JPH09166541A

JPH09166541A - 流動粒子分析装置

Info

Publication number: JPH09166541A
Application number: JP7328552A
Authority: JP
Inventors: Masahiko Osawa; 昌彦大澤
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1995-12-18
Filing date: 1995-12-18
Publication date: 1997-06-24

Abstract

(57)【要約】【課題】照射光の入射時の変動により測定値のばらつ
きを除去して、精度のよい安定した測定が可能な流動粒
子分析装置を提供する。【解決手段】フローセル４のシースフロー４１に入射
したレーザ光７の側方散乱光４４を光検出器２１で検出
し、レーザ光７の中心軸とシースフロー４１の中心との
位置ずれを検出する。この位置ずれが所定の範囲内に入
るようにＣＰＵ２５がフローセル４のＸＹ方向の位置を
ＸＹ駆動手段３０によって制御する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は流動粒子分析装置
に関し、特に高速で流れる粒子浮遊液を流体力学的に集
束させ、該箇所にレーザ光などを照射し、散乱光や蛍光
を逐次検出して粒子の性質、構造を解析するようにし
た、いわゆるフローサイトメータを含む流動粒子分析装
置に関する。

【０００２】

【従来の技術】バイオテクノロジーの発展に伴い、医
学、生物学などの分野で、細胞、ＤＮＡ等の粒子の自動
分析および分別を行なう装置の要求が高まっている。こ
のような粒子の分析を行なう流動粒子分析装置の代表的
なものとしてフローサイトメータが知られている。たと
えば、レーザを光源とするフローサイトメトリを適用し
た流動粒子分析装置は、細胞等の分析対象の粒子を、粒
子整列手段であるフローセル内で１列にして流し、この
流れてくる粒子にレーザ光を照射する。粒子により生じ
る前方散乱光や蛍光などを検出して電気信号に変換し、
これらの電気信号に基づいて粒子の分析が行なわれる。
その結果多数の粒子を高速で分析することができる。

【０００３】図８は一般的なフローサイトメータ２００
の要部を示す模式図である。図８を参照して、容器中に
あり、粒子を含むサンプル液１は、別の溶液中にあるシ
ース液２とともにエアポンプ３によってフローセル４に
導かれる。フローセル４の内部では、シース液２がサン
プル液１を円筒状に包み込むさや状のシースフローが形
成される。このシースフローは粒子をフローセルの中心
軸に沿って１つ１つ正確に流すための手段として形成さ
れるものである。フローセル４の下部には、レーザ光源
５から出射され、集束レンズ６によって絞り込まれたレ
ーザ光７が照射される。サンプル液１に含まれる粒子
は、多くの場合蛍光染料や蛍光ラベルモノクロナール抗
体などの蛍光物質で蛍光標識されており、粒子がレーザ
光７中を通過するとき、散乱光と蛍光が発生する。

【０００４】散乱光は集光レンズ８とビームブロック９
からなる集光光学系を経て、たとえばフォトダイオード
などの光検出器１０で検出される。一方、蛍光について
は、赤色蛍光は集光レンズ１１、ハーフミラー１２、集
光レンズ１３、フィルタ１４からなる集光光学系で集め
られて、光検出器１５により検出される。緑色蛍光はこ
れとは別経路のハーフミラー１２から集光レンズ１６、
フィルタ１７で集められ、光検出器１８により検出され
る。通常、蛍光の光検出器１５，１８には、微弱光の検
出が可能な光電子増倍管が用いられる。散乱光を検出す
る光検出器１０、赤色蛍光を検出する光検出器１５およ
び緑色蛍光を検出する光検出器１８からの信号は、それ
ぞれ信号処理回路１９に送られ、ここで散乱光と蛍光の
強度を分析することにより粒子の同定が行なわれる。

【０００５】上記の例では、光源にレーザ光源５を使用
しているが、これよりも安価な水銀ランプやキセノンラ
ンプを用いた装置もある。また、蛍光の測定を３色や４
色に細分して測定する装置や、散乱光の９０°方向成分
を測定する装置もある。さらに粒子識別機能に加えて、
識別した粒子を分取、ソーティングする機構を備えたセ
ルソータと呼ばれる装置もある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来の流動粒子分析装
置としてのフローサイトメータは上記のように構成され
ていた。図９は図８においてフローセル４内のシースフ
ロー４１のレーザ光７の透過平面における透過状態とそ
の強度分布を示す図である。図９において左側に示した
のはレーザ光がシースフロー４１の中央部を照射した状
態（Ａ）と点線で示すように中央部からずれた状態
（Ｂ）におけるレーザ光７の強度分布を示す。

【０００７】図９を参照して、レーザ光７の強度分布は
通常は特性Ａに示すようにガウス分布を呈している。検
体であるシース液２で包まれた粒子４０は、シースフロ
ー４１の中央部を通過するから、粒子４０に対してレー
ザ光７が照射されるとき、レーザ光７の光軸位置がシー
スフロー４１の中央部に一致すれば、粒子４０には強度
の最も強い光が入射し、効率のよい測定ができる。

【０００８】しかしながら、レーザ光７の光軸がシース
フロー４１の中心部からＢのように相対的にずれると、
粒子４０に照射されるレーザ光７の強さは、ガウス分布
に従って弱いものとなり、得られる散乱光や蛍光も弱く
なる。このように、従来の流動粒子分析装置において
は、レーザ光の光軸がシースフローの中心からずれると
同一粒子を測定しても同一の光検出信号が得られなくな
り、測定精度に限界があるという問題があった。

【０００９】この発明は上記のような問題点を解消する
ためになされたもので、照射光の入射時の変動による測
定値のばらつきを除去して、精度のよい安定した測定が
可能な流動粒子分析装置を提供するものである。なお、
照射光の光源としては、レーザ光源，水銀ランプ，キセ
ノンランプ等従来と同じ光源が使用できる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】請求項１に係る流動粒子
分析装置は、粒子浮遊液を高速に流す粒子液流送手段
と、粒子液流送手段に所定の強度分布をもった照射光を
照射する照射手段と、集光光学系を介して照射光による
粒子からの散乱光または蛍光を受光する受光手段と、受
光手段の受光信号処理を行なう信号処理手段と、信号処
理手段からの信号をもとに粒子の分析を行なう粒子分析
手段と、照射手段と粒子液流送手段との位置ずれを検出
して位置ずれ信号を出力する位置ずれ検出手段と、位置
ずれ信号に基づいて粒子液流送手段の位置を補正する補
正手段とを含む。

【００１１】粒子浮遊液を流す粒子液流送手段とそれに
照射光を照射する照射手段との位置ずれを位置ずれ検出
手段で検出し、検出された位置ずれ信号に基づいて粒子
液流送手段の位置を補正するため、粒子には強度の最も
強い光が入射するよう位置が調整される。その結果、効
率のよい粒子の解析が可能になる。

【００１２】請求項２〜４に係る流動粒子分析装置にお
いては、粒子からの前方散乱受光系後方散乱受光系、ま
たは側方散乱受光系の光路中に光分割器を介在して検出
光を取出し、それを位置ずれ信号としている。

【００１３】位置ずれ検出手段がそれぞれの方向の散乱
受光系の光路中に光分割器を介在して位置ずれ信号とし
ての検出光を取出しているため、簡単な構成で位置ずれ
を検出できる。

【００１４】請求項５に係る流動粒子分析装置において
は、請求項１の流動粒子分析装置において位置ずれ検出
手段は粒子からの蛍光を受光する方向と対称な方向の側
方散乱受光系の光路中に光分割器を介在して検出光を取
出し、それを位置ずれ信号とする。

【００１５】粒子からの蛍光を受光する方向と対称な方
向の側方散乱受光系に設けた光分割器で位置ずれ信号を
検出するため、照射光の中心の位置ずれが確実に検出で
きる。

【００１６】請求項６に係る流動粒子分析装置において
は、請求項１の位置ずれ検出手段が４分割フォトダイオ
ードを用いている。４分割フォトダイオードを用いて位
置ずれを検出しているため、位置ずれ方向を確実に検出
できる。

【００１７】請求項７に係る流動粒子分析装置において
は、請求項１の位置ずれ検出手段が４分割フォトダイオ
ードを用い、４分割フォトダイオードは縦方向と横方向
にマトリクス状に配列され、縦方向の電流差と横方向の
電流差を位置ずれ検出信号として検出する。縦方向およ
び横方向に配列されたフォトダイオードの電流差から位
置ずれを検出するため簡単な構成で位置ずれを検出する
ことができる。

【００１８】請求項８に係る流動粒子分析装置において
は、位置ずれ検出手段はエリアＣＣＤを用いている。エ
リアＣＣＤを用いて位置ずれの検出を行なっているた
め、簡単な構成で位置ずれの検出が可能になる。

【００１９】請求項９に係る流動粒子分析装置において
は、位置ずれ検出手段は二次元のＰＳＤを用いている。
位置ずれ検出を二次元ＰＳＤを用いて行なっているた
め、簡単な構成で位置ずれの検出が可能になる。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下この発明の実施の形態を図面
を参照して説明する。図１はこの発明に係る流動粒子分
析装置の要部１００を示す模式図である。

【００２１】図１を参照して、図示のないレーザ光源か
らの平行なレーザ光７がレンズ６によりシースフロー４
１の粒子４０を照射し、側方散乱光または蛍光４２をレ
ンズ１１と光検出器１８で受光および検出する。また、
前方散乱光４３はレンズ８と光検出器１０で検出する。
ここまでの構成は従来の図７と同様である。

【００２２】ここで、前方散乱光４３に対しては図１に
示すようにレーザ光７の直進光を避けるためレンズ８の
前に遮光板２０が挿入されている。

【００２３】これらの信号に対しては公知の増幅、ピー
クホールド等の信号処理が信号処理回路１９で行なわれ
る。信号処理回路１９は入力信号をＡ／Ｄ変換するため
にＡ／Ｄコンバータ２３を経て装置全体を制御するＣＰ
Ｕ２５のＩ／Ｏインタフェイス２４に接続されている。
Ｉ／Ｏインタフェイス２４には、プログラム等を記憶す
るＲＯＭ２６、データ等を記憶するＲＡＭ２７、ＣＲＴ
等の表示部２８、必要に応じて警報を発するための警報
手段２９等が接続されている。

【００２４】信号処理回路１９で処理され、Ａ／Ｄ変換
されたデータはＲＡＭ２７に記憶され、公知の方法で表
示部２８にデータが表示される。

【００２５】この実施例では、レーザ光７の中心の位置
ずれを検出するため、側方散乱光４２の対称方向に反射
した光４４を検出するための光検出器２１が設けられて
いる。前述のように、レーザ光７の中心の位置ずれが起
こると、側方散乱光４２だけではなく、側方散乱光４４
にも位置ずれが起こる。これを光検出器２１で受光して
いる。

【００２６】次に光検出器２１について説明する。光検
出器２１は、たとえば図２に示す構成を有している。こ
こでは、４分割フォトダイオードＢ１〜Ｂ４で構成され
ている。それぞれの出力は図に示すように配線され、オ
ペアンプ５１，５２を用いてそれぞれトラッキング信号
Ｔｒ１およびＴｒ２が出力される。

【００２７】ここで、Ｔｒ１＝（ＩＢ１＋ＩＢ２）−
（ＩＢ３＋ＩＢ４）Ｔｒ２＝（ＩＢ１＋ＩＢ３）−（ＩＢ２＋ＩＢ４）ここでＩＢ１〜ＩＢ４は４分割フォトダイオードＢ１〜
Ｂ４の出力電流値である。

【００２８】次に側方散乱光４４を用いて光検出器２１
がレーザ光７の中心位置ずれを検出する方法について説
明する。図３はフォトダイオードＢ１〜Ｂ４とその上に
照射された側方散乱光４４との位置関係を示す図であ
る。図３を参照して、側方散乱光４４が（Ａ）のように
フォトダイオードＢ１〜Ｂ４の中心にあると、トラッキ
ング信号Ｔｒ１，Ｔｒ２ともほぼ０になる。この状態に
初期設定しておけば、トラッキング信号Ｔｒ１，Ｔｒ２
の出力のずれにより、レーザ光の光軸のずれが検出でき
る。

【００２９】すなわち、図３（Ｂ）のように、側方散乱
光４４がフォトダイオードＢ１，Ｂ２側に寄ると、トラ
ッキング信号Ｔｒ１＞０，トラッキング信号Ｔｒ２≒０
になる。また、側方散乱光４４がフォトダイオードＢ
１，Ｂ３側に寄ると、トラッキング信号Ｔｒ１≒０，ト
ラッキング信号Ｔｒ２＞０となり、それぞれの方向が検
出できる。

【００３０】再び図１を参照して、この発明に係る流動
粒子分析装置はＩ／Ｏインタフェイス２４に接続され、
フローセル４（シースフロー４１に対応）を図中Ｘ，Ｙ
方向に駆動するＸＹ駆動手段３０を有しており、これを
用いてフローセル４をＸ，Ｙ方向に駆動してフローセル
４のレーザ光７の中心に対するずれを補正している。

【００３１】図４はＸＹ駆動手段３０の構成を示す模式
図である。図４を参照して、フローセル４はフローセル
支柱５３を介してＸＹ駆動手段３０に接続されている。
ＸＹ駆動手段３０としては、たとえばパルスモータやレ
ーザアクチュエータを使用した精密駆動装置が用いられ
る。

【００３２】トラッキング信号Ｔｒ１，Ｔｒ２が所定の
値であるα，βに対して以下のような関係になったと
き、ＣＰＵ２５は信号処理回路１９からのデータ収集を
停止してＸＹ駆動手段３０によりフローセル４の位置補
正を行なう。

【００３３】｜Ｔｒ１｜≧α，｜Ｔｒ２｜≧β 位置補正は、｜Ｔｒ１｜＜α、｜Ｔｒ２｜＜β …（１）の範囲内に入るようにＸ軸およびＹ軸方向にフローセル
４の位置をコントロールする。最適にセッティングした
Ｔｒ１、Ｔｒ２の値をＴｒ１０、Ｔｒ２０とすると、
α、βの値はたとえば、α＝Ｔｒ１０×１．１、β＝Ｔ
ｒ２０×１．１に設定する。

【００３４】図５は前方散乱光４３を検出する光検出器
１０の検出出力データＦＳＣ（forward scattering lig
ht）と光検出器１８の検出するＳＳＣ（side scatterin
g light ）データの信号波形を示す図である。図に示す
ように、ＦＳＣ，ＳＳＣにおいて凹部または凸部が生じ
ている部分でフローセル４において粒子４０が検出され
ている。したがって、フローセル４の位置ずれの検出お
よびコントロールは、図５において，，に示すよ
うに細胞が通過しないときのタイミングで実施する必要
がある。これらのタイミングコントロールは、ＣＰＵ２
５を介して可能である。

【００３５】ＣＰＵ２５は、式（１）の範囲内にＸＹ駆
動手段３０をコントロールできれば、信号処理回路１９
からのデータを再び収集し、たとえばヒストグラムデー
タとして表示部２８に表示する。しかしながら、式
（１）の範囲内に入らないときは、警報手段２９を用い
てオペレータに測定の異常を知らせる。

【００３６】上記実施形態においては、側方散乱光４４
を用いてレーザ光７の位置ずれを検出しているが、これ
に限らず、図６に示すようにシースフロー４１の後方散
乱光６１をハーフミラー６２を介して検出するようにし
てもよいし、図６に示すようにシースフロー４１の前方
散乱光４３をハーフミラー６３を介して検出してもよ
い。

【００３７】また、光検出器３として４分割フォトダイ
オードを用いたが、ＣＣＤやＰＳＤ（Positive Sensiti
ve Device ）のように、光軸のぶれを検出できる光検出
器であればよい。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明に係る流動粒子分析装置の要部を示す
模式図である。

【図２】光検出器の構成を示す模式図である。

【図３】光検出器を構成するフォトダイオードと該光検
出器に照射する側方散乱光の位置関係を示す図である。

【図４】ＸＹ駆動部とフローセルとの関係を示す図であ
る。

【図５】前方光検出器および側方光検出器からの出力デ
ータ例を示す図である。

【図６】この発明の他の実施形態を示す図である。

【図７】この発明の他の実施形態を示す図である。

【図８】従来の流動粒子分析装置の要部を示す模式図で
ある。

【図９】レーザ光の光軸位置がシースフローからずれた
状態のレーザ光の強度分布を示す図である。

【符号の説明】４フローセル６集束レンズ７レーザ光８集光レンズ１０光検出器１１集光レンズ１８光検出器１９信号処理回路２１光検出器２２信号処理回路２３Ａ／Ｄコンバータ２４Ｉ／Ｏインタフェイス２５ＣＰＵ２６ＲＯＭ２７ＲＡＭ２８表示部２９警報手段３０ＸＹ駆動手段４０粒子４１シースフロー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】粒子浮遊液を高速に流す粒子液流送手段
と、前記粒子液流送手段に所定の強度分布をもった光を照射
する照射手段と、集光光学系を介して前記光による粒子からの散乱光また
は蛍光を受光する受光手段と、前記受光手段の受光信号処理を行なう信号処理手段と、前記信号処理手段からの信号をもとに前記粒子の分析を
行なう粒子分析手段と、前記照射手段と前記粒子液流送手段との位置ずれを検出
してその位置ずれ信号を出力する位置ずれ検出手段と、前記位置ずれ信号に基づいて前記粒子液流送手段の位置
を補正する補正手段とを含む、流動粒子分析装置。
【請求項２】前記位置ずれ検出手段は前記粒子からの
前方散乱受光系の光路中に光分割器を介在して前記位置
ずれ信号として検出光を取出す、請求項１に記載の流動
粒子分析装置。
【請求項３】前記位置ずれ検出手段は前記粒子からの
後方散乱受光系の光路中に光分割器を介在して前記位置
ずれ信号として検出光を取出す、請求項１に記載の流動
粒子分析装置。
【請求項４】前記位置ずれ検出手段は前記粒子からの
側方散乱受光系の光路中に光分割器を介在して前記位置
ずれ信号として検出光を取出す、請求項１に記載の流動
粒子分析装置。
【請求項５】前記位置ずれ検出手段は、前記粒子から
の蛍光を受光する方向と対称な方向の側方散乱受光系の
光路中に光分割器を介在して検出光を取出し、その検出
光を前記位置ずれ信号とする、請求項１に記載の流動粒
子分析装置。
【請求項６】前記位置ずれ検出手段は４分割フォトダ
イオードを含む請求項１ないし５のいずれかに記載の流
動粒子分析装置。
【請求項７】前記４分割フォトダイオードは、縦方向
と横方向にマトリックス状に配列され、前記縦方向の電
流差と前記横方向の電流差とを前記位置ずれ信号とす
る、請求項１ないし５のいずれかに記載の流動粒子分析
装置。
【請求項８】前記位置ずれ検出手段は、エリアＣＣＤ
を含む請求項１ないし５のいずれかに記載の流動粒子分
析装置。
【請求項９】前記位置ずれ検出手段は、二次元ＰＳＤ
を含む請求項１ないし５のいずれかに記載の流動粒子分
析装置。