JPH09327295A - Vitamin d receptor isoform protein - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は新規なビタミンＤレ
セプターアイソフォームタンパク質をコードする遺伝
子、該遺伝子を含む組換えベクター、該組換えベクター
によって形質転換された宿主細胞、該宿主細胞を培養す
ることによって得られるビタミンＤレセプターアイソフ
ォームタンパク質、該タンパク質を認識する抗体、なら
びに該タンパク質を用いた骨密度の診断方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a gene encoding a novel vitamin D receptor isoform protein, a recombinant vector containing the gene, a host cell transformed with the recombinant vector, and culturing the host cell. The present invention relates to a vitamin D receptor isoform protein obtained by the method, an antibody that recognizes the protein, and a method for diagnosing bone density using the protein.
【０００２】[0002]
【従来技術】１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
3［１，２５（ＯＨ）2Ｄ3］は、カルシウム恒常性や細
胞分化を制御するなどの生物活性を有するが、その生物
活性のほとんどは核内ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）
によって媒介される遺伝子の発現によって作用する（Da
rwish and DeLuca, Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expre
ss.,3:89-116, 1993）。ＶＤＲは、リガンド誘導可能な
転写因子として機能する核内レセプタースーパーファミ
リーのメンバーであることが知られている（Greenand C
hambon, Trends Genet., 4:309-314, 1988; Parker, Cu
rr. Opin. Cell Biol., 5:499-504, 1993）。このファ
ミリーにはステロイドホルモン、甲状腺ホルモンおよび
レチノイン酸に対する核内レセプター、ならびにオーフ
ァン・レセプターと呼ばれるリガンド未知のレセプター
が含まれる。構造や機能の類似性に基づくと、ＶＤＲ
は、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）、９−シスレチ
ノイン酸レセプター（ＲＸＲ）や甲状腺ホルモンレセプ
ター（ＴＲ）と共に核内レセプタースーパーファミリー
内でサブファミリーを形成する。PRIOR ART 1,25-Dihydroxyvitamin D
3 [1,25 (OH) 2 D 3 ] has biological activities such as regulating calcium homeostasis and cell differentiation, but most of the biological activities are nuclear vitamin D receptor (VDR).
Acts by gene expression mediated by (Da
rwish and DeLuca, Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expre
ss., 3: 89-116, 1993). VDR is known to be a member of the nuclear receptor superfamily that functions as a ligand-inducible transcription factor (Green and C
hambon, Trends Genet., 4: 309-314, 1988; Parker, Cu
rr. Opin. Cell Biol., 5: 499-504, 1993). This family includes nuclear receptors for steroid hormones, thyroid hormones and retinoic acid, as well as receptors of unknown ligand called orphan receptors. Based on structural and functional similarities, VDR
Forms a subfamily within the nuclear receptor superfamily with the retinoic acid receptor (RAR), 9-cis retinoic acid receptor (RXR) and thyroid hormone receptor (TR).
【０００３】ＲＡＲやＴＲと同様に、ＶＤＲはＲＸＲと
ヘテロダイマーを形成することが知られている。これら
のヘテロダイマーは異なってはいるが類似の標的エンハ
ンサーエレメントと結合する。この標的エンハンサーエ
レメントは２つの反復するコアＡＧＧＴＣＡモチーフ
（または関連の６塩基からなるモチーフ）からなってい
る。２つのコアモチーフの間に存在するスペーサーはＲ
ＸＲ／ＶＤＲヘテロダイマーの場合には３ｂｐ（ＤＲ
３）であり、ＲＸＲ／ＴＲでは４ｂｐ（ＤＲ４）であ
り、ＲＸＲ／ＲＡＲでは２ｂｐ（ＤＲ２）および５ｂｐ
（ＤＲ５）である。このスペーサーの違いにより、標的
エンハンサーエレメントを認識するための核内レセプタ
ーを区別する（Umesono et al., Cell 65:1255-1266, 1
991; Rastinejad et al., Nature 375:203-211, 199
5）。Like RAR and TR, VDR is known to form a heterodimer with RXR. These heterodimers bind different but similar target enhancer elements. This target enhancer element consists of two repeating core AGGTCA motifs (or a related 6-base motif). The spacer existing between the two core motifs is R
3 bp (DR in case of XR / VDR heterodimer
3), 4 bp (DR4) for RXR / TR, 2 bp (DR2) and 5 bp for RXR / RAR
(DR5). This difference in spacer distinguishes nuclear receptors for recognition of target enhancer elements (Umesono et al., Cell 65: 1255-1266, 1
991; Rastinejad et al., Nature 375: 203-211, 199.
Five).
【０００４】上述したＲＸＲとＶＤＲとのヘテロダイマ
ー形成に加えて、ＶＤＲはいくつかのビタミンＤレスポ
ンスエレメント（ＶＤＲＥ）においてホモダイマーを形
成し、これはビタミンＤに２つのシグナル伝達経路の存
在することを示唆する（Carberg et al., Nature 361:6
57-660, 1993; Towers et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 90:6310-6314, 1993）。In addition to the above-mentioned heterodimer formation between RXR and VDR, VDR forms homodimers in some vitamin D response elements (VDREs), which indicates that vitamin D has two signaling pathways. Suggest (Carberg et al., Nature 361: 6
57-660, 1993; Towers et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 90: 6310-6314, 1993).
【０００５】これらのレセプターの機能上および構造上
の類似性にもかかわらず、現在までにＶＤＲタンパク質
ではただ１つのタイプが見いだされているのみである。
一方、ＲＡＲ、ＲＸＲやＴＲでは複数のサブタイプなら
びにこれによりコードされるタンパク質が変化した形の
アイソフォームが見いだされている（Kastner et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2700-2704, 1990; Ler
oy et al., EMBO J. 10:59-69, 1991; Zelent et al.,
EMBO J. 10:71-81, 1991）。ＲＡＲおよびＴＲのアイソ
フォームは選択的スプライシングおよび／または異なる
プロモーターの制御により生じると考えられている。ま
た、一過性発現アッセイを用いる機能的分析によると、
レセプターアイソフォーム間では転写促進活性が異なる
ことが示されている（Nagpal, et al., Cell 70:1007-1
019, 1992）。さらに、ＲＡＲおよびＲＸＲのレセプタ
ーアイソフォームやサブタイプを欠失するマウス系を用
いる遺伝実験から、レチノイン酸シグナル経路に及ぼす
各サブタイプやアイソフォームの組織特異的ならびに発
生段階特異的な役割が明らかとなった（Kastner etal.,
Cell 78:987-1003, 1994）。したがって、核内レセプ
ターのサブタイプおよびアイソフォームはリガンドの生
物学的作用を区別して調節しているように思われる。Despite the functional and structural similarities of these receptors, to date only one type of VDR protein has been found.
On the other hand, in RAR, RXR and TR, several subtypes and isoforms in which the proteins encoded thereby have altered forms have been found (Kastner et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2700-2704, 1990; Ler
oy et al., EMBO J. 10: 59-69, 1991; Zelent et al.,
EMBO J. 10: 71-81, 1991). It is believed that RAR and TR isoforms result from alternative splicing and / or control of different promoters. Also, according to a functional analysis using a transient expression assay,
Transcription-promoting activity has been shown to differ between receptor isoforms (Nagpal, et al., Cell 70: 1007-1.
019, 1992). Furthermore, genetic experiments using a mouse system lacking the RAR and RXR receptor isoforms and subtypes have revealed a tissue-specific and developmental stage-specific role of each subtype or isoform on the retinoic acid signaling pathway. (Kastner et al.,
Cell 78: 987-1003, 1994). Thus, nuclear receptor subtypes and isoforms appear to differentially regulate the biological effects of ligands.
【０００６】ＶＤＲのインビトロでの機能的分析（Naka
jima et al., Mol. Endocrinol. 8:159-172, 1994）な
らびに遺伝性１，２５（ＯＨ2）Ｄ3耐性佝僂病（ＨＶＤ
ＲＲ）患者に見られる遺伝的突然変異（Kristjansson e
t al., J. Clin. Invest. 92:12-16, 1993）を用いるこ
とにより、ビタミンＤシグナル伝達経路にとってのＶＤ
Ｒの重要性が示されている。また最近になって、ヒトＶ
ＤＲ遺伝子（ｈＶＤＲ）の第８イントロンにマッピング
される対立遺伝子の変異体が、オステオカルシン（骨形
成やその維持に関与するタンパク質）の循環と骨密度に
密接に関連することが報告されている（Morrison et a
l., Nature 367:284-287, 1994）。これらの知見に基づ
き、彼らはｈＶＤＲ遺伝子の対立遺伝子変異体を用いて
骨密度を予測し、これを成人の骨折危険度予測に用いる
ことを提案している。ヒトＶＤＲ遺伝子の対立遺伝子の
相違が原因となるスプライシングの変化によるｍＲＮＡ
の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列の変化によって、転
写の半減期が異なる可能性を彼らは示唆しているが、対
立遺伝子の変異がビタミンＤのシグナル経路にどのよう
に影響するかについての分子生物学的な研究はなされて
いない。In vitro functional analysis of VDR (Naka
jima et al., Mol. Endocrinol. 8: 159-172, 1994) and hereditary 1,25 (OH 2 ) D 3 resistant disease (HVD).
Genetic mutations found in RR patients (Kristjansson e
T., J. Clin. Invest. 92: 12-16, 1993).
The importance of R is shown. Recently, human V
It has been reported that an allelic variant that maps to the 8th intron of the DR gene (hVDR) is closely related to the circulation of osteocalcin (a protein involved in bone formation and its maintenance) and bone density (Morrison et a
L., Nature 367: 284-287, 1994). Based on these findings, they propose using allelic variants of the hVDR gene to predict bone density and use it to predict adult fracture risk. MRNA due to altered splicing due to allelic differences in the human VDR gene
They suggest that the half-life of transcription may be different depending on the sequence of the 3'untranslated region (UTR) of Arabidopsis thaliana, but how the allelic mutation influences the vitamin D signaling pathway. Has not been studied in terms of molecular biology.
【０００７】したがって、ビタミンＤの広範な効果や
１，２５（ＯＨ2）Ｄ3の種々の代謝誘導体を考えると、
ビタミンＤの作用に影響するＶＤＲタンパク質のサブタ
イプやアイソフォームが存在する可能性がある。Therefore, considering the broad effects of vitamin D and various metabolic derivatives of 1,25 (OH 2 ) D 3 ,
There may be subtypes or isoforms of VDR protein that affect the action of vitamin D.
【０００８】[0008]
【発明が解決すべき課題】多くの核内レセプターにおい
て終止コドンを含むエキソンは他のエキソンに比べて長
さが長いことが知られている。この最終エキソンおよび
その前後のイントロンの塩基配列には種々の遺伝的多型
が知られている。この遺伝的多型は非コード領域に生じ
るか、あるいはコードされるアミノ酸は変化しない場合
が多いが、多型による塩基の変異によりｍＲＮＡの安定
性および発現量が変化することが知られている。塩基の
変化による疾患と関連した異常なスプライシングに関し
ては、１）エキソン・スキッピング、２）隠れたスプラ
イス部位の活性化、３）イントロン内における偽エキソ
ンの生成、４）イントロンのエキソン化、の４つが知ら
れており、多くの疾患と関連している。特に長いエキソ
ンの前後において異常なスプライシングが起きやすい。It is known that in many nuclear receptors, exons containing a stop codon are longer than other exons. Various genetic polymorphisms are known in the nucleotide sequence of this final exon and introns before and after it. This genetic polymorphism often occurs in a non-coding region or the encoded amino acid is not changed in many cases, but it is known that the stability and the expression amount of mRNA are changed by the mutation of the base due to the polymorphism. Regarding abnormal splicing associated with disease due to base changes, there are four types of 1) exon skipping, 2) activation of hidden splice sites, 3) generation of pseudoexons in introns, and 4) exonization of introns. It is known and associated with many diseases. Abnormal splicing is particularly likely to occur before and after long exons.
【０００９】上述したように、核内レセプターにおける
ｍＲＮＡの多型については、ＴＲ、ＲＡＲ、ＲＸＲなど
では遺伝子が異なる種々のサブタイプが存在し、さらに
個々の遺伝子から選択的スプライシングによるｍＲＮＡ
の多型が生理的条件で生じることが知られている。ま
た、これによりコードされるタンパク質が変化してアイ
ソフォームが生成したり、ｍＲＮＡの安定性が変化し、
より精緻な遺伝子発現調節に寄与していると考えられ
る。As described above, regarding polymorphisms of mRNA in nuclear receptors, there are various subtypes having different genes in TR, RAR, RXR, etc., and mRNAs by alternative splicing from individual genes.
Is known to occur under physiological conditions. In addition, the protein encoded by this changes isoforms, the stability of mRNA changes,
It is considered that it contributes to more precise regulation of gene expression.
【００１０】しかしながら、ビタミンＤレセプター（Ｖ
ＤＲ）ではこのような現象はまだ知られていない。した
がって、本発明の目的は、ＶＤＲの選択的スプライシン
グにより生じるアイソフォームの有無を検討し、併せて
その機能を研究することにある。However, the vitamin D receptor (V
In DR), such a phenomenon is not yet known. Therefore, an object of the present invention is to investigate the presence or absence of an isoform produced by alternative splicing of VDR and also to study its function.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明者らは正規の（canonical）ラットＶＤＲ
（以下においてｒＶＤＲ０という）の種々の領域をコー
ドするＤＮＡ断片およびＤＮＡ結合ドメイン中のＰボッ
クスのオリゴヌクレオチド（Parker, Curr. Opin. Cell
Biol. 5:499-504, 1993）を用いて、各種ネズミおよび
鳥類組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
することにより、新規なＶＤＲアイソフォームをコード
する遺伝子を単離し、その構造を決定することができ
た。In order to achieve the above object, the present inventors have established a canonical rat VDR.
DNA fragments encoding various regions (hereinafter referred to as rVDR0) and P-box oligonucleotides in the DNA binding domain (Parker, Curr. Opin. Cell
Biol. 5: 499-504, 1993) to isolate a gene encoding a novel VDR isoform and to determine its structure by screening a cDNA library derived from various murine and avian tissues. did it.
【００１２】また、この遺伝子を適当なベクターに挿入
した後、この発現ベクターにより形質転換された転換転
換体を培養し、産生された目的タンパク質を分離、精製
することにより新規なＶＤＲアイソフォームタンパク質
を得ることができた。ビタミンＤレセプターでこのよう
なアイソフォームが同定されたのはこれが最初の例であ
る。Further, after inserting this gene into an appropriate vector, a transformant transformed with this expression vector is cultured, and the produced target protein is separated and purified to obtain a novel VDR isoform protein. I was able to get it. This is the first example of the identification of such an isoform at the vitamin D receptor.
【００１３】併せて、上記新規なＶＤＲアイソフォーム
タンパク質の機能を検討し、これがビタミンＤのシグナ
ル伝達経路をネガティブに調節することを確認した。In addition, the function of the novel VDR isoform protein was examined, and it was confirmed that it negatively regulates the vitamin D signal transduction pathway.
【００１４】したがって、本発明は、ＶＤＲアイソフォ
ームタンパク質をコードする遺伝子を提供する。本発明
の好ましい遺伝子は、配列番号１に示すアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列、またはこれを一部置換、
欠失もしくは付加したヌクレオチド配列、あるいはこれ
らにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ
であり、この遺伝子はラットに由来する。このようなラ
ット由来の好ましい遺伝子は配列番号２に示すものであ
る。本発明の好ましい遺伝子はまた、配列番号３に示す
ヌクレオチド配列、またはこれを一部置換、欠失もしく
は付加したヌクレオチド配列、あるいはこれらにハイブ
リダイズするヌクレオチド配列を含むＤＮＡであり、こ
の遺伝子はヒトに由来する。Accordingly, the present invention provides a gene encoding a VDR isoform protein. A preferred gene of the present invention is a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a partial substitution thereof,
DNA containing a deleted or added nucleotide sequence or a nucleotide sequence that hybridizes to these
And this gene is from rat. A preferred rat-derived gene is shown in SEQ ID NO: 2. A preferred gene of the present invention is also a DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a nucleotide sequence partially substituted, deleted or added thereto, or a nucleotide sequence that hybridizes to these, and this gene is used in humans. Comes from.
【００１５】本発明はまた、ＶＤＲアイソフォームタン
パク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供
する。The present invention also provides a recombinant vector containing a gene encoding a VDR isoform protein.
【００１６】本発明はさらに、ＶＤＲアイソフォームタ
ンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターによ
って形質転換された原核もしくは真核宿主細胞を提供す
る。The invention further provides a prokaryotic or eukaryotic host cell transformed with a recombinant vector containing a gene encoding a VDR isoform protein.
【００１７】本発明はさらに、ＶＤＲアイソフォームタ
ンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターによ
って形質転換して得られた形質転換体を培養することに
よって得られるＶＤＲアイソフォームタンパク質を提供
する。The present invention further provides a VDR isoform protein obtained by culturing a transformant obtained by transforming with a recombinant vector containing a gene encoding the VDR isoform protein.
【００１８】本発明はさらに、ＶＤＲアイソフォームタ
ンパク質を認識する抗体を提供する。The present invention further provides an antibody that recognizes the VDR isoform protein.
【００１９】本発明はさらに、ＶＤＲアイソフォームタ
ンパク質を用いた骨密度の診断方法を提供する。The present invention further provides a method for diagnosing bone density using the VDR isoform protein.
【００２０】[0020]
【発明の好ましい実施態様】本発明ではＶＤＲアイソフ
ォームタンパク質をコードする遺伝子を以下の手順によ
って得ることができた。しかし、本発明の遺伝子を得る
には、これに限定されず、後述するように本発明の遺伝
子を発現する組織、細胞などから当業者に公知の方法を
用いてｃＤＮＡを調製することができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In the present invention, a gene encoding a VDR isoform protein could be obtained by the following procedure. However, the gene of the present invention is not limited to this, and cDNA can be prepared from tissues, cells, etc. expressing the gene of the present invention using methods known to those skilled in the art as described below.
【００２１】このようにして、クローン化されたＶＤＲ
アイソフォームタンパク質をコードする遺伝子は適当な
ベクターＤＮＡに組み込むことにより、他の原核細胞ま
たは真核細胞の宿主細胞を形質転換させることができ
る。The VDR cloned in this way
The gene encoding the isoform protein can be transformed into another prokaryotic or eukaryotic host cell by incorporating it into an appropriate vector DNA.
【００２２】さらに、これらのベクターに適当なプロモ
ーターおよび形質発現に係わる配列を導入することによ
り、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現すること
ができる。また、目的とする遺伝子の他にポリペプチド
をコードする遺伝子を連結して、融合タンパク質として
発現させ、精製を容易にしたり、発現量を上げ、精製工
程中で適当な処理を施すことにより、目的のタンパク質
を切り出すことも可能である。後述する実施例ではＧＳ
Ｔ融合タンパク質として発現させ、精製した後、ＧＳＴ
を除去してＶＤＲアイソフォームタンパク質を単離し
た。Furthermore, the gene can be expressed in each host cell by introducing an appropriate promoter and a sequence for expression into these vectors. Further, by linking a gene encoding a polypeptide in addition to the target gene and expressing it as a fusion protein to facilitate purification or increase the expression level, and subjecting it to an appropriate treatment in the purification step, It is also possible to cut out the protein of. In the examples described below, GS
Expressed as a T fusion protein, purified, and then GST
Was removed to isolate the VDR isoform protein.
【００２３】一般に、真核生物の遺伝子はヒトインター
フェロン遺伝子等で知られているように、多型現象を示
すと考えられ（例えば、 Nishi等、 J.Biochem. 97 153
1985)、この多形現象によって１個またはそれ以上のア
ミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化はあ
ってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。Generally, eukaryotic genes are considered to exhibit polymorphism as known in human interferon genes and the like (for example, Nishi et al., J. Biochem. 97 153).
1985), one or more amino acids may be substituted by this polymorphism, or the amino acids may not be changed at all even if the base sequence changes.
【００２４】また、配列番号１のアミノ酸配列の中の１
個またはそれ以上のアミノ酸を欠くかまたは付加したポ
リペプチドあるいはアミノ酸が１個もしくはそれ以上の
アミノ酸で置換されたポリペプチドでもＶＤＲアイソフ
ォームタンパク質の活性を有することがある。例えば、
ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシステイ
ンに相当するヌクレオチド配列をセリンに相当する配列
に変換して得られたポリペプチドがＩＬ−２活性を保持
することも既に公知となっている (Wang等、Science, 2
24 1431 1984）。1 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
A polypeptide lacking or adding one or more amino acids or a polypeptide in which one or more amino acids are substituted may also have VDR isoform protein activity. For example,
It is already known that a polypeptide obtained by converting a nucleotide sequence corresponding to cysteine of human interleukin 2 (IL-2) gene into a sequence corresponding to serine retains IL-2 activity (Wang. Etc., Science, 2
24 1431 1984).
【００２５】また、真核細胞で発現させた場合その多く
は糖鎖が付加されるが、アミノ酸を１ないしそれ以上変
換することにより糖鎖付加を調節することができるがこ
の場合も、ＶＤＲアイソフォームタンパク質の活性を有
することがある。[0025] Further, most of them are subjected to sugar chain addition when expressed in eukaryotic cells, and sugar chain addition can be regulated by converting one or more amino acids. May have foam protein activity.
【００２６】さらに、得られたポリペプチドがＶＤＲア
イソフォームタンパク質活性を有し、配列番号１に示さ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝
子または配列番号２または３に示すヌクレオチド配列と
ハイブリダイズする遺伝子も本発明に含まれる。なお、
ハイブリダイゼーション条件は、通常行われているプロ
ーブハイブリダイゼーションの条件を適用することもで
きる（例えばMolecular Cloning : A Laboratory Manua
l, Sambrook ら、Cold spring Habor Laboratory Pres
s, 1989) 。Further, the obtained polypeptide has VDR isoform protein activity and hybridizes with a gene encoding a polypeptide containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3. The gene that does this is also included in the present invention. In addition,
As the hybridization conditions, the conditions for probe hybridization that is usually performed can be applied (for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manua).
l, Sambrook et al., Cold spring Habor Laboratory Pres
s, 1989).
【００２７】本発明の発現ベクターは、複製起源、選択
マーカー、発現させようとする遺伝子の前に位置するプ
ロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シ
グナルなどを含んでいる。The expression vector of the present invention contains an origin of replication, a selectable marker, a promoter located before the gene to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation signal and the like.
【００２８】本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生
物宿主細胞としては、例えば、大腸菌 (Escherichia
coli) 、バシルス・ズブチリス (Bacillus subtilis)
、バシルス・サーモフィルス（Bacillus thermophilu
s) 等が挙げられる。また真核生物のうち、真核微生物
の宿主細胞としては、例えばサッカロミセス・セレビシ
エー（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられ、哺
乳動物由来の宿主細胞としては、例えばＣＯＳ細胞、チ
ャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７
細胞、３Ｔ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＢＨＫ細胞、ナバル
バ細胞などが挙げられる。なお、本発明の形質転換体の
培養は、宿主細胞に適した培養条件を適宜選択して行え
ばよい。Among the hosts used in the expression system of the present invention, examples of prokaryotic host cells include Escherichia coli.
coli ), Bacillus subtilis
, Bacillus thermophilu
s ) and the like. Among eukaryotes, examples of eukaryotic microbial host cells include Saccharomyces cerevisiae , and examples of mammalian-derived host cells include COS cells, Chinese hamster ovary (CHO) cells, C127
Cells, 3T3 cells, Hela cells, BHK cells, Nabarva cells and the like. The culture of the transformant of the present invention may be carried out by appropriately selecting culture conditions suitable for the host cell.
【００２９】以上のようにして目的とするＶＤＲアイソ
フォームタンパク質をコードする遺伝子で形質転換した
形質転換体を培養し、産生したＶＤＲアイソフォームタ
ンパク質は、細胞内または細胞外から分離し均一にまで
精製することができる。As described above, the transformant transformed with the gene encoding the desired VDR isoform protein is cultured, and the produced VDR isoform protein is isolated from the inside or outside of the cell and purified to homogeneity. can do.
【００３０】なお、本発明の目的タンパク質であるＶＤ
Ｒアイソフォームタンパク質の分離・精製は、通常の蛋
白質で用いられる分離・精製方法を使用すればよく、何
ら限定されるものではない。例えば各種クロマトグラフ
ィー、限外濾過、塩折、透析等を適宜選択、組合せれて
用いることができる。The VD which is the target protein of the present invention
Separation / purification of the R isoform protein may be carried out by using the separation / purification method used for ordinary proteins, and is not limited at all. For example, various kinds of chromatography, ultrafiltration, salt folding, dialysis, etc. can be appropriately selected and used in combination.
【００３１】ＶＤＲアイソフォームタンパク質の活性を
測定するには、例えば以下に記載する、ＣＡＴ（クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を
レポーター遺伝子として用いる遺伝子転写活性測定法で
ある一過性発現アッセイ（ＣＡＴアッセイ）を用いて評
価することができる。To measure the activity of the VDR isoform protein, for example, the transient expression assay (CAT), which is a method for measuring gene transcription activity using the CAT (chloramphenicol acetyltransferase) gene as a reporter gene, described below, is used. Assay).
【００３２】ＨｅＬａ細胞をダルベッコの改変イーグル
培地（フェノールレッド不含、５％デキストランコーテ
ィングチャコール処理をしたウシ胎児血清補充）中に維
持する。リン酸カルシウム法により全量２０μｇのＤＮ
Ａを用いて９ｃｍのペトリ皿で４０−５０％コンフルエ
ントの細胞に形質転換する。用いるＤＮＡはＣＡＴレポ
ータープラスミド２μｇとレセプター発現ベクター５０
０ｎｇを、さらに形質転換の効率によるバラツキを正規
化するための内部対照として用いるβ−ガラクトシダー
ゼ発現ベクターであるｐＣＨ１００（Pharmacia）３μ
ｇも加え、ＤＮＡの全量を合わせるためのキャリアとし
てＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ Ｍ１３＋（Stratagene）を使
用する。HeLa cells are maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (phenol red-free, supplemented with 5% dextran-coated charcoal-treated fetal calf serum). 20 μg of total DN by the calcium phosphate method
Using A, transform 9-40 cm Petri dishes into 40-50% confluent cells. The DNA used was CAT reporter plasmid 2 μg and receptor expression vector 50.
0 ng is a β-galactosidase expression vector, pCH100 (Pharmacia) 3μ, which is used as an internal control to further normalize the variation due to the efficiency of transformation.
g is also added and Bluescript M13 + (Stratagene) is used as a carrier to combine the total amount of DNA.
【００３３】形質転換の１時間後および各培地交換時
に、培地中にリガンド（オールトランスレチノイン酸１
μＭあるいは甲状腺ホルモン０．１μＭあるいはビタミ
ンＤ０．１μＭ）を加える。リン酸カルシウム沈殿化Ｄ
ＮＡとともに２０時間インキュベートした後、細胞を新
しい培地で洗浄し、さらに２０〜２４時間インキュベー
トする。凍結乾燥により細胞抽出物を調製し、文献（Sa
saki et al., Biochemistry 34:370-377, 1995）記載の
方法でβ−ガラクトシダーゼ活性を正規化した後、ＣＡ
Ｔをアッセイする。One hour after the transformation and at the time of changing each medium, the ligand (all-trans-retinoic acid 1
μM or thyroid hormone 0.1 μM or vitamin D 0.1 μM) is added. Calcium phosphate precipitation D
After 20 hours incubation with NA, cells are washed with fresh medium and incubated for an additional 20-24 hours. The cell extract was prepared by freeze-drying and
saki et al., Biochemistry 34: 370-377, 1995) after normalizing β-galactosidase activity by the method described in CA
Assay T.
【００３４】本発明のＶＤＲアイソフォームタンパク質
を認識する抗体はポリクローナル抗体であっても、モノ
クローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の
作製にあたっては、常法（例えば、新生化学実験講座
１、タンパク質I、ｐ３８９〜３９７、１９９２参照）
に従い、抗原（ＶＤＲアイソフォームタンパク質）をウ
サギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、マウスなどの動物に免役
し、生体内に産生される抗体を採取することにより得る
ことができる。得られた抗体の力価は当業界で公知の方
法により測定できる。モノクローナル抗体の作製も常法
（例えば、Kohleret al., Nature 256:496, 1975; Kohl
er et al., Eur. J. Immunol. 6:511, 1976）に従って
行うことができる。すなわち、上述したように動物を免
疫して抗体分泌体細胞を得て、これを骨髄腫細胞系と融
合し、抗体を産生するハイブリドーマを選択することに
より行う。The antibody recognizing the VDR isoform protein of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. In preparing a polyclonal antibody, a conventional method (see, for example, Shinsei Chemistry Laboratory Course 1, Protein I, p389-397, 1992)
In accordance with the method described above, the antigen (VDR isoform protein) can be obtained by immunizing animals such as rabbits, rats, goats, sheep and mice and collecting the antibodies produced in vivo. The titer of the obtained antibody can be measured by a method known in the art. Monoclonal antibodies can also be prepared by standard methods (eg, Kohler et al., Nature 256: 496, 1975; Kohl
er et al., Eur. J. Immunol. 6: 511, 1976). That is, it is carried out by immunizing an animal as described above to obtain antibody secretor cells, fusing this with a myeloma cell line, and selecting a hybridoma that produces an antibody.
【００３５】また、このようなモノクローナル抗体およ
びポリクローナル抗体の結合性断片、例えば、Ｆａｂ、
Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ断片も本発明の抗体として使用で
きる。抗体断片は完全な抗体をパパインまたはペプシン
などで消化して常法により得ることができる。Further, binding fragments of such a monoclonal antibody and a polyclonal antibody such as Fab,
F (ab ′) 2 , Fv fragments can also be used as the antibody of the present invention. The antibody fragment can be obtained by a conventional method by digesting a complete antibody with papain or pepsin.
【００３６】本発明を以下において具体的に説明する。ＶＤＲアイソフォームタンパク質をコードする遺伝子の
単離 正規の（canonical）ラットＶＤＲ（ｒＶＤＲ０）のリ
ガンド結合ドメイン（Sasaki et al., Biochemistry 3
4:370-377, 1995）を用いて、ｒＶＤＲ０ ｃＤＮＡと
密接に関連する１０個の陽性クローンを単離した。次い
でｒＶＤＲ０タンパク質（Burmester et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 85:1005-1009, 1988）をコードす
るエキソンに対応するプライマー対を用いるポリメラー
ゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によってこれらのク
ローンを分析し、同じアイソフォーム（以下においてｒ
ＶＤＲ１という）をコードする２つのクローンを見いだ
した。The present invention will be specifically described below. Of the gene encoding the VDR isoform protein
The ligand-binding domain of isolated canonical rat VDR (rVDR0) (Sasaki et al., Biochemistry 3
4: 370-377, 1995) were used to isolate 10 positive clones closely related to the rVDR0 cDNA. Then rVDR0 protein (Burmester et al., Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 85: 1005-1009, 1988), these clones were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) using a primer pair corresponding to the exon encoding the same isoform (r
We found two clones encoding VDR1).
【００３７】ｒＶＤＲ０とｒＶＤＲ１の配列決定を行
い、ｒＶＤＲ１に特異的な２８５ヌクレオチドを同定し
た（図１）。ｒＶＤＲ１ではｒＶＤＲ０のリガンド結合
ドメインに１１３４ｂｐが挿入されていたが、ｒＶＤＲ
１のその他の配列はｒＶＤＲ０のオープンリーディング
フレームと同一であった（図１）。Sequencing of rVDR0 and rVDR1 was performed and 285 nucleotides specific to rVDR1 were identified (FIG. 1). In rVDR1, 1134 bp was inserted in the ligand binding domain of rVDR0.
The other sequences of 1 were identical to the open reading frame of rVDR0 (Fig. 1).
【００３８】ｒＶＤＲ遺伝子のゲノム構造と配列とを分
析することにより、この挿入された配列がエキソン８と
９の間にあるイントロンに由来すること（図２）、なら
びにこのエキソン−イントロンの間の配列がＣｈａｍｂ
ｏｎの一般則（イントロンの両側の５’側がＧＴ、３’
側がＡＧとなる）に合致し、したがってこのアイソフォ
ームが選択的スプライシングによる一次転写物により生
じたことを示唆する。遺伝子座のｒＶＤＲ１のエキソン
としてイントロン８を保持することは、遺伝子座の最も
下流領域に位置する比較的大きなエキソンを生じること
になる。ラットＶＤＲのこの遺伝子構造は、大きな最終
エキソンをもつこのレセプタースーパーファミリーの他
のメンバーの構造とよく似ている（Gronemeyer, Annu.
Rev. Genet. 25:89-123, 1991）。Analysis of the genomic structure and sequence of the rVDR gene revealed that the inserted sequence was derived from the intron between exons 8 and 9 (FIG. 2) and the sequence between this exon and intron. Is Chamb
on's general rule (GT's are 3'on both sides of the intron, 3 '
Side becomes AG), thus suggesting that this isoform was produced by a primary transcript by alternative splicing. Retaining intron 8 as the exon of rVDR1 at the locus will result in a relatively large exon located in the most downstream region of the locus. This genetic structure of rat VDR is very similar to that of other members of this receptor superfamily with a large terminal exon (Gronemeyer, Annu.
Rev. Genet. 25: 89-123, 1991).
【００３９】したがって、本発明のＶＤＲアイソフォー
ムタンパク質（ｒＶＤＲ１）をコードする遺伝子は配列
番号２に示すヌクレオチド配列、ならびに配列番号１に
示すアミノ酸配列をもつ。ｒＶＤＲ１の推定アミノ酸配
列はｒＶＤＲ０と比べて、Ｃ末端の８６アミノ酸を欠失
し、１９アミノ酸を余分にもつ。これは、エキソン８と
エキソン９の間に存在するイントロンの１１３４ｂｐに
位置するストップコドンによって翻訳が停止したためで
あると考えられる（図１および図２参照）。Therefore, the gene encoding the VDR isoform protein (rVDR1) of the present invention has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The deduced amino acid sequence of rVDR1 lacks the C-terminal 86 amino acids and has an extra 19 amino acids compared to rVDR0. This is probably because the stop codon located at 1134 bp of the intron existing between exon 8 and exon 9 stopped translation (see FIGS. 1 and 2).
【００４０】次いで、ｒＶＤＲ１のこのエキソンをノー
ザンブロットの特異的プローブとして用いてｒＶＤＲ１
転写物（Sasaki et al., Biochemistry 34:370-377, 19
95）の存在を検出した。その結果、この転写物はｒＶＤ
Ｒ０が発現している腎臓と腸で検出された（図３）。一
方、エキソン６と７の間にあるイントロン６の１０４２
ｂｐを含む非特異的プローブを用いると特異的転写物は
検出できなかった。特異的バンドをデンシトメーターで
分析したところ、ｒＶＤＲ１転写物の量はｒＶＤＲ０の
量の１／１５〜１／２０であった。また、各種組織由来
のポリ（Ａ）+ｍＲＮＡを逆転写酵素を用いてｃＤＮＡ
とした後、ＰＣＲで増幅し、細胞質ゾルのｍＲＮＡ分画
中のｒＶＤＲ１転写物を検出し、ｒＶＤＲ１転写物の存
在を確認した。したがって、ｒＶＤＲ１転写物は転写の
ための成熟ｍＲＮＡとして細胞質ゾル中に局在している
ことが示唆された。ｒＶＤＲ１の機能的役割 ヒトＶＤＲのＣ末端にあるリガンド結合ドメインの正確
な位置は４０３〜４２７アミノ酸残基（ｒＶＤＲ０では
３９９〜４２３アミノ酸）にマッピングされるという最
近の報告（Nakajima et al., Mol. Endocrinol., 8:159
-172, 1994）と合致して、インビトロ合成したｒＶＤＲ
１タンパク質はリガンド結合を示さなかった（図１
１）。This exon of rVDR1 was then used as a specific probe for Northern blots to rVDR1.
Transcript (Sasaki et al., Biochemistry 34: 370-377, 19
95) was detected. As a result, this transcript was rVD.
It was detected in the kidney and intestine where R0 was expressed (Fig. 3). On the other hand, 1042 of intron 6 between exons 6 and 7
No specific transcript could be detected using a non-specific probe containing bp. When the specific band was analyzed by a densitometer, the amount of rVDR1 transcript was 1/15 to 1/20 of the amount of rVDR0. In addition, poly (A) + mRNA derived from various tissues can be converted into cDNA using reverse transcriptase.
Then, the presence of the rVDR1 transcript was confirmed by detecting the rVDR1 transcript in the mRNA fraction of the cytosol by PCR amplification. Therefore, it was suggested that the rVDR1 transcript is localized in the cytosol as a mature mRNA for transcription. Functional role of rVDR1 A recent report that the exact position of the C-terminal ligand binding domain of human VDR maps to amino acid residues 403-427 (399-423 amino acids for rVDR0) (Nakajima et al., Mol. Endocrinol., 8: 159
-172, 1994) and in vitro synthesized rVDR
1 protein showed no ligand binding (Fig. 1
1).
【００４１】ＲＸＲとのヘテロダイマー形成に必要とさ
れる２つのドメインのうちの１つ（ｈｅｐｔａｄ９：ｒ
ＶＤＲ０では３９９〜４０７アミノ酸）はｒＶＤＲ１に
はなかったが、特異的ＤＮＡ結合に関与するもう一方の
領域（ｈｅｐｔａｄ４：ｒＶＤＲ０では３２１〜３２８
アミノ酸）はｒＶＤＲ１に存在していた。One of the two domains required for heterodimer formation with RXR (heptad9: r
In VDR0, 399-407 amino acids were absent in rVDR1, but in the other region involved in specific DNA binding (heptad4: rVDR0, 321-328).
Amino acids) were present in rVDR1.
【００４２】そこで、一過性発現アッセイ（ＣＡＴアッ
セイ）（Sasaki et al., Biochemistry 34:370-377, 19
95）を用いて、ｒＶＤＲ１の転写促進活性を評価した。
ｒＶＤＲ０、ｒＶＤＲ１およびラットＲＸＲαを発現す
るベクター、ならびにコンセンサスなビタミンＤレスポ
ンスエレメント（ＶＤＲＥ）を含むＣＡＴレポータープ
ラスミドを調製した。このコンセンサスなビタミンＤレ
スポンスエレメントは上述した３ｂｐのスペーサー（Ｄ
Ｒ３Ｔ）を介して２つのＡＧＴＴＣＡモチーフが直接連
結したものである。このモチーフはＡＧＧＴＣＡよりも
強いＶＤＲの結合モチーフであると言われている（Free
dman et al., Mol. Endcrinol., 8:265-273, 1994）。
その結果、ｒＶＤＲ１自体は転写促進活性を有していな
かった。しかし、ｒＶＤＲ０（０．５μｇ）とｒＶＤＲ
１（２μｇ）とをコトランスフェクションした場合に
は、試験したすべての細胞（以下の実施例では代表例と
してＨｅＬａ細胞について示す）において、ｒＶＤＲ０
によるリガンド誘導の転写促進活性を阻害した（図４参
照）。また、ｒＶＤＲ０の存在下（発現ベクター０．５
μｇ）にｒＶＤＲ１発現ベクターの添加量を増加する
と、ｒＶＤＲ１の阻害活性はより顕著になった（図５参
照）。ｒＶＤＲ０発現ベクターを５μｇ添加したときに
もリガンド誘導の転写促進活性は抑制されなかったので
（図５）、この阻害作用は限られた核内ファクターに対
する２つのアイソフォーム間の単なる拮抗（Tasset et
al., Cell 62:1177-1187, 1990）によるものではない。
さらに、本明細書ではデータを記載していないが、ＲＸ
Ｒの３つのサブタイプ（α、β、γ）間では明瞭な差は
観察されなかった。ｒＶＤＲ１のドミナントネガティブ活性は配列特異的で
ある ｒＶＤＲ０に対するｒＶＤＲ１の阻害程度は配列特異的
であり、これはヒト・オステオカルシンＶＤＲＥよりも
マウス・オステオポンチンについての方が顕著であっ
た。これはＶＤＲホモダイマーがマウス・オステオポン
チンの標的ＶＤＲＥとの結合をより好むためであるとさ
れている（Cheskis et al., Molec. Cell.Biol. 14:332
9-3338, 1994）。ＡＧＴＴＣＡモチーフの方がＡＧＧＴ
ＣＡモチーフよりもＶＤＲの結合コアとして優れている
という考えは、ＤＲ３ＴがＤＲ３ＧよりもＶＤＲＥとし
てより活性であるという事実からも支持される（図７参
照）。Therefore, a transient expression assay (CAT assay) (Sasaki et al., Biochemistry 34: 370-377, 19)
95) was used to evaluate the transcription promoting activity of rVDR1.
A CAT reporter plasmid containing rVDR0, rVDR1 and rat RXRα expressing vectors and a consensus Vitamin D response element (VDRE) was prepared. This consensus Vitamin D response element is a 3 bp spacer (D
Two AGTTCA motifs are directly linked via R3T). This motif is said to be a stronger VDR binding motif than AGGTCA (Free.
dman et al., Mol. Endcrinol., 8: 265-273, 1994).
As a result, rVDR1 itself did not have a transcription promoting activity. However, rVDR0 (0.5 μg) and rVDR
When co-transfected with 1 (2 μg), rVDR0 was observed in all cells tested (HeLa cells are shown as a representative in the examples below).
It inhibited the ligand-induced transcription-promoting activity (see FIG. 4). In the presence of rVDR0 (expression vector 0.5
μg), the inhibitory activity of rVDR1 became more prominent (see FIG. 5). This inhibition was a simple antagonism between the two isoforms against limited nuclear factors (Tasset et al.), as addition of 5 μg of rVDR0 expression vector did not suppress the ligand-induced transcription promoting activity (FIG. 5).
al., Cell 62: 1177-1187, 1990).
Further, although no data is given herein, RX
No clear differences were observed between the three R subtypes (α, β, γ). The dominant negative activity of rVDR1 is sequence-specific
The degree of inhibition of rVDR1 on certain rVDR0s was sequence-specific, which was more pronounced for mouse osteopontin than for human osteocalcin VDRE. This is alleged to be because the VDR homodimer prefers to bind mouse osteopontin to the target VDRE (Cheskis et al., Molec. Cell. Biol. 14: 332).
9-3338, 1994). The AGTTCA motif is more AGGT
The notion that DR3T is more active as a VDRE than DR3G is supported by the idea that it is superior to the CA motif as a binding core for VDR (see Figure 7).
【００４３】一方、ｒＶＤＲ１は同種のレセプターが存
在するときには、レチノイン酸のコンセンサスレスポン
スエレメント（ＤＲ５）や甲状腺ホルモンのコンセンサ
スレスポンスエレメント（ＤＲ４）のリガンド誘導の転
写促進活性を抑制しなかった（図６参照）。同種のレス
ポンスエレメントが存在するときに、ｒＶＤＲ１はその
他のレチノイン酸レスポンスエレメント（ＤＲ１および
ＤＲ２）やエストロゲンレスポンスエレメント（コンセ
ンサスＥＲＥ）に明瞭な効果を及ぼさなかった。したが
って、これらの結果はｒＶＤＲ１アイソフォームがｒＶ
ＤＲ０に対するドミナントネガティブレセプターとして
作用することを示唆する。ｒＶＤＲ１はホモダイマーとしてＶＤＲＥと結合する
が、ＲＸＲとはヘテロダイマー複合体を形成しない ｒＶＤＲ１のドミナントネガティブ活性についての分子
メカニズムを検討するため、コンセンサスＶＤＲＥ（Ｄ
Ｒ３Ｔ）との結合活性を試験し、ｒＶＤＲ０の結合活性
と比較した。On the other hand, rVDR1 did not suppress the ligand-induced transcription-promoting activity of the retinoic acid consensus response element (DR5) and the thyroid hormone consensus response element (DR4) in the presence of the same type of receptor (see FIG. 6). ). RVDR1 had no clear effect on the other retinoic acid response elements (DR1 and DR2) and estrogen response elements (consensus ERE) when the same type of response element was present. Therefore, these results indicate that the rVDR1 isoform is rV
It is suggested that it acts as a dominant negative receptor for DR0. rVDR1 binds to VDRE as a homodimer
However, in order to investigate the molecular mechanism of the dominant negative activity of rVDR1 that does not form a heterodimer complex with RXR , the consensus VDRE (D
The binding activity with R3T) was tested and compared with that of rVDR0.
【００４４】このため、遺伝子組換え法によりｒＶＤＲ
０タンパク質とｒＶＤＲ１タンパク質とを生産した。ｒ
ＶＤＲ０およびｒＶＤＲ１のｃＤＮＡのオープンリーデ
ィングフレームからは、それぞれ４８ＫＤａおよび４０
ＫＤａのタンパク質であることを予測された。精製した
ｒＶＤＲ０およびｒＶＤＲ１タンパク質はＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル上で予測された分子量の位置に移動した（図
８）。For this reason, rVDR was
0 protein and rVDR1 protein were produced. r
From the open reading frames of the VDR0 and rVDR1 cDNAs, 48 KDa and 40 respectively.
It was predicted to be a KDa protein. The purified rVDR0 and rVDR1 proteins were SDS-PA.
It migrated to the position of the expected molecular weight on the GE gel (Fig. 8).
【００４５】ＤＲ３Ｔとの結合試験の結果、精製組換え
ｒＶＤＲ０タンパク質は、文献（Freedman et al., Mo
l. Endocrinol. 8:265-273, 1994）に記載するように、
ＲＸＲがなくてもホモダイマーとしてＤＲ３Ｔと結合し
た（図９）。ｒＶＤＲ１ホモダイマーもこれと同程度に
ＤＲ３Ｔと結合した。次いで、マウスＲＸＲαをｒＶＤ
Ｒ０に加えると、ヘテロダイマー形成によってＤＮＡ結
合が顕著に増加し、ＲＸＲαに対する特異的モノクロー
ナル抗体がこのＤＮＡ−ヘテロダイマーを認識し結合す
ることにより、電気泳動のバンドがシフトした。これに
よって複合体中にＲＸＲが存在することが確認された。
しかしながら、ｒＶＤＲ１はｒＲＸＲαとヘテロダイマ
ーを形成することができず、これはヒトＶＤＲ（ｈＶＤ
Ｒ）のＣ末端をもたない突然変異体（Nakajima et al.,
Mol. Endocrinol. 8:159-172, 1994）と同様に、ヘテ
ロダイマー形成に必要なＣ末端ドメインをもたないため
であると思われる。As a result of the binding test with DR3T, the purified recombinant rVDR0 protein was found to be in the literature (Freedman et al., Mo.
l. Endocrinol. 8: 265-273, 1994).
It bound DR3T as a homodimer even without RXR (Fig. 9). The rVDR1 homodimer also bound DR3T to a similar extent. Then, the mouse RXRα was rVD
When added to R0, DNA binding was markedly increased by heterodimer formation, and a specific monoclonal antibody against RXRα recognized and bound this DNA-heterodimer, and the electrophoretic band was shifted. This confirmed the presence of RXR in the complex.
However, rVDR1 was unable to form a heterodimer with rRXRα, which was associated with human VDR (hVD
R) without a C-terminus (Nakajima et al.,
Mol. Endocrinol. 8: 159-172, 1994), which seems to have no C-terminal domain required for heterodimer formation.
【００４６】ｒＶＤＲ１は、コンセンサス甲状腺レスポ
ンスエレメント（ＤＲ４）およびレチノイン酸レスポン
スエレメント（ＤＲ５）とは特異的結合をせず（図１
０）、これは標的エンハンサーエレメントに対するｒＶ
ＤＲ１の特異性がｒＶＤＲ０と同じであることを示唆す
る。RVDR1 does not specifically bind to the consensus thyroid response element (DR4) and retinoic acid response element (DR5) (FIG. 1).
0), which is the rV to the target enhancer element
It suggests that the specificity of DR1 is the same as rVDR0.
【００４７】ＶＤＲでは、ＲＡＲ、ＲＸＲやＴＲと同様
に、ＤＮＡ結合ドメイン間に形成されるダイマー境界面
がその同種のレスポンスエレメントとのレセプターダイ
マーの結合認識を特定するという従来の観察（例えば、
Rastinejad et al., Nature375:203-211, 1995）と今回
の結果はよく一致する。In VDR, as in RAR, RXR and TR, the conventional observation that the dimer interface formed between DNA binding domains specifies binding recognition of the receptor dimer with its cognate response element (eg,
This result is in good agreement with Rastinejad et al., Nature 375: 203-211, 1995).
【００４８】転写促進活性アッセイの結果をまとめる
と、ｒＶＤＲ１が、ホモダイマーとして標的ＶＤＲＥ
（ビタミンＤレスポンスエレメント）と競合的に結合す
ることによって、ビタミンＤシグナル伝達経路において
ドミナントネガティブレセプターとして作用することを
示している。In summary, the results of the transcription promoting activity assay show that rVDR1 is the target VDRE as a homodimer.
It is shown that it acts as a dominant negative receptor in the vitamin D signal transduction pathway by competitively binding with (vitamin D response element).
【００４９】本発明で得られた新規ラットＶＤＲアイソ
フォーム（ｒＶＤＲ１）は選択的スプライシングによっ
て生じた一次ｒＶＤＲ転写物であるが、ｒＶＤＲ１はｒ
ＶＤＲ０ではイントロン８に存在する余分のエキソンを
もつ。この新しいエキソン（ｒＶＤＲ０中のイントロン
８）のストップコドンはＣ末端にあるリガンド結合ドメ
イン（８６アミノ酸）の一部を失わせるが、１９アミノ
酸を付加する。ヒトＶＤＲアイソフォームの単離 既知のヒトＶＤＲイントロン８の配列（ＷＯ９４−０３
６３３号）よりイントロン８を特異的に増幅するプライ
マーをデザインし、ヒトゲノムＤＮＡよりイントロン８
を増幅した。このイントロン８をランダムプライマーに
より32Ｐ−ｄＣＴＰを取り込ませたプローブとして用
い、ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（Clontech社）を
スクリーニングし、ヒトＶＤＲイントロン７、エキソン
８、イントロン８を含むｃＤＮＡ断片を得た。ヒトの場
合には、アミノ酸への翻訳の際にイントロン７全長のフ
レームが合ってエキソン８と連結するためにラットの場
合と異なり、イントロン７も保持したアイソフォームｃ
ＤＮＡの断片をクローニングすることができた。The novel rat VDR isoform obtained according to the present invention (rVDR1) is a primary rVDR transcript produced by alternative splicing.
VDR0 has an extra exon present in intron 8. The stop codon of this new exon (intron 8 in rVDR0) causes a loss of part of the C-terminal ligand binding domain (86 amino acids), but adds 19 amino acids. Isolation of Human VDR Isoforms Known Human VDR Intron 8 Sequence (WO94-03
633), a primer for specifically amplifying intron 8 was designed, and intron 8 was isolated from human genomic DNA.
Was amplified. This intron 8 was used as a probe incorporating 32 P-dCTP with a random primer, and a human leukocyte cDNA library (Clontech) was screened to obtain a cDNA fragment containing human VDR intron 7, exon 8, and intron 8. In the case of human, since the frame of full length intron 7 is aligned and linked to exon 8 upon translation into amino acid, unlike in the case of rat, isoform c which also retains intron 7
It was possible to clone a fragment of DNA.
【００５０】得られたｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
を決定し、配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する
ことを確認した。The nucleotide sequence of the obtained cDNA fragment was determined and confirmed to have the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3.
【００５１】ヒトの場合、イントロン７も保持したクロ
ーンが得られたことから、他のアイソフォーム（例え
ば、イントロン７のみをもつアイソフォーム、イントロ
ン７と８をもつアイソフォーム、イントロン８のみをも
つアイソフォームなど）の存在が示唆される。ＶＤＲアイソフォームの機能とその利用 構造と機能の類似性から、ＶＤＲはＲＡＲ、ＲＸＲおよ
びＴＲとともに核内レセプターフーパーファミリーの中
でサブファミリーを形成する。しかしながら、ＲＡＲ、
ＲＸＲやＴＲのアイソフォームタンパク質は選択的スプ
ライシングおよび／または異なるプロモーターの使用に
よって組合わされる種々のエキソンからなっているの
で、ＶＤＲはこのサブファミリー中では特異なものであ
るといえる。いくつかの遺伝子では、イントロンをエキ
ソンとして保持すると機能的に異なるアイソフォームタ
ンパク質を生じることが既に知られている（Nakamura e
t al., Science 257:1138-1142, 1992）が、核内レセプ
ター遺伝子スーパーファミリーのレセプターアイソフォ
ームとしてはこれが最初の例である。このために、ＲＡ
Ｒ、ＲＸＲやＴＲとは異なり、ＶＤＲアイソフォームは
そのｃＤＮＡクローニングがなされたにも拘わらず、そ
の後も長く発見されなかったともの思われる。In the case of human, a clone was obtained which also retained intron 7, and therefore, other isoforms (for example, an isoform having only intron 7, an isoform having introns 7 and 8 and an isoform having only intron 8) were obtained. Form) is suggested. Due to the similarity of the function of the VDR isoform and its utilization structure and function, VDR forms a subfamily within the nuclear receptor Hooper family with RAR, RXR and TR. However, RAR,
The RXR and TR isoform proteins are composed of different exons that are combined by alternative splicing and / or the use of different promoters, which makes VDR unique in this subfamily. It is already known that, for some genes, retaining introns as exons results in functionally different isoform proteins (Nakamura e
al., Science 257: 1138-1142, 1992) is the first example of a receptor isoform of the nuclear receptor gene superfamily. For this reason, RA
Unlike R, RXR, and TR, it seems that the VDR isoform has not been discovered for a long time after that, despite its cDNA cloning.
【００５２】本発明のＶＤＲアイソフォームタンパク質
はビタミンＤシグナル伝達経路においてドミナントネガ
ティブレセプターとして作用する。最近の報告（Morris
on et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6665-6
669, 1994）によると、ヒトＶＤＲ遺伝子における対立
遺伝子の変化が血中オステオカルシンの濃度と骨密度に
密接に関連する。骨密度は骨粗しょう症による骨折の危
険性を予測する基準となりうるものである。この報告に
よると、骨密度を予測するヒトＶＤＲ遺伝子の対立遺伝
子変化はイントロン８に位置するという。したがって、
本発明において得られたｒＶＤＲ１がラットＶＤＲ遺伝
子のイントロン８を保持することによって生じたもので
あることは極めて興味深い。本発明のＶＤＲアイソフォ
ームタンパク質を用いることによりビタミンＤシグナル
伝達経路の調節メカニズムを解明し、また骨密度の改善
などに使用することが期待できる。The VDR isoform protein of the present invention acts as a dominant negative receptor in the vitamin D signaling pathway. Recent Report (Morris
on et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6665-6
669, 1994), allelic changes in the human VDR gene are closely associated with blood osteocalcin concentration and bone density. Bone density can be a standard for predicting the risk of fracture due to osteoporosis. According to this report, an allelic change in the human VDR gene that predicts bone density is located in intron 8. Therefore,
It is extremely interesting that the rVDR1 obtained in the present invention is generated by retaining intron 8 of rat VDR gene. By using the VDR isoform protein of the present invention, the regulation mechanism of the vitamin D signal transduction pathway is elucidated, and it can be expected to be used for improving bone density and the like.
【００５３】また、本発明のＶＤＲアイソフォームの発
現量が種々の疾患と関係していると考えられる。疾患と
しては、骨粗しょう症、骨折、二次性甲状腺機能亢進
症、免疫疾患、皮膚疾患などＶＤＲが関係していると考
えられるすべての疾患において本発明のアイソフォーム
の発現の大小が発病と関連のある可能性がある。したが
って、本発明のＶＤＲアイソフォームの単離、性状決定
はこれらの疾患の解明、治療に大きな意味を有する。Further, it is considered that the expression level of the VDR isoform of the present invention is related to various diseases. As for diseases, the magnitude of the expression of the isoform of the present invention is related to the onset in all diseases considered to be related to VDR, such as osteoporosis, bone fracture, secondary hyperthyroidism, immune disease, and skin disease. There is a possibility. Therefore, the isolation and characterization of the VDR isoform of the present invention has great significance in elucidating and treating these diseases.
【００５４】本発明を以下の実施例によってさらに詳し
く説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。The present invention will be described in more detail by the following examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
【００５５】[0055]
実施例１：ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのクローニングｃＤＮＡのクローニング ｒＶＤＲ０のリガンド結合ドメインを含むＸｈｏＩ−Ｐ
ｓｔＩ制限酵素断片を放射性標識し、ラット腎臓ｃＤＮ
Ａライブラリー（Clontech）をスクリーニングするプロ
ーブとして用いた。ハイブリダイゼーション混合物に
は、５０％ホルムアミド、１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶
液、５ｘＳＳＰＥ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮ
Ａおよび１０6ｃｐｍの32Ｐ−標識プローブＤＮＡを含
んでいた。ニトロセルロース膜を４２℃、１６時間ハイ
ブリダイズさせ、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５
℃、３０分、２回洗浄した。膜を増感スクリーンを用い
て−８０℃で１６時間露光した。Example 1: Cloning of cDNA and genomic DNA Cloning of cDNA XhoI-P containing the ligand binding domain of rVDR0
Radiolabeling of the stI restriction enzyme fragment was performed, and rat kidney cDNA was labeled.
The A library (Clontech) was used as a probe to screen. The hybridization mixture contained 50% formamide, 1 × Denhardt's solution, 5 × SSPE, 100 μg / ml denatured salmon sperm DN.
A and 10 6 cpm of 32 P-labeled probe DNA. The nitrocellulose membrane was hybridized at 42 ° C. for 16 hours and then 55 ° in 2 × SSC, 0.1% SDS.
It was washed twice at 30 ° C. for 30 minutes. The film was exposed for 16 hours at -80 ° C using an intensifying screen.
【００５６】ｒＶＤＲ０タンパク質（Burmester et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1005-1009, 198
8）をコードするエキソンに対応するプライマーを用い
るポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によっ
てこれらのクローンを分析し、１０6個のプラークか
ら、１０個の陽性クローンを選択した。この中から同じ
アイソフォームであるｒＶＤＲ１をコードする２個のク
ローンをさらに選択した。すなわち、ヌクレオチド配列
の決定を行ったところ、１０個の陽性クローンのうち、
８個がｒＶＤＲ０であり、２個がｒＶＤＲ１であること
が判明した。ゲノムＤＮＡのクローニング ｒＶＤＲ１ ｃＤＮＡのＳｍａＩ−ＫｐｎＩ断片をプロ
ーブとして用いて、ラットゲノムライブラリー（Clonte
ch）由来のＢａｍＨＩ部位をもつ約２０ｋｂのゲノム断
片をクローニングした。イントロン８を含むＰｓｔＩ部
位をもつ３．５ｋｂのＤＮＡ断片をサブクローニング
し、配列決定した。RVDR0 protein (Burmester et a
L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1005-1009, 198
These clones were analyzed by polymerase chain reaction (PCR) using primers corresponding to the exon encoding 8) and 10 positive clones were selected from 10 6 plaques. From this, two clones encoding the same isoform, rVDR1, were further selected. That is, when the nucleotide sequence was determined, out of 10 positive clones,
It was found that eight were rVDR0 and two were rVDR1. Cloning of Genomic DNA Using the SmaI-KpnI fragment of rVDR1 cDNA as a probe, a rat genomic library (Clonte
A genomic fragment of about 20 kb having a BamHI site derived from ch) was cloned. A 3.5 kb DNA fragment containing the PstI site containing intron 8 was subcloned and sequenced.
【００５７】得られたｒＶＤＲ１のヌクレオチド配列を
配列番号２に、推定アミノ酸配列を配列番号１に示す。
また、ｒＶＤＲ０と比較した配列を図１に、ＶＤＲゲノ
ムの関連領域と選択的スプライシングによって生じるｒ
ＶＤＲ１のマッピングをｒＶＤＲ０と比較して図２に示
す。 実施例２：ノーザンブロット分析 ｒＶＤＲ０およびｒＶＤＲ１転写物の発現を、ラット腸
および腎臓由来のポリＡ（+）ｍＲＮＡ３μｇを用い
て、ノーザンブロット分析により試験した。プローブと
してｒＶＤＲ１のエキソン８を用いた。得られた結果を
図３に示す。ｒＶＤＲ１転写物はｒＶＤＲ０が発現して
いる腸と腎臓で発現していた。ｒＶＤＲ転写物の相対量
は、特異的バンドをデンシトメーターでスキャニングし
て計算した。３つ以上の試料の平均を求めたところ、ｒ
ＶＤＲ１転写物の量はｒＶＤＲ０の量の１／１５〜１／
２０であった。 実施例３：プラスミドの構築 ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位をもつ合成オリ
ゴヌクレオチドをプラスミドｐＧＣＡＴ（Kato et al.,
Cell 68:731-742, 1992）の対応する制限部位に挿入し
てＣＡＴレポーター遺伝子を構築した。ＣＡＴレポータ
ー遺伝子およびゲルシフトアッセイでプローブとして用
いたオリゴヌクレオチド配列は以下の通りである： DR3G： 5'-AGCTTCAGGTCAGGAAGGTCAGT-3'; DR3T： 5'-AGCTTCAGTTCGGAAGTTCAGT-3'; DR4： 5'-AGCTTCAGGTCACGGAAGGTCAGT-3'; DR5： 5'-AGCTTCAGGTCACCGGAAGGTCAGT-3'; ヒトオステオカルシンＶＤＲＥ（ＯＣ）： 5'-AGCTTGCTCGGGTAGGGGTGACTCACCGGGTGAACGGGGGCATCTCG
ACTCGT-3' マウスオステオポンチンＶＤＲＥ（ＯＰＮ）： 5'-AGCTTGCTCGGGTAGGGTTCACGAGGTTCACTCGACTCGT-3' また、ｒＶＤＲ０のＳａｃＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＰＣ
Ｒで増幅したｒＶＤＲ１断片（図１中の９１１〜１０７
１ｂｐ）で置換することによりｒＶＤＲ１発現ベクター
を構築した。 実施例４：組換えＶＤＲタンパク質の発現と精製 ｒＶＤＲ０およびｒＶＤＲ１をコードするｃＤＮＡを、
ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いるＰＣＲに
より増幅し、プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ（Pharmacia）
の対応する部位に挿入した。これらのベクターを用いて
大腸菌（ＤＨ５α）を形質転換し、ＩＰＴＧ（０．１ｍ
Ｍ）で誘導した。The nucleotide sequence of the obtained rVDR1 is shown in SEQ ID NO: 2, and the deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
The sequence compared to rVDR0 is also shown in FIG. 1 with the associated regions of the VDR genome and r generated by alternative splicing.
The mapping of VDR1 is shown in FIG. 2 in comparison with rVDR0. Example 2: Northern Blot Analysis Expression of rVDR0 and rVDR1 transcripts was examined by Northern blot analysis using 3 μg of poly A ( + ) mRNA from rat intestine and kidney. Exon 8 of rVDR1 was used as a probe. FIG. 3 shows the obtained results. The rVDR1 transcript was expressed in the intestine and kidney where rVDR0 was expressed. Relative amounts of rVDR transcripts were calculated by scanning specific bands with a densitometer. When the average of three or more samples was calculated, r
The amount of VDR1 transcript is 1/15 to 1 / the amount of rVDR0
20. Example 3: Construction of plasmids Synthetic oligonucleotides with HindIII and XbaI restriction sites were added to plasmid pGCAT (Kato et al.,
Cell 68: 731-742, 1992) was inserted into the corresponding restriction sites to construct the CAT reporter gene. The CAT reporter gene and the oligonucleotide sequences used as probes in the gel shift assay are as follows: DR3G: 5'-AGCTTCAGGTCAGGAAGGTCAGT-3 '; DR3T: 5'-AGCTTCAGTTCGGAAGTTCAGT-3'; DR4: 5'-AGCTTCAGGTCACGGAAGGTCAGT-3 '. DR5: 5'-AGCTTCAGGTCACCGGAAGGTCAGT-3 '; Human osteocalcin VDRE (OC): 5'-AGCTTGCTCGGGTAGGGGTGACTCACCGGGTGAACGGGGGCATCTCG
ACTCGT-3 'Mouse osteopontin VDRE (OPN): 5'-AGCTTGCTCGGGTAGGGTTCACGAGGTTCACTCGACTCGT-3' In addition, the SacI-BamHI fragment of rVDR0 was used as a PC.
RVDR1 fragment amplified by R (911 to 107 in FIG. 1)
The rVDR1 expression vector was constructed by substituting 1 bp). Example 4: Expression and purification of recombinant VDR protein cDNAs encoding rVDR0 and rVDR1 were
Amplified by PCR using BamHI and EcoRI restriction sites, plasmid pGEX-2T (Pharmacia)
Was inserted into the corresponding site. E. coli (DH5α) was transformed with these vectors, and IPTG (0.1 m
M).
【００５８】得られるＧＳＴ融合タンパク質をグルタチ
オン・セファロース４Ｂで精製した。各ＧＳＴ融合タン
パク質５００μｇをトロンビン（５Ｕ）で消化した後、
グルタチオン・セファロースに通してトロンビンとＧＳ
Ｔを除去した。フロースルー分画をさらに、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロールを含む５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平
衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけた。これ
らのタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥで９５％以上
であった。 実施例５：ＣＡＴアッセイによるｒＶＤＲ１の作用 ｒＶＤＲ０に対するｒＶＤＲ１のドミナントネガティブ
活性を試験した。The resulting GST fusion protein was purified on Glutathione Sepharose 4B. After digesting 500 μg of each GST fusion protein with thrombin (5 U),
Thrombin and GS through glutathione sepharose
T was removed. The flow-through fraction was further added to 1M Na
Cl containing Cl, 1 mM DTT, 10% glycerol 50
It was applied to a Sephadex G200 column equilibrated with mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). The purity of these proteins was 95% or more by SDS-PAGE. Example 5: Effect of rVDR1 by CAT assay The dominant negative activity of rVDR1 on rVDR0 was tested.
【００５９】３ｂｐ（ＤＲ３Ｔ）のスペーサーを介して
２つの５’−ＡＧＴＴＣＡモチーフを含むＣＡＴレポー
タープラスミド、ならびにマウスＲＸＲα（０．５μ
ｇ）、ｒＶＤＲ０（０．５μｇ）およびｒＶＤＲ１（２
μｇ）を発現するベクターでＨｅＬａ細胞を形質転換し
た。形質転換した細胞を１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3（１０
ｎＭ）の存在下（＋）または不在下（−）に４４時間維
持し、ｐＣＨ１１０内部対照ベクターによって発現する
β−ガラクトシダーゼ活性によってＣＡＴ活性を正規化
し、少なくとも３つの独立した試験から得られる平均値
±標準偏差で示した。得られた結果を図４に示す。A CAT reporter plasmid containing two 5'-AGTTCA motifs via a 3 bp (DR3T) spacer, as well as mouse RXRα (0.5 μm).
g), rVDR0 (0.5 μg) and rVDR1 (2
HeLa cells were transformed with a vector expressing (μg). The transformed cells were treated with 1,25- (OH) 2 D 3 (10
nM) was maintained in the presence (+) or absence (−) for 44 hours, CAT activity was normalized by β-galactosidase activity expressed by the pCH110 internal control vector, and the mean value obtained from at least three independent tests ± The standard deviation is shown. FIG. 4 shows the obtained results.
【００６０】図から明らかなように、ｒＶＤＲ１自体は
転写促進活性を有していなかった。しかし、ｒＶＤＲ０
とｒＶＤＲ１とをコトランスフェクションした場合に
は、ＨｅＬａ細胞において、ｒＶＤＲ０によるリガンド
誘導の転写促進活性を阻害した。 実施例６：ｒＶＤＲ１の用量依存的活性 細胞をｒＶＤＲ０発現ベクター０．５μｇ、ならびに
１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3（１０ｎＭ）の存在下に、図５
に示す量のＶＤＲ発現ベクター（ｒＶＤＲ０またはｒＶ
ＤＲ１）で形質転換した。ＣＡＴ活性は実施例５と同様
の方法で計算した。図５から明らかなように、ｒＶＤＲ
０の存在下にｒＶＤＲ１発現ベクターの添加量を増加す
ると、ｒＶＤＲ１の阻害活性はより顕著になった。ｒＶ
ＤＲ０発現ベクターを５μｇ添加したときにもリガンド
誘導の転写促進活性は抑制されなかった。 実施例７：甲状腺ホルモンおよびレチノイン酸シグナル
伝達経路に及ぼすｒＶＤＲ１の効果 ４ｂｐ（ＤＲ４：コンセンサス甲状腺ホルモンレスポン
スエレメント）または５ｂｐ（ＤＲ５：コンセンサスレ
チノイン酸レスポンスエレメント）のスペーサーを介し
て２つの５’−ＡＧＴＴＣＡモチーフを含むＣＡＴレポ
ータープラスミド、ならびにマウスＲＸＲαおよびニワ
トリＴＲα（ＤＲ４用）あるいはＲＸＲαおよびマウス
ＲＡＲα（ＤＲ５用）を発現するベクターで、同種のリ
ガンド［１０ｎＭ甲状腺ホルモン（Ｔ3）、１μＭオー
ルトランスレチノイン酸］の存在下または不在下に、細
胞を形質転換した。ｒＶＤＲ１発現ベクター（２μｇ）
でコトランスフェクションすることによりｒＶＤＲ１の
効果を試験した。ＣＡＴ活性は実施例５と同様の方法で
計算した。As is clear from the figure, rVDR1 itself had no transcription promoting activity. However, rVDR0
When cotransfected with rVDR1, it inhibited the ligand-induced transcription promoting activity by rVDR0 in HeLa cells. Example 6: Dose-dependent activity of rVDR1 Cells were expressed in the presence of 0.5 μg of rVDR0 expression vector and 1,25- (OH) 2 D 3 (10 nM) in FIG.
VDR expression vector (rVDR0 or rV
It was transformed with DR1). The CAT activity was calculated by the same method as in Example 5. As is clear from FIG. 5, rVDR
When the addition amount of the rVDR1 expression vector was increased in the presence of 0, the inhibitory activity of rVDR1 became more remarkable. rV
The ligand-induced transcription promoting activity was not suppressed even when 5 μg of the DR0 expression vector was added. Example 7: Effect of rVDR1 on Thyroid Hormone and Retinoic Acid Signaling Pathways Two 5'-AGTTCA motifs via a 4 bp (DR4: consensus thyroid hormone response element) or 5 bp (DR5: consensus retinoic acid response element) spacer. And a vector expressing mouse RXRα and chicken TRα (for DR4) or RXRα and mouse RARα (for DR5) containing a homologous ligand [10 nM thyroid hormone (T 3 ), 1 μM all-trans retinoic acid]. Cells were transformed in the presence or absence. rVDR1 expression vector (2 μg)
The effect of rVDR1 was tested by co-transfection with. The CAT activity was calculated by the same method as in Example 5.
【００６１】得られた結果を図６に示す。ｒＶＤＲ１は
同種のレセプターが存在するときには、レチノイン酸の
コンセンサスレスポンスエレメント（ＤＲ５）や甲状腺
ホルモンのコンセンサスレスポンスエレメント（ＤＲ
４）のリガンド誘導の転写促進活性を抑制しないことが
判明した。 実施例８：ｒＶＤＲ０に対するｒＶＤＲ１の阻害活性の
配列特異性 ＤＲ３Ｇ、ＤＲ３Ｔ、ヒトオステオカルシンＶＤＲＥ
（ＯＣ）およびマウスオステオポンチンＶＤＲＥ（ＯＰ
Ｎ）を含むＣＡＴレポータープラスミド、ならびにＲＸ
ＲおよびＶＤＲ（ｒＶＤＲ０またはｒＶＤＲ１）の発現
ベクターを用いて、１，２５−（ＯＨ）2Ｄ3（１０ｎ
Ｍ）の存在下または不在下に、ＨｅＬａ細胞を形質転換
した。ＣＡＴ活性は実施例５と同様の方法で計算した。The obtained results are shown in FIG. rVDR1 is a consensus response element for retinoic acid (DR5) or a consensus response element for thyroid hormone (DR) when cognate receptors are present.
It was found that the ligand-induced transcription promoting activity of 4) was not suppressed. Example 8: Sequence specificity of the inhibitory activity of rVDR1 on rVDR0 DR3G, DR3T, human osteocalcin VDRE
(OC) and mouse osteopontin VDRE (OP
CAT reporter plasmid containing N), and RX
Using expression vectors for R and VDR (rVDR0 or rVDR1), 1,25- (OH) 2 D 3 (10n
HeLa cells were transformed in the presence or absence of M). The CAT activity was calculated by the same method as in Example 5.
【００６２】得られた結果を図７に示す。ｒＶＤＲ０に
対するｒＶＤＲ１の阻害程度は配列特異的であり、これ
はヒト・オステオカルシンＶＤＲＥよりもマウス・オス
テオポンチンについての方が顕著であった。また、ＤＲ
３ＴはＤＲ３ＧよりもＶＤＲＥとしてより活性であるこ
とが観察された。 実施例９：ｒＶＤＲ１のホモダイマーおよびヘテロダイ
マー形成ならびにそのＤＮＡ結合性 （Ａ）ｒＶＤＲ１の分子量 実施例４の方法により大腸菌中でｒＶＤＲ０およびｒＶ
ＤＲ１をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、グルタ
チオン・セファロース４Ｂで精製した後トロンビンで消
化した。消化した試料をセファデックスＧ−１００カラ
ムにかけてさらにｒＶＤＲ０とｒＶＤＲ１タンパク質を
精製した。ＧＳＴ融合タンパク質（図８中、ＧＳＴ−ｒ
ＶＤＲ０またはＧＳＴ−ｒＶＤＲ１として示す）および
精製ｒＶＤＲタンパク質（図８中、ｒＶＤＲ０またはｒ
ＶＤＲ１として示す）を５％ポリアクリルアミドーＳＤ
Ｓゲルで電気泳動を行い、分子量マーカーから分子量を
測定した。ｒＶＤＲ０およびｒＶＤＲ１のオープンリー
ディングフレームから予期されたそれぞれの分子量（ｒ
ＶＤＲ０では４８ＫＤａ；ｒＶＤＲ１では４０ＫＤａ）
の位置にバンドが観察された。 （Ｂ）ゲルシフトアッセイ 文献（Sasaki et al., Biochemistry 34:370-377, 199
5）記載の方法を用いて、電気泳動移動シフトアッセイ
（ＥＭＳＡ）および抗体スーパーシフトを行った。この
アッセイには以下の精製レセプターも使用した： ＲＡＲ：大腸菌中で生成したＡＢ領域を欠く部分精製マ
ウスＲＡＲα（ｍＲＡＲα△ＡＢ）； ＲＸＲ：大腸菌中で生成したＡＢ領域を欠く部分精製マ
ウスＲＸＲα（ｍＲＸＲα△ＡＢ）； ＴＲ：大腸菌中で生成した部分精製ニワトリＴＲα。The obtained results are shown in FIG. The degree of inhibition of rVDR1 on rVDR0 was sequence-specific, which was more pronounced for mouse osteopontin than for human osteocalcin VDRE. Also, DR
It was observed that 3T was more active as VDRE than DR3G. Example 9: Homodimer and heterodimer formation of rVDR1 and its DNA binding properties (A) Molecular weight of rVDR1 rVDR0 and rV in E. coli by the method of Example 4.
DR1 was expressed as a GST fusion protein, purified with glutathione-Sepharose 4B and digested with thrombin. The digested sample was applied to a Sephadex G-100 column to further purify the rVDR0 and rVDR1 proteins. GST fusion protein (in FIG. 8, GST-r
VDR0 or GST-rVDR1) and purified rVDR protein (in FIG. 8, rVDR0 or rVDR0).
Shown as VDR1) 5% polyacrylamide-SD
Electrophoresis was performed on S gel, and the molecular weight was measured from the molecular weight marker. The respective molecular weights expected from the open reading frames of rVDR0 and rVDR1 (r
(48 KDa for VDR0; 40 KDa for rVDR1)
A band was observed at the position. (B) Gel shift assay literature (Sasaki et al., Biochemistry 34: 370-377, 199)
5) Electrophoretic migration shift assay (EMSA) and antibody supershift were performed using the method described. The following purified receptors were also used in this assay: RAR: partially purified mouse RARα (mRARαΔAB) lacking the AB region produced in E. coli; RXR: partially purified mouse RXRα (mRXRα lacking the AB region produced in E. coli. ΔAB); TR: partially purified chicken TRα produced in E. coli.
【００６３】抗体スーパーシフトにはモノクローナル抗
体４ＲＸ（ＲＸＲ用）を用いた。Monoclonal antibody 4RX (for RXR) was used for antibody supershift.
【００６４】レセプターおよび［32Ｐ］−５−末端標識
合成オリゴヌクレオチド（ＤＲ３Ｔ、ＤＲ３Ｇ、ＤＲ４
およびＤＲ５）を含む結合反応混合物、ならびにポリ
（ｄｌｄＣ）（Pharmacia, ２μｇ）を、結合バッファ
ー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍ
Ｍジチオスレイトール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ
ＫＣｌ、１０％グリセロール］中、２５℃で１５分イン
キュベートした。インキュベーション開始時に抗体を添
加した。文献（Sasaki et al., Biochemistry34:370-37
7, 1995）記載の方法により、得られた生成物を５％ポ
リアクリルアミドゲルに溶解した。Receptor and [ 32 P] -5-end labeled synthetic oligonucleotides (DR3T, DR3G, DR4
And DR5), and poly (dldC) (Pharmacia, 2 μg) in binding buffer [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 m.
M dithiothreitol, 1 mM EDTA, 100 mM
KCl, 10% glycerol] at 25 ° C. for 15 minutes. Antibody was added at the start of the incubation. Reference (Sasaki et al., Biochemistry 34: 370-37
7, 1995) and the product obtained was dissolved in a 5% polyacrylamide gel.
【００６５】ＤＲ３Ｔをプローブとして用い、図９に示
す種々の量の精製マウスＲＸＲα（ＲＸＲ）、精製ｒＶ
ＤＲ０およびｒＶＤＲ１でゲルシフトアッセイを行っ
た。得られた結果を図９に示す。モノクローナル抗体
（マウスＲＸＲα用の４ＲＸ）を用いるスーパーシフト
試験によってＤＲ３Ｔ−ＲＸＲ−ＶＤＲ複合体の存在が
確認された。図９中、レーン６のバンドは抗ＲＸＲ抗体
でスーパーシフトした複合体の位置を示す。これよりｒ
ＶＤＲ１ホモダイマーがコンセンサスＶＤＲＥ（ＤＲ３
Ｔ）と結合することが示された。Using DR3T as a probe, various amounts of purified mouse RXRα (RXR) and purified rV shown in FIG. 9 were obtained.
Gel shift assays were performed with DR0 and rVDR1. The results obtained are shown in FIG. The presence of the DR3T-RXR-VDR complex was confirmed by a supershift test using a monoclonal antibody (4RX for mouse RXRα). In FIG. 9, the band in lane 6 shows the position of the complex supershifted with the anti-RXR antibody. From this r
VDR1 homodimer is consensus VDRE (DR3
T) has been shown to bind.
【００６６】次に、ＤＲ４およびＤＲ５をプローブとし
て用い、図１０に示す種々の量の精製ｒＶＤＲ１、ニワ
トリＴＲα（ＴＲ）およびマウスＲＡＲα（ＲＡＲ）で
ゲルシフトアッセイを行った。得られた結果を図１０に
示す。ｒＶＤＲ１ホモダイマーはコンセンサス甲状腺ホ
ルモンレスポンスエレメントまたはレチノイン酸レスポ
ンスエレメント（ＤＲ４およびＤＲ５）と結合しなかっ
た。 実施例１０：ヒトＶＤＲアイソフォームの単離 ヒトゲノムＤＮＡよりＶＤＲイントロン８を特異的にＰ
ＣＲ法により増幅し、ランダムプライム法にて放射性標
識し、ヒト白血球ｃＤＮＡライブラリー（Clontech社）
をスクリーニングするプローブとした。ハイブリダイゼ
ーション混合液には５０％ホルムアミド、５ｘＤｅｎｈ
ａｒｄｔ’ｓ溶液、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、２０
０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび１０6ｃｐｍの
32Ｐ−標識プローブＤＮＡを含んでいた。ニトロセルロ
ース膜を４２℃、１６時間ハイブリダイズさせ、４ｘＳ
ＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回、２ｘＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ中で１回、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回
それぞれ室温１０分間洗浄した。膜を増感スクリーンを
用いて−８０℃で１６時間露光した。４ｘ１０6クロー
ンより約１．４ｋｂのインサートをもつ１個の陽性クロ
ーンを得た。Next, gel shift assay was performed using various amounts of purified rVDR1, chicken TRα (TR) and mouse RARα (RAR) shown in FIG. 10, using DR4 and DR5 as probes. FIG. 10 shows the obtained results. The rVDR1 homodimer did not bind the consensus thyroid hormone response element or the retinoic acid response element (DR4 and DR5). Example 10: Isolation of human VDR isoforms VDR intron 8 specific P from human genomic DNA
Amplified by CR method, radiolabeled by random prime method, human leukocyte cDNA library (Clontech)
Was used as a probe for screening. Hybridization mixture contains 50% formamide, 5x Denh
ardt's solution, 5xSSC, 0.1% SDS, 20
0 μg / ml denatured salmon sperm DNA and 10 6 cpm
It contained 32 P-labeled probe DNA. Hybridize nitrocellulose membrane at 42 ° C for 16 hours, 4xS
SC, 0.1% once in SDS, 2xSSC, 0.1%
The plate was washed once in SDS and once in 1 × SSC and 0.1% SDS at room temperature for 10 minutes. The film was exposed for 16 hours at -80 ° C using an intensifying screen. One positive clone having an insert of about 1.4 kb was obtained from 4 × 10 6 clones.
【００６７】得られたクローンのヌクレオチド配列を決
定し、配列番号３のヌクレオチド配列を得た。The nucleotide sequence of the obtained clone was determined to obtain the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
【００６８】配列番号：１ 配列の長さ：３５６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 MEATAASTSLPDPGDFDRNVPRICGVCGDRATGFHFNAMTCEGCKGFFRRSMKRKALFTC 60 PFNGDCRITKDNRRHCQACRLKRCVDIGMMKEFILTDEEVQRKREMIMKRKEEEALKDSL 120 RPKLSEEQQHIIAILLDAHHKTYDPTYADFRDFRPPVRMDGSTGSYSPRPTLSFSGNSSS 180 SSSDLYTTSLDMMEPSGFSNLDLNGEDSDDPSVTLDLSPLSMLPHLADLVSYSIQKVIGF 240 AKMIPGFRDLTSDDQIVLLKSSAIEVIMLRSNQSFTMDDMSWDCGSQDYKYDVTDVSKAG 300 HTLELIEPLIKFQVGLKKLNLHEEEHVLLMAICIVSPGTEPGREELRDLGHVGDCE 356[0068] SEQ ID NO: 1 Length of sequence: 356 SEQ type: amino acid Topology: linear sequence type: Peptide sequence MEATAASTSLPDPGDFDRNVPRICGVCGDRATGFHFNAMTCEGCKGFFRRSMKRKALFTC 60 PFNGDCRITKDNRRHCQACRLKRCVDIGMMKEFILTDEEVQRKREMIMKRKEEEALKDSL 120 RPKLSEEQQHIIAILLDAHHKTYDPTYADFRDFRPPVRMDGSTGSYSPRPTLSFSGNSSS 180 SSSDLYTTSLDMMEPSGFSNLDLNGEDSDDPSVTLDLSPLSMLPHLADLVSYSIQKVIGF 240 AKMIPGFRDLTSDDQIVLLKSSAIEVIMLRSNQSFTMDDMSWDCGSQDYKYDVTDVSKAG 300 HTLELIEPLIKFQVGLKKLNLHEEEHVLLMAICIVSPGTEPGREELRDLGHVGDCE 356
【００６９】配列番号：２ 配列の長さ：１０７１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATGGAGGCAA CAGCGGCCAG CACCTCCCTG CCCGACCCTG GTGACTTTGA CCGGAACGTG 60 CCCCGGATCT GTGGAGTGTG TGGAGACCGA GCCACAGGCT TCCACTTCAA TGCTATGACC 120 TGTGAAGGCT GCAAAGGTTT CTTCAGGCGG AGCATGAAGC GGAAGGCCCT GTTCACCTGT 180 CCCTTCAATG GAGATTGCCG CATCACCAAG GACAACCGGC GACACTGCCA GGCCTGCCGG 240 CTCAAACGCT GTGTGGACAT CGGCATGATG AAGGAGTTCA TCCTGACAGA TGAGGAGGTA 300 CAGCGTAAGA GGGAGATGAT AATGAAGAGA AAAGAGGAAG AGGCCTTGAA GGACAGTCTG 360 AGGCCCAAGC TATCTGAAGA ACAACAGCAC ATCATAGCCA TCCTGCTGGA CGCCCACCAC 420 AAGACCTATG ACCCCACCTA CGCTGACTTC AGGGACTTCC GGCCTCCAGT TCGTATGGAC 480 GGAAGTACAG GGAGCTATTC TCCAAGGCCC ACACTCAGCT TCTCCGGGAA CTCCTCCTCC 540 TCCAGCTCTG ACCTGTACAC CACCTCACTA GACATGATGG AACCATCCGG CTTTTCCAAC 600 CTGGATCTGA ACGGAGAGGA TTCTGATGAC CCGTCTGTGA CTCTGGACCT GTCTCCTCTC 660 TCCATGCTGC CCCACCTGGC TGACCTTGTC AGTTACAGCA TCCAAAAGGT CATCGGCTTT 720 GCCAAGATGA TCCCAGGATT CAGGGATCTC ACCTCCGATG ACCAGATTGT CCTGCTTAAG 780 TCAAGCGCCA TTGAGGTGAT CATGTTACGC TCCAACCAGT CTTTCACCAT GGATGATATG 840 TCCTGGGACT GTGGCAGCCA GGACTACAAG TACGACGTCA CCGATGTCTC CAAAGCTGGG 900 CACACCCTGG AGCTGATCGA GCCCCTCATA AAGTTCCAGG TGGGGCTGAA GAAGCTGAAC 960 TTACATGAGG AAGAGCATGT CCTTCTCATG GCCATCTGCA TTGTCTCCCC GGGTACGGAG 1020 CCTGGCAGGG AGGAGCTGAG GGACCTGGGA CACGTTGGGG ACTGTGAATG A 1071SEQ ID NO: 2 Sequence length: 1071 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double Topology: Linear Sequence type: cDNA sequence ATGGAGGCAA CAGCGGCCAG CACCTCCCCC CCCGACCCTG GTGACTTTGA CCGGAACGTG 60 CCCCGGATCT GTGGAGTGTG TGGAGACCGA GCCACAGGCTTATGACCTC TCTACTACTA GCAAAGGTTT CTTCAGGCGG AGCATGAAGC GGAAGGCCCT GTTCACCTGT 180 CCCTTCAATG GAGATTGCCG CATCACCAAG GACAACCGGC GACACTGCCA GGCCTGCCGG 240 CTCAAACGCT GTGTGGACAT CGGCATGATG AAGGAGTTCA TCCTGACAGA TGAGGAGGTA 300 CAGCGTAAGA GGGAGATGAT AATGAAGAGA AAAGAGGAAG AGGCCTTGAA GGACAGTCTG 360 AGGCCCAAGC TATCTGAAGA ACAACAGCAC ATCATAGCCA TCCTGCTGGA CGCCCACCAC 420 AAGACCTATG ACCCCACCTA CGCTGACTTC AGGGACTTCC GGCCTCCAGT TCGTATGGAC 480 GGAAGTACAG GGAGCTATTC TCCAAGGCCC ACACTCAGCT TCTCCGGGAA CTCCTCCTCC 540 TCCAGCTCTG ACCTGTACAC CACCTCACTA GACATGATGG AACCATCCGG CTTTTCCAAC 600 CTGGATCTGA ACGGAGAGGA TTCTGATGAC CCGTCTGTGA CTCTGGACCT GTCTCCTCTC 660 TCCATGCTGC CCCACCTGGC TGACCTTGTC AGTTACAGCA TCCAAAAGGT C ATCGGCTTT 720 GCCAAGATGA TCCCAGGATT CAGGGATCTC ACCTCCGATG ACCAGATTGT CCTGCTTAAG 780 TCAAGCGCCA TTGAGGTGAT CATGTTACGC TCCAACCAGT CTTTCACCAT GGATGATATG 840 TCCTGGGACT GTGGCAGCCA GGACTACAAG TACGACGTCA CCGATGTCTC CAAAGCTGGG 900 CACACCCTGG AGCTGATCGA GCCCCTCATA AAGTTCCAGG TGGGGCTGAA GAAGCTGAAC 960 TTACATGAGG AAGAGCATGT CCTTCTCATG GCCATCTGCA TTGTCTCCCC GGGTACGGAG 1020 CCTGGCAGGG AGGAGCTGAG GGACCTGGGA CACGTTGGGG ACTGTGAATG A 1071
【００７０】配列番号：３ 配列の長さ：１４０４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATGGAGGCAA TGGCGGCCAG CACTTCCCTG CCTGACCCTG GAGACTTTGA CCGGAACGTG 60 CCCCGGATCT GTGGGGTGTG TGGAGACCGA GCCACTGGCT TTCACTTCAA TGCTATGACC 120 TGTGAAGGCT GCAAAGGCTT CTTCAGGCGA AGCATGAAGC GGAAGGCACT ATTCACCTGC 180 CCCTTCAACG GGGACTGCCG CATCACCAAG GACAACCGAC GCCACTGCCA GGCCTGCCGG 240 CTCAAACGCT GTGTGGACAT CGGCATGATG AAGGAGTTCA TTCTGACAGA TGAGGAAGTG 300 CAGAGGAAGC GGGAGATGAT CCTGAAGCGG AAGGAGGAGG AGGCCTTGAA GGACAGTCTG 360 CGGCCCAAGC TGTCTGAGGA GCAGCAGCGC ATCATTGCCA TACTGCTGGA CGCCCACCAT 420 AAGACCTACG ACCCCACCTA CTCCGACTTC TGCCAGTTCC GGCCTCCAGT TCGTGTGAAT 480 GATGGTGGAG GGAGCCATCC TTCCAGGCCC AACTCCAGAC ACACTCCCAG CTTCTCTGGG 540 GACTCCTCCT CCTCCTGCTC AGATCACTGT ATCACCTCTT CAGACATGAT GGACTCGTCC 600 AGCTTCTCCA ATCTGGATCT GAGTGAAGAA GATTCAGATG ACCCTTCTGT GACCCTAGAG 660 CTGTCCCAGC TCTCCATGCT GCCCCACCTG GCTGACCTGG TCAGTTACAG CATCCAAAAG 720 GTCATTGGCT TTGCTAAGAT GATACCAGGA TTCAGAGACC TCACCTCTGA GGACCAGATC 780 GTACTGCTGA AGTCAAGTGC CATTGAGGTC ATCATGTTGC GCTCCAATGA GTCCTTCACC 840 ATGGACGACA TGTCCTGGAC CTGTGGCAAC CAAGACTACA AGTACCGCGT CAGTGACGTG 900 ACCAAAGGTA TGCCTAGNNN NCACCTCCTG GGGAGTCTTT TTCAGCTCCC AGATTCTGGC 960 TCCACCCGTC CTGGGGTTTG GCTCCAATCA GATACATGGG AGGGAGTTAG GCACCAACAG 1020 GCAGAGAAGG GCGAGGGTCA GACCCATGGG GTTGGAGGTG GGTGGGCGGC TCCTCAGCTC 1080 TTGCCCGCAG TACCTCCCCA TTGTCTCTCA CAGGCCGGAC ACAGCCTGGA GCTGATTGAG 1140 CCCCTCATCA AGTTCCAGGT GGGACTGAAG AAGCTGAACT TGCATGAGGA GGAGCATGTC 1200 CTGCTCATGG CCATCTGCAT CGTCTCCCCA GGTATGGGGC CAGGCAGGGA GGAGCTCAGG 1260 GACCTGGGGA GCGGGGAGTA TGAAGGACAA AGACCTGCTG AGGGCCAGCT GGGCAACCTG 1320 AAGGGAGACG TAGCAAAAGG AGACACAGAT AAGGAAATAC CTACTTTGCT GGTTTGCAGA 1380 GCCCCTGTGG TGTGTGGACG CTGA 1404SEQ ID NO: 3 Sequence length: 1404 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Two Topologies: Linear Sequence type: cDNA sequence ATGGAGGCAA TGGCGGCCAG CACTTCCCTG CCTGACCCTG GAGACTTTGA CCGGAACGTG 60 CCCCGGATCT GTGGGGTGTG TGGAGACCGA GCCACTGGGCTATCACCTC TCTACTACTA GCAAAGGCTT CTTCAGGCGA AGCATGAAGC GGAAGGCACT ATTCACCTGC 180 CCCTTCAACG GGGACTGCCG CATCACCAAG GACAACCGAC GCCACTGCCA GGCCTGCCGG 240 CTCAAACGCT GTGTGGACAT CGGCATGATG AAGGAGTTCA TTCTGACAGA TGAGGAAGTG 300 CAGAGGAAGC GGGAGATGAT CCTGAAGCGG AAGGAGGAGG AGGCCTTGAA GGACAGTCTG 360 CGGCCCAAGC TGTCTGAGGA GCAGCAGCGC ATCATTGCCA TACTGCTGGA CGCCCACCAT 420 AAGACCTACG ACCCCACCTA CTCCGACTTC TGCCAGTTCC GGCCTCCAGT TCGTGTGAAT 480 GATGGTGGAG GGAGCCATCC TTCCAGGCCC AACTCCAGAC ACACTCCCAG CTTCTCTGGG 540 GACTCCTCCT CCTCCTGCTC AGATCACTGT ATCACCTCTT CAGACATGAT GGACTCGTCC 600 AGCTTCTCCA ATCTGGATCT GAGTGAAGAA GATTCAGATG ACCCTTCTGT GACCCTAGAG 660 CTGTCCCAGC TCTCCATGCT GCCCCACCTG GCTGACCTGG TCAGTTACAG C ATCCAAAAG 720 GTCATTGGCT TTGCTAAGAT GATACCAGGA TTCAGAGACC TCACCTCTGA GGACCAGATC 780 GTACTGCTGA AGTCAAGTGC CATTGAGGTC ATCATGTTGC GCTCCAATGA GTCCTTCACC 840 ATGGACGACA TGTCCTGGAC CTGTGGCAAC CAAGACTACA AGTACCGCGT CAGTGACGTG 900 ACCAAAGGTA TGCCTAGNNN NCACCTCCTG GGGAGTCTTT TTCAGCTCCC AGATTCTGGC 960 TCCACCCGTC CTGGGGTTTG GCTCCAATCA GATACATGGG AGGGAGTTAG GCACCAACAG 1020 GCAGAGAAGG GCGAGGGTCA GACCCATGGG GTTGGAGGTG GGTGGGCGGC TCCTCAGCTC 1080 TTGCCCGCAG TACCTCCCCA TTGTCTCTCA CAGGCCGGAC ACAGCCTGGA GCTGATTGAG 1140 CCCCTCATCA AGTTCCAGGT GGGACTGAAG AAGCTGAACT TGCATGAGGA GGAGCATGTC 1200 CTGCTCATGG CCATCTGCAT CGTCTCCCCA GGTATGGGGC CAGGCAGGGA GGAGCTCAGG 1260 GACCTGGGGA GCGGGGAGTA TGAAGGACAA AGACCTGCTG AGGGCCAGCT GGGCAACCTG 1320 AAGGGAGACG TAGCAAAAGG AGACACAGAT AAGGAAATAC CTACTTTGCT GGTTTGCAGA 1380 GCCCCTGTGG TGTGTGGACG CTGA 1404
【００７１】配列番号：４ 配列の長さ：２１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GGTATGCCTA GNNNNCACCT CCTGGGGAGT CTTTTTCAGC TCCCAGATTC TGGCTCCACC 60 CGTCCTGGGG TTTGGCTCCA ATCAGATACA TGGGAGGGAG TTAGGCACCA ACAGGCAGAG 120 AAGGGCGAGG GTCAGACCCA TGGGGTTGGA GGTGGGTGGG CGGCTCCTCA GCTCTTGCCC 180 GCAGTACCTC CCCATTGTCT CTCACAGGCC 210SEQ ID NO: 4 Sequence length: 210 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Two Topology: Linear Sequence type: cDNA sequence GGTATGCCTA GNNNNCACCT CCTGGGGAGT CTTTTTCAGC TCCCAGATTC TGGCTCCACC 60 CGTCCTGGGG TTTGGCTCCA ATCAGATACA TGCGAACC ACAGCAGAGAGAGG TAG GTCAGACCCA TGGGGTTGGA GGTGGGTGGG CGGCTCCTCA GCTCTTGCCC 180 GCAGTACCTC CCCATTGTCT CTCACAGGCC 210
【００７２】配列番号：５ 配列の長さ：１７３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GTATGGGGCC AGGCAGGGAG GAGCTCAGGG ACCTGGGGAG CGGGGAGTAT GAAGGACAAA 60 GACCTGCTGA GGGCCAGCTG GGCAACCTGA AGGGAGACGT AGCAAAAGGA GACACAGATA 120 AGGAAATACC TACTTTGCTG GTTTGCAGAG CCCCTGTGGT GTGTGGACGC TGA 173SEQ ID NO: 5 Sequence length: 173 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Two Topology: Linear Sequence type: cDNA sequence GTATGGGGCC AGGCAGGGAG GAGCTCAGGG ACCTGGGGAG CGGGGAGTAT GAAGGACACA 60 GACCTGCTGA GGGCCAGCTG GGCAACCTGA AGGGGAGAACACAGAG 120A TACTTTGCTG GTTTGCAGAG CCCCTGTGGT GTGTGGACGC TGA 173
【図１】ｒＶＤＲ０およびラット腎臓ｃＤＮＡライブラ
リーから単離されたｒＶＤＲ１のｃＤＮＡのヌクレオチ
ドおよびアミノ酸配列を示す。FIG. 1 shows the nucleotide and amino acid sequences of rVDR0 and rVDR1 cDNA isolated from a rat kidney cDNA library.
【図２】エキソン７〜９近傍のラットＶＤＲゲノム領域
および選択的スプライシングによって生じた２つのｒＶ
ＤＲアイソフォーム（ｒＶＤＲ０およびｒＶＤＲ１）の
タンパク質の構造を示す。ｒＶＤＲのＡ〜Ｅ領域および
そのアミノ酸残基を模式的に示す。ラットＶＤＲゲノム
領域の制限酵素部位のＳはＳｍａＩを、ＨはＨｉｎｄII
Iを、ＫはＫｐｎＩを、ＰはＰｓｔＩを表す。FIG. 2. Rat VDR genomic region near exons 7-9 and two rVs generated by alternative splicing.
1 shows the protein structures of the DR isoforms (rVDR0 and rVDR1). The AE region of rVDR and its amino acid residues are schematically shown. S of the restriction enzyme site in the rat VDR genome region is SmaI, and H is HindII.
I, K represents KpnI, and P represents PstI.
【図３】ｒＶＤＲ０およびｒＶＤＲ１転写物の発現を、
ラット腸および腎臓からのポリＡ（＋）ｍＲＮＡを用い
てノーザンブロットで分析した図（電気泳動の写真）で
ある。FIG. 3: Expression of rVDR0 and rVDR1 transcripts
It is the figure (photograph of electrophoresis) analyzed by Northern blotting using poly A (+) mRNA from rat intestine and kidney.
【図４】ＣＡＴアッセイを用いた、ｒＶＤＲ０のｒＶＤ
Ｒ１に対するドミナントネガティブ活性試験の結果を示
す。FIG. 4: rVD of rVDR0 using the CAT assay.
The result of the dominant negative activity test with respect to R1 is shown.
【図５】ＣＡＴアッセイを用いた、ｒＶＤＲ１の用量依
存的活性試験の結果を示す。FIG. 5 shows the results of a dose-dependent activity test of rVDR1 using the CAT assay.
【図６】ＣＡＴアッセイを用いた、ｒＶＤＲ１の甲状腺
ホルモンおよびレチノイン酸シグナリング経路に及ぼす
試験の結果を示す。FIG. 6 shows the results of testing rVDR1 on thyroid hormone and retinoic acid signaling pathways using the CAT assay.
【図７】ｒＶＤＲ１のドミナントネガティブ活性が配列
特異的であることを示すグラフである。FIG. 7 is a graph showing that the dominant negative activity of rVDR1 is sequence specific.
【図８】大腸菌中でｒＶＤＲ０およびｒＶＤＲ１をＧＳ
Ｔ融合タンパク質として発現させた試料（ＧＳＴ−ｒＶ
ＤＲ０およびＧＳＴ−ｒＶＤＲ１）、ならびにトロンビ
ンで消化し、精製して得たｒＶＤＲ０およびｒＶＤＲ１
試料を用いて、ポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルで測定
した分子量を示す（電気泳動の写真）。FIG. 8: GS rVDR0 and rVDR1 in E. coli
Sample expressed as T fusion protein (GST-rV
DR0 and GST-rVDR1), and rVDR0 and rVDR1 obtained by digestion with thrombin and purification.
The molecular weight measured by polyacrylamide-SDS gel using a sample is shown (electrophoresis photograph).
【図９】ＤＲ３Ｔをプローブとして用い、種々の量の精
製マウスＲＸＲα（ＲＸＲ）、精製ｒＶＤＲ０およびｒ
ＶＤＲ１で行ったゲルシフトアッセイの結果を示す（電
気泳動の写真）。FIG. 9: Using DR3T as a probe, varying amounts of purified mouse RXRα (RXR), purified rVDR0 and rVDR0 and r
The result of the gel shift assay performed by VDR1 is shown (electrophoresis photograph).
【図１０】ＤＲ４およびＤＲ５をプローブとして用い、
種々の量の精製ｒＶＤＲ１、ニワトリＴＲα（ＴＲ）お
よびマウスＲＡＲα（ＲＡＲ）で行ったゲルシフトアッ
セイの結果を示す（電気泳動の写真）。FIG. 10: Using DR4 and DR5 as probes,
Figure 3 shows the results of gel shift assays performed with varying amounts of purified rVDRl, chicken TRα (TR) and mouse RARα (RAR) (electrophoresis pictures).
【図１１】大腸菌にて合成した組換えｒＶＤＲタンパク
質（ｒＶＤＲ０またはｒＶＤＲ１）と、［3Ｈ］でラベ
ルした１，２５（ＯＨ）2Ｄ3１ｎＭと、ラベルしていな
い１，２５（ＯＨ）2Ｄ3をいろいろな濃度で加え、４
℃、１６時間インキュベートし、結合しなかったビタミ
ンＤを遠心分離にて除き、組換えｒＶＤＲタンパク質に
結合したリガンドの放射活性を測定した結果を示す。FIG. 11: Recombinant rVDR protein (rVDR0 or rVDR1) synthesized in E. coli, [ 3 H] -labeled 1,25 (OH) 2 D 3 1 nM and unlabeled 1,25 (OH) 2 Add D 3 at various concentrations and 4
The results of measuring the radioactivity of the ligand bound to the recombinant rVDR protein by incubating at 16 ° C. for 16 hours, removing unbound vitamin D by centrifugation are shown.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ Ｘ 33/53 33/53 Ｄ Ｈ 33/566 33/566 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical display location C12P 21/02 C12P 21/02 C G01N 33/50 G01N 33/50 TX 33/53 33/53 DH 33/566 33/566 // (C12P 21/02 C12R 1:19)
Claims (12)
ンパク質をコードする遺伝子。1. A gene encoding a vitamin D receptor isoform protein.
ンパク質をコードする遺伝子がラット由来である請求項
１記載の遺伝子。2. The gene according to claim 1, wherein the gene encoding the vitamin D receptor isoform protein is derived from rat.
するヌクレオチド配列、またはこれを一部置換、欠失も
しくは付加したヌクレオチド配列、あるいはこれらにハ
イブリダイズするヌクレオチド配列を含むＤＮＡである
請求項１または２記載の遺伝子。3. A DNA comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a nucleotide sequence partially substituted, deleted or added, or a nucleotide sequence hybridizing to these, or The gene according to 2.
する請求項３記載の遺伝子。4. The gene according to claim 3, which has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
ンパク質をコードする遺伝子がヒト由来である請求項１
記載の遺伝子。5. The gene encoding a vitamin D receptor isoform protein is of human origin.
The described gene.
示すヌクレオチド配列を含む請求項５記載の遺伝子。6. The gene according to claim 5, which comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and / or SEQ ID NO: 5.
たはこれを一部置換、欠失もしくは付加したヌクレオチ
ド配列、あるいはこれらにハイブリダイズするヌクレオ
チド配列を含むＤＮＡである請求項５または６記載の遺
伝子。7. The gene according to claim 5 or 6, which is a DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, a nucleotide sequence partially substituted, deleted or added, or a nucleotide sequence that hybridizes to these.
ター。8. A recombinant vector containing the gene according to claim 1.
質転換された原核もしくは真核宿主細胞。9. A prokaryotic or eukaryotic host cell transformed with the recombinant vector according to claim 8.
とによって得られるビタミンＤレセプターアイソフォー
ムタンパク質。10. A vitamin D receptor isoform protein obtained by culturing the host cell according to claim 9.
ーアイソフォームンパク質を認識する抗体。11. An antibody that recognizes the vitamin D receptor isoform protein according to claim 10.
ーアイソフォームタンパク質を用いた骨密度の診断方
法。12. A method for diagnosing bone density using the vitamin D receptor isoform protein according to claim 10.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8194179A JPH09327295A (en) | 1996-06-10 | 1996-06-10 | Vitamin d receptor isoform protein |
| AU35550/97A AU3555097A (en) | 1996-06-10 | 1997-06-10 | Vitamin d receptor isoform protein |
| PCT/IB1997/000947 WO1997047172A1 (en) | 1996-06-10 | 1997-06-10 | Vitamin d receptor isoform protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8194179A JPH09327295A (en) | 1996-06-10 | 1996-06-10 | Vitamin d receptor isoform protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09327295A true JPH09327295A (en) | 1997-12-22 |
Family
ID=16320256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8194179A Pending JPH09327295A (en) | 1996-06-10 | 1996-06-10 | Vitamin d receptor isoform protein |
Country Status (3)
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|---|---|
| JP (1) | JPH09327295A (en) |
| AU (1) | AU3555097A (en) |
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5260199A (en) * | 1991-07-30 | 1993-11-09 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of producing 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptor protein |
| DE69333659T2 (en) * | 1992-07-31 | 2005-11-17 | Garvan Institute Of Medical Research, Darlinghurst | ASSESSMENT OF TRANS-ACTING FACTORS OF ALLELEN VARIATION |
-
1996
- 1996-06-10 JP JP8194179A patent/JPH09327295A/en active Pending
-
1997
- 1997-06-10 WO PCT/IB1997/000947 patent/WO1997047172A1/en active Application Filing
- 1997-06-10 AU AU35550/97A patent/AU3555097A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3555097A (en) | 1998-01-07 |
| WO1997047172A1 (en) | 1997-12-18 |
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