JPH0949836A

JPH0949836A - 抗体による蛋白質構造の評価方法

Info

Publication number: JPH0949836A
Application number: JP7202011A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Ishibashi; 整石橋; Shinichi Fukuzono; 真一福薗; Norio Shimizu; 範夫清水
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1995-08-08
Filing date: 1995-08-08
Publication date: 1997-02-18

Abstract

(57)【要約】【目的】遺伝子操作技術で生産した蛋白質、あるいは
変性状態から天然型に戻すいわゆるリフォールフォルデ
ィング操作をした蛋白質の２次構造を評価すること。【構成】蛋白質のループ構造などの領域に対する抗体
をそのアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として作製
して、天然型に結合するものと変性型に結合する抗体を
選抜する。そして遺伝子操作技術で生産した該蛋白質あ
るいはリフォールフォルディング操作をした該蛋白質に
対する該抗体の結合能を検定して、該領域の状態が天然
型あるいは変性型であるのかを判定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生理活性を有する蛋白
質の活性に係る２次構造評価に関するもので、遺伝子工
学的に生産した、あるいは変性条件から生理条件に置か
れた該蛋白質の２次構造における構造形成の有無を判定
する方法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子操作技術によりインスリンや成長
ホルモンなどの生理活性物質が微生物を用いて生産され
ている。しかし、生産された蛋白質が不活性であった
り、天然のものにくらべ活性が低いことがある。これ
は、生産された蛋白質が、不完全な折畳やS-S結合の掛
け違いのために完全な天然型の構造になっていないため
である。このような蛋白質の２次構造の評価は、ＣＤス
ペクトルや蛍光強度変化の測定などにより行われてい
る。

【０００３】しかしながら、これらの方法ではヘリック
スやシート構造の比率を測定できるが、２つのヘリック
ス構造あるいは２つのシート構造さらにはヘリックスと
シート構造を連結するループ構造の有無の判定はむずか
しい。これらループ構造は、生理活性物質のレセプタと
の結合部位となっていることが多く、ループ構造形成の
有無が生理活性に大きく影響している。したがって、ル
ープ構造の評価方法が必要とされている。

【０００４】抗体を用いて蛋白質の構造変化を調べる試
みはすでに行われている。James F.Collawnらは、チト
クロームCでアミノ酸残基を別のものに置き換えたり、
あるいは化学修飾したことにより生ずる構造変化を抗チ
トクロームモノクローナル抗体により検定し、抗体をプ
ローブとした方法がCDスペクトル測定より優れているこ
とを示した(Journal of Biological Chemistry， Vol.
263， No. 18，pp8625-8634 (1988)。また、Jean-Marc
Chatelらは、活性型のアセチルコリンエステラーゼのみ
に結合するモノクローナル抗体と不活性型及び変性型に
結合するモノクローナル抗体を作製した(FEBS LETTER
S，Vol.319，No.1，pp12-15 (1993))。前者のエピトー
プの位置は、トリプシンで切断されない領域にあるが、
後者のエピトープはトリプシンで切断される領域にあ
り、両者のエピトープの位置の違いにより結合特異性に
違いが生じている。これまでの抗体は、エピトープ領域
のアミノ酸残基の置換やプロテーアゼによる切断などに
よる構造変化を検出するもので、即ち、アミノ酸残基の
変化を検出することに利用されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術における
抗体による蛋白質の評価では抗体をアミノ酸残基の変化
を検出するプローブとして利用しているが、２次構造の
評価にまでは至っていない。そして通常の抗体作製にお
いても天然型に結合しない抗体が出現するが、抗体を２
次構造評価に利用することへの配慮にかけていたために
スクリーニングで排除されていた。また、本発明の要件
である天然型の蛋白質あるいは変性型の蛋白質に結合す
る抗体は、天然型あるいは変性した供試蛋白質、例えば
２−メルカプトエタノール存在下でのSDS処理により変
性したものを、それぞれ別々にウサギやマウスなどの実
験動物に投与して免疫させることで、抗血清としてそれ
ぞれの抗体が得られる。そして天然型及び変性型の蛋白
質を抗原にして酵素標識抗体測定方法(以下ELISAと略
す)により、それぞれにのみ陽性の抗血清を選抜すれば
目的の抗体が得られる。しかし、両者の抗血清の主要な
エピトープが一致しないことが多く、本発明のように特
定の領域の構造を評価するのには不向きである。

【０００６】同様にマウスやラットに免疫して、その脾
臓細胞とミエローマ細胞を融合してハイブリドーマ細胞
株を樹立して、その抗体をELISAによりスクリーニング
することで目的のモノクローナル抗体を得ることができ
る。しかし、多数の抗体が誘導されることからそのエピ
トープを調べ、さらに共通のアミノ酸配列のエピトープ
で天然型あるいは変性型に結合する抗体を選抜すること
は複雑で効率的でない。

【０００７】したがって、ある領域に絞って、例えば２
次構造のループ構造に対して天然型と変性型に対する抗
体を同時に作製しなければならない。これ対してポリペ
プチド(以下ペプチドと略す)を担体に固定化して免疫す
ることで抗ペプチド抗体を作製する技術では各種抗体を
作製できる。この技術によりループ構造を形成している
領域のアミノ酸配列に対する抗体の作製を検討したとこ
ろ、天然型のループ構造に結合できる抗体と変性型のみ
にしか結合しない抗体を同時に作製することができた。
そして、これらの抗体により該アミノ酸配列を有するS-
S結合の掛け違った蛋白質との結合特性を調べたとこ
ろ、生理活性の低いものでは、変性型の抗体が良く結合
し、正常な２次構造を形成していないことが示唆され
た。これらの結果に基づき、本発明を行うに至った。

【０００８】本発明は、遺伝子操作技術あるいはリフォ
ールディング操作により得られた蛋白質の構造を抗体に
より評価する方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の要件である抗
体、即ち蛋白質のある領域に対して、天然型あるいは変
性型に結合する抗体を同時に作製するために、抗ペプチ
ド抗体を作製する技術を採用した。天然型の蛋白質と
は、生体に有るときと同等の構造状態とし、変性型は、
同天然型の蛋白質を２メルカプトエタノール存在下でＳ
ＤＳ処理した状態と定義する。

【００１０】ペプチドは、アミノ酸残基が十数箇からな
るものを利用するが、ペプチド単独では免疫原性が低い
ため、キャリア蛋白質としてBSA(bovine serum albumi
n)やKLH（keyhole limpet hemocyanin)などにペプチド
結合したものを免疫原とする。そしてペプチドのアミノ
酸配列は、３次構造が不明な場合はHydropathy法により
予測される親水性領域を選抜すると良い。また疎水性と
判定される領域でも抗体が誘導されることもあるので、
必ずしも親水性領域のみを選抜する必要もない。

【００１１】３次構造が不明な場合で２次構造に於るル
ープ構造部位、即ち、２つのヘリックス構造あるいは２
つのシート構造またはヘリックス構造とシート構造を連
結するループ構造に関する抗体を作製するためのペプチ
ドのアミノ酸配列は、Chou、Fasman and Rose 法などに
よる２次構造及びターン構造予測結果からループ構造を
推定して、選抜することができる。

【００１２】さらに、３次構造が判明しているもの、あ
るいは３次構造が判明している同族の蛋白質からその３
次構造が予測されているものでは、抗体分子あるいは抗
体の軽鎖や重鎖の抗原結合部位が近づけるかあるいは近
づけない領域、例えば凹あるいは凸の領域にあるアミノ
酸配列を選抜すると良い。前者では、天然型では結合し
ないが、変性型では結合する抗体が期待できる。また、
ループ構は後者に属するが、凸の領域のアミノ酸配列を
持つペプチドでは天然型で結合する抗体と変性型で結合
する抗体の両者の誘導が期待される。

【００１３】例えば、マウス神経成長因子Nerve Growth
Facter（以下NGFと略す）は、その結晶を用いて３次構
造が解明されている。そして、同族蛋白質の脳由来神経
成長因子Brain-derived Neurotrophic Facter（以下BDN
Fと略す)はそのアミノ酸配列の相同性が高いことから、
３次構造が推測されている(Tom L. Blundelら；Natur
e、Vol.354 pp411-414 (1991)）。その推測構造結果に
基づけば、BDNFもNGFと同様に３組のシート構造と４個
のループ構造を持っている。４個のループ構造の内３
個、シーケンス番号30から35番のアミノ酸配列-DMSGG
-、43から47番のアミノ酸配列-PVSKG-及びシーケンス番
号92から96番-DSKKAR-で構成されるループ構造は、レセ
プタとの結合部位と考えられている。

【００１４】したがって、これら配列を有するペプチド
を合成すれば良い。この時、該配列はなるべく全体配列
のなかでN末端あるいはC末端側に置かない方が良い。ま
た、BDNFでは該ループ構造の前後の配列は、凹んだ領
域、例えば、シーケンス番号39から42番-LEKV-は２つの
ループ構造に囲まれた位置にあることから、このアミノ
酸配列を認識する抗体は、変性型のみにしか結合しない
ものである可能性が大きい。したがって、シーケンス番
号39から50番のアミノ酸配列-LEKVPSKGQLK-のペプチド
を用いると、ループ構造を認識する抗体と変性型のみに
しか結合しない抗体が期待できる。

【００１５】選抜したアミノ酸配列を有するペプチド
は、遺伝子操作技術を利用してあるいは化学合成法によ
り合成すれば良い。前者では、別の蛋白質と融合して合
成すれば、直接免疫に利用できる。後者では、BSAやKLH
などのキャリア蛋白質に化学的に結合させなければなら
ない。その結合は、NHS(N-hydroxysuccinimide)やEDCI
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimde)を用
いて行うことができる。この様に調製したペプチドとキ
ャリア蛋白質の融合物は抗原として、免疫に利用でき
る。

【００１６】抗ペプチド抗体は、ポリクローナルでも良
いが、ペプチドといえども数種類のエピトープに対する
抗体が誘導されているため、目的の領域のアミノ酸配列
に絞って評価するにはモノクローナル抗体の方が良い。
前者の場合、該抗原をラビットやラットなどの実験動物
に常法に従って免疫することで調製できる。得られた抗
血清はそのまま利用しても良いが、プロテインAやプロ
テインGを用いてアフィニティークロマトグラフィで精
製しても良い。そして、目的蛋白質の天然型及び変性型
に対してELISAを行い、天然型に結合するものや変性型
にのみ結合する抗体を選抜する。後者は、いわゆる細胞
融合法により造成されたハイブリドーマ細胞株を培養す
ることでモノクローナル抗体を調製して、天然型の蛋白
質に結合するものや変性型にのみ結合する抗体を選抜す
ることになる。また、該免疫した動物のＢ細胞の抗体遺
伝子を遺伝子操作技術により抗体分子あるいは抗原結合
部位を有する分子を作製して、同様に選抜しても良い。
さらに該ハイブリドーマ細胞の抗体遺伝子から遺伝子操
作技術により抗体分子あるいは抗原結合部位を有する分
子を作製しても良い。

【００１７】常法に従って、ミエローマ細胞株の樹立さ
れているマウスあるいはラットなどの実験動物の皮下、
静脈または、腹腔に２から３週間おきに該抗原を注射し
て免疫させる。注射の回数は、抗体価の変化を測定しな
がら決めることができる。例えば、抗体価を１０⁵以上
に設定すると良いが、特に限定するものはでない。抗体
価の測定に利用する抗原はペプチドとキャリア蛋白質の
融合した該抗原及びキャリア蛋白質の２つを用いると良
い。該抗体価に達した供試個体より脾臓を摘出して、ミ
エローマ細胞と脾臓細胞を融合する。例えば、マウスを
供試個体とすれば、X63株、P3U1株、NS-1株あるいはSP2
株のミエローマ細胞株を利用できる。

【００１８】細胞融合は、ポリエチレングリコール(分
子量1000〜4000)を用いて行える。ハイブリドーマ細胞
は、HAT培地により選抜する。そして各ハイブリドーマ
細胞群の培養液について１次スクリーニングを行う。ペ
プチドとキャリア蛋白質の融合した該抗原及びキャリア
蛋白質の２つを用いてELISAを行い、前者で陽性で後者
で陰性、あるいは陽性の度合いが前者の方が大きいもの
について、限界希釈法によりクローニングする。このEL
ISAで天然型及び変性型の蛋白質を用いる場合、両者で
陰性のもの以外を選抜してクローニングすれば良い。

【００１９】次にクローニングした細胞株の培養液にて
２次スクリーニングを行う。ペプチドとキャリア蛋白質
の融合した該抗原及びキャリア蛋白質の２つを用いてEL
ISAを行い、前者で陽性で後者で陰性のものを選抜す
る。選抜株について３次スクリーニングをする。１次ス
クリーンで天然型及び変性型の蛋白質を用いた場合は、
そのクローンは、２次スクリーニングを省く。なお、３
次スクリーニングの前に再度クローニングを行っても良
い。３次スクリーニングは、各クローンにつて天然型及
び変性型の蛋白質に対する結合能を、天然型で陽性の抗
体Ａ及び変性型のみに陽性の抗体Ｂを産生するクローン
に分けて選抜する。選抜は、ELISAやドットブロッテイ
ングなどで行えるが、抗原抗体反応における結合定数と
解離定数そして親和性定数を測定して分類することもで
きる。なお、抗体のクラスは特に限定する必要がない。

【００２０】選抜クローンの抗体は、次の操作により調
製できる。該クローンを予めプリスタンを投与した動物
個体の腹腔へ移植し、１０〜１４日後に復水を採取する
ことで抗体が得られる。また、該クローンを無血清培地
に馴化させた後、無血清培地で培養してその培養液から
抗体を得る。抗体は、該復水または培養液から硫安塩
析、イオン交換クロマトグラフィーやアフィニティクロ
マトグラフィーなどの工程を経て精製できる。

【００２１】これら精製抗体について、使用アミノ酸配
列におけるエピトープの位置を同定する。同定は、６個
程度のアミノ酸残基からなるペプチドをＮ-末端側から
順に１残基ずつずらして、例えば-LEKVPVSKGQLK-で、EK
VPVS、KVPVSK、VPSKGQ、．．を合成して、それぞれのペ
プチドの一端を担体に固定化した状態で交差反応性を検
討して決めることができる。また、相同性のある蛋白質
で類似のアミノ酸配列領域のペプチドを同じく担体に固
定して交差反応性を検討しても良い。なお、担体は、プ
ラスチック表面あるいは該キャリア蛋白質で良い。その
検討結果に基づいて目的の領域のアミノ酸配列をエピト
ープとする抗体を選抜する。

【００２２】対象蛋白質である遺伝子操作技術で作製し
たあるいはリフォールディング操作をした蛋白質のある
領域Ｒについて、そのアミノ酸配列とエピトープのアミ
ノ酸配列が同一もしくは類似であり、かつ天然型で陽性
の抗体Ａ及び変性型のみに陽性の抗体Ｂを用いて、該蛋
白質につて、ELISAやドットブロッテイングあるいは抗
原抗体反応における結合定数と解離定数そして親和性定
数を測定して交差反応性を検討する。その結果、抗体Ａ
の結合が陽性かつ抗体Ｂの結合が陰性の場合は、供試該
蛋白質における領域Ｒは天然型と、また抗体Ｂのみが陽
性の場合は、該領域を変性型と判定する。また、すべて
の抗体が陰性の場合は、該領域Ｒがその構造の形成如何
に拘らず、別の領域のペプチドにより遮蔽されているこ
とを示す。即ち、該領域Ｒは天然型でないと判定する。
そして抗体Ｂのみしか得られない領域Ｒについては、該
抗体Ｂの結合が陽性の場合は領域Ｒは変性型と判定す
る。以上、蛋白質の２次構造を評価するためのペプチド
のアミノ酸配列の選抜、該ペプチドに対する抗体の作
製、抗体の選抜とエピトープの決定そして供試蛋白質に
対する結合能の検定を行うことで、抗体により蛋白質の
２次構造を評価することができる。

【００２３】

【作用】本発明は、蛋白質のある領域Ｒに対して、天然
型の領域Ｒに結合する抗体Ａ及び変性型の領域Ｒにのみ
結合する抗体Ｂを作製して、遺伝子操作技術で調製した
あるいは変性状態からリフォールディング操作をした該
蛋白質とをそれぞれ反応させ、それぞれの結合能をELIS
Aやドットブロッテイングあるいは抗原抗体反応におけ
る結合定数と解離定数そして親和性定数を測定して交差
反応性を検討することで、該蛋白質の該領域Ｒが天然型
か、あるいは変性型かを判定して該蛋白質の２次構造を
評価するものである。

【００２４】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本実施例に限定されるものではない。

【００２５】実施例１次の方法によりBDNFのループ構造を構成するアミノ酸配
列を持つペプチド-LEKVPVSKGQLK-及び-ALTMDSKKRIGWRF-
に対する抗ペプチドモノクローナル抗体を作製した。以
後、前者のペプチドをW336、後者のペプチドをW338と呼
ぶ。

【００２６】（１）ペプチド抗原の作製ペプチドは、Fmoc法により合成して、逆相クロマトグラ
フィーにより純度80〜90％に精製した。これらペプチド
をそれぞれBSAに結合させて、供試抗原とした。以下に
その方法を示す。

【００２７】ペプチド5mgを350mlのPBSに溶解して、こ
れをぺプチドとBSAの重量比が３：10となるように50ml
のBSA溶液（30mg/ml）と混合した。そして15mgのEDCI
（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide、h
ydrochloride）を混合溶解させた後、室温、暗条件下で
一晩静置した。反応液を１LのPBSで４回透析した後、遠
心分離（10,000×ｇ、5分）により凝集物を除去した。
上清を抗原として採取し、-80℃に保存した。以下この
抗原をpeptide-BSAと呼ぶ。

【００２８】該peptide-BSAのN末端のアミノ酸配列をプ
ロテインシーケンサーにより調べた。その結果、ペプチ
ド及びBSAそれぞれのＮ−末端からのアミノ酸残基が順
番に検出され、ペプチドの結合とそのアミノ酸配列を確
認すると共にペプチドの分子内やペプチド同志の結合
（アスパラギン酸とグルタミン酸残基を介しての結合）
による異常が起きていないことが分かった。そしてBSA
とペプチドのアミノ酸残基の検出量よりBSA１分子当り
のペプチド数を計算したところ、その数は６から30であ
った。

【００２９】（２）免疫各peptide-BSAをそれぞれ２匹のBALB/cマウス（♀、４
週齢）にアジュバント（N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-i
soglutamine)とともに腹腔に２週間間隔で注射して免疫
した。１回目は、抗原量100μgとアジュバント15μgをP
BSに混合した液0.5mlを、２回目以降は、抗原量２0μg
とアジュバント15μgの混合液を、血清の抗体価が10⁵以
上に上昇するまで注射した。その結果、４回の抗原の投
与では、いずれも十分な抗体価に達成していないことが
分かり、さらに免疫を継続した。そして６回目の免疫で
W336-BSA及びW338-BSAは抗体価が10⁵以上になった。そ
こでマウスから脾臓細胞を摘出して細胞融合を行った。

【００３０】（３）細胞融合とHAT選抜脾臓細胞とミエローマ細胞（P3U1)とを細胞数で５：１
になるように混合したペレットを調製して、分子量1500
のポリエチレングリコール50％溶液（75mM HEPES:Boehr
inger Manheim社製）で常法に従い細胞融合した。融合
後、20%FBS（牛胎児血清）含有のHAT培地（ERDF培地
（極東製薬社製）にHAT溶液（大日本製薬社製）を混合
したもの）に脾臓細胞濃度が２×10⁶cells/mlとなるよ
うに融合細胞を懸濁して、96穴マイクロプレートのウエ
ルに100μlずつ分注した。そして37℃のＣＯ₂インキュ
ベータで培養を開始した。その４日後に100μlのHAT培
地を添加して、それ以後２日おきに培地交換（50％）を
した。

【００３１】（４）スクリニーングおよびクローニング抗体のスクーリニングは２段階とし、1次はpeptide-BSA
を抗原としたELISAで、2次でrBDNF(PEPROTECH社製；組
み換え大腸菌による生産、純度96％）を用いてドットブ
ロッティングした。クロニーングは、1次スクリーニン
グで陽性であったハイブリドーマ細胞を限界希釈法によ
り行った。４週齢マウスの胸腺を摘出し、ＨＴ培地（ER
DF培地にＨＴ溶液（大日本製薬社製）を混合したもの）
に同細胞を懸濁して、フィーダ細胞液（１×10⁷cells/
ml）を調製した。そしてハイブリドーマ細胞を濃度が２
×10⁵cells/mlとなるようにフィーダ細胞液に懸濁し
て、その100μlを96穴マイクロプレートのウエルに分注
して培養した。培養10日後、顕微鏡で単一のコロニーが
出現したウエルを選抜して、100μlのＨＴ培地を添加し
た。そしてコロニーが肉眼にて判別できる大きさになっ
たものについて、ELISAを行い陽性のものを選抜した。
陽性クローンは、24ウエルプレートで培養後、ELISAで
再度陽性を確認して液体窒素内に凍結保存した。

【００３２】96穴マイクロプレート４枚でハイブリドー
マ細胞をHAT選択して、次いでハイブリドーマ細胞が出
現したウエルの培養液についてELISAを行い、peptide-B
SAに対して陽性でかつBSAで陰性あるいは呈色度合いがp
eptide-BSAの方がBSAより高いウエルを選んだ。ハイブ
リドーマ細胞の出現率は平均40％で、次に選抜ウエルの
ハイブリドーマ細胞をクローニングした。それぞれ１個
のコロニーが出現したウエルについてELISAを行い、pep
tide-BSA陽性でかつBSAで陰性のものを選抜した。その
結果、W336-BSAでは７クローン（4A12、4AA5、4AB2、4A
B5、4BE1、4BF5、4H11）、そしてW338-BSAでは3クロー
ン（6B1、6B33、6B35）を樹立した。これらのハイブリ
ドーマのいくつかは工業技術院生命工学工業技術研究所
に下記のように寄託された。

【００３３】ハイブリドーマ4AA5:FERM P-15075 ハイブリドーマ4A12:FERM P-15076 ハイブリドーマ4AB2:FERM P-15077 ハイブリドーマ4BE1:FERM P-15078 ハイブリドーマ4H11:FERM P-15079 ハイブリドーマ6B33:FERM P-15080 各ハイブリドーマ細胞株の産生する抗体の重鎖及び軽鎖
を検定したところ、4A12及び6B1抗体を除いてほとんど
がIgM型の重鎖、そして軽鎖はすべてκ型であった。4A1
2及び6B1抗体は、全ての重鎖抗体とは結合しないものの
軽鎖抗体と結合した。そこで両抗体を非還元条件でSDS-
PAGEを行い、ニトロセルロース膜に転写して軽鎖抗体で
ブロッテングした。その結果、両抗体とも軽鎖のモノマ
ー（約25kDa)の位置にバンドが検出され、4A12及び6B1
細胞は、軽鎖のみを産生していることが分かった。

【００３４】（５）抗体の調製各ハイブリドーマ細胞株を血清培地から無血清培地へ馴
化（約２週間かけて血清濃度を10％から０％に順次低下
させて継代培養）した。これらの株はいずれも抗体産生
能を低下させずに無血清培地に馴化させることができ、
無血清培地で抗体を生産した。そして該ハイブリドーマ
細胞について容量400mlのタッピングフラスコ（仕込量8
0ml）で浮遊培養した。培養上清液を限外ろ過膜（分画
分子量；200kDa、東洋アドバンテック社製）により約10
倍に濃縮して飽和硫安で塩析した後、透析を行い抗体を
得た。

【００３５】実施例２上記抗体につき、市販されているrBDNF(PEPROTECH 社
製)及びrNGF(AUSTRAL Biologicals社製；組み換えCHO細
胞による生産、純度９０％以上）に対する交差反応性を
ドットブロット法により検討した。rNGFについて同時に
行った理由は、選抜したペプチドが表１に示すようにNG
Fと相同するアミノ酸配列を有していることから、rNGF
への結合の可能性があると考えられたからである。

【００３６】

【表１】

【００３７】表１はBDNF由来のW336及びW338ペプチドと
NGF由来のW335及びW337ペプチドとの相同部位のアミノ
酸配列を示す。

【００３８】rNGF、2ME-SDS処理したrNGF、rBDNF、2ME-
SDS処理したrBDNF及びpeptide-BSAの抗原溶液（0.1mg/m
l)そして抗体溶液をそれぞれニトロセルロース膜（Hybo
nd-C：Amersham社製）上に１ml滴下し、室温で乾燥させ
て抗原を固定した。PBSTとPBSで洗浄後（それぞれ５分
間の振盪条件で２回、以後単に洗浄と略す）、２枚のパ
ラフィルムでニトロセルロース膜を乳蛋白質溶液（1/4
ブロックエース）に浸漬してはさみ、周囲をハサミで切
って上下のパラフィルムを圧着した。これを４℃で一晩
放置してブロッキングした。洗浄後、上記のように抗体
溶液（0.2ml)と膜をパラフィルムではさみ、37℃で一時
間反応させた。そして２次抗体及びアビジン−ビオチン
化パーオキシダーゼを順に結合させて4-クロロ-1-ナフ
トール溶液(３mg/ml-メタノール溶液をPBSと容積比１：
５で混合して、H2O2を0.015％添加）で発色させた。

【００３９】rBDNFに結合した抗体は、4A12及び4H11
抗体のみであった。しかも、両抗体はrNGFにも結合する
とともに2ME-SDS処理して変性させたrBDNF及びrNGFにも
結合した。

【００４０】2ME-SDS処理した変性rBDNFのみに結合し
たものは、4AA5、4AB2及び6B33抗体で、いずれも2ME-SD
S処理したrNGFにも結合した。

【００４１】4BE1、4BF5及び6B1抗体は、変性したrNG
Fで薄く発色したが、peptide-BSA及び2ME-SDS処理したr
BDNFで発色が見られなかった。また、4AB5及び6B35抗体
は全て発色しなかった。それぞれ抗体自身の発色が上記
の他の抗体のそれと同程度であることから、発色しなか
った要因は、親和性が著しく弱いためと考えられた。以
上の結果、天然型のrBDNFと交差反応する抗体は、4A12
及び４H11抗体のみで、4AA5、4AB2及び6B33抗体は2ME-S
DS処理した変性型のみに結合することが分かった。ま
た、それぞれの抗体がrNGFの天然型あるいはその変性型
に結合することから、エピトープ（結合部位）がNGFと
相同する領域を持っていることが分かった。

【００４２】実施例３ドットブロッティングにて比較的親和性の高い、4AA5、
4A12、4AB2、4H11及び6B33抗体のエピトープを検討し
た。

【００４３】4AA5、4A12、4AB2、及び4H11抗体は、いず
れも2ME-SDS処理したrNGFにも結合したことから、これ
らのエピトープがNGFのアミノ酸配列中にも存在してい
る。そこで表１に示すNGF由来のペプチドとの交差反応
の有無を検討した。なお、対照区として、W337及びW338
のペプチドを使用した。

【００４４】いずれの抗体もNGF由来のW335ペプチドに
結合したことから、W335とW336で類似の配列-LEKV-を認
識していると考えられた。さらに、4AB2及び4H11抗体
は、W338とも結合することから、W336とW338の共通の配
列-SK-を認識している。したがって、4AA5及び4A12のエ
ピトープは、-LEKV-の配列を含む領域、また、4AB2及び
4H11抗体のエピトープは、-LEKVPVSK-の配列を含む領域
であると考えられた。ところで、4AA5及び4AB2抗体は、
変性したrBDNFのみにしか結合できないが、4A12及び4H1
1抗体は、天然型にも結合する。即ち、4AA5と4A12抗体
また4AB2と4H11抗体は、それぞれエピトープのアミノ酸
配列が近いにも拘わらず、rBDNFへの結合特性が異なっ
ていることが分かった。これは、天然型のエピトープへ
の親和性の違いによると考えられた。

【００４５】B33抗体は、W337-BSA及びW338-BSAのELISA
では後者のみにしか結合せず、即ち、両ペプチドで共通
でないところが結合部位と考えられた。しかし、2ME-SD
S処理したrBDNF及びrNGFのドットブロットでは両者に結
合したことから、その結合部位がNGFでW337以外の配列
にあることが分かった。そこでW338のアミノ酸配列に於
て-ALTMD-あるいは-WRF-の配列以外でNGFと共通の配列
があるか否かを検索したところ、-DSK-の配列がNGFの72
から74番目にあることが分かった。そして、W336-BSAの
ELISAでは6B33抗体は陰性であったことから、-DSK-を特
異的に認識していると考えた。

【００４６】実施例４各抗体の結合特性は、その親和性に依存していることが
これまでの結果より分かった。そこで、4AA5、4A12、4A
B2、4H11、4BE1及び6B33抗体について天然型及び変性型
のrBDNFに対して親和性定数（KA）をFisons社製のIAsys
装置を利用して測定した。

【００４７】その結果、各抗体のka、kd及び親和性定数
（KA）は表２のようになった。

【００４８】

【表２】

【００４９】表２は4AA5、4A12、4AB2、4BE1、4H11及び
6B33抗体の天然型及び変性型BDNFとの抗原抗体反応にお
ける結合定数、解離定数及び親和性定数を示す。

【００５０】天然型のrBDNFのドットブロットで陽性
の4A12及び4H11抗体の親和性定数（KA）は、4.31及び2.
17、また、陰性の4AA5、4AB2、4BE1及び6B33抗体は0.91
以下と小さいことが分かった。この差は、解離定数（k
d）に大きな差がないことから、結合定数（ka）の違い
に起因している。即ち、4A12及び4H11抗体は、そのkaが
他の抗体に比べ一桁大きいことから、それぞれのエピト
ープと会合する確率が高いことが分かる。

【００５１】変性型のBDNFへのKAは、いずれも天然型
のものに比べて増加した。その増加割合は、4AA5、4A1
2、4AB2及び6B33抗体で約４倍から150倍と大きいが、4H
11抗体は1.3倍と低いことが分かった。この違いは、前
者ではいずれもkaが増加しているのに対して、後者では
大きく減少したことによる。即ち、4H11抗体は変性型よ
りも天然型のエピトープと会合し易いことことが分かっ
た。

【００５２】ドットブロッティングで陰性でKA値が最
大値である抗体は4BE11抗体で、KAは1.35×10⁷、また、
ドットブロッティングで陽性のKA値が最小値である抗体
は4H11抗体で、KA値は2.17×10⁷であった。即ち、KA値
が1.35×10⁷以下ではドットブロッティングで陰性、2.1
7×10⁷以で陽性と判定できる。

【００５３】以上の結果から、4AA5、4A12、4AB2、4H11
及び6B33抗体のrBDNFに対する結合能は明らかにその親
和性に依存していることを確認した。

【００５４】ところで、4AA5と4A12抗体、また4AB2と4H
11抗体は、それぞれエピトープのアミノ酸配列がほぼ同
じであるにも拘わらず、なぜ天然型のrBDNFに対して親
和性に違いがあるのであろうか。

【００５５】KAは、抗体の抗原結合部位の構造とエピト
ープとの相補性に依存している。4AA5と4A12抗体の変性
型のrBDNFに対するKA がほぼ同じであることから、両者
の抗原結合部位は変性型のエピトープと相補性が強いこ
とが分かる。しかし、4A12抗体の天然型のrBDNFに対す
るKA は、4AA5抗体の約23倍と大きい。これは、4A12抗
体のkaが4AA5抗体の約20倍と大きいこと、即ちエピトー
プと会合する確率が高いことに起因していると考えられ
る。このことから、天然型では-LEKV-のエピトープは２
つのループ構造の間に挟まれた位置にあるため4AA5抗体
は物理的に近づき難いが、軽鎖の4A12抗体はその隙間に
近づけたと推測される。また、4AB2と4H11抗体のKAは、
天然型と変性型で異なることから、両者の抗原結合部位
の構造の違いによると言える。前者は、変性型のエピト
ープと、後者は天然型のそれと相補的な抗原結合部位を
持っていることが確認できた。

【００５６】実施例５組み換え大腸菌で作製したrBDNFの構造を4AA5、4A12、4
AB2、4H11及び6B33抗体をプローブとしてイムノブロッ
テイングで評価を試みた。

【００５７】その際、4AA5と4A12抗体では、前者が陰性
で後者が陽性であれば、-LEKV-の配列が天然型である
が、前者が陽性であると変性型と判定した。両者が陰性
の場合は、-LEKV-の配列が遮蔽されていることになる。
また、4AB2と4H11抗体では、前者が陰性で後者で陽性で
あったとすると、-LEKVPVSK-の配列は天然型に、前者が
陽性であれば変性型と判定した。そして両者が陰性の場
合は、同配列の一部または全体が遮蔽されていると考え
た。6B33抗体は、陽性であると-DSK-の配列は変性型で
あり、陰性であれば天然型かあるいは完全に遮蔽された
状態と判定した。そこで、S-S結合の掛け違った各種rBD
NF(E-5〜9）について上記抗体によりドットブロッテイ
ングを行った。各rBDNFで陽性の抗体を表３に示す。

【００５８】

【表３】

【００５９】表３は組み換え大腸菌で作製したBDNFで、
S-S結合の掛け違いのあるものに対する4AA5、4A12、4AB
2、4H11及び6B33抗体の結合を示す。

【００６０】E-5及びE-7AとBは、S-S結合位置は未だ決
定されていないが、SDS-PAGEや逆相クロマトグラフィの
結果よりS-S結合の掛け違いが予想されている。E-6、8
及び9は、S-S結合位置が判明しているもので、A、B２種
類はそれぞれ共通のS-S結合を１個持っている。これら
は、生物活性の指標であるED₅₀の値は、いずれも正常な
S-S結合を持つもの（0.07ng/ml)に比べ大きく神経線維
の伸張を誘導する能力が低いが、まったく生物活性を消
失しているわけでもない。

【００６１】E-6A、E-9A及びBは、いずれも4AA5、4AB2
及び6B33抗体が結合したことから、-LEKVPSK-及び-DSK-
の配列は変性型である。したがって、これらの配列を含
むループは、構成されていないと判定した。それでも生
物活性を有しているのは、もう１つのループが構成され
ていたためと考えれる。一方、E-6Bは、4AB2抗体で陰性
で4H11抗体で陽性であることから-LEKVPSK-の配列が天
然型に近い状態にあり、ループ構造を構成していると考
えらる。そして4A12抗体の結合がないことから、-LEKV-
の領域の一部が遮蔽されていると考えられる。また、6B
33抗体が陰性であることから、もう一つのループも構成
されている可能性もある。E-8A及びBは、すべての抗体
に対して陰性である。ループ構造が構成されないでそれ
ぞれの4AA5及び4AB2抗体のエピトープが遮蔽されている
か、あるいは、ループ構造が構成されていて4A12及び4H
11抗体のエピトープが遮蔽されている場合が想定され
る。前者であるとすると、E-6A、E-9A及びBの状態に近
い。しかし、生物活性がこれらより大きいことから、後
者の可能性が高いと判定した。

【００６２】これらの結果より、S-S結合の掛け違うrBD
NFの生物活性の大小は、ループ構造の状態に依存してい
るため、4AA5、4A12、4AB2、及び4H11抗体の結合の有無
を調べることで、ループ構造の状態を予測してrBDNFの
生物活性の大小を判定できることが分った。

【００６３】

【発明の効果】本発明によれば、遺伝子操作技術で生産
した蛋白質やリフォルディング操作をした蛋白質におい
て特定領域の構造、例えばループ構造が天然型あるいは
変性型であるかを判定できるため、生理活性の度合いを
評価できる。また、蛋白質構造異常に基づく疾患に対し
て、生体試料の免疫組織染色と組合せることで、生体の
異常判定にも適用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】蛋白質のある領域Ｒに対して、天然型の該
領域に結合する抗体Ａ及び変性型の該領域にのみ結合す
る抗体Ｂを作製して、それぞれの抗体を供試蛋白質と反
応せしめ、抗体Ａの結合が陽性かつ抗体Ｂの結合が陰性
の場合を供試蛋白質における該領域Ｒは天然型と判定
し、抗体Ｂの結合が陽性の場合または抗体Ａ及び抗体Ｂ
の結合がいずれも陰性の場合は供試蛋白質における該領
域Ｒを変性型と判定することを特徴とする抗体による蛋
白質構造の評価方法。
【請求項２】供試蛋白質の領域Ｒのアミノ酸配列を持つ
ペプチドを担体に結合したものを免疫原として天然型に
結合する抗体Ａ及び変性型のみに結合する抗体Ｂを作製
することを特徴とする抗体の作成方法。
【請求項３】供試蛋白質が脳由来神経成長因子によるも
のであり、該供試蛋白質の領域Ｒのアミノ酸配列が-ALT
MDSKKRIGWRF-または-LEKVPVSKGQLK-である請求項２記載
の抗体の作成方法。