JPH09308495A - バクテリアセルロースの連続的製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 バクテリアセルロース（ＢＣ）の製造方法に
於いて、ＢＣの高い生産速度と収率を達成すること。 【解決手段】 セルロース生産菌を連続培養して、培養
液中の残糖の濃度を２０ｇ／Ｌ以下に維持しつつ、かつ
０．４ｇ／Ｌ／hr以上の生産速度でセルロース性物質を
製造する方法、及び糖に対する見かけの基質親和性を高
める因子を含有する培地を用いてセルロース生産菌を培
養して、セルロース性物質を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、連続培養における
培養液中の残糖濃度を一定値以下に維持しつつ、高生産
速度で、セルロース性物質を生産する能力を有する微生
物（以下、「セルロース生産菌」という。）に属する菌
体を用いてセルロース性物質（以下、「バクテリアセル
ロース」又は「ＢＣ」という。）を連続的に製造する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＢＣ（バクテリアセルロース）は可食性
であり食品分野で利用されるほか水系分散性に優れてい
るので食品、化粧品又は塗料等の粘度の保持、食品原料
生地の強化、水分の保持、食品安定性向上、低カロリー
添加物又は乳化安定化助剤としての産業上利用価値があ
る。ＢＣは木材パルプ等から製造されるセルロースに較
べ、フィブリルの断片幅が２ケタ程度も小さいことを特
徴とする。従って、ＢＣの離解物はミクロフィブリルの
かかる構造的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分
子用補強剤として各種の産業用用途がある。このような
セルロース性離解物を紙状または固型状に固化した物質
は高い引張弾性率を示すのでミクロフィブリルの構造的
特徴に基づくすぐれた機械特性が期待され、各種産業用
素材としての応用がある。

【０００３】ＢＣの製造方法に関しては、特開昭６２−
２６５９９０号、特開昭６３−２０２３９４号及び特公
平６−４３４４３号等にＢＣの製造方法に関する記載が
ある。セルロース生産菌の培養を行なう際に適当とされ
ている栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキ
ス、燐酸ナトリウム及びクエン酸からなる Schramm／He
strin 培地（Schramm ら、J. General Biology, ll, p
p.123〜129, 1954 ）が知られている。また、このよう
な栄養培地に、培地中の特定栄養素によるセルロース生
成促進因子である、イノシトール、フィチン酸及びピロ
ロキノリンキノン（ＰＱＱ）（特公平５−１７１８号公
報；高井光男，紙パ技協誌，第４２巻，第３号，第２３
７〜２４４頁）等を添加したり、更には、カルボン酸又
はその塩（特願平５−１９１４６７号）、インベルター
ゼ（特願平５−３３１４９１号）及びメチオニン（特願
平５−３３５７６４号）を添加することによって、セル
ロース性物質の生産性が向上することが見い出されてい
る。又、特定の範囲の酸素移動容量係数（ＫＬａ）の条
件下でセルロース生産菌を培養する方法（特願平７−３
１７８７号）、炭素源の培養液中濃度を一定値以上に維
持しながらセルロース生産菌を培養する方法（特願平７
−２７６４０７）、及び培養の或る段階に於いて、発酵
槽の内圧を一定値以上に維持しながらセルロース生産菌
を培養する方法（特願平７−２７６４０８）等も提案さ
れている。また、従来より、微生物を培養する培養形式
としては、静置、振盪もしくは通気攪拌培養等が用いら
れてきた。また、培養操作法としては、いわゆる回分培
養法、流加回分培養法、反復回分培養法及び連続培養法
等が使用されてきた。尚、攪拌手段としては、例えばイ
ンペラー（攪拌羽根）、エアーリフト発酵槽、発酵ブロ
スのポンプ駆動循環、及びこれら手段の組合せ等が使用
されている。インペラーの種類としては、門型羽根、タ
ービン羽根、ヘリカルリボン羽根及びスクリュー羽根等
が知られている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】経済的かつ高収率なＢ
Ｃの製造方法として、培養期間中、培養系からの培養液
の引き抜き及び該引き抜き量とほぼ等容量の新たな培養
液の供給を連続的に行なうことによって、培養中の培養
液に於けるセルロース性物質の濃度を一定値以下、又は
酸素消費速度を一定値以上に保つことができるように低
く維持することを特徴とするＢＣの製造方法が特願平６
−１９２２８８号に記載されている。しかしながら、該
方法によって、培養中にＢＣが蓄積することによって培
養液の粘度が増加するのに伴ない必要な酸素の供給が困
難になる、という欠点が解決され、高い生産速度は達成
されたものの、希釈率（即ち、培地の供給速度）が比較
的高いため、引き抜き液中に未利用の糖が多く残ってし
まい、結果としてＢＣ生産の収率に未だ課題を残してい
た。そこで、本発明者等は、上記課題を解決すべく検討
した結果、本発明を完成させたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、セルロ
ース生産菌を連続培養して、培養液（引き抜き液）中の
残糖の濃度を２０ｇ／Ｌ以下、好ましくは８ｇ／Ｌ以下
に維持しつつ、かつ０．４ｇ／Ｌ／hr以上の生産速度で
セルロース性物質を製造する方法に係わる。本発明の製
造方法に於いて、希釈率を制御することによって培養液
中の糖濃度を一定値以下に維持したまま、ＢＣを含む培
養液を連続的に培養系から引き抜くことによって、セル
ロース生産菌の連続培養におけるＢＣの収率を向上させ
るものである。ここで「連続的」とは、「断続的」又は
「間欠的」をも含むものであって、培養系に対する培養
液の供給・引き抜きをペリスタティックポンプ等を用い
て一定の流量で常時継続的に行なう態様に限らず、一定
時間の間隔で培養液の供給・引き抜きを行なう態様もか
かる概念に包含されるものである。いずれの場合も、引
き抜き液中の残糖の濃度をモニタリングしながら、その
値に応じて、供給量及び引き抜き量を適宜決めていくこ
とによって、かかる培養液中の糖濃度を低い範囲に維持
することができる。培養液中の残糖の濃度を２０ｇ／Ｌ
以下に維持する具体的な方法の例としては、例えば菌体
としてＢＰＲ３００１Ａ株を用いた場合には希釈率を
０．１２／hr以下にすることが挙げられる。ここで、
「希釈率」は以下のように定義する。 Ｄ＝Ｆ／Ｖ ここで、Ｄ：希釈率（／hr） Ｆ：培地供給速度（Ｌ／hr） Ｖ：発酵槽内の培養液量（Ｌ）

【０００６】更に、本発明は、フルクトース等の糖に対
する菌体の見かけの基質親和性を高める（即ち、基質親
和定数（Ｋ_s ）を小さくする。）ような因子を含有する
培地を用いてセルロース生産菌を培養して、セルロース
性物質を製造する方法に係わる。かかる因子の例とし
て、乳酸、エタノール、アセトアルデヒド、酢酸、ピル
ビン酸及びグリセロール並びにこれらの混合物等を挙げ
ることができる。培地中のかかる因子の濃度は、当業者
が適宜選択することができるが、通常、１〜３０ｇ／Ｌ
である。

【０００７】ここで、基質親和定数（Ｋ_s ）とは、微生
物と或る基質との親和性を表すものであり、最大比増殖
速度の半分の比増殖速度を示すときの基質濃度に等し
い。すなわち、或る基質に対して基質親和性が高いほ
ど、基質親和定数の値は小さくなる。 Monod式によれ
ば、基質親和定数Ｋ_s と最大比増殖速度μmax 、比増殖
速度μ、残存基質濃度Ｓとの間には以下の関係が成り立
つ。 μ＝μmax ×Ｓ／（Ｋ_s ＋Ｓ） ここで、 μ：比増殖速度（／hr） μmax ：最大比増殖速度（／hr） Ｓ：残存基質濃度（ｇ／Ｌ） Ｋ_s ：基質親和定数（ｇ／Ｌ） 連続培養では定常状態において希釈率Ｄと比増殖速度μ
が等しいとみなせるため、定常状態での培養液基質濃度
と希釈率との関係から、特定の微生物と或る基質に関し
て、参考例に示すように Lineweaver-Burk plot を用い
て実験的にＫ_sを算出することができる。

【０００８】本発明方法を実施するに際しては、前述の
培養形式・培養操作法に加えて、特願平６−１９２２８
７号に記載されている「培養装置と浮上分離装置及びエ
ッジフィルター等の分離装置の間で菌体を含む培養液を
循環させるセルロース性物質の製造方法であって、該分
離装置に於いて、生産物であるセルロース性物質を菌体
及び培養液から分離することを特徴とする、前記方法」
を採ることもできる。

【０００９】本発明において使用されるセルロース生産
菌は、例えば、ＢＰＲ２００１株に代表されるアセトバ
クター・キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファ
ーメンタンス（Acetobacter xylinum subsp. sucroferm
entans）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter
xylinum ）ＡＴＣＣ２３７６８、アセトバクター・キシ
リナムＡＴＣＣ２３７６９、アセトバクター・パスツリ
アヌス（A. pasteurianus ）ＡＴＣＣ１０２４５、アセ
トバクター・キシリナムＡＴＣＣ１４８５１、アセトバ
クター・キシリナムＡＴＣＣ１１１４２及びアセトバク
ター・キシリナムＡＴＣＣ１０８２１等の酢酸菌、その
他に、アグロバクテリウム属、リゾビウム属、サルシナ
属、シュードモナス属、アクロモバクター属、アルカリ
ゲネス属、アエロバクター属、アゾトバクター属及びズ
ーグレア属並びにそれらをＮＴＧ（ニトロソグアニジ
ン）等を用いる公知の方法によって変異処理することに
より創製される各種変異株である。尚、ＢＰＲ２００１
株は、平成５年２月２４日に通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され
（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３４６６）、その後１９９
４年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に基づく寄託（受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４５４５）に移管されている。

【００１０】ＮＴＧ等の変異剤を用いての化学的変異処
理方法には、例えば、Bio Factors,Vol. 1, p.297−302
(1988)及び J. Gen. Microbiol, Vol. 135, p.2917−2
929(1989) 等に記載されているものがある。従って、当
業者であればこれら公知の方法に基づき本発明で用いる
変異株を得ることができる。また、本発明で用いる変異
株は他の変異方法、例えば放射線照射等によっても得る
ことができる。上述の方法によって創製されるセルロー
ス生産菌の中でも、通気攪拌培養することによって、ポ
リスチレン換算の重量平均重合度が１．６×１０⁴ 以
上、好ましくは１．７×１０⁴ 以上である高重合度のバ
クテリアセルロースを製造するか、又は、静置培養する
ことによって、ポリスチレン換算の重量平均重合度が
２．０×１０⁴ 以上である高重合度のバクテリアセルロ
ースを製造する菌株が好ましい。本発明で使用し得る高
重合度のバクテリアセルロースの生産菌のうち、ＢＰＲ
３００１Ａは、平成７年６月１２日付で通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター
に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８２を付さ
れている。一般的に、高分子材料の強度や弾性率は、高
分子の重合度が高いほど、高いものとなることが知られ
ている。バクテリアセルロースの場合にも同様で、高重
合度のバクテリアセルロースを原料として得られた各種
製品は、相対的に低い重合度のバクテリアセルロースを
原料として得られたものと比較して、その強度や弾性率
が高い。従って、高強度や弾性率のものを製造したい場
合には、先に述べたような高重合度のバクテリアセルロ
ースを用いた方が高い効果が得られる。

【００１１】本発明におけるＢＣ等の各種セルロースの
重量平均重合度は、検出器としてＲＩを内蔵したＧＰＣ
システム（Tosoh ＨＬＣ−８０２０）を用いて以下のよ
うにして測定する。各種セルロース試料を発煙硝酸−五
酸化リン溶液で W.J. Alexander, R.L. Mitchell, Anal
ytical chemistry 21, 12, 1497-1500 (1949) の方法に
よりニトロ化する。コントロールとして同時にニトロ化
したコットンリンターを用いる。セルロースニトロ化物
はＴＨＦ（和光純薬 １級）に０．０５％濃度で溶かし
たのち、１．０μｍポアサイズのフィルターで濾過す
る。ＧＰＣの溶離液にもＴＨＦを用いる。流速は０．５
ml／min 、圧力は１０〜１３kg f／cm² 、サンプル注入
量は１００μl とする。カラムはＴＳＫｇｅｌ ＧＭＨ
−ＨＲ（Ｓ）（７．５ＩＤ×３００mm×２本）とガード
カラム（ＨＨＲ（Ｓ））(Tosoh Co., Ltd.) を用い３５
℃で測定する。分子量算出のためにスタンダードポリス
チレン(Tosoh) を用いポリスチレン換算の相対分子量を
求める。２×１０⁷ から２６３０の分子量のポリスチレ
ンを用い、溶出時間（ｔ）と分子量の対数（ｌｏｇＭ）
について、３次式：（ｌｏｇＭ＝Ａｔ³ ＋Ｂｔ² ＋Ｃｔ
＋Ｄ）による近似を行いスタンダード曲線を作製する。
分子量はTosoh のデータ処理専用機（ＳＣ−８０２０）
に内蔵されたプログラム（ｖｅｒ．３，１０）により重
量平均分子量を計算する。これらの分子量の値からニト
ロ化後の置換度を考慮して重量平均重合度を計算する。

【００１２】本発明の製造方法に用いる培地の組成物
中、炭素源としてはシュクロース、グルコース、フルク
トース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、
及びマルトース等の糖類を単独或いは併用して使用する
ことができる。更にはこれらのものを含有する澱粉水解
物、シトラスモラセス、ビートモラセス、ビート搾汁、
サトウキビ搾汁、柑橘類を始めとする果汁等をシュクロ
ースに加えて使用することもできる。また、窒素源とし
ては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アン
モニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、尿素等有機或い
は無機の窒素源を使用することができ、或いはＢａｃｔ
−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｂａｃｔ−Ｓｏｙｔｏｎｅ、Ｙｅａ
ｓｔ−Ｅｘｔｒａｃｔ、豆濃などの含窒素天然栄養源を
使用してもよい。有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、２，７，９−トリカルボキシ−１
Ｈピロロ〔２，３，５〕−キノリン−４，５−ジオン、
亜硫酸パルプ廃液、リグニンスルホン酸等を添加しても
よい。

【００１３】生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変
異株を使用する場合には、要求される栄養素を補添する
ことが必要である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト
塩、モリブデン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用
される。更に、前述のセルロース生成促進因子を適宜培
地中に添加することもできる。例えば、酢酸菌を生産菌
として用いる場合には、培養のｐＨは３ないし７に、好
ましくは５付近に制御する。培養温度は１０〜４０℃、
好ましくは２５〜３５℃の範囲で行う。培養装置に供給
する酸素濃度は１〜１００％、望ましくは２１〜８０％
であれば良い。これら培地中の各成分の組成割合は培養
方法に応じて当業者が適宜選択し得るものである。

【００１４】本発明の方法によって製造されるＢＣはそ
のまま回収してもよく、さらに本物質中に含まれる菌体
を含むセルロース性物質以外の不純物を取り除く処理を
施すことが出来る。不純物を取り除くためには、水洗、
加圧脱水、希酸洗浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ
及び過酸化水素などの漂白剤による処理、リゾチームな
どの菌体溶解酵素による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デ
オキシコール酸などの界面活性剤による処理、常温から
２００℃の範囲の加熱洗浄などを単独及び併用して行
い、セルロース性物質から不純物をほぼ完全に除去する
ことができる。このようにして得られた本発明でいうセ
ルロース性物質とは、セルロース及び、セルロースを主
鎖としたヘテロ多糖を含むもの及びβ−１，３、β−
１，２等のグルカンを含むものである。ヘテロ多糖の場
合のセルロース以外の構成成分はマンノース、フラクト
ース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、ラム
ノース、グルクロン酸等の六炭糖、五炭糖及び有機酸等
である。尚、これ等の多糖が単一物質である場合もある
し２種以上の多糖が水素結合等により混在してもよい。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下の実施例により、本発明をさ
らに詳細に説明する。

【００１６】

【実施例】実施例１ ＢＰＲ３００１Ａ株を以下の条件で連続培養した。培養条件 前培養として、１１２．５mlのＣＳＬ−Ｆｒｕ培地（培
地組成は表１）が入った５００ml容斜めバッフル付き三
角フラスコにＢＰＲ３００１Ａ株のRoux培養菌液を１
２．５ml接種し、２８℃、１８０rpm で３日間振盪培養
した。この培養液をホモジナイザーで１０，０００rpm
、１分間無菌的に離解したもの１２．５mlを１１２．
５mlのＣＳＬ−Ｆｒｕ培地（培地組成は表１）が入った
５００ml容斜めバッフル付き三角フラスコ６本に接種
し、２８℃、１８０rpm で２４時間振盪培養した。次
に、１４４０mlのＣＳＬ−Ｆｒｕ培地が入った３リット
ル容のジャー３台にこの菌液を１６０mlずつ接種して回
分培養を開始した。この時の初発糖濃度は４０ｇ／Ｌ、
初発ＣＳＬ濃度は４ｖ／ｖ％とした。培養中は、培養温
度は３０℃、ｐＨは５±０．１で制御した。また、通気
量は８００ml／分とし、攪拌は溶存酸素が充足されるよ
うに２００〜１２００rpm に制御した。連続培養には、
１）表１記載のＣＳＬ−Ｆｒｕ培地の糖濃度を３０ｇ／
Ｌに変更した培地、２）１）の培地に乳酸を７．５ｇ／
Ｌ添加した培地、３）１）の培地に１０ｇ／Ｌのエタノ
ールを添加した培地、の３種類の培地を供給培地として
使用した。回分培養開始後２０時間目から上記３種類の
培地を各ジャーに希釈率０．０３４（／hr）で３６時間
供給してＢＣ生産を行った。また、希釈率０．０６９、
０．１０２（／hr）でも同様の培養を行った。培地供給
量及び培養液引き抜き量は培地供給量と培養液引き抜き
量が等しくなるように重量測定しながら制御した。その
結果得られた、希釈率とＢＣ生産速度及び引き抜き液中
の残糖量との関係、並びに希釈率と消費糖収率及び投入
糖収率との関係を、それぞれ図１及び図２に示した。

【００１７】

【表１】

【００１８】

【表２】ビタミン混合物 化合物 mg／Ｌ イノシトール ２００ ナイアシン ４０ ピリドキシンＨＣｌ ４０ チアミンＨＣｌ ４０ パントテン酸カルシウム ２０ リボフラビン ２０ ｐ−アミノ安息香酸 ２０ 葉 酸 ０．２ ビオチン ０．２

【００１９】

【表３】塩類混合液 ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ３６０mg／Ｌ ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ １４７０mg／Ｌ Ｎａ₂ ＭｏＯ₂ ・２Ｈ₂ Ｏ ２４２mg／Ｌ ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １７３mg／Ｌ ＭｎＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ １３９mg／Ｌ ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ ５mg／Ｌ

【００２０】尚、図１中、引き抜き液中の残糖濃度は、
引き抜き液を適宜希釈して、０．４５μｍの酢酸セルロ
ース膜で濾過したものを高速液体クロマトグラフ（日本
分光社製ＨＰＬＣ、分離カラム： Shodex Asahipak NH2
P-50 4E ）で測定して求めた。更に、連続培養中のＢＣ
生産速度（ｇ／Ｌ／hr）を計算する為のＢＣ蓄積量は、
引き抜き液中の固形物を集積し、水洗して培地成分を除
去した後、１ＮＮａＯＨ水溶液中で８０℃、２０分間処
理して菌体を除去した。さらに、洗浄液が中性付近にな
るまで生成セルロースを水洗した後、８０℃で１２時間
真空乾燥して乾燥重量を測定することで求めた。

【００２１】又、図２中の、消費糖収率（％）及び投入
糖収率（％）は以下のようにして求めた。消費糖収率（％）の計算 いま、糖濃度がＦｒｕ_in（ｇ／Ｌ）である培地を供給速
度Ｆ（Ｌ／hr）で供給している連続培養系において、時
間ｔ₀ のとき、発酵槽内に体積Ｖ（Ｌ）の培養液が存在
し、その培養液中のＢＣ濃度がＢＣ₀ （ｇ／Ｌ）、糖濃
度がＦｒｕ₀ （ｇ／Ｌ）であったとする。ｔ時間経過し
た時間ｔ₁ のとき、培養液中のＢＣ濃度がＢＣ₁ （ｇ／
Ｌ）、糖濃度がＦｒｕ₁ （ｇ／Ｌ）になっていたとし、
ｔ時間のうちにｖ（Ｌ）引き抜かれた引き抜き液中のＢ
Ｃ濃度がＢＣ_out （ｇ／Ｌ）、残糖濃度がＦｒｕ
_out （ｇ／Ｌ）であったとする、消費糖収率Ｙｃ（％）
は、 Ｙｃ＝（Ｐ₁ −Ｐ₀ ＋Ｐ_out ) ／（Ｓ₀ ＋Ｓ_in−Ｓ₁ −
Ｓ_out ) ^* １００ で表される。ここで、 Ｙｃ：消費糖収率（％） Ｐ₀ ：時間ｔ₀ における発酵槽内の全ＢＣ量（ｇ）（Ｐ
₀ ＝ＢＣ₀ ^* Ｖ） Ｐ₁ ：時間ｔ₁ における発酵槽内の全ＢＣ量（ｇ）（Ｐ
₁ ＝ＢＣ₁ ^* Ｖ） Ｐ_out ：時間ｔ₀ から時間ｔ₁ にかけて引き抜かれた引
き抜き液中の全ＢＣ量（ｇ）（Ｐ_out ＝ＢＣ_out ^* ｖ） Ｓ₀ ：時間ｔ₀ における発酵槽内の全糖量（ｇ）（Ｓ₀
＝Ｆｒｕ₀ ^* Ｖ） Ｓ₁ ：時間ｔ₁ における発酵槽内の全糖量（ｇ）（Ｓ₁
＝Ｆｒｕ₁ ^* Ｖ） Ｓ_in：時間ｔ₀ から時間ｔ₁ にかけて供給された全糖量
（ｇ）（Ｓ_in＝Ｆｒｕ_in ^* ｖ） Ｓ_out ：時間ｔ₀ から時間ｔ₁ にかけて引き抜かれた引
き抜き液中の全残糖量（ｇ）（Ｓ_out ＝Ｆｒｕ
_out ^* ｖ） ｔ：経過時間（hr）（ｔ＝ｔ₁ −ｔ₀ ） ｖ：時間ｔ₀ から時間ｔ₁ にかけて引き抜かれた引き抜
き液量（ｖ＝Ｆ^* ｔ）

【００２２】投入糖収率（％）の計算 投入糖収率Ｙｔは次式から求めた。 Ｙｔ＝（Ｐ₁ −Ｐ₀ ＋Ｐ_out ）／Ｓ_in ^* １００ ここで、 Ｙｔ：投入糖収率（％） Ｐ₀ ：時間ｔ₀ における発酵槽内の全ＢＣ量（ｇ）（Ｐ
₀ ＝ＢＣ₀ ^* Ｖ） Ｐ₁ ：時間ｔ₁ における発酵槽内の全ＢＣ量（ｇ）（Ｐ
₁ ＝ＢＣ₁ ^* Ｖ） Ｐ_out ：時間ｔ₀ から時間ｔ₁ にかけて引き抜かれた引
き抜き液中の全ＢＣ量（ｇ）（Ｐ_out ＝ＢＣ_out ^* ｖ） Ｓ_in：時間ｔ₀ から時間ｔ₁ にかけて供給された全糖量
（ｇ）（Ｓ_in＝Ｆｒｕ_in ^* ｖ） ｔ：経過時間（hr）（ｔ＝ｔ₁ −ｔ₀ ） ｖ：時間ｔ₀ から時間ｔ₁ にかけて引き抜かれた引き抜
き液量（ｖ＝Ｆ^* ｔ）

【００２３】参考例 実施例に示した実験において、３種類の供給培地を用い
た連続培養での希釈率Ｄと定常状態での引き抜き液中の
残糖濃度Ｓの関係を調べた。 Monod式を変形した次式に
従って、引き抜き液中の残糖濃度の逆数（１／Ｓ）と希
釈率Ｄの逆数（１／Ｄ）をプロットした（図３）。 １／μ＝１／Ｄ＝（Ｋ_s ／μmax) ^*（１／Ｓ）＋（１／
μmax) この解析法では得られた直線のＸ軸切片が（−１／
Ｋ_s ）に等しい。最小自乗法によって（１／Ｓ）：（１
／Ｄ）プロットの直線のＸ軸切片を求めた。得られた結
果を以下の表４に示す。エタノール及び乳酸を供給培地
に添加すると、基質親和定数が小さくなっており、これ
は糖に対する見かけの親和性が高まっていることを示し
ている。

【００２４】

【表４】 連続培養におけるＢＰＲ３００１Ａ株の フラクトースに対する見かけの基質親和定数（Ｋ_s ) ────────────────────────────── 培地 基質親和定数（Ｋ_s ） （ｇ／Ｌ） ────────────────────────────── ＣＳＬ−Ｆｒｕ（対照） ９ エタノール添加ＣＳＬ−Ｆｒｕ ５．６ 乳酸添加ＣＳＬ−Ｆｒｕ ３．３ ──────────────────────────────

【００２５】

【発明の効果】図１の結果から明らかなように、セルロ
ース生産菌の連続培養において、本発明に従い乳酸及び
エタノール等の糖に対する菌体の見かけの基質親和性を
高めるような因子を添加した培地を用いると、これらの
因子を添加しない対照のＣＳＬ−Ｆｒｕ培地に比べて、
同一希釈率に於いて、ＢＣの生産速度が向上すると共
に、引き抜き液中の残糖濃度も低下する、という従来技
術では達成できなかった効果を奏功することができた。
更に、図２から、上記因子の培地への添加によって、消
費糖収率及び投入糖収率のいずれも向上することが判
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 希釈率とＢＣ生産速度及び引き抜き液中の残
糖量との関係を示す。

【図２】 希釈率と消費糖収率及び投入糖収率との関係
を示す。

【図３】 定常の状態での引き抜き液中の残糖濃度
（Ｓ）の逆数（１／Ｓ）と希釈率の逆数（１／Ｄ）をプ
ロットしたものを示す。

フロントページの続き (72)発明者 矢野 壽人 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１号 株式会社バイオポリマー・リサーチ内 (72)発明者 吉永 文弘 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１号 株式会社バイオポリマー・リサーチ内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セルロース生産菌を連続培養して、培養
   液中の残糖の濃度を２０ｇ／Ｌ以下に維持しつつ、かつ
   ０．４ｇ／Ｌ／hr以上の生産速度でセルロース性物質を
   製造する方法。
2. 【請求項２】 糖に対する見かけの基質親和性を高める
   因子を含有する培地を用いてセルロース生産菌を培養し
   て、セルロース性物質を製造する方法。
3. 【請求項３】 前記因子が、乳酸、エタノール、アセト
   アルデヒド、酢酸、ピルビン酸及びグリセロール並びに
   それらの混合物から成る群から選択される、請求項２に
   記載の方法。