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JPH09220091A - 形質転換酵母菌株 - Google Patents

形質転換酵母菌株

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Publication number
JPH09220091A
JPH09220091A JP9005583A JP558397A JPH09220091A JP H09220091 A JPH09220091 A JP H09220091A JP 9005583 A JP9005583 A JP 9005583A JP 558397 A JP558397 A JP 558397A JP H09220091 A JPH09220091 A JP H09220091A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
yeast
strain
hexose
gene
transport factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP9005583A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul Klaassen
クラーセン ポール
Rooijen Rutger Jan Van
ヤン ファン ローエイエン ルートヘル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gist Brocades NV
DSM Delft BV
Original Assignee
Gist Brocades NV
Gist Brocades BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gist Brocades NV, Gist Brocades BV filed Critical Gist Brocades NV
Publication of JPH09220091A publication Critical patent/JPH09220091A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C12/00—Processes specially adapted for making special kinds of beer
    • C12C12/002—Processes specially adapted for making special kinds of beer using special microorganisms
    • C12C12/006—Yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT OF FLOUR OR DOUGH FOR BAKING, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/047—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
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    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
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    • C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、酵母によるガス及びアルコール生
成能を改良した形質転換酵母、及び該酵母を用いる方法
を提供する。 【解決手段】 ヘキソース輸送因子遺伝子が構造性プロ
モータの支配下にあり、ヘキソース輸送因子遺伝子が非
形質転換酵母においては発現しない条件下で、該遺伝子
を発現することができる酵母を提供する。また、酵母を
用いたビール、パン、ワイン及びウイスキーの製造方法
を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、酵母によるガス及
びアルコール生成の改良に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】例えば、Saccharomyces 属に属する酵母
菌株が、エタノールの製造及びパンの発酵に世界的に用
いられている。このような酵母は、嫌気的な条件下で糖
類を発酵してほぼ等モル量の二酸化炭素（ＣＯ2 ）及び
エタノールにする。パン酵母は、クリーム酵母（乾燥物
15〜21％）、圧搾酵母（乾燥物26〜33％）、活性乾燥酵
母（乾燥物92〜94％）又はインスタント乾燥酵母（乾燥
物94〜97％）として商業的に入手することができる。過
去数十年間、酵母研究における最重要課題の一つは、改
善されたＣＯ2 生成率をもたらす、パン酵母の発酵能力
の改良であった。この目的のために、古典的な雑種形成
技術及び分子遺伝学的技術が用いられてきた。
【０００３】酵母の活動による糖類の代謝における初期
ステップの一つに、原形質膜を透る糖類の輸送がある。
Saccharomyces 属においては、グルコース及びフラクト
ースのようなヘキソースの吸収は、単糖類促進要素(fac
ilitators)の超科(superfamily) に属する特定のヘキソ
ース輸送因子によって媒介される(Reifenberger, E.,Fr
eikel, K.及びCiriacy, M. (1995) 16(1), 157 - 167
頁) 。現在までのところ、このようなキャリアーをコー
ドする16種以上の遺伝子（著名なのはヘキソーストラン
スポータを発現する、いわゆるHXT 遺伝子）が特定され
ている。個々のHXT 遺伝子及び相同体の発現は酵母細胞
が検出したヘキソースの濃度のような環境因子に依存す
る。このヘキソースの吸収は、２種の動力学的に異なる
システムによって触媒されると述べられている(Bisson,
L.F., Coons, D.M., Kruckeberg, A.L.及びLewis D.A.
(1993) Crit Rev Biochem Mol Biol 28, 295 〜308
頁;Lagunas,R.(1993) FEMS Microbiol Rev 104, 229〜2
42 頁) 。一方ののシステムはヘキソースに高い親和性
を有する。比較的高いヘキソース濃度、例えば、グルコ
ース２％で育った細胞には、高親和性成分はない。この
条件下では、低親和性トランスポータが、酵母細胞によ
って発現される。複数のHXT 遺伝子が欠けている変異酵
母菌株を作ることにより、酵母の主なグルコース輸送因
子を同定することが可能になる（前記 Reifenberger ら
の論文）。グルコース濃度が高い培地と低い培地（0.1
％〜５％）で育った、遺伝子HXT １〜７が欠けている酵
母菌株では、グルコースの吸収とグルコースの消費は検
出レベルよりも低かった。遺伝子HXT １〜７の１種のみ
を発現する変異酵母菌株において、これらの変異株の培
養条件に関係なく（0.1 ％〜５％）、HXT1p 及びHXT3p
は低親和性輸送因子(Km =50〜100 mM ヘキソース）
を、HXT4p は適度に低親和性の輸送因子(Km = 50〜100
mM ヘキソース）を、HXT2p 、HXT6p 及びHXT7p は、高
親和性トランスポータ(Km = 1 〜 4 mM ヘキソース）
を発現する(Reifenberger, E., Freikel, K.及びCiriac
y, M. (1995) Yeast 11, S 457) 。
【０００４】該論文には、グルコースの吸収において影
響を受ける、実験室の菌株の変異体が記載されている。
これらの変異をコードする遺伝子は GGS1 と命名されて
いる(Thevelein, J.M. (1992) Ant. V. Leeuwenh. 62,
109 〜130 頁）。Thevelein は次のモデルを提案してい
る。野性タイプの細胞において、グルコース流入は低親
和性グルコースキャリアー、糖キナーゼ、及び GGS-1遺
伝子生成物（GGS-1 に支配されているタンパク質）から
なる複合体に媒介される。この複合体はi). グルコース
流入の抑制及び調節、及びにii).全体のシリーズ又は全
てのグルコース誘導信号を送る経路の活性化という、２
種の機能を有することが示唆されている。このモデルに
よると、ggs-1 変異体では、この複合体はもはや機能を
発揮せず、代謝の不均衡を引き起こす。この細胞は成長
を止める。細胞の内部に燐酸エステルの急速な蓄積がお
き、そのため無機燐(Pi ) の涸渇が起きるからである。
【０００５】しかしながら、信号を送る際に観察される
欠陥は、ヘキソキナーゼPII をコードするHXK2遺伝子を
欠失させることにより回復する（Hohmann, S., Neves,
M.J., de Koning, W., Alijo, R., Romos, J. 及びThev
elein, J.M. (1993) Curr. Genet. 23, 281 〜289
頁）。明らかに、解糖における最初の数ステップの速い
速度が、ヘキソースリン酸化が低い速度になることによ
って低下する。この結論は、ggs-1 変異体の細胞へのグ
ルコースの流入が倍地中の糖の量によって制限される場
合に、ggs-1 変異体が恒成分培養槽で成育することがで
きるという観察によっても支持される(Van Dam, K., Ja
nsen, N. Postma, P., Richard, P., Ruijter, G., Rug
gers, M., Smits, H.P., Teusink, B., Van der Vlag,
J., Walsh, M.C., Westerhoff, H.V. (1993) Ant. V. L
eeuwenh. 63, 315〜321 頁）。ggs/hxk ダブル変異株実
験室菌株において、グルコース信号を送る効果があると
いう事実は、GGS タンパク質自体が該信号を送る分子で
はないことを示している。さらに、GGS1遺伝子はトレハ
ロース-6- リン酸シンターゼをコードするTIP1遺伝子と
同じである（Bell, W., Klaassen, P., Ohnacker, M.,
boller, T., Herweijer,M.A., Schoppink, P.J. Van de
r Zee, P., Wiemken, A. (1992) Eur. J. Biochem. 20
9, 951〜959 頁）。ヘキソース輸送因子、ヘキソースリ
ン酸化酵素及びトレハロース合成複合体の相互作用を考
慮し得る３種の可能なモデルが提案されている(Thevele
in, J.M., Hohmann, s. (1995) TIBS 20, ３〜10頁）。
それぞれのモデルが若干の観察事項を説明し得るが、い
ずれのモデルも実験的な証拠により明確に確立され又は
支持されていない。
【０００６】３種すべてのヘキソースキナーゼ（hxk1,
hxk2, glk1) を欠く実験室菌株の酵母細胞において、そ
れでもなお原形質膜を通るグルコースの輸送がみられた
(Smits, H.P., Smits, G.J., Postma, P.W., Walsh, M.
C.及びVan Dam, K., (1996)Yeast 12, 439 〜447
頁）。細胞内グルコース濃度は2.0 mMまで蓄積され、ヘ
キソースキナーゼがないにもかかわらず、それでもなお
グルコースの輸送が起きていることを示した。全トリハ
ロースシンセターゼ複合体、並びにTPS1(GGS1)の精製に
ついて記載されている(Londesborough, J., 及びVuori
o, M., (1991) J. Gen. Micr. 137, 323 〜330 頁; Bel
l, W., Kalaassen,P., Ohnacker, M., Boller, T., Her
weijer,M.A., Schoppink, P.J. van der zee, P., Wiem
ken, A. (1992) Eur. J. Biochem. 209, 951〜959
頁）。前記トリハロースシンセターゼ複合体は、シトソ
ル分画から精製され、GGS1は膜関連タンパク質ではない
ことは強く示唆された。すべてを考慮しても、低親和性
グルコースキャリアー、糖キナーゼ及び GGS-1遺伝子生
成物の相互作用を提起するモデル(Thevelein, (1992) A
nt. V. Leeuwenh. 62,109 〜130 頁）は、それでもな
お、むしろ理論的であると結論することができる。最
近、またThevelein グループは、かれらの初期のモデル
に疑問を持っている(de Winde, J.H., Crauwels, M. Ho
hmann, S., Thevelein, J.M.及びWinderinckx, J. (199
6) Eur. J. Biochem. 241, 633〜643 頁）。
【０００７】驚くべきことに、例えば、構成性プロモー
タの支配下に HXT遺伝子の特別のコピーを導入した結果
として、ヘキソースの輸送にかかわる一又は数種の遺伝
子を構成的に発現する、産業上に用いられる酵母は、改
善されたＣＯ2 及びエタノール生成率を有する新菌株を
もたらすことが見い出された。機能上の大きな改善が単
相体（実験室）菌株において容易に得られることが知ら
れている。しかしながら、産業上及び商業的に入手でき
る菌株においては、このことは容易ではない。この現在
の産業上及び商業的入手できる菌株は古典的な遺伝学的
技術を用い、数十年に渡って改良されてきた。すでに産
業上利用できる菌株は、ほぼ最大のガス発生率を発揮す
ると考えられている。前記ヘキソースの吸収率、したが
って、その結果としてのガス生成の効果もまた、ヘキソ
ース輸送因子遺伝子の天然プロモータの変異、例えば、
関連するヘキソース輸送因子発現が変化するように、プ
ロモータ領域における一以上のヌクレオチドの削除、挿
入又は置換することにより、得られる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明はヘキソースの
発酵率を改善した形質転換酵母を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような酵
母を作りだすために、少なくとも１種、好ましくは相同
体、ＤＮＡ構造体を酵母に導入する。このＤＮＡ構造体
は、好ましくは構成性の強力なプロモータの支配下にお
いて、ヘキソースの吸収を促進するタンパク質をコード
する少なくとも１種のHXT 遺伝子又は相同体を含むもの
である。低親和性（K m ＝20 - 100mM）輸送因子遺伝子
を用いることが好ましいことを見いだした。HXT 1 及び
／又はHXT 3 遺伝子を用いることが好ましい。前記遺伝
子はホスト細胞のゲノムに組み込むことにより、酵母細
胞に導入し、安定的に維持することができる。また、そ
の代わりに、ＤＮＡ構造体として、プラスミド、好まし
くはマルチコピープラスミドのような非組込みベクター
上に維持することもできる。
【００１０】産業上利用できる酵母の調製プロセスは流
加式発酵装置においてパン酵母を培養することからな
る。しばしば、糖蜜が炭素源として用いられる。この酵
母生成物は数種の（しかし全てではない。）ヘキソース
輸送因子、すなわち流加式発酵プロセスにおいて重要な
ものを含んでいる。これらのヘキソース輸送因子は、パ
ンなどの生地において酵母が必要とするものと同じでは
ない。環境条件が違うからである。その結果として、該
酵母はヘキソース輸送因子の正しい組合せを合成するこ
とにより、自らを新しい環境に適合させることが必要と
なる。本発明の酵母においては、前記生地において用い
られるヘキソース輸送因子の正しい組合せを直ちに発現
する。したがって、本発明の一局面においては、前記HX
T 遺伝子又は相同体は、このような条件下において、こ
の遺伝子が野性タイプの菌株によって発現されないよう
な条件下で、発現する。本発明は、前記生地に加えられ
た場合、直ちに発現されるヘキソース輸送因子遺伝子を
有する形質転換酵母を提供する。一方、野性タイプの菌
株は、該菌株がこの遺伝子を十分な量で発現できるま
で、例えば30〜45分間という長い時間を必要とする。
【００１１】ヘキソースとは、炭素原子数６個の糖類又
は炭水化物、例えば、グルコース、フラクトース、ガラ
クトース又はマンノースを意味する。ヘキソース輸送因
子遺伝子とは、原形質膜を通ってヘキソースが拡散移動
ことを促進するタンパク質をコードする遺伝子をいい、
例えば、HXT-1, HXT-2, HXT-3 又はHXT-4 がある。Ｄ
ＮＡ配列がそれでもヘキソースを輸送できるようにタン
パク質をコードするように、一以上のヌクレオチドを置
換、削除又は付加することにより、これらの遺伝子から
誘導されたＤＮＡ配列は、本発明の一部とみなす。 産
業上利用できる酵母とは、単相体酵母菌株ではなく、か
つテストＡにおいて、165 分で乾燥体285 mg当たり450
mlよりも多いＣＯ2 よりも高いＣＯ2 生成能を有し、好
ましくはテストＡにおいて、165 分で乾燥体285 mg当た
り500 mlＣＯ2 を生成する全ての酵母菌株を意味する。
好ましくは、この産業上利用できる菌株はパン酵母であ
り、さらに好ましくはSaccharomyces 属に属する酵母で
あり、さらに好ましくはSaccharomyces cerevisiaeであ
る。
【００１２】相同体ＤＮＡとは同じ酵母属に由来するＤ
ＮＡを意味する。例えば、相同体ＤＮＡは、Saccharomy
ces を、Saccharomyces に由来するＤＮＡで形質転換す
るする場合に使用する。したがって、その発現を果たす
のに用いられるヘキソース輸送因子遺伝子及び／又はプ
ロモータは形質転換される酵母と相同性であることが好
ましい。もし有るならば、遺伝子及びプロモータととも
に導入される他の遺伝子も相同性であることが好まし
い。このような方法において、他の属に由来する新しい
特性を導入することなく、酵母属に存在する特性が改善
される。関連のある遺伝子には、糖キャリアー、特にヘ
キソース輸送因子、相同性遺伝子、すなわち、改変され
たＤＮＡ配列が、それでもヘキソース輸送をできるタン
パク質をコードしているように、１種以上のヌクレオチ
ドを置換し、又は１種以上のコドンを付加又は削除し
た、これらの配列に由来するＤＮＡ配列である。
【００１３】構造性プロモータとは、環境条件とは独立
に遺伝子を発現するプロモータを意味し、例えば、Benn
etzen 及びHallによって記載されたと同様なアルコール
デヒドロゲナーゼプロモータ（ADH-1 プロモータ）(Ben
netzen, J.C.及びHall, B.D.(1982) J.Biol.Chem. 258,
3018 頁）、Holloand及びHolloandによって記載された
と同様なグリセルアルデヒド-3- リン酸デヒドロゲナー
ゼプロモータ（GAPDHプロモータ）(Holland及びHollan
d,(1980) J.Biol.Chem. 252, 2596 〜2605頁）、並び
に、１種以上のヌクレオチドの削除、付加又は置換によ
って変異させたHXT プロモータがある。このようなプロ
モータを使用することにより、流加式発酵生成プロセス
の条件下、並びにパンなどの生地の条件下で、発現を達
成する。本発明の形質転換酵母は、突然変異、集団交配
及びプロトプラスト融合のような、菌株改良手法のため
の出発菌株として使用することができる。これまでに記
載したヘキソースの吸収を強化する遺伝子の導入後、糖
の含有量を変化させたパンなどの生地において( ショ糖
０％から30％まで）ガス生成の増加を観察することがで
きる。
【００１４】本発明は、パンなどの生地に適用できるだ
けでなく、例えば、加水分解澱粉から工業的にエタノー
ルを製造する発酵系のような、すべての発酵プロセスに
適用できる。したがって、本発明の形質転換酵母菌株は
パン酵母を含むだけでなく、例えば、ビール、ウイスキ
ー及びワイン酵母菌株を含む。したがって、本発明は、
強力な構造性プロモータの支配下で、ヘキソース輸送因
子遺伝子及び／又はその相同体を含む構造体の導入を採
用することにより、ヘキソース吸収率、及びその結果と
しての、パンなどの生地におけるガス生成率を増加をさ
せることができるという利点を確立することができた。
この後に記載する例は、ヘキソースキャリアーを過剰発
現するパン酵母に関連する発明を詳細に説明するもので
ある。
【００１５】〔クローニング技術〕一般的なクローニン
グ技術に関し、"The handbook of Sambrook et al"(Sam
brook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989))
を参照した。分子クローニングに関し、"A laboratory
manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold
Spring Harbor, NY) を参照した。 〔組み換えプラスミドの構築〕 1) pTZ18RGAPDHhygB このプラスミドは、GAPDH プロモータの支配下に薬剤 H
ygromycin B に対する耐性を付与する遺伝子を含む。こ
のようなＤＮＡフラグメントの組合わせを、酵母におけ
る優性の選択可能なマーカーとして使用することができ
る。pTZ18R（商業的に入手可能、Pharmacia ）をSmalで
切断する。GAPDH プロモータの支配下に(*1,参照) 、薬
剤 Hygromycin B に対する耐性を付与する遺伝子を含
む、BamHI-Sallフラグメントを(*2,参照) 、大型フラグ
メント Klenow ＤＮＡポリメラーゼの助けによりブラン
ト(Blunt) にする。このブラントエンドフラグメントを
pTZ18Rに結合させ、プラスミド pTZ18RGAPDHhygBを得た
（図１）。 *1) Holland and Holland に記載されたのと同じ内容で
ある(Holland and Holland, (1980), J.Biol.Chem. 255
2596 〜2605頁) 。 *2) Gritz and Davies に記載されたのと同じ内容であ
る(Gritz, L. and Davies, J. (1983) Gene 25, 179 〜
188 頁) 。
【００１６】2) pKSPO1 この組込みプラスミドは、強力な構造性ADH1プロモータ
の支配下にあるHXT1遺伝子を含み、かつ GAPDHプロモー
タの支配下でHygromycin B耐性遺伝子を含む。ADH1プロ
モータの支配下にあるHXT1遺伝子を含む(*3,参照) 、プ
ラスミドYIpAPHXT1 を（図２、*4, 参照) をBamHI 及び
Sallで切断し、他のものの中から、約4.4 Kbのフラグメ
ントを得た。このフラグメントを、前もってBamHI 及び
Sallで切断しておいたpTZ18RGAPDHhygB に結合、挿入
し、プラスミドpKSPO1を得た（図３）。 *3) Bennetzen and Hallに記載されたのと同じ内容であ
る(Bennetzen, J.C. andHall, B.D. (1982), J.Biol.Ch
em. 257 3018 頁) 。 *4) 入手先; M. Ciriacy and E. Reifenberger, Heinri
ch-heine University, Duesserdorf, Germany. このプラスミドは組込みプラスミドであり、ホスト細胞
のゲノムに直線状に組込まれる。この場合、該組込みは
制限酵素 Hpal を用いて pKSPO1 を切断することによ
り、ホスト細胞のゲノム上のHXT1の座に対して行われ
る。
【００１７】〔酵母の形質転換〕酵母菌株の形質転換
を、イトウらの論文の方法に基づいて行った(Ito, H.,
Fukuda, Y., MUrata, K. and Kimura, A. (1983) J. Ba
cteriology 153 163〜168頁）。Saccharomyces 菌株を
標準酵母栄養培地で、１〜６ OD 600nm の密度となるよ
うに培養した。この酵母細胞を遠心分離して集め、洗浄
し、かつ濃度２Ｍまで、好ましくは１Ｍのアルカリ金属
イオン、好ましくはリチウムイオンで前処理する。この
細胞を30℃で、約60分間インキュベートした後、この細
胞を、形質転換するＤＮＡ（１〜20μg ）とともに30℃
で、約60分間インキュベートした。ポリエチレングリコ
ール、好ましくは約4,000 ダルトンのポリエチレングリ
コールを、最終濃度約20％〜50％となるように加える。
30℃で、30分間インキュベートした後、この細胞を42℃
で５分間加熱処理する。好ましくは、この細胞懸濁液を
標準酵母栄養培地で洗浄し、所定量の新鮮な標準酵母栄
養培地に入れてインキュベートする。この細胞を30℃で
１時間インキュベートし、かつHygromycin B 400μg/ml
を含む標準寒天培地上に植えつける。
【００１８】酵母細胞にプラスミドが組込まれて形質転
換されている場合、この組込みはHpal消化ＤＮＡを用い
てHXT1座に対し起こされている。この組込みはプラスミ
ドベクターの一又は幾つかのコピーで得られている(Szo
stak, J.W. and Cou, R. (1979) Plasmid 2, 536頁）。
ＣＯ2 生成実験に用いられた、これらの形質転換体にお
ける正確なコピー数を、標準分子生物学的技術を用いて
測定した(Sambrook, J. et al, 前に記載）。 〔合成生地培地におけるＣＯ2 生成の測定（テスト
Ａ）〕酵母 Saccharomyces cerevisiae の細胞をマルト
ース１％を含むＹＥＰ培地（酵母抽出物１％w/v 、ペプ
トン２％w/v ）で培養した。この細胞を静止期になるま
で、回転式振盪機により30℃で一晩培養した。遠心分離
器で該細胞を集め、水で洗浄し、濃度約13〜15mgとなる
ように水に再懸濁した。続いて、この酵母懸濁液0.6 ml
に水1.9 ml及び合成生地培地に加え、28℃で165 分間イ
ンキュベートした。この培地の組成は、１リットル当た
り、グルコース110 ｇ、（ＮＨ4 ）ＳＯ 4 ３ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ４ｇ、ＫＨ2 ＨＰＯ4 ４ｇ、カサミ
ノ酸(Casaminoacids) ４ｇ、クエン酸４ｇ(1 aq)、三ナ
トリウムクエン酸45ｇ(2 aq)、ビタミンＢ1 及びＢ6 10
mg、ニコチン酸 40 mg、パントテン酸カルシウム 20 mg
及びビオチン0.02mgであり、ｐＨは5.6 である。インキ
ュベートを行っている間に生成したＣＯ2 をキャリアー
ガス（Ｎ2 ）を用いて溶液からフラッシュし、赤外線検
出器(Leybold-Heraeus) を用いて、165 分間測定した。
嫌気的に発生したＣＯ2 の総量、並びに具体的なＣＯ2
生成速度をオンラインで計算した。
【００１９】 〔菌株のリスト〕 菌株Ｂ 産業上利用できるパン酵母菌株 菌株Ｂ-pKSP01D プラスミドpKSP01で形質転換した産業上利用できるパン 酵母菌株Ｂ 菌株Ｃ 産業上利用できるパン酵母菌株 菌株Ｃ-pKSP01A プラスミドpKSP01で形質転換した産業上利用できるパン 酵母菌株Ｃ 菌株Ｄ 産業上利用できるパン酵母菌株 菌株Ｄ-pKSP01K プラスミドpKSP01で形質転換した産業上利用できるパン 酵母菌株Ｄ 下記の菌株は次の機関に寄託されている。 "The Centraal Bureau voor Schimmelcultures (CBS)
(Baarn, Holland)"Saccharomyces cerevisiae 菌株Ｂは、菌株227Ng とし
て、前記CBS にアクセス番号745.95で寄託されている。
Saccharomyces cerevisiae 菌株Ｃは、菌株210Ng とし
て、前記CBS にアクセス番号744.95で寄託されている。
Saccharomyces cerevisiae 菌株Ｄは、菌株247Ng とし
て、前記CBS にアクセス番号747.95で寄託されている。
【００２０】
【実施例】 〔実施例１〕HXT1遺伝子の構造性発現は、合成生地培地
において改善されたガス生成率をもたらす。菌株Ｂ、Ｂ
-pKSP01D、Ｃ、Ｃ-pKSP01A、Ｄ及びＤ-pKSP01Kを、炭素
源としてマルトース１％を含むＹＥＰ培地において、30
℃で一晩培養した。ＣＯ2 生成率（図４〜６）、並びに
ＣＯ2 の総量を合成生地培地において測定した（表
１）。これらの条件で生成したＣＯ2 の総量は、それぞ
れの親の菌株と比較して形質転換体では有意に増加し
た。
【００２１】
【表１】 ＣＯ2 生成 相対ＣＯ2 生成（％） 菌 株 ml CO 2 /285mg乾燥重量 165 分間 菌株Ｂ ６１８ １００ 菌株Ｂ-pKSP01D ６７３ １０９ 菌株Ｃ ５５６ １００ 菌株Ｃ-pKSP01A ６１９ １１１ 菌株Ｄ ５２８ １００ 菌株Ｄ-pKSP01K ５９９ １１３
【００２２】表１ 合成生地培地におけるHXT1遺伝子を過剰発現する酵母菌
株の総ＣＯ2 生成（165 分間におけるml CO 2 /285mg乾
燥重量）及びこれらの酵母菌株によって生成される相対
的なＣＯ2 量。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミド pTZ18RGAPDHhygBの制限地図を示
す。
【図２】プラスミド YIpAPHXT1の制限地図を示す。
【図３】プラスミド pKSPO1 の制限地図を示す。
【図４】菌株Ｂ及びHxt1p を構成的に発現する菌株Ｂの
形質転換体のガス生成率を示す。
【図５】菌株Ｃ及びHxt1p を構成的に発現する菌株Ｃの
形質転換体のガス生成率を示す。
【図６】菌株Ｄ及びHxt1p を構成的に発現する菌株Ｄの
形質転換体のガス生成率を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｐ 7/06 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 7/06 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヘキソース輸送因子遺伝子を構造的に発
    現することができる形質転換酵母。
  2. 【請求項２】 ヘキソース輸送因子遺伝子が構造性プロ
    モータの支配下にある請求項１記載の酵母。
  3. 【請求項３】 ヘキソース輸送因子遺伝子が非形質転換
    酵母においては発現しない条件下で、該遺伝子を発現す
    ることができる、請求項１又は２記載の酵母。
  4. 【請求項４】 ヘキソース輸送因子遺伝子及び構成性プ
    ロモータが酵母に対して相同性である請求項２又は３記
    載の酵母。
  5. 【請求項５】 ヘキソース輸送因子遺伝子が、HXT1, HX
    T2, HXT3, HXT4, HXT5, HXT6又はHXT7である請求項１〜
    ４のいずれか１項記載の酵母。
  6. 【請求項６】 Saccharomyces 属、好ましくは Sacchar
    omyces cerevisiaeの菌株に属する請求項１〜５のいず
    れか１項記載の酵母。
  7. 【請求項７】 ビール、パン、ワイン又はウイスキー酵
    母である、請求項２に記載の酵母。
  8. 【請求項８】 産業上利用できる酵母菌株に属する請求
    項１〜７のいずれか１項記載の酵母。
  9. 【請求項９】 活性乾燥、インスタント乾燥、圧搾又は
    クリーム酵母の形態である請求項１〜８のいずれか１項
    記載の酵母。
  10. 【請求項１０】 発酵プロセスにおける請求項１〜９の
    いずれか１項記載の酵母の使用。
  11. 【請求項１１】 パンなどの生地における発酵を目的と
    する請求項１０の使用。
  12. 【請求項１２】 前記生地が糖を30％まで含む請求項１
    １の使用。
  13. 【請求項１３】 加水分解澱粉からエタノールを発酵生
    成することを目的とする請求項１０の使用。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜８のいずれか１項に記載さ
    れた酵母の製造方法であって、１種以上の構造性発現が
    可能なヘキソース輸送因子遺伝子を酵母に与えるよう
    に、酵母を突然変異又は形質転換させることを含む方
    法。
  15. 【請求項１５】 酵母を１種以上のヘキソース輸送因子
    遺伝子で形質転換し、これらの又は各遺伝子が構造性プ
    ロモータの支配下にある請求項１４記載の方法。
JP9005583A 1996-01-16 1997-01-16 形質転換酵母菌株 Pending JPH09220091A (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0004241D0 (sv) * 2000-06-29 2000-11-17 Gothia Yeast Solutions Ab Ubv Modified yeast
SE0002460D0 (sv) 2000-06-29 2000-06-29 Roslyn Bill Modified yeast
US7052724B2 (en) * 2001-02-02 2006-05-30 Suntory Limited Method of producing active dry yeast
AU2002336876B2 (en) * 2001-11-06 2008-01-31 The University Of British Columbia Modulating urea degradation in wine yeast
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Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB577915A (en) * 1944-01-12 1946-06-05 Luigi Bragazzi A machine for cutting potatoes into chips
US5190877A (en) * 1987-09-03 1993-03-02 Gist-Brocades N.V. Saccharomyces strains for maltose fermentation
EP0577915A1 (fr) * 1992-07-09 1994-01-12 N.V. Algist-Bruggeman Souches de levures transformées de manière à posséder une résistance au stress et/ou un pouvoir fermentatif amélioré

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AU1017097A (en) 1997-07-24
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DK0785275T3 (da) 2000-11-06
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ES2150185T3 (es) 2000-11-16
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