JPH09238684A - 耐熱性ＡＴＰアーゼαおよびβサブユニット遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列、
又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同
一なＤＮＡ塩基配列を有する耐熱性ＡＴＰアーゼαおよ
びβサブユニット遺伝子。 【効果】 耐熱性試薬、バイオリアクターにおけるＡＴ
Ｐ供給酵素として有用な耐熱性ＡＴＰアーゼをコードす
る遺伝子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、耐熱性を示し、試
薬やＡＴＰ供給型バイオリアクターのＡＴＰ生成に有用
な酵素であるＡＴＰアーゼのサブユニットを構成する遺
伝子に関する。本サブユニットをコードするＤＮＡを組
み込んだ組み換え体ＤＮＡを含む微生物や培養細胞を培
養液中で培養し、該培養物中に蓄積される該蛋白質を採
集することにより得られる該蛋白質は、安定性の高い試
薬やバイオリアクターのＡＴＰの供給源として利用する
ことができる。

【０００２】

【従来の技術】これまで市販されているＡＴＰアーゼ
は、例えばシグマ社から４種類が上市されているが（シ
グマ社1995年度カタログ48ページ）、いずれも反応至適
温度が37℃と低く、４℃あるいは−20℃という低温で保
存する必要があった。またいずれも動物の臓器から調製
しており、供給源の確保にも問題があった。さらに種々
のＡＴＰ共役型バイオリアクターが考案されているが
（例えば、戸田 清著、バイオテクノロジーの話、pp15
3-154 、日刊工業新聞社、1983年、あるいは永田和彦、
中島 宏、耐熱性酵素の新しい利用、化学と生物、32，
120-124,(1994)) 安定性に優れたＡＴＰアーゼがなく、
効率が良くないことから、その実用性に問題があった。

【０００３】本発明者らは、それまで報告されていた最
も高い至適温度を持つサルファロブス・アシドカルダリ
ウス（Sulfolobus acidocaldarius ）由来の酵素（Koni
shiet al, J.Biochem.,102, 1379-1387(1987)) の至適
温度である85℃を上回る90℃に反応至適温度を持つ新規
ＡＴＰアーゼを超好熱硫黄依存菌に分類されるサーモコ
ッカス（Thermococcus）属に見い出し、先に出願を行っ
た（特願平6-279451号明細書) 。しかしながら、例え
ば、サーモコッカスKI株、KS-1株、KS-2株では10Ｌスケ
ールで90℃、８時間の培養で1.5g程度の菌体しかとれ
ず、酵素取得の効率の点で問題があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子工学
の手法を用いて耐熱性ＡＴＰアーゼを生産すべく、その
生産のもととなる遺伝子を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】ＡＴＰアーゼαおよびβ
サブユニットをコードする遺伝子の全配列を得るため
に、精製ＡＴＰアーゼ蛋白質由来の70kDa のサブユニッ
ト（αサブユニット）および60kDa のサブユニット（β
サブユニット）蛋白質を単離、Ｎ末端アミノ酸配列を決
定し、それらの配列および他の古細菌のＡＴＰアーゼ遺
伝子のホモロジーの高いアミノ酸配列をもとにプライマ
ーを合成し、ＰＣＲ法によりＡＴＰアーゼ遺伝子の断片
を取得するとともに、これをプローブとしてゲノムＤＮ
Ａライブラリーのスクリーニングを行い、ＡＴＰアーゼ
両サブユニット全長をコードするクローンを取得してそ
の塩基配列を決定し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、配列番号１で表され
るＤＮＡ塩基配列、又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩
基配列と実質的に同一なＤＮＡ塩基配列を有する耐熱性
ＡＴＰアーゼαサブユニット遺伝子である。また、本発
明は、配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列、又は配列
番号２で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同一なＤＮ
Ａ塩基配列を有する耐熱性ＡＴＰアーゼβサブユニット
遺伝子である。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
耐熱性ＡＴＰアーゼαサブユニット遺伝子は、配列番号
１で表されるＤＮＡ塩基配列、又は配列番号１で表され
るＤＮＡ塩基配列と実質的に同一なＤＮＡ塩基配列を有
する。ここで、「配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列
と実質的に同一なＤＮＡ塩基配列」とは、配列番号１で
表されるＤＮＡ塩基配列の幾つかのヌクレオチド残基に
ついて、欠失、置換、付加等の変化が生じた配列であっ
て、ＡＴＰアーゼαサブユニットとして作用し得るポリ
ペプチドをコードする配列をいう。

【０００８】また、本発明の耐熱性ＡＴＰアーゼβサブ
ユニット遺伝子は、配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配
列、又は配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的
に同一なＤＮＡ塩基配列を有する。ここで、「配列番号
２で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同一なＤＮＡ塩
基配列」とは、配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列の
幾つかのヌクレオチド残基について、欠失、置換、付加
等の変化が生じた配列であって、ＡＴＰアーゼβサブユ
ニットとして作用し得るポリペプチドをコードする配列
をいう。

【０００９】本発明の遺伝子は以下の手順で得ることが
できる。まず、耐熱性ＡＴＰアーゼを生産できる微生
物、例えば、サーモコッカスKI株、KS-1株、KS-2株など
を培養、集菌後菌体を破砕し、膜画分を調製、可溶化後
各種クロマトグラフィーによってＡＴＰアーゼを精製す
る。この精製ＡＴＰアーゼをＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離し、疎水性の膜であるＰＶＤＦ
膜等に電気的に転写する。クマシーブリリアントブルー
Ｒ-250等の色素で検出されるバンドを切り出した後、プ
ロテインシークエンサーによりＮ末端からのアミノ酸配
列を決定しその配列に基づいてプローブを合成する。

【００１０】一方、耐熱性ＡＴＰアーゼ生産菌のゲノム
ＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断後、適当なベク
ターに連結し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。
ベクターにはλファージ由来の各種ベクター例えばλgt
10やλZapII など、あるいはpUC18 やpBR322等のプラス
ミドベクターを用いることができる。目的の遺伝子を保
持するクローンの選択には、前記プローブを用いてハイ
ブリダイゼーションを行い、これに強く結合するクロー
ンを選択すればよい。また、近縁のＡＴＰアーゼ遺伝子
間のホモロジーの高い領域のアミノ酸配列から適宜プラ
イマーを合成してＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を取得し、
それをプローブにしても良い。塩基配列の決定はサンガ
ー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法によっ
て決定できる。以上の手順により翻訳開始コドンから終
始コドンを含むＡＴＰアーゼαおよびβサブユニットを
コードするＤＮＡの全長を単離することができる。な
お、ＡＴＰアーゼαおよびβサブユニットをコードする
ＤＮＡを含む大腸菌JM105-pTAE1-5 は、工業技術院生命
工学工業技術研究所にFERM P-15475として寄託されてい
る（寄託日平成８年２月２７日）。

【００１１】単離したＤＮＡは適当な発現ベクターに挿
入し、微生物や培養細胞に導入して発現させることによ
り、当該蛋白質を大量調製することが可能である。本発
明の遺伝子は、耐熱性ＡＴＰアーゼの生産に有用であ
る。この遺伝子から生産されるＡＴＰアーゼは、試薬や
バイオリアクターなどに利用することができる。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明を説明
するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではな
い。

【００１３】

【実施例】

〔実施例１〕ＡＴＰアーゼαおよびβサブユニットのＮ
末端アミノ酸配列の決定 特願平6-279451号明細書に記載の方法で超好熱硫黄依存
菌KI株を培養し、菌体からＡＴＰアーゼを取得、精製し
た。すなわち10Ｌの培地（0.25％酵母エキス、0.１％Ｌ
-シスチン、海水7.５Ｌ、蒸留水2.５Ｌからなり、pH 6.
8に調整）で８時間90℃で嫌気的に培養を行った。高速
遠心機にて集菌（1.5g) し超音波で菌体を破砕した。高
速遠心機にて残渣を除き、上清をさらに超遠心分離機に
て遠心（88,000×ｇ，1.５時間）し、その沈澱を膜画分
とした。膜画分を緩衝液で洗浄後0.１％トリトンＸ-100
を含むトリス緩衝液でＡＴＰアーゼを可溶化し、再び超
遠心分離を行った。その上清からBlue-sepharose CL-6
B、Scphacryl S-300 の各カラムクロマトグラフィーに
よりＡＴＰアーゼを精製した。

【００１４】精製酵素を10％ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって各サブユニットに分離した。その
後、ＰＶＤＦ膜（アプライドバイオシステムズ社）に電
気的にブロッティングし（日本エードー）、ＣＢＢ-R25
0 によって染色しサブユニットを検出した。切り出した
70kDa および60kDのバンドはプロテインシークエンサー
ＰＳＱ-2（島津製作所）によりそのＮ末端アミノ酸配列
を決定した。決定した配列を図１に示す。

【００１５】〔実施例２〕サーモコッカスKI株ゲノムＤ
ＮＡの調製 実施例１と同様にKI株の５Ｌ培養を行った。菌体0.6gを
10mlのＴＮＥ緩衝液（100mM NaCl, 20mM EDTA を含む20
mMトリス塩酸緩衝液、pH 8.0）に懸濁した。10％ＳＤＳ
溶液と１％とトリトンＸ-100溶液を各々１mlずつ添加
し、４℃で一晩放置した。ついで温度を50℃にしてプロ
テイナーゼＫ溶液（20mg/ml)を50μl 添加し４時間振盪
した。フェノール処理、クロロホルム処理後、ＲＮase
Ａ溶液（0.5mg/ml）を50μl 添加し、37℃で１時間放置
した。再び10％ＳＤＳ溶液を１ml、プロテイナーゼＫ溶
液（20mg/ml)を50μl 添加し、50℃で70分放置した。フ
ェノール処理、クロロホルム処理後（溶液量10ml) 、１
mlの３Ｍの酢酸ナトリウム溶液（pH5.2)、25mlのエタノ
ールを添加し、−20℃で２時間放置した。その後高速遠
心機で遠心しＤＮＡを沈澱させ、70％エタノール溶液３
mlで沈澱を洗浄、遠心エバポレーターで乾固させて、Ｔ
Ｅ緩衝液0.５mlに溶解した。この操作により約２mgのゲ
ノムＤＮＡが得られた。

【００１６】〔実施例３〕ＰＣＲによるＡＴＰアーゼα
サブユニット断片の増幅およびその塩基配列の決定 実施例１で得られたαサブユニットのＮ末端アミノ酸配
列および他の古細菌（メタノサルシナ・バーケリ〔Meth
anosarcina barkeri〕、ハロバクテリウム・ハロビウム
〔Halobacterium halobium〕、スルホロバス・アシドカ
ルダリウス〔Sulfolobus acidocaldarius 〕）のαサブ
ユニットの中央部位に位置する相同領域から以下のＤＮ
Ａプライマーを合成した。

【００１７】 KI-10F : GT(AGCT)GT(AGCT)GC(AGCT)GA(CT)GG(AGCT)ATGAA KI-10R : CC(CT)TC(CT)TC(AGCT)CC(AGCT)CGCAT(CT)TC KI-20R : AT(CT)TC(AGCT)CC(AGT)AT(AGCT)A(AG)(AGCT)CCCAT

【００１８】KI-10FおよびKI-20RはＮ末端アミノ酸配列
に基づいて設計したプライマー、KI-10Rは中央部の相同
領域のアミノ酸配列に基づいて設計したプライマーであ
る。実施例２のように調製したサーモコッカスKI株のＤ
ＮＡを鋳型としてPCR-Amplification kit（宝酒造）を
用いたＰＣＲ反応の結果、KI-10FとKI-20Rのプライマー
の組合せでは77bp、KI-10FとKI-10Rの組み合わせでは約
１kbp と、予想される長さの断片が増幅された。それぞ
れ低融点アガロースで電気泳動を行い、ＤＮＡ断片を切
り出してエッペンドルフチューブに移し、70℃で３分保
温してゲルを融解してＤＮＡを抽出した。フェノール処
理、ついでクロロホルム処理の後、エタノール沈澱を行
った。沈澱を70％エタノールで洗浄後、減圧乾固し、Ｔ
Ｅ緩衝液に溶解した。

【００１９】以上のように調製したＤＮＡ断片をpT7-Bl
ucベクター (Novagen社）にTakaraligation kit Ver.1
（宝酒造）を用いて連結し、コンピテントセルE.coli J
M109（宝酒造）を用いて形質転換した。陽性クローンを
選択し、挿入断片のあることを確認後、25mlのＬＢ培地
（50μg/mlのアンピシリンを含む）に植菌し、一晩37℃
で振盪培養した。培養液を遠心分離して集菌後、主にラ
ボマニュアル遺伝子工学増補版pp51-52（村松正実編、
丸善、1990年）記載の方法に従ってプラスミドＤＮＡを
調製した。この操作により約20μg のＤＮＡを調製し
た。１サンプルあたり１μg のＤＮＡを鋳型として、Dy
e Terminator cycle sequencing kit （パーキンエルマ
ー社）を用いてシークエンス反応を行い、ＤＮＡシーク
エンサー（373A，アプライドバイオシステムズ社）によ
り塩基配列を決定した。その結果、KI-10FとKI-20R増幅
断片のコードするアミノ酸はＡＴＰアーゼαサブユニッ
トのＮ末端アミノ酸配列と一致すること、およびKI-10F
とKI-10R増幅断片は他のＡＴＰアーゼの配列と相同性を
示すとともにＡＴＰ結合部位を有しており、またKI-10F
とKI-20R増幅断片部分を含んでいることから、確かにＡ
ＴＰアーゼ遺伝子の一部であることが明らかになった。

【００２０】〔実施例４〕サーモコッカスKI株ゲノムＤ
ＮＡライブラリーの作製 実施例２に従って作製したゲノムＤＮＡ30μg に25ユニ
ットの制限酵素Sau3AIを添加して１時間37℃で反応し、
部分切断を行った。１％アガロース電気泳動の結果、制
限酵素処理後のＤＮＡは10kbp から１kbまでの長さに及
んでいた。切断反応後の溶液をフェノール処理、エタノ
ール沈澱をして、ＤＮＡを得た。一方、BamHI および脱
リン酸化処理したpUC18 をファルマシア社より購入し、
その位置にゲノムＤＮＡ切断断片をTakara ligation ki
t Ver.1 により連結し、 E.coliJM109 を用いて形質転
換しサーモコッカスKI株ゲノムＤＮＡライブラリーとし
た。

【００２１】〔実施例５〕ＡＴＰアーゼ遺伝子を含む組
み換えクローンの選択 実施例３によって作製した約１kbp のＤＮＡ断片（KI-1
0FとKI-10Rをプライマーとした断片）１μg を、DIG DN
A labelling and detection kit（ベーリンガーマンハ
イム社）を用いてランダムプライマーによりラベルし、
プローブとした。一方、実施例４に従って作製した形質
転換株をＬＢプレート（アンピシリン、X-gal を含む）
にまいて一晩培養後、ナイロンメンブレン ハイボンド
Ｎ（アマシャム社）上に固定し、コロニーハイブリダイ
ゼーションを行った。方法は主に上記kit添付のプロト
コールに従い、プレハイブリダイゼーション、ハイブリ
ダイゼーションは68℃で行った。約8,000個のクローン
より、プローブと結合する８個のコロニーを得た。これ
らのコロニーのプラスミドが挿入されているＤＮＡ断片
を調べた結果、クローンpA2-5 がＡＴＰアーゼαサブユ
ニット内部のSau3AI部位からβサブユニット全長を、ク
ローンpA3-1 がαおよびβサブユニット全長を含んでい
ることを明らかにした。そして、このクローンpA3-1 に
ついて、DyeTerminator cycle sequencing kit を用い
てシークエンス反応を行い、373AＤＮＡシークエンサー
により塩基配列を決定した。得られた遺伝子は図２に示
した通り、ＡＴＰアーゼαおよびβサブユニットを含ん
でいた。なお、βサブユニットの翻訳開始コドンのメチ
オニンの位置は実施例１によって決定したアミノ酸配列
から推定したものである。

【００２２】

【発明の効果】本発明は、サーモコッカス属の微生物に
由来するＡＴＰアーゼαおよびβサブユニット遺伝子を
提供する。本発明の遺伝子から造られる蛋白質は、耐熱
性試薬、バイオリアクターにおけるＡＴＰ供給酵素とし
て極めて有用である。

【００２３】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：１７５８ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名 ：Thermococcus sp. 配列

【００２４】

【００２５】配列番号２ 配列の長さ：１３９２ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名 ：Thermococcus sp. 配列

【００２６】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＴＰアーゼαおよびβサブユニットのＮ末端
アミノ酸配列を示す図である。

【図２】ＡＴＰアーゼαおよびβサブユニット遺伝子を
含む塩基配列の前段部分を示す図である。

【図３】ＡＴＰアーゼαおよびβサブユニット遺伝子を
含む塩基配列の中段部分を示す図である。

【図４】ＡＴＰアーゼαおよびβサブユニット遺伝子を
含む塩基配列の後段部分を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列、
   又は配列番号１で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同
   一なＤＮＡ塩基配列を有する耐熱性ＡＴＰアーゼαサブ
   ユニット遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列、
   又は配列番号２で表されるＤＮＡ塩基配列と実質的に同
   一なＤＮＡ塩基配列を有する耐熱性ＡＴＰアーゼβサブ
   ユニット遺伝子。