丸性女性化症及び肝硬変が挙げられる。雌のテストステロン量は通常、正常な雄の場合より遥かに少ない。雌の血清テストステロン量の増加の一般的な原因としては、多嚢胞性卵巣（スタイン−レベンタール症候群）、卵巣腫瘍、副腎腫瘍及び副腎過形成が挙げられる。女性の男性化は、アンドロゲン投与及びテストステロンの内因性過剰産生に起因する。現行のテストステロンアッセイ血清中のテストステロンの定量に使用できる方法は幾つか存在する。血清／血漿中テストステロン濃度の測定に使用される方法は、６種に大別される：（１）ガスクロマトグラフィー／質量分光分析法（Ｓａｂｏｔ，Ｊ．Ｆ．ら，Ｊ．ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，３３９：２３３（１９８５）；Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，Ｙ．ら，ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１６：２４１（１９８８）；Ｆｕｒｕｔａ，Ｔ．ら，Ｊ．ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５２５：１５（１９９０）；Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ら，Ｊ．ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５６５：３５（１９９１）；Ｗｕｄｙ，Ｓ．Ａ．ら，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，５７：３１９（１９９２））；（２）同位体希釈質量分析法（Ｓｉｅｋｍａｎｎ，Ｌ．，Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．，１１：１１７（１９７９）；Ｍｏｎｅｔｉ，Ｇ．ら，Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．，２７（１−３）：５３（１９８７））；（３）薄層クロマトグラフィー（Ｖｉｎｇｌｅｒ，Ｐ．ら，Ｊ．ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５７１：７３（１９９１））；（４）化学発光（Ｓｙｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｂ．ら，ＡｎａｌｙｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，２３９：１９５（１９９０）；Ｓｔａｂｌｅｒ，Ｔ．Ｖ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３７（１１）：１９８７（１９９１）；ＶａｎＤｙｋｅ＆ＶａｎＤｙｋｅ，１９９１）（５）高性能液体クロマトグラフィー（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ら，Ｊ．ｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，４２６：３３（１９８８）；Ｅｒｋｏｃ，Ｆ．Ｕ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．，２７：８６（１９８９）；Ｕｅｓｈｉｂａ，Ｈ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３７（８）：１３２９（１９９１）；（６）酵素結合イムノアッセイ（Ｈｏｓｏｄａ，Ｈ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，２８（１０）：３０３５（１９８０）；Ｍａｒｃｕｓ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，４６（６）：９７５（１９８５）；Ａｌｉ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７：１７３（１９９２）；Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７：１８１（１９９２）；Ｄｈａｒ，Ｔ．Ｋ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７：１６７（１９９２）；Ｒａｓｓａｓｉｅ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，５７：２８８（１９９２）；Ｒａｓｓａｓｉｅ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，５７：１１２（１９９２）；ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＧｍｂＨ，１９９２）；及び（７）ラジオイムノアッセイ（Ｒａｏ，Ｐ．Ｎ．ら，Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．，９：５３９（１９７８）；Ｈｏｓｏｄａ，Ｈ．ら，Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．，１０：５１３（１９７９）；Ｃｅｋａｎ，Ｓ．Ｚ．，Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．，１１：１６２９（１９７９）；ＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓＩｎｃ．，“ＲＳＬ，¹²⁵ＩＴｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ”ＰａｃｋａｇｅＩｎｓｅｒｔ，ＲｅｖｉｓｉｏｎＮｏ．４，１９８３年１月；ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，“Ｃｏａｔ−Ａ−ＣｏｕｎｔＴｏｔａｌＴｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ”，ＰａｃｋａｇｅＩｎｓｅｒｔ，Ｖ１１６，１９９２年１月）。１９６０年代以降の、感度及び特異性が極めて高いラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の開発は、ステロイドの定量に改革をもたらした。ＲＩＡ法は速くて簡単で比較的低コストであるため、使用頻度が高い。この傾向は、便利で信頼性のある市販キットが入手できるようになって、著しく増大した。市販のテストステロンアッセイは主に、臓器摘出を必要としない「直接的」ラジオイムノアッセイである。ＲＩＡでは、限定量の特異的抗体をホルモンと反応させる。¹²⁵Ｉ標識テストステロンが、患者試料中のテストステロンと所定時間にわたり競合する。結合ホルモンを遊離ホルモンから分離した後、結合フラクションの放射能量を定量して、未知の試料の測定の基準となる標準曲線の作成に使用する。市販のテストステロンアッセイでは、結合ホルモンと遊離ホルモンの分離に使用する方法がいろいろ有る。市販のＲＩＡの具体例としては、ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏｒｐｏｒａｉｏｎ（ＤＰＣ）のＣｏａｔ−Ａ−ＣｏｕｎｔＴｏｔａｌＴｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅＡｓｓａｙ、及びＩＣＮＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓＩｎｃ．のＲＳＬ ¹²⁵Ｉ−Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅキットが挙げられる。ＤＰＣキットは下記のような固相分離方法を使用する：（１）テストステロンに特異的な抗体をポリプロピレン管の壁に固定し、（２）¹²⁵Ｉテストステロンを患者試料中の対象分析物と競合させ、（３）管の上澄を採取して結合ホルモンを遊離ホルモンから分離する。ＲＳＬキットは次のような液相分離方法を使用する：１）テストステロンに特異的な抗体を固相に結合するのではなく溶液中で自由にさせておき、２）¹²⁵Ｉテストステロンを患者試料中の対象分析物と競合させ、３）沈降用抗血清（二次抗体）を加えて、テストステロンに特異的な抗体：ホルモンを沈殿させ、結合ホルモンを遊離ホルモンから分離する。前述のＲＩＡ方法は下記の欠点を有する：１）取扱者が放射線防護手段を使用しなければならない；２）放射性廃棄物を処分しなければならない；３）使用する標識試薬の半減期が短い。これらの理由により、別のイムノアッセイ方法が模索された。ＲＩＡ法とは違って、最近導入された微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）は、医者の診療室及び病院の施設で使用される比較的新しい検査方法である。この方法では、抗体が懸濁ラテックス粒子に結合し、次いで測定すべき対応する対象分析物が特異的に結合する。次いで粒子をガラス繊維フィルターシステムに通す。粒子はガラス繊維フィルターに吸着され、非結合対象分析物はガラス繊維フィルターを通って洗浄される。ステロイドのような低分子量対象分析物の場合は、対象分析物に結合しなかった抗体分子の数を測定することにより対象分析物の量を決定する。この操作は、ハプテン標識接合体の添加によって実施する。次いで酵素の基質を加え、試料中の対象分析物量に反比例する蛍光量を発生させる。広く使用されるようになった別の同位体不使用の均一相法は蛍光偏光である。この方法は、テストステロンの定量では知られていなかった。蛍光偏光法は、蛍光標識化合物が、直線偏光によって励起された時に、その回転速度に反比例する偏光度を有する蛍光を放出するという原理に基づく。従って、蛍光標識トレーサー−抗体複合体を直線偏光で励起すると、放出された光が高度の偏光状態を維持する。なぜなら発蛍光団は、光が吸収された時点と放出される時点との間は回転を抑制されるからである。「遊離」トレーサー化合物（即ち抗体に結合していない）を直線偏光によって励起すると、対応するトレーサー−抗体結合体より遥かに速く回転し、分子はよりランダムに配向されるため、放出された光の偏光が解消される。このように、蛍光偏光は、競合結合イムノアッセイで形成されたトレーサー−抗体結合体の量を測定する手段を提供する。発明の概要本発明は、対象化合物の１位に標識を有する新規試薬及び免疫原；１位免疫原に対する抗体；並びに新規の１位が標識された試薬及び免疫原を製造するための新規の出発材料、１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンを提供する。本発明は、検査試料中のテストステロンを検出し定量するためのアッセイも提供する。該アッセイは、前記試薬を単独で、又は６位が標識された試薬もしくは６位免疫原に対する抗体と組合わせて使用する。好ましいアッセイは、１位が標識された試薬と６位免疫原に対する抗体とを使用するイムノアッセイである。好ましくは、アッセイは、イムノアッセイの特異性と均一相法の速度及び利便性とを併有し、検査試料中のテストステロンの正確で信頼できる定量を行う、微粒子酵素イムノアッセイ及び蛍光偏光イムノアッセイである。本発明は、新規の１位免疫原、新規の１位免疫原に対する抗体、１位が標識された試薬、並びに１位免疫原及び標識試薬を製造するための出発材料の合成方法も提供する。図面の簡単な説明第１図は、本発明の合成方法で１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを製造するための合成経路を示している。第２図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合することによって本発明の免疫原を製造するための合成経路を示している。第３図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合することによって本発明の免疫原を製造するための合成経路を示している。第４図は、本発明の合成方法に従い、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合することによって本発明の免疫原を製造するための合成経路を示している。第５図は、本発明の合成方法に従い、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合することによって本発明の免疫原を製造するための合成経路を示している。第６図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを６−カルボキシフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。第７図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを５−カルボキシフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。第８図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを６−アミノメチルフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。第９図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを４’−アミノメチルフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。第１０図は、本発明の合成方法に従い、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンをアルカリホスファターゼに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。第１１図は、本発明の合成方法に従い、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンを４’−アミノメチルフルオレセンに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。第１２図は、本発明の合成方法に従い、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンをアルカリホスファターゼに結合することによって本発明のトレーサーを製造するための合成経路を示している。第１３図は、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例１０）及び６−（Ｏ−カルボキシメチル）− オキシムテストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例１２）を用いて作成した標準曲線を示している。発明の詳細な説明本発明は、新規の１位が標識された試薬及び免疫原、並びに１位免疫原に対する抗体を提供する。１位が標識された試薬及び免疫原を製造するための新規の出発材料も提供する。本発明は、検査試料中のテストステロンを検出し定量するためのアッセイも提供する。これらのアッセイは、前記試薬を単独で、又は６位が標識された試薬もしくは６位免疫原に対する抗体と組合わせて使用する。好ましいアッセイは、１位が標識された試薬と６位免疫原に対する抗体とを使用するイムノアッセイである。好ましくは、アッセイは、イムノアッセイの特異性と均一相法の速度及び利便性とを併有し、検査試料中のテストステロンの正確で信頼できる定量を行う、微粒子酵素イムノアッセイ及び蛍光偏光イムノアッセイである。本発明は、１位免疫原、標識試薬及びこれらの出発材料並びに１位免疫原に対する抗体の合成方法も提供する。本明細書で使用する略号は以下の通りである：Ａｒ＝アルゴンＢＳＡ＝ウシ血清アルブミンＣＤＣｌ₃＝重水素化クロロホルムＤＣＣ＝１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドＤＭＦ＝ジメチルホルムアミドＥＤＡ−ＢＯＣ＝Ｎ−ブチルオキシカルボニルエチレンジアミンＥＤＡＣ＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドＥｔＯＡｃ＝酢酸エチルＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ＝酢酸エチル／ヘキサンＥｔＯＨ＝エタノールＨＦ＝フッ化水素酸ＨＯＳｕ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＫＬＨ＝キーホールリンペットヘモシアニンＭｅ₂Ｓ＝硫化ジメチルＭｅＯＨ＝メタノールＮ−Ｂｏｃ＝Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニルＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドＯＴＢＤＭＳ＝ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルＴＢＤＭＳ＝ｔ−ブチルジメチルシリルＴＢＤＭＳＣ＝ｔ−ブチルジメチルシリルクロリドｔ−ＢｕＯＨ＝ｔ−ブタノールＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸ＴＨＦ＝テトラヒドロフランＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィーＴＮＢＳ＝トリニトロベンジルスルホン酸１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン−ＥＤＡ＝１−α−（３ ’−カルボキシプロピル）テストステロン−エチレンジアミン４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン＝テストステロン５−ＣＦＬ＝５−カルボキシフルオレセン６−ＣＦＬ＝６−カルボキシフルオレセンまた、「１位免疫原」は、免疫原性担体タンパク質がリンカーアームを介してテストステロン分子のステロイド環の１位に結合している免疫原であると定義される。「６位免疫原」は、免疫原性担体タンパク質がリンカーアームを介してテストステロン分子のステロイド環の６位に結合している免疫原であると定義される。「１位が標識された試薬」は、標識がリンカーアームを介してテストステロン分子のステロイド環の１位に結合している標識試薬であると定義される。「６位が標識された試薬」は、標識がリンカーアームを介してテストステロン分子のステロイド環の６位に結合している標識試薬であると定義される。６位免疫原は当業者に公知である。これに対し、本出願人が知る限り、１位が標識された試薬及び１位免疫原は当業者に知られていない。従って、本明細書で開示する１位が標識された試薬及び免疫原、並びにこれらの合成化学も本発明の範囲内に包含される。Ｍ．Ｋｏｃｏｒら、ＰｏｌｉｓｈＪ．Ｃｈｅｍ．，８３：１４９−１５５（１９７９）は、テストステロンの１位に結合した（ＣＯＯＨ）を開示している。しかしながらＫｏｃｏｒらは、免疫原又は標識試薬、及びイムノアッセイにおけるこれら物質の使用とりわけテストステロンのアッセイにおける使用は開示していない。更に、Ｋｏｃｏｒらは、本発明とは異なる合成方法を開示している。本発明は、新規の１位免疫原及び標識試薬を製造するための新規の出発材料も提供する。該新規の出発材料の製造方法も提供する。その新規出発材料は１−α −（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンであり、その構造式は下記のように示される：１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロン前記式中、ｎは１〜１０の数字である。好ましくは、ｎは１〜５である。より好ましくは、ｎは３である。「ｎ’」は「ｎ」と同じ値をさす。好ましい出発材料は１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンであり、下記の構造式を有する：１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン本発明は、新規の出発材料を製造するための新規の方法も提供する。前記新規の１位が標識された試薬及び１位免疫原に対する抗体は、テストステロンのイムノアッセイで有用である。これらの物質は同一アッセイで使用でき、又は別の標識試薬もしくは抗体と組合わせて使用できる。好ましいアッセイは、１位が標識された試薬と６位免疫原に対する抗体とを使用する。本発明では、まず検査試料を標識試薬及び抗体試薬に同時に又は任意の順序で逐次接触させ、次いで抗体との結合反応に関与した又は関与しなかった標識試薬の量を検査試料中のテストステロン量の関数として測定することにより、テストステロンの検出及び特異的定量を実施する。検査試料は任意の天然体液もしくは組織、又はこれらの抽出物もしくは希釈物であり、非限定的具体例としては全血、血清、血漿、尿及び唾液が挙げられる。本発明は特に、免疫原、これらの免疫原から産生された抗体、並びにテストステロンの検出そして好ましくは特異的定量を行う微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）及び蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）で使用するための標識試薬に関する。Ｉ．標識試薬本発明の好ましい１位及び６位が標識された試薬はそれぞれ下記の一般式で示される：式１中のｎは１〜１０の数字を表す。好ましくはｎは１〜５である。より好ましくは、ｎは３である。式１及び２中のＱは検出可能部分である。Ｑは、好ましくは、酵素、蛍光分子及び化学発光分子の中から選択する。Ｑは好ましくは、蛍光分子又は酵素である。好ましい標識試薬では、Ｑは、４’−アミノメチルフルオレセン、５−アミノメチルフルオレセン及び６−アミノメチルフルオレセンのようなアミノメチルフルオレセン、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセンのようなカルボキシフルオレセン、５−及び６−アミノフルオレセンのようなアミノフルオレセン、チオ尿素フルオレセン並びにメトキシトリアジノリルアミノフルオレセンの中から選択される。ＭＥＩＡ方式では、Ｑの好ましい具体例は、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシターゼ及びβ −ラクタマーゼといった酵素である。化学発光分子としてのＱの具体例は、ルミノール、アクリジニウムスルホンアミド及びアクリジニウムエステルである。Ｗは、好ましくは０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有する飽和又は不飽和の接続部分である。但し、（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る。ヘテロ原子としては窒素、酸素及び硫黄が挙げられる。１位が標識された試薬（式１で示される）を式５又は式６の免疫原に対する抗体と一緒にアッセイで使用する場合は、Ｗの特異的化学構造は免疫原のＸと同じか又は異なり得る。同様にして、６位が標識された試薬（式２で示される）を式５又は式６の免疫原に対する抗体と一緒にアッセイで使用する場合は、Ｗの特異的化学構造は免疫原のＸと同じか又は異なり得る。より好ましくは、Ｗは０〜１０個の炭素とヘテロ原子とからなる。Ｗの具体例としては、アルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基が挙げられる。尚、本明細書の定義では、Ｗはゼロであり得る。即ち、炭素及びヘテロ原子がゼロの時である。Ｗ＝０であれば、接続部分は存在しない。これは、Ｑが直接テストステロン誘導体に直接結合していることを意味する。フルオレセン標識した好ましい１位が標識された試薬は下記の式３で示される：蛍光偏光アッセイの場合は、式３の標識試薬を使用するのが好ましい。式３の試薬の製造には、１９８５年４月９日に交付されたＫｉｒｋｅｍｏらの米国特許第４，５１０，２５１号“ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎＡｓｓａｙｆｏｒＬｉｇａｎｄｓｕｓｉｎｇＡｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓａｓＴｒａｃｅｒｓ”、及び１９９２年３月３０日出願のＭａｔｔｉｎｇｌｙの米国特許出願第０７／８５９，７７５号“５（６）−Ｍｅｔｈｙｌ−ＳｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”に記載のように、アミノメチルフルオレセンを使用し得る。酵素標識した好ましい１位が標識された試薬は下記の式で示される：他の１位が標識された試薬は下記の実施例で説明する。II．免疫原好ましい１位及び６位免疫原はそれぞれ下記の式５及び６で示される：式５及び式６中、Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは接続部分である。接続部分、連結部、スペーサー、スペーサーアーム及びリンカーという用語は互換的に使用され、ある所定の物質（例えばハプテン）を第二の所定の物質（例えば免疫原性担体又は検出可能部分）と区分する任意の共有結合した化学的実体を意味する。本発明では、Ｘは、好ましくは０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０個以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有する飽和又は不飽和の接続部分を表し、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る。ヘテロ原子としては窒素、酸素及び硫黄が挙げられる。Ｘの具体例としては、アルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基が挙げられる。尚、本明細書の定義では、Ｘはゼロであり得る。即ち、炭素及びヘテロ原子がゼロの時である。Ｘ＝０であれば接続部分は存在しない。これは、Ｐが式５及び式６でテストステロン誘導体に直接結合していることを意味する。より好ましくは、Ｘは０〜１０個の炭素とヘテロ原子とからなる。式５中の「ｎ」は１〜１０の数字であり得る。好ましくは、ｎは１〜５である。より好ましくは、ｎは３である。当業者に明らかなように、式５及び式６では、免疫原性担体に対するテストステロン誘導体の比は１対１に限定されない。テストステロン誘導体対免疫原性担体の比は、免疫原性担体上の化学的に得られる官能基の数によって決定され、合成の際の二つの材料の比率によって制御される。テストステロン誘導体によるＰ上の置換度は、免疫原性担体上に得られる官能基の１〜１００％の範囲で変化し得る。置換率は好ましくは１０％〜９５％、より好ましくは１５％〜８５％である。当業者に理解されるように、免疫原性担体物質Ｐは、当業者に広く知られているもののうちのいずれかから選択でき、通常はタンパク質、ポリペプチド又はペプチドであるが、十分な大きさ及び免疫原性を有する他の物質、例えば炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸、核酸等も使用し得る。好ましくは、免疫原性担体物質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン等のようなタンパク質である。より好ましい免疫原では、下記の構造式７に示すように、Ｐはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、Ｘは０である： III．１位が標識された試薬及び免疫原の製造１位が標識された試薬及び免疫原は両方とも、新規の出発材料１−α−（ｎ’ −カルボキシアルキル）テストステロン、より好ましくは１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを用いて合成できる。１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンの製造ステップは下記の通りである：出発材料、１，４−アンドロスタンジエン −１７β−オル−３−オン（ボルデノン）の１７位をＴＢＤＭＳ基により保護し、次いで［ｎ’＋１］−アルケニルマグネシウムブロミドでアルキル化して、１ −［ｎ’＋１］−アルケニル−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン− ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成する。この化合物をオゾン分解し、次いで次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル） −４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを得る。その後、１７位の保護基をアセトニトリル中のフッ化水素酸水溶液での処理によって除去し、所望のハプテン、１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンを得る。好ましい１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンは１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンである。１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンの合成は実施例１及び第１図に示す。本明細書では、図に示す化合物が化合物番号を有する場合は、その番号を角括弧内に示す。例えば第１図では、［２］は、１−（４’−ペンテニル）−４−アンドロステン− １７β −オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを表す。実施例１及び第１図に示すように、出発材料１，４−アンドロスタンジエン− １７β−オル−３−オン（ボルデノン）の１７位をＴＢＤＭＳ基により保護し、次いで４−ペンテニルマグネシウムブロミドでアルキル化して、１−（４’−ペンチル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル［２］（第１図）を得た。この化合物をオゾン分解し、次いで次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、１−α−（３’−カルボキシプロピル）−４− アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを得た。その後、１７位の保護基をアセトニトリル中のフッ化水素酸水溶液での処理によって除去し、所望のハプテン、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン［３］（第１図）を得た。１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロン、好ましくは１−α− （３’−カルボキシプロピル）テストステロンを出発材料として、１位が標識された試薬及び免疫原を下記のように合成し得る。Ａ．好ましい新規の１位が標識された試薬の製造式１の構造を有する好ましい１位が標識された試薬は、１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンを出発材料として下記のように合成できる：（ａ）テストステロンの１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）基を選択的に活性化し、次いで（ｂ）該テストステロン誘導体を選択した検出可能部分に結合し、最後に（ｃ）非結合テストステロンを検出可能部分に結合したテストステロンと分離する。より特定的には、前記の１位が標識された試薬は下記のように合成できる：（ａ）テストステロンの１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）基を１−エチル− ３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化し、次いで（ｂ）該活性化エステルを塩基性条件下で検出可能部分に結合し、最後に（ｃ）非結合テストステロンをテストステロン−検出可能部分複合体又は検出可能部分とゲル浸透クロマトグラフィーによって分離する。前記製造方法では、１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンが好ましくは１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンである。好ましい検出可能部分は酵素及びフルオレセンである。Ｂ．新規の好ましい１位免疫原の製造式５で示される好ましい１位免疫原は、１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンを出発材料として製造し得る。説明を簡単にするために、以後は好ましい１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを非限定的具体例として使用するが、当業者には明らかなように、別の１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンを使用してもよい。第１図〜第４図に示す図式（及び対応する実施例）に基づいて説明する。１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンは、当業者に公知の方法に従い、二官能リンカーを介して、又は直接的結合方法で、タンパク質担体に結合し得る。二官能リンカーを使用する場合は、ｖ−Ｘ−ｙは下記の意味を表す：ｖ及びｙは官能基であり、そのうちの一つは１−（カルボキシプロピル）テストステロンのカルボキシレートと反応し得、他方はＰ上の化学的に得られる官能基と反応し得る。Ｘは接続部分である。当業者には多くの二官能リンカーが知られている。例えば、本明細書に参考として包含されるＢｉｅｎｉａｒｚらの米国特許第５，００２，８８３号には、ヘテロ二官能リンカーが記述されている。これらのヘテロ二官能リンカーは、末端がいずれか一方の官能基に対して特異性を示すため、場合によっては好んで使用される。また、合成における利便性のために、当業者によく知られている保護形態の官能基ｖ−及び−ｙ（例えば、本明細書に参考として包含されるＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｔｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，１９９１年，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ参照）を使用し、所望の時点で脱保護してもよい。本発明の免疫原の製造では通常、Ｖを−ＯＨ、−ハロゲン（例えば−Ｃｌ、− Ｂｒ、−Ｉ）、−ＳＨ及び−ＮＨＲ’の中から選択する。Ｒ’はＨ、アルキル、アリール、置換アリールの中から選択し、ｙはヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）、アミノ（−ＮＨ₂）、アルデヒド（−ＣＨ（＝Ｏ））及びアジド（−Ｎ₃）の中から選択する。Ｘは、好ましくは０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０個以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有する飽和又は不飽和の連結部分である。但し、（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る。ヘテロ原子としては窒素、酸素及び硫黄が挙げられる。Ｘの具体例としては、アルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基が挙げられる。尚、本明細書の定義では、Ｘはゼロであり得る。即ち、炭素及びヘテロ原子がゼロの時である。Ｘ＝０であれば接続部分は存在しない。これは、Ｐが式２でテストステロン誘導体に直接結合していることを意味する。テストステロンの１−（カルボキシプロピル）誘導体とｖ−Ｘ−ｙとの反応は、官能基ｙを有する接続部分Ｘを有する連結中間化合物（II）を生成する。官能基−ｙは、当業者に公知の幾つかの方法のいずれかで、免疫原性担体上の官能基と反応させることができる。通常安定性の高いアミド結合を形成するのが好ましいことが多い。アミド結合を形成するためには、まずスペーサーアームのカルボン酸部分［ｙ＝（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ］を、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドのような活性化用試薬及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような添加剤で活性化する。次いで、活性化形態のものを、免疫原性担体物質を含む緩衝溶液と反応させる。あるいは、カルボン酸基を、分離して又は分離せずに、高反応性混合無水物、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾリド又は混合炭酸塩に変換し、次いで免疫原性担体物質と混合する。当業者には明らかなように、アミド結合の形成には、ここに列挙するもの以外の多くの試薬を使用し得る。末端アミン（ｙ＝−ＮＨ₂）官能性を有するスペーサーアームは、アセトニトリル又はジメチルホルムアミドのような適当な溶液中でＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネートと反応させることによって、高反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドウレタンに変換できる。得られたウレタンを緩衝水溶液中で免疫原性担体物質と反応させると、免疫原が得られる。末端アルデヒド官能性［ｙ＝−ＣＨ（＝Ｏ）］を有するスペーサーアームは、当業者に公知の方法に従い、還元アミノ化により、シアノホウ水素化ナトリウムの存在下で緩衝水溶液中で免疫原性担体物質に結合できる。スペーサーアームは、免疫原と類似の方法で、相補的センス（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｓｅｎｓｅ）でスペーサーアーム上の反応基と反応するアミノ、ヒドロキシル又はカルボキシル基のような官能基を有する固体支持体に接合することができる。その結果、ハプテンに対する抗体の分離又は精製に使用できる固相が得られる。このように、前述のテストステロン誘導体は、当業者に公知の種々の方法で免疫原性担体物質Ｐに結合できる。IV．６位が標識された試薬及び免疫原の製造６位が標識された試薬及び免疫原は、当業者に公知の方法、例えば６−（Ｏ− カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（下記の構造を有する）を出発材料として使用する方法で合成し得る：６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンＶ．抗体の産生本明細書で開示する１位及び６位免疫原は、当業者に公知の方法に従い、本発明のイムノアッセイシステムで使用するためのポリクローナル及びモノクローナル両方の抗体の製造に使用できる。通常は、ウサギ、ヤギ、マウス、テンジクネズミ又はウマのような宿主動物に、種々の部位の一つ以上へ、免疫原を普通はアジュバントと混合して注射する。その後、抗体力価が最適値に到達するまで該力価を評価すべく採血を行いながら、一定又は不定の時間間隔で、同一部位又は異なる部位への注射を行う。抗体は、十分量の血清を得るよう宿主動物の採血を行うか、又は体細胞ハイブリダイゼーション法、もしくは他の、モノクローナル抗体を得るための当業者に公知の方法によって得る。該抗体は、例えば−２０℃で貯蔵し得る。本発明の抗体は、完全免疫グロブリンの他に、免疫グロブリンの抗原結合フラグメントを含む。これらのフラグメントの具体例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’ ）₂及びＦｖが挙げられる。この種のフラグメントは公知の方法で製造できる。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））を用いて、免疫原又はそのフラグメントを接種した動物に由来する脾臓細胞を、通常は被接種動物と同じ又は異なる種の永久増殖細胞系（好ましくは骨髄腫細胞系）との融合によって不死化し、次いで適当なクローニング及びスクリーニング操作を行うことにより産生できる。抗体は、Ｒｅａｄｉｎｇの米国特許第４，４７４，８９３号又はＣａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号に記載の方法に従って産生した組換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体はまた、Ｓｅｇｅｌらの米国特許第４，６７６，９８０号に記載の方法で化学的に構築して得る。本発明のポリクローナル及びモノクローナル抗体は、好ましくは、式５の構造を有する１位免疫原を用いて産生する。より好ましくは、式７の構造を有する免疫原を使用する。VI．新規の１位が標識された試薬及び免疫原を用いるイムノアッセイ本発明者は、１位が標識された試薬と６位免疫原に対する抗体とを使用すると、優れたテストステロンイムノアッセイが可能になるという驚くべき事実を見出した（実施例１８の微粒子酵素イムノアッセイによって例示されている）。この発見は驚くべきものである。なぜなら、当業者に公知のように、特異的抗体及び相補的標識ハプテン（例えば標識試薬）を製造する場合は、抗体応答を誘起するために使用する免疫原及び標識ハプテンの両方について化学構造を考慮しなければならないからである。従来は、選択性抗体の取得にとって重要なハプテン固有の特徴部分と離れたハプテン上の部位を介して担体にハプテンを接続する。同様にして、この種の抗体に結合することができる標識ハプテンを製造する場合は、担体タンパク質と同じ部位を介してハプテンに標識を接続するのが普通である。相補的標識ハプテンは通常、ハプテンの重要な特徴への抗体結合を妨害しないように、担体タンパク質の接続に使用した免疫原のそれと同じハプテン上の部位に標識を接続することによって合成する。同一のテストステロン接続位置に同一の結合アームを用いた抗体及び酵素接合体を使用する適合システム（ｍａｔｃｈｉｎｇｓｙｓｔｅｍ）では、臨床試料中のテストステロンの定量に必要な範囲の標準曲線の作成ができなかった。本発明は、抗体及び酵素接合体が、同一結合アームだが異なるテストステロン位置に接続されているという点で異なっている。この形態は、標準曲線を臨床試料中のテストステロンの定量に必要な範囲で作成できるという利点を有する。実施例１８から明らかなように、本発明の標識試薬は単独でテストステロンアッセイの性能を改善できる。従って、アッセイ又はキットは、本発明の標識試薬を、テストステロン及び本発明の標識試薬の両方を認識し、且つ実施例４及び５の免疫原によって産生する抗体であるのが好ましいポリクローナル又はモノクローナル抗体と共に使用し得る。また、ＦＰＩＡ又はＭＥＩＡのような競合イムノアッセイの実施を可能にするために、トレーサー及びテストステロンは抗体に競合的に結合できるものでなければならない。同様に、免疫原はテストステロンの誘導体又は類似体であるのが好ましい。標識試薬は、検査試料中に存在し得る内因性免疫グロブリン、即ち標識試薬に結合すべきではない抗体に結合しないか又はほとんど結合しないことが好ましい。これは、前記結合がアッセイの精度を妨害するのを回避するためである。尚、前記標識試薬、及びアッセイ又はアッセイキット用の抗体を産生させるために使用し得る免疫原は、同じ又は異なるＷ及びＸを有し得る（前出の式１、２、５及び６参照）。Ａ．微粒子酵素イムノアッセイを用いるテストステロンアッセイ検査試料中のテストステロンの濃度又は含量は、本発明の試薬を使用することにより、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）で正確に定量できる。テストステロンの特異的定量のためにＭＥＩＡを実施すべく、試料中のテストステロンを測定するための検量線を作成した。本発明では、式６のテストステロン１−α−（３’−カルボキシプロピル）標識試薬（即ちトレーサー）を用いると、テストステロンの定量に関して優れた微粒子酵素イムノアッセイ結果が得られるという予想外の驚くべき事実が判明した。特に、驚くべきことに、前記標識試薬の使用が、必要とされるアッセイの感度／精度にとって重要なものであるという予想外の事実が判明した。この利点は、テストステロンの特異的定量が先行技術と比べて改善されたことを意味する。抗体に結合したトレーサーの量は、検査試料中に存在するテストステロンの量に反比例して変化する。従って、抗体結合部位に対するテストステロン及びトレーサーの相対的結合親和性は、アッセイシステムの重要なパラメーターである。一般的には、微粒子酵素法は、基質を酵素で開裂して最終的蛍光生成物を得るという原理に基づく。競合酵素イムノアッセイの場合は、生成される蛍光生成物の量が試料中のテストステロン量に反比例する。本発明に従ってテストステロンの特異的定量のために微粒子酵素イムノアッセイを実施する時は、抗血清か又は本発明の免疫原で産生したモノクローナル抗体の存在に対して検出可能な蛍光応答を生起することができる本発明の標識試薬の存在下で、テストステロンを含んでいる疑いのある検査試料を、抗血清か又は本発明の免疫原で産生したモノクローナル抗体に接触させる。Ｂ．蛍光偏光イムノアッセイを用いるテストステロンアッセイ一般的には、蛍光偏光法は、蛍光トレーサーが、特有の波長の平面偏向光によって励起された時に、所与の媒質中のトレーサーの回転速度に反比例する入射刺激光に対する偏光度を保持する別の特有の波長（即ち蛍光）で光を放出するという原理に基づく。このような特性の結果として、回転が抑制されているトレーサー物質、例えば粘稠溶液相中に存在するか、又は比較的遅い回転速度を有する別の溶液成分に結合しているトレーサー物質は、自由に流動する溶液中にある場合と比べて、比較的大きい発光偏光度を保持する。本発明のテストステロン特異的定量のために蛍光偏光イムノアッセイを実施する場合は、テストステロンを含んでいる疑いのある検査試料を、抗血清又は本発明の免疫原で産生したモノクローナル抗体の存在に対して検出可能な蛍光偏光応答を生起することができる本発明の標識試薬の存在下で、抗血清又は本発明の免疫原で産生したモノクローナル抗体と接触させる。次いで溶液に平面偏光を通して蛍光偏光応答を得、該応答を検査試料中に存在するテストステロンの量の尺度として検出する。本発明のテストステロン誘導体は、これらを一般的な担体物質に結合することにより免疫原を製造するために使用され、次いで抗体を得るために使用される。本発明のテストステロン誘導体は、検査試料中のテストステロンを定量するイムノアッセイで検出試薬として機能する標識試薬の製造にも使用される。微粒子酵素アッセイ及び蛍光偏光アッセイは、市販の自動化計器、例えばＩＭｘ（登録商標）計器（本出願人）を用いて実施し得る。Ｃ．他のアッセイ方式本発明のテストステロン定量には、微粒子酵素アッセイ及び蛍光偏光アッセイ以外に様々なイムノアッセイ方式を使用できる。これらのイムノアッセイシステム方式の非限定的具体例としては、競合法、サンドイッチ法及びイムノメーター法が挙げられる。一般的には、これらのイムノアッセイシステムは、標識又は検出可能部分に接続した本発明の抗体又はそのフラグメントからなる標識試薬を含んでいる検査試料に由来する特定の対象分析物に、免疫グロブリン、即ち完全抗体又はそのフラグメントが結合する能力に依存する。検出可能標識の非限定的具体例としては、酵素、放射性標識、ビオチン、毒素、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リポソーム、発色団、化学発光体、着色粒子及び着色微粒子、蛍光化合物、例えばアミノメチルフルオレセン、５−フルオレセニル、６−フルオレセニル、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、アミノフルオレセン、チオ尿素フルオレセン及びメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセン及び類似の蛍光誘導体が挙げられる。典型的には、この種のイムノアッセイシステム方式における結合度は、対象分析物との結合反応に関与した又は関与しなかった標識試薬中に存在する検出可能部分の量によって決定される。検出され測定される検出可能部分の量は、検査試料中に存在する対象分析物の量に相関し得る。例えば、競合イムノアッセイシステムでは、しばしば対象分析物と称される測定すべき物質が、構造が類似している対象分析物及びトレーサーの一部分又は複数部分に特異的な抗体上の限定数の部位であって、前記抗体の産生に使用する免疫原と共有される前記部位に関して、しばしばトレーサーと称される検出可能部分に結合した類似の構造をもつ物質と競合する。この種のアッセイの一具体例は、（ａ）（所期の対象分析物を含んでいる疑いのある）検査試料を、標識試薬（即ちトレーサー）と、標識試薬及び対象分析物に結合できる抗体とに接触させて、反応溶液を形成し、（ｂ）該反応溶液を、抗体が標識試薬と存在している場合の対象分析物に結合するのに十分な時間にわたってインキュべートし、（ｃ）前記抗体に結合した反応溶液中の標識試薬の量を、検査試料中の対象分析物の量の関数として測定することからなる。標識試薬及び抗体は検査試料に同時に又は任意の順序で逐次添加し得る。好ましくは、標識試薬を加えた後で抗体を検査試料に加える。好ましいアッセイでは、１位が標識された試薬を、１位又は６位免疫原に対する抗体と共に使用する。６位が標識された試薬は、１位免疫原に対する抗体と共に使用することもできる。免疫原及び標識試薬の好ましい具体例は下記の実施例で示す。Ｖ．検査キット本発明の検査キットは、検査試料中のテストステロンを定量するための所望のイムノアッセイの実施に必要な必須試薬を総て含む。この種のイムノアッセイの具体例としては、微粒子酵素イムノアッセイ及び蛍光偏光イムノアッセイが挙げられる。検査キットは、必要な試薬を、組成物として、又は試薬の相容性が許す場合には混合物として収容する１個以上の容器を組合わせたような商業用包装形態を有するのが好ましい。特に好ましいのは、検査試料中のテストステロンの微粒子酵素イムノアッセイ定量のための検査キットであって、本出願明細書に記載のようなテストステロン定量用の任意のトレーサー化合物及び抗体を含む検査キットである。尚、検査キットは勿論、当業者に公知のような、且つユーザーの観点から所望であり得る他の物質、例えば緩衝液、希釈剤、標準物質等も含み得る。以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。以下の実施例は、（１）１位免疫原及び標識試薬の合成の出発材料である１− α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンの合成（実施例１）、（２）１位免疫原の合成（実施例２及び３）、（３）６位免疫原の合成（実施例４及び５）、（４）１位が標識された試薬の合成（実施例６〜１０）、（５）６位が標識された試薬の合成（実施例１１及び１２）、（６）実施例２〜５の免疫原を使用する抗体の産生及び精製（実施例１３〜１６）、（７）実施例１６で産生した抗体のラテックス粒子への結合（実施例１７）、並びに（８）実施例４の６位免疫原及び実施例１０の１位が標識された試薬を用いるイムノアッセイ（実施例１８）を説明する。本発明は、公開及び非公開の研究を参考としている。これらの研究は例えば、科学論文、係属特許出願及び特許等である。本明細書で引用する研究は総て、本明細書に参考として包含される。本発明は特定の実施態様に基づいて説明したが、後述の「請求の範囲」を逸脱せずに当業者によってなされ得る変更及び代替も本出願の対象として包含される。実施例１この実施例（第１図）は、下記の式：１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンで示される１−α−（３ ’−カルボキシプロピル）テストステロンの合成を説明する。乾燥ＤＭＦ１５０ｍｌ中のｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１１．０ｇ、７１ｍｍｏｌ）溶液を撹拌し、これに１，４−アンドロスタジエン−１７β−オル−３−オン（１０．０ｇ、３５ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（９．５ｇ、１４０ｍｍｏｌ）を一度に加えた。該反応混合物を室温で４．５時間撹拌した。ＴＬＣ［シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（１０／９０，ｖ／ｖ）］で、出発材料が完全に消滅したことが判明し、沈殿物が形成された。該反応混合物を３００ｍｌのペンタンに注入し、有機相を氷冷５％塩酸（１００ｍｌ ×２）、５％重炭酸ナトリウム（１００ｍｌ×２）、ブライン（１００ｍｌ×２）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で脱水した。濾過し、濾液を減圧下で回転蒸発器で濃縮して、粘稠油状物を得た。重力カラムクロマトグラフィー［シリカゲル５００ｇ、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（１０／９０ｖ／ｖ）→ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（２０／８０ｖ／ｖ）の溶離］で精製すると、純粋な１，４−アンドロスタジエン−１７ β−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテルが１１．６ｇ（８３％）得られた。４−ペンテニルマグネシウムブロミドオーブン乾燥し、撹拌棒と隔壁と２５０ｍｌ添加漏斗とを備えた２５０ｍｌ三首丸底フラスコに、Ｍｇ削り屑（４．３０ｇ、０．１７７ｍｏｌ）を充填し、該装置をドライヤーで加熱しながらＡｒで掃気した。室温に冷却した後、Ｍｇ削り屑を３０ｍｌの無水ＴＨＦで覆った。Ｉ₂結晶を加え、Ｉ₂反応混合物の褐色が消えた直後に、該反応混合物をある程度暖めながら、無水ＴＨＦ５０ｍｌ中の５− ブロモ−１−ペンタン（２５ｇ、０．１６８ｍｏｌ）溶液を２．５時間かけて滴下した。添加終了後、反応混合物を室温で２時間撹拌し、７０ｍｌの乾燥ＴＨＦを加えて、沈殿したグリニャール試薬を溶解した。得られた溶液をＡｒ下でカニューレにより乾燥隔壁キャップ付き２００ｍｌ褐色壜に導入し、室温で貯蔵した。１−α−（４’−ペンテニル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテルオーブン乾燥した２５０ｍｌ三首丸底フラスコに撹拌棒及び隔壁を具備し、ＴＨＦ中の４−ペンテン−１−イルマグネシウムブロミドの１．０Ｍ溶液（７５ｍｌ、７５ｍｍｏｌ）をＡｒ下で−２０℃で仕込んだ。高速撹拌下の該懸濁液にＣｕＢｒ−硫化ジメチル複合体（１．５２ｇ、７．４ｍｍｏｌ）を一度に加えた。３分撹拌後、乾燥ＴＨＦ７ｍｌ中の１，４−アンドロスタジエン−１７β−３− オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（４．４２ｇ、１１．０３ｍｍｏｌ）を添加漏斗を介して約３分間で添加した。添加漏斗内の沈殿物は少量の乾燥ＴＨＦ（３ｍｌ）で全て洗い落とした。次いで、フラスコを氷水中で１５分間撹拌しながら０℃に暖めた。得られた暗赤色の溶液を−７８℃に冷却し（ドライアイス− アセトン）、９Ｎ塩酸（Ａｒでの掃気により脱酸素）の添加によりゆっくり停止して黄色混合物を得た。該混合物を１５０ｍｌのジエチルエーテル及び１５０ｍｌのブラインに注入した。有機相を分離し、半飽和重炭酸ナトリウム（１００ｍｌ）、ブライン（１００ｍｌ×２）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で脱水した。脱水、濾過及び溶媒蒸発後に得られた粗成生物を重力カラムクロマトグラフィー［シリカゲル３００ｇ、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（１０／９０ｖ／ｖ）］で精製すると、純粋な１−α−（４’− ペンテニル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテルが２．５２ｇ（４９％）得られた。１−α−（３’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−オル− ３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテル５００ｍｌ三首丸底フラスコ内の、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍｌ）とＭｅＯＨ（１００ｍｌ）とピリジン（２ｍｌ）との混合物中の１−α−（４’−ペンテニル） −４−アンドロステン−１７β−オル−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（１．９１８ｇ、４．０７ｍｍｏｌ）溶液にスーダンIII溶液（２ｍｌ、ＥｔＯＨ中０．１％）を加え、薄桃色の溶液全体を撹拌下で−７８℃に冷却した。該反応混合物に、パスツールピペットを介して、Ｏ₃流（９０Ｖ、７．５ｐｓｉのＯ₂及び流量０．２ｓｌｐｍの流量で発生させた）を溶液の水面のすぐ下に通した。スーダンIIIの色が消えたらＯ₃の添加を停止し、溶液中にＮ₂を静かに通し、過剰Ｏ₃を除去した。得られた溶液に硫化ジメチル（４ｍ１、５４．３ｍｍｏｌ）を加え、該混合物を撹拌しながら一晩ゆっくりと室温に暖めた。ＴＬＣ［シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ（２０／８０，ｖ／ｖ）］で、出発材料が完全に消費されたことが判明した。該反応混合物を減圧下で回転蒸発器で蒸発させ、残渣を１００ｍｌのトルエンと共に２回同時蒸発させて残留ＭｅＯＨを全て除去した。得られた残渣を３０ｍｌのｔ−ＢｕＯＨに溶解し、２−メチル− ２−ブテン（６．７ｍｌ、６３ｍｍｏｌ）を加え、次いで、リン酸塩緩衝液（ｐＨ＝３．３、０．２０Ｍ）５ｍｌに塩化ナトリウム（９２０ｍｇ、８．１４ｍｍｏｌ）を加えて新しく調製した酸化剤溶液を撹拌下でゆっくりと加えた。室温で３０分間の撹拌後、酸化反応は完了していた。反応混合物を回転蒸発器で蒸発乾固させ、残渣をブライン３００ｍｌ／ＥｔＯＡｃ３００ｍｌの混合物と共に振盪し、ｐＨをｐＨ＝３に調整した。有機層を分離し、亜硫酸ナトリウム溶液（３００ｍｌ、２％ｗ／ｖ、ｐＨ＝４）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で脱水し、濾過し、蒸発させて粗成生物を得、これを重力カラムクロマトグラフィー［シリカゲル１２０ｇ、ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ（９５／５）］で精製して油状物を得た。３０ｍｌのＣＨ₃ＣＮから再結晶化すると、１−α−（３ ’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オンｔ− ブチルジメチルシリルエーテルが固体物質として８６３ｍｇ（４３％）得られた。１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン５０ｍｌのＣＨ₃ＣＮ中の１−α−（３’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−３−オンｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（８４１ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）の懸濁液を撹拌し、これに、新しく調製したＣＨ₃ＣＮ中５％（ｖ／ｖ）の４８％ＨＦを１０ｍｌ加えた。該混合物は撹拌によって徐々に均質になり、１時間後にＴＬＣ［シリカゲル、ＣＨ₂Ｃｌ₂（９３／７，ｖ／ｖ）］で完全に反応したことが判明した。該反応混合物を３００ｍｌのブライン中に注ぎ、３００ｍｌのＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を分離し、ブライン（３００ｍｌ×２）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で脱水し、回転蒸発器で蒸発させて粗生成物を得、これを重力カラムクロマトグラフィー［シリカゲル１２０ｇ、ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ（９０／１０、ｖ／ｖ）］で精製すると、純粋な１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンが５５３ｍｇ（８６％）得られた。実施例２この実施例は、ウシ血清アルブミンへの１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンの接合を説明する（第２図）。乾燥ＤＭＦ１ｍｌ中の１−α−（３’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−３−オン、ＴＢＤＭＳ−エーテル（６４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＨＯＳｕ（２４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、撹拌下でＤＣＣ（３５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を一度に加えた。３０分間の撹拌後、均質溶液全体が濁った状態になった。該反応混合物を室温で１６時間撹拌し、活性化エステルの形成状況をＴＬＣ（シリカゲル、１００％酢酸エチル）で監視した。該活性化エステル混合物を、綿栓を詰めた使い捨てピペットで濾過し、固体を１ｍｌの乾燥ＤＭＦで洗浄した。濾過した活性化エステル溶液に、リン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．８０）５ｍｌ中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、２９３ｍｇ）溶液を滴下した。室温で１６時間撹拌した後、該反応混合物を透析膜管（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ*２，７９７９２５，カタログＤ１６１４−１２、サイズ２５ｍｍ、直径１５．９ｍｍ）に移し、該管をリン酸塩緩衝液（４β、０．１Ｍ、ｐＨ＝７．８０）に対して６時間透析した。次いで、該管を蒸留水４ｌに対して、７時間、１７時間、７時間、１７時間、７時間、１７時間、７時間で透析した。該タンパク質溶液を凍結乾燥し、包装した。ＴＮＢＳ滴定の結果、アミノ基置換率は５６％であった。実施例３この実施例は、キーホールリンペットヘモシアニンへの１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンの接合を説明する（第３図）。乾燥ＤＭＦ１ｍｌ中の１−α−（３’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−３−オン、ＴＢＤＭＳ−エーテル（６４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）及びＨＯＳｕ（２４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、撹拌下でＤＣＣ（３５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を一度に加えた。３０分撹拌後、均質溶液全体が濁った状態になった。該反応混合物を室温で１６時間撹拌し、活性化エステルの形成状況をＴＬＣ（シリカゲル、１００％酢酸エチル）で監視した。該活性化エステル混合物を、綿栓を詰めた使い捨てピペットで濾過し、固体を１ｍｌの乾燥ＤＭＦで洗浄した。濾過した活性化エステル溶液に、リン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．８０）１０ｍｌ中のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ、２９２ｍｇ）溶液を滴下した。室温で１６時間撹拌した後、該反応混合物を透析膜管（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ*２，７９７９２５，カタログＤ１６１４−１２、サイズ２５ｍｍ、直径１５．９ｍｍ）に移し、該管をリン酸塩緩衝液（４ｌ、０．１Ｍ、ｐＨ＝７．８０）に対して６時間透析した。次いで、該管を蒸留水４ｌに対して、７時間、１７時間、７時間、１７時間、７時間で透析した。該タンパク質溶液を凍結乾燥し、包装した。実施例４この実施例は、ウシ血清アルブミンへの６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンの接合を説明する（第４図）。乾燥ＤＭＦ０．８ｍｌ中の、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（５０ｍｇ、０．１３３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２７．５ｍｇ、０．１３３ｍｍｏｌ）及びＨＯＳｕ（１８．４ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）の反応混合物を室温で１６時間撹拌した。綿栓を詰めた使い捨てパスツールピペットで尿素を濾過し、０．８ｍｌの乾燥ＤＭＦで洗浄した。濾液をまとめて、リン酸塩緩衝液（４．０ｍｌ、ｐＨ＝７．８０）及びＤＭＦ（０．８ｍｌ）の混合物中のＢＳＡ（２２６ｍｇ）溶液に滴下した。該反応混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで透析膜管［Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ*２，７９７９２５，カタログＤ１６１４−１２、サイズ２５ｍｍ、直径１５．９ｍｍ］に移した。該管を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．８０）４ｌに対して室温で７時間透析し、次いで蒸留水４ｌに対して７時間、１７時間、７時間、１７時間、７時間，１７時間で透析した。免疫原を凍結乾燥し、貯蔵した。ＴＮＢＳ滴定の結果、アミノ基置換率は５２％であった。実施例５この実施例は、キーホールリンペットヘモシアニンへの６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンの接合を説明する（第５図）。乾燥ＤＭＦ０．８ｍｌ中の、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（５０ｍｇ、０．１３３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（２７．５ｍｇ、０．１３３ｍｍｏｌ）及びＨＯＳｕ（１８．４ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）の反応混合物を室温で１６時間撹拌した。綿栓を詰めた使い捨てパスツールピペットで尿素を濾別し、０．８ｍｌの乾燥ＤＭＦで洗浄した。濾液をまとめて、リン酸塩緩衝液（８．０ｍｌ、ｐＨ＝７．８０）及びＤＭＦ（１．６ｍｌ）の混合液中のＫＬＨ（１８０ｍｇ）溶液に滴下した。該反応混合物を室温で１６時間撹拌し、次いで透析膜管［Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ*２，７９７９２５，カタログＤ１６１４−１２、サイズ２５ｍｍ、直径１５．９ｍｍ］に移した。該管を４ｌの０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．８０）に対して室温で７時間透析し、次いで蒸留水４ｌに対して７時間、１７時間、７時間、１７時間、７時間，１７時間で透析した。免疫原を凍結乾燥し、包装した。実施例６この実施例及び第６図は、下記の式３：で示される好ましい１位が標識された試薬、テストステロン−フルオレセン接合体の合成を説明する。新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ２ｍｌ中の１−α−（３’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン、ＴＢＤＭＳ−エーテル（９５．４ｍｇ、０．２５４ｍｍｏｌ）及びＨＯＳｕ（５８ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌し、これにＤＣＣ（５３ｍｇ、０．２５４ｍｍｏｌ）を一度に加えた。該反応混合物を室温で１６時間撹拌し、次いでＮ−ＢＯＣ−エチレンジアミン（８５ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）を加え、該反応混合物を室温で１６時間撹拌した。該溶液を綿を詰めた使い捨てピペットで濾過し、二つの分離用ＴＬＣプレート（厚さ２ｍｍ、Ｃ¹⁸逆相プレート）に適用した。これらのプレートをメタノール／水／酢酸（８０／２０／０．５，ｖ／ｖ）混合物で展開した。所望のバンドを切り取り、３００ｍｌのメタノールで抽出した。メタノール抽出物を濾過し、減圧下で蒸発させると、７７ｍｇ（５９％）のＮ−Ｂｏｃ保護エチレンジアミドステロイドが得られた。質量分析（ＤＣＩ，ＮＨ₃）５１７（Ｍ＋Ｈ）⁺ ，５３４（Ｍ＋ＮＨ4）⁺。Ｎ−Ｂｏｃエチレンジアミドステロイド（４４ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン及びトリフルオロ酢酸１／１混合物（合計２ｍｌ）に溶解し、室温で１０分間撹拌した。ＴＬＣで反応が完了したことが判明した。溶媒を減圧下で回転蒸発器で除去した。脱保護アミンを分離せず、残渣を次の結合反応で直接使用した。新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ１ｍｌ中の６−カルボキシフルオレセン（３６ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）、ＨＯＳｕ（２１ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（２０ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）を室温で２４時間撹拌した。ＴＬＣの結果、反応は完了していた。この活性化エステル溶液を１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン−ＥＤＡ−ＴＦＡ塩（０．０９８ｍｍｏｌ）に加え、混合物全体を乾燥ＤＭＦで２ｍｌに希釈した。トリエチルアミン（５６μｌ、０．４０ｍｍｏｌ）を加え、該反応混合物を１６時間撹拌した。綿を詰めた使い捨てピペットで反応混合物を濾過し、濾液をＣ¹⁸逆相分離用ＴＬＣプレート（厚さ１ｍｍ）に適用した。該プレートを真空乾燥し、メタノール／水／酢酸（７０／３０／０．５，ｖ／ｖ）で展開した。所望のバンドをメタノール（１５０ｍｌ）で抽出し、メタノール抽出物を減圧下で蒸発させると、４８ｍｇ（６３％）のトレーサーが得られた。質量分析（ＦＡＢ）７７５（Ｍ＋Ｈ）⁺，７９７（Ｍ＋Ｎａ）⁺。実施例７この実施例及び第７図は、下記の式：で示される、別の１位が標識された試薬、別のテストステロン−フルオレセン接合体の合成を説明する。新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ２ｍｌ中の１−α−（３’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン、ＴＢＤＭＳ−エーテル（９５．４ｍｇ、０．２５４ｍｍｏｌ）及びＨＯＳｕ（５８ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ）の溶液を撹拌し、これにＤＣＣ（５３ｍｇ、０．２５４ｍｍｏｌ）を一度に加えた。該反応混合物を室温で１６時間撹拌し、次いでＮ−ＢＯＣ−エチレンジアミン（８５ｍｇ、０．５３０ｍｍｏｌ）を加え、該反応混合物を室温で１６時間撹拌した。該溶液を、綿を詰めた使い捨てピペットで濾過し、二つの分離用ＴＬＣプレート（厚さ２ｍｍ、Ｃ¹⁸逆相プレート）に適用した。これらのプレートをメタノール／水／酢酸（８０／２０／０．５，ｖ／ｖ）混合物で展開した。所望のバンドを切り取り、３００ｍｌのメタノールで抽出した。メタノール抽出物を濾過し、減圧下で蒸発させると、７７ｍｇ（５９％）のＮ−Ｂｏｃ保護エチレンジアミドステロイドが得られた。質量分析（ＤＣＩ，ＮＨ₃）５１７（Ｍ＋Ｈ）⁺，５３４（Ｍ＋ＮＨ₄）⁺。Ｎ−Ｂｏｃエチレンジアミドステロイド（４４ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン及びトリフルオロ酢酸１／１混合物（合計２ｍｌ）に溶解し、室温で１０分間撹拌した。ＴＬＣで反応が完了していることが判明した。溶媒を減圧下で回転蒸発器で除去した。脱保護アミンを分離せず、残渣を次の結合反応で直接使用した。０．５ｍｌのＤＭＦ中の５−カルボキシフルオレセン（２０．３ｍｇ、００５４ｍｍｏｌ）、ＨＯＳｕ（１２ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（１１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を室温で２４時間撹拌した。ＴＬＣで反応が完了していることが判明した。この活性化エステル溶液を１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン−ＥＤＡ−ＴＦＡ塩（０．０７２ｍｍｏｌ）に加え、該混合物全体を乾燥ＤＭＦで１ｍｌに希釈した。トリエチルアミン（３０μｌ、０．２２ｍｍｏｌ）を加え、該反応混合物を１６時間撹拌した。綿を詰めた使い捨てピペットで反応混合物を濾過し、濾液をＣ¹⁸逆相分離用ＴＬＣプレート（厚さ１ｍｍ）に適用した。該プレートを真空乾燥し、メタノール／水／酢酸（７０／３０／０．５，ｖ／ｖ）で展開した。所望のバンドをメタノール（１５０ｍｌ）で抽出し、メタノール抽出物を減圧下で蒸発させると、３１ｍｇ（７５％）のトレーサーが得られた。質量分析（ＦＡＢ）７７５（Ｍ＋Ｈ）⁺，７９７（Ｍ＋Ｎａ）⁺。実施例８この実施例は、下記の式：で示されるトレーサーを製造するための６−アミノメチルフルオレセンへの１− α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンの結合（第８図）を説明する。新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ０．５ｍｌ中の１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン（５５ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ）、ＨＯＳｕ（２９ｍｇ、０．２５２ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（２６ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）を室温で１６時間撹拌し、その後６−アミノメチルフルオレセンヒドロブロミド（５６ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（７０μｌ、０．５０ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を室温で更に１６時間撹拌した。ＴＬＣで反応が完了していることが判明した。該反応混合物を２ｍｍの分離用プレート（順相）に適用し、真空乾燥し、（塩化メチレン／メタノール／酢酸、９２／８／０．５，ｖ／ｖ）展開した。所望のバンドを切り取り、塩化メチレン中１０％メタノール１５０ｍｌで抽出した。溶媒を減圧下で回転蒸発器で蒸発させると、３６ｍｇ（３４％）のトレーサーが得られた。質量分析（ＦＡＢ）７１８（Ｍ＋Ｈ）⁺。実施例９この実施例は、下記の式：で示されるトレーサーを製造するための４’−アミノメチルフルオレセンへの１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンの結合（第９図）を説明する。新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ０．５ｍｌ中の１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン（５５ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ）、ＨＯＳｕ（２９ｍｇ、０．２５２ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（２６ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）を室温で１６時間撹拌し、その後４’−アミノメチルフルオレセン塩酸塩（５０ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３５μｌ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。該反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ＴＬＣで反応が完了していることが判明した。該反応混合物を２ｍｍの分離用プレート（順相）に適用し、真空乾燥し、（塩化メチレン／メタノール／酢酸、９２／８／０．５，ｖ／ｖ）展開した。所望のバンドを切り取り、塩化メチレン中１０％メタノール１５０ｍｌで抽出した。溶媒を減圧下で回転蒸発器で蒸発させると、４０ｍｇ（３８％）のトレーサーが得られた。質量分析（ＦＡＢ）７１８（Ｍ＋Ｈ）⁺。実施例１０この実施例は、アルカリホスファターゼへの１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンの接合を説明する（第１０図）。新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ６０．８μｌ中の１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン（３．１ｍｇ、０．００８３ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（１．０９ｍｇ、０．００９５ｍｍｏｌ）及びＥＤＡＣ（１．６ｍｇ、０．００８３ｍｍｏｌ）を室温で１時間混合した。該反応混合物３．５μｌ（７×１０^-4ｍｍｏｌ）を、新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ４９６．５μｌに加えた。該反応混合物３００μｌ（４．９×１０^-6ｍｍｏｌ）にアルカリホスファターゼ（２．９×１０^-5 ｍｍｏｌ）及びｐＨ１０．０の重炭酸塩緩衝液（０．０２ｍｍｏｌ、１．７ｍｇ重炭酸ナトリウム及び０．０２ｍｍｏｌ、２．１ｍｇ炭酸ナトリウム）を加えた。該反応体を室温で１６時間混合し、次いでＧ−２５セファデックスを用いてカラムクロマトグラフィーにかけると、所望のテストステロン接合体が得られた。実施例１１この実施例は、下記式で示されるトレーサーを製造するための４’−アミノメチルフルオレセンへの６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロンの結合（図１１）を説明する。新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ０．５ｍｌ中の６−（Ｏ−カルボキシメチル）− オキシムテストステロン（１９．２ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）、ＨＯＳｕ（１１．８ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（１９．５ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）を室温で１６時間撹拌した。活性化エステルは分離しなかった。該反応混合物に４’−アミノメチルフルオレセン塩酸塩（２１ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２８μｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１６時間撹拌した後、該反応混合物を順相分離用シリカゲルプレートに適用し、真空乾燥し、（塩化メチレン／メタノール／酢酸、９２／８／０／０．５、ｖ／ｖ）展開した。所望のバンドを切り取り、塩化メチレン中１０％メタノール５０ｍｌで抽出した。質量分析（ＦＡＢ）７１９（Ｍ＋Ｈ）⁺。実施例１２この実施例は、アルカリホスファターゼへの６−（Ｏ−カルボキシメチル）− オキシムテストステロンの接合を説明する（第１２図）。６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ６０．８μｌ中の６−（Ｏ −カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（３．１ｍｇ、０．００８３ｍｍｏｌ）、ＮＨＳ（１．０９ｍｇ、０．００９５ｍｍｏｌ）及びＥＤＡＣ（１．６ｍｇ、０．００８３ｍｍｏｌ）を室温で１時間混合した。該反応混合物３．５ μｌ（７×１０^-4ｍｍｏｌ）を、新しく脱ガスした乾燥ＤＭＦ４９６．５μｌに加えた。該反応混合物３００μｌ（４．９×１０^-6ｍｍｏｌ）にアルカリホスファターゼ（２．９×１０^-5ｍｍｏｌ）及びｐＨ１０．０重炭酸塩緩衝液（０．０２ｍｍｏｌ、１．７ｍｇ重炭酸ナトリウム及び０．０２ｍｍｏｌ、２．１ｍｇ炭酸ナトリウム）を加えた。該反応体を室温で１６時間混合し、次いでＧ−２５セファデックスを用いてカラムクロマトグラフィーにかけると、所望のテストステロン接合体が得られた。実施例１３免疫感作方法各々が６匹のウサギを含む４個のグループを下記の４種類の異なる免疫原のうちの一つで免疫感作した：（ａ）ＢＳＡに結合した６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン｛本明細書では６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン：ＢＳＡとも称し、実施例４に示す構造式を有する｝、（ｂ）ＫＬＨに結合した６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン｛本明細書では６−（Ｏ−カルボキシメチル）− オキシムテストステロン：ＫＬＨとも称し、実施例５に示す構造式を有する｝、（ｃ）ＢＳＡに結合した１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン（実施例２）、及び（ｄ）ＫＬＨに結合した１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン（実施例３）。まず、将来の採血の評価で基準として使用するための血液を各ウサギから採取した。ウサギの膝窩リンパ節（ＰＬＮ）に、フロイント完全アジュバント中に乳化した抗原０．５ｍｇを注射した。３週間の間隔で、筋内注射により、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）で乳化した抗原０．２５０ｍｇをウサギに追加注射した。最初の注射及び次の追加注射の１０日後に、血液（５０ｍｌ）を採取した。抗体は３〜４ケ月後に成熟した。許容し得る特異性を示したウサギから、２５ｍｌ／ウサギ／月で更に１２ヵ月間にわたり血液を採取した。血液を集め、プールして、代表的抗血清プールを形成した。血清の評価採取血液を更に、特異性と、実施例１０に記載の標識試薬及び実施例１４、１６、１７及び１８に記載する方法を用いる検量線作成の可能性とについて、ＩＭｘ（登録商標）計器で評価した。実施例１４抗血清のプロテインＡ精製プロテインＡの一般的精製方法は下記の通りである。カラムクロマトグラフィー［２０ｍｌプロテインＡゲル（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ番号２０３６６ｇ）、１．５Ｍグリシン／３Ｍ塩化ナトリウムｐＨ９．０→０．１Ｍクエン酸ｐＨ３．０の溶離剤］による２３２．５ｍｇの抗血清精製の結果、７０ｍｇの精製物質が得られた。溶出液を１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（３．０ｌ）に対して２〜８℃で１６時間透析した。該物質をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＩｍｍｅｒｓｉｂｌｅＣＸ−３０限外濾過装置（カタログ番号ＰＴＴＫ１１Ｋ２５）を用いて濃縮し、１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（１００ｍｌ）を用いて約５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度にした。濃縮物質を０．２μｍフィルターで濾過した。実施例１５６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン：Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１０２アフィニティ樹脂の製造下記の実施例は、実施例１４で得た抗血清を更に精製するために使用したアフィニティ樹脂の製造を説明する。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１０２ゲル（１０．０ｍｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１５３−２４０１）を１００．０ｍｌの１００％エタノールで洗浄した。１００％エタノール１０．０ｍｌ中の６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン（６１．８ｍｇ、１６５μｍｏｌ）を、洗浄したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１０２樹脂１０．０ｍｌに加えた。このスラリーにＥＤＡＣ（３８．３ｍｇ、１９９．８μｍｏｌ）及びＮＨＳ（１９．９８ｍｇ、１９９．８μｍｏｌ）を加えた。該スラリーを静かに４時間回転させた。該樹脂を２０ｍｌガラスカラム内に注入し、１００％エタノール（１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）及び１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（１００ｍｌ）で洗浄した。次いでカラムから排出し、後で使用するために貯蔵した。実施例１６実施例１５に記載の６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム：Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１０２アフィニティ樹脂を用いる実施例４及び５に記載の免疫原に由来する抗血清のアフィニティ精製６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン：ＢＳＡ又は６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン：ＫＬＨを接種したウサギから得たプロテインＡ精製抗血清を、実施例１５の６−（Ｏ−カルボキシメチル） −オキシムテストステロン：Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１０２アフィニティ樹脂を用いて精製した。一般的なアフィニティ精製操作は下記の通りである。まず、溶出液がｐＨ７．２になるまで、６−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムテストステロン：Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１０２アフィニティ樹脂（１０ｍｌ、実施例１５）を１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２で洗浄した。プロテインＡ精製抗血清（５０ｍｇ、実施例１４）をカラムにかけ、１６時間結合させた。カラムを１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（１００ｍｌ）、２Ｍ塩化ナトリウム（１００ｍｌ）及び１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（５０ｍｌ）で洗浄した。抗体を０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２．０で溶離し、５ｍｇの精製物質を得た。精製した抗血清を、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＩｍｍｅｒｓｉｂｌｅＣＸ−３０限外濾過装置（カタログ番号ＰＴＴＫ１１Ｋ２５）、及び１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（１００ｍｌ）で約５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。実施例１７この実施例は、実施例１６で精製した抗血清をカルボン酸塩改質ラテックス（ＣＭＬ）粒子に共有結合する方法を説明する。ラテックス粒子の洗浄界面活性剤を用いて乳化重合により極めて均一なラテックス粒子を形成する。界面活性剤（通常は負の電荷を有する）は、粒子をタンパク質でコーティングする前に除去しなければならない。当業者に公知の粒子洗浄方法は幾つか存在する。Ｓｅｒａｄｙｎの粒子洗浄方法（ＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８８）を少しだけ変えて使用した。水２ｍｌ中０．２ｇのラテックス粒子（Ｓｅｒａｄｙｎ、カルボン酸塩改質ラテックス、直径０．３９６μｍ、ＭＦＧロット番号２１７９、ＰＫＧロット番号２Ｂ６６）に、１ｇのＢｉｏ−Ｒａｄ混合床樹脂（カタログ番号１４２７４２５）を加えた。該スラリーを室温で１時間混合した。該反応混合物をガラス焼結フィルターで濾過し、界面活性剤を除いたラテックス粒子を含む濾液を水／０．１％アジ化ナトリウムで希釈して、３．２％ラテックス粒子溶液を得た。洗浄したカルボン酸塩改質ラテックス粒子への抗体（実施例１６）の共有結合前述のラテックス粒子３ｍｇにＭＥＳ緩衝液ｐＨ４．５（０．０２５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１分間混合した後、０．１ｍｇのアフィニティ精製抗体（実施例１６）を加えた。更に１分間混合した後、２．０９μｍｏｌのＥＤＡＣを加え、該反応混合物を室温で１時間混合した。粒子を遠心分離で精製し、ペレットを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で２回、ＩＭｘ（登録商標）ＭＥＩＡＬｉｎｅ希釈剤で１回洗浄した。次いで、粒子をラテックス粒子貯蔵希釈剤（０．０５ｍｍｏｌトリス、０．１ｍｍｏｌ塩化ナトリウム、０．１３６ｇスクロース、１２５μ ｇウサギＩｇＧ、ｐＨ７．４）中に再懸濁した。実施例１８テストステロンの微粒子酵素イムノアッセイラテックス粒子に結合したアフィニティ精製抗血清（実施例１７）及び１−α −（３’−カルボキシプロピル）テストステロンアルカリホスファターゼトレーサー（実施例１０）を市販のＩＭｘ（登録商標）計器で使用した。ＩＭｘ（登録商標）計器の一般的操作は、販売業者が推奨するＩＭｘ（登録商標）システム操作説明書に記載の手順に従った。ＩＭｘ（登録商標）システム操作説明書には、１）操作理論：微粒子酵素イムノアッセイ；２）操作上の注意及び制限；３）毎日の始動操作；４）維持すべき品質管理に必要な毎月の及び定例の操作が記述されている。検量線及び交差反応性検査を下記のＩＭｘ（登録商標）アッセイ手順に従って実施した。ＩＭｘ（登録商標）テストステロンアッセイは、微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ）法をベースとする。ＩＭｘ（登録商標）テストステロン試薬及び試料を下記の方法で反応容器に加えた：１）抗体に結合したラテックス粒子（ラテックス粒子貯蔵希釈剤中のラテックス−抗体結合体２．５×１０^-6ｇ、実施例１７）、グリシン（３．９×１０^-5モル）及び５０μ ｌの試料を、プローブ／電極アセンブリにより反応容器のインキュベーションウェル内で１１５μｌのＩＭｘ（登録商標）ＭＥＩＡＬｉｎｅ希釈剤に最終ｐＨ５．５で加えた；２）５１４秒間インキュベートした後、１７５μｌ／２５０μ ｌのインキュベーション混合物を反応容器のガラス繊維マトリクスに移し、ＩＭｘ（登録商標）ＭＥＩＡＬｉｎｅ希釈剤で２回洗浄した；３）次いで、標識試薬（２．１×１０^-9モルのタンパク質、実施例１０）を反応容器のガラス繊維マトリクスに加えた；４）６秒間インキュベートした後、非結合標識試薬をＩＭｘ（登録商標）ＭＥＩＡＬｉｎｅ希釈剤で３回洗浄することにより除去した；５）次いで、抗体基質（４−メチルウンベリフェリルホスフェート）を反応容器のガラス繊維マトリクスに加え、蛍光生成物をＩＭｘ（登録商標）計器のＭＥＩＡ光学アセンブリによって測定した。ラテックス粒子に結合したアフィニティ精製抗血清（実施例１７）を、テストステロン、１−α−（３’−カルボキシブロピル）テストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例１０）及び６−（Ｏ−カルボキシメチル） −オキシムテストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例１２）に結合する能力について評価した。第１３図に示すように、テストステロンのＭＥＩＡアッセイを用いて標準曲線を作成した。１−α−（３’−カルボキシブロピル）テストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例１０）を用いると、より良好な標準曲線が得られた。ラテックス粒子に結合したアフィニティ精製抗血清（実施例１７）の交差反応性をＭＥＩＡアッセイで評価した。構造的にテストステロンに相関しており、且つ内因性又は外因性起源に由来する雄又は雌の血液中に存在する化合物を検査した（表１）。表１は、ラテックス粒子に結合したアフィニティ精製抗血清（実施例１７）及び１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロン：アルカリホスファターゼ標識試薬（実施例１０）を用いる記載のアッセイを妨害する可能性の有る化合物の交差反応性を示している。表１の化合物は、典型的には、テストステロンアッセイの特異性を調べるために市販アッセイで使用される。低い交差反応性は、アッセイ、特に抗体が、テストステロンに対して大きな特異性を有することを意味する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ウオーリング，ジヨン・エーアメリカ合衆国、アイオワ・50616、チヤールズ・シテイー、ジエリー・アベニユー・1934 (72)発明者ジエイムズ，ブライアン・デイーアメリカ合衆国、イリノイ・60661‐2544、シカゴ、ウエスト・マデイソン・ストリート・ナンバー・2909・575 (72)発明者アートリツプ，シヤロン・ジーアメリカ合衆国、イリノイ・60126、エルムハースト、ノース・ウイロー・ロード・ 288

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の構造式：［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分であり、ｎは１〜１０である］で示される１位が標識された試薬。２．Ｗが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項１に記載の１位が標識された試薬。３．Ｗが０〜１０個の炭素とヘテロ原子とからなる請求項２に記載の１位が標識された試薬。４．ヘテロ原子が窒素、酸素及び硫黄の中から選択される請求項２に記載の１位が標識された試薬。５．Ｗが、アルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基の中から選択される請求項２に記載の１位が標識された試薬。６．ｎが１〜５である請求項２に記載の１位が標識された試薬。７．ｎが３である請求項６に記載の１位が標識された試薬。８．前記検出可能部分が、酵素、蛍光分子及び化学発光分子の中から選択される請求項１に記載の１位が標識された試薬。９．ｎが１〜５であり、Ｗがアルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基の中から選択される請求項８に記載の１位が標識された試薬。１０．前記蛍光分子がアミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオ尿素フルオレセン及びメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセンの中から選択され、前記酵素がアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシターゼ及びβ−ラクタマーゼの中から選択され、前記化学発光分子がルミノール、アクリジニウムスルホンアミド及びアクリジニウムエステルの中から選択される請求項８に記載の１位が標識された試薬。１１．下記の実施例６〜１０の構造式：の中から選択した構造式を有する請求項１に記載の１位が標識された試薬。１２．下記の式：［式中、（ａ）Ｐは免疫原性担体物質であり、（ｂ）Ｘは接続部分であり、（ｃ）ｎは１〜１０であり、（ｄ）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜１００％である］で示される１位免疫原。１３．Ｘが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項１２に記載の１位免疫原。１４．Ｘが０〜１０個の炭素とヘテロ原子とからなる請求項１３に記載の１位免疫原。１５．ヘテロ原子が窒素、酸素及び硫黄の中から選択される請求項１３に記載の１位免疫原。１６．Ｘが、アルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基の中から選択される請求項１２に記載の１位免疫原。１７．ｎが１〜５である請求項１３に記載の１位免疫原。１８．ｎが３である請求項１７に記載の１位免疫原。１９．免疫原性担体が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸及び核酸の中から選択される請求項１２に記載の１位免疫原。２０．免疫原性担体物質が、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン及びチログロブリンの中から選択される請求項１２に記載の１位免疫原。２１．Ｘがアルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基の中から選択され、ｎが１〜５である請求項１９に記載の１位免疫原。２２．下記の実施例２及び３の構造式：［式中、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを意味し、ＫＬＨはキーホールリンペットヘモシアニンを意味し、テストステロン誘導体によるＢＳＡ又はＫＬＨの置換度は１％〜１００％である］を有する群の中から選択される請求項２０に記載の１位免疫原。２３．テストステロン誘導体によるＢＳＡ又はＫＬＨの置換度が１０％〜９５％である請求項２２に記載の１位免疫原。２４．下記の構造式：［式中、（ａ）Ｐは免疫原性担体物質であり、（ｂ）ｎは１〜１０であり、（ｃ）Ｘは結合部分であり、（ｄ）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜１００％である］で示される１位免疫原で産生した抗体。２５．Ｘが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項２４に記載の抗体。２６．免疫原性担体が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸及び核酸の中から選択したものである請求項２４に記載の抗体。２７．免疫原性担体物質が、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン及びチログロブリンの中から選択したものである請求項２６に記載の抗体。２８．免疫原が、下記の実施例２及び３の式：［式中、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを意味し、ＫＬＨはキーホールリンペットヘモシアニンを意味し、テストステロン誘導体によるＢＳＡ又はＫＬＨの置換度は１％〜１００％である］で示される免疫原群から選択したものである請求項２７に記載の抗体。２９．検査試料中の対象分析物を定量するための競合イムノアッセイ方法であって、（ａ）前記検査試料を、下記の式：［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分であり、ｎは１〜１０である］で示される１位が標識された試薬と、前記１位が標識された試薬及び前記対象分析物に結合することができる抗体とに接触させて反応溶液を形成し、（ｂ）前記抗体に結合した前記反応溶液中の前記１位が標識された試薬の量を前記検査試料中の前記対象分析物の量の関数として測定するステップを含む前記競合イムノアッセイ方法。３０．Ｗが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項２９に記載の方法。３１．ヘテロ原子を窒素、酸素及び硫黄の中から選択する請求項３０に記載の方法。３２．前記検出可能部分を、酵素、蛍光分子及び化学発光分子の中から選択する請求項２９に記載の方法。３３．１位が標識された試薬が、下記の実施例６〜１０の構造式：の中から選択した構造式を有する請求項２９に記載方法。３４．前記抗体を、下記の式５及び式６：［式中、（ａ）Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは第二の接続部分であり、（ｂ）ｎは１〜１０であり、（ｃ）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜１００％である］の中から選択した構造式を有する免疫原で産生する請求項２９に記載の方法。３５．Ｘが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項３４に記載の方法。３６．Ｗが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項３４に記載の方法。３７．Ｗが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得、（５）ＸはＷと同じか又は異なり得る、請求項３５に記載の方法。３８．免疫原性担体を、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、多糖、リポ多糖、ポリ（アミノ）酸及び核酸の中から選択する請求項３４に記載の方法。３９．免疫原性担体物質を、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン及びチログロブリンの中から選択する請求項３８に記載の方法。４０．免疫原が、下記の実施例２〜５の式：の中から選択した構造式を有する請求項３９に記載の方法。４１．免疫原が式６を有する請求項３４に記載の方法。４２．Ｘが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項４１に記載の方法。４３．Ｗが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項４１に記載の方法。４４．Ｗが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得、（５）ＸはＷと同じか又は異なり得る、請求項４３に記載の方法。４５．ヘテロ原子を窒素、酸素及び硫黄の中から選択する請求項４４に記載の方法。４６．Ｗ及びＸを、アルキレン、アリールアルキレン及びアルキレン置換シクロアルキレン基の中から選択する請求項４５に記載の方法。４７．前記標識された試薬が、下記の実施例６〜１０の式：の中から選択した式を有する請求項４４に記載の方法。４８．標識された試薬が実施例１０の構造式を有する請求項３４に記載の方法。４９．前記免疫原が実施例４及び５の式の中から選択した構造式を有する請求項４８に記載の方法。５０．検査試料中の対象分析物を定量するための競合イムノアッセイ方法であって、（ａ）前記検査試料を、標識された試薬と、下記の構造式：で示される１位免疫原で産生した抗体とに接触させ、但し前記式中、（ｉ）Ｐは免疫原性担体物質であり、（ii）ｎは１〜１０であり、（iii）Ｘは接続部分であり、（iv）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜１００％であり、（ｖ）前記抗体は前記標識試薬及び前記対象分析物に結合することができ、（ｂ）前記抗体に結合した前記反応溶液中の前記標識試薬の量を前記検査試料中の前記対象分析物の量の関数として測定するステップを含む前記競合イムノアッセイ方法。５１．標識された試薬が、下記の式：［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分であり、ｎは１〜１０である］で示される６位が標識された試薬である請求項５０に記載の競合イムノアッセイ。５２．Ｗ及びＸが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗ及びＸは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得、（５）Ｗ及びＸは同じか又は異なり得る、請求項５１に記載のイムノアッセイ。５３．標識された試薬を、下記の実施例１１及び１２の式：で示される標識試薬の中から選択する請求項５２に記載のイムノアッセイ。５４．検査試料中のテストステロンを定量するための検査キットであって、（ａ）下記の式：［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分であり、ｎは１〜１０である］で示される１位が標識された試薬と、（ｂ）テストステロンと前記標識された試薬とに結合することができる抗体からなる抗体試薬とを含む前記検査キット。５５．Ｗが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得る、請求項５４に記載の検査キット。５６．Ｑが、酵素、蛍光分子及び化学発光分子の中から選択したものである請求項５４に記載の検査キット。５７．前記蛍光分子がアミノメチルフルオレセン、アミノーフルオレセン、５ −カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオ尿素フルオレセン及びメトキシトリアジノリル−アミノフルオレセンの中から選択したものであり、前記酵素がアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシターゼ及びβ−ラクタマーゼの中から選択したものであり、前記化学発光分子がルミノール、アクリジニウムスルホンアミド及びアクリジニウムエステルの中から選択したものである請求項５６に記載の検査キット。５８．前記抗体が、下記の構造式５又は構造式６［式中、（ａ）Ｐは免疫原性担体物質であり、（ｂ）Ｘは接続部分であり、（ｃ）ｎは１〜１０であり、（ｄ）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜１００％である］で示される免疫原で産生したものである請求項５４に記載の検査キット。５９．Ｘが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得、（５）Ｗ及びＸは同じか又は異なり得る、請求項５５に記載の検査キット。６０．検査試料中のテストステロンを定量するための検査キットであって、（ａ）下記の式：［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは接続部分であり、ｎは１〜１０である］で示される６位が標識された試薬と、（ｂ）下記の構造式：で示される１位免疫原で産生した抗体とを含み、但し前記式中、（ｉ）Ｐは免疫原性担体物質であり、（ii）ｎは１〜１０であり、（iii）Ｘは接続部分であり、（iv）テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜１００％であり、（ｖ）前記抗体は前記標識試薬及び前記対象分析物に結合することができる、前記検査キット。６１．Ｘ及びＷが０〜５０個の炭素とヘテロ原子とからなり、ヘテロ原子数が１０以下であり、直鎖、分枝鎖もしくは環状部分又はこれらを任意に組合わせた構造を有し、飽和又は不飽和であり、但し（１）直接結合し得るヘテロ原子は２個以下であり、（２）Ｘ及びＷは−Ｏ−Ｏ−結合を含み得ず、（３）環状部分の構成員は６個以下であり、（４）分枝は炭素原子上でのみ生起し得、（５）Ｗ及びＸは同じか又は異なり得る、請求項６０に記載の検査キット。６２．下記の式：［式中、Ｐは免疫原性担体物質であり、Ｘは接続部分であり、テストステロン誘導体によるＰの置換度は１％〜１００％である］で示される免疫原の製造方法であって、（ａ）１，４−アンドロスタンジエン− １７β−オル−３−オンの１７位をＴＢＤＭＳにより保護し、（ｂ）ステップ（ａ）で得た化合物を４−ペンチルマグネシウムブロミドでアルキル化して、１−（４’−ぺンテニル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン −ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｃ）ステップ（ｂ）で得た化合物をオゾン分解し、次いで次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、１−α−（３’ −カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ− ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｄ）ステップ（ｃ）で得た化合物の１７位の保護基を除去して、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを生成し、（ｅ）１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを免疫原性担体物質に接合するステップを含む前記方法。６３．下記の式：１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロン［式中、ｎは１〜１０であり、ｎ’はｎと同じ数値を有する］で示される１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンの製造方法であって、（ａ）１，４−アンドロスタンジエン−１７β−オル−３−オンの１７位をＴＢＤＭＳにより保護し、（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を［ｎ’＋１］− アルケニルマグネシアムブロミドでアルキル化して、１−［ｎ’＋１］−アルケニル−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｃ）１−［ｎ’＋１］−アルケニル−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルをオゾン分解し、次いで次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、１−α−（ｎ’−カルボキアルキル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｄ）１−α−（ｎ’−カルボキアルキル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルをアセトニトリル中のフッ化水素酸水溶液で処理することにより１−α−（ｎ’−カルボキアルキル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルの１７位の保護基を除去して、１−α−（ｎ’−カルボキシアルキル）テストステロンを生成するステップを含む前記方法。６４．下記の構造式：で示される１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンの製造方法であって、（ａ）１，４−アンドロスタンジエン−１７β−オル−３−オンの１７位をＴＢＤＭＳにより保護し、（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を４−ペンテニルマグネシウムブロミドでアルキル化して、１−（４’−ペンテニル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｃ）１−（４’−ペンテニル）−４−アンドロステン−１７β−オル− ３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルをオゾン分解し、次いで次亜塩素酸ナトリウムで酸化して、１−α−（３’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７ β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルを生成し、（ｄ）１− α−（３’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３− オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルをアセトニトリル中のフッ化水素酸水溶液で処理することにより１−α−（３’−カルボキシプロピル）−４−アンドロステン−１７β−オル−３−オン−ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルの１７位の保護基を除去して、１−α−（３’−カルボキシプロピル）テストステロンを生成するステップを含む前記方法。