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JPH08512406A - Hepatitis E virus confirmation assay and reagents - Google Patents

Hepatitis E virus confirmation assay and reagents

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Publication number
JPH08512406A
JPH08512406A JP7504052A JP50405295A JPH08512406A JP H08512406 A JPH08512406 A JP H08512406A JP 7504052 A JP7504052 A JP 7504052A JP 50405295 A JP50405295 A JP 50405295A JP H08512406 A JPH08512406 A JP H08512406A
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JP
Japan
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seq
peptide
antibody
hev
assay
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP7504052A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
ドーソン，ジヨージ・ジエイ
グテイーレス，ロビン・エイ
ポール，デボラ・エイ
ナイツジ，マーク・エフ
Original Assignee
アボツト・ラボラトリーズ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アボツト・ラボラトリーズ filed Critical アボツト・ラボラトリーズ
Publication of JPH08512406A publication Critical patent/JPH08512406A/en
Pending legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

(57)【要約】 検査試料中に存在し得る抗ＨＥＶ抗体の存在を検出するために有用なアッセイ、試薬及び検査キット。アッセイ方法は、（ａ）試料を、抗ＨＥＶ抗体に特異的に結合する１種類以上の合成ペプチドに、ペプチド／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で接触させ、（ｂ）前記ペプチド／抗体複合体を、抗ヒト抗体に接合したシグナル発生化合物からなる指示試薬に接触させ、ペプチド／抗体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、（ｃ）検査試料中の抗ＨＥＶ抗体の存在を示す測定可能シグナルを検出することからなる。   (57) [Summary] Assays, reagents and test kits useful for detecting the presence of anti-HEV antibodies that may be present in a test sample. The assay method comprises: (a) contacting a sample with one or more synthetic peptides that specifically bind anti-HEV antibodies for a time and under conditions sufficient to form a peptide / antibody complex; The antibody / antibody complex is contacted with an indicator reagent consisting of a signal-generating compound conjugated to an anti-human antibody and incubated for a time and under conditions sufficient to form a peptide / antibody / antibody complex, (c) in the test sample It consists of detecting a measurable signal indicative of the presence of anti-HEV antibody.

Description

【発明の詳細な説明】 肝炎Ｅ型ウイルス確認アッセイ及び試薬発明の背景 本発明は、一般的には肝炎Ｅ型ウイルス（ＨＥＶ）に関し、より特定的には、 検査試料中のＨＥＶに対する抗体の存在を確認するために有用なアッセイに関す る。 水系伝染、流行性、又は腸伝染非Ａ非Ｂ型肝炎（ＥＴ−ＮＡＮＢＨ）といった ように様々に呼ばれるＨＥＶは世界中に分布しており、発展途上国ではウイルス 性肝炎の大半の風土性発生の原因であることが確認された。Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌ ｅｙら，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４４２−４６１（１９９０）。先進国 でも、ＥＴ−ＮＡＮＢＨの散発性症例、及び旅行者によってもたらされた感染が 報告されている。Ｓ．Ｊ．Ｓｋｉｄｍｏｒｅら，Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１５４ １（１９９１）。主な伝染経路は糞便−経口であるが、ある疫学研究によれば、 限定された人−人感染経路も示唆された。Ｏ．Ｖｅｌａｓｑｕｅｚら，Ｊ．Ａｍ ｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ． ３６３：３２８１−３２８５（１９９０）。この病 気は、妊娠７ケ月〜９ケ月の妊 婦が感染した場合には死亡率が高く、約２０％であることが実証されている。Ｄ ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙら、前出文献参照。 ＨＥＶの推定病原体の分子クローニングは、ウイルスに感染する組織培養シス テムが存在しないために、これまで実現しなかった。しかしながら、入手可能な 動物モデルの使用及び新たに開発された非特異的増幅方法によって、ＨＥＶビル マ株に感染したシノモルガス（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）マカクの胆汁から得られ る固有のｃＤＮＡクローンが同定された（「ＥＴ１．１」と命名）。Ａ．Ｇ．Ａ ｎｄｊａｐａｒｉｄｚｅら，Ｖｏｐｒ．Ｖｉｒｕｓｏｌ．１：７３−８０（１９ ８６）、Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８４：６２７７−６２８１（１９８７）、及びＧ．Ｗ．Ｒｅｙｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３３５−１３３９（１９９０）。このクローンのウ イルス起源の確認の成功により、ソマリア、タシケント、ボルネオ、パキスタン 及びメキシコでのＥＴ−ＮＡＮＢＨの流行の際に採取されたヒト糞便試料中で類 似の配列が同定された。Ｇ．Ｒ．Ｒｅｙｅｓら，前出文献参照。メキシコのＥＴ −ＮＡＮＢＨの発生時に採 取されたヒト糞便試料から、ｃＤＮＡライブラリーも形成された。Ｇ．Ｒ．Ｒｅ ｙｅｓら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，Ｊａｐｏｎ．２６：１４２−１４７（ １９９１）。 これらのｃＤＮＡライブラリーのイムノスクリーニングの結果、ＨＥＶに特異的 なエピトープをコードする二つのｃＤＮＡクローンが同定された。Ｐ．Ｏ．Ｙａ ｒｂｏｕｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５７９０−５７９７（１９９１）。一 組の重複ｃＤＮＡクローンの単離及び配列解析の結果、この形態の肝炎は、他の 特性解析されたウイルス性肝炎病原体のいずれとも分子的に異なる新しいウイル スに起因することが判明した。Ａ．Ｗ．Ｔａｍ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５ ：１２−１３１（１９９１）。 ＨＥＶゲノムの種々の領域がクローニングされ、大腸菌内で、グルタチオン− Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現された。例え ばＳ．Ｊ．Ｓｋｉｄｍｏｒｅら，前出文献参照。これらの組換え抗原のうちの４ 個、即ちＨＥＶビルマ（Ｂ）株に由来する２個と、ＨＥＶメキシコ（Ｍ）株に由 来する２個は、以前にＨＥＶにさらされた個体に由来する抗体によって認識され る抗原部位を含むことが判明した。Ｐ．Ｏ．Ｙａｒｂｏｕｇｈら、 前出文献参照。メキシコ株由来の二つの抗原であるＭ３−２及びＭ４−２は、そ れぞれ第二読取り枠（ＯＲＦ−２）及び第三読取り枠（ＯＲＦ−３）のカルボキ シ末端のアミノ酸配列に対応する。ビルマ株由来の二つの抗原であるＢ３−２及 びＢ４−２は、それぞれＯＲＦ−２及びＯＲＦ−３のカルボキシ末端のアミノ酸 配列に対応する。Ｍ３−２及びＢ３−２組換え抗原はどちらも、ＯＲＦ−２のカ ルボキシ末端からの４２個のアミノ酸を含む。これらの４２アミノ酸配列の間の アミノ酸相同度は９０．５％である。前出文献参照。Ｍ４−２及びＢ４−２組換 え抗原はいずれも、ＯＲＦ−３のカルボキシ末端からの３３個のアミノ酸を含む 。これら二つの３３アミノ酸配列の間の相同度は７３．５％である。前出文献参 照。 Ｍ３−２、Ｍ４−２、Ｂ３−２及びＢ４−２組換え抗原は、個体の検査試料を 抗ＨＥＶ抗体に関してアッセイすることにより個体内のＨＥＶ抗体の存在を決定 するためのアッセイで使用されてきた。しかしながら、組換え技術の使用は偽陽 性の結果をもたらし得る。これは、主に二つの理由に起因し得る。第一の理由は 、所望の組換え抗原の製造方法が、これらの抗原を微生物培養、通常は細菌又は 酵母源 の培養で製造することからなるという点にある。この操作の間には、細菌又は酵 母タンパク質が組換え抗原と同時に精製される。従って、精製組換え抗原をアッ セイで捕捉相に使用したときには、同時精製された細菌又は酵母タンパク質も存 在することになる。検査試料は、組換え抗原及び同時精製細菌タンパク質のいず れか又は両方に対する抗体を有し得る。同時精製タンパク質に対する抗体を有す る検査試料を、検査試料中の所期の対象分析物に対する抗体を捕捉するために使 用される目的の組換え抗原の存在下に反応させると、検査試料中の抗体は同時精 製タンパク質の方に結合する。検査試料が同時精製細菌又は酵母タンパク質と反 応すると偽陽性反応が生起し得、所期の対象分析物に関しての「陽性」と誤認す る。第二の理由は、組換えＨＥＶ抗原がＧＳＴ中の融合タンパク質として発現さ れることにある。周知のように、個体の中にはＧＳＴに対する抗体を産生するも のがある。従って、クローニングされ、ＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌 内で発現されたＨＥＶ組換え抗原を使用するアッセイでも偽陽性反応が起こり得 る。なぜなら、ＧＳＴにだけ反応し得る個体の場合にも、組換えタンパク質を捕 捉抗原として使用した場合、ＨＥＶ 特異的対象分析物に対する抗体のアッセイで陽性反応を示し得るからである。更 に、商業的使用に必要な大量の組換え抗原の製造には特別の製造設備が必要であ り得、商業的使用に必要な厳密な規則条件が多い範囲内での組換え抗原の製造は 問題であることが多い。 ＨＩＶのような病原体ではスクリーニングアッセイの結果の存在を確認するた めの方法があるが、これらの技術はＨＥＶの存在の確認にはまだ使用できない。 例えば、ＨＥＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養及びウエスタンブロット検査のような方 法は使用できない。ＨＥＶ核酸の検出はＰＣＲの実施によって試み得るが、この 方法は手間と費用がかかり、サーモサイクラーのような特殊な装置を必要とし、 所要時間が２４時間に及ぶ。抗ＨＥＶ抗体の存在の確認には免疫電子顕微鏡法（ ＩＥＭ）が使用されてきたが、ＩＥＭの使用は日常的な確認手段としては費用の 制約がある。 従って、検査試料中のＨＥＶ抗体の存在を確認するための、正確で、迅速で費 用効率の高い方法を提供することは、有益なことであろう。発明の概要 本発明は、検査試料中の抗ＨＥＶ抗体の存在を確認する ためのアッセイを提供する。このアッセイは、（ａ）検査試料を、抗ＨＥＶ抗体 に特異的に結合する１種類以上の合成ペプチドと、ペプチド／抗体複合体の形成 に十分な時間及び条件下で接触させ、（ｂ）前記ペプチド／抗体複合体を、抗ヒ ト抗体に接合したシグナル発生化合物からなる指示試薬と接触させ、ペプチド／ 抗体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートし、（ｃ）検 査試料中の抗ＨＥＶの存在を示す測定可能なシグナルを検出することからなる。 本発明で使用するＨＥＶ合成ペプチドのアミノ酸配列は、Ｐ．Ｏ．Ｙａｒｂｏ ｕｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：５７９０−５７９７（１９９１）に記載の ような予測されたアミノ酸配列から得た。これらの合成ペプチドには、ＳＰＭ４ ２（配列番号１、組換え抗原Ｍ４−２に対応）、ＳＰＢ４２（配列番号２、組換 え抗原Ｂ４−２に対応）、ＳＰＢ３３（配列番号３、組換え抗原Ｂ３−２に対応 ）及びＳＰＭ３３（配列番号４、組換え抗原Ｍ３−２に対応）がある。 本発明は、抗ＨＥＶ抗体の存在について検査試料をアッセイするために有用な 本発明の合成ＨＥＶペプチドを１種 類以上含むキットも提供する。発明の詳細な説明 本発明は、肝炎Ｅ型ウイルス（ＨＥＶ）に対する抗体の検出に有用なアッセイ 、合成ペプチド及びキットを提供する。本発明の配列は合成手段で製造されるた め、ＧＳＴ中で製造された組換えタンパク質に伴う問題がなく、又は、しばしば 組換え抗原と同時精製される外来細菌もしくは酵母タンパク質も含まない。従っ て、本明細書で開示する合成ペプチドは、当業者に公知の組換え抗原と比べて、 これらの組換えタンパク質が有する交差反応性の問題がないため有利である。 合成ペプチドは、種々のアッセイで使用される以外に、ＣＮＢｒ活性化セファ ロースと類似のマトリクスに接合して、細胞培養物又は生物組織、例えば血液及 び肝臓から、ＨＥＶ抗原に特異的な抗体をアフィニティ精製するために使用する ことができる。また、本発明の合成ペプチドは、治療及び他の類似用途に使用す るためのキメラ、モノクローナル又はポリクローナル抗体の製造にも使用できる 。 本明細書で開示する本発明の合成ペプチドは、単独で又は組合わせて使用し得 る。例えば、本発明の１種類以上の ペプチドを単一固相に接合して種々のアッセイシステムで使用し得る。あるいは 、個々のペプチドを微粒子のような固相に別個に接合し、同様に処理した別の微 粒子と組合わせてアッセイで使用してもよい。こうしたアッセイでは、アッセイ のペプチド及び／又はペプチド濃度を変えることによって最適化できる。アッセ イを最適化する方法は当業者によく知られている。接合方法は当業者に幾つか知 られており、例えばコーティング及び共有結合が挙げられる。 本明細書に記載の本発明の方法によって検査できる「検査試料」としては、所 期の抗体を含む可能性があるヒト又は動物の体液、例えば全血、血清、血漿、脳 脊椎液、尿、腹水もしくは他の任意の身体構成成分又は任意の組織培養上清が挙 げられる。 本明細書で使用する「固相」という用語は、不溶性であるか又は後続の反応に よって不溶性にできる任意の物質を意味する。固相としては、捕捉試薬を引き付 け固定する能力が本来備わっているものを選択し得る。あるいは、捕捉試薬を引 き付け固定する能力を有する別の受容体を保持できる物質を固相として使用する 。別の受容体としては、捕捉試薬自体又は捕捉試薬に結合した帯電物質と逆の電 荷を 有する帯電物質が挙げられる。あるいは、受容体分子は、固相上に固定され（固 相に接合し）て、特異的結合反応を介して捕捉試薬を固定することができる任意 の特異的結合員であってもよい。受容体分子は、アッセイの実施前又はアッセイ の実施中に、捕捉試薬を固相物質に間接的に結合させる事ができる。従って固相 は、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ及び他 の当業者に公知の形状のプラスチック、誘導体化プラスチック、磁性もしくは非 磁性金属、ガラス又はケイ素からなる表面であり得る。 固相は、検出抗体によるアクセスに十分な多孔率と、抗原に結合するのに適し た表面親和性とを有する、任意の適当な多孔性物質からなることも考えられ、そ れも本発明の範囲内に包含される。通常はミクロ多孔質構造が好ましいが、水和 状態でゲル構造を有する物質も使用し得る。この種の有用な固体支持体としては 、天然高分子炭水化物及びこれらを合成的に改質、架橋又は置換した誘導体、例 えば寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアーゴム、セルロース エステル、特に硝酸及びカルボン酸とのエステル、混合セルロースエステル及び セルロースエーテ ル；窒素含有天然ポリマー、例えばタンパク質及び架橋もしくは改質ゼラチンを 含む誘導体；天然炭化水素ポリマー、例えばラテックス及びゴム；適度に多孔性 の構造を有するように製造し得る合成ポリマー、例えばビニルポリマー、具体例 として、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ 酢酸ビニル及びその部分加水分解誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレ ート、前記重縮合物のコポリマー及びターポリマー、例えばポリエステル、ポリ アミド及び他のポリマー、例えばポリウレタン又はポリエポキシド；多孔質無機 材料、例えばアルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩又は炭酸塩、具体例と して硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム；アルカリ金属、アルカリ 土類金属、アルミニウム及びマグネシウムのケイ酸塩；アルミニウム又はケイ素 の酸化物又は水和物、例えばクレー、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト 、シリカゲル又はガラス（これらの物質は前記ポリマー物質と共にフィルターと して使用し得る）；並びに前述の物質類の混合物又はコポリマー、例えば先在す る天然ポリマーに合成ポリマーを重合せしめたグラフトコポリマーが挙げられる 。これらの物質はいずれも、フィルム、 シート又はプレートのような適当な形態で使用し得、あるいは紙、ガラス、プラ スチックフィルム又は布のような適当な不活性担体にコーティング、結合又は積 層し得る。 ニトロセルロースの多孔質構造は、モノクローナル抗体を含む広範囲の試薬に 対して優れた吸収性及び吸着性を示す。ナイロンも類似の特性を有し、やはり適 当な物質である。 前述のような多孔質固体支持体は、厚さ約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは 約０．１ｍｍのシートの形態を有するのが好ましいと考えられる。孔径は広範囲 で変化し得、好ましくは約０．０２５〜１５ミクロン、特に約０．１５〜１５ミ クロンである。この種の支持体の表面は、抗原又は抗体を支持体に共有結合させ る化学的操作によって活性化し得る。このようにすれば抗原又は抗体の不可逆的 結合が得られるが、通常は十分に解明されていない疎水性の力による多孔質物質 上への吸着によって結合する。 フロースルー・アッセイ装置用の好ましい固相材料としては、多孔性ガラス繊 維材料又は他の繊維マトリクス材料のような濾紙が挙げられる。この種の材料の 厚さは重要でなく、主にアッセイする試料又は対象分析物の特性、例え ば検査試料の流動性に応じて選択すべきものである。 固相の本来の電荷を変えるか又は増加させるために、帯電物質を前記材料に直 接コーティングするか、又は後で固相支持材料に保持されることになる微粒子に コーティングし得る。あるいは、微粒子をカラム内に保持するか又は可溶性試薬 と検査試料との混合物中に懸濁して、固相として使用することもでき、又は粒子 自体を固相支持材料によって保持し固定することもできる。「保持し固定する」 という表現は、支持材料の表面又は内部の粒子が、支持材料内の他の場所に実質 的に移動できない状態を意味する。粒子は、当業者が任意の適当な種類の粒状物 質の中から選択し得、具体例としては、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート 、ポリプロピレン、ラテックス、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニ トリル、ポリカーボネート又は類似の物質からなるものが挙げられる。粒子の大 きさは重要でないが、粒状の平均直径は使用する支持材料の平均孔径より小さい ことが好ましい。このように、他の種々の固相を使用する具体例も考えられ、本 発明の範囲内に包含される。例えば、欧州特許公開第０３２６１００号に対応す る同時係属米国特許出願第１５０，２７８号及び米国特許 出願第３７５，０２９号（欧州特許公開第０４０６４７３号）に記載されている 、負電荷ポリマーとの固定化可能反応複合体を固定するためのイオン捕捉操作を 本発明で使用して、高速溶液相免疫化学反応を実施することができる。固定化可 能な免疫複合体を、負電荷のポリアニオン／免疫複合体と、予め処理した正電荷 の多孔質マトリクスとの間のイオン交換によって反応混合物の残部から分離し、 前述のシグナル発生システム、例えば欧州特許公開第０，２７３，１１５号に対 応する同時係属米国特許出願第９２１，９７９号に記載の化学発光シグナル測定 を用いて検出する。 本発明の方法は、微粒子技術を用いるシステム、例えば固相が微粒子からなる 自動化及び半自動化システムでの使用に適合させることもできる。この種のシス テムとしては、公開欧州特許出願第０４２５６３３号及び第０４２４６３４号に それぞれ対応する係属米国特許出願第４２５，６５１号及び米国特許第５，０８ ９，４２４号、並びに米国特許第５，００６，３０９号に記載のものが挙げられ る。 「指示試薬」は、抗ＨＥＶ抗体用の特異的結合員に接合していて、外部手段に よって検出できる測定可能シグナル を発生するシグナル発生化合物（標識）を含み得る。本明細書で使用する「特異 的結合員」という用語は、特異的結合対、即ち、一方の分子が化学的又は物理的 手段を介して他方の分子に特異的に結合する二つの異なる分子のうちの一員を意 味する。指示試薬は、抗ＨＥＶ抗体用の特異的結合対の抗体又は抗体フラグメン トからなる結合員である外に、ハプテン−抗ハプテン系、例えばビオチン又は抗 ビオチン、アビジン又はビオチン、炭水化物又はレクチン、相補的ヌクレオチド 配列、エフェクター又は受容体分子、補酵素又は酵素、並びに酵素阻害剤又は酵 素等のいずれかを含む任意の特異的結合対の一員であり得る。 使用可能な種々のシグナル発生化合物（標識）としては、発色体；触媒、例え ばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー ゼ等のような酵素；発光化合物、例えばフルオレセン及びローダミン、化学発光 化合物、例えばアクリジニウム、フェナントリジニウム、ジオキセタン、ルミノ ール等；放射性元素；及び直接可視標識が挙げられる。いずれの標識を選択する かは重要でないが、それ自体で、又は１種類以上の別の物質と協働してシグナル を発生できるものがよい。 本発明の合成ペプチドは、抗ＨＥＶ抗体の定性検査で事前に反応性（又は「陽 性」）であるとされた検査試料中の、抗ＨＥＶ抗体の存在を確認するための種々 のアッセイシステムで使用できる。これらのペプチドは、組換え抗原Ｍ４−２に 対応する配列番号１、組換え抗原Ｂ４−２に対応する配列番号２、組換え抗原Ｂ ３−２に対応する配列番号３、及び組換え抗原Ｍ３−２に対応する配列番号４と して同定されている。第一の実施態様で、本発明は、（ａ）検査試料を１種類以 上のＨＥＶ合成ペプチドと接触させ、得られた混合物を、ペプチド／抗体複合体 の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートするステップと、（ｂ）前記ペ プチド／抗体複合体を、検出できる測定可能シグナルを発生することができるシ グナル発生化合物に接合した抗ヒト抗体又はそのフラグメントからなる指示試薬 と接触させ、この第二の混合物を、ペプチド／抗体／指示試薬複合体の形成に十 分な時間及び条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）検査試料中の抗Ｈ ＥＶの存在を示すものとしてシグナル発生化合物から発生した測定可能シグナル を検出するステップとを含むアッセイを提供する。好ましくは、捕捉ペプチドを 、アッセイで使用する前に固相に結合する。 固相を使用する場合は、シグナル発生化合物の検出の前に液相から固相を分離し 得る。また、ステップ（ａ）及び（ｂ）は同時に実施できる。本発明では、いず れのアッセイ実施態様でも検査試料を希釈することができ、本明細書に記載の全 てのアッセイ手順のステップの合間に洗浄を実施し又は実施し得る。 あるいは、事前に抗ＨＥＶ抗体に対して反応性を示した検査試料を、抗ＨＥＶ 抗体に特異的に結合するＨＥＶ抗原（免疫応答［例えば抗体産生」を誘発する、 ＨＥＶでコードされたアミノ酸の配列）からなる溶液相捕捉試薬と接触させ、抗 体／抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートする。次いで抗 体／抗原複合体を、最初のステップで使用したＨＥＶ抗原内に存在するアミノ酸 を含む合成ＨＥＶペプチドからなる固相捕捉試薬と接触させる。複合体及び固相 を、ペプチド／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベートする 。次いで、固相を溶液から分離し、測定可能シグナルを発生することができるシ グナル発生化合物に接合したモノクローナルもしくはポリクローナル抗ヒト抗体 又はそのフラグメントからなる指示試薬と接触させて混合物を形成する。この混 合物を、ペ プチド／抗体／指示試薬複合体の形成に十分な時間及び条件下でインキュベート する。固定した抗体の存在は、発生した測定可能シグナルの検出によって決定さ れる。発生したシグナルの量が最初のスクリーニングと比べて減少していれば、 検査試料中に抗ＨＥＶ抗体が存在していることになる。 別の実施態様では、少なくとも一つのＨＥＶ合成ペプチドをニトロセルロース 膜上に固定する。このペプチドをニトロセルロース膜上に固定する前に、このペ プチドに別のペプチドを結合もしくは架橋するか、又はこのペプチドを種々の担 体タンパク質、例えばＢＳＡ、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブ ミン等に結合もしくは架橋することもできる。検査試料を、ペプチド／抗体複合 体の形成に十分な時間及び条件下で、膜上でインキュベートする。非結合タンパ ク質を除去した後、膜をシグナル発生化合物で標識した抗ヒト抗体からなる指示 試薬と共にインキュベートする。検査試料の抗ＨＥＶ抗体の存在及び／又は量は 、測定可能シグナルの検出によって決定される。シグナルの量は、検査試料中に 存在する抗ＨＥＶ抗体の量に依存する。 他の種々の固相を使用する別の実施態様も考えられ、本 発明の範囲内に包含される。例えば、いずれも本出願人によるもので本明細書に 参考として包含される、欧州特許公開第０３２６１００号に対応する同時係属米 国特許出願第１５０，２７８号及び米国特許出願第３７５，０２９号（欧州特許 公開第０４０６４７３号）に記載されている、負電荷のポリマーで固定化可能反 応複合体を固定するためのイオン捕捉方法を本発明で使用して、高速溶液相免疫 化学反応を行うことができる。固定化可能免疫複合体を、負電荷のポリアニオン ／免疫複合体と予備処理した正電荷の多孔質マトリクスとの間のイオン交換によ って反応混合物の残部から分離し、前述の種々のシグナル発生システム、例えば 本明細書に参考として包含される本出願人の欧州特許公開第０２７３１１５号に 対応する同時係属米国特許出願第９２１，９７９号に記載の化学発光シグナル測 定を用いて検出する。 本発明の方法は、微粒子技術を用いるシステム、例えば固相が微粒子からなる 自動化及び半自動化システムでの使用に適合させることもできる。この種のシス テムとしては、公開欧州特許出願第０４２５６３３号及び第０４２４６３４号に それぞれ対応する係属米国特許出願第４２６，６５ １号及び第４２６，６４３号に記載のものが挙げられる。これらの先行特許出願 は本明細書に参考として包含される。 イムノアッセイ用の走査型プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）の使用も、本発明の合 成ペプチドに容易に適用できる方法である。走査型プローブ顕微鏡法、特に原子 力顕微鏡法では、捕捉相、例えば本発明の合成ペプチドのうちの一つ以上を固相 に付着し、固相表面に存在し得る抗原／抗体複合体を走査型プローブ顕微鏡で検 出する。走査型トンネル顕微鏡法を使用すれば、抗原／抗体複合体を検出するた めに多くのイムノアッセイシステムで通常使用しなければならない標識の必要が なくなる。この種のシステムは、本明細書に参考として包含される本出願人の係 属米国特許出願第６６２，１４７号に記載されている。 特異的結合反応をモニターするためのＳＰＭの使用は様々に実施し得る。ある 実施態様では、特異的結合相手（本発明の合成ペプチドである抗体特異性物質） の一結合員を、走査に適した表面に接合する。抗体特異性物質の接合は、当業者 の公知の方法に従い、プラスチック又は金属面からなる固相を含む試験片への吸 着によって行い得る。あるい は、誘導体化プラスチック、金属、ケイ素又はガラスの固相を含む試験片への特 異的結合相手（抗体特異性物質）の共有結合を使用してもよい。共有結合の方法 は当業者に公知であり、例えば試験片に特異的結合相手を不可逆的に結合する様 々な手段がある。試験片がケイ素又はガラスの場合は、特異的結合相手を結合す る前に表面を活性化しなければならない。アミノ、ビニル及びチオールのような 反応基を導入するためには、それぞれトリエトキシアミノプロピルシラン（Ｓｉ ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている）、 トリエトキシビニルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社，Ｍｉｌｗａ ｕｋｅｅ，ＷＩ）及び（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（Ｓｉｇ ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）のような活性化シラン化合物を使用し得る。このよ うな活性化表面は結合相手を直接結合するために使用でき（アミノ又はチオール の場合）、又は活性化表面を更にグルタルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル ）スベレート、ＳＰＰＤ９（スクシンイミジル３−［２−ピリミジルジチ］プロ ピオネート）、ＳＭＣＣ（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１− カルボン酸スクシンイミジル）、Ｓ ＩＡＢ（［４−ヨードアセチルアミノ］安息香酸スクシンイミジル）及びＳＭＰ Ｂ（４−［１−マレイミドフェニル］酪酸スクシンイミジル）のようなリンカー と反応させて、表面から結合相手を分離し得る。ビニル基は、共有結合手段を得 るために酸化し得る。この基は、ポリアクリル酸のような種々のポリマーの重合 のためのアンカーとして使用することもできる。その場合は、特異的結合相手の ための複数の結合点を得ることができる。アミノ面は、異なる大きさ及び能力の 親水性リンカーを得るために、種々の分子量の酸化デキストランと反応させ得る 。酸化可能デキストランの具体例としては、デキストランＴ−４０（分子量４万 ダルトン）、デキストランＴ−１１０（分子量１１万ダルトン）、デキストラン Ｔ−５００（分子量５０万ダルトン）、デキストランＴ−２Ｍ（分子量２百万ダ ルトン）（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから市販 されている）、又はＦｉｃｏｌｌ（分子量７万ダルトン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ社，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている））が挙げられる。ま た、１９８８年１月２９日出願の係属米国特許出願第１５０，２７８号及び１９ ８９年７月７日出願の第３７５，０ ２９号に記載の方法及び化学手段を用いて、高分子電解質相互作用により特異的 結合相手を試験片表面に固定してもよい。前記特許出願はいずれも本出願人によ るもので、本明細書に参考として包含される。好ましい接合方法は共有接合であ る。特異的結合相手の接合に次いで、非特異的接合を最小にするために、表面を 血清、タンパク質又は他の阻止剤のような物質で更に処理してもよい。表面はま た、アッセイの目的に対する適性を確認するために、製造場所又は使用場所で走 査し得る。走査プロセスが試験片の特異的結合特性を変えることはないと考えら れる。 本発明は固相の使用が好ましいことを明らかにするが、本発明のペプチドは非 固相アッセイシステムでも使用できる。これらのアッセイシステムは当業者に公 知であり、本発明の範囲内に含まれるとみなされる。 アッセイに使用する試薬は、アッセイで使用するペプチド又はペプチド混合物 のような別個の試薬を入れたバイアル又はビンのような容器を一つ以上含むキッ トの形態で提供できると考えられる。これらのキットは、アッセイの実施に必要 な別の試薬、例えば洗浄試薬、処理試薬及び指示試薬のバイアル又は容器も含み 得る。 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を 明らかにするものであって、限定するものではない。 実施例１ 合成ペプチドの合成 Ａ． ＳＰＢ４２（配列番号２）の合成 完全に保護したペプチド樹脂を、Ｇ．Ｂａｒａｎｙ及びＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆ ｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，（Ｅ．Ｇｒｏｓｓ及びＴ．Ｍｅｉｎｈｏ ｅｆｆｅｒ編）２，１−２８４（１９８０），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹの方法に従い、段階的固相合成（カルボキシル末端残基 から始める）によって下記のようにフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂 上に組み立てた。Ｃ末端アミノ酸アルギニン（Ａｒｇ）をオキシメチルフェニル アセトアミドメチル（ＯＭＰＡ）結合を介して固体支持体に結合し、トリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）での長時間の処理に対しても安定性の高いＰＡＭ樹脂を得た。 ＢＯＣ−Ａｒｇ（ＴＯＳ）−ＯＣＨ2−ＰＡＭ−樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、 ０．１６１４８ｇ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（ＡＢＩ）ペ プチド合成器モ デル４３０Ａ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから市販されている）の 反応容器に移した。カルボキシル末端からＮ末端までの後続アミノ酸の総てを、 キャッピングを含むＡＢＩの０．１ｍｍｏｌ小規模高速サイクル手順（ＡＢＩ、 製品番号［Ｐ／Ｎ］６０１７８１、バージョン１．４０）を用いて段階的に結合 した。保護アミノ酸を、予め形成した対称性無水物化学を用いて結合した。但し 、アスパラギン、グルタミン、アルギニン及びヒスチジンは、Ｎ，Ｎ’−ジシク ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（Ｈ ＯＢＴ）化学を用いて二重結合した。最初の結合では、ジメチルホルムアミド（ ＤＭＦ）中に溶解した無水酢酸を用いて保護アミノ酸を結合した。個々のアミノ 酸の酢酸との無水物を塩化メチレン中で形成し、次いで溶剤をＤＭＦと交換し、 その後ペプチド合成器の反応容器に移した。対称性無水物による第二の結合はＤ ＭＦ中で実施した。使用した総てのアミノ酸のＮ−アミノ基をｔ−ブチルオキシ カルボニル（ｔ−ＢＯＣ）結合によって保護した。種々のアミノ酸の側鎖官能基 を下記の基で保護した： Ｓｅｒ−Ｂｚｌ（ベンジル） Ａｓｐ，Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（Ｏ−ベンジル） Ｈｉｓ−ＤＮＰ（ジニトロフェノール） Ａｒｇ−Ｔｏｓ（トシレート） 完全に保護したペプチド樹脂（０．３３８ｇ）を塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2） 中で５分間膨潤させた。このペプチド樹脂を手動反応容器に移し、ＤＭＦ中５％ チオフェノールで２０分間の処理を２回実施し、各処理後に１分間のＣＨ2Ｃｌ2 洗浄を６回行い、次いで合成器の反応容器に移した。次いで、製造業者指定手順 （ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に従い、ＣＨ2Ｃｌ2中６０％ＴＦＡ を用いてｔ−ＢＯＣ保護基を除去し、部分的に脱保護したペプチド樹脂を、実験 室真空下、室温で一晩乾燥した。 次いで、部分的に脱保護したペプチド樹脂を無水フッ化水素（ＨＦ、９ｍｌ） 中のｐ−クレゾール（１ｍｌ）で０℃で２時間処理して、樹脂支持体からペプチ ドを開裂した。ＨＦ／ＤＭＳ及び他の揮発物質を真空下０℃で留去した。開裂ペ プチド及び樹脂を１５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、開裂ペプチド を１０ｍｌずつの４０％酢酸水溶液及び１６％酢酸水溶液でそれぞれ３回洗浄し て抽出した。水性抽出物をまとめて、１５ｍｌずつのジエチルエ ーテルで３回洗浄し、次いで凍結乾燥して未精製ペプチドを得た。 未精製ペプチドの純度を、Ｃ４、４．６×３０ｍｍカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｔｈ ｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）での逆相 高性能液体クロマトグラフィーを使用し、流速１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡ水 溶液（Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）を溶媒系として用いて分析した。 このペプチド分析に使用した好ましい溶媒勾配は、２０％Ｂ溶媒から始めた。カ ラムを２０％Ｂに５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で５０％Ｂま で増加させ、１分間維持した。最後に、カラムを２分間で２０％Ｂに戻した。流 出液中のペプチドの存在を２２５ｎｍ及び２５４ｎｍで同時に監視した。精製ペ プチドの組成を酸加水分解によって測定した。酸を除去した後、加水分解物をＢ ｅｃｋｍａｎ ６３００アミノ酸分析計で分析した。 精製ポリペプチドを大量に得たい場合には、半分離用逆相高性能液体クロマト グラフィーを、Ｃ１８、１０×１００ｍｍカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｔｈｅ Ｓｅｐ ａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）を用いて、 前記と同じ０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００アセトニトリル（Ｂ）溶媒系 を使用して、類似の方法で実施した。半分離操作の好ましい溶媒勾配は２１％Ｂ で開始し、３ｍｌ／分で５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で４０ ％Ｂまで増加させた。濃度を４０％Ｂに１分間維持し、次いで１分間で２１％Ｂ に低下させた。 Ｂ． ＳＰＢ３３（配列番号３）の合成 完全に保護したペプチド樹脂を、前出のＢａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌ ｄの一般的方法に従い段階的固相合成（カルボキシル末端残基から始める）でフ ェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂上に組み立てた。Ｃ末端アミノ酸アル ギニン（Ａｒｇ）をオキシメチルフェニルアセトアミドメチル（ＯＭＰＡ）結合 を介して固体支持体に結合し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での長時間の処理に 対しても安定性の高いＰＡＭ樹脂を得た。ＢＯＣ−Ａｒｇ（ＴＯＳ）−ＯＣＨ2 −ＰＡＭ−樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ、０．１７１９５ｇ）を、ＡＢＩペプチ ド合成器モデル４３０Ａの反応容器に移した。カルボキシル末端からＮ末端まで の後続アミノ酸の総てを、キャッピングを含むＡＢＩの０．１ｍｍｏｌ小規模高 速サイクル手順（ＡＢＩ、Ｆｒｏ ｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｐ／Ｎ ６０１７８１、バージョン１．４０）を用 いて段階的に結合した。保護アミノ酸を、予め形成した対称性無水物化学を用い て結合した。但し、アスパラギン、グルタミン、アルギニン及びヒスチジンは、 Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾ トリアゾール（ＨＯＢＴ）化学を用いて二重結合した。最初の結合では、ジメチ ルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した無水酢酸を用いて保護アミノ酸を結合し た。個々のアミノ酸の酢酸との無水物を塩化メチレン中で形成し、次いで溶剤を ＤＭＦと交換し、その後ペプチド合成器の反応容器に移した。対称性無水物によ る第二の結合はＤＭＦ中で実施した。使用した総てのアミノ酸のＮ−アミノ基を ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）結合によって保護した。種々のアミ ノ酸の側鎖官能基を下記の基で保護した： Ｔｈｒ，Ｓｅｒ−Ｂｚｌ（ベンジル） Ａｓｐ−Ｏｃｈｘｌ（Ｏ−クシロヘキシル） Ｈｉｓ−ｐＢｏｍ（ｐ−ベンジルオキシメチル） Ａｒｇ−Ｔｏｓ（トシル） 樹脂を合成器の反応容器に移す前に、完全に保護したペ プチド樹脂（０．２５５２７ｇ）を塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2）中で５分間膨潤 させた。次いで、製造業者指定手順に従い、６０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2を使用し てｔ−ＢＯＣ保護基を除去し、部分的に脱保護したペプチド樹脂を、実験室真空 下、室温で一晩乾燥した。 次いで、部分的に脱保護したペプチド樹脂を無水ＨＦ（９ｍｌ）中のｐ−クレ ゾール（１ｍｌ）で０℃で１時間４５分処理して、樹脂支持体からペプチドを開 裂した。ＨＦ／ＤＭＳ及び他の揮発物質を真空下０℃で留去した。開裂ペプチド 及び樹脂を１５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、開裂ペプチドを１０ ｍｌずつの４０％酢酸水溶液及び１５％酢酸水溶液でそれぞれ３回洗浄して抽出 した。水性抽出物をまとめて、１５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、 次いで凍結乾燥して未精製ペプチドを得た。 未精製ペプチドの純度を、Ｃ４、４．６×３０ｍｍカラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ 、ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡから市販されている）での逆相高性能 液体クロマトグラフィーを使用し、流速１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡ水溶液（ Ａ）及び１００％アセトニトリル（Ｂ）を溶媒系と して用いて分析した。このペプチド分析に使用した好ましい溶媒勾配は、１２％ Ｂ溶媒から始めた。カラムを１２％Ｂに１分間維持し、次いで直線勾配を用いて ２０分間で２９％Ｂまで増加させ、１分間維持した。最後に、カラムを１分間で １２％Ｂに戻した。流出液中のペプチドの存在を２２６ｎｍ及び２６４ｎｍで同 時に監視した。精製ペプチドの組成を酸加水分解によって測定した。酸を除去し た後、加水分解物をＢｅｃｋｍａｎ ６３００アミノ酸分析計で分析した。 精製ポリペプチドを大量に得たい場合には、Ｃ４、１０×１００ｍｍカラム（ Ｖｙｄａｃ，Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ ，ＣＡ）を用使用し、前記と同じ０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００アセト ニトリル（Ｂ）溶媒系を用いて、類似の方法で半分離用逆相高性能液体クロマト グラフィーを実施した。半分離操作の好ましい溶媒勾配は１７％Ｂで開始し、３ ｍｌ／分で５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で２８％Ｂまで増加 させた。濃度を２８％Ｂに１分間維持し、次いで１分間で１７％Ｂに低下させた 。 Ｃ． ＳＰＭ３３（配列番号４）の合成 完全に保護したペプチド樹脂を、前出のＢａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌ ｄの一般的方法に従い、段階的固相合成（カルボキシル末端残基から始める）に よってフェニルアセトアミドメチル（ＰＡＭ）樹脂上に組み立てた。Ｃ末端アミ ノ酸バリン（Ｖａｌ）を、オキシメチルフェニルアセトアミドメチル（ＯＭＰＡ ）結合を介して固体支持体に結合し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での長時間の 処理に対しても安定性の高いＰＡＭ樹脂を得た。ＢＯＣ−Ｖａｌ−ＯＣＨ2−Ｐ ＡＭ−樹脂（０．７８ｍｍｏｌ／ｇ、０．１２８６３ｇ）をＡＢＩペプチド合成 器モデル４３０Ａ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の反応容器に移し た。カルボキシル末端からＮ末端までの後続アミノ酸の総てを、キャッピングを 含むＡＢＩの０．１ｍｍｏｌ小規模高速サイクル手順（ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｐ／Ｎ ６０１７８１、バージョン１．４０）を用いて段階的 に結合した。保護アミノ酸を、予め形成した対称性無水物化学を用いて結合した 。但し、アスパラギン、グルタミン、アルギニン及びヒスチジンは、Ｎ，Ｎ’− ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾー ル（ＨＯＢＴ）化学を用いて二重結合 した。最初の結合では、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した無水酢酸 を用いて保護アミノ酸を結合した。個々のアミノ酸の酢酸との無水物を塩化メチ レン中で形成し、次いで溶剤をＤＭＦと交換し、その後ペプチド合成器の反応容 器に移した。対称性無水物による第二の結合はＤＭＦ中で実施した。使用した総 てのアミノ酸のＮ−アミノ基を、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）結 合によって保護した。種々のアミノ酸の側鎖官能基を下記の基で保護した： Ｔｈｒ，Ｓｅｒ−Ｂｚｌ（ベンジル） Ａｓｐ，Ｇｌｕ−ＯＢｚ（Ｏ−ベンジル） Ｈｉｓ−ｐＢｏｍ（ｐ−ベンジルオキシメチル） Ａｒｇ−Ｔｏｓ（トシル） Ｃｙｓ−４ＭｅＢｚｌ（４−メチルベンジル） Ｔｙｒ−２ＢｒＺ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル） Ｌｙｓ−２ＣｌＺ（２−クロロベンジルオキシカルボニル） 樹脂を合成器の反応容器内に配置する前に、完全に保護したペプチド樹脂（０ ．３４１３７ｇ）を塩化メチレン （ＣＨ2Ｃｌ2）中で５分間膨潤させた。次いで、製造業者指定手順に従い、６０ ％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2を使用してｔ−ＢＯＣ保護基を除去し、部分的に脱保護し たペプチド樹脂を、実験室真空下、室温で一晩乾燥した。 次いで、部分的に脱保護したペプチド樹脂を無水ＨＦ（９ｍｌ）中のｐ−クレ ゾール（０．６ｍｌ）及びｐ−チオクレゾール（０．５ｇ）で０℃で１時間４５ 分処理して、樹脂支持体からペプチドを開裂した。ＨＦ／ＤＭＳ及び他の揮発物 質を真空下０℃で留去した。開裂ペプチド及び樹脂を１６ｍｌずつのジエチルエ ーテルで３回洗浄し、開裂ペプチドを１０ｍｌずつの４０％酢酸水溶液及び１６ ％酢酸水溶液でそれぞれ３回洗浄して抽出した。水性抽出物をまとめて、１６ｍ ｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、次いで凍結乾燥して未精製ペプチドを 得た。 未精製ペプチドの純度を、Ｃ４、４．６×３０ｍｍカラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ 、ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）での逆相高性能液体クロマトグラフ ィーを使用し、流速１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００％ア セトニトリル（Ｂ）を溶媒系として用いて分析した。このペプチド分析に使用し た好ましい溶媒勾配は、３３％ Ｂ溶媒で開始した。カラムを３３％Ｂに１分間維持し、次いで直線勾配を用いて ２０分間で６３％Ｂまで増加させ、１分間維持した。最後に、カラムを１分間で ３３％Ｂに戻した。流出液中のペプチドの存在を、２２６ｎｍ及び２８０ｎｍで 同時に監視した。精製ペプチドの組成を酸加水分解によって測定した。酸を除去 した後、加水分解物をＢｅｃｋｍａｎ ６３００アミノ酸分析計で分析した。 精製ポリペプチドを大量に得たい場合には、Ｃ４、１０×１００ｍｍカラム（ Ｖｙｄａｃ，Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ ，ＣＡ）を使用し、前記と同じ０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００アセトニ トリル（Ｂ）溶媒系を用いて、類似の方法で半分離用逆相高性能液体クロマトグ ラフィーを実施した。半分離操作の好ましい溶媒勾配は３０％Ｂで開始し、３ｍ ｌ／分で５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で４５％Ｂまで増加さ せた。濃度を４５％Ｂに１分間維持し、次いで１分間で３０％Ｂに低下させた。 Ｄ． ＳＰＭ４２（配列番号１）の合成 完全に保護したペプチド樹脂を、前出のＢａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌ ｄの一般的方法に従い、段階的固相 合成（カルボキシル末端残基から始める）によってフェニルアセトアミドメチル （ＰＡＭ）樹脂上に組み立てた。Ｃ末端アミノ酸バリン（Ｖａｌ）を、オキシメ チルフェニルアセトアミドメチル（ＯＭＰＡ）結合を介して固体支持体に結合し 、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での長時間の処理に対しても安定性の高いＰＡＭ 樹脂を得た。ＢＯＣ−Ｖａｌ−ＯＣＨ2−ＰＡＭ−樹脂（０．７７ｍｍｏｌ／ｇ 、０．３１７０ｇ）をＡＢＩペプチド合成器モデル４３０Ａ（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔ ｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の反応容器に移した。カルボキシル末端からＮ末端まで の後続アミノ酸の総てを、キャッピングを含むＡＢＩの標準的０．５ｍｍｏｌ規 模ＨＯＢＴ／Ｎ−メチルピロリジン（ＮＭＰ）化学手順（ＡＢＩ）Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｐ／Ｎ ４００６７４、バージョン１．４０）を用いて段階 的に結合した。保護したアミノ酸を、予め形成した対称性無水物化学を用いて結 合した。但し、アスパラギン、グルタミン、アルギニン及びヒスチジンはＮ，Ｎ ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）／１−ヒドロキシベンゾトリア ゾール（ＨＯＢＴ）化学を用いて二重結合した。最初の結合では、ジメチルホル ムアミド（ＤＭＦ）中に溶解した無水 酢酸を用いて保護アミノ酸を結合した。個々のアミノ酸の酢酸との無水物を塩化 メチレン中で形成し、次いで溶剤をＤＭＦと交換し、その後ペプチド合成器の反 応容器に移した。対称性無水物による第二の結合もＤＭＦ中で実施した。使用し た総てのアミノ酸のＮ−アミノ基をｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ） 結合によって保護した。種々のアミノ酸の側鎖官能基を下記の基で保護した： Ｔｈｒ，Ｓｅｒ−Ｂｚｌ（ベンジル） Ａｓｐ，Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（Ｏ−ベンジル） Ｈｉｓ−ｐＢｏｍ（ｐ−ベンジルオキシメチル） Ａｒｇ−Ｔｏｓ（トシル） Ｃｙｓ−４ＭｅＢｚｌ（４−メチルベンジル） Ｔｙｒ−２ＢｒＺ（２−ブロモベンジルオキシカルボニル） Ｌｙｓ−２ＣｌＺ（２−クロロベンジルオキシカルボニル） Ａｓｐ−ＯＢｚｌ（Ｏ−ベンジル） Ａｓｐ−ＯＣｈｘｌ（Ｏ−シクロヘキシル） Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（Ｏ−ベンジル） Ｇｌｕ−ＯＣｈｘｌ（Ｏ−シクロヘキシル） 樹脂を合成器の反応容器内に配置する前に、完全に保護したペプチド樹脂（０ ．４６ｇ）を塩化メチレン（ＣＨ2Ｃｌ2）中で５分間膨潤させた。次いで製造業 者指定手順に従い、６０％ＴＦＡ／ＣＨ2Ｃｌ2を使用してｔ−ＢＯＣ保護基を除 去し、部分的に脱保護したペプチド樹脂を実験室真空下、室温で一晩乾燥した。 次いで、部分的に脱保護したペプチド樹脂を無水ＨＦ（１０ｍｌ）中の硫化ジ メチル（ＤＭＳ、１ｍｌ）、ｐ−クレゾール（１ｍｌ）及びｐ−チオクレゾール （０．２ｇ）で０℃で２時間処理して、樹脂支持体からペプチドを開裂した。Ｈ Ｆ／ＤＭＳ及び他の揮発物質を真空下０℃で留去した。開裂ペプチド及び樹脂を １５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、開裂ペプチドを１０ｍｌずつの ４０％酢酸水溶液及び１６％酢酸水溶液でそれぞれ３回洗浄して抽出した。水性 抽出物をまとめて、１５ｍｌずつのジエチルエーテルで３回洗浄し、次いで凍結 乾燥して未精製ペプチドを得た。 未精製ペプチドの純度を、Ｃｌｇ、４．６×３０ｍｍカラム（Ｖｙｄａｃ，Ｔ ｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）での逆 相高性能液体 クロマトグラフィーを使用し、流速１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ） 及び１００％アセトニトリル（Ｂ）を溶媒系として用いて分析した。このペプチ ド分析に使用した好ましい溶媒勾配は２５％Ｂ溶媒で開始した。カラムを２５％ Ｂに５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で４５％Ｂまで増加させ、 １分間維持した。最後に、カラムを１分間で２５％Ｂに戻した。流出液中のペプ チドの存在を２２５ｎｍ及び２６４ｎｍで同時に監視した。精製ペプチドの組成 を酸加水分解によって測定した。酸を除去した後、加水分解物をＢｅｃｋｍａｎ ６３００アミノ酸分析計で分析した。 精製ポリペプチドを大量に得たい場合には、Ｃ１８、１０×１００ｍｍカラム （Ｖｙｄａｃ，Ｔｈｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ，Ｈｅｓｐｅｒｉ ａ，ＣＡ）を使用し、前記と同じ０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ）及び１００アセト ニトリル（Ｂ）溶媒系を使用して、類似の方法で半分離用逆相高性能液体クロマ トグラフィーを実施した。半分離操作の好ましい溶媒勾配は２７％Ｂで開始し、 ３ｍｌ／分で５分間維持し、次いで直線勾配を用いて２０分間で４０％Ｂまで増 加させた。濃度を４０％Ｂに１分間維持 し、次いで１分間で２７％Ｂに低下させた。 実施例２ ペプチドを備えた捕捉相の製造 実施例１Ｄ（配列番号１）、実施例１Ａ（配列番号２）、実施例１Ｂ（配列番 号３）及び実施例１Ｃ（配列番号４）に記載のように製造したペプチドを、ＨＥ Ｖに対する抗体を捕捉する後続アッセイで使用するための固相として、ポリスチ レンビーズ上に別々にコーティングした。手順は下記の通りである。粉砕ポリス チレンビーズ（本出願人から市販されている）を蒸留水又はプロパノールで洗浄 した。次いでビーズを、回転、振盪又は他の動的モード下で、リン酸塩緩衝食塩 水（ＰＢＳ）溶液中０．５〜２０μｇ／ｍ１のペプチドの溶液と共に、５６℃（ 範囲：室温〜６０℃）で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ビ ーズをＰＢＳ中で洗浄した。次いで、ビーズをＰＢＳ中５％ＢＳＡで０．５〜２ 時間ブロックし、ＰＢＳ中５％スクロースで１５〜６０分間オーバーコーティン グし、その後乾燥した。 実施例３ 組換え抗原を備えた捕捉相の製造 ４種類のＨＥＶ組換え抗原Ｍ４−２、Ｍ３−２、Ｂ４−２及びＢ３−２（それ ぞれ配列番号１、配列番号４、配列番号２及び配列番号３に対応する）がクロー ニングされ、大腸菌中でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（Ｇ ｅｎｅｌａｂｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，Ｃ Ａ）との融合タンパク質として発現された。これらの組換え抗原を、ＨＥＶに対 する抗体の捕捉相として後続アッセイで使用する固相として、ポリスチレンビー ズ上に別々にコーティングした。手順は下記の通りである。粉砕ポリスチレンビ ーズ（本出願人）を蒸留水又はプロパノールで洗浄した。次いでビーズを、回転 、振盪又は他の動的モード下で、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中０．５〜 ２０μｇ／ｍｌの抗原の溶液と共に、４０℃（範囲：室温〜６０℃）で２時間イ ンキュベートした。インキュベーション後、ビーズをＰＢＳ中で洗浄した。次い で、ビーズをＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で０．５〜２時間ブロ ックし、ＰＢＳ中５％スクロースで１５〜６０分間オーバーコーティングし、そ の後乾燥した。 実施例４ ＥＬＩＳＡによる抗ＨＥＶ ＩｇＧ抗体の検出 Ａ． ＨＥＶ合成ペプチドを用いるＥＬＩＳＡ 血清検査試料を、２０％ヤギ血清、１０％ウシ胎児血清、１％ウシ血清アルブ ミン、０．２％トリトン（登録商標）Ｘ−１００、０．１％アジ化ナトリウムを 含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）／トリス／ＥＤＴＡ、ｐＨ７．８、からなる 試料希釈剤中に１：３００で希釈した。次いで、希釈試料２００μｌを、実施例 ２に記載のように製造した合成ペプチドｓｐ４２（配列番号１又は２）又はｓｐ ３３（配列番号３又は４）でコーティングした固相（ポリスチレンビーズ）と共 に、反応トレー内で、４０℃／静置又は室温／振盪下で２時間インキュベートし た。インキュベーション後、ビーズを蒸留水で十分に洗浄し、４０℃／静置又は 室温／振盪下で、１０％ヤギ血清、１０％ウシ胎児血清、０．１５％トリトン（ 登録商標）Ｘ−１００を含むトリス緩衝食塩水中に希釈したヤギ抗ヒトＨＲＰＯ （Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ及びＰｅｒｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから 市販されている）と共に６０分間インキュベートした。ビーズを十分に洗浄した 後、ＯＰＤタブレット（本出願人）をタブレット当たり５ｍｌのＯＰＤ希釈剤 （本出願人）に加えることにより新しく調製したＯＰＤ基質試薬を３００μｌ加 えた。ビーズ及びＯＰＤ基質試薬を室温で３０分間インキュベートした後、１． ０ｍｌの１Ｎ硫酸を加えて発色反応を停止させた。硫酸添加後２時間以内に４９ ２ｎｍで基質の吸光率を測定することにより、発色量を測定した。 Ｂ． ＨＥＶ組換えタンパク質を用いるＥＬＩＳＡ 実施例４Ａの記載のように、但し合成タンパク質でコーティングした固相の代 わりに実施例３の方法で製造した組換えタンパク質でコーティングした固相を使 用して、ＥＬＩＳＡを実施した。結果 このアッセイを、ウィスコンシン南東部（ＨＥＶ感染が風土病ではないとみな される地域）の３８６人の有志の血液ドナーから得た血清試料のパネルに適用し た。ＨＥＶ合成ペプチド配列番号１、２、３及び４のアミノ酸配列に対応するい ずれかのＨＥＶ組換え抗原を使用した固相捕捉試薬を用いて、試料を検査した。 組換え抗原使用アッセイを用いて、検査した３８６個の試料のうち８個が反応性 と判定された。組換え抗原に対して反応性であるとされた８個 の試料は、本発明の方法でも反応性を示した。８個の抗ＨＥＶ反応性試料から得 られたデータ、及び個々の捕捉試薬に対するこれら試料の反応性を表１に示す。 正の符号（＋）は反応性を表し、負の符号（−）は非反応性を表す。 この方法を、世界中の様々な集団の９８２の個体に由来 する血清試料にも適用した。種々の地域に由来する試料の中で、１種類以上の組 換え抗原に対して繰り返し反応性を示す試料の割合は２．３〜１６．０％であっ た。反応性試料の約半分は、合成ペプチドに対しても反応性を示した。これは、 これらの試料が真に反応性であることを裏付けるものである。確認された抗ＨＥ Ｖ抗体検出率は米国、ドイツ、日本及びニュージーランドでは低いが（１．１〜 ３．０％）、メキシコ及びタイでは高い（それぞれ７．０％及び７．６％）。こ の研究で得られたデータを表２に示す。 前述の方法を使用した別の研究では、ＨＥＶ組換え抗原及び合成ペプチドの反 応性を、ソマリアのＨＥＶ発生に由来する１５１個の試料と比較した。組換え抗 原に反応する１２５個の試料のうち１２２個が、合成ペプチドにも反応すること が明らかにされた。これは、約９８％の一致を意 味する。 より大規模な研究では、前記方法を用いて、ドイツ、ベルリンの８６２人の有 志の血液ドナーに由来するＨＥＶ組換え抗原及び合成ペプチドの反応性を比較し た。これらの試料のうち１３個（１．５１％）が１種類以上の組換え抗原と反応 し、１０個（１．２％）が１種類以上の合成ペプチドと反応した。 実施例７ 阻止アッセイ 実施例１Ｄ（配列番号１）、実施例１Ａ（配列番号２）、実施例１Ｂ（配列番 号３）及び実施例１Ｃ（配列番号４）に記載の方法で製造したペプチドを、実施 例４Ａに記載のように、固相捕捉体としてのポリスチレンビーズに別々にコーテ ィングした。 実施例１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ及び２のように製造した合成ペプチドでコーテ ィングしたポリスチレンビーズを固相抗原として使用した。血清試料を、ＨＥＶ エピトープに対する抗体が固相に結合するのを特異的に阻止するために阻止試薬 （組換え抗原Ｂ４−２又はＭ３−２のいずれか）を含むか、あるいは抗ＨＥＶが 固相に結合するのを阻止し ない対照試薬（組換えＨＣＶ抗原）を含む試料希釈剤中に希釈した。組換えＨＣ Ｖ抗原は、Ｇ．Ｊ．Ｄａｗｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．２９：１４７ ９−１４８６（１９９０）に記載のものと同じであった。試料希釈剤は２５〜５ ００μｇ／ｍｌの阻止又は対照試薬を含んでいた。阻止試薬によって吸光率の値 が５０％以上減少した試料を反応性とみなした。 阻止又は対照試薬を含む試料希釈剤中に試料を希釈し（１：３００）、室温〜 ４０℃で１時間インキュベートした。次いで希釈試料２００μｌを、対応する合 成ペプチドでコーティングしたビーズと共にインキュベートし、実施例４Ａに記 載のようにＥＬＩＳＡを実施した。阻止試薬によって吸光率の値が５０％以上減 少した試料を反応性とみなした。 前述の方法を、実施例１の組換え抗原及び合成ペプチドに対して反応性である ことが判明したウィスコンシン南東部のドナーに由来する８個の試料に適用した 。本発明の種々の合成ペプチドでコーティングした固相に予め結合させた抗ＨＥ Ｖ抗体の結合は、固相上にコーティングした合成ペプチドに対応する組換え抗原 を含む希釈剤中に試料を希 釈することによって特異的に阻止できた。Ｇ．Ｊ．Ｄａｗｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒ ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ． ３８：１７５−１８６（１９９２）参照。該文献は本明 細書に参考として包含される。 実施例８ ＣＤＣパネルの反応性 種々のＥＴ−ＮＡＮＢＨから得たＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃ ｏｎｔｒｏｌの８個の試料を、実施例５及び実施例６で使用したものと類似の方 法及び材料を用いて、抗ＨＥＶ（ＩｇＧ及びＩｇＭ）について検査した。ビルマ 由来の一つの試料は総てのアッセイで陰性であった。４個の試料は、４種類の総 ての組換え抗原に対するＩｇＧクラス抗体に対して反応性を示した。８個の試料 のうち７個はＢ４−２エピトープに反応し、そのうち６個がＳＰＢ３３（配列番 号３）で確認された。別のビルマ試料はＢ４−２に対してのみ反応性を示した。 Ｂ４−２及びＳＰＢ３３アッセイの両方で反応性を示した試料は、少なくとも２ 種類の別のＨＥＶ組換え抗原にも反応することが判明した。これと比較して、Ｉ ｇＭ特異的アッセイでは、７個の急性期血清のうち６個がＢ４−２と反応し、７ 個のうち５個が Ｂ３−２及びＭ４−２と反応し、７個のうち３個がＭ３−２と反応した。Ｇ．Ｊ ．Ｄａｗｓｏｎら（１９９２）前出文献参照。 実施例９ シノモルガスマカクの検査 実験的に感染させたシノモルガスマカクから得た血清の免疫反応性を調べるた めの検査を、組換えＨＥＶタンパク質及び合成ペプチドの両方を用いて実施した 。接種した後、３匹の動物は総て１種類以上の組換え抗原又は合成ペプチドに反 応する抗体を産生した。試料の一部は組換え抗原及び合成ペプチドの両方に反応 し、別の試料はいずれか一方に反応した。Ｇ．Ｊ．Ｄａｗｓｏｎら（１９９２） 前出文献参考。 実施例１０ 交差反応性検査 種々のウイルスに対する抗体及び干渉グロブリンを有する患者及びチンパンジ ーから得た検査試料を、実施例４に記載の抗ＨＥＶ ＩｇＧ法及びＩｇＭ法の両 方で検査した。この検査方法の特異性が高いことは、表３に示すように、種々の 病気に由来する試料の間に観察される交差反応の欠 失から明らかである。 実施例１１ 限界希釈検査 ６個の血清陽性血清試料を抗ＨＥＶ欠失ヒト正常血清中に段階的に希釈し、Ｇ ＳＴ中で製造した組換えペプチド又は合成ペプチドによって、実施例４に記載の 手順で、Ｂ３ −２及びＢ４−２についてアッセイした。検査結果を下記の表４に示す。 前記データは、試料がＢ４−２に反応する場合には、合成ペプチド（ｓｐ）を 使用した時の方が、対応する組換えタンパク質（ＧＳＴ）を使用した時より終点 が大きいことを示している。しかしながら、Ｂ３−２配列に反応する５個の試料 のうち３個は、合成ペプチド（ｓｐ）より組換えタンパク質（ＧＳＴ）に対して より大きい反応性を示した。 本発明のアッセイは、アッセイ条件及び／又はインキュベーション時間を変更 し、抗原又は抗体捕捉又はプローブ試薬を様々に組合わせて使用し、当業者に公 知の別の方法、試薬及び条件を使用することによって、更に最適化できる と考えられる。これらの変更は総て本発明の範囲内に含まれるとみなされる。ま た、手動方法又は自動化分析器も本発明の範囲を逸脱せずに本発明のアッセイに 使用できるか、又は適合させ得る。従って、本発明は後述の「請求の範囲」によ ってのみ限定されるものとする。 Detailed Description of the Invention                   Hepatitis E virus confirmation assay and reagentsBackground of the Invention   The present invention relates generally to hepatitis E virus (HEV), and more specifically, Assays useful for confirming the presence of antibodies to HEV in a test sample It   Waterborne, epidemic, or enteric non-A non-B hepatitis (ET-NANBH) HEV, which is widely referred to as It was confirmed to be the cause of most of the endemic outbreaks of sexually transmitted hepatitis. D. W. Bradl ey,Br. Med. Bull.46: 442-461 (1990). Developed country However, sporadic cases of ET-NANBH, and infections caused by travelers It has been reported. S. J. Skidmore et al.,Lancet  337: 154 1 (1991). The main route of transmission is faecal-oral, but according to one epidemiological study, A limited person-to-person transmission route was also suggested. O. Velasquez et al.,J. Am er. Med. Assoc. 363: 3281-3285 (1990). This disease Qi is pregnant from 7th to 9th month of pregnancy It has been demonstrated that mortality is high when women are infected, about 20%. D ． W. See Bradley et al., Supra.   Molecular cloning of putative HEV pathogens has been demonstrated in tissue culture cis infected with viruses. It never happened because there was no system. However, available By using animal models and newly developed non-specific amplification methods, HEV Obtained from the bile of cynomolgus macaques infected with macaque strains A unique cDNA clone was identified (designated "ET1.1"). A. G. A ndjaparidze et al.,Vopr. Virusol． 1: 73-80 (19 86), D.I. W. Bradley et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6277-6281 (1987), and G. W. Reyes et al.,Science   247: 1335-1339 (1990). This clone Somalia, Tashkent, Borneo, Pakistan succeeded in confirming the origin of the Ils And in human fecal samples collected during the ET-NANBH outbreak in Mexico A similar sequence was identified. G. R. See Reyes et al., Supra. Mexican ET -Collected when NANBH occurs A cDNA library was also formed from the human fecal samples taken. G. R. Re yes,Gastroenterol, Japan.26: 142-147 ( 1991). As a result of immunoscreening of these cDNA libraries, specific to HEV Two cDNA clones encoding different epitopes were identified. P. O. Ya rbough et al.,J. Virol.65: 5790-5797 (1991). one As a result of isolation and sequence analysis of a set of overlapping cDNA clones, this form of hepatitis A new virus that is molecularly distinct from any of the characterized viral hepatitis pathogens It turned out to be due to A. W. Tam. ,Virology  185 : 12-131 (1991).   Various regions of the HEV genome have been cloned and cloned in E. coli to glutathione- It was expressed as a fusion protein with S-transferase (GST). example S. J. See Skidmore et al., Supra. 4 of these recombinant antigens Individuals, namely two from the HEV Burma (B) strain and the HEV Mexico (M) strain. The two that come are recognized by antibodies from individuals previously exposed to HEV It was found to contain the antigenic site. P. O. Yarbough et al. See the references above. Two antigens from the Mexican strain, M3-2 and M4-2, are Second reading frame (ORF-2) and third reading frame (ORF-3) Corresponds to the amino acid sequence at the cis end. Two antigens from the Burmese strain, B3-2 and And B4-2 are carboxy-terminal amino acids of ORF-2 and ORF-3, respectively. Corresponds to an array. Both M3-2 and B3-2 recombinant antigens are ORF-2 caps. It contains 42 amino acids from the ruboxy terminus. Between these 42 amino acid sequences The amino acid homology is 90.5%. See the references above. Recombination with M4-2 and B4-2 All antigens contain 33 amino acids from the carboxy terminus of ORF-3 . The homology between these two 33 amino acid sequences is 73.5%. Reference above Teru.   The M3-2, M4-2, B3-2, and B4-2 recombinant antigens were prepared from individual test samples. Determine the presence of HEV antibody in an individual by assaying for anti-HEV antibody Has been used in assays to However, the use of recombinant technology is false positive May have sexual consequences. This can be due to two main reasons. The first reason , The desired method for producing recombinant antigens is the use of these antigens in microbial cultures, usually bacteria or Yeast source The point is that it consists of manufacturing by culture. During this operation, bacteria or fermentation The mother protein is co-purified with the recombinant antigen. Therefore, the purified recombinant antigen should be Co-purified bacterial or yeast proteins are also present when used in the capture phase in the Will be present. The test sample should be either recombinant antigen or co-purified bacterial protein. It may have antibodies to either or both. Have antibodies against co-purified protein Test sample is used to capture antibodies to the desired analyte of interest in the test sample. When reacted in the presence of the recombinant antigen of interest to be used, the antibodies in the test sample are co-purified. It binds to the produced protein. The test sample does not react with the co-purified bacterial or yeast protein. False positives can occur when responding and are mistaken for "positive" for the intended analyte of interest It The second reason is that the recombinant HEV antigen is expressed as a fusion protein in GST. Is to be done. As is well known, some individuals produce antibodies to GST. There is Therefore, E. coli was cloned and used as a fusion protein with GST. False positive reactions can occur in assays using HEV recombinant antigens expressed in It This is because, even in the case of an individual who can react only with GST, the recombinant protein can be captured. HEV when used as a capture antigen This is because a positive reaction can be shown in an antibody assay for the specific target analyte. Change In addition, special manufacturing equipment is required to produce large quantities of recombinant antigens for commercial use. And the production of recombinant antigens within the range of strict regulatory requirements required for commercial use Often a problem.   To confirm the presence of screening assay results in pathogens such as HIV However, these techniques cannot yet be used to confirm the presence of HEV. For example, for HEV in vitro culture and Western blotting The law cannot be used. Detection of HEV nucleic acids can be attempted by performing PCR, The method is laborious and expensive, requires specialized equipment such as thermocyclers, It takes 24 hours. To confirm the presence of anti-HEV antibody, immunoelectron microscopy ( IEM) has been used, but the use of IEM is costly as a daily confirmation tool. There are restrictions.   Therefore, an accurate, rapid and cost-effective method for confirming the presence of HEV antibodies in a test sample is required. It would be beneficial to provide a highly efficient method.Summary of the invention   The present invention confirms the presence of anti-HEV antibodies in a test sample To provide an assay for. In this assay, (a) a test sample is treated with an anti-HEV antibody. Of peptide / antibody complexes with one or more synthetic peptides that specifically bind to And (b) the peptide / antibody complex, and Contact with an indicator reagent consisting of a signal-generating compound conjugated to the antibody Incubating for a time and under conditions sufficient for the formation of antibody / antibody complex, It consists of detecting a measurable signal indicative of the presence of anti-HEV in the test sample.   The amino acid sequence of the HEV synthetic peptide used in the present invention is described in P. O. Yarbo ugh et al.,J. Virol., 65: 5790-5797 (1991). Obtained from such predicted amino acid sequence. These synthetic peptides include SPM4 2 (SEQ ID NO: 1, corresponding to recombinant antigen M4-2), SPB42 (SEQ ID NO: 2, recombinant) Corresponding to antigen B4-2), SPB33 (SEQ ID NO: 3, corresponding to recombinant antigen B3-2) ) And SPM33 (SEQ ID NO: 4, corresponding to recombinant antigen M3-2).   The present invention is useful for assaying test samples for the presence of anti-HEV antibodies. One synthetic HEV peptide of the present invention Kits containing more than one species are also provided.Detailed Description of the Invention   The present invention provides an assay useful for detecting antibodies to hepatitis E virus (HEV). , Synthetic peptides and kits. The sequences of the present invention were produced by synthetic means. Therefore, there are no problems with recombinant proteins produced in GST, or often It also does not include foreign bacterial or yeast proteins that are co-purified with recombinant antigens. Follow Thus, the synthetic peptides disclosed herein, compared to recombinant antigens known to those of skill in the art, It is advantageous because there are no cross-reactivity issues with these recombinant proteins.   In addition to being used in various assays, synthetic peptides are used in CNBr-activated cephalic It is attached to a matrix similar to that of cellulose to allow cell culture or biological tissue, such as blood and Used for affinity purification of antibodies specific to HEV antigens from liver and liver be able to. The synthetic peptides of the invention may also be used for therapeutic and other similar applications. Can also be used to produce chimeric, monoclonal or polyclonal antibodies for .   The synthetic peptides of the invention disclosed herein may be used alone or in combination. It For example, one or more of the present invention The peptides can be conjugated to a single solid phase and used in various assay systems. Or , Individual peptides were separately conjugated to a solid phase, such as a microparticle, and treated with It may be used in an assay in combination with particles. In these assays, the assay Can be optimized by varying the peptide and / or the peptide concentration. Asse Methods for optimizing B are well known to those skilled in the art. Several methods of joining are known to those skilled in the art. And include, for example, coatings and covalent bonds.   An “inspection sample” that can be inspected by the method of the present invention described herein is as follows. Human or animal body fluids that may contain life-phase antibodies, such as whole blood, serum, plasma, brain Spinal fluid, urine, ascites fluid or any other body component or any tissue culture supernatant. You can   As used herein, the term "solid phase" is insoluble or in a subsequent reaction. Thus, it means any substance that can be made insoluble. As a solid phase, attracts capture reagents You can choose the one that has the inherent ability to lock. Alternatively, pull the capture reagent. Use as a solid phase a substance that can hold another receptor with the ability to lock in . Another acceptor is the opposite charge of the capture reagent itself or the charged material bound to the capture reagent. Load Examples of the charged substance have. Alternatively, the receptor molecule is immobilized on a solid phase (solid phase). Any that can be attached to the phase) to immobilize the capture reagent via a specific binding reaction. May be a specific binding member of Receptor molecules can be either pre-assayed or assayed The capture reagent can be indirectly bound to the solid phase material during the performance of. Therefore solid phase Are test tubes, microtiter wells, sheets, beads, microparticles, chips and others Shaped plastics, derivatized plastics, magnetic or non It can be a surface made of magnetic metal, glass or silicon.   Solid phase suitable for binding antigen with sufficient porosity for access by detection antibody It may be composed of any suitable porous material having a good surface affinity. These are also included within the scope of the present invention. Usually a microporous structure is preferred, but hydration Materials having a gel structure in the state may also be used. Useful solid supports of this type include , Natural polymeric carbohydrates and synthetically modified, cross-linked or substituted derivatives thereof, eg For example, agar, agarose, cross-linked alginic acid, substituted and cross-linked guar gum, cellulose Esters, especially with nitric acid and carboxylic acids, mixed cellulose esters and Cellulose ethere Nitrogen; natural polymers containing nitrogen, such as proteins and cross-linked or modified gelatin Derivatives containing; natural hydrocarbon polymers such as latex and rubber; moderately porous Synthetic polymers, such as vinyl polymers, which can be produced to have the structure of As polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyvinyl chloride, poly Vinyl acetate and its partially hydrolyzed derivatives, polyacrylamide, polymethacrylate And copolymers and terpolymers of said polycondensates, such as polyesters, poly Amides and other polymers such as polyurethanes or polyepoxides; porous inorganics Materials, such as alkaline earth metal and magnesium sulfates or carbonates, with specific examples Barium sulfate, calcium sulfate, calcium carbonate; alkali metal, alkali Silicates of earth metals, aluminum and magnesium; aluminum or silicon Oxides or hydrates of eg clay, alumina, talc, kaolin, zeolites , Silica gel or glass (these materials may be used with A mixture or copolymer of the aforementioned substances, eg pre-existing Graft copolymer prepared by polymerizing synthetic polymer on natural polymer . All of these substances are films, It may be used in any suitable form such as a sheet or plate, or it may be paper, glass, plastic. Coating, bonding or laminating onto a suitable inert carrier such as a sticky film or cloth Can be layered.   The porous structure of nitrocellulose is suitable for a wide range of reagents, including monoclonal antibodies. On the other hand, it exhibits excellent absorption and adsorption properties. Nylon also has similar properties and is also suitable It is a proper substance.   The porous solid support as described above has a thickness of about 0.01-0.5 mm, preferably It is believed preferable to have a sheet morphology of about 0.1 mm. Wide pore size And preferably about 0.025 to 15 microns, especially about 0.15 to 15 microns. It's Kron. The surface of this type of support allows the antigen or antibody to be covalently attached to the support. It can be activated by chemical manipulation. In this way the irreversible nature of the antigen or antibody Porous materials due to hydrophobic forces that yield binding but are usually not well understood It binds by adsorption on top.   A preferred solid phase material for flow-through assay devices is porous glass fiber. Examples include filter papers such as fibrous materials or other fiber matrix materials. Of this kind of material Thickness is not critical and is primarily a property of the sample or analyte of interest to be assayed, for example For example, it should be selected according to the fluidity of the test sample.   To change or increase the intrinsic charge of the solid phase, a charged substance is directly added to the material. Particles that will be intimately coated or that will later be retained on a solid support material. Can be coated. Alternatively, keep the microparticles in the column or use soluble reagents. It can also be suspended in a mixture with a test sample and used as a solid phase or particles. It can also be held and fixed by the solid support material. "Hold and fix" The expression is that particles on the surface or inside the support material are substantially distributed elsewhere in the support material. It means a state that cannot be moved. Particles can be any suitable type of particulate material by those skilled in the art. The quality can be selected from among the following, and specific examples include polystyrene and polymethyl acrylate. , Polypropylene, latex, polytetrafluoroethylene, polyacryloni Mention may be made of tolyl, polycarbonate or similar materials. Large of particles Size is not critical, but the average diameter of the granules is smaller than the average pore size of the support material used Is preferred. Thus, specific examples using various other solid phases are also conceivable. Within the scope of the invention. For example, corresponding to European Patent Publication No. 0326100. Co-pending US Patent Application No. 150,278 and US Patent Described in Application No. 375,029 (European Patent Publication No. 0406473) , An ion trapping procedure to immobilize an immobilizable reaction complex with a negatively charged polymer It can be used in the present invention to perform rapid solution phase immunochemical reactions. Can be fixed Active immunocomplex with negatively charged polyanion / immunocomplex and pretreated positive charge Separated from the rest of the reaction mixture by ion exchange with the porous matrix of The above-mentioned signal generating system, for example, European Patent Publication No. 0,273,115 Chemiluminescent signal measurement according to co-pending US patent application No. 921,979 To detect.   The method of the present invention is a system using particulate technology, eg the solid phase consists of particulates. It can also be adapted for use in automated and semi-automated systems. This kind of cis The system is described in published European patent applications 0425633 and 0424634. Corresponding pending US Patent Application No. 425,651 and US Patent No. 5,084, respectively. 9,424, as well as those described in US Pat. No. 5,006,309. It   The "indicator reagent" is attached to the specific binding member for the anti-HEV antibody and is attached to an external means. Therefore a measurable signal that can be detected May include a signal generating compound (label) that generates As used herein, "singular The term "specific binding member" refers to a specific binding pair, that is, one molecule is chemically or physically A member of two different molecules that specifically binds to another molecule via a means. To taste. The indicator reagent is an antibody or antibody fragment of a specific binding pair for anti-HEV antibody. In addition to being a binding member consisting of a hapten-anti-hapten system such as biotin or Biotin, avidin or biotin, carbohydrates or lectins, complementary nucleotides Sequences, effector or receptor molecules, coenzymes or enzymes, and enzyme inhibitors or enzymes It can be a member of any specific binding pair, including any of the following.   Examples of various signal-generating compounds (labels) that can be used include chromophores; catalysts, eg Alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, β-galactosider Enzymes such as zeal; luminescent compounds such as fluorescein and rhodamine, chemiluminescence Compounds such as acridinium, phenanthridinium, dioxetane, lumino And radioactive elements; and direct visible labels. Which sign to choose Is not important, but the signal may be on its own or in cooperation with one or more other substances. The one that can generate   The synthetic peptides of the present invention are previously reactive (or “positive” in qualitative tests of anti-HEV antibodies). For determining the presence of anti-HEV antibodies in a test sample that has been identified as Can be used in the assay system. These peptides bind to recombinant antigen M4-2 Corresponding SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 corresponding to recombinant antigen B4-2, recombinant antigen B SEQ ID NO: 3 corresponding to 3-2 and SEQ ID NO: 4 corresponding to recombinant antigen M3-2 Have been identified. In the first embodiment, the present invention provides (a) one or more kinds of test samples. The mixture is contacted with the above HEV synthetic peptide and the resulting mixture is used as a peptide / antibody complex. Incubating for a time and under conditions sufficient for the formation of The peptide / antibody complex is capable of producing a detectable measurable signal. An indicator reagent comprising an anti-human antibody or a fragment thereof conjugated to a radiogenic compound This second mixture is allowed to form a peptide / antibody / indicator reagent complex and is then contacted with Incubating for minutes and conditions, and (c) anti-H in the test sample. Measurable signal generated from a signal generating compound as an indication of the presence of EV And a step of detecting Preferably, the capture peptide , Bind to the solid phase before use in the assay. If a solid phase is used, separate it from the liquid phase before detecting the signal-generating compound. obtain. Also, steps (a) and (b) can be performed simultaneously. In the present invention, Test samples can also be diluted in any of these assay embodiments, and all of the Washes may or may be performed between steps of all assay procedures.   Alternatively, a test sample previously showing reactivity to the anti-HEV antibody is used as an anti-HEV antibody. HEV antigens that specifically bind to antibodies (inducing an immune response [eg, antibody production], (HEV-encoded amino acid sequence) Incubate for a time and under conditions sufficient for the formation of the body / antigen complex. Then anti Amino acids present in the HEV antigen used in the first step in the body / antigen complex Is contacted with a solid phase capture reagent consisting of a synthetic HEV peptide containing Complex and solid phase Are incubated for a time and under conditions sufficient for the formation of the peptide / antibody complex . The solid phase is then separated from the solution and is capable of producing a measurable signal. Monoclonal or polyclonal anti-human antibody conjugated to gnullogenic compound Alternatively, it is contacted with an indicator reagent consisting of a fragment thereof to form a mixture. This mixture The mixture Incubate for a time and under conditions sufficient to form the peptide / antibody / indicator reagent complex To do. The presence of immobilized antibody is determined by detection of the measurable signal generated. Be done. If the amount of signal generated is reduced compared to the initial screen, The presence of anti-HEV antibodies in the test sample.   In another embodiment, at least one HEV synthetic peptide is nitrocellulose. Fix on the membrane. Before immobilizing the peptide on the nitrocellulose membrane, Another peptide may be attached or cross-linked to the peptide, or this peptide may Body proteins such as BSA, keyhole limpet hemocyanin, ovoalbu It is also possible to bond or crosslink to min or the like. Test sample is a peptide / antibody complex Incubate on the membrane for a time and under conditions sufficient for body formation. Unbonded tamper An instruction consisting of an anti-human antibody whose membrane has been labeled with a signal-generating compound after removal of the protein. Incubate with reagents. The presence and / or amount of anti-HEV antibody in the test sample is , Determined by detection of a measurable signal. The amount of signal in the test sample Depends on the amount of anti-HEV antibody present.   Alternative embodiments using various other solid phases are also contemplated and Within the scope of the invention. For example, all of them are filed by the applicant in the present specification. Co-pending rice corresponding to EP 0326100, incorporated by reference National patent application No. 150,278 and US patent application No. 375,029 (European patent Publication No. 0406473), which can be immobilized with a negatively charged polymer. The ion trapping method for immobilizing the reaction complex is used in the present invention for rapid solution phase immunization. A chemical reaction can take place. Immobilizable immune complex, negatively charged polyanion By ion exchange between the / immunocomplex and the pretreated positively charged porous matrix Is separated from the rest of the reaction mixture by means of various signal generating systems such as In Applicant's European Patent Publication No. 0273115, incorporated herein by reference, Chemiluminescent signal measurements as described in corresponding co-pending US Patent Application No. 921,979. Detection using a constant.   The method of the present invention is a system using particulate technology, eg the solid phase consists of particulates. It can also be adapted for use in automated and semi-automated systems. This kind of cis The system is described in published European patent applications 0425633 and 0424634. Corresponding pending US Patent Application Nos. 426,65 No. 1 and No. 426,643 are mentioned. These prior patent applications Are incorporated herein by reference.   The use of Scanning Probe Microscopy (SPM) for immunoassays is also a feature of the present invention. This method can be easily applied to adult peptides. Scanning probe microscopy, especially atoms In force microscopy, a capture phase, for example one or more of the synthetic peptides of the invention, is applied to the solid phase. Antigen / antibody complex that may be present on the solid phase surface by scanning probe microscopy. Put out. Detection of antigen / antibody complexes using scanning tunneling microscopy The need for labels that normally have to be used in many immunoassay systems Disappear. A system of this kind is the subject of the Applicant, which is hereby incorporated by reference. No. 662,147.   The use of SPM to monitor specific binding reactions can be performed in a variety of ways. is there In embodiments, specific binding partners (antibody-specific substances that are synthetic peptides of the invention) One bond member of is bonded to a surface suitable for scanning. Those skilled in the art will be able to conjugate antibody-specific substances. According to the well-known method in (1), the test piece containing the solid phase consisting of a plastic or metal surface is absorbed. It can be done by wearing clothes. There Is a feature for test pieces containing a solid phase of derivatized plastic, metal, silicon or glass. A covalent bond of a heterologous binding partner (antibody specific substance) may be used. Covalent bond method Are known to those skilled in the art, for example to irreversibly bind a specific binding partner to a test strip. There are various means. If the test piece is silicon or glass, bind a specific binding partner The surface must be activated before it can be used. Such as amino, vinyl and thiol In order to introduce a reactive group, triethoxyaminopropylsilane (Si gma Chemical Company, St. Commercially available from Louis, MO), Triethoxyvinylsilane (Aldrich Chemical Company, Milwa UKE, WI) and (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane (Sig Activated silane compounds such as Ma Chemical) can be used. This Such activated surfaces can be used to attach binding partners directly (amino or thiol ), Or activated surface is further glutaraldehyde, bis (succinimidyl) ) Suberate, SPPD9 (succinimidyl 3- [2-pyrimidyldithi] pro Pionate), SMCC (4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane-1- Succinimidyl carboxylate), S IAB ([4-iodoacetylamino] succinimidyl benzoate) and SMP A linker such as B (4- [1-maleimidophenyl] succinimidyl butyrate) Can be reacted with to separate the binding partner from the surface. Vinyl groups provide a means of covalent attachment Can oxidize in order to. This group is used to polymerize various polymers such as polyacrylic acid. It can also be used as an anchor for. In that case, the specific binding partner Multiple binding points can be obtained for Amino face is of different size and ability Can be reacted with various molecular weights of oxidized dextran to obtain hydrophilic linkers . Specific examples of oxidizable dextran include dextran T-40 (molecular weight 40,000). Dalton), Dextran T-110 (molecular weight 110,000 Dalton), Dextran T-500 (molecular weight 500,000 daltons), dextran T-2M (molecular weight 2 million daltons) Luton) (all commercially available from Pharmacia, Piscataway, NJ ), Or Ficoll (molecular weight 70,000 Daltons (Sigma Chem ical, St. Commercially available from Louis, MO)). Well Also, pending US patent application Nos. 150,278 and 19 filed January 29, 1988. No. 375,0 filed on July 7, 1989 Specific for polyelectrolyte interactions using the method and chemical means described in No. 29. The binding partner may be fixed on the surface of the test piece. The above patent applications are all filed by the applicant. Which is included herein by reference. The preferred joining method is covalent joining It Subsequent to the conjugation of specific binding partners, the surface is sized to minimize non-specific conjugation. It may be further treated with substances such as serum, proteins or other inhibitors. Surface In addition, in order to confirm suitability for the purpose of the assay, run at the manufacturing site or the use site. You can check. It is believed that the scanning process does not change the specific binding properties of the specimen. Be done.   Although the present invention reveals that the use of a solid phase is preferred, the peptides of the present invention It can also be used in a solid phase assay system. These assay systems are not Knowledge and considered to be within the scope of the present invention.   The reagents used in the assay are the peptides or peptide mixtures used in the assay. Kit containing one or more vials or bottles containing separate reagents such as It can be provided in the form of These kits are required to perform the assay Vials or containers of other reagents such as cleaning reagents, processing reagents and indicator reagents obtain.   The present invention will be described below with reference to examples, but these examples are not intended to limit the scope of the present invention. Clarification, not limitation.                               Example 1                         Synthesis of synthetic peptides A.Synthesis of SPB42 (SEQ ID NO: 2)   The fully protected peptide resin was prepared using G. Barany and R.M. B. Merrif field,The Peptides,(E. Gross and T. Meinho Effer) 2, 1-284 (1980), Academic Press, According to the method of New York, NY, stepwise solid phase synthesis (carboxyl terminal residue Phenylacetamidomethyl (PAM) resin by Assembled on. C-terminal amino acid arginine (Arg) is oxymethylphenyl Bound to a solid support via an acetamidomethyl (OMPA) bond, A PAM resin with high stability was obtained even after long-term treatment with acetic acid (TFA). BOC-Arg (TOS) -OCH2-PAM-resin (0.58 mmol / g, 0.16148 g) from Applied Biosystems (ABI). Petit synthesizer Dell 430A (commercially available from ABI, Foster City, CA) Transferred to reaction vessel. All of the subsequent amino acids from the carboxyl terminus to the N terminus, ABI 0.1 mmol small scale fast cycle procedure including capping (ABI, Gradual coupling using product number [P / N] 601781, version 1.40) did. The protected amino acids were attached using a preformed symmetrical anhydride chemistry. However , Asparagine, glutamine, arginine and histidine are N, N'-disicu Rohexyl carbodiimide (DCC) / 1-hydroxybenzotriazole (H Double bonds were made using OBT) chemistry. In the first bond, dimethylformamide ( The protected amino acids were coupled with acetic anhydride dissolved in DMF). Individual amino Forming the acid anhydride with acetic acid in methylene chloride, then exchanging the solvent with DMF, Then, it was transferred to the reaction vessel of the peptide synthesizer. The second bond by the symmetrical anhydride is D Performed in MF. The N-amino groups of all the amino acids used were t-butyloxy. Protected by carbonyl (t-BOC) bond. Side chain functional groups of various amino acids Was protected with the following groups:   Ser-Bzl (benzyl)   Asp, Glu-OBzl (O-benzyl)   His-DNP (dinitrophenol)   Arg-Tos (tosylate)   Completely protected peptide resin (0.338 g) was added to methylene chloride (CH2Cl2) Allow to swell for 5 minutes in. Transfer the peptide resin to a manual reaction vessel and add 5% in DMF. Treated with thiophenol for 20 minutes twice and after each treatment for 1 minute CH2Cl2 Washing was performed 6 times, and then transferred to the reaction vessel of the synthesizer. Then manufacturer specified procedure CH according to (ABI, Foster City, CA)2Cl2Medium 60% TFA The t-BOC protecting group was removed with to test the partially deprotected peptide resin. Dry overnight at room temperature under room vacuum.   The partially deprotected peptide resin was then treated with anhydrous hydrogen fluoride (HF, 9 ml). P-cresol (1 ml) in the mixture was treated at 0 ° C. for 2 hours to remove peptidyl from the resin support Cleavage. HF / DMS and other volatiles were distilled off under vacuum at 0 ° C. Cleavage The peptide and the resin were washed 3 times with 15 ml of diethyl ether each time to remove the cleaved peptide. Was washed 3 times with 10 ml of 40% acetic acid aqueous solution and 16% acetic acid aqueous solution, respectively. Extracted. Combine the aqueous extracts with 15 ml of diethyl ether. It was washed with ether three times and then freeze-dried to obtain a crude peptide.   The purity of the unpurified peptide was measured on a C4, 4.6 x 30 mm column (Vydac, Th e Separations Group, Hesperia, CA) Using high performance liquid chromatography, 0.1% TFA water at a flow rate of 1 ml / min. Analysis was performed using solution (A) and 100% acetonitrile (B) as the solvent system. The preferred solvent gradient used for this peptide analysis started with 20% B solvent. Mosquito The ram was maintained at 20% B for 5 minutes, then using a linear gradient to 50% B in 20 minutes. And held for 1 minute. Finally, the column was returned to 20% B in 2 minutes. Flow The presence of peptides in the exudates was monitored simultaneously at 225 nm and 254 nm. Purification The composition of the peptide was determined by acid hydrolysis. After removing the acid, the hydrolyzate was added to B Analyzed on an eckman 6300 amino acid analyzer.   If you want to obtain a large amount of purified polypeptide, reverse-phase high-performance liquid chromatography for semi-separation. The graph was taken on a C18, 10 × 100 mm column (Vydac, The Sep. arations Group, Hesperia, CA) Same 0.1% TFA aqueous solution (A) and 100 acetonitrile (B) solvent system as above Was used in a similar manner. The preferred solvent gradient for the semi-separation operation is 21% B Start at 3 ml / min for 5 min, then use a linear gradient to 40 min for 20 min. % B. Maintain concentration at 40% B for 1 minute, then 21% B for 1 minute Lowered. B.Synthesis of SPB33 (SEQ ID NO: 3)   The fully protected peptide resin was prepared using the above-mentioned Barany and Merrifield. In stepwise solid phase synthesis (starting with the carboxyl terminal residue) according to the general method of d. Assembled on phenylacetamidomethyl (PAM) resin. C-terminal amino acid Bonding ginine (Arg) with oxymethylphenylacetamidomethyl (OMPA) Bound to a solid support via and can be treated with trifluoroacetic acid (TFA) for a long time. A highly stable PAM resin was obtained. BOC-Arg (TOS) -OCH2 -PAM-resin (0.58 mmol / g, 0.17195 g) was added to ABI pepti It was transferred to a reaction vessel of a dozer synthesizer model 430A. From carboxyl end to N end All of the subsequent amino acids of ABI including capping 0.1 mmol Fast cycle procedure (ABI, Fro Ster City, CA, P / N 601781, version 1.40) And joined in stages. Protected Amino Acids Using Preformed Symmetric Anhydride Chemistry Joined together. However, asparagine, glutamine, arginine and histidine, N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) / 1-hydroxybenzo Double bonds were made using triazole (HOBT) chemistry. In the first bond, dimethy The protected amino acids were coupled using acetic anhydride dissolved in luformamide (DMF). It was The anhydride of the individual amino acids with acetic acid is formed in methylene chloride and then the solvent is removed. It was replaced with DMF and then transferred to the reaction vessel of the peptide synthesizer. By symmetrical anhydride The second ligation was performed in DMF. The N-amino groups of all amino acids used were Protected by a t-butyloxycarbonyl (t-BOC) bond. Various nets The side chain functional groups of the no acids were protected with the following groups:   Thr, Ser-Bzl (benzyl)   Asp-Ochxl (O-xylhexyl)   His-pBom (p-benzyloxymethyl)   Arg-Tos   Prior to transferring the resin to the synthesizer reaction vessel, a fully protected Peptide resin (0.255527g) was added to methylene chloride (CH2Cl2) Swell for 5 minutes in Let Then follow 60% TFA / CH according to manufacturer specified procedure2Cl2Use The t-BOC protecting group was removed with a partially deprotected peptide resin in a laboratory vacuum. Under, dried at room temperature overnight.   The partially deprotected peptide resin was then p-creative in anhydrous HF (9 ml). The peptide was released from the resin support by treating with sol (1 ml) at 0 ° C for 1 hour and 45 minutes. Torn HF / DMS and other volatiles were distilled off under vacuum at 0 ° C. Cleaved peptide And the resin was washed 3 times with 15 ml of diethyl ether each time to remove the cleaved peptide. Extraction by washing 3 times each with 40% acetic acid aqueous solution and 15% acetic acid aqueous solution. did. The combined aqueous extracts are washed 3 times with 15 ml portions of diethyl ether, Then, it was lyophilized to obtain a crude peptide.   The purity of the crude peptide was measured on a C4, 4.6 x 30 mm column (Brownlee). , ABI, Foster City, CA) reverse phase high performance Using liquid chromatography at a flow rate of 1 ml / min, 0.1% TFA aqueous solution ( A) and 100% acetonitrile (B) as solvent system Then, it was used and analyzed. The preferred solvent gradient used for this peptide analysis is 12% Starting with solvent B. Hold the column at 12% B for 1 min, then use a linear gradient Increased to 29% B in 20 minutes and held for 1 minute. Finally, let the column run for 1 minute It returned to 12% B. The presence of peptides in the effluent was detected at 226 nm and 264 nm. Sometimes I watched. The composition of the purified peptide was determined by acid hydrolysis. Remove the acid The hydrolyzate was then analyzed on a Beckman 6300 amino acid analyzer.   If a large amount of purified polypeptide is desired, a C4, 10 × 100 mm column ( Vydac, The Separations Group, Hesperia , CA) using the same 0.1% TFA aqueous solution (A) and 100 aceto. Reversed-phase high-performance liquid chromatography for semi-separation in a similar manner using the nitrile (B) solvent system. Chromatography was performed. The preferred solvent gradient for the semi-separation operation starts at 17% B and Hold at ml / min for 5 minutes, then increase to 28% B in 20 minutes using a linear gradient Let The concentration was maintained at 28% B for 1 minute and then reduced to 17% B in 1 minute. . C.Synthesis of SPM33 (SEQ ID NO: 4)   The fully protected peptide resin was prepared using the above-mentioned Barany and Merrifield. For stepwise solid phase synthesis (starting with the carboxyl terminal residue) according to the general method of d. Thus assembled on Phenylacetamidomethyl (PAM) resin. C-terminal net Valine noate (Val) was added to oxymethylphenylacetamidomethyl (OMPA). ) Attached to a solid support via a bond and trifluoroacetic acid (TFA) for an extended period of time. A PAM resin having high stability against treatment was obtained. BOC-Val-OCH2−P AM-resin (0.78 mmol / g, 0.12863 g) was synthesized with ABI peptide. Transfer to the reaction vessel of vessel model 430A (ABI, Foster City, CA) It was Cap all the subsequent amino acids from the carboxyl terminus to the N terminus Including 0.1 mmol small scale fast cycle procedure of ABI (ABI, Foster City, CA, P / N 601781, version 1.40) Combined with. Protected amino acids were attached using preformed symmetrical anhydride chemistry . However, asparagine, glutamine, arginine and histidine are N, N'- Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) / 1-hydroxybenzotriazo Double bond using HOBT chemistry did. For the first coupling, acetic anhydride dissolved in dimethylformamide (DMF) Was used to attach protected amino acids. Acetic anhydride of individual amino acids with methyl chloride Formed in benzene and then the solvent was exchanged for DMF, then the reaction volume of the peptide synthesizer. I transferred it to a container. A second coupling with symmetrical anhydride was performed in DMF. Total used The N-amino groups of all amino acids are linked to t-butyloxycarbonyl (t-BOC). Protected by a combination. The side chain functional groups of various amino acids were protected with the following groups:   Thr, Ser-Bzl (benzyl)   Asp, Glu-OBz (O-benzyl)   His-pBom (p-benzyloxymethyl)   Arg-Tos   Cys-4MeBzl (4-methylbenzyl)   Tyr-2BrZ (2-bromobenzyloxycarbonyl)   Lys-2ClZ (2-chlorobenzyloxycarbonyl)   Prior to placing the resin in the reaction vessel of the synthesizer, fully protected peptide resin (0 ． 34137g) to methylene chloride (CH2Cl2) For 5 minutes. Then follow the manufacturer's specified procedure % TFA / CH2Cl2To remove the t-BOC protecting group and partially deprotect The peptide resin was dried overnight at room temperature under laboratory vacuum.   The partially deprotected peptide resin was then p-creative in anhydrous HF (9 ml). Sol (0.6 ml) and p-thiocresol (0.5 g) at 0 ° C. for 1 hour 45 The peptide was cleaved from the resin support by a min treatment. HF / DMS and other volatiles The material was distilled off under vacuum at 0 ° C. Cleave the peptide and resin in 16 ml of diethyl ether. Wash the peptide 3 times with the ether, and add 10 ml of the cleaved peptide to 40% aqueous acetic acid and 16 times. % Aqueous acetic acid solution and each extracted three times. 16m together with the aqueous extract Wash the crude peptide three times with 1 l of diethyl ether, then freeze-dry to remove the unpurified peptide. Obtained.   The purity of the crude peptide was measured on a C4, 4.6 x 30 mm column (Brownlee). , ABI, Foster City, CA) Reversed-phase high-performance liquid chromatograph Using 0.1% TFA aqueous solution (A) and 100% aqueous solution at a flow rate of 1 ml / min. Analysis was performed using cetonitrile (B) as the solvent system. Used for this peptide analysis And the preferred solvent gradient is 33% Starting with solvent B. Hold the column at 33% B for 1 min, then use a linear gradient Increased to 63% B in 20 minutes and held for 1 minute. Finally, let the column run for 1 minute It returned to 33% B. Presence of peptides in effluent at 226 nm and 280 nm Monitored at the same time. The composition of the purified peptide was determined by acid hydrolysis. Remove acid The hydrolyzate was then analyzed on a Beckman 6300 amino acid analyzer.   If a large amount of purified polypeptide is desired, a C4, 10 × 100 mm column ( Vydac, The Separations Group, Hesperia , CA) using the same 0.1% TFA aqueous solution (A) and 100 acetoni Reversed-phase high-performance liquid chromatograph for semi-separation in a similar manner using the tolyl (B) solvent system Ruffy was carried out. The preferred solvent gradient for the semi-separation operation starts at 30% B and is 3 m Hold at 1 / min for 5 minutes and then increase to 45% B in 20 minutes using a linear gradient. I let you. The concentration was maintained at 45% B for 1 minute and then decreased to 30% B in 1 minute. D.Synthesis of SPM42 (SEQ ID NO: 1)   The fully protected peptide resin was prepared using the above-mentioned Barany and Merrifield. Stepwise solid phase according to the general method of d. Phenylacetamidomethyl by synthesis (starting at the carboxyl terminal residue) Assembled on (PAM) resin. C-terminal amino acid valine (Val) Attached to a solid support via a phenylphenylacetamidomethyl (OMPA) bond Highly stable even for long-term treatment with trifluoroacetic acid (TFA) A resin was obtained. BOC-Val-OCH2-PAM-resin (0.77 mmol / g , 0.3170 g) from ABI peptide synthesizer model 430A (ABI, Fast er City, CA). From carboxyl end to N end All of the subsequent amino acids of ABI are standard 0.5 mmol standards including capping. Mimic HOBT / N-Methylpyrrolidine (NMP) Chemical Procedure (ABI) Foster   City, CA, P / N 400674, version 1.40) Combined with each other. The protected amino acids are coupled using a preformed symmetrical anhydride chemistry. It matched. However, asparagine, glutamine, arginine and histidine are N, N '-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) / 1-hydroxybenzotria Double bonds were made using Zol (HOBT) chemistry. In the first bond, dimethylform Anhydrous dissolved in muamide (DMF) The protected amino acids were coupled using acetic acid. Chloride anhydride of individual amino acids with acetic acid Formed in methylene, then exchanged the solvent for DMF, and then reacted on the peptide synthesizer. It was transferred to a reaction container. A second coupling with a symmetrical anhydride was also performed in DMF. use The N-amino groups of all amino acids are t-butyloxycarbonyl (t-BOC). Protected by binding. The side chain functional groups of various amino acids were protected with the following groups:   Thr, Ser-Bzl (benzyl)   Asp, Glu-OBzl (O-benzyl)   His-pBom (p-benzyloxymethyl)   Arg-Tos   Cys-4MeBzl (4-methylbenzyl)   Tyr-2BrZ (2-bromobenzyloxycarbonyl)   Lys-2ClZ (2-chlorobenzyloxycarbonyl)   Asp-OBzl (O-benzyl)   Asp-OChxl (O-cyclohexyl)   Glu-OBzl (O-benzyl)   Glu-OChxl (O-cyclohexyl)   Prior to placing the resin in the reaction vessel of the synthesizer, fully protected peptide resin (0 ． 46 g) to methylene chloride (CH2Cl2) For 5 minutes. Then manufacturing 60% TFA / CH according to the procedure specified by the operator2Cl2To remove the t-BOC protecting group. The stripped and partially deprotected peptide resin was dried under laboratory vacuum at room temperature overnight.   The partially deprotected peptide resin was then treated with disulfide sulfide in anhydrous HF (10 ml). Methyl (DMS, 1 ml), p-cresol (1 ml) and p-thiocresol The peptide was cleaved from the resin support by treatment with (0.2g) at 0 ° C for 2 hours. H F / DMS and other volatiles were distilled off under vacuum at 0 ° C. Cleavage peptide and resin After washing 3 times with 15 ml of diethyl ether each time, the cleaved peptide was washed with 10 ml of Extraction was carried out by washing with 40% acetic acid aqueous solution and 16% acetic acid aqueous solution three times each. aqueous The extracts are combined, washed three times with 15 ml of diethyl ether each time, and then frozen. The crude peptide was obtained by drying.   The purity of the crude peptide was measured by Clg, 4.6 × 30 mm column (Vydac, T The opposite at the He Separations Group, Hesperia, CA) Phase high-performance liquid Chromatography using 0.1% TFA aqueous solution (A) at a flow rate of 1 ml / min. And 100% acetonitrile (B) were used as the solvent system for analysis. This pepti The preferred solvent gradient used for the Dot analysis started with 25% B solvent. 25% column Hold at B for 5 minutes, then increase to 45% B in 20 minutes using a linear gradient, Hold for 1 minute. Finally, the column was returned to 25% B in 1 minute. Pep in the effluent The presence of tide was monitored simultaneously at 225 nm and 264 nm. Purified peptide composition Was measured by acid hydrolysis. After removing the acid, the hydrolyzate is Beckman.   It was analyzed with a 6300 amino acid analyzer.   If you want to obtain a large amount of purified polypeptide, use C18, 10 x 100 mm column. (Vydac, The Separations Group, Hesperi a, CA), using the same 0.1% TFA aqueous solution (A) and 100 aceto as above. Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography for Semi-Separation in Similar Method Using Nitrile (B) Solvent System Totography was performed. A preferred solvent gradient for the semi-separation operation starts at 27% B, Hold at 3 ml / min for 5 minutes, then increase to 40% B in 20 minutes using a linear gradient. I was added. Maintain concentration at 40% B for 1 minute Then reduced to 27% B in 1 minute.                                 Example 2                       Production of capture phase with peptides   Example 1D (SEQ ID NO: 1), Example 1A (SEQ ID NO: 2), Example 1B (SEQ ID NO: No. 3) and Example 1C (SEQ ID NO: 4). As a solid phase for use in subsequent assays that capture antibodies to V, Coated separately on ren beads. The procedure is as follows. Crushed police Wash the Tiren beads (commercially available from the applicant) with distilled water or propanol did. The beads are then subjected to phosphate buffered saline under rotation, shaking or other dynamic modes. 56 ° C (with a solution of 0.5-20 μg / ml peptide in water (PBS) solution) (Range: room temperature to 60 ° C.) and incubated for 2 hours. After incubation, The cells were washed in PBS. The beads are then 0.5-2 with 5% BSA in PBS. Block for 15 minutes and overcoat with 5% sucrose in PBS for 15-60 minutes And then dried.                                 Example 3                      Production of capture phase with recombinant antigen   Four types of HEV recombinant antigens M4-2, M3-2, B4-2 and B3-2 (that (Corresponding to SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively) Glutathione-S-transferase (GST) (GST) in E. coli. enlabs Technologies, Redwood City, C It was expressed as a fusion protein with A). These recombinant antigens were paired with HEV Polystyrene beads as the solid phase used in subsequent assays as the capture phase for Coated separately. The procedure is as follows. Crushed polystyrene (Applicant) was washed with distilled water or propanol. Then rotate the beads , In phosphate buffered saline (PBS) solution under shaking or other dynamic modes of 0.5- 2 hours at 40 ° C (range: room temperature to 60 ° C) with a solution of 20 µg / ml of antigen. Incubated. After incubation, the beads were washed in PBS. Next The beads were then blotted with 5% bovine serum albumin (BSA) in PBS for 0.5-2 hours. And overcoat with 5% sucrose in PBS for 15-60 minutes and then And then dried.                                 Example 4                Detection of anti-HEV IgG antibody by ELISA A.ELISA using HEV synthetic peptide   Serum samples were 20% goat serum, 10% fetal bovine serum, 1% bovine serum album. Min, 0.2% Triton® X-100, 0.1% sodium azide Containing phosphate buffered saline (PBS) / Tris / EDTA, pH 7.8, containing Diluted 1: 300 in sample diluent. 200 μl of diluted sample was then added to the Example Synthetic peptide sp42 (SEQ ID NO: 1 or 2) or sp prepared as described in 2. 33 (SEQ ID NO: 3 or 4) coated solid phase (polystyrene beads) Incubate for 2 hours at 40 ° C / static or room temperature / shaking in reaction tray It was After the incubation, wash the beads thoroughly with distilled water and leave at 40 ° C / static or At room temperature / with shaking, 10% goat serum, 10% fetal bovine serum, 0.15% triton ( Goat anti-human HRPO diluted in Tris-buffered saline containing ® X-100 (From Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD. (Commercially available) for 60 minutes. Washed the beads thoroughly Then add OPD tablets (Applicant) with 5 ml OPD diluent per tablet (Applicant) Add 300 μl of OPD substrate reagent newly prepared by adding I got it. After incubating the beads and OPD substrate reagent for 30 minutes at room temperature, 1. The color reaction was stopped by adding 0 ml of 1N sulfuric acid. 49 within 2 hours after adding sulfuric acid The amount of color developed was measured by measuring the absorptivity of the substrate at 2 nm. B.ELISA using HEV recombinant protein   Substitution of solid phase coated with synthetic protein as described in Example 4A. Instead, a solid phase coated with the recombinant protein prepared by the method of Example 3 was used. And an ELISA was performed.result   Southeastern Wisconsin (assuming HEV infection is not endemic) Applied to a panel of serum samples from 386 volunteer blood donors It was HEV synthetic peptide corresponding to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3 and 4 Samples were examined with solid phase capture reagents using some HEV recombinant antigens. 8 out of 386 samples tested using recombinant antigen-based assay Was determined. Eight that were said to be reactive to recombinant antigens The above sample also showed reactivity in the method of the present invention. Obtained from 8 anti-HEV reactive samples The data generated, and the reactivity of these samples with the individual capture reagents are shown in Table 1. A positive sign (+) represents reactivity and a negative sign (-) represents non-reactivity.   This method was derived from 982 individuals of various populations around the world. It was also applied to serum samples. One or more types of samples from various regions The proportion of samples that showed repeated reactivity to the modified antigen was 2.3 to 16.0%. It was About half of the reactive samples also showed reactivity with synthetic peptides. this is, This confirms that these samples are truly reactive. Confirmed anti-HE Although the V antibody detection rate is low in the United States, Germany, Japan and New Zealand (1.1- 3.0%) and higher in Mexico and Thailand (7.0% and 7.6% respectively). This The data obtained from this study are shown in Table 2.   In another study using the method described above, anti- HEV recombinant antigens and synthetic peptides Responsiveness was compared to 151 samples from HEV outbreaks in Somalia. Recombinant anti 122 out of 125 samples that react with the raw material also react with synthetic peptides Was revealed. This means about 98% agreement To taste.   In a larger study, using the method, 862 individuals in Berlin, Germany could be used. To compare the reactivity of HEV recombinant antigen and synthetic peptide derived from the blood donor of will It was 13 of these samples (1.51%) react with one or more recombinant antigens However, 10 (1.2%) reacted with one or more kinds of synthetic peptides.                                 Example 7                               Inhibition assay   Example 1D (SEQ ID NO: 1), Example 1A (SEQ ID NO: 2), Example 1B (SEQ ID NO: No. 3) and Example 1C (SEQ ID NO: 4). Separately coat the polystyrene beads as solid phase traps as described in Example 4A. I've read.   Coat with synthetic peptides prepared as in Examples 1A, 1B, 1C, 1D and 2. Filled polystyrene beads were used as the solid phase antigen. Serum samples are converted to HEV Blocking reagents to specifically block binding of antibodies against the epitope to the solid phase (Either recombinant antigen B4-2 or M3-2) or anti-HEV Prevent it from binding to the solid phase Diluted in sample diluent with no control reagent (recombinant HCV antigen). Recombinant HC V antigen is G. J. Dawson et al.,J. Clin. Micro.29: 147 9-1486 (1990). 25 to 5 for sample diluent It contained 00 μg / ml of blocking or control reagent. Absorbance value depending on blocking reagent Samples with a decrease of 50% or more were considered reactive.   Samples are diluted (1: 300) in sample diluent containing blocking or control reagents and allowed to reach room temperature to Incubated at 40 ° C for 1 hour. Then 200 μl of diluted sample was Incubated with beads coated with adult peptide and described in Example 4A. The ELISA was performed as described. Absorbance value is reduced by 50% or more by the blocking reagent A small sample was considered reactive.   The method described above is reactive to the recombinant antigen of Example 1 and to the synthetic peptide. Applicable to 8 samples from Southeastern Wisconsin donors found to be . Anti-HE pre-attached to a solid phase coated with various synthetic peptides of the invention V-antibody binding is a recombinant antigen corresponding to a synthetic peptide coated on a solid phase Dilute the sample in diluent containing I was able to stop it specifically by releasing it. G. J. Dawson et al.,J. Vir ol. Methods. 38: 175-186 (1992). The document is It is included as a reference in the detailed text.                                 Example 8                           CDC panel reactivity   Center for Disease C obtained from various ET-NANBH 8 samples of ontrol, similar to those used in Examples 5 and 6 Methods and materials were used to test for anti-HEV (IgG and IgM). Burma One sample of origin was negative in all assays. 4 samples are 4 kinds of total It showed reactivity to IgG class antibodies against all recombinant antigens. 8 samples Seven of them react with the B4-2 epitope, and six of them react with SPB33 (SEQ ID NO: It was confirmed in No. 3). Another Burmese sample showed reactivity only with B4-2. At least 2 samples showed reactivity with both B4-2 and SPB33 assays. It was also found to react with other types of HEV recombinant antigens. Compared to this, I In the gM-specific assay, 6 out of 7 acute phase sera reacted with B4-2, 5 out of Reacted with B3-2 and M4-2, three out of seven reacted with M3-2. G. J ． See Dawson et al. (1992) supra.                                 Example 9                         Examination of cynomolgus macaque   To investigate the immunoreactivity of sera obtained from experimentally infected cynomolgus macaques Tests were performed with both recombinant HEV protein and synthetic peptides . After inoculation, all three animals were challenged with one or more recombinant antigens or synthetic peptides. Produced the corresponding antibody. Part of sample reacts with both recombinant antigen and synthetic peptide Then, another sample reacted with either one. G. J. Dawson et al. (1992) Referenced above.                                Example 10                              Cross-reactivity test   Patients and chimpanzees with antibodies to various viruses and interfering globulin The test sample obtained from the above was used for both the anti-HEV IgG method and the IgM method described in Example 4. I inspected it. As shown in Table 3, the high specificity of this test method is The lack of cross-reactivity observed between disease-derived samples. It is clear from the loss.                             Example 11                            Limit dilution test   Six seropositive serum samples were serially diluted in anti-HEV deficient human normal serum to give G As described in Example 4 with recombinant or synthetic peptides produced in ST. In the procedure, B3 -2 and B4-2 were assayed. The inspection results are shown in Table 4 below.   The above data show that when the sample reacts with B4-2, the synthetic peptide (sp) End point when used than when using the corresponding recombinant protein (GST) Is large. However, 5 samples responding to the B3-2 sequence 3 out of the synthetic peptide (sp) to the recombinant protein (GST) It showed greater reactivity.   The assay of the present invention can vary assay conditions and / or incubation times. However, various combinations of antigen or antibody capture or probe reagents are used and disclosed to those skilled in the art. Can be further optimized by using other known methods, reagents and conditions it is conceivable that. All these modifications are considered to be within the scope of the invention. Well Also, manual methods or automated analyzers can be used in the assays of the invention without departing from the scope of the invention. It can be used or adapted. Therefore, the present invention is defined by the “claims” described below. Is limited only.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グテイーレス，ロビン・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ノース・ハント・クラブ・ロード・ 34859 (72)発明者 ポール，デボラ・エイ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、ダンハム・ロード・594 (72)発明者 ナイツジ，マーク・エフ アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレ イスレイク、ダーラム・ロード・820─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (72) Inventor Gutierrez, Robin A.             United States, Illinois 60031, Gar             Knee, North Hunt Club Road             34859 (72) Inventor Paul, Deborah A.             United States, Illinois 60031, Gar             Knee, Dunham Road 594 (72) Inventor Knight F. Mark F             United States, Illinois 60030, Gres             Islake, Durham Road 820

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 検査試料中の抗ＨＥＶ抗体の存在を確認するためのアッセイであって、（ ａ）検査試料を、抗ＨＥＶ抗体に特異的に結合する１種類以上の合成ペプチドに 、ペプチド／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で接触させ、（ｂ）前記 ペプチド／抗体複合体を、抗ヒト抗体に接合したシグナル発生化合物からなる指 示試薬に接触させ、ペプチド／抗体／抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下 でインキュベートし、（ｃ）検査試料中の抗ＨＥＶの存在を示す測定可能なシグ ナルを検出することからなる前記アッセイ。 ２． ステップ（ａ）を実施する前にステップ（ａ）のペプチドを固相に接合し 、前記固相を微粒子、ポリスチレンビーズ及び反応トレーのウェルの中から選択 する請求項１に記載のアッセイ。 ３． ステップ（ａ）及びステップ（ｂ）を同時に実施する請求項１に記載のア ッセイ。 ４． 合成ペプチドを、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の 中から選択する請求項１に記載のアッ セイ。 ５． 前記指示試薬のシグナル発生化合物を、酵素、発光化合物、放射性元素、 可視標識及び化学発光化合物の中から選択する請求項１に記載のアッセイ。 ６． 前記酵素を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びア ルカリホスファターゼの中から選択する請求項５に記載のアッセイ。 ７． 配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の中から選択される 合成ペプチド。 ８． 検査試料中のヒト抗ＨＥＶ抗体の存在を確認するためのアッセイキットで あって、固相に接合した抗ＨＥＶ抗体に特異的な合成ペプチドが１種類以上入っ ている容器を含み、前記合成ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３ 及び配列番号４の中から選択した１種類以上のペプチドからなる前記アッセイキ ット。 ９． 前記固相が、微粒子、ポリスチレンビーズ及び反応トレーのウェルの中か ら選択したものである請求項８に記載のキット。 １０． シグナル発生化合物に接合した抗ヒト抗体からなる指示試薬が入ってい る容器をも含み、前記シグナル発生 化合物が、酵素、発光化合物、放射性元素、可視標識及び化学発光化合物の中か ら選択したものである請求項９に記載のキット。[Claims] 1. An assay for confirming the presence of anti-HEV antibody in a test sample, comprising: a) The test sample is one or more synthetic peptides that specifically bind to the anti-HEV antibody. Contacting for a time and under conditions sufficient to form a peptide / antibody complex, (b) Finger consisting of a signal-generating compound in which a peptide / antibody complex is conjugated to an anti-human antibody Contact with the indicated reagents for a time and under conditions sufficient to form a peptide / antibody / antibody complex (C) a measurable sig that shows the presence of anti-HEV in the test sample. Said assay comprising detecting nulls. 2. Before carrying out step (a), the peptide of step (a) is conjugated to a solid phase. , Select the solid phase from fine particles, polystyrene beads, and wells of reaction tray The assay according to claim 1, wherein 3. The method according to claim 1, wherein the step (a) and the step (b) are simultaneously performed. Essay. 4. Synthetic peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 The assembly according to claim 1, which is selected from among Surname. 5. The signal generating compound of the indicator reagent is an enzyme, a luminescent compound, a radioactive element, The assay of claim 1 selected from visible labels and chemiluminescent compounds. 6. The enzymes are horseradish peroxidase, β-galactosidase and enzyme. The assay according to claim 5, wherein the assay is selected from among lucariphosphatase. 7. Selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 Synthetic peptide. 8. An assay kit for confirming the presence of human anti-HEV antibody in a test sample Therefore, one or more synthetic peptides specific to the anti-HEV antibody conjugated to the solid phase are included. Including the container, the synthetic peptides are SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 And the assay key consisting of one or more peptides selected from SEQ ID NO: 4. And 9. Is the solid phase in the wells of microparticles, polystyrene beads and reaction trays? The kit according to claim 8, which is selected from 10. Contains an indicator reagent consisting of an anti-human antibody conjugated to a signal-generating compound The signal generation Whether the compound is an enzyme, luminescent compound, radioactive element, visible label or chemiluminescent compound The kit according to claim 9, which is selected from
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