JPH09299083A - 低温アルカリプロテアーゼｔ１５、それを生産する微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用酵素製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 洗浄剤用酵素等として有用な、新規かつ高性
能の低温アルカリプロテアーゼの提供。 【解決手段】 次の酵素学的性質を有する低温アルカリ
プロテアーゼT15、それを生産する微生物、その製造
法、並びにそれを含有する洗浄剤組成物及び食品加工用
酵素製剤。 1)少なくとも０〜60℃で作用し、最適温度は28〜32℃、
Ca²⁺存在下で38〜42℃。 2)pH10.0、15分間の処理で約23〜27℃まで、Ca²⁺存在下
で約28〜32℃まで安定。 3)少なくともpH５〜12で作用し、最適pHは約11。 4)20℃、15分間の処理でpH７〜12で安定。 5)SDS-PAGEによる推定分子量は37,000±1,000。 6)カゼインをよく加水分解し、ヘモグロビンとケラチン
に対しても作用する。Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNaとGlt-A
la-Ala-Pro-Leu-pNaに対して良く作用し、p-ニトロアニ
リンを遊離する。 7)Hg²⁺で阻害される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な低温アルカ
リプロテアーゼ、それを生産する微生物、その製造法、
並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物及び食品加工用
酵素製剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】各種起源のプロテアーゼは、衣料用洗浄
剤、自動食器洗浄機用洗剤、コンタクトレンズ洗浄剤、
浴用剤、角質除去用化粧料、食品の改質（製パン、肉の
軟化、水産加工）、ビールの清澄剤、皮革なめし剤、写
真フィルムのゼラチン除去、消化助剤、消炎剤の成分
等、多分野で盛んに利用されている。

【０００３】その中で、最も大量に工業生産され、市場
規模が大きいのは洗剤用アルカリプロテアーゼであり、
アルカラーゼ、サビナーゼ（ノボ・ノルディスク社
製）、マクサカル（ギスト・ブロケイデス社製）、ＡＰ
Ｉ−２１（昭和電工社製）、ブラップ（ヘンケル社
製）、プロテアーゼＫ（ＫＡＰ；花王社製）等が知られ
ている。しかしながら、これらの酵素は最適温度が高温
側にあるため、水道水の温度などの低温領域で衣料を洗
浄する場合、その酵素特性が充分に発揮されているとは
いいがたい。また、上述のプロテアーゼの応用分野のほ
とんどは、体温、室温、低温条件下であるため、高温至
適酵素の使用はなじまない。加えて、高温至適酵素を用
いる高温処理工程は、省エネルギーの観点からも好まし
いとはいえない。

【０００４】一方、低温至適プロテアーゼは、皮なめ
し、パンの小麦蛋白の加工、あるいは反応系に熱をかけ
られないようなケース、すなわちチーズの熟成、肉の軟
化等の食品の改質にも有効である。

【０００５】プロテアーゼの洗剤等の商品への配合や工
業的プロセス等での利用を考えた場合、室温から低温領
域で有効に作用する酵素を見出すことは、省エネルギー
化に加えて酵素の機能を充分発揮させる上で、必須の条
件である。これまでに、寒冷地土壌、寒冷環境に棲息す
る生物、海水、冷蔵中のミルク等から分離された、プロ
テアーゼ生産菌が生産するプロテアーゼは必ずしも低温
酵素ばかりではないが、数多くの報告例がある。

【０００６】すなわち、シュードモナス エスピー（Ps
eudomonas sp.）No.５４８株（Agric. Biol. Chem.,３
６巻，１１８５頁，１９７０年）、エシェリヒア フロ
インディ（Escherichia freundii）の一菌株（Eur. J.
Biochem.,４４巻，８７頁，１９７４年）、キサントモ
ナス マルトフィラ（Xanthomonas maltophila）０４７
／０８株（FEMS Microbiol. Lett.,７９巻，２５７頁，
１９９１）、シュードモナス フルオレセンス（Pseudo
monas fluorescens）Ｔ１６株（Appl. Environ. Microb
iol.,４６巻，３３３頁，１９８３年）、シュードモナ
ス フルオレセンスＡＦＴ３６株（Biochim. Biophys.
Acta,７１７巻，３７６頁，１９８２年）、シュードモ
ナス エスピー１４５−２株（Microbios.,３６巻，７
頁，１９８２年）、アエロモナス サルモニシダ（Aero
monas salmonicida）９０１６／０２株（J. Appl. Bact
eriol.,５３巻，２８９頁，１９８３年）、シュードモ
ナス パウシモビリス（Pseudomonas paucinomobilis）
０４９／０３株，１７８／１３株，１８９／０６株とバ
チルス エスピー（Bacillus sp.）１７２／１５株（J.
Basic Microbiol.,３１巻，３７７頁，１９９１年）、
ビブリオ エスピー（Vibrio sp.）ＳＡ１株（Antonie
van Leeuwenhoek,４４巻，１５７頁，１９７８年）、シ
ュードモナス フルオレセンスＮＣＤＯ２０８５株（J.
Dairy Res.,５３巻，４５７頁，１９８６年）、シュー
ドモナス フルオレセンスＯＭ２２８株とセラチア マ
ルセッセンス（Serratia marcescens）ＯＭ１１９２株
（J. Dairy Res.,５３巻，９７頁，１９８６年）、シュ
ードモナス フルオレセンスＧＲ８３株（Lebensm.-Wis
s. u.-Technol.,２３巻，１０６頁，１９９０年）、ペ
シロミセス マルクァンディ（Paecilomyces marquandi
i（ＷＯ８８／０３９４８）、キサントモナス エスピ
ー（Xanthomonas sp.）Ｓ−１株（特開平５−２１１８
６８号公報）等の低温で生育できる微生物が種々のプロ
テアーゼを生産する。

【０００７】低温細菌が生産するプロテアーゼに関して
は、Fairbainらが要領よく総説にまとめている（J. Dai
ry Res.,５３巻，１３９頁，１９８６年）。これらのプ
ロテアーゼの一部には、低温領域に至適温度を有してい
る酵素も存在しているので前述の用途に使えることが期
待できる。

【０００８】最近、Asgeissonらは、スケソウダラのエ
ラスターゼについて（Biochim. Biophys. Acta,１１６
４巻，９１頁，１９９３年）、Fellerらは、好冷細菌で
あるバチルス ＴＡ４１株の産生するプロテアーゼ（J.
Biol. Chem.,２６９巻，１７４５３頁，１９９４年）
と好冷細菌であるアルテロモナス ハロプランクティス
（Alteromonas haloplanctis）Ａ２３株が産生するα−
アミラーゼについて（J.Biol. Chem.,２６７巻，５２１
７頁，１９９２年）、それぞれの触媒化学的性質から、
これらの酵素が低温条件に適応している可能性を示唆し
た。また、Jackmanら（Appl. Environ. Microbiol.,４
６巻，６頁，１９８３年）あるいはPatelら（Appl. Env
iron. Microbiol.,４６巻，３３３頁，１９８３年）に
よると、好冷細菌であるシュードモナス フルオレセン
スが生産するプロテアーゼは、中温細菌由来のプロテア
ーゼと比較して、活性化エネルギーが低い。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】このように、従来、種
々の低温プロテアーゼが知られているが、更に洗浄剤等
に利用する上で、高性能の低温プロテアーゼの開発が望
まれている。従って本発明は、低温条件下においても高
い活性を保持し、かつ反応の最適pHがアルカリ側にある
新規な低温アルカリプロテアーゼを提供すること、並び
にかかる酵素を菌体外に効率よく生産する微生物及び当
該微生物を用いた低温アルカリプロテアーゼの製造法を
提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは低温アルカリプロテアーゼを自然界から探索
した結果、土壌サンプルから至適温度を２８〜３２℃に
有し、低温条件下（例えば０℃以下）でも充分に作用す
るアルカリプロテアーゼを生産するバチルス属細菌を見
出し、本発明を完成した。

【００１１】すなわち本発明は、以下の酵素学的性質を
有する低温アルカリプロテアーゼＴ１５、それを生産す
る微生物、その製造法、並びに当該酵素を含有する洗浄
剤組成物及び食品加工用酵素製剤を提供するものであ
る。

【００１２】１）作用温度及び最適温度 少なくとも０〜６０℃で作用し、最適温度は２８〜３２
℃である。１０℃で最適温度における活性の約２５〜３
５％、０℃で最適温度における活性の約１０〜２０％の
活性を保持する。Ｃａ²⁺が存在すると最適温度は３８〜
４２℃に移行する。

【００１３】２）温度安定性 pH１０．０、１５分間の処理条件で約２３〜２７℃まで
安定であり、Ｃａ²⁺が存在すると約２８〜３２℃まで安
定である。

【００１４】３）作用pH及び最適pH 少なくともpH５〜１２で作用し、最適pHは約１１であ
る。pH１２においても最大活性値の８５〜９５％の活性
を保持する。

【００１５】４）pH安定性 ２０℃、１５分間の処理条件でpH７〜１２の範囲で安定
である。

【００１６】５）分子量 ソジュウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による推定分子量は、３７，０００±
１，０００である。

【００１７】６）基質特異性 カゼインをよく加水分解し、ヘモグロビンとケラチンに
対しても作用する。合成基質であるSuc-Ala-Ala-Pro-Ph
e-pNaとGlt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNaに対して良く作用し、
Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNa、Z-Gly-Gly-Phe-pNa、Suc-Al
a-Ala-Ala-pNa、Suc-Ala-Pro-Ala-pNa及びSuc-Ala-Ala-
Phe-pNaに対しても若干作用し、ｐ−ニトロアニリンを
遊離する（Sucはスクシニル基を、Gltはグルタリル基
を、Zはカルボベンゾイル基を、pNaはｐ−ニトロアニリ
ノ基を示す）。

【００１８】７）金属イオンの影響 Ｈｇ²⁺によって阻害される。

【００１９】８）阻害剤 エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコ
ールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（ＥＧＴ
Ａ）、フェニルメタンスルフォニルフルオライド（ＰＭ
ＳＦ）及びキモスタチンによって阻害される。

【００２０】９）界面活性剤の影響 ソジュウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）、ソジュウムα−オ
レフィンスルホン酸（ＡＯＳ）、ソジュウムアルカンス
ルホン酸（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸エステル（α−
ＳＦＥ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ａ
Ｅ）、ソジュウム直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（Ｌ
ＡＳ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナト
リウム（ＥＳ）等に対して極めて安定である。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明の低温アルカリプロテアー
ゼＴ１５は、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１
５を培養し、その培養物から採取することにより製造さ
れる。

【００２２】本発明のバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｔ
１５の分類同定に用いた培地を以下に示す（重量％で示
す）。

【００２３】培地１．ニュートリエントブロス，０．
８；寒天末（和光純薬社製），１．５ 培地２．ニュートリエントブロス，０．８ 培地３．ニュートリエントブロス，０．８；ゼラチン，
２．０；寒天末（和光純薬社製），１．５ 培地４．バクトリトマスミルク，１０．５ 培地５．ニュートリエントブロス，０．８；KNO₃ ０．
１ 培地６．バクトペプトン，０．７；NaCl，０．５；ブド
ウ糖，０．５ 培地７．ＳＩＭ寒天培地（栄研化学社製），指示量 培地８．ＴＳＩ寒天培地（栄研化学社製），指示量 培地９．バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．
５；可溶性澱粉，２．０；K₂HPO₄, ０．１；MgSO₄・7H₂
O，０．０２；寒天末（和光純薬社製），１．５ 培地10．Koserの培地（栄研化学社製），指示量 培地11．Christensenの培地（栄研化学社製），指示量 培地12．１．酵母エキス，０．０５；ブドウ糖１．０；
KH₂PO₄，０．１；Na₂SO₄，０．１ ２．酵母エキス，０．０５；ブドウ糖，１．０；KH₂P
O₄，MgSO₄・7H₂O，０．０２；CaCl₂・2H₂O，０．０５；
FeSO₄・7H₂O，０．００１；MnSO₄・4-6H₂O，０．００１ 窒素源として、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、塩
化アンモニウム及びリン酸アンモニウムを上記１及び２
の培地に加えて用いた。 培地13．キングＡ培地“栄研”（栄研化学社製），指示
量 培地14．キングＢ培地“栄研”（栄研化学社製），指示
量 培地15．尿素培地“栄研”（栄研化学社製），指示量 培地16．チトクロム・オキシダーゼ試験紙濾紙（日水製
薬社製） 培地17．３％過酸化水素水 培地18．バクトペプトン，１．５；酵母エキス，０．
５；KH₂PO₄，０．１；ブドウ糖，１．０；MgSO₄・7H
₂O，０．０２ 培地19．ペナッセイブロス（ディフコ社製），指示量 培地20．バクトペプトン，２．７；NaCl, ５．５；ブド
ウ糖，０．５；K₂HPO₄，０．１；ブロムチモールブル
ー，０．０６；寒天末，（和光純薬社製），１．５ 培地21．(NH₄)₂HPO₄，０．１；KCl，０．０２；MgSO₄・
7H₂O，０．０２，酵母エキス，０．０５；糖，１．０ 培地22．カゼイン，０．５；酵母エキス，０．０５；ブ
ドウ糖，１．０；KH₂PO₄，０．１；MgSO₄・7H₂O，０．
０２；寒天末（和光純薬社製），１．５

【００２４】バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１５の分
類学的性質を以下に示す。

【００２５】（ａ）顕微鏡的観察結果 １．１〜１．４μm ×５．４〜８．８μm の桿菌であ
り、周鞭毛を有し、運動性がある。楕円形の胞子の形成
が認められる。

【００２６】（ｂ）グラム染色性 陽性。

【００２７】（ｃ）各種培地における生育状態 １．肉汁寒天平板培養（培地１） 良好な生育をする。集落の形状は円形、表面は円滑で光
沢がある。集落の色調は、黄色である。 ２．肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。 ３．肉汁液体培養（培地２） 生育は良好で、菌膜の形成は認められない。 ４．肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育不良。 ５．リトマスミルク培地（培地４） 酸生成は認められない。

【００２８】（ｄ）生理学的性質 １．硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５） いずれも陰性。 ２．ＶＰテスト（培地６） 陰性。 ３．インドールの生成（培地７） 陰性。 ４．硫化水素の生成（培地８） 陰性。 ５．澱粉の加水分解（培地９） 陽性。 ６．クエン酸の利用（培地１０、１１） 陽性。 ７．無機窒素源の利用（培地１２） アンモニウム塩を利用する。 ８．色素の生成（培地１３、１４） 陰性。 ９．ウレアーゼ（培地１５） 陰性。 10．オキシダーゼ（培地１６） 陽性。 11．カタラーゼ（培地１６） 陽性。 12．生育のpH範囲（培地１８） 生育のpH範囲は５〜１１である。生育の至適pH範囲は８
〜９にある。 13．生育の温度範囲（培地１、１９） 生育の温度範囲は５〜５０℃であり、最も生育が旺盛な
温度は３０〜４０℃の間にある。 14．酸素に対する態度（培地２０） 好気的。 15．Ｏ−Ｆテスト（培地２１） 発酵型。 16．糖の利用性 Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトー
ス、マルトース、シュクロース、ラフィノース、可溶性
澱粉等を利用することができる。 17．食塩含有培地における生育（培地１中） 食塩濃度７％では生育するが、１０％では生育できな
い。 18．カゼインの分解（培地２２） 陽性。

【００２９】以上の菌学的性質に関する検討に基づき、
バージーズ・マニュアル・オブ・システマティク・バク
テリオロジー（Bergey's Mannual of Systematic Bacte
riology）第８版を参照し、比較検討した結果、本菌株
は、バチルス属の一種と判断された。そこで、本菌株を
バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１５と命名し、ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１５４５６として工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託した。

【００３０】上記の菌株を用いて、本発明の低温アルカ
リプロテアーゼＴ１５を得るには、培地に菌株を接種
し、常法に従って培養すればよい。

【００３１】培養に用いる培地中には、資化しうる炭素
源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが望まし
い。この炭素源及び窒素源は特に制限されないが、その
例としては、炭素源として可溶性澱粉、及びこれらの分
解物やその他の資化しうる炭素源、例えばグルコース、
ガラクトース、フラクトース、マルトース、シュクロー
ス、ラフィノース、廃糖蜜や資化うしる有機酸、例えば
クエン酸等が挙げられる。また窒素源としては、コーン
グルテンミール、大豆粉、コーンスティープリカー、カ
ザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、肉エキス、
トリプトン、ソイトン、ポリペプトン、ソイビーンミー
ル、綿実油粕、カルチベータ、ゼスト等の有機窒素源が
有効である。また、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム
塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれば、無機、有
機微量栄養やビタミン類を培地中に適宜添加することが
できる。

【００３２】培養温度は、５〜５０℃、特に１５〜３０
℃前後が好ましく、培養初発pHは５〜１１、特にpH８〜
９が好ましい。この条件下において通常１〜３日間で培
養は完了する。

【００３３】かくして得られた培養液の中から目的の酵
素である低温アルカリプロテアーゼＴ１５を採取するに
は、一般の酵素採取の手段に準じて行えば良い。即ち、
培養後、遠心分離、濾過等の通常の分離手段により菌体
を培養液から除去して粗酵素液を得る。この粗酵素液は
そのまま使用することもできるが、必要に応じて、限外
濾過、沈澱法等の手段により回収し、適当な方法を用い
て粉末化して用いることもできる。また、酵素精製の一
般的手段、例えば適当な陽イオン交換樹脂、陰イオン交
換樹脂、ヒドロキシアパタイト等によるクロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマ
トグラフィー、ゲル濾過等の組合わせによって精製する
こともできる。

【００３４】本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１５
の酵素学的諸性質について以下に説明する。

【００３５】〔酵素活性測定法〕カゼイン１％を含む５
０mMの各種緩衝液１mlを０．１mlの酵素溶液と混合し、
２５℃、１５分間反応させた後、反応停止液（０．１１
Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３
３Ｍ酢酸）２mlを加え、３０℃、２０分間放置した。次
に濾紙（ワットマン社製、Ｎｏ．２）で濾過し、濾液中
の蛋白分解物をフォーリン・ローリー法（Lowry, O. H.
et al., J. Biol. Chem.,１９３巻，２６５頁，１９５
１年）によって測定した。上記反応条件下において、１
分間に１mmolのチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物
を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とした。

【００３６】合成基質の加水分解反応を行う場合は、５
５．５mM炭酸緩衝液（pH１０．０、０．９ml）に５０mM
の各種合成基質溶液（ジメチルスルホキシドに溶解）
０．０５mlを混合し、２５℃で５分間保温した後、０．
０５mlの酵素液を加え２５℃で５分間反応させた。反応
停止液（５％クエン酸）２mlを加えた後、分光光度計を
用いて直ちに４２０nmにおける吸光度を測定し、遊離し
たｐ−ニトロアニリンを定量した。酵素１単位（Ｕ）は
上記反応条件において１分間に１μmol のｐ−ニトロア
ニリンを遊離させるのに必要な酵素量とした。

【００３７】〔酵素学的性質〕 （１）基質特異性 ５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に各種蛋白基質を０．
１％又は１％になるように加えた後、酵素を適当量添加
して２５℃で１５分間反応を行った。カゼインを基質と
した場合の分解活性を１００として、それぞれの基質に
対する分解活性を表１に示した。この結果から明らかな
ように、本酵素はカゼイン、ヘモグロビン及びケラチン
に対して良好な分解活性を示した。

【００３８】

【表１】

【００３９】ｐ−ニトロアニリンが結合した合成オリゴ
ペプチド基質を用いて、これらの分解活性を調べた結果
を表２に示した。供試したＮ−スクシニル化したAla-Al
a-Pro-Phe、Ala-Ala-Pro-Val、Ala-Ala-Ala、Ala-Pro-A
la及びAla-Ala-Phe、Ｎ−グルタリル化したAla-Ala-Pro
-Leu、Ｎ−カルボベンゾイル化したGly-Gly-Phe等の合
成基質からのｐ−ニトロアニリンの遊離が認められた。

【００４０】

【表２】

【００４１】（２）作用温度及び最適温度 基質として０．９１％のカゼインを含む５０mM炭酸緩衝
液（pH１０．０）に本酵素を加え、１５分間各温度で反
応を行った。図１から明らかなように、本酵素の最適温
度は２８〜３２℃であった。カルシウム（CaCl₂として
２mM）が存在すると、最適温度は約３８〜４２℃に移行
し、カルシウム非存在下の最適温度に比べ、約１．５倍
の活性促進が認められた。また本酵素は１０℃でも最適
温度の活性の約２５〜３５％の活性を示し、０℃（氷水
中）でも最適温度の活性の約１０〜２０％の活性を示
し、低温条件下でも充分作用することがわかる。

【００４２】（３）温度安定性 ５０mM炭酸緩衝液（pH１０．０）に本酵素を加え、各温
度で１５分間加熱した後氷冷した。カゼインを基質とし
て、２５℃で残存活性を求め、その結果を図２に示し
た。本酵素はＣａ²⁺非存在下で２３〜２７℃まで、２mM
Ｃａ²⁺存在下で２８〜３２℃まで安定であった。

【００４３】（４）作用pH及び最適pH ブリットン・ロビンソン広域緩衝液（５０mM）中に最終
濃度０．９１％となるようにカゼインを加え、２５℃で
１５分間反応を行い、各pHでの活性を測定した。図３か
ら明らかなように、本プロテアーゼは好アルカリ性酵素
であって、最適pHは１１近傍に認められる。また、その
作用pHは、少なくともpH５〜１２と幅広い。pH１２にお
いても最大活性値の８５〜９５％の活性を保持する。

【００４４】（５）pH安定性 ブリットン・ロビンソン広域緩衝液（２５mM，各pH）中
に本酵素を加え、２０℃で１５分間放置し、カゼインを
基質として残存活性を２５℃で測定した。図４に示した
ように、本酵素はpH７〜１２の広い範囲で安定であっ
た。

【００４５】（６）分子量 本酵素の分子量をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法により測定した。分子量マーカーには、低分子量
用マーカーキット（ファルマシア社製）のホスホリラー
ゼｂ（分子量：９４，０００）、アルブミン（分子量：
６７，０００）、オブアルブミン（分子量：４３，００
０）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量：３０，０
００）、トリプシンインヒビター（分子量：２０，１０
０）及びα−ラクトアルブミン（分子量：１４，４０
０）を用いた。本精製プロテアーゼ標品は電気泳動的に
均一であり、その分子量は３７，０００±１，０００と
推定された（図５）。

【００４６】（７）金属イオンの影響 各種金属塩が１mMになるように添加した２０mM炭酸緩衝
液（pH１０．０）に本酵素溶液を添加し、２０℃で２０
分間放置した。その後、５０mM炭酸緩衝液（pH１０．
０）で適当希釈を行い、残存活性を測定した。金属塩無
添加系で同様に処理した酵素活性を１００％として処理
群の残存活性を求めた。本酵素活性は、Ｈｇ²⁺によって
のみ阻害された（表３）。

【００４７】

【表３】

【００４８】（８）阻害剤の影響 １０mMリン酸緩衝液（pH７．０；２mM CaCl₂含有）に各
種阻害剤を所定濃度になるように加え、本酵素を添加
し、２０℃で２０分間放置した後、残存活性を測定し
た。表４から明らかなように、キレート剤であるＥＤＴ
ＡとＥＧＴＡ及びセリン酵素阻害剤であるＰＭＳＦ及び
キモスタチンによって阻害されることより、本酵素は金
属依存性セリンプロテアーゼであると考えられる。

【００４９】

【表４】

【００５０】（９）界面活性剤の影響 本酵素を、０．２％の界面活性剤を含有する５０mM炭酸
緩衝液（pH１０．０；２mM CaCl₂含有）に加えて、２０
℃で２０分間放置した後、残存活性を測定した。表５か
ら明らかなように、本酵素はＳＤＳ、ＡＯＳ、ＳＡＳ、
α−ＳＦＥ、ＡＥ、ＬＡＳ、ＥＳ（それぞれ０．２％濃
度）等の界面活性剤と長時間接触させてもほとんど失活
せず、強力な界面活性剤耐性を有していることがわか
る。

【００５１】

【表５】

【００５２】このように、本発明の低温アルカリプロテ
アーゼＴ１５は、過去の報告に無い新規酵素である。最
近、南極の海水から分離されたバチルス属の一種が熱に
不安定なズブチリシン型の酵素を生産することが報告さ
れているが（Davailら、J. Biol. Chem.,２６９巻，１
７４４８頁（１９９４年））最適温度が４０℃近傍にあ
り、その他の性質を較べても明らかに本発明の酵素とは
異なっている。

【００５３】本発明の洗浄剤組成物中への上記低温アル
カリプロテアーゼＴ１５の配合量は、低温アルカリプロ
テアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、
洗浄剤組成物１kg当たり０．１〜５０００Ｕ、特に１〜
５００Ｕが好ましい。

【００５４】また、本発明の洗浄剤組成物には、公知の
洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄成分
としては、例えば次のものが挙げられる。

【００５５】（１）界面活性剤 平均炭素数１０〜１６のアルキル基を有する直鎖アルキ
ルベンゼンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖
又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均０．５
〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエト
キシ硫酸塩、平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有す
るアルキル硫酸塩、平均炭素数１０〜２０のオレフィン
スルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０のアルカンスルホ
ン酸塩、平均炭素数１０〜２０のα−スルホ脂肪酸メチ
ルあるいはエステル塩、平均炭素数８〜２０の高級脂肪
酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキ
ル基を有し、１分子中に平均０．５〜８モルのエチレン
オキサイドを付加したアルキルエーテルカルボン酸塩等
のアニオン性界面活性剤；平均炭素数１０〜２０のアル
キル基を有し、１〜２０モルのエチレンオキサイドを付
加したポリオキシエチレンアルキルエーテル、高級脂肪
酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキサイド付
加物等の非イオン性界面活性剤；その他ベタイン型両性
界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エス
テル系界面活性剤、アミノ酸型界面活性剤、カチオン性
界面活性剤等の界面活性剤を単独で又は組合わせて用い
ることができる。

【００５６】これらの界面活性剤は、洗浄剤組成物中５
〜６０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体
状洗浄剤組成物については１０〜４５％、液体洗浄剤組
成物については２０〜５５％配合することが好ましい。
また、本発明洗浄剤組成物が漂白剤である場合、界面活
性剤は一般に１〜１０％、好ましくは１〜５％配合され
る。

【００５７】（２）二価金属イオン捕捉剤 トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩等の
縮合リン酸塩、ゼオライト等のアルミノケイ酸塩、合成
層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジア
ミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセ
タールカルボン酸塩等を任意に用いることができる。

【００５８】この二価金属イオン捕捉剤は、０〜５０
％、好ましくは５〜４０％配合される。また、リンを含
有しない二価金属イオン捕捉剤を用いることがより好ま
しい。

【００５９】（３）アルカリ剤及び無機塩 ケイ酸塩、炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、アルカノー
ルアミン等を任意に用いることができる。これらは０〜
８０％配合される。

【００６０】（４）再汚染防止剤 ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸塩、ポリアク
リル酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、カルボキシ
メチルセルロース等を任意に用いることができる。再汚
染防止剤は０〜１０％、好ましくは１〜５％配合され
る。

【００６１】（５）酵素 セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ヘ
ミセルラーゼ、β−グルコシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、低温アルカリプ
ロテアーゼＴ１５以外のプロテアーゼ等の酵素を任意に
用いることができる。低温アルカリプロテアーゼＴ１５
はセルラーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ等の酵素と併用
すれば洗浄力をいっそう向上させることができる。

【００６２】（６）水道水中の有効塩素の捕捉剤又は還
元剤 有効塩素の捕捉剤として、硫酸アンモニウム、尿素、塩
酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸グアニ
ジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、ジエタ
ノールアミン、トリエタノールアミン、またグリシング
ルタミン酸ナトリウム等で代表されるアミノ酸及び牛血
清アルブミン、カゼイン等の蛋白質、更には蛋白質の加
水分解、肉エキス、魚肉エキス等が挙げられる。

【００６３】還元剤としては、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、
亜二チオン酸塩等のアルカリ金属塩、アルカリ土壌金属
塩等、ロンガリットＣ等が挙げられる。

【００６４】（７）漂白剤 過炭酸塩、過硼酸塩、スルホン化フタロシアニン亜鉛塩
又はアルミニウム塩、過酸化水素等、漂白作用を有する
ものであればよい。

【００６５】（８）蛍光染料 通常洗浄剤に用いられる蛍光染料。

【００６６】（９）可溶化剤 液体洗剤の場合には次のような可溶化剤を用いることが
できる。エタノール等の低級アルコール、ベンゼン、ス
ルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等の低級アルキ
ルベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコール等のポ
リオール類など。

【００６７】（10）その他 上記以外に、香料、ケーキング防止剤、酵素の活性化
剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性
化剤等の洗剤に常用の成分を必要に応じて配合すること
ができる。

【００６８】本発明の洗浄剤組成物の形態は、用途に応
じて選択することができ、例えば液体、粉末、顆粒等と
することができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料
用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、排水管洗浄剤、義
歯洗浄剤、漂白剤等として使用することができる。

【００６９】また、本発明の低温アルカリプロテアーゼ
Ｔ１５は、パンの小麦蛋白の加工、食肉の軟化、チーズ
の熟成等の食品加工や、皮なめしなどにも利用すること
ができる。

【００７０】本発明の低温アルカリプロテアーゼＴ１５
を食品加工に用いるには、低温アルカリプロテアーゼＴ
１５をそのまま、又は粉末状もしくは粒状の食品加工用
酵素製剤として、使用することができる。かかる食品加
工用酵素製剤には、低温アルカリプロテアーゼＴ１５の
ほか、澱粉類、蛋白質類、糖類、調味料、エステル類等
を配合することができる。

【００７１】

【実施例】以下、実施例を挙げて更に詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００７２】実施例１ 土壌サンプル約１ｇを生理食塩水（１０ml）に懸濁し、
８０℃で１０分間熱処理を行った後、以下に示した組成
を有するプロテアーゼ生産判定プレートに塗抹し、２０
℃で５〜７日間培養した。生育した集落の周囲に卵黄の
分解によって生じた凹みを指標としてプロテアーゼ生産
菌を分離した。得られた分離株の中から、低温プロテア
ーゼ生産性を調べ、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１
５を選抜した。

【００７３】 プロテアーゼ生産判定プレート 酵母エキス（ディフコ社製） ２ｇ リン酸一カリウム １ｇ 硫酸マグネシウム ０．２ｇ 卵黄（フナコシ社製） １０ｇ グルコース ５ｇ カルボキシメチルセルロース ５ｇ 寒天 １５ｇ ＊炭酸ナトリウム ２ｇ イオン交換水 １リットル ＊：別滅菌 （pH１０．０）

【００７４】実施例２ 実施例１で得られたバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１
５株を下に示した液体培地で好気的に２０℃、２日間培
養した。培養後、遠心分離（１２，０００×ｇ，２０分
間）して得られた上清液を１０mMトリス−塩酸緩衝液
（pH７．５；２mMCaCl₂含有）で５℃、一昼夜透析し
た。透析内液のプロテアーゼ活性を、カゼイン基質とし
て２０℃で測定したところ（５０mM炭酸緩衝液中，pH１
０．０）、０．６〜１Ｕ／ｌ培養液に相当するプロテア
ーゼの生産が認められた。

【００７５】 液体培地 ポリペプトンＳ １０ｇ 酵母エキス ０．５ｇ リン酸一カリウム １．０ｇ 硫酸マグネシウム ０．２ｇ ＊グルコース ５ｇ ＊炭酸ナトリウム ２．６ｇ イオン交換水 １．０リットル ＊：別滅菌 （pH９．３）

【００７６】実施例３ バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｔ１５株を実施例２の液
体培地に接種し、２０℃で４０時間培養した。培養後、
１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５；２mM CaCl₂含
有）に対し５℃で一昼夜透析した。この透析内液を凍結
乾燥し、乾燥終了後、少量のイオン交換水で溶解し、同
平衡緩衝液（pH７．５；２mM CaCl₂含有）に対し５℃で
一昼夜透析し濃縮液とした。この濃縮液を平衡化したセ
ファクリルＳ−２００スーパーファイン（ファルマシア
社製）のカラムでゲルクロマトグラフィーを行った。得
られた活性画分を最終酵素標品として使用した。この結
果、約３〜４倍まで精製された（回収率約８０％）。本
精製標品を常法に従ってＳＤＳ電気泳動（１２．５％ア
クリルアミドゲル）を行ったところ、図５（ｂ）に示し
たように均一であることが確認された。

【００７７】実施例４ 洗浄試験 本発明の洗浄剤組成物を用い、以下の洗浄試験を行っ
た。 （１）洗剤 表６に示す配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を調
製して用いた。

【００７８】

【表６】

【００７９】（２）汚染布 ｉ）人工汚染布 スイス国立産業資材試験研究機関作製の市販人工汚染布
ＥＭＰＡ１１６（血液／ミルク／カーボン汚れ）を実験
に供した。 ii）天然襟布汚染布 木綿金布（＃２０２３布）をワイシャツの襟に縫い付
け、青年男子に３日間着用させる。着用後２５℃、６５
％ＲＨに１ケ月放置後、汚れの程度を三段階に分け、こ
のうち最も汚れのひどいもののうち、中心点に対して汚
れが対称な布を選び出し、この汚れの対称点で布を半裁
し、実験に供した。

【００８０】（３）洗浄条件及び方法 ｉ）人工汚染布の洗浄 ＥＭＰＡ１１６を８×８cm程に裁断後、表６に示す配合
組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗剤を０．０８３３％に
なるように４°ＤＨの水にて調整後、２０℃で１時間浸
漬を行った。浸漬終了後、ターゴットメーター（上島製
作所社製）を使用し、１リットル、２０℃、１００rp
m、１０分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、色彩色差計
ＣＲ−３００（ミノルタ社製）で明度を測定し、酵素未
添加の洗浄系による明度を１００とした場合の比率を洗
浄力指数として表した。

【００８１】ii）天然汚染布のターゴットメーターによ
る洗浄 天然襟布汚染布を１１×１３cm程に裁断後、表６に示す
配合組成の弱アルカリ性粉末衣料用洗浄剤を０．０８３
３％になるように４°ＤＨの水にて調整後、２０℃、１
時間浸漬を行った。浸漬終了後ターゴットメーター（上
島製作所社製）を使用し、１リットル、２０℃、１００
rpm、１０分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、一対の襟
布（１５組）を見比べ、汚れ落ちの程度を３名の熟練し
た判定者によりそれぞれ肉眼で判定を行った。判定方法
は、汚れがほぼ完全に落ちている場合を５点、汚れがほ
とんど落ちていない場合を１点とし、１５枚の襟布の合
計評価点を求め、酵素未添加の洗浄系による評価点を１
００とした場合の比率を洗浄液指数として表した。

【００８２】ii）天然汚染布の洗濯機による洗浄 ９×３０cm程の天然汚染布を対称の位置で半裁し、９×
１５cmの一対の汚染布の一方を基準洗剤である酵素無添
加洗剤で洗浄し、片方を比較洗剤である本発明の低温ア
ルカリプロテアーゼＴ１５を含有する洗剤でそれぞれ洗
浄した。まず、天然汚染布片１５枚を５０×５０cmの綿
布に縫い付け、６リットルの表６に示す配合組成の弱ア
ルカリ性粉末衣料用洗剤０．４１７％の洗剤溶液に、こ
の汚染布と綿製肌着を合わせて１kg入れ、２０℃で１時
間浸漬後、東芝社製製洗濯機（銀河）に移し、全量を３
０リットルとした後、強反転で１０分間洗浄した。濯
ぎ、乾燥後、基準洗剤で洗った半裁布と本発明の低温ア
ルカリプロテアーゼＴ１５を含有する洗剤で洗った半裁
布とを肉眼判定による一対比較で評価した。汚れの程度
を表す１０段階にランクづけした標準汚れを基準にし、
洗浄布をランクづけした。洗浄性は基準洗剤の洗浄力を
１００としたときの本発明の低温アルカリプロテアーゼ
Ｔ１５を含有する洗剤の洗浄力の点数を表した。洗浄力
指数の差は０．５以上で有意の差とみなすことができ
る。

【００８３】（４）結果 以上の洗浄試験の結果を表７に示す。

【００８４】

【表７】

【００８５】

【発明の効果】本発明のプロテアーゼは、作用最適温度
を低温領域に有し、界面活性剤によってもほとんど阻害
を受けず、また、酸性から高アルカリ溶液中で幅広く安
定である。従って、本酵素は洗浄剤組成物の配合成分と
して、低温下で有利に使用できるものである。また、低
温条件下における、皮なめしや、パンの小麦蛋白の加
工、食肉の軟化、チーズの熟成といった食品の改質にも
有効である。

【００８６】また、本酵素の生産菌はバチルス属細菌の
一種であることから、培養条件の検討、突然変異やホス
ト−ベクター系（ＥＫ系やＢＳ系）等の育種により、著
量の本発明酵素を菌体外生産することも可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】低温アルカリプロテアーゼＴ１５の温度−活性
曲線を示す図である。

【図２】低温アルカリプロテアーゼＴ１５の温度安定性
を示す図である。

【図３】低温アルカリプロテアーゼＴ１５のpH活性曲線
を示す図である。

【図４】低温アルカリプロテアーゼＴ１５のpH安定性を
示す図である。

【図５】低温アルカリプロテアーゼＴ１５の分子量の測
定結果を示す図である。（ａ）は分子量とＳＤＳ電気泳
動距離の相関を示し、（ｂ）は酵素標品のＳＤＳ電気泳
動（１２．５％アクリルアミドゲル）を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 伊藤 進 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の酵素学的性質を有する低温アルカリ
   プロテアーゼＴ１５。 １）作用温度及び最適温度 少なくとも０〜６０℃で作用し、最適温度は２８〜３２
   ℃である。１０℃で最適温度における活性の約２５〜３
   ５％、０℃で最適温度における活性の約１０〜２０％の
   活性を保持する。Ｃａ²⁺が存在すると最適温度は３８〜
   ４２℃に移行する。 ２）温度安定性 pH１０．０、１５分間の処理条件で約２３〜２７℃まで
   安定であり、Ｃａ²⁺が存在すると約２８〜３２℃まで安
   定である。 ３）作用pH及び最適pH 少なくともpH５〜１２で作用し、最適pHは約１１であ
   る。pH１２においても最大活性値の８５〜９５％の活性
   を保持する。 ４）pH安定性 ２０℃、１５分間の処理条件でpH７〜１２の範囲で安定
   である。 ５）分子量 ソジュウムドデシル硫酸−ポリアクリルアミドゲル電気
   泳動法による推定分子量は、３７，０００±１，０００
   である。 ６）基質特異性 カゼインをよく加水分解し、ヘモグロビンとケラチンに
   対しても作用する。合成基質であるSuc-Ala-Ala-Pro-Ph
   e-pNaとGlt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNaに対して良く作用し、
   Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNa、Z-Gly-Gly-Phe-pNa、Suc-Al
   a-Ala-Ala-pNa、Suc-Ala-Pro-Ala-pNa及びSuc-Ala-Ala-
   Phe-pNaに対しても若干作用し、ｐ−ニトロアニリンを
   遊離する（Sucはスクシニル基を、Gltはグルタリル基
   を、Zはカルボベンゾイル基を、pNaはｐ−ニトロアニリ
   ノ基を示す）。 ７）金属イオンの影響 Ｈｇ²⁺によって阻害される。 ８）阻害剤 エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコールビス（２
   −アミノエチルエーテル）四酢酸、フェニルメタンスル
   フォニルフルオライド及びキモスタチンによって阻害さ
   れる。 ９）界面活性剤の影響 ソジュウムドデシル硫酸、ソジュウムα−オレフィンス
   ルホン酸、ソジュウムアルカンスルホン酸、α−スルホ
   脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテ
   ル、ソジュウム直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ポリ
   オキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム等に対
   して極めて安定である。
2. 【請求項２】 バチルス エスピー（Bacillus sp.）Ｋ
   ＳＭ−Ｔ１５と命名され、ＦＥＲＭ Ｐ−１５４５６と
   して寄託された請求項１記載の低温アルカリプロテアー
   ゼＴ１５を生産する微生物。
3. 【請求項３】 請求項２記載の微生物を培養し、その培
   養物から当該低温アルカリプロテアーゼを採取すること
   を特徴とする請求項１記載の低温アルカリプロテアーゼ
   Ｔ１５の製造法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の低温アルカリプロテアー
   ゼＴ１５を含有する洗浄剤組成物。
5. 【請求項５】 請求項１記載の低温アルカリプロテアー
   ゼＴ１５を含有する食品加工用酵素製剤。