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JPH088864B2 - ルシフェラーゼ - Google Patents

ルシフェラーゼ

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JPH088864B2
JPH088864B2 JP63088246A JP8824688A JPH088864B2 JP H088864 B2 JPH088864 B2 JP H088864B2 JP 63088246 A JP63088246 A JP 63088246A JP 8824688 A JP8824688 A JP 8824688A JP H088864 B2 JPH088864 B2 JP H088864B2
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JP
Japan
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luciferase
temperature
luciferin
buffer
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直樹 梶山
力 増田
宏樹 辰巳
衛一 中野
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Kikkoman Corp
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Kikkoman Corp
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酸素分子によるルシフェリンの酸化触媒す
る、純化されたルシフェラーゼに関する。
〔従来の技術〕
従来、ヘイケボタル（Luciola lateralis）由来のル
シフェラーゼは、不安定であるために精製に成功してい
ないのが実情である〔蛋白質、核酸、酸素、第32巻、第
10号、第44〜59頁、特に第47頁（第1234〜1249頁、特に
1237頁）（1987）〕。
ルシフェラーゼは、ATPの定量等に極めて有効に用い
ることができる。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明はヘイケボタル由来のルシフェラーゼを提供す
ることを目的とする。
〔課題を解決するための手段〕
そこで、本発明者等は、このような実情に鑑み鋭意検
討した結果、ヘイケボタル尾部からルシフェラーゼを単
離し、純化することに成功し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、ヘイケボタル（Luciola laterali
s）から純化されたルシフェラーゼであって、下記の理
化学的性質： 作 用： 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるル
シフェリンの酸化を触媒する酵素である。
ルシフェリン＋ATP＋O2→ オキシルシフェリン＋AMP＋ピロリン酸＋CO2＋光 基質特異性： ADP、CTP、UTP及びGTPには作用しない。
至適pH及び安定pH範囲： 至適pHは、ルシフェリンを基質とした場合、pH7.5〜
9.5である（第１図参照）。
安定pH範囲は、pH6.0〜10.5である（第２図参照）。
作用適温の範囲： ０〜50℃である。
pH、温度等による失活の条件： pH5.0以下及びpH12.0以上で４時間後完全に失活す
る。
pH7.8において、温度55℃、15分間の熱処理により完
全に失活する。
熱安定性： 温度40℃、15分間の処理で78.3％の残存酵素活性を有
し、温度50℃、８分間の処理でも６％の残存酵素活性を
有する。
を有し、かつ以下の精製工程： a.ヘイケボタルルシフェラーゼの粗酵素溶液から30〜70
％の硫酸アンモニウム飽和で形成した沈殿を、1mMエチ
レンジアミン４酢酸２ナトリウム及び硫酸アンモニウム
を10％飽和となるように25mMトリス（ヒドロキシ）アミ
ノメタン−塩酸緩衝液,pH＝7.8に添加することによって
調製した溶液中に溶解すること； b.該溶解した沈殿溶液をゲル濾過クロマトグラフィーに
供し、活性区分を回収すること； c.該活性区分を0.1M塩化ナトリウムおよび10％（V/V）
エチレングリコールを、10mMリン酸１水素ナトリウム−
リン酸２水素ナトリウム溶液に添加することによって調
製した緩衝液に対して透析すること； d.10mMリン酸緩衝液で平衡化したヒドロキシ−アパタイ
トカラム上に該透析物質を吸着すること； e.該ヒドロキシ−アパタイトカラムから10mM〜100mMの
リン酸緩衝液,pH7.5によるリニアグラジエントによって
溶出されたルシフェラーゼ活性を有する区分を採取する
こと； を行うことにより得られる。
以下、本発明を詳細に説明する。
先ず、本酵素の理化学的性質を以下に記載する。
作 用： 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるル
シフェリンの酸化を触媒する酵素である。
基質特異性： ADP、CTP、UTP及びGTPには作用しない。
至適pH及び安定pH範囲： 至適pHは、ルシフェリンを基質とし、25mMグリシルグ
リシンのpHをpH6.5〜11.5迄変化させ、温度30℃で反応
させ、20秒間発光量（フォトン数）を測定した場合、第
１図に示す如くpH7.5〜9.5であり、また安定pH範囲は、
ルシフェリンを含有する緩衝液（pH4.6〜8.0:25mMリン
酸緩衝液、pH8.0〜11.5:25mMグリシン・塩化ナトリウム
−水酸化ナトリウム緩衝液をそれぞれ使用。なお、それ
ぞれの緩衝液には10％飽和となる如く硫酸アンモニウム
を添加したものである。）に酵素を添加し、温度０℃で
４時間作用させた場合、第２図に示す如く、6.0〜10.5
である。なお、第２図において、 それぞれ25mMリン酸緩衝液、及び25mMグリシン・塩化ナ
トリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を使用した場合の活
性を示す。
力価の測定法： 25mMグリシルグリシン（pH7.8）8ml、硫酸マグネシウ
ム溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）に硫酸マグネ
シウムを0.1Mとなる如く添加した溶液〕0.5ml及びルシ
フェリン溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）にルシ
フェリンを1mMとなる如く添加した溶液〕0.8mlを混合し
てルシフェリン混合液を調製する。
このようにして得たルシフェリン混合液400μ及び
測定するルシフェラーゼ10μを混合したものに、ATP
溶液〔25mMグリシルグリシン（pH7.8）にATPを10mMとな
る如く添加したもの。〕80μを注入すると同時に、ル
ミノメーター（アロカ社製、ルミネッセンスリーダ BL
R−201）により発生するフォトン数を20秒間積算して求
める。
作用適温の範囲： pH7.8のもとに、各温度で反応させ20秒間発光量（フ
ォトン数）を測定した場合、０〜50℃の範囲内にある。
pH、温度等による失活の条件： （イ）pHによる失活の条件 pH5.0以下及びpH12.0以上で４時間後完全に失活す
る。
（ロ）温度による失活の条件 pH7.8において、温度55℃、15分間の熱処理により完
全に失活する。
耐熱性： 精製した本酵素100キロカウント（Kcount）含有する
酵素液100μ〔10％（V/V）エチレングリコール、0.1M
NaCl及び0.2％（W/V）アルブミンを含有する60mMリン
酸緩衝液（pH7.5）〕を、温度40℃で15、30及び60分間
保持して残存する酵素活性を測定した結果を、第１表に
示した。
なお、対照としてゲンジボタル及びアメリカホタルの
ルシフェラーゼについても上記と同様にして残存酵素活
性を測定した結果を合せて第１表に示した。
上表より明らかな如く、本発明は、対照に比し著しく
耐熱性を有するルシフェラーゼであることが判る。
次に、本酵素を製造するための具体的手段を以下に述
べる。
本酵素を製造する方法としては、如何なる方法でも良
く、例えば、以下の方法が挙げられる。
本発明に用いられるヘイケボタルとしては、自然界よ
り採集したもの、あるいは人工的に養殖したもの等如何
なるものでもよく、そして、ヘイケボタル尾部には、ル
シフェラーゼが多量に存在するためにヘイケボタル尾部
はルシフェラーゼ分離源として好適である。
そして、緩衝液に、ヘイケボタルを添加して粉砕し、
粉砕物を得る。
緩衝液としては、ルシフェラーゼを失活させるもので
なければ、如何なるものでもよく、例えば、トリス（ヒ
ドロキシ）アミノメタン−塩酸緩衝液、グリシン・塩化
ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等
にそれぞれ10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添加
したもの等が挙げられる。
粉砕手段としては、乳鉢及び乳棒を用いる方法、ホモ
ゲナイザー、ワーリングブレンダー、フレンチプレス等
を用いる方法等が挙げられる。
次いで、粉砕物より通常の遠心分離あるいは濾過処理
等により残渣を除去して、粗酵素液を得るか、これに必
要により凍結乾燥法、アルコール沈澱法、アセトン沈澱
法などを適宜選択して実施することにより粗酵素粉末を
得る。
上記粗酵素液もしくは粗酵素粉末よりさらに精製酵素
標品を得るには、例えばセファデックス、ウルトロゲル
もしくはバイオゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換
体を用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用
いる電気泳動法、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶
出法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティク
ロマト法、分子ふるい膜もしくは中空糸膜等を用いる分
画法等を適宜選択し、組合わせて実施することにより、
精製された酵素標品を得ることが出来る。
〔実施例〕
次に、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。
実施例 25mMトリス（ヒドロキシ）アミノメタン−塩酸緩衝液
に、1mMエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム及び2mMフ
ェニルメチルスルフォニルフルオリドを添加し、更に硫
酸アンモニウムを10％飽和となる如く添加して得た混液
（pH7.8）15mlに、ヘイケボタル〔（株）西武百貨店よ
り購入〕の尾部200匹分を添加し、ヒスコトロン
〔（株）日音医理科器械製作所製〕を用いて破壊したも
のを、12,000r.p.m.で20分間遠心分離処理し、上清（粗
酵素溶液）14.5mlを得た。
このようにして得た粗酵素溶液を常法により硫化アン
モニウムを用いて塩析し、30％〜70％飽和で生成した沈
澱を30,000r.p.m.で10分間遠心分離処理し、その沈澱を
25mM混合液〔少量の25mMトリス（ヒドロキシ）アミノメ
タン−塩酸緩衝液に、1mMエチレンジアミン４酢酸２ナ
トリウム及び10％飽和となる如く硫酸アンモニウムを添
加して得た溶液（pH7.8）〕に溶解させて溶液を得た。
次いで、この溶液を、上記25mM混合液で平衡化された
ウルトロゲル（Ultrogel）AcA34（LKB社製）カラム中を
通過させてゲル濾過クロマトグラフィーを行い活性区分
を得た。
このようにして得た区分を、リン酸緩衝液〔10mMリン
酸１水素ナトリウム−リン酸２水素ナトリウム溶液に、
0.1M塩化ナトリウム及びエチレングリコール10％（V/
V）を添加した緩衝液〕を用いて透析を行い、得られた
溶液を、10mMリン酸緩衝液で平衡化されたヒドロキシ−
アパタイトHPLC（東洋曹達工業社製、TSKgel HA−100
0）カラムに吸着させ、10〜100mM迄のリン酸緩衝液（pH
7.5）によるリニアグラジエント（Liner Gradient）溶
出を行うことにより純化されたヘイケボタル由来のルシ
フェラーゼ活性区分180μ〔酵素活性:2.4×102キロカ
ウント〕を得た。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明酵素の至適pH域を示す図であり、また
第２図は、本発明酵素の安定pH範囲を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中野 衛一 埼玉県岩槻市木曽良２―86 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，74（４），1977，Ｐ．2799− 2802

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヘイケボタル（Luciola lateralis）から
    純化されたルシフェラーゼであって、下記の理化学的性
    質： 作用； 下記の酵素反応式で示されるように酸素分子によるルシ
    フェリンの酸化を触媒する酵素である。 ルシフェリン＋ATP＋O2→ オキシルシフェリン＋AMP＋ピロリン酸＋CO2＋光 基質特異性； ADP、CTP、UTP及びGTPには作用しない。 至適pH及び安定pH範囲； 至適pHは、ルシフェリンを基質とした場合、pH7.5〜9.5
    である。 安定pH範囲は、pH6.0〜10.5である。 作用適温の範囲； ０〜50℃である。 pH、温度等による失活の条件； pH5.0以下及び12.0以上で４時間後完全に失活する。 pH7.8において、温度55℃、15分間の熱処理により完全
    に失活する。 熱安定性； 温度40℃、15分間の処理で78.3％の残存酵素活性を有
    し、温度50℃、８分間の処理でも６％の残存酵素活性を
    有する。 を有し、かつ以下の精製工程： a.ヘイケボタルルシフェラーゼの粗酵素溶液から30〜70
    ％の硫酸アンモニウム飽和で形成した沈殿を、1mMエチ
    レンジアミン４酢酸２ナトリウム及び硫酸アンモニウム
    を10％飽和となるように25mMトリス（ヒドロキシ）アミ
    ノメタン−塩酸緩衝液,pH＝7.8に添加することによって
    調製した溶液中に溶解すること； b.該溶解した沈殿溶液をゲル濾過クロマトグラフィーに
    供し、活性区分を回収すること； c.該活性区分を0.1M塩化ナトリウムおよび10％（V/V）
    エチレングリコールを、10mMリン酸１水素ナトリウム−
    リン酸２水素ナトリウム溶液に添加することによって調
    製した緩衝液に対して透析すること； d.10mMリン酸緩衝液で平衡化したヒドロキシ−アパタイ
    トカラム上に該透析物質を吸着すること； e.該ヒドロキシ−アパタイトカラムから10mM〜100mMの
    リン酸緩衝液,pH7.5によるリニアグラジエントによって
    溶出されたルシフェラーゼ活性を有する区分を採取する
    こと； を行うことにより得られる純化された該ルシフェラー
    ゼ。
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