JPH08510391A

JPH08510391A - Ｍｔｓ遺伝子における生殖系統の変異およびｍｔｓ遺伝子における癌の素因の検出方法

Info

Publication number: JPH08510391A
Application number: JP7524780A
Authority: JP
Inventors: スコルニック，マーク・エイチ; キャノン−アルブライト，リサ・エイ; カン，アレクサンダー
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション; ミリアド・ジェネティックス・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-03-18
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1996-11-05
Also published as: US6140473A; US5994095A; NZ284612A; AU2378995A; US6180776B1; US6037462A; RU2161309C2; EP0702730A4; AU685627B2; CN1128049A; US5801236A; NO954495D0; CA2162150A1; US6090578A; CA2162150C; US5739027A; FI955416A7; FI955416A0; FI955416L; EP0702730A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトの癌における多重腫瘍サプレッサー（Multiple Tumor Suppressor）（ＭＴＳ）遺伝子における体細胞変異およびヒトの癌の診断ならびに予後におけるその使用に関する。さらに本発明は、ＭＴＳ遺伝子における生殖系列の変異、およびメラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌のごとき癌になりやすい素因の診断におけるその利用に関する。また本発明は、遺伝子治療、蛋白置換療法ならびに蛋白模擬体をはじめとする、ＭＴＳ遺伝子における変異を有するヒトの癌の治療に関する。結局は、本発明は、癌の治療に用いる薬剤のスクリーニングに関する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ＭＴＳ遺伝子における生殖系統の変異およびＭＴＳ遺伝子における癌の素因の検出方法関連出願の相互参照本発明は、１９９４年６月１日出願の第０８／２５１，９３８号、１９９４年３月１８日出願の第０８／２１５，０８７号、および１９９４年３月１８日出願の第０８／２１５／０８６号の一部継続出願であり、参照によりそれらすべてを本明細書に取り入れる。第０８／２５１，９３８号は、１９９４年３月１８日出願の第０８／２１４，５８２号の一部継続出願の１９９４年４月１４日出願の第０８／２２７，３６９号の一部継続出願であり、参照によりそれらすべてを本明細書に取り入れる。発明の背景本発明は、ヒトの癌における多重腫瘍サプレッサー（Multiple Tumor Suppres sor）（ＭＴＳ）遺伝子における体細胞変異およびヒトの癌の診断ならびに予後におけるその使用に関する。さらに本発明は、ＭＴＳ遺伝子における生殖系列の変異、およびメラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌のごとき癌になりやすい素因の診断におけるその利用に関する。また本発明は、遺伝子治療、蛋白置換療法ならびに蛋白模擬体をはじめとする、ＭＴＳ遺伝子における変異を有するヒトの癌の治療に関する。結局は、本発明は、癌の治療に用いる薬剤のスクリーニングに関する。本発明の背景、そして特に実施のためのさらなる詳細を提供する場合について説明するために本明細書に用いる刊行物および他の材料は、参照により本明細書に取り入れられ、適宜以下の文章において参照され、それらは添付した文献のリストにそれぞれ記載されている。癌の遺伝学は複雑で、形質転換状態に対する多くの優性かつ正のレギュレーター（腫瘍遺伝子）ならびに多くの劣性かつ負のレギュレーター（腫瘍抑制遺伝子）を包含する。１００種以上の腫瘍遺伝子が特徴づけられている。１２種よりも少ない腫瘍抑制遺伝子が同定されているが、その数は５０を越えると期待される（クヌドソン（Knudson），１９９３年）。非常に多くの遺伝子の関与が、正常組織の完全性を維持するために細胞中で機能する増殖調節機構を複雑なものにしている。この複雑さは別の方法で明らかにされている。今までのところ、すべて、あるいは大部分のヒトの癌の増殖に関与することが示されている単一遺伝子はない。大部分の共通した腫瘍原性変異はＨ −ｒａｓ遺伝子において存在し、すべての固形癌の１０〜１５％において見られる（アンダーソン（Anderson）ら，１９９２年）。最も頻繁に変異される腫瘍抑制遺伝子はｐ５３遺伝子であり、すべての腫瘍の約５０％において変異されている。すべての形質転換細胞に共通する標的がなければ、正常組織に損傷を与えずにガン細胞を破壊し、あるいは元に戻すことのできる「魔弾」の夢はかなわない。新世代の特異的に標的とされる抗腫瘍剤に対する希望は、細胞分裂の調節に一般的役割を果たす腫瘍抑制遺伝子または腫瘍遺伝子を同定しうる余地を与える可能性がある。クローニングされ特徴づけられた腫瘍抑制遺伝子は、１）網膜芽腫（ＲＢ１）；２）ウィルムス（Wilm's）腫瘍（ＷＴ１）：３）リー−フラウメニ（Li-Fraum eni）（ＴＰ５３）；４）家族性腺腫様ポリープ症（ＡＰＣ５）；５）１型神経線維腫症（ＮＦ１）；６）２型神経線維腫症（ＮＦ２）；７）フォン・ヒッペル −リンダウ（von Hippel-Lindau）症候群（ＶＨＬ）；および８）２Ａ型多発性内分泌腫瘍形成（ＭＥＮ２Ａ）に対する感受性に影響する。遺伝学的にマッピングされているが、未だ単離されていない腫瘍サプレッサー遺伝子座は、１型多発性内分泌腫瘍形成（ＭＥＮ１）；リンチ（Lynch）癌家族症候群２（ＬＣＦＳ２）；家族性乳癌（ＢＲＣＡ１）；神経芽腫（ＮＢ）；基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）；ベックウィズ−ウィーデマン（Beckwith-Wiedema nn）症候群（ＢＷＳ）；腎臓細胞癌（ＲＣＣ）；結節状硬化症１（ＴＳＣ１）；および結節状硬化症２（ＴＳＣ２）に関する遺伝子を包含している。現在に至るまで特徴づけられている腫瘍抑制遺伝子は、ＤＮＡ結合蛋白（ＷＴ１）、補助的な転写レギュレーター（ＲＢ１）、ＧＴＰａｓｅ活性化蛋白またはＧＡＰｓ（ＮＦ１）、細胞骨格成分（ＮＦ２）、膜結合受容体キナーゼ（ＭＥＮ２Ａ）をはじめとする種々の蛋白タイプに対する類似性を有する産物、および既知蛋白とは明らかな類似性のない他の産物（ＡＰＣおよびＶＨＬ）をコードしている。多くの場合、本来遺伝学的研究により同定された腫瘍抑制遺伝子は、消失または変異されるいくつかの散在性の癌において示されている。この結果は、染色体の変状は、癌になりやすい遺伝的素因および散在性の癌の両方に関連する重要な腫瘍抑制遺伝子の位置を示しうることを示唆する。今までのところ特徴づけられているいくつかの腫瘍抑制遺伝子であることの証明の１つは、ある種の癌タイプにおいて、それらが高頻度で欠失されるということである。欠失は、しばしば、単一の対立遺伝子の損失、いわゆるヘテロ接合度の損失（ＬＯＨ）を包含するが、両方の対立遺伝子のヘテロ接合性の欠失をも包含しうる。ＬＯＨに関しては、先在する遺伝的変異または二次的な散在性変異のいずれかにより、残りの対立遺伝子は機能的でないと推察される。メラノーマは、多数のアメリカ人を苦しめている癌である（アメリカン・キャンサー・ソサエティー（American Cancer Society），１９９２年）。紫外線への曝露のごとき環境の影響は、メラノーマ発生に大きな役割を果たしているが、遺伝も関連因子である。家族性メラノーマ、ＭＬＭに関する遺伝子が染色体９ｐ２１にマッピングされた（キャノン−アルブライト（Cannon-Albright）ら，１９９２年；ナンカロウ（Nancarrow）ら，１９９３年；グルイス（Gruis）ら，１９９３年；ゴールドステイン（Goldstein）ら，１９９４年）。ＭＬＭ遺伝子座における単一の素因となる対立遺伝子を有することは、個体がメラノーマを発生させる可能性を約５０倍まで増大させる。メラノーマになりやすい素因は、優性メンデル則として遺伝するが、ＭＬＭにおける素因を作る変異は、元々クヌドソン（Knud son）（１９７１年）により提案された様式で体細胞の劣勢対立遺伝子として作用すると考えられる。１個の野生型および１個の変異したＭＬＭ対立遺伝子を有する素因のある個体においては、細胞分裂は、ＭＬＭの野生型コピーの損失または不活性化を包含する二次的変異を受け、そのことによって、遺伝された変異対立遺伝子は無防備となる。逆に、該遺伝子の単一の野生型コピーは悪性の発生を妨げる。９ｐ２１におけるＭＬＭ付近の染色体の変状は、神経膠細胞系、小型でない細胞肺系（non-small cell lung lines）および急性リンパ芽球白血病系をはじめとするいくつかの異なる腫瘍タイプにおいて非常によく特徴づけられている（オロペイド（Olopade）ら，１９９２年；オロペイド（Olopade）ら，１９９３年；ルケイス（Lukeis）ら，１９９０年；ディアス（Diaz）ら，１９８８年；ミドルトン（Middleton）ら，１９９１年；ファウンテイン（Fountain）ら，１９９２年；チェン（Cheng）ら，１９９３年；ジェイムズ（James）ら，１９９３年）。かくして、非メラノーマ腫瘍細胞における９ｐ２１染色体異常の頻度に基づけば、ＭＬＭ領域が少なくともいくつかの異なる腫瘍タイプの発達に関与している遺伝子（遺伝子群）を有する可能性がある。これらの事柄はＬＯＨならびに高頻度のホモ接合性欠失に関連している。組織中の細胞は、その生活において、３つの選択肢のみを有する−−それらは分裂し増殖することができるか、増殖せずに静止するか、あるいはアポトーシスにより死滅するかである。腫瘍は、不適切な増殖および分裂または死ぬべき場合に死なない細胞のいずれかにより生じうる。腫瘍の増殖をコントロールする機構の１つは、細胞周期に対する直接の調節を必要とするであろう。例えば、ＤＮＡ複製の決定をコントロールする遺伝子は、それらがプロセスにおいて剌激的役割を果たしているか、あるいは阻害的役割を果たしているかに依存するが、腫瘍遺伝子または腫瘍抑制遺伝子に関する魅力的な候補である。細胞周期（Ｇ₁、Ｓ、Ｇ₂およびＭ期）による真核細胞の発達は、一連のサイクリン／サイクリン−依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）複合体の形成、活性化およびその後の不活性化により支配されている。サイクリンＤ'ｓ／Ｃｄｋ２、４、５、サイクリンＥ／Ｃｄｋ２、サイクリンＡ／Ｃｄｋ２およびサイクリンＢ／Ａ／Ｃｄｋ２はこのプロセスに必要であること示されている。サイクリンＤ'ｓおよびＣｄｋ２、Ｃｄｋ４ならびにＣｄｋ５は、Ｇ₁からＳへの遷移に関連していた；すなわち、細胞が増殖しＤＮＡ複製を開始するかどうかを決定する場合に関連していた。さらなる細胞周期調節エレメントが最近発見された。これらのエレメントはＣｄｋの阻害物質（Ｃｄｋ阻害物質，ＣｋＩ）であり、Ｆａｒ１、ｐ２１、ｐ４０、ｐ２０およびｐ１６を包含する（マークス（Marx），１９９４年；ナスマイス（Nasmyth）およびフント（Hunt），１９９３年）。最近になって、いくつかの腫瘍遺伝子および腫瘍抑制遺伝子は、細胞周期に直接関与していることがわかった。例えば、サイクリン（ＤＮＡ複製を促進する蛋白）の１つは腫瘍遺伝子として関与し（モトクラ（Motokura）ら，１９９１年；ラミー（Lammie）ら，１９９１年：ウィザーズ（Withers）ら，１９９１年；ローゼンバーグ（Rosenberg）ら，１９９１年）、腫瘍サプレッサーＲｂは第１のサイクリン結合パートナーであるＣｄｋと相互作用する（エウェン（Ewen）ら，１９９３年）。メラノーマ感受性遺伝子座の同定は、例えば、日光への曝露による増加した癌の危険性を評価するための、個体の遺伝学的スクリーニングへの途を開くであろう。さらにＭＴＳは、他の多数の癌（白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌をはじめとする癌であるが、これらに限定しない）の部位に対する素因を作りうる。さらに、ＭＴＳはいくつかの異なる腫瘍タイプの発達に影響するため、癌患者における予後の決定に有用である。よって、ＭＴＳは、メラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌にかかりやすい素因を予測する非常に重要な診断試験の開発の基礎として役立つ可能性がある。そのうえ、ＭＴＳは多数の腫瘍タイプの発達に関連しているため、ＭＴＳは、その腫瘍増殖を抑制する能力による一般的な抗癌治療のための、直接的あるいは間接的手段を提供しうる。例えば、腫瘍細胞が正常なＭＴＳ機能を回復することは、細胞を悪性でない細胞に変える可能性がある。発明の概要本発明は、ヒトの癌における多重腫瘍サプレッサー（Multiple Tumor Suppres sor）（ＭＴＳ）遺伝子における体細胞変異およびヒトの癌の診断ならびに予後におけるその使用に関する。さらに本発明は、ＭＴＳ遺伝子における生殖系列の変異、およびメラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌のごとき癌になりやすい素因の診断におけるその利用に関する。また本発明は、遺伝子治療、蛋白置換療法ならびに蛋白模擬体をはじめとする、ＭＴＳ遺伝子における変異を有するヒトの癌の治療に関する。結局は、本発明は、癌の治療に用いる薬剤のスクリーニングに関する。図面の簡単な説明図１Ａは血族３１３７を示す。すべてのメラノーマ患者は感受性のあるハプロタイプを有している。感受性のあるハプロタイプを有する個体における他の癌も示す。凡例は以下のごとし：黒丸または黒四角はメラノーマを示す；一部を黒く塗った丸または一部を黒く塗った四角は他の癌を示す；「／」は死去したことを示す；「＊」は個体が感受性のあるハプロタイプを有するかどうかが不明であることを示す；「＊＊」は個体が感受性のあるハプロタイプを有することを示す；「３５」は、病気になった場合、試験または診断を受けた年齢を示す。図１Ｂは血族３１６１を示す。すべてのメラノーマ患者は感受性のあるハプロタイプを有している。他の癌はハプロタイプではない。凡例は以下のごとし：黒丸または黒四角はメラノーマを示す；一部を黒く塗った丸または一部を黒く塗った四角は他の癌を示す；「／」は死去したことを示す；「＝」は血族図の他の場所に現れることを示す；五角形中の「３」は多重婚を示す；「３５」は、病気になった場合、試験または診断を受けた年齢を示す。図１Ｃは血族３３５５を示す。すべてのメラノーマ患者は感受性のあるハプロタイプを有している。他の癌はハプロタイプではない。凡例は以下のごとし：黒丸または黒四角はメラノーマを示す；一部を黒く塗った丸または一部を黒く塗った四角は他の癌を示す；「／」は死去したことを示す；「３５」は、病気になった場合、試験または診断を受けた年齢を示す。図１Ｄは血族１７７１を示し、メラノーマおよび他の癌の発生を示す。変異は、この血族におけるＭＴＳにおいて同定された。凡例は以下のごとし：「＊」は確認された変異を有する者である；黒丸または黒四角はメラノーマを示す；一部を黒く塗った丸または一部を黒く塗った四角は他の癌を示す（この血族における結腸癌）；「／」は死去したことを示す；「３５」は、病気になった場合、試験または診断を受けた年齢を示す。図２は、ＩＦＮＡ−ｓおよびＤ９Ｓ１７１により仕切られた領域におけるＹＡＣおよびＰ１クローンを示す。セントロメアは右にある。Ｐ１クローンに関しては、矢印はベクター中のＴ７プロモーターの方向を示す。一緒に群分けされたＹＡＣは、領域中でのＳＴＳマッピングに基づき、同様であるクローンを示す。これらのＹＡＣはおそらく同一でなない。ＹＡＣ（Ａ５、Ｂ１１、Ｃ６およびＦ９）はＩＦＮ−１およびＩＦＮ−ｓを含んでいる。ＹＡＣ（Ｄ１、Ｆ５およびＥ３）はＤ９Ｓ１２６およびＤ９Ｓ１７１を含んでいる。Ｄ９Ｓ１７１を含む近位のＹＡＣ末端も、ＩＦＮＡ−ｓを含む遠位のＹＡＣ末端も、示されていない。距離は必ずしもスケール通りに描いたものではない。ＩＦＮＡ−ｓおよびＤ９Ｓ１７１の内部にあるマーカーを図２に示す。「ｃ」で始まるマーカーはコスミド末端配列由来である。コスミドは示されていない。ｃ１.ｂとｃ５.３との間の距離および７６０−ＬとＤ９Ｓ１７１との間の距離は不明である。図３は、メラノーマ細胞系において観察された欠失のダイヤグラムを示す。欠失されたマーカーのセットに基づき、欠失を１２クラスに分類する。１１種の細胞系は図に示したすべてのマーカーを欠失していた。このクラスは示さない。他の１２種のクラスのそれぞれの代表例の数を細胞系数の欄に示す。クラス１〜１０については、欠失部位は欠失したＤＮＡに隣接したマーカーにおける欠落として示される。すなわち、欠失に至るシリーズにおける最後の陽性のマーカーである。クラス１１および１２については、欠失部位は黒三角により示される。図４Ａはコスミドｃ５の地図を示す。コスミドおよびＰ１と同様に、欠失分析に使用した重要なＳＴＳを示す。ｃ１.ｂマーカーはＰ１−１０６２に近い方にあり、示されていない。ＭＴＳ１およびＭＴＳ２の転写方向を矢印で示す。図４Ｂはコスミドｃ５の制限酵素地図およびＳＴＳ地図を示す。ＭＴＳ１およびＭＴＳ２に関するコーディングエキソンの位置を太線で示す。「Ｅ１」および「Ｅ２」は、それぞれ「コーディングエキソン１」および「コーディングエキソン２」を示す。「Ｂ」はＢａｍＨＩ、「Ｓ」はＳａｌＩ、「Ｒ１」はＥｃｏＲＩ、「Ｒ５」はＥｃｏＲＶを示す。図５Ａおよび図５Ｂは、ＭＴＳ１に関する５’非翻訳領域、エキソン１およびイントロン１の一部を含むゲノム配列と、ｐ１６に関する公表されている配列（セラノ（Serrano）ら，１９９３年）との比較を示す。開始コドン（下線）は位置８９１にあり、スプライス部位（矢印）は位置１０１６にある。図５Ａ〜Ｂに示すＭＴＳ１配列は配列番号：３である。図５Ｂに示すｐ１６配列は配列番号：２４である。図６Ａおよび６Ｂは、ＭＴＳ１に関するイントロン１の一部、エキソン２およびイントロン２の一部を含むゲノム配列と、ｐ１６に関する公表されている配列（セラノ（Serrano）ら，１９９３年）との比較を示す。スプライス部位（矢印）は位置１９２の前かつ位置４９８の後にある。図６Ａ〜Ｂに示すＭＴＳ１配列は配列番号：４である。図６Ａに示すｐ１６配列は、配列番号：４のヌクレオチド１９２〜４９８と同じである。図７Ａおよび７Ｂは、ＭＴＳ２に関するイントロン１、「エキソン２」およびその後の配列を含むゲノムと、公表されたｐ１６配列との比較を示す。「エキソン２」配列は、ヌクレオチド２７３〜５８０のＭＴＳ１のエキソン２と同様である。ＭＴＳ２におけるスプライス部位、およびｐ１６におけるスプライス部位を矢印で示す。相違（divergence）が開始する点を°により示す。ＭＴＳ２に関する終止コドンはエキソン２中位置５３２にあり、「＊」により示す。図７Ａ〜Ｂに示すＭＴＳ２配列は配列番号：５である。図７Ａに示すｐ１６配列は配列番号：４のヌクレオチド１９２〜４９８と同じである。図８は、エキソン２および周囲の各イントロンを含むＭＴＳ１およびＭＴＳ２のＤＮＡ配列の比較を示す。ＭＴＳ１に関するイントロン１の３’スプライスジャンクションおよびイントロン２の５’スプライスジャンクションを三角により示す。コーディングエキソン２の３’末端近傍の相違点を矢印により示す。示されたＭＴＳ１配列は配列番号：４のヌクレオチド９２〜５４８に対応する。示されたＭＴＳ２配列は配列番号：５のヌクレオチド１７４〜６３０に対応する。図９は種々のＳＴＳの腫瘍細胞系における欠失を示す。正のコントロールおよび負のコントロールはそれぞれのＰＣＲ実験に使用され、１つのみまたは２つのＳＴＳが欠失している細胞系（例えば、クラス２１）を、少なくとも２回再試験した。図１０Ａ〜Ｃは、ＭＴＳ２ｍＲＮＡの発現を示す。図１０Ａは種々のヒト組織由来のＲＮＡ（クローンテック（Clonetech）社製）におけるＭＴＳ２転写物の相対的レベルを示す。レーン１−脳；レーン２−胸部；レーン３−腎臓；レーン４−肺；レーン５−リンパ球；レーン６−卵巣；レーン７−膵臓；レーン８− 前立腺；レーン９−牌臓；レーン１０−胃；レーン１１−甲状腺。予想分子量と異なる産物の起源は不明である（レーン１参照）。図１０Ｂは、ヒト・リンパ球における相対的なＭＴＳ２転写物のレベルを、マイトジェンによる誘導後の時間の関数として示す：レーン１−０時間；レーン２−１時間；レーン３−２時間；レーン４−４時間；レーン５−８時間；レーン６−１６時間；レーン７−２４時間；レーン８−３２時間；レーン９−４０時間；レーン１０−４８時間；レーン１１−５６時間；レーン１２−６４時間。大多数の細胞は誘導後４０〜５０時間においてＳ期にあった。図１０Ｃは、ＭＴＳ２転写物のレベルをＲｂの状態の関数として示す。Ｒｂ⁺細胞系は：レーン１−ＫＩＴ８（ホリ（Hori）ら，１９８７年）；レーン２−２倍体のヒト・線維芽細胞ＭＲＣ５（２８代継代）；レーン３−ＵＭＳＣＣ２；レーン４−ブリストル８；レーン５−ＺＲ７５；レーン６− ＨａＣａＴ；レーン７−Ｔ２４。Ｒｂ^-細胞系は：レーン８−ＭＤＡＭＢ４６８；レーン９−５６３７；レーン１０−Ｃ３３Ａ；レーン１１−ＳｉＨａ；レーン１２−ＣａＳｋｉ；レーン１３−ＷＥＲＩ。図１１は５’−非翻訳領域を含むＭＴＳ２に関するｃＤＮＡ配列（およびコードされるポリペプチド）を示す。エキソン２の開始は位置４９１にあり、矢印により示す。ｃＤＮＡ配列を配列番号：１５として示し、アミノ酸配列を配列番号：１６として示す。図１２Ａおよび１２Ｂは、ＭＴＳ１Ｅ１βのｃＤＮＡ配列（およびコードされるポリペプチド）を示す。スプライス部位を矢印で示す。エキソン２は位置３３５から開始し、エキソン３は位置６４２から開始する。ｃＤＮＡ配列を配列番号：１３として示し、アミノ酸配列を配列番号：１４として示す。図１３はＰ１６領域の構成を示す地図である。エキソン１α（Ｅ１α）、エキソン１β（Ｅ１β）、エキソン２（Ｅ２）およびエキソン３（Ｅ３）を黒く塗ったボックスにより示す。制限部位ＥｃｏＲＩ（Ｒ１）、ＥｃｏＲＶ（ＲＶ）およびｓａｌＩ（Ｓ）を示す。上の制限酵素地図はゲノムクローンコスミドｃ５およびＰ１１０６３である。下の地図は細胞系Ａ３７５およびＳＫ−ｍｅｌ９３における欠失である。破線は欠失したＤＮＡを示す。図１４はマウスおよびヒトのＰ１６β転写物の配列を並べたものである。大文字は同じヌクレオチドを示す。Ｐ１６読み取り枠におけるストップコドンに下線を付す。Ｅ１βとＥ２との間のスプライスジャンクションを脱字記号（ｖ）で示す。マウス・β配列を配列番号：２５として示す。ヒト・β配列は配列番号：１３のヌクレオチド１９３〜４６１と同じである。図１５は、Ｅ１βの欠失を有する細胞系におけるα転写物の発現を示す。ｃＤＮＡは、示された試料から単離された全ＲＮＡ由来のものである。放射線標識したプライマーを反応に用いてＰ１６転写物を増幅した。同体積のαおよびβ増幅物を混合し、生成物を変性５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した：レーン１ −静止Ｔ細胞；レーン２−細胞系ＳＫ−ｍｅｌ９３；レーン３−細胞系Ａ３７５。図１６Ａ〜ＤはＰ１６転写物の発現を示す。放射線標識したプライマーを反応に用いてＰ１６転写物を増幅し、生成物を変性５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。図１６Ａおよび１６Ｂにおいて、共通試料からのαおよびβ反応物を電気泳動の前に混合した。図１６Ａは、種々のヒト組織由来のＲＮＡにおけるＰ１６転写物の相対的レベルを示す：レーン１,脳；レーン２,胸部；レーン３,腎臓；レーン４,肺；レーン５,リンパ球；レーン６,卵巣；レーン７,膵臓；レーン８,前立腺；レーン９,脾臓；レーン１０,胃；レーン１１,甲状腺。図１６Ｂは、ヒト・リンパ球におけるβ転写物の相対量をマイトジェンによる誘導後の時間の関数として示す：レーン１,０時間；レーン２,１時間；レーン３,２時間；レーン４,４時間；レーン５,８時間；レーン６,１６時間；レーン７,２４時間；レーン８,３２時間；レーン９,４０時間；レーン１０,４８時間；レーン１１,５６時間；レーン１２,６４時間。図１６Ｃは、ヒト・リンパ球におけるα転写物の相対量をマイトジェンによる誘導後の時間の関数として示す：レーンは図１６Ｂと同じであるが、１時間のポイントを省略した。細胞周期の進行に影響する疑いのある、あるいは細胞周期の間、転写レベルにおいて調節されている他の分子の発現も分析した。以前の結果と一致して、ＣＤＫ４およびＧｏＳ２（機能不明の分子であるが、静止Ｔ細胞が細胞周期に入るとその転写が誘導される）のレベルはＴ細胞の誘導により上昇した（ラッセル（Russell）およびフォースダイク（For sdyke），１９９１年；マツヒメ（Matsuhime）ら，１９９２年；ゲング（Geng）およびワインバーグ（Weinberg），１９９３年）。対照的に、実験期間中、ｐ２７のＲＮＡレベルは不変であるように思われた（トヨシマ（Toyoshima）およびハンター（Hunter），１９９４年；カトー（Kato）ら，１９９４年）。図１６Ｄは、Ｐ１６転写物をＲｂの状態の関数として示す。Ｒｂ^-細胞系：レーン１,ＷＥＲＩ；レーン２,ＣａＳｋｉ；レーン３,ＳｉＨａ；レーン４,Ｃ３３Ａ；レーン５,５６３７；レーン６,ＭＤＡＭＢ４６８。Ｒｂ⁺細胞系：レーン７,Ｔ２４；レーン８,ＨａＣａＴ；レーン９,Ｚｒ７５；レーン１０,ブリストル８；レーン１１,ＵＭＳＣＣ２；レーン１２,２倍体のヒト・線維芽細胞ＭＲＣ５（２８代継代）；レーン１３,ＫＩＴ（ホリ（Hori）ら，１９８７年）。図１７は、ｃＤＮＡの非コーディング部分を含むＭＴＳ１に関するｃＤＮＡ配列を示す。三角はスプライスジャンクションを示す。２番目のスプライスジャンクションにおける配列中の破線は、単にこのスプライスジャンクションを強調するに過ぎず、それらは欠失した塩基を示すのではない。この配列は配列番号：３６である。発明の詳細な説明本発明は、ヒトの癌における多重腫瘍サプレッサー（Multiple Tumor Suppres sor）（ＭＴＳ）遺伝子における体細胞変異およびヒトの癌の診断ならびに予後におけるその使用に関する。さらに本発明は、ＭＴＳ遺伝子における生殖系列の変異、およびメラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌のごとき癌になりやすい素因の診断におけるその利用に関する。また本発明は、遺伝子治療、蛋白置換療法ならびに蛋白模擬体をはじめとする、ＭＴＳ遺伝子における変異を有するヒトの癌の治療に関する。結局は、本発明は、癌の治療に用いる薬剤のスクリーニングに関する。本発明は、ＭＴＳ遺伝子座または変異したＭＴＳ遺伝子座のすべてもしくは一部からなる、好ましくは、少なくとも長さ８塩基であり約１００ｋｂを越えない、単離ポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドはアンチセンスポリヌクレオチドであってもよい。さらに本発明は、かかる単離ポリヌクレオチドからなる組み換え構築物、例えば、形質転換細胞における発現に適した組み換え構築物を提供する。さらに、分析対象中のＭＴＳ遺伝子座の一部からなるポリヌクレオチドまたはその発現産物を検出する方法が本発明により提供される。かかる方法は、さらにＭＴＳ遺伝子座の一部ゐ増幅する工程からなっていてもよく、該ＭＴＳ遺伝子座の一部の増幅用プライマーであるポリヌクレオチドのセットを提供する工程を包含していてもよい。該方法は、癌にかかりやすい素因の診断または癌の診断もしくは予後に有用である。また本発明は、ＭＴＳ遺伝子座によりコードされる少なくとも５個のアミノ酸残基からなる単離ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体、好ましくは、モノクローナル抗体を提供する。また本発明は、分析対象中の、ＭＴＳ遺伝子座の一部からなるポリヌクレオチドを検出するためのキットであって、適当な容器に入ったＭＴＳ遺伝子座の一部に相補的なポリヌクレオチドおよびその使用説明書からなるキットを提供する。さらに本発明は、ヌクレオチドをポリマー化してＭＴＳの少なくとも８個の連続したヌクレオチドからなる配列を得ることからなる、ポリヌクレオチドを調製するための方法；およびアミノ酸をポリマー化してＭＴＳ遺伝子座中においてコードされている少なくとも５個のアミノ酸からなる配列を得ることからなる、ポリペプチドを調製するための方法を提供する。さらに、本発明は、癌治療のための薬剤をスクリーニングしてＭＴＳ遺伝子産物の機能を回復させるための適当な薬剤を確認する方法を提供する。結局は、本発明は、遺伝子に基づく、癌細胞に指向される治療に必要な手段を提供する。これらの治療因子は、適当なベクター中に置かれていてるか、またはＭＴＳ蛋白の機能が再構成されるようにより直接的な方法で標的細胞に送達される、ＭＴＳ遺伝子座のすべてまたは一部からなるポリヌクレオチドの形態であってもよい。治療因子は、ＭＴＳの蛋白配列の一部または全体に基づくポリペプチドの形態であってもよい。これらは機能的にはインビボにおいてＭＴＳの活性と置換する。メラノーマおよび他の癌にかかりやすい素因を個体に与えるＭＴＳ遺伝子座（先行技術においてはメラノーマ（ＭＬＭ）遺伝子座と呼ばれていた）は、Ｃｄｋ、特にＣｄｋ４の阻害剤であることが見いだされているＭＴＳ１をコードする遺伝子であるということが本発明により見いだされた。本明細書においては、この遺伝子をＭＴＳ１と呼ぶ。さらに、ＭＴＳ遺伝子座が、その配列の一部に関してＭＴＳ１と類似であるＭＴＳ２と呼ばれる第２のコーディング配列を含むということも本発明により見いだされた。ＭＴＳ１遺伝子が２個の別々のプロモーター（ αおよびβ）を有するということも、本発明により見いだされた。αプロモーターが使用される場合、得られるｍＲＮＡはエキソン１α、エキソン２およびエキソン３からなる。これをＭＴＳ１と呼ぶ。βプロモーターが使用される場合、得られるｍＲＮＡはエキソンβ１、エキソン２およびエキソン３からなる。これをＭＴＳ１Ｅ１βと呼ぶ。生殖系列におけるＭＴＳ遺伝子座における変異はメラノーマおよび他の癌になりやすい素因を示すものであるということが、本発明により見いだされた。結局、ＭＴＳ遺伝子座における体細胞変異は、すべての腫瘍タイプでないとしても大部分の腫瘍タイプに関連し、よって、癌または癌の予後に関する一般的なインジケーターを提供するものであるということが、本発明により見いだされた。ＭＴＳ遺伝子座の変異は、コーディング配列および非コーディング配列中の欠失、挿入ならびに点突然変異を包含しうる。ＭＬＭ遺伝子座は、遺伝マーカーおよびメラノーマ素因の間における、ユタ州の血族と１のテキサス州の血族における劇的な連関を示すことにより、最初の遺伝学的位置を占めた（キャノン（Cannon）−アルブライト（Albright），１９９２年）。血族において、組み換えにより決定された領域は、Ｄ９Ｓ７３６およびＤ９Ｓ１７１に挟まれている。したがって、欠失を有するメラノーマおよび非メラノーマ双方の腫瘍細胞系におけるホモ接合性欠失の分析により、遺伝子を局在化させるためにこれらのおよび他の遺伝マーカーが用いられた。欠失の最小限の重複領域は、ＩＦＮＡ−ｓおよびＤ９Ｓ１７１に挟まれていた。これらのマーカーを取り囲んでいるゲノムクローン同定するためにＹＡＣライブラリーがスクリーニングされた。Ｐ１クローンが染色体区域の一部として単離され、それらは２個のギャップを除いてはＩＦＮＡ−ｓからＤ９Ｓ１７１に至る領域に接していた。より詳細な分子地図を作成するために特異的配列−タグをつけられた部位（「ＳＴＳ」）が調製された。これらのマーカーおよび欠失分析によると、欠失重複領域は、コスミド５（ｃ５）上に見いだされたマーカーであるマーカーｃ５ .１およびｃ５.３を中心とする部分に重複していた。最も高頻度に欠失されているマーカーはｃ５.３であり、これはＭＴＳに非常に近接していた。「ＣｐＧ」島の存在に関するｃ５の分析により、ｃ５がＭＴＳに関して少なくとも１個の候補遺伝子を含んでいることが示された。ｃ５のＥｃｏＲＩフラグメントのＤＮＡ配列が決定され、ＧｅｎＢａｎｋ由来の配列と比較された。ヒト・Ｃｄｋ４阻害剤またはｐ１６をコードしている先に同定された遺伝子の領域に類似の、ｃ５の別々の領域が同定された（セラノ（Serrano）ら，１９９３年）。これらの２個の候補遺伝子はＭＴＳ１およびＭＴＳ２と呼ばれた。リンパ球、胎児の脳および正常な胸部をＭＴＳ１のエキソン２由来のプローブでスクリーニングすることにより、ＮＴＳ１Ｅ１βと呼ばれるさらなる候補が同定された。ｃ５由来のゲノム配列とｐ１６のｍＲＮＡ配列との詳細な比較により、ＭＴＳ１がｐ１６をコードしている配列の一部と同じである３０７ｂｐの伸長部分を含むことが明らかとなった。ＭＴＳ１におけるこのヌクレオチドの伸長部分は、認識可能なスプライスジャンクション配列に隣接していた。ＭＴＳ１のさらなる特徴づけにより、ＭＴＳ１がｐ１６の全コーディング配列および２個のイントロンを含むことが示された。イントロン１は翻訳開始部位から１２６ｂｐ下流にあり；イントロン２は翻訳終止部位から１１ｂｐ上流にあった。該２個のイントロンはｐ１６コーディング配列を３つの領域、すなわち１２６ｂｐの５'領域（コーディングエキソン１）、３０７ｂｐの中央の領域（コーディングエキソン２）、および１１ｂｐの３'領域（コーディングエキソン３）に分断していた。ＭＴＳ２は、コーディングエキソン２の５'末端からイントロン２の方向に約２００ｂｐ伸長しているｐ１６とほとんど同じＤＮＡ配列の領域を含んでいた。しかしながら、ＭＴＳ１のイントロン２の５１ｂｐ上流の所に至っては配列の類似性が減少しており、その場所では２個の配列は完全に相違していた。このことは、ＭＴＳ２の最終コドンの位置に対応いている。ＭＴＳ１由来の配列とＭＴＳ２由来の配列の比較により、これらの２個の遺伝子間の類似性も、イントロン１の３'スプライシジャンクションから約５０ヌクレオチド上流までであることが示された。よって、非コーディングＤＮＡ部分は、コーディングＤＮＡと推定されるいくつかの領域よりも保存的である。コーディングＤＮＡにおける配列の相違がクローニングによる人工物である可能性を排除するために、ＭＴＳ２の配列相違箇所を越えて特異的に増幅を行うためにＰＣＲプライマーが設計された。これらのプライマーはコスミドＰ１およびゲノムＤＮＡ由来の予想された分子量のフラグメントを増幅した。それゆえ、ＭＴＳ２のエキソン２の３'末端付近に存在する相違配列は真のゲノム配列である。ＭＴＳ１Ｅ１βは、エキソン１βまたは１Ｅβと呼ばれるエキソン１を有し、ＭＴＳ１およびＭＴＳ２のエキソン１において見いだされた配列とは異なる配列を有している。さらにＭＴＳ１Ｅ１βは、ＭＴＳ１のエキソン２および３と同じであるエキソン２（Ｅ２）およびエキソン３（Ｅ３）含んでいる。エキソン１β はｍＴＳ１のエキソン１の上流にあり、いかなるコーディング配列も含まない。結果的に、ＭＴＳ１Ｅ１βは、エキソン２の最初のＡＴＧにおける翻訳開始部位を有するｐ１０をコードしている。ＭＬＭ素因を有すると推定される個体由来のエキソン２を用いてゲノムＤＮＡを分析することにより、遺伝学的に感受性のある遺伝子座ＭＴＳとの関連について、ＭＴＳ１およびＭＴＳ２が試験された。８人の個体のうちの１個体において、ＤＮＡ多形性がＭＴＳ１のエキソン２において確認された。変異は単一のヌクレオチド置換であり、アミノ酸変化を起こすものであった。この多形性はＭＬＭ素因対立遺伝子に関連して分枝していた。ＭＴＳ１における傷害（欠失およびヌクレオチド置換）の優位性は、ＭＴＳ１または密接に連関した遺伝子座は腫瘍表現型に貢献していることを示す。これらの傷害を受けた細胞は、傷害を受けない細胞よりも選択的利点を有する。傷害は細胞増殖に関係のないランダムな出来事であるという別の説明は、いくつかの理由により成立する可能性がない。第１に、腫瘍表現型とＭＴＳ１における変異との高い相関は、ＭＴＳ変異と腫瘍形成との間の因果関係を意味する。第２に、ＭＴＳ１はメラノーマに対する感受性に影響し、よって、腫瘍抑制遺伝子として独立して意味を持つ。第３に、Ｃｄｋ阻害剤としてのｐ１６の生化学的機能は、ＭＴＳ１インビボにおいてＤＮＡ複製の生起に対する一般的な阻害物質として作用するというモデルにうまく一致する。本発明診断および予後方法によれば、野生型ＭＴＳ遺伝子座の変化が検出される。さらに、野生型ＭＴＳ遺伝子座を検出し、素因または腫瘍形成の欠如を確認することにより、本発明方法を実施することができる。「野生型遺伝子の変化」は、コーディングおよび非コーディング配列における欠失、挿入および点突然変異をはじめとするすべての形態の変異を包含する。欠失は遺伝子全体であってもよく、あるいは遺伝子の一部であってもよい。点突然変異はストップコドンにおいて生じてもよく、フレームシフト変異またはアミノ酸置換であってもよい。体細胞変異は、ある組織、例えば腫瘍組織にのみ生じるものであってもよく、生殖系列において遺伝しない。生殖系列の変異は、いかなる体組織においても見いだされ、遺伝する。ただ１つの対立遺伝子が体細胞変異した場合、初期の腫瘍状態が示される。しかしながら、両方の対立遺伝子が変異した場合、後期の腫瘍状態が示される。欠失されていないＭＴＳ対立遺伝子（例えば、ＭＴＳの欠失を有する染色体に対する姉妹染色体上に見られる）を、挿入、小規模な欠失および点突然変異のごとき他の変異に関してスクリーニングすることができる。腫瘍組織において見いだされる多くの変異は、ＭＴＳ遺伝子産物の発現を減少させるものであろう。しかしながら、機能的でない遺伝子産物を生じる変異も、癌の状態を誘導するであろう。遺伝子のプロモーターのごとき調節領域において点突然変異が生じる可能性があり、ｍＲＮＡ発現の欠損または減少を引き起こす。さらに点突然変異は、正しいＲＮＡのプロセッシングを廃止し、ＭＴＳ遺伝子産物の発現の減少、またはｍＲＮＡの安定性もしくは翻訳効率の低下を引き起こす。有用な診断方法は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、１本鎖コンホーメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析およびさらに以下に詳述するようなＰＣＲ−ＳＳＣＰを包含するが、これらに限定しない。本発明において同定されるメラノーマおよび他の癌のごとき癌にかかりやすい素因を、ヒトのいずれかの組織をＭＴＳ遺伝子の変異に関して試験することにより確認することができる。例えば、生殖系列のＭＴＳ変異を遺伝しているヒトは癌を発生させる傾向がある。このことを、その人の体のいかなる組織から得たＤＮＡを試験することによっても調べることができる。最も簡単には、血液を取り、血液細胞からＤＮＡを抽出する。さらに、胎児細胞、胎盤細胞または羊水をＭＴＳ遺伝子の変異に関して試験することにより、胎児期の診断を行うこともできる。例えば、点突然変異もしくは欠失による野生型ＭＴＳ対立遺伝子の変化を、本明細書で述べるいかなる手段によっても検出することができる。組織における野生型ＭＴＳ対立遺伝子の変化を検出するためには、正常組織から当該組織を単離することが役に立つ。腫瘍細胞に関する組織標品を富栄養化させるための手段は当該分野において知られている。例えば、組織をパラフィンまたはクリオスタット切片から単離してもよい。サイトメトリー（cytometry）により正常細胞から癌細胞を分離してもよい。正常細胞から腫瘍細胞を分離するためのこれらの方法ならびに他の方法は当該分野においてよく知られている。腫瘍組織への常細胞の混入が激しい場合には、変異の検出はより困難となる。ＤＮＡ配列の多形性を検出するための迅速な予備分析を、１種またはそれ以上の制限酵素でのＤＮＡ断片の一連のサザンブロットを調べることにより行うことができる。各ブロットは一連の正常個体および一連の癌、腫瘍患者、もしくは両方のものを含む。ハイブリダイズするフラグメントを示すサザンブロット（ＭＴＳ遺伝子座の近傍またはこれを含む配列をプローブとした場合、対照ＤＮＡからの長さが異なる）は変異の可能性を示す。非常に長い制限フラグメントを生じる制限酵素を用いる場合、パルスフィールドゲル電気泳動（「ＰＦＧＥ」）を用いる。当該分野においてよく知られた方法を用いてＭＴＳ対立遺伝子の分子クローニングおよび当該対立遺伝子の配列決定を行うことにより、点突然変異の検出を行うことができる。別法として、知られた方法を用いて、腫瘍組織由来のゲノムＤＮＡ標品から直接に遺伝子配列を増幅することもできる。次いで、増幅配列のＤＮＡ配列を決定することができる。感受性を有する対立遺伝子の存在の確認に関する、より完全であるが、さらに間接的な試験について６つのよく知られた方法がある：１）１本鎖コンホーメーション分析（「ＳＳＣＡ」）（オリタ（Orita）ら，１９８９年）；２）変性グラジエントゲル電気泳動（「ＤＧＧＥ」）（ワーテル（Wartell）ら，１９９０年；シェフィールド（Sheffield）ら，１９８９年）；３）ＲＮａｓｅ保護アッセイ（フィンケルステイン（Finkelstein）ら，１９９０年；キンスラー（Kinsz ler）ら，１９９１年）；４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（「ＡＳＯｓ」）（コナー（Conner）ら，１９８３年）；５）イー・コリ（E.coli）のｍｕｔＳ蛋白のごときヌクレオチドのミスマッチを認識する蛋白の使用（モドリッチ（Modrich），１９９１年）；および６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ラノ（Rano ）およびキッド（Kidd），１９８９年）。対立遺伝子特異的ＰＣＲには、その３ '末端において特定のＭＴＳ変異体にハイブリダイズするプライマーを用いる。特定のＭＴＳ変異体は存在しない場合、増幅生成物は観察されない。欧州特許出願第０３３２４３５号およびニュートン（Newton）ら，１９８９年に開示された増幅不応変異システム（Amplification Refractory Mutation System）（ＡＲＭＳ）を用いてもよい。クローニングし、配列決定し、次いで増幅を行うことにより、遺伝子の挿入および欠失を検出することもできる。さらに、該遺伝子または周囲のマーカーに対する制限フラグメント長の多形性（ＲＦＬＰ）プローブを用いて対立遺伝子の変化または多形性フラグメントにおける挿入を評価することもできる。かかる方法は、罹患した個体の親類縁者を、その個体において見いだされるＭＴＳ変異の存在に関してスクリーニングするのに有用である。当該分野において知られた挿入および欠失を検出するための他の方法を用いることもできる。はじめの３つの方法（すなわち、ＳＳＣＡ、ＤＧＧＥおよびＲＮａｓｅ保護アッセイ）において、新たな電気泳動バンドが出現する。配列の変化は１本鎖の分子内塩基対合に変化を起こすので、ＳＳＣＡは異なって移動するバンドを検出する。ＲＮａｓｅ保護は変異ポリヌクレオチドの２個またはそれ以上の小フラグメントへの開裂を必要とする。ＤＧＧＥは、変性グラジエントゲルを用いて変異配列の移動速度の野生型配列との相違を検出する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイにおいて、特異的配列を検出するオリゴヌクレオチドを設計し、ハイブリダイゼーション信号の有無を検出することによりアッセイを行う。ｍｕｔＳアッセイにおいては、変異配列および野生型配列の間のヘテロ二重鎖におけるヌクレオチドのミスマッチを有する配列のみに蛋白が結合する。本発明によれば、ミスマッチとは、２本の鎖が1００％の相補性を示さない、ハイブリダイズした核酸二重鎖である。全体としての同一性の欠如は、欠失、挿入、逆転または置換によるものであろう。ミスマッチの検出を用いて遺伝子またはそのｍＲＮＡ産物における点突然変異を検出することができる。これらの方法は配列決定よりも感度が低いが、多くの腫瘍試料について簡単に行うことができる。ミスマッチ開裂法の例はＲＮａｓｅ保護法である。本発明の実施において、該方法は、ヒトの野生型ＭＴＳ遺伝子コーディング配列に相補的な標識リボプローブ（riboprobe）の使用を必要とする。リボプローブと腫瘍組織から単離したｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかをアニーリング（ハイブイリダイズ）させ、次いで、二重鎖ＲＮＡ構造におけるいくつかのミスマッチを検出できる酵素ＲＮａｓｅＡで消化する。ミスマッチがＲＮａｓｅＡにより検出される場合、ＲＮａｓｅＡはそのミスマッチの部位を開裂する。かくして、アニーリングされたＲＮＡ標品が電気泳動ゲルのマトリックス上で分離される場合、もし、ＲＮａｓｅＡによりミスマッチが検出され開裂されたならば、リボプローブとｍＲＮＡまたはＤＮＡに関する全長の二重鎖よりも小さいＲＮＡ生成物が見られるであろう。リボプローブは全長のＭＴＳのｍＲＮＡまたは遺伝子を必要としないが、それらのいずれかの断片であってよい。リボプローブがＭＴＳのｍＲＮＡまたは遺伝子の唯一の断片からなる場合には、これらのプローブを多数用いてミスマッチに関して全ｍＲＮＡ配列をスクリーニングするのが望ましい。同様の方法で、酵素的または化学的開裂により、ＤＮＡプローブを用いてミスマッチを検出することができる。例えば、コットン（Cotton）ら，１９８８年；シェンク（Shenk）ら，１９７５年；ノバーク（Novack）ら，１９８６年参照。別法として、マッチしている二重鎖に対するミスマッチの二重鎖の電気泳動における移動度の変化によりミスマッチを検出することもできる。例えば、カリエロ（Cariello），１９８８年参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいずれかを用いて、変異を有する細胞のｍＲＮＡまたはＤＮＡを、ハイブリダイゼーション前のＰＣＲ（下記）を用いて増幅することができる。ＭＴＳのＤＮＡにおける変化は、特に、その変化が欠失および挿入のごとき大規模な配列の変化である場合には、サザンハイブリダイゼーションを用いて検出することもできる。ＰＣＲを用いることにより増幅されたＭＴＳ遺伝子のＤＮＡ配列を、対立遺伝子特異的プローブを用いてスクリーニングしてもよい。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、それぞれが既知変異を有するＭＴＳ遺伝子配列の領域を含んでいる。例えば、１のオリゴマーが、ＭＴＳ遺伝子配列の一部に対応している長さが約３０ヌクレオチドであってもよい。かかる対立遺伝子特異的プローブの組を用いることにより、ＰＣＲ増幅生成物をスクリーニングして前以て同定されているＭＴＳ遺伝子における変異の存在を確認することができる。例えば、ナイロンフィルター上で、対立遺伝子特異的プローブの増幅されたＭＴＳ配列とのハイブリダイゼーションをおこなうことができる。緊縮ハイブリダイゼーション条件下での特定のプローブに対するハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブにおけるのと同じ変異が腫瘍組織に存在することを示す。候補となる遺伝子座における変異に関する最も決定的な試験は、癌患者由来のゲノムＭＴＳ配列を対照由来の配列と比較することである。別法として、例えばＰＣＲによる増幅後にメッセンジャーＲＮＡを配列決定することができ、それにより候補遺伝子のエキソン構造の決定の必要性を除去することができる。ＭＴＳのコーディング領域の外側で生じる癌患者由来の変異体を、ＭＴＳ遺伝子付近またはＭＴＳ遺伝子内のイントロンおよび調節配列のごとき非コーディング配列を試験することにより検出することができる。非コーディング領域における変異は重要であるという初期の指摘は、対照個体と比較した場合の、癌患者における異常なサイズのメッセンジャーＲＮＡ分子またはメッセンジャーＲＮＡ分子の豊富さを明らかにするノーザンブロット分析に由来する。ＭＴＳのｍＲＮＡ発現の変化を、当該分野において知られたいかなる方法によっても検出することができる。これらの方法は、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ増幅およびＲＮａｓｅ保護を包含する。減少したｍＲＮＡ発現は野生型ＭＴＳ遺伝子の変化を示す。野生型ＭＴＳ遺伝子の変化を、野生型ＭＴＳ蛋白の変化についてのスクリーニングによっても検出することができる。例えば、ＭＴＳと免疫反応性のあるモノクローナル抗体を用いて組織をスクリーニングすることができる。同種の抗原の欠如はＭＴＳの変異を示すであろう。変異した対立遺伝子の産物に特異的な抗体を用いて変異ＭＴＳ遺伝子産物を検出することもできる。かかる免疫学的アッセイを、当該分野で知られたいかなる便利なフォーマットにおいても行うことができる。それらは、ウェスタンブロット、免疫組織学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。変化したＭＴＳ蛋白を検出するためのいかなる手段を用いても、野生型ＭＴＳ遺伝子の変化を検出することができる。蛋白別号分析のごとき機能的アッセイを用いることができる。例えば、ＭＴＳ蛋白はＣｄｋ、特にＣｄｋ４に結合することが知られている。よって、野生型ＭＴＳ蛋白またはＣｄｋ４に対する結合能についてのアッセイを用いることができる。さらに、ＭＴＳの生化学的機能（Ｃｄｋ４のごときＣｄｋに対する阻害および細胞周期の調節）を検出するアッセイを用いることもできる。変異したＭＴＳ遺伝子産物の発見は野生型ＭＴＳ遺伝子の変化を示す。血清、便、尿および痰のごとき他のヒトの身体からの試料において、変異したＭＴＳ遺伝子または遺伝子産物を検出することもできる。組織における変異したＭＴＳ遺伝子または遺伝子産物を検出するための上記と同じ方法を他の身体からの試料に適用することができる。癌細胞は腫瘍から剥離し、かかる身体からの試料中に存在する。さらに、ＭＴＳ遺伝子産物自体は細胞外空間へ分泌され、癌細胞が存在しない場合でさえもこれらの身体試料中に見いだされる。かかる身体試料をスクリーニングすることにより、多くのタイプの癌について、簡単な初期の診断を行うことができる。さらに、変異したＭＴＳ遺伝子または遺伝子産物についてかかる身体試料を試験することにより、化学療法および放射線療法の進行を簡単にモニターすることができる。本発明診断方法は、ＭＴＳが腫瘍形成において役割を果たしているいかなる腫瘍についても適用可能である。染色体アーム９ｐの欠失またはＭＴ領域内での体細胞変異は、試験されたほとんどすべての腫瘍において観察された。本発明診断方法は臨床医にとり有用であるため、臨床医は適切な治療コースを決定することができる。本発明プライマーのペアーは、ＰＣＲを用いる特定のＭＴＳ対立遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用である。１本鎖ＤＮＡプライマーのペアーを染色体９ｐ上のＭＴＳ遺伝子内もしくはその周辺の配列とアニーリングさせてＭＴＳ遺伝子自体のＤＮＡ合成の増幅を開始することができる。これらのプライマーの完全なセットによりＭＴＳ遺伝子コーディング配列のすべてのヌクレオチド、すなわちエキソンの合成が可能となる。好ましくは、プライマーのセットはイントロンおよびエキソン療法の配列の合成を可能にする。対立遺伝子特異的プライマーを用いることもできる。かかるプライマーは特定のＭＴＳ変異対立遺伝子とアニーリングし、かくして鋳型としての変異対立遺伝子の存在下の生成物のみを増幅するであろう。次いで行う増幅配列のクローニングを容易にするため、プライマーが、その５ '末端に付加された制限酵素部位の配列を有していてもよい。かくして、制限酵素部位を形成するのに必要なわずかのヌクレオチド以外は、プライマーのすべてのヌクレオチドはＭＴＳ配列またはＭＴＳに隣接する配列由来である。かかる酵素は当該分野においてよく知られている。プライマー自体を、当該分野でよく知られた方法を用いて合成することができる。一般的には、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いてプライマーを合成することができる。配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：１３、配列番号：１５および配列番号：３６に示されるＭＴＳ読み取り枠の配列が与えられれば、特定のプライマーの設計は当業者によく知られたものである。本発明により提供される核酸プローブは多くの目的に有用である。それらを、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション、およびすでに上述した点突然変異検出のためのＲＮａｓｅ保護法に用いることができる。本発明プローブを用いてＰＣＲ増幅産物を検出することができる。他の方法を用いてＭＴＳ遺伝子またはｍＲＮＡに関するミスマッチを検出するために本発明プローブを用いてもよい。定義本発明は以下の定義を用いる：「ポリヌクレオチドの増幅」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびＱ−ベータレプリカーゼ伸し用による増幅方法をいうのに用いる。これらの方法はよく知られており、当該分野において広く行われている。米国特許第４,６８３,１９５号および第４, ６８３,２０２号ならびにイニス（Innis）ら，１９９０年（ＰＣＲに関して）；ウー（Wu）ら，１９８９年ａ（ＬＣＲに関して）参照。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは市販されている。好ましくは、ＭＴＳ領域由来の配列を増幅するのに有用なプライマーは、ＭＴＳ領域またはその標的領域に隣接する領域における配列に対して相補的であり特異的にハイブリダイズするものである。増幅により得られたＭＴＳ配列を直接配列決定してもよい。別法として、しかしあまり望ましくない方法であるが、増幅された配列を配列決定前にクローン化してもよい。酵素的に増幅されたゲノム断片の直接クローニングおよび配列分析のための方法はシャーフ（Scharf），１９８６年に記載されている。「分析対象のポリヌクレオチド」および「分析対象の鎖」は、標的配列を有する可能性があり、生化学的試料をはじめとする種々のタイプの試料中に存在しうる１本鎖または２本鎖ポリヌクレオチドをいう。「抗体」さらに本発明は、ＭＴＳポリペプチドならびにそのフラグメントまたはＭＴＳ領域由来、特にＭＴＳ遺伝子座もしくはその一部由来のポリヌクレオチド配列に特異的に結合する、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体ならびにそのフラグメント、そしてその免疫学的結合等価物を提供する。「抗体」なる用語を、均一な分子本体、または多くの異なる分子本体からなる血清生成物のごとき混合物の療法をいうために用いる。ペプチド合成装置においてポリペプチドを合成的に調製し、キャリア分子（例えば、キーホルリムペット（keyhol e limpet）のヘモシアニン）とカップリングさせ、次いで、数カ月にわたりウサギに注射することができる。ＭＴＳポリペプチドまたはフラグメントに対する免疫反応性に関してウサギの血清を試験する。蛋白、ポリペプチド、融合蛋白またはそれらのフラグメントをマウスに注射することによりモノクローナル抗体を作成してもよい。モノクローナル抗体をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、ＭＴＳポリペプチドまたはそのフラグメントに対する特異的免疫反応性について試験する。ハーロウ（Harlow）およびレイン（Lane），１９８８年参照。これらの抗体はアッセイならびに医薬において有用であろう。十分量の所望ポリペプチドが得られたならば、それを種々の目的に使用することができる。典型的な使用は、特異的結合抗体の製造である。これらの抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、当該分野において知られたインビトロ法またはインビボ法により製造することができる。ポリクローナ抗体の製造には、適当な標的免疫系、典型的にはマウスまたはウサギを選択する。次いで、当該動物に適した方法および免疫学者によく知られたたのパラメーターにより決定された方法で、精製された抗原を免疫系に与える。典型的な注射部位は、足の甲、筋肉内、腹腔内、または経皮である。もちろん、マウスまたはウサギの代わりに他の種を用いてもよい。次いで、当該分野で知られた方法を用いてポリクローナル抗体を精製し、所望の特異性に適合させる。通常は、イムノアッセイを用いて免疫学的応答をアッセイする。通常は、かかるイムノアッセイは、例えば、抗原として同じ細胞、同じ方法により産生される抗原の源をいくらか精製することを必要とする。種々のイムノアッセイ法は当該分野においてよく知られている。例えば、ハーロウ（Harlow）およびレイン（La ne），１９８８年、またはゴディング（Goding），１９８６年参照。１０^-8または好ましくは１０^-9ないし１０^-10Ｍ^-1もしくはそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を、典型的には、例えば、ハーロウ（Harlow）およびレイン（Lane），１９８８年、またはゴディング（Goding），１９８６年において記載された標準的方法により作成する。簡単には、適当動物を選択し、所望の免疫感作プロトコールに従う。適当な期間の経過後、かかる動物の脾臓を切り取り、典型的には、適当な選択的条件下において個々の脾臓細胞を不死化された骨髄腫細胞と融合させる。その後、細胞をクローン的に分離し、各クローンの上清をその抗原の所望領域に特異的な適当な抗体の産生について試験する。他の適当な方法は、リンパ球の抗原性ポリペプチドへのインビトロでの曝露、あるいはまたファージもしくは同様のベクター中の抗体のライブラリーの選択を包含する。ヒューズ（Huse）ら，１９８９年参照。本発明ポリペプチドおよび抗体を修飾して用いても、修飾せずに用いてもよい。しばしば、検出可能なシグナルを有する物質を共有結合的または非共有結合的に結合させることにより、ポリペプチドおよび抗体が標識されよう。種々の標識および結合方法が知られており、学術文献および特許文献の双方に広く報告されている。適当な標識は、放射性核、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光物質、化学発光物質、磁性粒子等を包含する。かかる標識の使用を教示する特許は、米国特許第３,８１７,８３７、３,８５０,７５２、３,９３９,３５０、３,９９６,３４５、４,２７７,４３７、４,２７５,１４９および４,３６６,２４１号を包含する。さらに、組み換え免疫グロブリンを得てもよい（米国特許第４,８１６,５６７号参照）。「結合パートナー」は、高い特異性でリガンド分子を結合することのできる分子をいい、例えば、抗原と抗原特異的抗体、あるいは酵素とその阻害剤である。一般的には、特異的結合パートナーは十分な親和性で結合して分析対象コピー／相補的二重鎖（ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合）を単離条件下で固定化しなくてはならない。特異的結合パートナーは当該分野において知られており、例えば、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジン、ＩｇＧと蛋白Ａ、多くの知られた受容体−リガンドのカップル、および相補的ポリヌクレオチド鎖を包含する。相補的ポリヌクレオチド鎖の結合パートナーの場合、通常、パートナーは少なくとも約１５塩基の長さであり、少なくとも４０塩基の長さであってもよい。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成ヌクレオチドアナログからなっていてもよい。「生物学的試料」は、個体由来の分析対象であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを有する可能性のある組織もしくは体液の試料、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外側の部分、呼吸器、消化管ならびに尿生殖管、唾液、血液細胞、腫瘍、器官、組織およびインビトロ細胞培養成分の試料を包含するが、これらに限定されない。本明細書に用いる用語「診断」または「予後」は、腫瘍形成の過程において用いられ、１）腫瘍形成としての障害の分類、２）腫瘍形成の重篤さの決定、または３）治療前、治療中および治療後の疾病の進行のモニタリングを示すために用いられる。「コードする」ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを「コードする」といわれる。そのネイティブな状態にある場合、あるいは当業者によく知られた方法により操作された場合、ポリヌクレオチドは転写および／または翻訳されてｍＲＮＡを生じ、そして／またはポリペプチドもしくはそのフラグメントを生じる。アンチセンス鎖はかかる核酸と相補的であり、コーディング配列はそこから推定されうる。「単離された」または「実質的に純粋な」「単離された」または「実質的に純粋な」核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、リボゾーム、ポリメラーゼ、他の多くのヒト・ゲノム配列ならびに蛋白のごときネイティブなヒトの配列もしくは蛋白を本質的に伴う他の細胞成分から実質的に分離されたものである。この用語は、天然環境から取り出された核酸配列または蛋白を包含し、組み換えまたはクローン化されたＤＮＡ単離体および化学合成されたアナログもしくは異種生物の系により生物学的に合成されたアナログを包含する。「ＭＴＳ対立遺伝子」は、ＭＴＳ遺伝子座の正常な対立遺伝子、ならびに個体に多くの部位の癌（例えば、メラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌）を発生させる素因を与える変化した対立遺伝子をいう。かかる素因を与える対立遺伝子は、「ＭＴＳ感受性対立遺伝子」とも呼ばれる。「ＭＴＳ遺伝子座」、「ＭＴＳ遺伝子」、「ＭＴＳ核酸」または「ＭＴＳポリヌクレオチド」は、そのすべてがＭＴＳ領域にあるポリヌクレオチドあって、正常組織において発現される可能性のうポリヌクレオチドをいう。それらのうちある種の対立遺伝子は個体に多くの部位の癌（例えば、メラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌）を発生させる素因を与える。ＭＴＳ遺伝子座なる用語を、本明細書においては先行技術にいうＭＬＭ遺伝子座に代えて用い、「ＭＴＳ」の使用は、遺伝子座、遺伝子、領域等に関連して用いられる「ＭＬＭ」を包含する。ＭＴＳ遺伝子座における変異は、他のタイプの腫瘍の開始および／または進行に関連していてもよい。一部には、個体に癌発生の素因を与える変異により遺伝子座が示される。これらの変異は上記ＭＴＳ領域内のものである。ＭＴＳ遺伝子座は、コーディング領域、介在配列ならびに転写および／または翻訳をコントロールしている調節エレメントを包含する。ＭＴＳ遺伝子座は当該ＤＮＡ配列のすべての対立遺伝子変種を包含する。これらの用語は、核酸について用いられる場合、ＭＴＳポリペプチド（ｐ１６を含む）、フラグメント、同族体もしくは変種（例えば、蛋白融合または欠失によるもの）をコードしている核酸をいう。本発明核酸は、天然のＭＴＳをコードしている遺伝子由来の、あるいは実質的にそれと同様な配列、または天然のＭＴＳをコードしている遺伝子もしくはその一部と相同性を有する配列を有する。ＭＴＳポリペプチド（ＭＴＳ１）に関するコーディング配列を配列番号：１に示し、ＭＴＳポリペプチド（ＭＴＳ１）のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。第２のＭＴＳポリペプチド（ＭＴＳ１Ｅ１β）のコーディング配列を配列番号：１３に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号：１４に示す。第３のＭＴＳポリペプチド（ＭＴＳ２）のコーディング配列を配列番号：１５に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号：１６に示す。Ｐ１６なる用語は、ＭＴＳ１およびＭＴＳ１Ｅ１βの代わりに用いられ、ｐ１６をコードしているＭＴＳ１およびｐ１０をコードしているＭＴＳ１Ｅ１βの両方を主するために用いられる。ＭＴＳ１およびＭＴＳ１Ｅ１βは１つの遺伝子の２つの形態であり、転写に際して、当該２つの形態は該遺伝子の２個のプロモーターに依存している。ＭＴＳ２はＭＴＳ領域の別の部分であり、ｐ１５をコードしている。本発明ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、および混合ポリマー、センスならびにアンチセンス鎖の両方を包含し、化学的または生物学的に修飾されていてもよく、あるいは当業者に容易に認識される非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。かかる修飾は、例えば、標識、メチル化、１個またはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、電荷のない結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）、電荷のある結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）、懸垂部分（pendent moieties）（例えば、ポリペプチド等）、挿入物（例えば、アクリジン、プソラレン等）、キレーター、アルキル化剤、および修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸等）のごとき分子間修飾を包含する。さらに、水素結合および他の化学的相互作用により特定の配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も包含される。かかる分子は当該分野で知られており、例えば、分子骨格においてリン酸結合の代わりにペプチド結合が使用されている分子である。本発明は、ＭＴＳのすべてまたは一部からなる組み換え型核酸を提供する。該組み換え構築物は宿主細胞中で自律的に複製可能であってもよい。また、該組み換え構築物は宿主細胞の染色体中に組み込まれてもよい。かかる組み換え型ポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドからなり、その起源もしくは取り扱いにより、１）天然においては会合しているポリヌクレオチドのすべてまたは一部に会合していない；２）天然においては連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結している；あるいは３）天然には存在しない、のいずれかである。それゆえ、天然に存在しない配列からなる組み換え型核酸が本発明により提供される。野生型配列を用いてもよいが、しばしば、それは、例えば欠失、置換または挿入によって変化させられるであろう。種々のタイプのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、本発明核酸の天然の源としてスクリーニングしてもよく、あるいは、ゲノムＤＮＡもしくはたの天然起源に存する配列を、矢よＰＣＲにより増幅することによりかかる核酸を提供してもよい。通常は、ｃＤＮＡライブラリーの選択は、所望蛋白に関するｍＲＮＡが豊富である組織起源に対応する。通常は、ファージライブラリーが好ましいが他のタイプのライブラリーを用いてもよい。ライブラリーのクローンをプレート上に広げ、スクリーニングのための基質に移し、変性させ、次いで、所望配列の存在に関してプローブされる。本発明に用いるＤＮＡ配列は、通常は少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチド）、よち通常には少なくとも約７〜１５コドン、そして最も好ましくは少なくとも約３５コドンからなるであろう。このヌクレオチドの数は、通常は、ＭＴＳをコードしている配列に特異的にハイブリダイズする都合のよいプローブに必要な、ほぼ最小限の長さである。核酸の取り扱い法は、一般的に説明されており、例えば、サムブルック（Samb rook）ら，１９８９年またはアウスベル（Ausbel）ら，１９９２年に記載されている。制限酵素等のごとき、かかる方法に適用する試薬は当該分野において広く知られており、ニュー・エングランド・バイオラブズ（New England BioLabs）、ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、アマシャム（Amersham ）、プロメガ・バイオテク（Promega Biotec）、ユー・エス・バイオケミカルズ（U.S.Biochemica1s）、ニュー・イングランド・ニュクリアー（New England Nu clear）のごとき業者、および他の多くの販売元から市販されている。本発明融合蛋白の製造に用いる組み換え型核酸は天然由来であっても合成配列であってもよい。多くの天然遺伝子配列を、適当なプローブを用いてｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから得ることができる。ジェンバンク（GenBank）ナショナル・インステイチュート・オブ・ヘルス（National Institute of Health）参照。「ＭＴＳ領域」は、Ｐ１クローンであるＰ１−１０６２およびＰ１−１０６３において見いだされるヒト・染色体９の一部をいう。イー・コリＮＳ３５２９中のこれらのＰ１クローンは、アメリカ合衆国、メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）に、１９９４年３月１６日に寄託され、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ６９５８９および６９５９０を付与された。この領域は、ＭＴＳ１、ＭＴＳ２およびＭＴＳ１Ｅ１β遺伝子を含んでいるＭＴＳ遺伝子座を含む。本明細書の用語「ＭＴＳ遺伝子座」、「ＭＴＳ対立遺伝子」および「ＭＴＳ領域」はすべて、該遺伝子座、対立遺伝子または領域からなる２本鎖ＤＮＡ、ならびに該遺伝子座、対立遺伝子または領域からなる１本鎖ＤＮＡをいう。本明細書の用語、ＭＴＳ遺伝子座または領域もしくは対立遺伝子の「一部」は、少なくとも約８ヌクレオチド、あるいは好ましくは約１５ヌクレオチド、あるいはより好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの最小サイズを有し、少なくとも約４０ヌクレオチドの最小サイズを有していてもよいと定義される。「ＭＴＳ蛋白」または「ＭＴＳポリペプチド」は、ＭＴＳ遺伝子座によりコードされている蛋白またはポリペプチド（ＭＴＳ１ポリペプチド、ＭＴＳ２ポリペプチドおよびＭＴＳ１Ｅ１βポリペプチド）、その変種もしくはフラグメントをいう。用語「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーおよびその同等物をいい、生成物の特定の長さをいうのではない；よって、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白はポリペプチドの定義に包含される。この用語はポリペプチドの修飾体、例えば、グリコシレーション、アセチル化、ホスホリレーション等されたものをいうのではなく、あるいはそれらを排除する。例えば、１個またはそれ以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然アミノ酸等）を含むポリペプチド、置換された結合ならびに当該分野で知られた天然および非天然双方の他の修飾を有するポリペプチドは当該定義に包含される。通常は、かかるポリペプチドは、ネイティブなＭＴＳ配列に対して、少なくとも約５０％相同、好ましくは約９０％以上相同、より好ましくは少なくとも約９５％相同である。さらに、高いもしくは低い緊縮条件においてＭＴＳをコードしている核酸にハイブルダイズするＤＮＡによりコードされている蛋白、およびＭＴＳ蛋白に対する抗血清により回収される密接に関連したポリペプチドもしくは蛋白も、当該定義に包含される。相同性に関して比較されるポリペプチドの長さは、一般的には、少なくとも約１６アミノ酸、通常は少なくとも約２０残基、より通常には少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、そして好ましくは約３５残基よりも多い。「作動可能に連結された」は、そのように記載された構成要素が意図された様式でそれらの機能を発揮できるような関係にある並置をいう。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響する場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結される。「プローブ」ある種の癌の素因となるかまたは大部分の癌に関連しているＭＴＳ対立遺伝子に関連したポリヌクレオチド多形性は、緊縮ないし緩和条件でのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件において標的配列と安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。プローブが完全に標的配列と相補的であると予想される場合、緊縮条件が用いられるであろう。いくつかのミスマッチが予想される場合、例えば、プローブが完全には相補的でないという結果により変種が予想される場合には、ハイブリダイゼーションの緊縮度を低下させてもよい。非特異的／偶然の結合を除外する条件、すなわち、ノイズを最小にする条件が選択される。かかる示度は通常のＤＮＡ多形性ならびに変異を同定するので、これらの示度は、ＭＴＳ感受性対立遺伝子の検出を示すためのさらなる分析を必要とする。ＭＴＳ対立遺伝子に対するプローブは、ＭＴＳ領域またはそのｃＤＮＡの配列由来であってもよい。プローブはいかなる適当な長さであってもよく、ＭＴＳ領域のすべてまたは一部にわたるものであり、ＭＴＳ領域と特異的にハイブイダイゼーションする。標的配列がプローブと同じ配列を含む場合、緊縮条件下においてさえもハイブリッドは比較的安定であるため、プローブは短くてもよく、例えば、約８〜３０塩基対の範囲でよい。ある程度のミスマッチがプローブについて予想される場合、すなわち、プローブが変種領域にハイブリダイズしそうな場合には、必要な特異性で標的配列にハイブリダイズする長いプローブを用いてもよい。プローブは、標識またはレポーター分子に結合した単離ポリヌクレオチドを包含するであろうし、さらに標準的方法により、配列が同様である他のポリヌクレオチド配列を単離するのに用いられてもよい。プローブを調製し、標識する方法は、例えば、サムブルック（Sambrook）ら，１９８９年またはアウスベル（Ausb el）ら，１９９２年参照。相同的ポリヌクレオチドにより、他の同様のポリヌクレオチドを選択することができる。別法として、遺伝暗号の縮重を用いることにより、これらのまたは同様のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを合成または選択することができる。沈黙の変化（silent changes）により種々のコドン置換を導入してもよく、あるいは特定の系のために発現を最適化してもよい。ポリペプチドの特性、おそらく、リガンド結合親和性、鎖間の親和性、またはポリペプチドの分解もしくはターンオーバー速度を変化させるために変異を導入してもよい。本発明合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドからなるプローブは、天然または組み換え型の１本鎖もしくは２本鎖ポリヌクレオチド由来であってもよく、または化学合成されたものであってもよい。さらに、ニックトランスレーション、クレノウフィル−イン反応（Klenow fill-in reaction）、または当配分野で知られた他の方法によりプローブを標識してもよい。少なくとも約８ヌクレオチド、通常には少なくとも約１５ヌクレオチド、そして約６Ｋｂより少ない、通常は約１.０Ｋｂより少ないポリヌクレオチド配列の一部がプローブとして好ましい。プローブを用いてＭＴＳをコードしているｍＲＮＡが細胞または組織に存在するかどうかを調べてもよい。「蛋白の修飾またはフラグメント」は、実質的に１次構造配列と相同的であるが、例えば、インビボまたはインビトロでの化学的および生化学的修飾を有するかまたは通常見られないアミノ酸を含んでいるＭＴＳポリペプチドまたはそのフラグメントについて、本発明により用いられる。かかる修飾は、例えば、アセチル化、カルボキシル化、ホスホリレーション、グリコシレーション、ユビキチネーション、放射性核ならびに種々の酵素修飾による標識のごとき、当業者により容易に認識されるような修飾を包含する。ポリペプチドの標識のための種々の方法、またはかかる目的に使用される標識は当該分野でよく知られており、³²Ｐ、標識された抗リガンドに結合するリガンド（例えば、抗体）、発蛍光団、化学発光剤、酵素、および標識リガンドに対する特異的結合ペアーのメンバーとして役立ちうる抗リガンドが包含される。標識の選択は、必要な感度、プライマーとの結合容易性、必要な安定性、および使用可能な器具に依存する。ポリペプチドを標識する方法は当該分野で知られている。例えば、サムブルック（Sambrook）ら，１９８９年またはアウスベル（Ausbel）ら，１９９２年参照。実質的に全長のポリペプチド以外に、本発明は、生物学的に活性のある当該ポリペプチドのフラグメントを提供する。重要な生物学的活性は、ＭＴＳポリペプチドに特徴的なリガンド結合、免疫学的活性および他の生物学的活性を包含する。免疫学的活性は、標的免疫系における免疫原機能ならびに競争物質またはＭＴＳ蛋白のエピトープの代用抗原として役立つ結合用免疫学的エピトープを共有することの双方を包含する。本明細書に用いる「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定因子をいう。エピトープは、当該エピトープに特有の空間的配置にある３個のアミノ酸からなっていてもよい。一般的には、エピトープは、少なくとも５個、より通常には少なくとも約８〜１０個のかかるアミノ酸からなる。かかるアミノ酸の空間的配置は当該分野で知られている。免疫学的目的のために、タンデム−リピート（tandem-repeat）ポリペプチド断片を免疫原として用いてもよく、そのことにより非常に抗原的な蛋白が生産される。また、かかるポリペプチドは、特異的結合に関して非常に効果的な競争物質として役立つであろう。ＭＴＳポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的な抗体の製造を後述する。さらに本発明は、ＭＴＳポリペプチドおよびフラグメントはらなる融合ポリペプチドを提供する。２種またはそれ以上のＭＴＳポリペプチド配列間で、またはＭＴＳと関連蛋白との間で同種のポリペプチドを融合させることができる。同様に、誘導体蛋白の混合した特性または活性を示す異種の融合物を構築してもよい。例えば、リガンド結合または他のドメインを、異なる新たな融合ポリペプチドまたはフラグメントとの間で「交換」してもよい。かかる同種または異種の融合ポリペプチドは、例えば、変化した結合強度または特異性を示す可能性がある。融合パートナーは、免疫グロブリン、細菌のβ−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、蛋白Ａ、β−ラクタマーゼ、アルファアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび酵母・アルファ接合因子を包含する。例えば、ゴドウスキ（Godowski）ら，１９８８年参照。典型的には、下記組み換え核酸法により融合蛋白を製造してもよく、あるいは化学合成してもよい。ポリペプチド合成法は、例えば、メリフィールド（Merrif ield），１９６３年において記載されている。「蛋白の精製」は、ＭＴＳをコードしている組み換え型核酸で形質転換された細胞由来のごとき、他の生物学的物質からＭＴＳポリペプチドを単離する種々の方法をいい、それらは当該分野においてよく知られている。例えば、かかるポリペプチドを、例えば本発明により提供される抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製してもよい。蛋白精製のための種々の方法が当該分野で知られており、ドイチャー（Deutscher），１９９０年およびスコウプス（S copes），１９９２年において記載された方法を包含する。「単離された」、「実質的に純粋な」および「実質的に均一な」なる用語は、天然の状態において付随している成分から分離された蛋白またはポリペプチドをいうために適宜用いられる。少なくとも試料の約６０ないし７５％が単一のポリペプチド配列を示す場合、単量体蛋白は実質的に純粋である。典型的には、実質的に純粋な蛋白は、約６０ないし９０％Ｗ／Ｗの蛋白試料からなり、より通常には約９５％、そして好ましくは約９９％以上の純度である。蛋白の純度または均一性を当該分野で知られた多くの手段、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行って、次いでゲルを染色することにより単一のポリペプチドのバンドを可視化することにより示すことができる。ある目的には、ＨＰＬＣまたは当該分野で知られた精製に用いる他の手段を用いることにより、より高度な分離を行ってもよい。ＭＴＳ蛋白は、天然において付随している汚染物質から分離された場合、実質的に天然において付随している成分を含まない。よって、化学合成または天然における起源とは異なる細胞系において合成されたポリペプチドは、実質的には、天然において付随している成分を含まないであろう。さらに、当該分野において知られた蛋白精製法を用いる単離により、蛋白から天然において付随している成分を除去してもよい。たとえ同種の細胞タイプにおいて発現されたとしても、単離または操作された遺伝配列の発現産物して生産されたポリペプチドを、本明細書においては「単離ポリペプチド」という。異種細胞により合成的に作られた形態または分子は、本質的に単離分子である。「組み換え型核酸」は、天然には存在しないかまたは配列の２個の別個の断片の人工的組み合わせにより調製される核酸である。この人工的な組み合わせは、しばしば、化学合成法もしくは核酸の単離断片の人工的操作、例えば遺伝子工学的手法により行われる。通常は、かかる人工的操作は、コドンを、同じかまたは保存的アミノ酸をコードしている縮重コドンに置き換えるものであるが、典型的には、配列認識部位の導入または除去である。また、かかる人工的操作を行って、所望機能の核酸断片を結合させて所望の機能の組み合わせを発揮させるようにする。「調節配列」は、通常は、遺伝子の発現に影響する遺伝子座のコーディング領域の１０Ｋｂ以内の配列をいう（遺伝子の転写、およびｍＲＮＡの翻訳、スプライシング、安定性等を含む）。「実質的に相同または同様」他の核酸（またはその相補鎖）とともに適当に並べた場合に（適当なヌクレオチドの挿入または欠失を有するが）、ヌクレオチド配列の同一性が少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常は約７０％、よち通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも９５〜９８％においてあるならば、核酸またはそのフラグメントは互いに「実質的に相同」である（または「実質的に同様」である）。また、核酸またはそのフラグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、別の核酸（またはその相補鎖）にハイブリダイズする場合、鎖またはその相補鎖に対して実質的な相同性または（同様であること）が存在する。特異性が全く欠如している場合よりも実質的に選択的なハイブリダイゼーションが起こる場合、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。典型的には、少なくとも約１４個のヌクレオチドにおいてその約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％が相同的である場合に、選択的ハイブリダイゼーションが起こるであろう。カネヒサ（ Kanehisa），１９８４年参照。説明したように、相同性の比較を行う長さは、長い鎖であってよく、ある具体例においては、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０個のヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４個のヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約３６個のヌクレオチドである。核酸のハイブリダイゼーションは、相補鎖の塩基組成、長さ、およびハイブリダイズする核酸との間のミスマッチヌクレオチド塩基数のほかに、塩濃度、温度、または有機溶媒のごとき条件（それらは当業者により容易に認識される）により影響を受けるであろう。一般的に、緊縮温度条件は、３０℃以上、典型的には３７℃以上、好ましくは４５℃以上の温度を包含する。通常は、緊縮塩条件は、１０００ｍＭ以下、典型的には５００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下である。しかしながら、パラメーターの組み合わせは、いかなる単一のパラメーターの測定よりも重要である。例えば、ウェトムーア（Wetmur）およびデイビドソン（Davidson），１９６８年参照。プローブの配列も、ある条件下においては二重鎖ＤＮＡに特異的にハイブルダイズして三重鎖または高次ＤＮＡ複合体を形成しうる。かかるプローブの調製および適当なハイブリダイゼーション条件は当該分野において知られている。「実質的な相同性」または「実質的な同一性」なる用語は、ポリペプチドについていう場合には、対象とするポリペプチドまたは蛋白が、天然の蛋白全体またはその一部に対して少なくとも約３０％、通常は少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有することを示す。「実質的に同様の機能」は、野生型ＭＴＳ核酸または野生型ＭＴＳポリペプチドに関する、修飾された核酸または修飾された蛋白の機能をいう。修飾されたポリペプチドは実質的に野生型のＭＴＳポリペプチドに対して相同的であり、実質的に同じ機能、すなわち、Ｃｄｋ、特にＣｄｋ４の阻害機能を有するであろう。修飾されたポリペプチドは変化したアミノ酸配列を有していてもよく、さらに／または修飾されたアミノ酸を含んでいてもよい。Ｃｄｋを阻害する機能のほかに、修飾されたポリペプチドは、長い半減期のごとき他の有用な特性を有していてもよい。修飾されたポリペプチドのＣｄｋ阻害活性は、実質的に野生型ＭＴＳポリペプチドの活性と同じであってもよい。また、修飾されたポリペプチドのＣｄｋ阻害活性は野生型ＭＴＳポリペプチドの活性よりも高くてもよい。修飾されたポリペプチドは慣用的方法を用いて合成され、あるいは修飾された核酸によりコードされており、慣用的方法を用いて製造される。修飾された核酸は慣用的な方法により製造される。野生型ＭＴＳ遺伝子機能と実質的に同じ機能を有する核酸は、上記修飾された蛋白を生じる。典型的には、ポリペプチドに関する相同性は、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、ザ・シークエンス・アナリシス・ソフトウェア・パッケージ・オブ・ザ・ジェネティクス・コンピューター・グループ，ユニバーシティー・オブ・ウィスコンシン・バイオテクノロジー・センター，９１０ユニバーシティー・アベニュー・マディソン・ウィスコンシン５３７０５（the sequence A nalysis Software Package of the Genetics Computer Group，University of W isconsin Biotechno1ogy Center，910 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705）参照。蛋白分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の修飾に割り当てられた相同性の測定値を用いて同様の配列をマッチさせる。典型的には、保存的置換は以下のグループ内での置換を包含する：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。ポリペプチドの「フラグメント」、「一部」または「断片」は、少なくとも約５ないし７個、しばしば少なくとも約７ないし９個のアミノ酸、典型的には少なくとも約９ないし１３個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０ないし３０個またはそれ以上の連続したアミノ酸残基の並びである。本発明ポリペプチドは、可溶性である場合、固相支持体、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、カラム充填剤（例えばセファロースビーズ）、磁性ビーズ、グラスウール、プラスチック、金属ポリマーゲル、細胞、または他の物質にカップリングさせてもよい。かかる支持体は、例えば、ビーズ、ウェル、計量棒または膜の形態であってもよい。「標的領域」は、増幅および／または検出される核酸の領域をいう。用語「標的配列」は、所望条件下において、プローブまたはプライマーが安定なハイブリッドを形成する配列をいう。本発明の実施には、特記しないかぎり、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、遺伝学、および免疫学の慣用的方法を用いる。例えば、マニアティス（Maniatis），１９８２年；サムブルック（Sambrook）ら，１９８１年；アウスベル（Ausbel）ら，１９９２年；グロバー（Glover），１９８５年；アナンド（ Anand），１９９２年；グスリー（Guthrie）およびフィンク（Fink），１９９１年参照。ヒト・染色体９ｐのマッピングをはじめとするヒト・遺伝子のマッピングに関する方法および材料の議論は、例えば、ホワイト（White）およびラロウエル（Lalouel），１９８８年にある。組換えまたは化学合成核酸の調製；ベクター、形質転換、宿主細胞本発明の多量のポリヌクレオチドは、適当な宿主細胞中で複製させることによって製造することができる。所望の断片をコードする天然または合成のポリヌクレオチド断片は、原核生物または真核生物細胞に導入できかつその中で複製できる、通常はＤＮＡ構築物である組換えポリヌクレオチド構築物中に導入されよう。通常は、ポリヌクレオチド構築物は、酵母または細菌のごとき単細胞生物宿主中での複製に適しているであろうが、（ゲノム内へ組み込まれるか組み込まれないかの）培養哺乳動物もしくは植物または他の真核生物の細胞系への導入も目的とし得る。本発明の方法により作製した核酸の精製は、例えば、サムブルック（ Sambrook）ら，１９８９年またはアウスベル（Ausubel）ら，１９９２年に記載されている。また、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ビューケッジ（Beaucage）およびカルサーズ（Carruthers）、１９８１年により記載されているホスホルアミダイト法またはマテューチ（Matteucci）ら、１９８１年によるトリエステル法によるような化学合成によっても作製でき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。原核生物または真核生物宿主へ導入するために調製したポリヌクレオチド構築物は、所望のポリペプチドをコードする目的のポリヌクレオチド断片を含む、宿主により認識される複製系よりなっていてもよく、好ましくは、該ポリペプチドコードセグメントに作動可能に連結された転写および翻訳開始調節配列も含むであろう。発現ベクターには、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、ターミネーター配列およびｍＲＮＡ安定化配列のごとき、複製開始点または自律複製配列（ＡＲＳ）および発現制御配列、プロモーター、エンハンサー、ならびに必要なプロセシング配列が含まれていてもよい。分泌シグナルには、適当には、蛋白質を、細胞膜を通過および/または停留させることができ、かくしてその機能的局所解剖学が達成できる天然のＭＴＳ蛋白質もしくは他の受容体または同種もしくは関連種の分泌ポリペプチドのいずれか由来のもの、あるいは細胞から分泌されるものが包含されうる。かかるベクターは、当該分野でよく知られていて、例えば、サムブルック（Sambrook）ら，１９８９年またはアウスベル（Ausubel）ら，１９９２年に論じられている標準的な組換え技術の手段によって調製できる。適当なプロモーターおよび他の必要なベクター配列の選択は、宿主で機能するように選択され、適当には、ＭＴＳ遺伝子と本来的に関連するものを含んでいてもよい。細胞系および発現ベクターの作動可能な組合せの例は、サムブルック（ Sambrook）ら、１９８９年またはアウスベル（Ausubel）ら、１９９２年に記載されている；また、例えば、メッツガー（Metzger）ら、１９８８年も参照せよ。多くの有用なベクターが当該分野で知られており、ストラタジーン（Stratage ne）社、ニュー・イングランド・バイオラボス（New England Biolabs）社、プロメガ・バイオテック（Promega Biotech）社および他社のごとき販売業者から得ることができる。ｔｒｐ、ｌａｃおよびファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび糖分解酵素プロモーターのごときプロモーターは、原核生物宿主に用いることができる。有用な酵母プロモーターには、メタロチオネイン、３-ホスホグリセレート・キナーゼまたはエノラーゼもしくはグリセルアルデヒド-３-ホスフェートデヒドロゲナーゼのごとき他の糖分解酵素、マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域ならびに他のもののプロモーター領域が含まれる。酵母発現に用いるのに適応なベクターおよびプロモーターは、さらにヒッツェマン（Hitzeman）ら，ＥＰ７３,６７５Ａにも記載されている。適当な非-天然哺乳動物プロモーターには、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター（フィアーズ（Fiers）ら，１９７８年）、またはマウスモロニ−白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、ニワトリ肉腫ウイルス、アデノウイルスII、ウシ乳頭腫ウイルスまたはポリオーマウイルス由来のプロモーターが含まれていてもよい。さらに、複数コピーの遺伝子が生成され得るように（例えば、ＤＨＦＲのような）増幅性遺伝子に該構築物を連結させてもよい。適当なエンハンサーおよび他の発現制御配列については、例えば、「エンハンサーおよび真核生物遺伝子の発現（Enhancers and Eukaryotic Gene Expression）」、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Habor，New York）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）社（１９８３年）も参照。かかる発現ベクターは、自律的に複製させることもできるが、当該分野でよく知られている方法によって、宿主細胞のゲノムに挿入することによってそれらを複製させることもできる。発現およびクローニング用のベクターには、当該ベクターで形質転換した宿主細胞の生存または増殖に必要な蛋白質をコードする遺伝子である選択マーカーが含まれるのが適当であろう。この遺伝子が存在することにより、挿入物を発現する宿主細胞のみの増殖が保証される。典型的な選択遺伝子は、ａ）例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート他のような抗生物質またはその他の毒性物質に対する耐性を付与する；ｂ）栄養要求欠損を相補する、またはｃ）例えば、バチルス（Bacillus）属についてＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から利用できない重要な栄養物を供給する蛋白質をコードしている。適当な選択マーカーの選択は、宿主細胞に依存し、異なった宿主に対する適当なマーカーは当該分野でよく知られている。目的の核酸を含有するベクターは、イン・ビトロ（invitro）で転写して、得られたＲＮＡを、例えば、注射（ティー・クボ（T.Kubo）ら、１９８８年参照）のようなよく知られている方法によって宿主細胞に導入できる。あるいは、該ベクターは、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ-デキストランまたは他の物質を用いたトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル衝突（microprojectile bombardment）；リポフェクション；（レトロウイルスゲノムのごとき、ベクターが感染因子である）感染；および他の方法を含む、細胞性宿主のタイプによって変動する当該分野でよく知られた方法によって宿主細胞に直接導入できる（一般的には、サムブルック（Sambrook）ら，１９８９年およびアウスベル（Ausubel）ら，１９９２年参照）。とりわけ、前記のものを含む当該分野で知られているいずれかの方法によるポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、「形質転換」として本明細書中では示す。その中に前記の核酸を導入した細胞は、かかる細胞の子孫をも含むことを意味する。大量の本発明の核酸およびポリペプチドは、適合する原核生物または真核生物宿主の細胞において、ベクターまたは他の発現ビヒクル中でＭＴＳ核酸またはその一部分を発現させることによって調製できる。最も一般に用いる原核生物宿主は、バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）またはシュードモーナス（Pse udomonas）を用いてもよいが、エスシェリヒア・コリ（Escherichia coli）の株である。酵母、糸状菌、植物、昆虫、または両生類もしくは鳥類のごとき、哺乳動物または他の真核生物ぼ宿主細胞も、本発明の蛋白質の産生に有用となり得る。培養における哺乳動物細胞の増殖性は、本質的によく知られている（ジャコビー（Ja koby）およびパスタン（Pastan）（編）１９７９年参照）。一般的に用いられる哺乳動物宿主細胞系の例は、例えば、高発現性、所望のグリコシレーションパターンまたは他の特徴を提供するのに適当となり得る他の細胞系も熟練実施者によって称賛されるであろうが、ＶＥＲＯおよびHeLa細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＷＩ３８、ＢＨＫならびにＣＯＳ細胞系である。クローンは、ベクター構築の様式に依存するマーカーを用いることによって選抜する。マーカーは、同一または異なったＤＮＡ分子上にあってもよいが、同一のＤＮＡ分子にあるのが好ましい。原核生物宿主においては、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する耐性によって、形質転換体を選抜することができる。温度感受性に基づく特定の生成物の産生を、適当なマーカーとして供することもできる。本発明のポリヌクレオチドで形質転換した真核生物または原核生物の細胞は、本発明の核酸およびポリペプチドの産生のみならず、例えば、ＭＴＳポリペプチドの特徴を研究するのにも有用であろう。アンチセンス・ポリヌクレオチド配列は、ＭＴＳ遺伝子座の発現を妨害または低下させるのに有用であり、当業者により理解されるであろう。例えば、ＭＴＳ遺伝子座またはＭＴＳ領域からの他の配列（特に、ＭＴＳ遺伝子座側面のもの）の全部または一部分を含むポリヌクレオチドベクターを、アンチセンス向きでプロモーターの制御下に配置し、細胞に導入してもよい。かかるアンチセンス構築物の細胞内での発現によって、ＭＴＳの転写および/または翻訳および/または複製が妨害されるであろう。サイクリン（cycline）およびCdkは、真核生物における遍在性の細胞周期制御因子である。かかる蛋白質は、最初に酵母において発見され、海洋性無脊椎動物、両生類、ならびにネズミ、ウサギおよびヒトを含む哺乳動物においても発見されている。１の種の遺伝子配列に基づくプローブおよび/またはプライマーを用いることにより、他の種において相同性の細胞周期制御配列遺伝子を同定する。かくして、本明細書に開示するＭＴＳ遺伝子配列に基づくプローブおよびプライマーを用いて、他の種において相同性のＭＴＳ遺伝子配列および蛋白質を同定する。これらのＴＭＳ遺伝子配列および蛋白質は、それらが単離された種についての本明細書に記載した診断/予後、治療および薬剤スクリーニング方法に用いられる。使用方法；核酸診断および診断キット患者を癌にし易くするＭＴＳ対立遺伝子の存在を検出するためには、血液のごとき生物学的試料を調製し、ＭＴＳの感受性対立遺伝子が存在するか否かにつき分析する。新生物、悪性の前駆障害に向かう進行、または予後指標としての存在を検出するためには、障害の生物学的試料を調製し、ＭＴＳの新生物対立遺伝子が存在するか否かにつき分析する。これらの試験の結果および解釈的情報は、試験した患者に対するコミュニケーション用にヘルスケア提供者に戻される。かかる診断は、診断を行う研究室によって行うことができ、または別法として、診断キットを製造し、ヘルスケア提供者または自己診断用に個人の患者に販売することもできる。まず、該スクリーニング法には、例えば、ＰＣＲによるごとき、関連のＭＴＳ配列の増幅に続くＤＮＡ配列分析が含まれる。本発明のもう１つの好ましい具体例において、該スクリーニング法には、ＰＣＲによらない方法が含まれる。かかるスクリーニング法には、当該分野でよく知られている２段階標識増幅方法学が含まれる。ＰＣＲおよびＰＣＲによらないスクリーニング方法は双方とも、高レベルの感度で標的配列を検出することができる。現在用いられる最もポピュラーな方法は、標的増幅である。本発明においては、標的核酸配列をポリメラーゼで増幅する。ポリメラーゼにより行われる増幅を用いる１つの特に好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。本発明の範囲内で目的とする好ましいＰＣＲによる方法を実施例１に提供する。ポリメラーゼ連鎖反応および他のポリメラーゼにより行われる増幅アッセイにより、ポリメラーゼにより行われる増幅サイクルの使用を通して、コピー数において百万倍以上の増加が達成できる。一旦増幅されれば、得られた核酸は、配列決定するか、またはＤＮＡプローブ用物質として使用できる。該プローブを（例えば、癌感受性のスクリーニングのように）標的配列の存在を検出するのに用いる場合、血液または血清のごとき分析すべき生物学的試料を処理して、所望により、核酸を抽出してもよい。試料核酸は、標的配列の検出を容易にする種々の方法；例えば、変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製してもよい。分析核酸の標的化領域は、通常、少なくとも部分的には一本鎖であって、プローブの標的配列とハイブリッドを形成しなければならない。配列が元来一本鎖である場合には、変性させる必要はないであろう。しかしながら、配列が二本鎖である場合には、配列を恐らくは変性させる必要があるであろう。変性は、当該分野で知られている種々の方法によって行うことができる。分析核酸およびプローブは、プローブ中の標的配列が分析物中の予想標的化配列と安定なハイブリッドを形成するのを促進する条件下でインキュベートする。分析物に結合させるのに用いるプローブの領域は、ヒト染色体９ｐの標的化領域に対して完全に相補的に作製することができる。したがって、間違ったものを予防するためには高度な緊縮条件が望ましい。しかしながら、プローブがゲノムに独特な染色体の領域に相補的である場合にのみ、高度な緊縮条件を用いる。ハイブリダイゼーションの緊縮度は、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さおよびホルムアミドの濃度を含む、ハイブリダイゼーションの間および洗浄工程の間の多くの要因によって決定する。これらの要因は、例えば、マニアティス（ Maniatis）ら、１９８２年およびサムブルック（Sambrook）ら、１９８９年に概説されている。特定の条件下では、三重らせん、四重らせん他のごときさらに高いオーダーのハイブリッドの形成が、標的配列を検出する手段を提供するのに望ましい。得られたハイブリッドを検出する場合には、通常は標識したプローブを用いることにより達成される。別法として、該プローブは非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。適当な標識、ならびにプローブおよびリガンドを標識する方法は、当該分野で知られており、例えば、（例えば、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたはキナーゼ処理のような）既知の方法によって取り込ませることができる放射性標識物、ビオチン、蛍光性基、（例えば、ジオキセタン、特には励起ジオキサタンのような）化学発光基、酵素、抗体等が含まれる。この基本スキームの変形は当該分野で知られており、外来物質から検出すべきハイブリッドの分離を容易にし、かつ/または該標識部位からのシグナルを増幅させる変形が含まれる。多くのこれらの変形が、例えば、マシューズ（Matthews）およびクリッカ（Kricka）、１９８８年；ランデグレン（Landegren）ら、１９８８年；ミットリン（Mittlin）、１９８９年；米国特許第４,８６８,１０５号およびＥＰＯ公開第２２５,８０７号に概説されている。前に注記したごとく、本発明においては、非-ＰＣＲベースのスクリーニングアッセイも目的としている。例示的な非-ＰＣＲベースの方法を実施例１５に提供する。この方法は、核酸プローブ（または正常なホスホジエステルをメチルホスホネート骨格に置き換えたごときアナログ）を低レベルのＤＮＡ標的にハイブリダイズさせる。このプローブは、共有結合がハイブリダイゼーションの特異性を妨害しないように、当該プローブに共有結合する酵素を有していてもよい。次いで、この酵素-プローブ-抱合標的核酸複合体は、遊離プローブ酵素抱合体から単離され、次いで、酵素検出用に基質が添加される。酵素活性は、感度で１０³ 〜１０⁶倍増加する発色またはルミネセント出力の変化として観察する。オリゴデオキシヌクレオチド-アルカリ性ホスファターゼ・コンジュゲートの調製およびハイブリダイゼーション・プローブとしてのそれらの使用に関連する例については、ジャブロンスキー（Jablonski）ら、１９８６年を参照せよ。二段階標識増幅方法は、当該分野で知られている。これらのアッセイは、（ジゴキシゲニン、ビオチン等のごとき）小さなリガンドが、ＭＴＳに特異的に結合できる核酸プローブに結合するという原理に成り立っている。ＭＴＳ１に対する例示的なプローブは、配列番号：４のヌクレオチド位置４４８〜４９８に相当する核酸プローブである。対立遺伝子特異的プローブもこの例の範囲内で目的としており、例示的な対立遺伝子特異的プローブには、表３に要約した素因性突然変異および表５に要約した腫瘍中の体細胞突然変異を包含するプローブが含まれる。１つの例において、核酸プローブに結合する小さなリガンドは、抗体-酵素抱合体によって特異的に認識される。この例の１つの具体例において、ジゴキシゲニンを核酸プローブに結合させる。ハイブリダーゼーションは、（化学ルミネセント基質となる）抗体-アルカリ性ホスファターゼ抱合体によって検出する。この具体例による核酸プローブを標識する方法については、マーチン（Martin）ら、１９９０年を参照せよ。第二の例において、小さなリガンドは、一次リガンドに対して特異的に複合体を形成することができる二次リガンド-酵素抱合体によって認識される。この例のよく知られている具体例は、ビオチン-アビジン型の相互作用である。核酸プローブを標識するための方法およびビオチン-アビジンベースのアッセイにおけるそれらの使用については、リグビー（Rigby）ら、１９７７年およびヌグーエン（Nguyen）ら（１９９２年）を参照せよ。本発明の核酸プローブアッセイがＭＴＳ遺伝子を検出することができる核酸プローブの混合物を用いることも本発明の範囲内で目的としている。かくして、細胞試料中のＭＴＳ１の存在を検出する１つの例において、ＭＴＳ１に相補的な１種より多いプローブを用い、あるいはまた、特に、異なるプローブの数は２、３または５の異なった核酸プローブ配列である。もう１つの例において、患者のＭＴＳ１遺伝子配列中の突然変異の存在を検出するために、ＭＴＳ１に相補的な１種をこえるプローブを用い、ここに混合物には、ＭＴＳ１に変化を有する患者の集合で同定された対立遺伝子特異的突然変異に結合できるプローブが含まれている。この具体例において、いかなる数のプローブも用いることができ、好ましくは、個体に乳癌の素因を与えるものとして同定された主な遺伝子突然変異に対応するプローブが含まれるであろう。本発明の範囲内で目的する幾つかの候補プローブには、表３および５で同定した対立遺伝子-特異的突然変異を含むプローブが包含される。使用方法；ペプチド診断および診断キット新生物状態の障害を、野生-型ＭＴＳポリペプチドの変化に基づいて検出することもできる。かかる変化は、慣用技術による配列分析によって決定できる。さらに好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を用いて、ＭＴＳペプチド中の相違、またはＭＴＳペプチドがないことを検出する。本発明の好ましい具体例において、抗体は、溶液からＭＴＳ蛋白質を免疫沈降し、かつポリアクリルアミドゲルのウエスタン（Western）ブロットまたはイムノブロット上でＭＴＳ蛋白質と反応するであろう。もう１つの好ましい具体例において、抗体は、免疫組織化学的技術を用いて、パラフィンまたは凍結組織切片中のＭＴＳ蛋白質を検出するであろう。抗体を生成する技術および精製する技術は当該分野でよく知られており、本発明の調製を達成するためにはいずれのかかる技術を選択してもよい。ＭＴＳまたはその突然変異体を検出する方法に関連する好ましい具体例には、モノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）が含まれる。典型的なサンドイッチ法は、米国特許第４,３７６,１１０号および４, ４８６,５３０号（参照により本明細書に取り入れる）にデビッド（David）らにより記載されており、実施例１８に例示されている。使用方法：薬剤スクリーニング本発明は、Ｃｄｋポリペプチドまたはその結合断片を種々の薬剤のいずれかをスクリーニングする技術に用いることによって、化合物をスクリーニングするのに特に有用である。好ましくは、Ｃｄｋ４を利用する。かかる試験に用いるＣｄｋポリペプチドまたはその断片は、固体支持体に付着するか、または細胞表面に運ばれている溶液中の遊離物であってもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはその断片を発現する組換えポリヌクレオチドで安定して形質転換した原核生物または真核生物の宿主細胞を、好ましくは競争的結合アッセイにおいて利用する。独立または固定した形態のかかる細胞を、標準結合アッセイに用いることができる。例えば、Ｃｄｋポリペプチドまたはその断片と試験する剤との間のコンプレックスの形成を測定し、Ｃｄｋポリペプチドまたはその断片とＭＴＳポリペプチドまたその断片との間の複合体の形成が、試験する剤によって妨害される程度を検定することができる。かくして、本発明は、当該分野でよく知られている方法によって、かかる因子とＣｄｋポリペプチドまたはその断片とを接触させ、次いで、１）該因子とＣｄｋポリペプチドまたはその断片との間のコンプレックスの存在、または２）Ｃｄｋポリペプチドまたはその断片とリガンドとの間のコンプレックスの存在につきアッセイすることを特徴とする薬剤のスクリーニング方法を提供する。さらに、Ｃｄｋ活性を測定して因子がＣｄｋを阻害でき、かくして細胞周期を調節できるかをどうか判断する。かかる競争的結合アッセイにおいて、典型的には、Ｃｄｋポリペプチドまたはその断片を標識する。遊離Ｃｄｋポリペプチドまたはその断片を、蛋白質：蛋白質複合体で存在するものから分離し、遊離（すなわち、コンプレックスを形成しなかった）標識の量は、各々、試験される因子のＣｄｋに対する結合またはＣｄｋ：ＭＴＳポリペプチド結合の妨害の尺度となる。ＭＴＳポリペプチドの小さなペプチド（ペプチド模擬体）をこのように分析して、Ｃｄｋ阻害活性を有するものを同定する。薬剤スクリーニングのもう１つの方法は、Ｃｄｋポリペプチドに対して適当な結合親和性を有する化合物についての高処理量スクリーニングを提供し、ゲイセン（Geysen）の１９８４年９月１３日に公開された欧州特許出願番号８４/０３６６４に詳細に記載されている。簡単に言えば、多数の異なった小さなペプチド試験化合物を、プラスティックのピンまたは他のものの表面のごとき固体支持体上で合成する。ペプチド試験化合物をＣｄｋポリペプチドと反応させ、洗浄する。次いで、当該分野でよく知られている方法によって、結合Ｃｄｋポリペプチドを検出する。精製Ｃｄｋは、直接、前記の薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上に被覆することができる。しかしながら、ポリペプチドに対する非-中和抗体を用いて抗体を捕捉し、Ｃｄｋポリペプチドを固相上に固定することができる。本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用も目的とし、ここにおいて、Ｃｄｋポリペプチドまたはその断片に対する結合性につき、Ｃｄｋポリペプチドに特異的に結合できる中和抗体と試験化合物とを競争させる。このようにして、抗体を用いて、Ｃｄｋポリペプチドの１またはそれを超える抗原決定部位を有するいずれのペプチドの存在も検出することができる。薬剤スクリーニングに関するさらなる技術には、非機能性ＭＴＳ遺伝子を有する（前記したごとき）宿主真核生物細胞系または細胞の使用が含まれる。これらの宿主系または細胞は、Ｃｄｋレベルでの細胞周期制御が不完全である。宿主細胞系または細胞は、薬剤化合物の存在下で増殖させる。宿主細胞の増殖速度を測定して、該化合物が細胞周期を調節できるかを判断する。増殖速度を測定する１つの手段は、Ｃｄｋ、好ましくはＣｄｋ４の生物学的活性を測定することによる。使用方法；合理的なドラッグデザイン合理的なドラッグデザインの目的は、例えば、より活性または安定した形態のポリペプチド、または例えば、イン・ビボ（in vivo）でポリペプチドの機能を高めるかもしくは妨害する薬剤を創造するために、それらが相互作用する目的の生物学的に活性なポリペプチドまたは小分子の構造アナログ（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビターのような）を作製することである（例えば、ホジソン（Hodgson），１９９１年参照）。１つのアプローチにおいて、最初に（例えば、ｐ１６またはＣｄｋ４のような）目的の蛋白質、または例えばＣｄｋ４-ｐ１６コンプレックスの三次元構造を、ｘ-線結晶学、コンピューター・モデリングまたは最も典型的には組み合わせたアプローチによって決定する。しばしばほどではないが、ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同性蛋白質の構造に基づくモデリングによって得ることもできる。合理的な薬剤デザインの一例は、ＨＩＶプロテアーゼ・インヒビターの開発である（エリックソン（Ericks on）ら、１９９０年）。くわえて、（例えば、ｐ１６またはＣｄｋ４のような）ペプチドは、アラニンスキャン（alanine scan）（ウェルズ（Wells）１９９１年）によって分析する。この技術においては、アミノ酸残基をＡ1aで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する。ペプチドの各アミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの重要な領域を決定する。また、機能性アッセイによって選択した標的-特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することもできる。原則として、このアプローチにより、続く薬剤デザインがベースとできるファーマコア（pharmacore）を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体を生成させることによって、蛋白質結晶学全体を迂回することができる。鏡像の鏡像として、抗-イディオタイプ抗体の結合部位は、元の受容体のアナログであると予想されよう。次いで、抗-イディオタイプ抗体を用いて、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクからペプチドを同定し単離する。次いで、選択されたペプチドは、ファーマコアとして作用するであろう。かくして、例えば、改善されたＭＴＳ活性もしくは安定性、またはＭＴＳ活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニスト他として作用するものを有する薬剤をデザインすることができる。クローン化ＭＴＳ配列を入手できることによって、十分な量のＭＴＳポリペプチドを入手して、ｘ-線結晶学のような分析研究を行うことができる。さらに、本明細書中に提供するＭＴＳ蛋白質配列の情報は、ｘ-線結晶学に代えるかまたは加えて、コンピューターモデリング技術を用いることに導くであろう。使用方法：遺伝子治療また、本発明により、変異ＭＴＳ対立遺伝子を有する細胞に野生型ＭＴＳ機能を供給する方法も提供される。かかる機能を供給することにより、受容細胞の新生物増殖が抑制されるであろう。野生型ＭＴＳ遺伝子または該遺伝子の一部分は、当該遺伝子を染色体外に維持するようなベクターを用いて細胞に導入できる。かかる場合において、該遺伝子は、染色体外の位置から、細胞により発現されるであろう。突然変異ＭＴＳ対立遺伝子を有する細胞に遺伝子部分を導入し、発現させる場合、当該遺伝子部分は細胞の非腫瘍的増殖に必要なＭＴＳ蛋白質の一部分をコードしているべきである。野生型ＭＴＳ遺伝子またはその一部分が、細胞に存在する内因的な突然変異ＭＴＳ遺伝子との組換えが起こるように突然変異細胞に導入される状況がさらに好ましい。かかる組換えには、ＭＴＳ遺伝子突然変異が修正される、二重組換えの発生が必要である。組換えおよび染色体外維持の双方のための遺伝子導入用のベクターは当該分野で知られており、いずれの適当なベクターも用いることができる。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈およびウイルス形質導入のごとき、細胞にＤＮＡを導入する方法は当該分野で知られており、該方法の選択は通常の当業者の能力の範囲内にある。野生型ＭＴＳ遺伝子で形質転換した細胞は、癌の鎮静およびかかる鎮静を促進する薬剤治療を研究するためのモデル系として用いることができる。前記で一般的に論じたごとく、ＭＴＳ遺伝子またはその断片は、適用できる場合には、癌細胞においてかかる遺伝子の発現産物量を増加させるために、遺伝子治療法に用いることができる。かかる遺伝子治療は、正常細胞に比してＭＴＳポリペプチドのレベルがなくなっているかまたは減少している癌性または前癌性の細胞の双方における使用に特に適している。また、このことは、「正常な」レベルで突然変異遺伝子を発現している癌細胞においてでさえ、得られたＭＴＳ遺伝子の発現レベルを上昇させるのにも有用となり得るが、該遺伝子産物は完全には機能しない。遺伝子治療は、例えば、「遺伝病の治療（Therapy for Genetic Disease）」、ティー・フリードマン（T.Friedman）編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（Oxford University Press）社（１９９１年）１０５-１２１頁に、フリードマン（Friedman）によって記載されているような、一般的に許容される方法に従って行われるであろう。患者の腫瘍からの細胞を、まず前記した診断方法によって分析し、腫瘍細胞におけるＭＴＳポリペプチドの産生を確認する。発現制御エレメントに連結したＭＴＳ遺伝子のコピーを含み、かつ該腫瘍細胞内で複製できるウイルスまたはプラスミドベクターが好ましい。適当なベクターは、米国特許第５,２５２,４７９号およびＰＣＴ国際公開ＷＯ９３/０７２８２に開示されたごとく、知られている。次いで、ベクターを腫瘍部位に局所的かまたは（他の部位に転移し得るいずれの腫瘍細胞にも達せさせるためには）全身的に患者に注射する。トランスフェクションされた遺伝子が各標的化腫瘍細胞のゲノムに恒久的に取り込まれない場合には、該処理を定期的に繰り返すことができる。ＭＴＳポリペプチドは細胞周期の制御に本質的に拘わっているため、当該遺伝子を取り込んだ全ての細胞によるＭＴＳポリペプチドの構造的発現を避けるために、ＭＴＳ遺伝子をそれ自体の調節エレメントと共に導入するのが好ましい。当該分野で知られている遺伝子転移系は、本発明の遺伝子治療法を実施するのに有用となり得る。これらには、ウイルス的または非ウイルス的なトランスファー法が含まれる。パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０、マドザック（Madzak）ら，１９９２年のような）、アデノウイルス（バークナー（Berkner），１９９２年；バークナー（Berkner）ら，１９８８年；ゴルジグリア（Gorziglia）およびカピキアン（Kapikian），１９９１年；クオンチン（Quantin）ら，１９９２年；ローゼンフェルド（Rosenfeld）ら，１９９２年；ウィルキンソン（Wilkinson）ら，１９９２年；ストラットフォード（Stratford）-ペリコーデット（Perricaudet）ら，１９９１年のような）、ワクシニアウイルス（モス（Moss），１９９２年のような）、アデノウイルス伴生ウイルス（ムジクツカ（Muzyczka），１９９２年；オーイ（Ohi）ら，１９９０年のような）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス（マルゴルスキー（Margolskee），１９９２年；ジョンソン（Johnson）ら，１９９２年；フィンク（Fink）ら，１９９２年；ブレックフィールド（Breakf ield）およびゲラー（Geller），１９８７年；フリース（Freese）ら，１９９０年のような）、ならびに鳥類（ブランディオパドヒエイ（Brandyopadhyay）およびテミン（Temin），１９８４年；ペトロポウロス（Petropoulos）ら，１９９２年のような）、齧歯類（ミラー（Miller），１９９２年；ミラー（Miller）ら，１９８５年；ソルジェ（Sorge）ら，１９８４年：マン（Mann）およびバルチモア（Baltimore），１９８５年；ミラー（Miller）ら，１９８８年のような）およびヒト（シマダ（Shimada）ら，１９９１年；ヘルセス（Helseth）ら，１９９０年；ページ（Page）ら，１９９０年；ブックシャッヒャー（Buchschacher）およびパンガニバン（Panganiban），１９９２年のような）起源のレトロウイルスを含む数多くのウイルスが、遺伝子トランスファーベクターとして用いられてきた。ほとんどのヒトの遺伝子治療プロトコールは、無能化した齧歯類のレトロウイルスに基づいていた。当該分野で知られている非ウイルス遺伝子トランスファー法には、リン酸カルシウム共沈（グラハム（Graham）およびホン・デル・エブ（von der Eb），１９７３年；ペリセル（Pellicer）ら，１９８０年のような）のごとき化学的技術；例えば、マイクロインジェクション（アンダーソン（Anderson）ら，１９８０年；ゴードン（Gordon）ら，１９８０年；ブリンスター（Brinster）ら，１９８１年；コンスタンチーニ（Constantini）およびレイシー（Lacy），１９８１年のような）；リポソームを介した膜融合による転移（フェルグナー（Felgner）ら，１９８７年；ウォン（Wang）およびファン（Huang），１９８９年；カネダ（K aneda）ら，１９８９年；スチュアート（Stewart）ら，１９９２年；ナーベル（ Nabel）ら，１９９０年；リム（Lim）ら，１９９２年のような）；ならびに直接ＤＮＡ取り込み（ウォルフ（Wolff）ら，１９９０年；ウ（Wu）ら，１９９１年；ゼンケ（Zenke）ら，１９９０年；ウ（Wu）ら，１９８９年ｂ；ウォルフ（Wolff）ら，１９９１年；ワグナー（Wag ner）ら，１９９０年；ワグナー（Wagner）ら，１９９１年；コッテン（Cotten ）ら，１９９０年；クリエル（Curiel）ら，１９９１年ａ；クリエル（Curiel）ら，１９９１年ｂのような）のごとき機械的技術、ならびに受容体-媒介ＤＮＡトランスファーのような機械的技術が含まれる。ウイルスにより媒介される遺伝子転移は、リポソーム・デリバリーを用いた直接イン・ビボ遺伝子転移と組み合わせることができ、ウイルスベクターを周囲の非分裂細胞ではなく腫瘍細胞に向けることが可能となる。別法として、レトロウイルスベクター産生細胞系を腫瘍に注射することもできる（カルバー（Culver）ら，１９９２年）。産生細胞が注射されれば、ベクター粒子の連続的な源が提供される。この技術は、手術不可能な脳腫瘍を患ったヒトでの使用が認可されている。生物学的および物理学的な遺伝子トランンスファー法を合わせたアプローチにおいて、いずれかのサイズのプラスミドＤＮＡを、アデノウイルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン抱合抗体と組み合わせると、得られた複合体がアデノウイルスベクターに結合する。次いで、三分子複合体を用いて細胞に感染させる。アデノウイルスベクターにより、カップリングしたＤＮＡが損傷される前に、効率的な結合、内在化、およびエンドソーム分解が可能となる。リポソーム/ＤＮＡコンプレックスは、直接イン・ビボの遺伝子転移を媒介できることが示されている。標準的なリポソーム調製物においては、遺伝子転移プロセスが非特異的であるにも拘わらず、局在化されたインビボ（in vivo）の取り込みおよび発現が、例えば、直接インサイチュ（in situ）投与の後に、腫瘍沈着物で報告されている（ナーベル（Nabel），１９９２年）。使用方法：ペプチド治療ＭＴＳ活性を有するペプチドは、突然変異または欠損ＭＴＳ対立遺伝子を有する細胞に供給することができる。ＭＴＳ蛋白質の配列を開示する（配列番号：２、配列番号：１４および配列番号：１６）。蛋白質は、例えば、知られている発現ベクターを用いて、細菌中でｃＤＮＡ配列を発現させることによって産生できる。別法として、ＭＴＳポリペプチドは、ＭＴＳ-産生哺乳動物細胞から抽出することもできる。さらに、合成化学の技術を用いてＭＴＳ蛋白質を合成することもできる。いずれかのかかる技術により、ＭＴＳ蛋白質よりなる本発明の調製が提供できる。該調製物には、実質的に他のヒト蛋白質が含まれていない。このことは、微生物中またはイン・ビトロにおける合成により最も容易に達成される。活性ＭＴＳ分子は、例えば、マイクロインジェクションまたはリポソームを使用することによって細胞に導入できる。別法として、ある種の活性分子も、能動的または拡散によって、細胞によって取り込まれ得る。ＭＴＳ遺伝子産物の細胞外の適用は、腫瘍の増殖に十分に影響し得る。ＭＴＳ活性を有する分子の供給は、新生物状態の部分的な逆転を導くであろう。（例えば、ペプチド、薬剤または有機化合物のような）ＭＴＳ活性を有する他の分子を用いて、かかる逆転に作用させてもよい。実質的に同様な機能を有する修飾ポリペプチドもペプチド治療に用いられる。使用方法：形質転換宿主同様に、突然変異ＭＴＳ対立遺伝子を有する細胞および動物を、治療剤としての潜在的可能性性を有する物質を研究し試験するモデル系として用いることができる。細胞は、典型的には培養上皮細胞である。これらを、体細胞または生殖系列のいずれかのＭＴＳ変異を有する患者から単離できる。別法として、該細胞系は、前記したごとく、ＭＴＳ対立遺伝子に突然変異を有するように設計することもできる。試験物質を細胞に適用した後に、該細胞の新生物的な形質転換表現型を測定する。ヌードマウスにおける足場-依存性増殖、腫瘍形成性、細胞の侵入性、ならびに成長因子依存性を含む、腫瘍形成的に形質転換した細胞のいかなる特性も評価することができる。これらの各特性のためのアッセイは、当該分野で知られている。治療剤試験用の動物は、動物全体を突然変異誘発した後か、または生殖系細胞もしくは接合子を処理した後に選択できる。かかる処理には、通常は第二の動物種からの変異ＭＴＳ対立遺伝子の挿入、ならびに崩壊した相同性遺伝子の挿入が含まれる。別法として、動物の内因性ＭＴＳ遺伝子（群）を、挿入もしくは欠損突然変異または慣用技術を用いた他の遺伝子変性によって崩壊させてもよい（カペッチ（Capecchi），１９８９年；バランシウス（Valancius）およびスミシーズ（Smithies），１９９１年；ハスティー（Hasty）ら，１９９１年；シンカイ（S hinkai）ら，１９９２年；モンバーツ（Mombaerts）ら，１９９２年；フィルポット（Philpott）ら，１９９２年；スノーワート（Snouwaert）ら，１９９２年；ドーネホウアー（Donehower）ら，１９９２年）。試験物質を動物に投与した後に、腫瘍の増殖を評価しなければならない。試験物質が腫瘍の増殖を阻害または抑制する場合には、その試験物質は本明細書で同定した癌を治療するための治療剤の候補である。本発明は、以下の実施例を参照することにより説明されるが、例示的な方法によって説明されているのであって、いかなる場合においても本発明を限定することを意図するものではない。当該分野でよく知られている標準的技術または以下に特記する技術を用いた。実施例１材料および方法Ａ．ＭＴＳ家系図１Ａ〜１Ｄは、それぞれ血族３１３７、３１６１、３３５５および１７７１を示す。該図面には、これらの血族における癌の発生が示されている。血族３１３７におけるすべてのメラノーマは感受性ハロタイプを担持する。この血族について、該感受性ハロタイプを担持する他の癌も示されている。血族３１６１および３３５５におけるすべてのメラノーマは、感受性ハロタイプを担持する。血族１７７１における癌について、ＭＴＳ中の変異を同定した。Ｂ．腫瘍細胞系ルドビグ・インスティチュート・フォー・キャンサー・リサーチ、メモリアル・スローン−ケタリング・キャンサー・センター（Ludwig Institute for Cance r Research，Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）より７６個のメラノーマ細胞系を得、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Typ e Culture Collection（ATCC））より８個のメラノーマ細胞系および５個の非メラノーマ系を得た。Ｃ．腫瘍細胞系ＤＮＡの調製および分析約１×１０⁷個の細胞を３ｍｌの溶菌緩衝液（０.１ＭＮaＣｌ；０.１ＭトリスＨＣｌ pＨ８.０；５mＭＥＤＴＡ；０.５％ＳＤＳ）に加え、ついでボルテックスおよびインキュベート（６５℃、３０分間）することにより、細胞系からＤＮＡを単離した。０.５ｍｌの８ＭＫＯＡｃを加え、該反応液を混合し、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離（１０,０００×ｇで５分間）した後、等容量の９５％エタノールで上清を沈殿させ、再度遠心分離した（１０,０００ ×ｇで１５分間）。該ＤＮＡを５０〜２００mlのＨ₂Ｏに再懸濁した。Ｄ．ＰＣＲ反応０.１ｍＭｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.３）、５０ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ₂、０.０１％ゼラチンおよび１単位のアンプリタック・ポリメラーゼ（Amplitaq polymerae）（パーキン−エルマー（Perkin-Elmer））を含有する２０ｍｌの反応混合物中の３０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマーに５０ｎｇの鋳型を加えた。パーキン−エルマー９６００サーマルサイクラー中、９４℃で１０秒間、５５℃で１０秒間および７２℃で１０秒間、サンプルを３５回循環させた。１.５％アガロース（シーケム（SeaKem））または３％ヌシーブ（NuSieve）３：１アガロース（ＦＭＣバイオプロダクツ（BioProducts ））のいずれかによる電気泳動の後、エチジウムブロミド染色により生成物を可視化した。Ｅ．ＹＡＣ上記のＰＣＲ条件を用いて、ＣＥＰＨＹＡＣライブラリーをＩＦＮＡ、Ｄ９Ｓ１７１およびＤ９Ｓ１２６でスクリーニングすることにより、ＭＴＳ領域中にマーカーを含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）を得た。ＹＡＣを含有する酵母株を３０℃で３日間、ＡＨＣ培地（１０ｇ／１カゼイン加水分解産物−酸；１.７ｇ／ｌ酵母窒素塩基；５ｇ／ｌ硫酸アンモニウム；２０ｍｇ／ｌアデニンヘミサルフェート；２％グルコース；ｐＨ＝５.８）中で激しく振盪させて増殖させた。オースベル（Ausubel）ら（１９９２）の記載のとおりに酵母ＤＮＡを調製した。Ｆ．ファージライブラリーの構築ＹＡＣＤＮＡを含有する酵母ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化して完成させ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Boehringer-Mannheim））を用いてＢａｍＨＩ−消化ＥＭＢＬ３ファージアーム（プロメガ（Promega））に挿入し、ギガパックIIエクストラクツ（GigapackII extracts）（ストラタジーン（Stratagene））でインビトロパッケージングした。イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｃ６００上でファージを増殖させた。³²Ｐ−標識ヒトＣ₀ｔ−ＩＤＮＡ（ギブコ（GIBCO）−ＢＲＬ）でハイブリダイゼーションすることにより、ヒトＤＮＡを含有する組換えファージ同定した。ＹＡＣ左または右アームからの配列を含有するＰＣＲ断片でスクリーニングすることにより、ＹＡＣベクター（エンドクローン）に結合したヒト配列を含むファージを同定した。標準的な条件下（ミドルトン（Middleton）ら、１９９１）で、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った。陽性プラークを拾い上げ、再び３回平板培養することにより精製した。キアエックス（Qiaex）カラム（キアゲン（Qiagen））を用いてファージＤＮＡを調製した。Ｇ．コスミドライブラリーの構築ＹＡＣＤＮＡを含有する酵母ゲノムＤＮＡをＳａｕ３Ａで部分消化し、直線（１０〜４０％）ショ糖勾配上で大きさにより分画した（マニアティス（Maniat is）ら、１９８２に記載のとおりに行う）。製造業者の指示に従い、スーパーコス（SuperCos）１コスミドベクター（ストラタジーン（Stratagene））を調製し、質量比４：１（挿入：ベクター）で挿入ＤＮＡと混合し、リガーゼで処理し、上記のとおりインビトロパッケージングした。コスミドをＤＨ５α宿主細胞に導入し、１５ｃｍペトリ皿当たり２０００コロニーの密度で平板培養した。上記およびマニアティス（Maniatis）ら、１９８２に記載のとおり、コロニーハイブリダイゼーションを行った。Ｈ．Ｐ１クローンゲノム・システムズ・インコーポレーティッド（Genome Systems，Inc.）（ミズリー州セントルイス）から、本明細書中に記載のとおりに調製されたＳＴＳでスクリーニングすることにより、ＭＴＳ領域に及ぶＰ１クローンを得た。アルカリ溶解（バーンボイム（Birnboim）およびドリー（Doly）、１９７９）、ついで塩化セシウム勾配遠心分離（マニアティス（Maniatis）ら、１９８２）により、これらのクローンからのＤＮＡを単離した。Ｉ．ＳＴＳの作成Ｐ１ベクター（pSacBII）、スーパーコス（SuperCos）１ベクターまたはＥＭＢＬ３ベクターのクローニング部位に隣接する配列に相補性のオリゴヌクレオチドで１.０ｍｇのＰ１、コスミドまたは鋳型ＤＮＡを配列決定することにより、ＳＴＳを作成した。プリズム・レディー・リアクション・ダイデオキシ・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・キット（PRISM Ready DyeDeoxy Termi nator Cycle Sequencing Kit（ABI）を有するＡＢＩ３７３ＡＤＮＡ配列決定システム上で配列決定を行った。２０ｂｐ長に可能な限り近くなり、６０℃に可能な限り近い融解温度を有するようにＳＴＳを設計した。Ｊ．メラノーマー傾向血族におけるＭＴＳ１中の生殖系列変異標準的な方法を用いることにより、キャリヤー個体からのゲノムＤＮＡを血液から調製した。各サンプルからの２０ｎｇＤＮＡを用いてＭＴＳ１からのコーディングエキソン１または２を、あるいはＭＴＳ２からのコーディングエキソン２を増幅するためにイントロン位置でプライマーを設計した。ＰＣＲ反応では標準緩衝液を使用した（ただし、ＤＭＳＯを最終濃度５％になるまで加えた）。該配列の異なる点に位置したプライマーを使用し、増幅された生成物上でα−Ｐ³²− ｄＡＴＰを用いて循環配列決定反応を行った。すべての（Ａ）反応物、ついで（Ｃ）反応物等を並べて載せることにより、６％変性ポリアクリルアミドゲル上で該配列決定生成物を分析した。反対の鎖の配列分析によりすべての多形性が確認された。実施例２遺伝的に連鎖したマーカーを用いるＭＴＳの位置決定９ｐ２１領域中のホモ接合欠失について腫瘍細胞系を分析するために、ＭＴＳに連鎖していることが知られている１組のマーカーを使用した。これらのマーカーはもともと、１０個のユタ血族および１個のテキサス血族におけるメラノーマ素因の劇的な連鎖（ＬＯＤ得点＝１２.７）を示すために使用された（キャノンーアルブライト（Cannon-Albright）ら、１９９２）。該マーカーは、試験した最も遠位のマーカーであるα−インターフェロン遺伝子クラスター（ＩＦＮＡ）（クウィアトコウスキー（Kwiatkowski）およびディアズ（Diaz）、１９９２）からの配列、近位のマーカー（Ｄ９Ｓ１０４）および両者間の４個の追加マーカー（Ｄ９Ｓ１７１、Ｄ９Ｓ１２６、Ｄ９Ｓ１６１およびＤ９Ｓ１６９）を含んでいた（キャノン−アルブライト（Cannon-Albright）ら、１９９２）。遺伝的研究から、該介在マーカーの直線配列はＤ９Ｓ１７１、Ｄ９Ｓ１２６、Ｄ９Ｓ１６１、Ｄ９Ｓ１６９であると考えられた。該ＩＦＮＡマーカーは、野生型ゲノムＤＮＡから２個の断片［すなわちポリ（ＣＡ）の広がりを含有する約１３８〜１５０ｂｐの多形性断片（ＩＦＮＡ−１）および約１２０ｂｐの非変異断片（ＩＦＮＡ−ｓ）］を増幅したオリゴヌクレオチドプライマー対よりなるものであった。ＩＦＮＡ−１に関するＩＦＮＡ−ｓの位置は不明であった。欠失を含有すると既に報告されている５個の非メラノーマ腫瘍細胞系を、遺伝マーカーを用いて分析した。各細胞系は、試験したマーカーの少なくとも１個のホモ接合欠失を示した（表１）。Ｄ９Ｓ１６１、Ｄ９Ｓ１６９またはＤ９Ｓ１０４を使用することによってはホモ接合欠失は全く同定されなかった。これらの欠失の間の重なりの最小領域は、ＩＦＮＡ−１およびＤ９Ｓ１７１に隣接していた。これは、これらの２個のマーカーの間の領域が腫瘍抑制、おそらくＭＴＳに関連した遺伝子を含有することを示唆する。ついで、Ｄ９Ｓ１７１とＩＦＮＡ−１との間の、特にＩＦＮＡ−ｓに隣接したゲノム領域をさらに詳細に研究した。実施例３ＭＴＳ領域におけるゲノムクローンＩＦＮＡ−ｓを包囲する領域のゲノムクローンを得るために、ＣＥＰＨＹＡＣライブラリーをスクリーニングした（コーエン（Cohen）ら、１９９３）。Ｄ９Ｓ１７１マーカーを含有する１１個のＹＡＣおよびＩＦＮＡ−ｓを含有する５個のＹＡＣを同定した。Ｄ９Ｓ１７１およびＩＦＮＡ−ｓの両方を含むＹＡＣは全く単離されなかった（図２）。ＹＡＣクローン（Ｃ９、Ｃ６、Ｆ９）の３個をファージ中にサブクローニングし、１個のＹＡＣ（Ｃ６）をコスミドベクター中にサブクローニングした。これらおよびコスミドクローンは、公知の遺伝マーカーに本質的なＳＴＳを生成し下記の染色体歩行を促進する便宜な方法を提供した。該領域の近隣のゲノム地図の構築のための独立したゲノムＤＮＡ源を提供し、ＳＴＳの生成を促進するために、Ｄ９Ｓ１７１へ伸長しているＩＦＮＡ−ｓ、ＩＦＮＡ−ｓにまでさかのぼって伸長しているＤ９Ｓ１７１、および両方向のＹＡＣＣ６末端からのＰ１クローン中で染色体歩行を開始した。この染色体歩行の一部として合計２７個のＰ１クローンを単離した（図２）。決定されたＰ１は、ＩＦＮＡ−ｓからＤ９Ｓ１７１へ２個の間隙を有して伸びる隣接した集合体を形成した。Ｐ１クローンならびに数個のファージおよびコスミドクローンを使用してＭＴＳ領域の詳細な構造地図を得た。実施例４ＭＴＳ領域の詳細な構造分析ＭＴＳ領域のより詳細な分子地図を作成するためには追加のマーカーが必要であった。ゲノムクローンから得られたＤＮＡ配列を用いてＳＴＳについてのＰＣＲプライマーを設計した。これらのＳＴＳは、Ｐ１およびＹＡＣクローンを制御するのを助けるのに交替して機能した。ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１７１との間の領域からの合計５４個のＳＴＳは、ＭＴＳ領域の詳細な物理的地図を展開するための主要な基礎となった（図２）。これらのＳＴＳプライマー配列は、ゲノム・データベース（Genome Database）に寄託されている。ＩＦＮＡ−ｓからＤ９Ｓ１７１に伸長する新しいマーカーの組を用いて、ＭＴＳ領域におけるホモ接合欠失について８４個のメラノーマ細胞系を試験した。合計５２個の系がホモ接合欠失の領域を示した（図３）。該欠失の幾つかは広範であり、例えば１３個の系が８１６.７および７６０−Ｌの両方を含む領域を失っていた。ＭＴＳを位置決定するために、最も情報性に富む腫瘍系を２群に分けた（図３）。すなわち、ｉ）ｃ５.１の欠失のみを含有するもの（クラス１１）、およびi i）ｃ５.３の欠失のみを含有するもの（クラス１２）に分けた。合計５個のメラノーマ系をこれらの区分に分けた。欠失が検出されたすべての場合で、該欠失は単純であるようであった。すなわち、ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１７１との間の領域における複数欠失事象の証拠は全くなかった。全体的に、欠失を含む系は、マーカ−ｃ５.１およびｃ５.３の周囲に集中した欠失重複の領域を示し、これはＩＦＮＡ−ｓからＤ９Ｓ１７１への領域の完全な物理的地図の展開を不要にする。実施例５含有ＭＴＳとしてのコスミドｃ５およびＰ１コロニーＰ１０６２およびＰ１０６３の同定Ａ．遺伝マーカーの配置ＹＡＣクローンの分析および腫瘍細胞系中の欠失の分析により、マーカーの遺伝配置：ＩＦＮＡ、Ｄ９Ｓ１７１、Ｄ９Ｓ１２６に一致した結果が得られた。３個のＹＡＣはＤ９Ｓ１７１およびＤ９Ｓ１２６の両方を含有していたが、４個のＹＡＣはＩＦＮＡ−１およびＩＦＮＡ−ｓを含有していた（図２）。Ｄ９Ｓ１７１およびＩＦＮＡの両方を含有するものはなかった。これは、ｉ）ＩＦＮＡ−１およびＩＦＮＡ−ｓは深く連鎖していること、およびii）Ｄ９Ｓ１２６およびＤ９Ｓ１７１は連鎖していることを示唆する。これらの結果は細胞系欠失により確認された。Ｄ９Ｓ１７１を欠くほとんどの細胞系はＤ９Ｓ１２６をも欠いていた。反対に、系Ｕ−８７はＤ９Ｓ１７１およびＤ９Ｓ１２６について陽性を示したが、ＩＦＮＡ−ｓおよびＩＦＮＡ−１を欠いていた（表１）。１個のメラノーマ細胞系、すなわちＳＫ−ＭＥＬ−５は、ＩＦＮＡ−ｓ、Ｄ９Ｓ１７１およびＤ９Ｓ１２６を欠いていたが、ＩＦＮＡ−１は欠いていなかった。したがって、ＩＦＮＡ−１はＩＦＮＡ−ｓに対して遠位にあるに違いない。もう１つのメラノーマ細胞系であるＳＫ−Ｍｅｌ−Ｚａｎは、ＩＦＮＡ−１、ＩＦＮＡ−ｓおよびＤ９Ｓ１７１を含むがＤ９Ｓ１２６を含まず、ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１２６との間にＤ９Ｓ１７１が位置する欠失を含有していた。総括的には、これらの知見は表１に示すマーカーの順序を支持する。ヒトα−インターフェロン遺伝子ファミリーは２３個を超える遺伝子および染色体９ｐに位置する擬遺伝子よりなる。この遺伝子クラスターはクローニングされ、１０個の連鎖群に分類されている（ヘンコ（Henco）ら、１９８５）。連鎖群は、神経膠腫細胞系における異なるα−インターフェロン配列の欠失喪失の分析により、部分的に順序付けされている（オロペイド（Olopade）ら、１９９２）。神経膠腫系Ｈ４は、ＩＦＮＡ−１およびＩＦＮＡ−ｓの両方を欠く。また、それは連鎖群ＩＶ（例、α１３、α６およびα２０）からの配列をも欠く。神経膠腫系Ａ１７２はＩＦＮＡ−１および連鎖群ＩＶの両方を含有するが、連鎖群Ｉ（例、α１、α１９）、III（例、α８）およびIX（例、α２）およびＩＦＮＡ−ｓからの配列を欠く。この分析は、ＩＦＮＡ−１を、連鎖群Ｉ、IIIおよびIXならびにＩＦＮＡ−ｓに対して遠位に置く。Ａ１７２欠失の遠位境界は、ＩＦＮＡ− ｓの遠位の１個のＰ１長内にマッピングされる。したがって、連鎖群Ｉ、IIIおよびIXは、ＩＦＮＡ−ｓに対して８５ｋｂ未満の遠位の点に隣接しているに違いない。Ｂ．遺伝マーカー間の物理的距離この結果からは、ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１７１との間の距離の正確な推定をすることができなかった。なぜなら、両マーカーを含有するＹＡＣを単離することができなかったからである。さらに、ＳＴＳによるマッピングに基づけば、ＩＦＮＡ−ｓから遠位に伸長する５個のＹＡＣはすべて、Ｄ９Ｓ１７１から近位に伸長する１１個のＹＡＣのいずれとも重複しなかった。ＣＥＰＨＹＡＣ挿入の長さが平均すると５００ｋｂ未満であると仮定すると、ＩＦＮＡ−ｓとＤ９Ｓ１７１との間の距離は少なくともこの大きさであると考えられる。ＩＦＮＡ−ｓとｃ５.１との間の領域は、Ｐ１ライブラリー中の９個の歩行工程でカバーされた。各工程は平均してＰ１挿入の半分の長さであると仮定すると、ｃ５.１とＩＦＮＡ−ｓとの間の距離はおよそ４００ｋｂである。したがって、メラノーマ系においてしばしば欠失しているｃ５.１に堅く連鎖している腫瘍抑制遺伝子は、ＩＦＮＡ−ｓに対して約４００ｋｂ近位にあるに違いない。Ｃ．腫瘍系における欠失９ｐ２１領域のホモ接合欠失が、試験したメラノーマ腫瘍の５７％で見いだされた。１４個の腫瘍系が、７６０−Ｌを通って近位側に伸長する欠失を含有し、１６個の系が、遠位側の８１６.７を超えて伸長する欠失を含有していた。該欠失が原因となる、すなわち、この領域の遺伝子の欠失が腫瘍表現型に寄与すると仮定すると、腫瘍抑制遺伝子もまた７６０−Ｌと８１６.７との間に存在するに違いない。最も小さい欠失はマーカーｃ５.１およびｃ５.３を含んでいた。試験されたすべてのマーカーのうちで、最大数の系である５１からｃ５.３が欠失していた。したがって、腫瘍抑制遺伝子の最も可能性の高い位置はｃ５.３に非常に近い。なぜなら、それは最も頻繁に欠失しているマーカーであるからである。４個の系がｃ５.３（クラス１２）のみの欠失を含有し、１個の系がｃ５.１（クラス１１）のみを欠いていた。これらのマーカーの両方は、同じコスミドであるｃ５上の存在していた。したがって、腫瘍抑制遺伝子はコスミドｃ５からの配列を含むと考えられる。Ｐ１クローンＰ１０６２およびＰ１０６３は、ｃ５および包囲するコスミド中に見いだされる配列を含む。したがって、以下にさらに示すとおり、Ｐ１０６２およびＰ１０６３は全ＭＴＳ領域を含有する。上記実施例で得られた結果は、ＩＦＮＡ−１とＤ９Ｓ１２６との間の領域がＭＴＳの最も可能性の高い位置であることが判明したＭＴＳの以前の遺伝研究と一致する（キャノン−アルブライト（Cannon-Albright）ら、１９９２）。最近の遺伝研究は、Ｐ１−４５２上のＩＦＮＡ−ｓとＣ５.３との間にある多形性（ＣＡ）反復を用いて、ＭＴＳの位置をさらに限定している（図２）。したがって、ＭＴＳは、メラノーマ細胞系中のホモ接合欠失が集合している領域内に位置する。これらの結果は、ｃ５.３の近くのどこかに位置する腫瘍抑制遺伝子座、ＭＴＳがあるという見解を支持する。欠失を含有するすべての系は、欠失がｃ５.１またはｃ５.３（クラス１１および１２）に制限されている組を除いて、欠失したＤＮＡの共通の領域を共有する。コスミドｃ５内の細胞系以外の細胞系のこの区分においては、非重複欠失の兆候は全くなかった。したがって、例えば、ｃ５ .１およびｃ５.３から遠位の９ｐ２１中の第２の腫瘍抑制遺伝子座を含む、より複雑なスキームを生じさせる基礎は全くない。９ｐ２１のホモ接合欠失が複数の腫瘍型で生じるとの観察は、そこに存在する腫瘍抑制遺伝子が種々の組織で発現され得ることを示唆する。したがって、腫瘍抑制遺伝子は、複数の型の癌の発生に関与しているかもしれない点でｐ５３遺伝子に類似しているかもしれない（さらに以下のデータを参照されたし）。メラノーマ傾向家族において、他の型の癌が報告されている（ナンカロウ（Nancarrow ）ら、１９９３；バーグマン（Bergman）ら、１９９０）。ｃ５.１およびｃ５. ３を用いる種々の腫瘍型の徹底的な欠失分析（以下に示す）は、メラノーマ以外の腫瘍におけるこの腫瘍抑制遺伝子の重要性を明らかにする。観察されたホモ接合欠失のいくつかは、多数の遺伝マーカーを除去する。ファウンティン（Fountain）らは、２個の異なるメラノーマ系における染色体９ｐ２１のホモ接合欠失は２〜３Ｍbで伸長していると報告している（バーグマン（Ber gman）ら、１９９０）。この研究において、少なくとも１個の系、ＳＫ−ＭＥＬ −５が、試験した最も遠位のマーカーであるＩＦＮＡ−１からＤ９Ｓ１２６を越えて（明らかに大きすぎて単一のＹＡＣ上に含有され得ない領域である）伸長する欠失を含有していた。大きな欠失が優勢であることは、ＭＴＳを包囲する領域が細胞生存に必須の遺伝子を欠くことを示唆する。実施例６ＭＴＳ候補遺伝子の単離上記実施例では、ＭＴＳの近隣のＹＡＣおよびＰ１染色体歩行の結果を記載した。ｃ５配列由来のＳＴＳによる詳細な構造−マッピング実験は、５個の異なるメラノーマ細胞系におけるｃ５配列の小さな非重複欠失の存在を示す。この結果に基づけば、腫瘍抑制遺伝子（おそらくＭＴＳであろう）はｃ５内に少なくとも部分的に存在するようである。ｃ５が少なくとも１個の遺伝子を含有するというさらなる兆候は、ｃ５および近隣コスミドにおける（ＣｐＧ）ジヌクレオチド頻度の分析から得られる。哺乳動物においては、ほとんどすべてのハウスキーピング遺伝子およびすべての組織特異的遺伝子の半分近くが、（ＣｐＧ）ジヌクレオチドに異常に富む領域に関連している（バード（Bird）、１９８９；ラーセン（Larsen）ら、１９９２）。したがって、かかる「ＣｐＧ島」の存在は遺伝子を暗示する。コスミドｃ５、ｃ１２、ｃ５７およびｃ５９を、認識配列が２個の（ＣｐＧ）対を含む酵素である制限エンドヌクレアーゼＥａｇＩ、ＢｓｓＨＩおよびＳａｃＩＩで消化した。コスミドｃ５およびｃ１２のみがこれらの酵素のための部位を含有していた。コスミドｃ５は１個のＥａｇＩ部位、少なくとも１０個のＢａａＨＩ部位および少なくとも１２個のＳａｃＩＩ部位を含有していた。ｃ５および重複コスミドｃ１２におけるＣｐＧ島の存在は、ｃ５が実際に少なくとも１個のＭＴＳの候補遺伝子を含有することを示唆した。ＭＴＳを探すために、コスミドｃ５からのＥｃｏＲＩ断片のＤＮＡ配列を決定した。これらの配列をジーンバンク（GeneBank）からの配列に対して比較した場合、ヒトサイクリン依存キナーゼ４（Ｃｄｋ４）阻害剤またはｐ１６をコードする既に同定されている遺伝子の領域に類似している、ｃ５の２個の別個の領域を同定した（セラノ（Serrano）ら、１９９３）。これらの２個の遺伝子は、ＭＴＳの候補であり、ＭＴＳ１およびＭＴＳ２と称された。ＭＴＳ１は染色体９ｐテロメアに最も近いコスミドｃ５の末端近くに位置し、ＭＴＳ２はｃ５の動原体末端の近くに位置していた。図４Ｂを参照されたし。ＭＴＳ１およびＭＴＳ２の位置ならびにＰ１１０６２、１０６３および１０６９を示すコスミド地図を図４Ａに示す。ｃ５からのＭＴＳ１のゲノム配列のｐ１６ｍＲＮＡ配列との詳細な比較により、ＭＴＳ１が、ｐ１６コーディング配列の一部分と同一である３０７ｂｐの広がりを含有することが示された。ＭＴＳ１におけるヌクレオチドのこの広がりは、認識可能なスプライシング部位配列に隣接している。ＭＴＳ１をさらに特徴づけると、それはｐ１６および２個のイントロンの全体のコーディング配列を含むことが示された（図５Ａおよび５Ｂおよび図６Ａおよび６Ｂ）。イントロン１は、翻訳開始部位から１２６ｂｐ下流に位置し、イントロン２は翻訳停止部位から１１ｂｐ上流に位置する。これら２個のイントロンは、ＭＴＳ１のコーディング配列を３個の領域、すなわち、１２６ｂｐの５'領域（コーディングエキソン１）、３０７ｂｐの中央領域（コーディングエキソン２）および１１ｂｐの３'領域（コーディングエキソン３）に分割する。配列番号３は、ＭＴＳ１の５'領域、エキソン１およびイントロン１の一部分のヌクレオチド配列を記載する。配列番号４は、ＭＴＳ１のイントロン１の一部分、エキソン２およびイントロン２の一部分のヌクレオチド配列を記載する。ＭＴＳ２は、イントロン２へ約２１１ｂｐであるコーディングエキソン２の５ '末端から伸長するｐ１６とほとんど同一のＤＮＡ配列の領域を含有する（図７Ａ）。しかしながら、配列類似性は、ＭＴＳ２の最終コドンの位置に対応するＭＴＳ１におけるイントロン２の５１ｂｐ下流の地点まで減少する（図８）。ＭＴＳ１およびＭＴＳ２からの配列の比較（図８）は、これら２個の遺伝子の間の配列類似性も、イントロン１の３'スプライシング部位からおよそ４０ヌクレオチド上流に伸長していることを示した。したがって、非コーディングＤＮＡの一部分は、推定コーディングＤＮＡのいくつかの領域より保存的である。コーディングＤＮＡにおける配列ダイバージェンスがクローニング人工産物であるという可能性を除外するために、ＭＴＳ２の配列ダイバージェンス点を横切って特異的に増幅するためにＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーは、コスミド、Ｐ１およびゲノムＤＮＡからの予想された大きさの断片を増幅した。したがって、ＭＴＳ２におけるエキソン２の３'末端の近くに位置する該ダイバージェント配列は、ボナ・ファイド（bona fide）ゲノム配列である。配列番号５は、ＭＴＳ２のイントロン１の一部分、「エキソン２」および「イントロン２」のヌクレオチド配列を記載する。配列番号１５は、ＭＴＳ２のｃＤＮＡ配列を記載する。コスミドｃ５上の２個の深く関連した遺伝子の出現は、他の関連した遺伝子がこの領域に存在することを示唆する。この可能性を調べるために、コスミドｃ５、Ｃ１２、ｃ５９、ｐ１１０６３および１０６０およびヒトゲノムＤＮＡの制限酵素消化物からサザンブロットを調製した。これらのブロットを、ＭＴＳ２と共有する領域を含む、ＭＴＳ１からのエキソン２のほとんどを含有する断片でプローブした。２個のＥｃｏＲＩ断片を、クローニングされたＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの両方においてプローブで検出した。この結果は、ゲノム中の２個のｐ１６様遺伝子であるＭＴＳ１およびＭＴＳ２の存在と一致した。また、それは、今や公知の、ＭＴＳ１含有エキソン２および３（しかしＭＴＳ１のエキソン１ではない）の代替型であるＭＴＳ１Ｅ１βの存在と一致する。実施例７ＭＴＳ１Ｅ１βの単離および構造ＭＴＳ１Ｅ１βの単離完全ＭＴＳ１ｃＤＮＡをプローブとして用い、通常のｃＤＮＡライブラリースクリーニングにより、ハイブリッド選択によりＭＴＳ１Ｅ１βを含有するクローンを単離した。通常のｃＤＮＡライブラリースクリーニングは、ＭＴＳ１のエキソン２由来のプローブを用いて行った。胎児脳、正常な乳房およびリンパ球由来ライブラリーのそれぞれから百万個のクローンをスクリーニングした。ハイブリダイズｃＤＮＡクローンをリンパ球ライブラリーから単離した。該クローンを配列決定し、Ｅ１βを含有することが示された。また、それはＭＴＳ１のエキソン２（Ｅ２）およびエキソン３（Ｅ３）を含有していた。卵巣組織由来のｃＤＮＡをコスミドｃ５とインキュベートすることにより、ハイブリッド選択由来ｃＤＮＡクローンを単離した。該コスミドをビオチンで標識し、一本鎖にした。ｃ５と該ｃＤＮＡとの間のハイブリッドを形成させ、ついでストレプトアビジンで被覆された磁気粒子を用いて、ビオチニル化コスミドを捕らえた。選択されたｃＤＮＡを該コスミドから溶出し、ＰＣＲにより増幅し、クローニングし、配列決定した。該ｃＤＮＡクローンは、Ｅ１β、Ｅ２およびＥ３を含有する点で、ライブラリースクリーニングにより単離されたものと類似していた。該クローンはいずれも、上記のエキソン１（配列番号３参照）を含有していなかった。ＭＴＳ１Ｅ１ β ｃＤＮＡの配列は配列番号１３に記載されている。ＭＴＳ１Ｅ１βの構造ＭＴＳ１およびＭＴＳ１Ｅ１βは２個の形態、すなわち、共にエキソン２および３を利用するが異なる最初のエキソンを有する２個の形態の単一の遺伝子である。ＭＴＳ１は、ＭＴＳ１によりコードされるｐ１６タンパク質の最初の４３個のアミノ酸をコードするα形態（Ｅ１α）を含有する。ＭＴＳ１Ｅ１βは、エキソン１のβ形態（Ｅ１β）を含有する。ｐ１６遺伝子のエキソン構造は、複合ｃＤＮＡクローンの配列を、それが由来するゲノム領域と比較することにより決定した（図１３）。ゲノムサザン、Ｐ１６を含有するゲノム領域の配列分析、および長ＰＣＲを組み合わせて使用して、Ｐ１６エキソンの位置をマッピングした（図１３）。ｐ１６遺伝子はゲノムＤＮＡの約３０ｋｂにわたる。Ｅ１βは、最も５'側の平キソンであり、その順序はＥ１β、Ｅ１α、Ｅ２およびＥ３である。ｐ１６読み枠（エキソン２および３をコードするｐ１６で用いられる読み枠から推定された）におけるＥ１βの翻訳は、Ｅ１βとＥ２との間のスプライシング部位のわずか１０コドン上流に位置する枠内停止コドンを示した。停止コドンの位置はゲノムおよびｃＤＮＡ配列分析により確認された。この停止の下流の最初の潜在的な開始コドンは、Ｅ１／Ｅ２スプライシング部位のちょうど３'側のｐ１６読み枠にあった。この潜在的な開始コドンは、共通コザック（Kozak）配列（コザック（Kozak）、１９８７）によくは似ていない配列に隣接している。ｐ１６読み枠で翻訳されれば、ｐ１６遺伝子のＥ１β転写物は１０５個のアミノ酸のタンパク質をコードするであろう。 βｃＤＮＡの追加的分析によれば、それが、ｐ１６をコードするのに使用されるものより大きなＯＲＦを異なる枠内に有することが示された。該ＯＲＦ（ＯＲＦ２と称する）はＥ１βを通って伸長し、Ｅ２内への６７個のアミノ酸について伸びている。全体のＯＲＦは１８０個のアミノ酸のタンパク質をコードする。しかしながら、読み枠はＥ１βの５'末端で開いたままであり、したがって不完全であるかもしれない。統計学的分析は、この大きさのＯＲＦはランダム配列（Ｐ＝０.００３）よりなるＤＮＡ中では偶然には生じそうにないことを示唆した。しかしながら、β転写物の基本組成が与えられれば、可能性はより高くなった（Ｐ＝０.１６）。予想ポリペプチドはいずれの上記タンパク質とも類似していなかった。Ｅ１βの進化上保存されている部分を同定することは、その機能にどの配列が重要であるかの手掛かりを与えるであろう。ハイブリッド・キャプチャー（Hybr id Capture）ＲＡＣＥ（ＨＣＲ）と称される修飾ＲＡＣＥ技術（実施例１２参照）によりマウスｐ１６ｃＤＮＡを単離し、ヒトｐ１６ｃＤＮＡと比較した。１つの型のマウスＰ１６ｃＤＮＡの（β型）は、ヒトＥ１βと等価のエキソンおよびＥ２等価体を有していた。第２の型（α型）のものは、Ｅ２に結合したＥ１α等価体を含有していた。Ｅ１αおよびＥ２マウスエキソンは、それらのヒト相当物に対して７０％同一であった。マウスのヌクレオチド配列およびヒトＥ１βエキソンは５１％同一であり（図１４）、該マウスＥ１βエキソンもｐ１６をコードするのに使用される読み枠内に停止コドンを含有していた。停止コドンのヌクレオチド配列５'から推定されるヒトおよびマウスポリペプチドは、完全に分岐していた。したがって、ｐ１６読み枠内の停止コドンは配列決定人工産物ではないようである。Ｅ１βの役割に関して不明確であったので、本発明者らは全３個の読み枠内のマウスとヒトβ転写物との間の類似性について分析した。マウスおよびヒトβ転写物は、ｐ１６をコードするのに使用されるもの（ＯＲＦ１）より大きなＯＲＦ（ＯＲＦ２）を異なる読み枠内に含有していた。ＯＲＦ２によりコードされる推定ポリペプチドは４０％同一であった。しかし、ＯＲＦ２ペプチドの比較をＥ１ βによりコードされる部分に限定すると、それらは２８％同一であるにすぎなかった。これとは対照的に、マウスおよびヒトｐ１６配列は６７％同一であった。また、Ｅ２に含有されたＯＲＦ２から推定されたポリペプチドは、Ｅ２内の第３の読み枠（ＯＲＦ３）から推定されたポリペプチドと同様（４２％）に類似していた。これらの結果から、ＯＲＦ２は選択的に維持されず、おそらくタンパク質をコードしないことが示唆される。ヒトおよびマウスβＲＮＡの二次構造についても比較した。著しい類似性は全く確認されなかった。まとめて言うと、これらの結果が示唆するところによれば、β転写物はマウスおよびヒトの両方におけるその存在により、Ｐ１６機能に必要であり、それが翻訳されるならば、コード化タンパク質はおそらくエキソン２中の最初のメチオニンから開始するであろう。実施例８ＭＴＳ１における生殖系列変異ＭＴＳ１またはＭＴＳ２が遺伝感受性遺伝子座であるＭＴＳに対応するか否かを調べるために、ＭＴＳ素因対立遺伝子を担持すると考えられる８個の個体からゲノムＤＮＡを分析した（キャノン−アルブライト（Cannon-Albright）ら、１９９２）。ＭＴＳ１またはＭＴＳ２のいずれかに特異的なイントロン配列由来のオリゴヌクレオチドプライマー（表２）を用いて、該エキソンからのＤＮＡ配列を各サンプルから増幅した。プライマー１Ｆおよび１１０８Ｒを用いてＭＴＳ１のエキソン１を増幅し、ついでプライマー１１０８Ｒを用いて配列決定した。プライマー４２Ｆおよび５５１Ｒを用いてＭＴＳ１のエキソン２を増幅し、ついでプライマー４２Ｆおよび５５１Ｒを用いて配列決定した。プライマー２１Ｆおよび５０Ｒを用いてＭＴＳ２のエキソン２を増幅し、プライマー８９Ｆおよび５０Ｒを用いて再増幅し、ついでプライマー８９Ｆおよび５０Ｒを用いて配列決定した。これらのゲノム断片のＤＮＡ配列は、該８個体のうちの２個体において多形性を示した。残りのサンプルのいずれにおいても多形性は存在しなかったが、これはそれが該集団に共通でないことを示唆するものである。多形性がＭＴＳ染色体に連鎖し残りの相同染色体には連鎖していないことを示すために、各血族からの素因対立遺伝子を担持する他の個体からのゲノムＤＮＡを分析した。それぞれの場合において、多形性は、ＭＴＳ素因対立遺伝子と分離していた。コドン９３の変異（ｇｌｙ→ｔｒｐ）が血族３０１２の個体（１２８２１）に見いだされた。また、それは影響を受けたキャリアー兄弟姉妹（１３１８３）および影響を受けていないキャリアーいとこ（１４９１７）においても見いだされたが、影響を受けていない非キャリアー兄弟姉妹（１３１８４）では見いだされなかった。コドン１１８における変異（ｖａｌ→ａｓｐ）は、血族１７７１における個体（１５６３５）で見いだされた。また、それは一旦除かれた影響を受けたキャリアーの最初のいとこ（１０２０５）、影響を受けたキャリアーの最初のいとこ（１１４１４）および１０２０５の影響を受けたキャリアーの最初のいとこ（１０１４６）においても見いだされたが、１０２０５の影響を受けていない非キャリアーのおじ（１０１２０）では見いだされなかった。該多形性は、アミノ酸変化を起こす単一ヌクレオチド置換であった（表３）。該置換は、小さな親水性残基を大きな疎水性残基に置換すること、または中性アミノ酸を荷電アミノ酸に置換することのいずれかを含むものであった。ＭＴＳ２からのエキソン２は、試験した８個のサンプルにおいて多形性を全く示さなかった。これは、少なくともこの組の血族においては、ＭＴＳ２がメラノーマの素因とならないことを示唆する。ＭＴＳ１との類似性に基づくと、ＭＴＳ２は他の型の癌に含まれている可能性がある。また、ＭＴＳ２が非機能性遺伝子である可能性もある。メラノーマの素因がある個体におけるＭＴＳ１（ＭＴＳ２でなく）における生殖系列変異の知見は、メラノーマホモ接合欠失の分析と一致する。実施例９腫瘍系におけるＭＴＳの存在の分析複数の腫瘍型における９ｐ２１での高頻度の欠失のため、１２個の異なる型の腫瘍から由来する細胞系をＭＴＳ１の存在または非存在について分析した。該遺伝子を横切って広がる一組の配列標識部位（ＳＴＳ）を用いて、期待される断片の存在または非存在について腫瘍細胞系からのゲノムＤＮＡを試験した（図４Ａ、４Ｂおよび９）。この研究の結果は、ＭＴＳ１が大部分の腫瘍系から欠失していることを示唆する（表４）。ホモ接合欠失は、結腸および神経芽腫細胞系以外の試験したすべての腫瘍型において生じ、欠失の割合は最低値である肺癌および白血病における２５％から星状細胞腫における９４％へ変化した。全体では、ホモ接合欠失は試験した２９０個の細胞系のうちの１３５個で検出された。該分析に使用したＳＴＳは全体の遺伝子に及ばないため、この数字は、欠失を有する腫瘍系の割合の最小推定値を与える。このような訳で、ある小さな欠失が検出されなかったのであろう。また、このアプローチでは、少数のヌクレオチドの挿入または欠失、ヌクレオチド置換のような損傷が見逃されるのであろう。ＭＴＳ１変異を含有する細胞系の合計数の評価を向上させるために、ＭＴＳ１における損傷について、ＭＴＳ１の明らかなホモ接合欠失を受けていない３４個の細胞系をより詳細に調べた。ＭＴＳ１コーディング配列の約９７％よりなる配列を増幅し、多形性についてスクリーニングした。３４個のメラノーマのうちの１４個に分布する、ＭＴＳ１のエキソン２またはエキソン１における１８個の体細胞変異を観察した（表５）。これらの変異のうちの３個がフレームシフトであり、７個がナンセンス変異であり、４個がミスセンス変異であり、４個がサイレントであった。また、サイレント変異を含有する４個の系のうちの３個がさらに変異を含有し、１８個の変異のうちの１６個はコーディングエキソン２に位置していた。１個の系の他はすべて専ら半接合またはホモ接合多形性を含有していたが、これは残りの相同染色体が欠失を受けていることを示唆する。ヘテロ接合である単一系は２個の異なる非サイレント変異を含有していたが、これは各相同染色体が独立した変異事象を受けているという見解と一致した知見である。このＤＮＡ配列およびＭＴＳ１の欠失分析に基づき、最小で７５％のメラノーマ系が変異ＭＴＳ１を含有し、両相同染色体からの遺伝子を失っていた。ＭＴＳ１における損傷（欠失およびヌクレオチド置換）の優位性は、ＭＴＳ１または密接に連鎖した遺伝子座が腫瘍表現型に寄与していることを示す。これらの損傷を受ける細胞は、そうでない細胞に対する選択的な優位を享有する。損傷が細胞増殖に無関係な無作為な事象であるという代替的な説明は、種々の理由のために不可能と思われる。第１に、腫瘍表現型とＭＴＳ１における変異との間の深い相互関係は、ＭＴＳ１変異と腫瘍形成との間の因果関係を暗示する。第２に、ＭＴＳ１はメラノーマに対する感受性に影響を与え、したがって腫瘍抑制遺伝子として独立して関連している。第３に、Ｃｄｋの強力な阻害剤としてのｐ１６の生化学的機能は、一般的なＤＮＡ複製の開始の阻害剤としてｐ１６がインビボで作用するモデルにうまく適合する。ＭＴＳ１の変異または喪失が培養中の細胞増殖の産物である可能性がある。しかしながら、高い割合の一次白血病細胞もまた、ＭＴＳ１から５００ｋｂ未満に位置する遺伝子ファミリーである（ディアズ（Diaz）ら、１９９０）α−インターフェロン遺伝子クラスターのホモ接合欠失を含有する。先の欠失研究は、α− インターフェロン遺伝子の欠失が、ＭＴＳ１を越えて動原体まで伸長するマーカーを例外なく含むことを示唆する（ウイーバー（Weaver）−フェルドハウス（Fe ldhaus）ら、１９９４）。ＭＴＳ１領域のホモ接合欠失は一次腫瘍細胞および培養細胞系中に生じるため、腫瘍細胞系中で観察される欠失が培養中の細胞増殖の人工産物である可能性はないと思われる。それでも、腫瘍発達のＭＴＳ変異がいつ生じるかという疑問は、一次腫瘍サンプルを分析することにより最もうまく解明されるであろう。ＭＴＳ１のインビボでの役割すべての真核細胞では、細胞分裂は、ＤＮＡ合成が開始するＧ１からＳへの推移、および有糸分裂が開始するＧ２からＭへの推移の２個の臨界決定点の通過を要する。哺乳動物では、細胞分裂を制御する機構は複数の構成要素を有し、その多くは関連している（検討のためにはシェール（Sherr）、１９９３を参照されたし）。該ＣｄｋはＧ１からＳへの及びＧ２からＭへの推移を起こすいくつかの鍵基質をリン酸化により制御するため、該Ｃｄｋは制御装置の中心部にあるかもしれない。Ｇ１からＳへの推移は、細胞周期の最初に起こるため、おそらく最も臨界的な決定点であろう。これまで、Ｇ１からＳへの制御に関与しているかもしれない４個の型のＣｄｋ（Ｃｄｋ２〜５）、およびこれらのＣｄｋの一組の正の調節体（サイクリンＣ、Ｄ１〜３、Ｅ）が定義されている。また最近、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８、ｐ２０、ｐ２１およびｐ２７を含むいくつかの負の調節体が同定されている（シオン（Xiong）ら、１９９３；セラノ（Serrano）ら、１９９３；グ（Gu）ら、１９９３；エル−ダイアリー（El-Diery）ら、１９９３；ハーパー（Harper）ら、１９９３；ハノン（Hannon）およびビーチ（Beach）、１９９４；ポリアック（Polyak）ら、１９９４ｂ；トヨシマ（Toyoshima）およびハンター（Hunter）、１９９４；グアン（Guan）ら、１９９５）。これらの負の調節体は、ＣＤＫのキナーゼ活性を阻害することにより作用するようである。細胞周期調節体のいくつかはヒトの癌に関連している（検討のためにはハンター（Hunt er）およびパインズ（Pines）、１９９４を参照されたし）。ｐ２０はＣｄｋ２およびおそらく他のＣｄｋを阻害し、一方、ｐ１６（ＭＴＳ１、ＣＤＫＮ２またはＩＮＫ４ａとも称される）はＣｄｋ４を阻害するが、明らかにインビトロ検定ではＣｄｋ２を阻害しない（セラノ（Serrano）ら、１９９３）。インビトロ研究およびｐ５３とのその相互作用に基づき、ｐ２１はすべてのＣｄｋの一般的な阻害剤であると提案されている（シオン（Xiong）ら、１９９３）。したがって、インビトロでは、ｐ１６はｐ２１より特異的であるようである。これらの阻害剤のそれぞれは、Ｓ相へ入るのに拮抗すると予想される。また、シクリンＤ１またはＣＤＫ４は、いくつかの乳癌において過剰発現され、ｐ１６遺伝子は多数の細胞系および一次腫瘍において変異または欠失を受ける（バックリー（Buckley ）ら、１９９３；カルダス（Caldas）ら、１９９４；カンブ（Kamb）ら、１９９４ｂ；モリ（Mori）ら、１９９４；タム（Tam）ら、１９９４ａ）。これらの結果は、あるサイクリンおよびＣＤＫがプロトオンコジーンであり、Ｐ１６（ＭＴＳ１）が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆する。ｐ１５、ｐ１８、ｐ２１およびｐ２７の生化学的挙動はそれらもまた腫瘍抑制剤であり得ることを示すが、腫瘍または細胞系におけるそれらの遺伝子の詳細な変異分析は報告されていない。ここに示した結果は、ＭＴＳ１が細胞分裂の阻害剤としてインビボで機能するという証拠を提供する。ヒト染色体９の９ｐ２１断片に位置するｐ１６遺伝子（ＭＴＳ１）は、幾つかの型の腫瘍および腫瘍由来細胞系の高い割合で変異またはホモ接合的欠失を受けているため特に興味深い（キャルダス（Caldas）ら、１９９４；カンプ（Kamp）ら、１９９４ｂ；モリ（Mori）ら、１９９４；ノボリ（Nobori）ら、１９９４）。また、９ｐ２１連鎖メラノーマ感受性を担持することが知られているいくつかの血族においては、ＭＴＳ１変異はメラノーマの素因と分離する（ハスシアン（ Hussussian）ら、１９９４；カンブ（Kamb）ら、１９９４ａ）。しかしながら、ＭＴＳ１の遺伝および散発性癌における役割に関して未解決の疑問がある。９ｐ２１マーカーについて高いＬＯＤ得点を有するいくつかのメラノーマ傾向血族は、ＭＴＳ１コーディング配列における変異を示さない。また、腫瘍および細胞系におけるＭＴＳ１ホモ接合欠失の優勢は腫瘍抑制遺伝子不活性化については例外的であり、癌形成に関与しているＭＴＳ１近傍のもう１つの遺伝子の存在を暗示する。最近の報告は、いくつかのマイトジェンおよび抗マイトジェンシグナルが、ＣＤＫ阻害剤の活性を調節することにより少なくとも部分的に、細胞周期に影響を与えることを示唆する（フィルポ（Firpo）ら、１９９４；ハノン（Hannon）およびビーチ（Beach）、１９９４；カトウ（Kato）ら、１９９４；ポリアック（P olyak）ら、１９９４ａ；スリンガーランド（Slingerland）ら、１９９４）。例えば、ＴＧＦβ誘導細胞周期停止は、ｐ１５およびｐ２７の活性化により仲介されているかもしれない。逆に、ｐ２７は休止Ｔリンパ球のＩＬ−２誘導マイトジェン活性化の間、負に調節されているかもしれない。ＭＴＳ１の調節については割合にほとんど知られていない。多数の最近の報告は、ＭＴＳ１値がある程度はＲｂタンパク質により調節されているかもしれないという証拠を提供する（セラノ（Serrano）ら、１９９３；リー（Li）ら、１９９４ａ；タム（Tam）ら、１９９４ｂ；パリー（Parry）ら、１９９５）。これらおよび他の知見（セラノ（Ser rano）ら、１９９５）は、ＭＴＳ１がＣＤＫ４／６を阻害し、それによりＲｂのリン酸化を抑制するＭＴＳ１作用のモデルに寄与している。Ｒｂは今度はＭＴＳ１の値を限定するフィードバック回路に寄与している。これらの結果は、細胞周期の制御におけるＭＴＳ１の卓越した役割についての遺伝的証拠を提供する。また、この結果は、ＭＴＳ１のインビボでの標的が腫瘍発生の主要因であることを示唆する。ＭＴＳ１がＣｄｋ２でなくＣｄｋ−４をインビボで阻害するならば、Ｃｄｋ４は癌遺伝子の有力な候補であるかもしれない。ＭＴＳ１遺伝子中の変異の優勢は、Ｃｄｋ４が、ほとんどの（すべてというわけではない）細胞の細胞分裂の一般的な活性化因子として作用していることを暗示する。さらに、ＭＴＳ１の異なるＣｄｋに対する影響の生化学的研究は、正常細胞および形質転換細胞の両方におけるＣｄｋ活性の階層を明確にするのに役立つかもしれない。ｐ１６から類推して、ｐ２１がＣｄｋの一般的な阻害剤として作用するならば、大部分の腫瘍においてその遺伝子は喪失または変異しているかもしれない。ＭＴＳ１がほとんどの正常細胞で活性な一般的な腫瘍抑制剤であるならば、ＭＴＳ１における生殖系列変異はメラノーマ以外の癌の素因となると予想されるであろう。例えば、リー−フラオメニ（Li-Fraumeni）症候群で見られるようなｐ５３における生殖系列変異は、小児肉腫、乳癌を含む多数の腫瘍型の可能性を増加させる（マルキン（Malkin）ら、１９９０）。先の研究で、メラノーマにかかりやすい幾つかの家族において異常に高頻度の膵臓癌が見いだされている（バーグマン（Bergman）ら、１９９０；ナンキャロウ（Nancarrow）ら、１９９３）。この観察は、ＭＴＳ１のホモ接合欠失が膵臓腫瘍系で生じるという知見と一致する。ＭＴＳ１素因の遺伝的特徴は、ＭＴＳ１の体細胞の遺伝的特徴と相違する。例えば、ＭＴＳ１を包囲する領域から多数キロベースのＤＮＡを除く大きな欠失は、選択的な欠点のため、ヒト遺伝子プールから喪失しているかもしれない。しかしながら、かかる欠失は形質転換された体細胞では有利に働くかもしれない。おそらく、それが複数の遺伝子を除去するからであろう。この可能性は、ＭＴＳ２と称される、ＭＴＳ１に対して著しい類似性を有する第２遺伝子の存在と一致している。ＭＴＳ２はＭＴＳ１のエキソン１のおよそ１２ｋｂ上流に位置し、ＭＴＳ２の第１のエキソンは、ＭＴＳ２の第２のエキソンのおよそ２.５ｋｂ上流にある。ＭＴＳ２はＭＴＳ１と同様に機能しているのかもしれない。ＭＴＳ１およびＭＴＳ２の両方を除去する欠失は、一方の遺伝子を単独で不活性化する変異より大きな、細胞に対する増殖利点を付与するのであろう。あるいは、その２個の異なる遺伝子は、非重複的または部分重複的な組の細胞型において機能しているのかもしれない。これらの可能性についての完全な解明が待たれる。実施例１０ＭＴＳ１Ｅ１βの変異分析腫瘍由来細胞系においてＰ１６を不活化するホモ接合性欠失およびＰ１６にて変異を示さない９ｐ２１結合のメラノーマ傾向にある血族が共に優勢であることにより、Ｐ１６付近に癌形成にも関与する別の遺伝子の存在が提案されることとなった（Cairnsら、１９９４；Spruckら、１９９４）。Ｅ１βが細胞増殖の調整に関与するタンパク質をコードするならば、その場合、これらの配列は、初期の研究にて見逃されていたであろう散在性および／または家族性癌のいずれかにて変異を有しうる。そこで、Ｅ１βを、種々の腫瘍に由来する細胞系にて、およびいくらかメラノーマ傾向にある血族にて変異についてスクリーンした。メラノーマ傾向の血族の遺伝特性が既に報告されている（Cannon-Albrightら、１９９２）。ゲノムＤＮＡのメラノーマ傾向の血族（Kambら、１９９４ａ）および細胞系（Liuら、１９９５）からの単離が既に記載されている。Ｅ１βについてのＰＣＲ増幅を、前進性プライマー（５'−ＡＧＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＧ−３'配列番号３３）および復帰性プライマー（５'−ＧＧＣＴＡＧＡＧＧＣＧＡＡＴＴＡＴＣＴＧＴ−３'配列番号３４）を用い、以下の条件：９７℃で３秒間、６５℃で１０秒間、７５℃で２０秒間で３０サイクル行った。増幅反応体を１００倍に希釈し、同一の前進性プライマーおよび復帰性プライマー（５'−ＣＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＧ−３'配列番号３５）を用い、同一反応条件下で再び増幅させた。ＰＣＲ産生物を１％アガロースゲル上に置き、キアゲン・ビーズ（Qiagen bead）（Qiagen,Inc.）を用いて抽出した。該産生物をサイクリスト・シーケンシング・キット（Cyclist Sequencing kit）（ストラタゲン（Stratagene））を用い、前記した前進性プライマー（配列番号３３）で配列決定を行った。４種の腫瘍（表６）に由来する一連の２４細胞系にて、または影響を受けた家族構成員の間で共有する有意なハプロ型を有する６人のメラノーマ血族にて、Ｅ１βの配列変異体は全く検出されなかった（Cannon-Albrightら、１９９２）が、以前の研究においてＰ１６変異を示さなかった（Kambら、１９９４ａ）。これらの実験は、Ｅ１βの変異が腫瘍進行の間での共通事象ではなく、それら変異がこれらの血族における９ｐ２１結合メラノーマ感受性に関与しないことを示唆する。実施例１１ＭＴＳ２の変異スクリーニング細胞系におけるＭＴＳ２変異スクリーニング腫瘍由来細胞系にてＭＴＳ１を除去するホモ接合性欠失が優勢であることは、腫瘍形成にも関与する、ＭＴＳ１の付近にて別の遺伝子または複数の遺伝子が存在することを示唆する。ＭＴＳ２遺伝子が散在性癌に関与しているならば、それは腫瘍源の細胞系にて変異を有するかもしれない。そこで、ＭＴＳ２コーディング配列を一連の腫瘍細胞系における変異についてスクリーンに付した。ＭＴＳ２のエクソン１および２についてのＰＣＲ増幅をKambら（１９９４ａ）の記載に従って行った。プライマー対の２Ｅ１.Ｆ１（５'−ＡＧＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＧＴＴＡＡＧ−３'配列番号１９）および２Ｅ１.Ｒ２（５'−ＡＧＡＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＣ−３'配列番号２０）を用い、エクソン１を得た。プライマー対８９Ｆ（配列番号１２）および５０Ｒ（配列番号１１）を用いてエクソン２を得た。増幅後、ＤＮＡ産生物を１％アガロースゲル上に置き、キアゲン・ビーズ（Qiagen bead）（キアゲン・インコーポレイテッド（Qiagen, Inc.））を用いて抽出した。該産生物をエクソン１についてプライマー２Ｅ１. Ｆ１およびエクソン２について８９Ｆおよび５０Ｒで、サイクリスト・シーケンシング・キット（ストラタゲン）を用いて配列決定した。ＭＴＳ２コーディング配列を、嚢、グリオーム、アストロサイトーム、肺、腎臓およびメラノーマ腫瘍からの一連の細胞系における変異についてスクリーンした。これらの細胞系はすべて、高頻度でＭＴＳ２およびＭＴＳ１のモノ接合性欠失を有した（Kambら、１９９４ｂ）。メラノーマ、肺、腎臓および嚢の癌腫由来の細胞系は、ＭＴＳ１にて点またはフレームシフト変異を有することが明らかにされた（Liuら、１９９５）。しかし、グリオームおよびアストロサイトームの細胞系がこのようなＭＴＳ２変異を有することは明らかにされていない。これらのスクリーニング実験にて用いられる個々の細胞系は、以前に、ＭＴＳ２およびＭＴＳ１配列のモノ接合性欠失を有することが明らかにされていない群より選択した（Kambら、１９９４ｂ）。ＭＴＳ２変異は、スクリーンされた５８細胞系のうちいずれの細胞系のＭＴＳ２コーディング配列においても見られなかった（表７参照）。これらの型の細胞系におけるＭＴＳ１の前の実験に基づいて、そのセットは、嚢、メラノーマ、肺および腎臓群に限定して、約８のＭＴＳ１変異を有すると考えられる（Liuら、１９９５）。かくして、ＭＴＳ２における体細胞変異についての証拠は、この一連の腫瘍細胞系からは得られなかった。血族におけるＭＴＳ２変異スクリーニングＭＴＳ１コーディング配列変異を有しない９ｂ２１結合のメラノーマ傾向の血族において、ＭＴＳ２遺伝子がメラノーマ感受性を説明する可能性のあることは興味のあることである。メラノーマ傾向にある血統の遺伝特徴が既に報告されている（Cannon-Albrightら、１９９２）。家族構成員のゲノムＤＮＡを標準技法（Kambら、１９９４ａ）を用いて全血より分離したリンパ球から単離した。メラノーマにかかりやすい９ｐ２１結合の素因について高ＬＯＤ評点を有するが、前の研究にてＭＴＳ１変異を示さなかった６人の血族にて、前記したように、ＭＴＳ２コーディング配列の変異についてスクリーニングを行った（表８参照）（Ka mbら、１９９４ａ）。ＭＴＳ２における変異は見られなかった。これらの実験は、ＭＴＳ２病変が遺伝性メラノーマに関与するという証拠を提供しないが、そのような可能性は単にこれら限定された実験を基礎とするだけで除外できるものではない。実施例１２ＭＴＳ１およびＭＴＳ１Ｅ１βのＲＮＡの発現２種のＰ１６プロモーター２つの異なる形態のＰ１６ｍＲＮＡが２通りの方法にて生成できた。転写を異なるプロモーターより開始するか、またはｍＲＮＡを単一のプロモーターより誘導し、ついで交互にスプライスし、異なる形態の転写物を生成した。 α転写物およびβ転写物の個々のプロモーターについての証拠が、上流にあるＥ１β配列が欠失されると同時に、α形態が細胞系にて転写されることを測定することで得られた。細胞系Ａ３７５およびＳＫ-mel９３は、Ｅ１αとＥ１βの間の１つの破壊点で欠失を有した（図１３）。近位にある破壊点はいずれの細胞系においても正確にはマップされていないが、Ｅ１βの５'末端の上流少なくとも８５ｋｂであった。α−特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うと、これら細胞系は共にα転写物を発現することが明らかにされた（図１５）。ＲＴ−ＰＣＲの操作は以下のとおりである：ｃＤＮＡをＴ細胞、細胞系またはヒト組織（ Clontech）から単離した全ＲＮＡ（Sambrookら、１９８９）より合成した。ｃＤＮＡ反応はランダムな９ｍｅｒを用い、ＤＮＡ合成およびSuperscriptII逆トランスクリプターゼ（Bethesda Research Laboratories）をプライムした。α−³² Ｐ−ｄＡＴＰ（Amersham）（０.１Ｃｉ／ミリモル）を合成反応に用い、最終産生物に取り込まれた放射活性なヌクレオチドの量を測定することによりｃＤＮＡ収量を算定した。Ｐ１６αおよびＰ１６βの転写物レベルを、連続する２ラウンドの増幅にてＥ２由来のαまたはβ特異的前進性プライマーまたはヘミネスト復帰性プライマーを用い、ＰＣＲにより分析した。最初の増幅にて、２ｎｇのｃＤＮＡをα−特異的プライマーＡＳ.１（５'−ＣＡＡＣＧＣＡＣＣＧＡＡＴＡＧＴＴＡＣＧ−３'配列番号２６）またはβ−特異的プライマーＢＳ.１（５'−ＴＡＣＴＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＧＴＣＴＡ−３'配列番号２７）およびＸ２.Ｒ１４０'（５'−ＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣ−３'配列番号２２）で増幅させた。反応を、以下の反応条件下：９７℃で３秒間；６５℃で１０秒間；７５℃ で２０秒間、２０サイクル、パーキン−エルマイヤー９６００熱サイクラー上で行った。これらの反応物を１００倍に希釈し、ＡＳ.１またはＢＳ.１およびＸ２Ｂ（５'−ＣＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣ−３'配列番号２３）で再び増幅させた。Ｘ２Ｂオリゴを、その５'末端（Sambrookら、１９８９）をγ−³² Ｐ−ｄＡＴＰ（Dupont）で放射標識化した。１５サイクルである以外、ＰＣＲ条件は前記のとおりであった。ゲノムＤＮＡ汚染による問題を排除するのに、ＰＣＲ産生物はＥ１αまたはＥ１β／Ｅ２スプライス接合部をスパンした。該産生物を変性５％ポリアクリルアミドゲルを介し、電気泳動法により分析した。乾燥ゲルをＸ−ＯＭＡＴ（Kodak）フィルムに一夜暴露した。結果はα転写がＥ１βの５'配列と無関係であるプロモーターから開始することを示唆している。別の説明は、欠失が異所性プロモーター配列をＥ１αに融合させたというものである。しかし、Ａ３７５およびＳＫ-mel９３が、独立して細胞系より単離されることはないと考えられる。αプロモーターの正確な位置は明らかでないが、ＲＮase保護分析はそれがＰ１６開始コドンの少なくとも４４０ｂｐ上流で開始していることを示した。かくして、ヒトＰ１６遺伝子は、別個のプロモーター、Ｐ_αおよびＰ_βより産生した、別個の解読ポテンシャルを有する２つの部分的に重複した転写物の複合体である。Ｐ１６の発現パターン遺伝子の機能を解決する糸口は、異なる組織におけるその発現パターンの分析から明らかになるかもしれない。Ｐ１６の発現パターンを測定するのに、１１の組織より調製した一連のｃＤＮＡサンプルをαおよびβ特異的プライマーを用いるＰＣＲによってスクリーンした（図１６Ａ−Ｄ）。両形態のＰ１６転写物を、いくらか違いはあるが、試験したすべての組織にて検出した。例えば、脾臓において、αおよびβ形態の間の割合はβよりであった。反対に、胸部におけるその割合はαに有利であった。これらの発現データは、多くの異なる組織型に由来する細胞系にてＰ１６の欠失および点変異を認める研究データ（Kambら、１９９４ｂ；Liuら、１９９５）と一致し、多数の組織におけるｐ１６についての役割を示唆する。 In vitroにてＣＤＫ４およびＣＤＫ６の阻害剤であると明らかにされている（ Serranoら、１９９３；Liら、１９９４ａ；Parryら、１９９５）、ｐ１６の生化学機能があれば、細胞サイクルをトラバースした細胞として、Ｐ１６の発現を分析した。ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）はフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）＋インターロイキン−２（ＩＬ−２）により刺激され、刺激後の種々の時点で細胞を収穫した。これらの細胞をフローサイトメトリーによりその細胞サイクルの段階を測定し、ＲＴ−ＰＣＲによりＰ１６遺伝子発現の相対的レベルを測定し、ウェスタンブロット法によりｐ１６タンパク質のレベルを測定することにより分析した。末梢血液リンパ球を正常な成人ドナーより流出した血液から単離し、Fi coll-Hypaqueグラジエントにフローテーションさせることにより部分的に精製した（Boyum、１９６８）。リンパ球を前記したように対流傾瀉に付すことでさらに精製した（Elstadら、１９８８）。この方法にて調製した細胞集団は９８％純度のＰおよびＴ細胞であると評価された。該精製細胞を１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ（Gibco）にて増殖させた。休止細胞を１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Sigma）および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Sigma）で誘発させた。細胞サイクルの進行をフローサイトメトリーによりモニター観察した。ＲＮＡをＲＮazol Ｂ（CINNA/BIOTECX Laboratories,Inc.）を用い、一次Ｔ細胞より単離した。ＲＴ −ＰＣＲの定量性を、誘発後に単離されたＴ細胞ｃＤＮＡから一連の希釈体を形成することにより確認した。非希釈サンプル中に存在する標的ｃＤＮＡの量を、標的がもはや増幅し得ない希釈度を測定することにより定量した。種々のＰＣＲ実験からの結果は一致するが、希釈実験により４倍よりも大きいＲＮＡレベルの変化があった場合のみ検出できることがわかった。Ｒｂ⁺およびＲｂ^-細胞系由来のｃＤＮＡサンプルもまたこれを同じ方法にて分析した。ヒト・アクチンは容易に検出され、各ｃＤＮＡサンプル（組織、細胞系またはＴ細胞）中に同様の量にて存在した。Ｐ１６転写物の２種の形態の割合は、細胞サイクルを介して劇的に変化した（図１６Ｂ−Ｃ）。最初、β形態は低濃度であるが、刺激後、３０ないし４０時間までに、そのレベルは上昇し始めた。この間、α形態の発現レベルは、おそらくわずかに上昇しながら、比較的一定を保持した。フローサイトメトリーによれば、割合変化は、Ｇｏを終え、Ｓ期に入る細胞と相互関係にあった。ＲＴ−ＰＣＲの定量性を、鋳型希釈実験により試験した。かかる実験によれば、ＲＴ−ＰＣＲは転写物レベルの４倍またはそれ以上の変化に対して感受性であった。β誘発は少なくとも１０倍であると推定された。したがって、細胞サイクルを受けたＴ細胞として、該細胞はＰ１６転写物の２つの形態の相対量を変化させ、その結果、その割合はβよりに変化した。本発明者らはまた、細胞サイクルをトラバースしたＴ細胞として、Ｐ１６タンパク質発現のレベルを試験した。タンパク質をミトゲン誘発後の種々の時点で細胞より単離し、その単離したタンパク質をウェスタン分析に付した。ｐ１６タンパク質のレベルを完全ポリペプチドの２０Ｃ−末端アミノ酸に対抗して産生されたｐ１６抗体を用いて測定した。Ｇｏを終えた細胞として、ｐ１６タンパク質のレベルは比較的一定であった。かくして、ｐ１６コードＲＮＡ（α転写物）およびｐ１６タンパク質は共に、細胞サイクルの間、比較的一定であった。他に、Ｓ期の間にｐ１６レベルが適度に上昇することが報告されている（Tamら、１９９４ｂ）。種々の細胞型におけるｐ１６調節の違いを反映するか、またはタンパク質（またはｃＤＮＡ）レベルの２ないし３倍増を検出するという問題を反映する、ｐ１６の蓄積は見られなかった。腫瘍細胞系におけるＰ１６の発現今までの研究はＲbがＰ１６の発現に影響を及ぼすと示唆していた（Serranoら、１９９３；Liら、１９９４ａ；Parryら、１９９５）。β ｍＲＮＡの発現についての細胞のＲb状態の効果を試験した（図１６Ｄ）。ｃＤＮＡを一連の細胞系、そのうちの５つは野生型Ｒbタンパク質を有し、そのうちの６つは非機能性Ｒbタンパク質を有する細胞系より調製した（Parryら、１９９５）。予想どおり、α転写物はＲb−陰性系でのみ検出された。しかし、β転写物はＲb−陽性およびＲb−陰性細胞系の両方に存在した。したがって、αと異なり、βＲＮＡの発現は腫瘍由来細胞系におけるＲbの変異状態と無関係である。ｐ１６は多発性遺伝子種の一構成員であると証明されている（Guanら、１９９５）。他の多発性遺伝子種を用いて類推すれば、この種の構成員は余分な機能、異なる機能、または異なる時間または組織特異的パターンにて機能を発揮しているかもしれない。したがって、ｐ１６のレベルが低く、ＲbによるＰ１６調節が明らかに喪失していれば、Ｐ１６がＴリンパ球における細胞サイクルを調整しないことは可能である。しかし、β転写物はＴ細胞誘発時に劇的に誘発され、Ｐ１６は高割合のＴ細胞−誘導腫瘍にて欠失されているため（Hebertら、１９９４）、ｐ１６はヒトＴ細胞にて重要な機能を果たしていると考えられる。ｐ１６に対するＲbの劇的な効果はウイルス形質転換または腫瘍由来の細胞系においてのみ観察された。おそらく、Ｐ１６は、野生型組織中、ある別の方法で調節されているであろう。Ｅ１βはｐ１６の保存かつ調整された部分である β転写物の役割は明らかではないが、結果は：（ｉ）Ｅ１βはマウスにて保存されていること；（ii）β転写物の相対量は組織特異的および細胞−サイクル依存的方法の両方にて調整されること；および（iii）２つの細胞系は、Ｅ１αでなく、Ｅ１βを除去するモノ接合性欠失を有すること；によりｐ１６遺伝子座の機能として重要であることを示唆している。これらの結果はＥ１βが野生型Ｐ１６の機能について要求されることを示唆する。マウスβｃＤＮＡを単離し、ヒトのＭＴＳ１Ｅ１βと比較した。マウスｃＤＮＡクローンを、ハイブリッド捕獲ＲＡＣＥ（ＨＣＲ）と称される修飾ハイブリッド選択操作により単離した。マウスのポリＡ⁺に富むＲＮＡを胸部および胸腺組織より単離した。第１の鎖ｃＤＮＡ合成反応（Sambrookら、１９８９）はランダムな１２ｍｅｒおよびSuperscriptII逆トランスクリプターゼ（Bethesda Resear ch Laboratories）を用いた。第２の鎖合成の後、ｃＤＮＡを、特異的二本鎖オリゴ（ｄｓＲＰ.２）（５'−ＴＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＧＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧＴＴＣ−３'配列番号２８）をその５'末端に連結することにより「アンカー」に付した。第２のｃＤＮＡ鎖の５'末端は連結反応における単なるリン酸化ＤＮＡ末端であった。連結後、そのアンカーｃＤＮＡをSepharoseＣＬ−４Ｂカラム上で分別することにより精製した。アンカーｃＤＮＡをＰ１６特異的復帰性プライマー（５'−ＡＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣ−３'配列番号２９）およびＲＰ.２のネステッド・バージョン（ＲＰ.Ｂ）（５'−ＴＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＣＧＧＣＣＧＴＣＡＴＴＧ−３'配列番号３０）で増幅し、つづいて第１の増幅に用いた復帰性プライマーの上流で、ビオチニル化遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（５'−ＡＣＴＧＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＴＴＣＴＣＣ−３'配列番号３１）で捕獲した。その捕獲ｃＤＮＡをＲＰ.Ｂおよび遺伝子特異的復帰性プライマー（５'−ＧＡＡＣＧＴＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣ−３'配列番号３２）を用い、捕獲オリゴの上流で再び増幅させた。得られた産生物をゲル精製に付し、クローンし、配列決定した。マウスＰ１６オリゴヌクレオチドに対する配列を、低ストリンジェントでヒトＥ２プローブにハイブリッドしている配列を有するマウスゲノムクローンをクローンし、配列決定することにより測定した。マウスβ転写物のヒトのそれとの比較は、Ｅ１βがタンパク質をコードしないことを示唆する。Ｅ２のｐ１６リーディングフレームからなる配列だけが厳格に保存されていた。したがって、β転写物が翻訳された場合、タンパク質はＥ２にて開始され、ｐ１６をコードするのに用いられる同じフレームにて翻訳されたと考えれる。推論ポリペプチドは概算分子量１０ｋＤａを有し、ｐ１６に存在する４アンキリン繰返し単位の２３／４を保持する。しかし、ｐ１５は３１／２アンキリン繰返し単位を有するにすぎず（HannonおよびBeach、１９９４）、他のタンパク質が、１または２の繰返し単位だけで重なり、機能している。ｐ１０分子がin vivoにて存在するかどうか、該分子がＣＤＫ４／６を阻害するかどうか、依然試験されている。βＲＮＡの機能 β転写物の役割が細胞増殖を阻害することにあるとするならば、腫瘍由来細胞系においてＥ１βを分裂させる変異を見つけることができるであろう。Ｅ１βを除去する欠失を有する２つのメラノーマ細胞系がなおα転写物を発現し続けることはこの見解と一致している。ｐ１６コーディング配列は、これら細胞系における野生型である。にもかかわらず、Ｅ１βにて小遺伝障害（例えば、塩基置換）は全く一連の２５腫瘍細胞系において見られなかった。したがって、Ｅ１βがホモ接合性欠失の標的であると結論することは困難である。Ｅ１βエクソンがタンパク質をコードしないならば、小遺伝障害がその機能を崩壊するのに十分ではないであろう。また、前記した欠失の標的はある別の遺伝子であるかもしれない。例えば、ｐ１５遺伝子（ＭＴＳ２）がこれらメラノーマ細胞系にて欠失の関連標的であったことは可能である。この見解において、Ｅ１βは、Ｅ１αよりもＰ１５に近いため、容易に欠失された。しかし、本発明者らは種々の細胞系にてＰ１５点変異を検出できず、特異的にＰ１５を除去した欠失を有する細胞系はないため（Kambら、１９９４ｂ）、この説明は不当であると思われる。遺伝的証拠は、ｐ１６およびＲｂが、腫瘍進行の間にしばしば不活性化される増殖調整経路の構成員であることを示唆する。β転写物の役割が否定的に細胞増殖を調節することであるならば、それはおそらく、ｐ１６およびＲｂと無関係に変異するにちがいない別の経路の部分であろう。このことはＥ１βを特異的に崩壊する欠失が何故Ｒｂ^-細胞系にのみ見られるかを説明するであろう。その発現パターンに基づき、Ｅ１βは細胞を活性的にサイクルさせる役割を果たすようである。Ｅ１βの役割についての限定的結論は、in vivoにおけるその発現の分析を待つばかりである。実施例１３ＭＴＳ２ｍＲＮＡの発現ＲＮazol Ｂ（CINNA／BIOTECX Laboratories,Inc.）を用い、細胞系または一次Ｔ細胞からＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡを全ＲＮＡ（Sambrookら、１９８９）よりランダムな９ｍｅｒを用いて合成し、ＤＮＡ合成をプライムした。ｃＤＮＡ収量を、合成反応におけるα³²Ｐ−ｄＡＴＰ（Amerscham）（０.１Ｃｉ／ミリモル）を含め、最終生成物に取り込まれる放射活性ヌクレオチドの量を測定することにより計算した。ＭＴＳ２発現を連続する２ラウンドの増幅にてヘミネスト復帰性プライマーを用いることにより分析した。最初の増幅にて、２ｎｇのｃＤＮＡをＥ１Ｆ（５'−ＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＧＣ−３'配列番号２１）およびＸ２.Ｒ１４０'（５'−ＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＣ−３'配列番号２２）で増幅させた。該反応を以下の条件下：９７℃で３秒間；６５℃で１０秒間；７５℃で２０秒間、２０サイクルについてPerkin-Elmer ９６００熱サイクラーを用いて行った。これらの反応物を１００倍に希釈し、Ｅ１ＦおよびＸ２Ｂ（５'−ＣＧＴＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣ−３'配列番号２３）で再び増幅させた。Ｘ２Ｂオリゴをその５'末端でγ³²Ｐ−ｄＡＴＰ（DuPont）で放射標識化した（Sambrookら、１９８９）。ＰＣＲ条件は、１５サイクルである以外は、前記と同じであった。得られた産生物を変性５％ポリアクリルアミドゲルを介する電気泳動により分析した。乾燥ゲルを、Ｘ−ＯＭＡＴ（Kodak）に一夜暴露した。異なる組織でのＭＴＳ２発現ＭＴＳ２は、ＭＴＳ２がホモ接合的に欠失されている腫瘍に生じるものを含め、多くの組織型にて発現することが判明した（図１０Ａ参照）。しかし、組織間で相違があった。例えば、ＭＴＳ２転写物は肺組織にて容易に検出されたが、前立腺および脳組織では検出されなかった。対照的に、密接に関連するＭＴＳ１遺伝子の発現は試験した組織すべてに検出された。ＭＴＳ２ＲＮＡレベルにおける組織特異的相違がＭＴＳ２タンパク質についての組織特異的要件を反映しているかどうかわかっていない。細胞サイクルの間のＭＴＳ２発現ＭＴＳ２が細胞サイクルにおける重要な塩基転位を調節するならば、その発現は細胞サイクル中に変化するかもしれない。例えば、正常な分割細胞において、ｐ２１ｍＲＮＡの量は細胞サイクル期の機能に比例して変化する（Liら、１９９４ｂ）。ＭＴＳ２転写が細胞サイクル中に調節されるかどうかを試験するのに、休止ヒト細胞をＰＨＡおよびＩＬ２で剌激し、剌激後の種々の段階でモニターした（図１０Ｂ参照）。Ｇｏを終え、細胞サイクル期を経た細胞のように、ＭＴＳ２発現レベルにおける明白な傾向は何ら見られなかった。反対に、対照遺伝子、ＣＤＫ４の発現は、予想どおりに変化した（Matsushimeら、１９９２）。かくして、正常に分割している細胞のサイクルの間に、ＭＴＳ２ｍＲＮＡが差次的に発現することについての証拠は全く見いだされなかった。ＭＴＳ１タンパク質が、網膜芽腫タンパク質Ｒbが関与する成長調整経路にて関与していると提案されている（Serranoら、１９９３；Guanら、１９９５；Ser ranoら、１９９５）。最近の研究により、ＭＴＳ１の発現が、少なくとも部分的に、Ｒbにより調整されるという見解について、強力な状況証拠が得られた（Liら、１９９４ａ；Parryら、１９９５）。ＭＴＳ１とＭＴＳ２の間の生化学的類似性は、ＭＴＳ２もまた、Ｒbにより調整されることを示唆している。この可能性を、Ｒb陽性細胞系およびＲb陰性細胞系におけるＭＴＳ２ｍＲＮＡのレベルを比較することにより試験した。Ｒbの状態とＭＴＳ２ｍＲＮＡレベルの間に相関関係は何ら見られなかった（図１０Ｃ参照）。このことは、細胞系のＲ bの状態がＭＴＳ２転写物の量に劇的な影響を及ぼさないことを示唆している。かくして、ＭＴＳ１と異なり、ＭＴＳ２発現はＲbと無関係であろう。実施例１４ＭＴＳ１およびＭＴＳ２の異所性発現ＭＴＳ１の４８３塩基対フラグメントを、プライマーＭＴＳ１.Ｆ（５'ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴ３'）（配列番号１７）およびＥ３.Ｒ（５'ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＧＧＧＧＡＴＧＴＣＴＧ３'）（配列番号１８）を用いるポリメラーゼ連鎖反応により生成した。プライマーＭＴＳ１.Ｆは将来のクローニング用に５'末端付近に制限酵素部位およびコダック・コンセンサス配列（Kozak、１９８７）を包含するように設計された。この反応についての鋳型ＤＮＡは胸部組織由来のｃＤＮＡであった。この生成フラグメントを、EcoＲＩおよびBamＨＩで消化された発現ベクターｐｃＤＮＡ３（In Vitrogen）中に挿入した。ｐｃＤＮＡ３はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有し、アンピシリンおよびネオマイシンに対する耐性をコードする。ついで、得られた組換えベクター、ｐｃＤＮＡｐ１６を電気穿孔法により細胞系ＨＳ２９４Ｔに挿入した。ＨＳ２９４Ｔはメラノーマより誘導され、ＭＴＳ１およびＭＴＳ２の両方のホモ接合性欠失を有する。ＨＳ２９４Ｔを１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびＬ−グルタメートを補足した、ＤＭＥＭ（Gi bco）中に増殖させた。該細胞を５％ＣＯ₂中３７℃で増殖させた。ＨＳ２９４Ｔを、１：４の割合の、形質転換細胞に対してヒグロマイシン耐性を付与するｐＳＳ（Stratagene）、およびＣＭＶプロモーターの下流に挿入されたＭＴＳ１コーディング配列を含有するｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）または挿入体を有しないｐｃＤＮＡ３ベクターで共同形質転換した。ＭＴＳ２のコード部を、同様に、ｐｃＤＮＡ３中にクローンし、再びコダック配列を形成させてｐｃＤＮＡｐ１５を得、ＨＳ２９４Ｔ中に挿入した。このために、前記の実施例１３にて調製したＭＴＳ２ｃＤＮＡを用いた。ヒグロマイシン耐性用の選択マーカーを含有するプラスミドｐＳＳ（Stratage ne）を、同時に、ｐｃＤＮＡｐ１６またはｐｃＤＮＡｐ１５と一緒に共同転換させた；ｐＳＳは、電気穿孔にてキュベット当たり２０μｇで存在した。電気穿孔についての条件は、キュベット当たり８００μＬの細胞であり、１.５ｘ１０⁶細胞／ｍｌおよび５００μＦ電気容量、４００ボルトであった。対照実験をｐｃＤＮＡ３＋ｐＳＳを用いて行った。電気穿孔細胞（約４００μＬ）を、ヒグロマイシン３００μｇ／ｍｌと一緒にペトリ皿に入れた。コロニー数（Foci）を１４日後に計数した。結果を表９に示す。ＣＭＶプロモーターに融合した完全なＭＴＳ２コーディング配列を有する構築物がＨＳ２９４Ｔに形質転換された場合、その構築物は、ＭＴＳ１の異所性発現の効果に匹敵する、対照と比較した場合の７つの遺伝因子によりコロニー形成を阻害した。この結果はＭＴＳ２の異所性発現が細胞増殖を阻害するのに十分であることを示唆する。形質転換細胞が、ＭＴＳ１の異所性発現の結果と考えられる、Ｇ１にて阻止されるか、または増殖が他の方法にて阻止されるかどうか明らかでない。（ホモ接合性欠失のため）ｐ１５またはｐ１６発現を欠く細胞系におけるｐ１５またはｐ１６の過剰発現が細胞の増殖を阻害すると結論できる。正確な機構は不明であるが、ｐ１５またはｐ１６の過剰発現が細胞分裂を停止させるか、または細胞を殺す可能性がある。これらの結果はｐ１５およびｐ１６がin vivo にてbona fide腫瘍サプレッサータンパク質として機能し、したがってｐ１５およびｐ１６はおそらく治療的用途を有することを示唆する。多くの理由から、ＭＴＳ２は腫瘍サプレッサー遺伝子として有望な候補である。ＭＴＳ１に類似する広範な配列特性を有し、in vivoにてＣＤＫ機能に結合して阻害し、ＭＴＳ２の異所性発現は、in vivoにおける細胞増殖を阻害する。前記の結果は、ＭＴＳ２とＭＴＳ１の間に生化学的類似性があるにもかかわらず、２つのタンパク質にin vivoにて有意に異なる機能があるという可能性を想起させる。ＭＴＳ２の２つの特徴は、これがその可能性を有すること：ｉ）ＭＴＳ１でなく、ＭＴＳ２がＴＧＦβにより導入されること（HannonおよびBeach、１９９４）およびii）ＭＴＳ１と異なり、ＭＴＳ２転写はＲbと無関係と思われることを示唆する。ＭＴＳ２が腫瘍形成に全く関係しないことは可能である。また、ＭＴＳ２は、ＭＴＳ１の関連する経路とは別の腫瘍抑制の経路に関連しているかもしれない。この経路の要素は知られていないが、これら要素のうちいくつかは体細胞組織におけるＭＴＳ２よりもずっと高い頻度で変異すると考えられる。このことから、ＭＴＳ２の体細胞変異の欠如は決して腫瘍抑制における重要な役割を排除するものではない。前記したように、ＭＴＳ２の異所性発現は細胞増殖を阻害し、ＭＴＳ２の役割は首尾一貫して腫瘍を抑制することにある。細胞サイクルの間にＭＴＳ２発現が一定レベルであること、およびそのＴＧＦβによる誘発は、Ｇ１におけるＭＴＳ２の役割が、必須というわけではないが、細胞サイクルそれ自体の発生の時期の調整を阻止することにあることを示唆する。反対に、Ｒ bによるＭＴＳ１発現の調整は、ＭＴＳ１が細胞サイクルにおけるオシレーターとしての役割を有することを指示する。in vivoにおける増殖調整分子としてのＭＴＳ２の機能を試験することおよびＭＴＳ２が機能する範囲内の経路を吟味することは重要であろう。実施例１５サンプル中のＭＴＳの存在を検出するための２工程検定親サンプルをアントナラキス（Antonarakis）ら（１９８５）によって開示されている方法に従って処理し、１％アガロースゲルを通して分離し、サザーンブロット分析用のナイロン膜に移す。膜をＧＳ・ジン・リンカー（Gene Linker）（Bio-Rad）を用いて１５０ｍＪでＵＶ架橋する。配列番号４のヌクレオチド位置４４８−４９８に対応するＭＴＳプローブをｐＴＺ１８Ｕにサブクローンする。ファージミドをＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（Bio-Rad、リッチモンド、カリフォルニア州）に感染したイー・コリＭＶ１１９０に形質転換させる。一本鎖ＤＮＡを標準操作に従って単離する（Sambrookら、１９８９参照）。ブロットを０.５ＭＮaＰＯ₄の７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中、６５℃で１５〜３０分間、プレハイブリダイズする。該方法はNguyenら、１９９２に記載の方法によるものである。該ブロットを６５℃で、０.５ＭＮaＰＯ₄ の７％ＳＤＳ中、２５〜５０ｎｇ／ｍｌの一本鎖プローブＤＮＡで一夜ハイブリダイズする。ハイブリダイズ後の洗浄は、４０ｍＭＮaＰＯ₄の５％ＳＤＳ中、６５℃で２ｘ３０分間、洗浄し、つづいて４０ｍＭＮaＰＯ₄の１％ＳＤＳ中、６５℃で２ｘ３０分間、洗浄することからなる。次に、該ブロットを、室温で５分間、リン酸緩衝セイライン（ｐＨ６.８）でリンスし、室温で６０分間、ＰＢＳ中０.２％カゼインと共にインキュベートし、ＰＢＳにて５分間リンスする。ついで、該ブロットを、６Ｍ尿素、０.３ＭＮaＣｌおよび５ｘデンハード（Denhard's）溶液からなるハイブリダイゼーション用緩衝液で振盪水浴（４５℃）にて５〜１０分間、プレインキュベートする（ Sambrookら、１９８９参照）。該緩衝液を除去し、５０〜７５μｌ／ｃｍ²の新たなハイブリダイゼーション用緩衝液＋２.５ｎＭの共有結合したオリゴヌクレオチド−アルカリ性ホスファターゼ接合体（ユニバーサルプライマー部位に対して相補的なヌクレオチド配列を有する）（UP-AP、Bio-Rad）と置き換える。該ブロットを４５℃で２０〜３０分間ハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、２ｘ１０分間の洗浄として、６Ｍ尿素、１ｘ標準セイラインシトレート（ＳＳＣ）、０.１％ＳＤＳ中、４５℃で、および１ｘ１０分間の洗浄として、１ｘＳＳＣ、０.１％トリトン（登録商標）Ｘ−１００中にてインキュベートする。該ブロットを室温で１０分間、１ｘＳＳＣでリンスする。ブロットを、室温で振盪しながら１０分間、０.１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭＮgＣｌ₂、０.０２％ナトリウムアジドからなる基質緩衝液（pＨ１０.０）中にインキュベートする。個々のブロットを基質緩衝液および０.２ｍＭＡＭＰＰＤ（３'−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリルオキシ）フェニル−１,２−ジオキセタン・ジナトリウム塩、Bio-Rad）と一緒に熱密封性バックに入れる。室温で振盪しながら２０分間インキュベートした後、過剰のＡＭＰＰＤ溶液を除去する。該ブロットを一夜Ｘ−線フィルムに暴露する。陽性バンドはＭＴＳの存在を示唆する。実施例１６ＭＴＳに対するポリクローナル抗体の生成ＭＴＳコーディング配列の断片をイー・コリにて融合タンパク質として発現させた。過剰発現したタンパク質をゲル溶出により精製し、HarlowおよびLane（１９８８）により記載されている方法に類似する操作に従ってウサギおよびマウスを免疫化するのに用いた。この操作は種々の他のタンパク質に対するＡｂｓを生成すると示されている（例えば、Kreamerら、１９９３参照）。簡単には、ＭＴＳコーディング配列の鎖を、プラスミドＰＥＴ５Ａ（Navagen, Inc.、マディソン、ウィスコンシン州）中、融合タンパク質としてクローンさせた。ＭＴＳを組み入れた配列は、配列番号４の４４８〜４９８に対応するアミノ酸を包含する。ＩＰＴＧで誘発後、予想される分子量を有する融合タンパク質の過剰発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより確認した。融合タンパク質を電気溶出操作によりゲルから精製した。ＭＴＳ融合産生物としてのタンパク質の同定を、Ｎ−末端でのタンパク質配列決定により確認した。次に、精製タンパク質をウサギにおけるイムノゲンとして用いた。ウサギをフロイント完全アジュバント中のタンパク質１００μｇで免疫処理し、３週間の間隔で２回、最初はフロイント不完全アジュバント中のイムノゲン１００μｇ、つづいてＰＢＳ中のイムノゲン１００μ ｇでブーストした。抗体を含有する血清をその２週間後に収集した。この操作を繰り返し、ＭＴＳ遺伝子の変異体に対する抗体を生成する。これらの抗体を、野生型のＭＴＳに対する抗体と共に用い、種々の組織および生物学的流体中の変異体の存在および関連レベルを検出する。実施例１７ＭＴＳについて特異的なモノクローナル抗体の生成モノクローナル抗体を以下のプロトコルに従って生成する。マウスを、グルタルアルデヒドまたはＥＤＣ（周知である）を用いてキーホールリンペットヘモシアニンに結合した無傷のＭＴＳまたはＭＴＳペプチド（野生型または変異体）からなるイムノゲンで免疫化する。イムノゲンをアジュバントと混合する。各マウスに１０ないし１００μｇのイムノゲンを４回注射し、４回目の注射後、血液サンプルをマウスから摂取し、血清が該イムノゲンに対する抗体を有するかどうか測定する。血清力価をＥＬＩＳＡまたはＲＩＡにより測定する。イムノゲンに対する抗体の存在を示す血清を有するマウスを選択し、ハイブリドーマを産生する。脾臓を免疫マウスより摘出し、単一の細胞懸濁液を調製する（HarlowおよびLa ne、１９８８参照）。細胞融合は、本質的にKohlerおよびMilstein、１９７５の記載に従って行う。簡単には、Ｐ３.６５.３ミエローマ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州）を、HarlowおよびLane、１９８８の記載に従って、ポリエチレングリコールを用いて免疫脾臓細胞と融合させる。細胞を２ｘ１０⁵細胞／ウェルの密度で、９６ウェル組織培養プレート上にプレートする。個々のウェルを増殖について試験し、増殖したウェルの上澄を、野生型または変異体ＭＴＳ標的蛋白質を用いるＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによりＭＴＳ特異的抗体の存在についてテストする。陽性ウェルにある細胞を膨張させ、サブクローンして、モノクローン性を確立し、確認する。所望の特異性を有するクローンを膨張させ、マウスにてまたはホローファイバー系中、腹水細胞として増殖させ、特徴付けおよび開発用に検定するのに十分な量の抗体を産生する。実施例１８ＭＴＳについてのサンドウィッチアッセイモノクローナル抗体をプレート、チューブ、ビーズまたは粒子のような固体表面に付着させる。好ましくは、抗体を９６−ウェルのＥＬＩＳＡプレートのウェル表面に付着させる。ＭＴＳペプチド／タンパク質（野生型または変異体）含有の１００μｌのサンプル（例、血清、尿、組織シトゾル）を固相抗体に加える。該サンプルを室温で２時間インキュベートする。次に、サンプル流体をデカントし、該固相を緩衝液で洗浄し、未結合物質を除去する。１００μｌの（ＭＴＳペプチド／タンパク質上の異なる決定因子に対する）第２モノクローナル抗体を該固相に加える。この抗体を検出体分子（例、¹²⁵Ｉ、酵素、フルオロホールまたはクロモホール）で標識化し、該第２抗体を有する固相を室温で２時間インキュベートする。第２抗体をデカントし、該固相を緩衝液で洗浄し、未結合物質を除去する。サンプル中に存在するＭＴＳペプチド／タンパク質の量に比例する結合標識の量を測定する。野生型ＭＴＳに対して特異的なモノクローナル抗体ならびにＭＴＳにて同定された各変異に対して特異的なモノクローナル抗体を用いて、別個のアッセイを行う。本発明の方法および構成は種々の具体的表現の形態にて具体化することができ、そのうちのほんの２、３の具体例を本明細書中に開示するものである。他の具体例が存在し、それが本発明の精神から逸脱するものでないことは当業者にとって明らかである。かくして、記載されている具体例は例示であり、それに限定されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/574 ＺＣ１２Ｐ 21/02 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/574 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号０８／２１５，０８７ (32)優先日 1994年３月18日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／２２７，３６９ (32)優先日 1994年４月14日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／２５１，９３８ (32)優先日 1994年６月１日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スコルニック，マーク・エイチアメリカ合衆国84103ユタ州、ソルト・レイク・シティ、ノース・モント・ウェイ 460番 (72)発明者キャノン−アルブライト，リサ・エイアメリカ合衆国84124ユタ州、ソルト・レイク・シティ、サウス・アイドルワイルド・ロード4653番 (72)発明者カン，アレクサンダーアメリカ合衆国84102ユタ州、ソルト・レイク・シティ、イースト600サウス1103番

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物におけるメラノーマ、目のメラノーマ、白血病、星状膠細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、多発性ミエローマ、肉腫、筋肉腫、胆管癌、有棘細胞癌、ＣＬＬ、ならびに膵臓、胸部、脳、前立腺、膀胱、甲状腺、卵巣、子宮、睾丸、腎臓、胃、結腸ならびに直腸の癌に関する素因に関連した多形性を診断する方法であって、哺乳動物における野生型ＭＴＳ遺伝子にける生殖系統またはその発現産物の変化であって、上記癌への素因を示す変化を検出することを特徴とする方法。２．該ＭＴＳ遺伝子がＭＴＳ１である請求項１の方法。３．該ＭＴＳ遺伝子がＭＴＳ２である請求項１の方法。４．該ＭＴＳ遺伝子がＭＴＳ１Ｅ１βである請求項１の方法。５．該発現産物がＭＴＳ１のｍＲＮＡである請求項１の方法。６．該発現産物がＭＴＳ２のｍＲＮＡである請求項１の方法。７．該発現産物がＭＴＳ１Ｅ１βのｍＲＮＡである請求項１の方法。８．該組織試料由来のｍＲＮＡとＭＴＳ遺伝子プローブとのハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子のｍＲＮＡの変化が検出される請求項５の方法。９．該組織試料由来のｍＲＮＡとＭＴＳ遺伝子プローブとのハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子のｍＲＮＡの変化が検出される請求項６の方法。１０．ＭＴＳ遺伝子の調節領域において変化が検出される請求項１の方法。１１．非変性ポリアクリルアミドゲル上の１本鎖ＤＮＡの電気泳動移動度における変化を観察するこよにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１の方法。１２．該組織から単離されたゲノムＤＮＡに対するＭＴＳ遺伝子プローブのハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１の方法。１３．ＭＴＳ遺伝子プローブが、配列番号：３のヌクレオチド８９１から１０１６までおよび配列番号：４のヌクレオチド１９２から４９８までからなる群より選択されるエキソンにハイブリダイズする請求項１２記載の方法。１４．ＭＴＳ対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１記載の方法。１５．該組織におけるＭＴＳ遺伝子の全部または一部を増幅して増幅配列を得、次いで、増幅配列を配列決定することにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１の方法。１６．特異的ＭＴＳ対立遺伝子に関するＭＴＳ遺伝子の全部または一部を増幅することにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１の方法。１７．該組織におけるＭＴＳ遺伝子の全部または一部を分子クローニングしてクローン化された配列を得、クローン化された配列を配列決定することにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１の方法。１８．分子（１）および（２）を互いにハイブリダイズさせて二重鎖を形成させた場合に、該組織から単離されたＭＴＳ遺伝子ゲノムＤＮＡもしくはＭＴＳｍＲＮＡ（分子（１））とヒト・野生型ＭＴＳ領域ＤＮＡに相補的な核酸プローブ（分子（２））との間のミスマッチを同定することにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１の方法。１９．該組織におけるＭＴＳ遺伝子配列を増幅し、増幅された配列を野生型ＭＴＳ遺伝子配列からなる核酸プローブとハイブリダイゼーションさせることにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１の方法。２０．該組織におけるＭＴＳ遺伝子配列を増幅し、増幅された配列を非野生型ＭＴＳ遺伝子配列からなる核酸プローブとハイブリダイズさせることにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１の方法。２１．欠失突然変異に関するスクリーニングにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１の方法。２２．点突然変異に関するスクリーニングにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１記載の方法。２３．挿入に関するスクリーニングにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１記載の方法。２４．ＭＴＳ遺伝子とＭＴＳ遺伝子からなる核酸プローブとのインサイチュ（ in situ）でのハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子の変化が検出される請求項１記載の方法。２５．発現産物が蛋白分子である請求項１記載の方法。２６．イムノブロットにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求項２５の方法。２７．免疫細胞化学により野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求項２５の方法。２８．該組織から単離されたＭＴＳ遺伝子の蛋白とＣｄｋとの間の結合相互作用をアッセイすることにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求項２５の方法。２９．該ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項２８の方法。３０．Ｃｄｋの生化学的活性の阻害をアッセイすることにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求項２５の方法。３１．該ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項３０の方法。３２．哺乳動物試料における野生型ＭＴＳ遺伝子またはその発現産物、ＭＴＳ遺伝子座から生じる腫瘍形成を示さない野生型遺伝子または発現産物の存在を検出することを特徴とする、哺乳動物におけるＭＴＳ遺伝子座における腫瘍形成の欠如を確認する方法。３３．該ＭＴＳ遺伝子がＭＴＳ１である請求項３２の方法。３４．該ＭＴＳ遺伝子がＭＴＳ２である請求項３２の方法。３５．該発現産物がＭＴＳ１のｍＲＮＡである請求項３２の方法。３６．該発現産物がＭＴＳ２のｍＲＮＡである請求項３２の方法。３７．該組織試料由来のｍＲＮＡとＭＴＳ遺伝子プローブとのハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子のｍＲＮＡが検出される請求項３５の方法。３８．該組織試料由来のｍＲＮＡとＭＴＳ遺伝子プローブとのハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子のｍＲＮＡが検出される請求項３６の方法。３９．ＭＴＳ遺伝子プローブと該組織から単離されたゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子が検出される請求項３２の方法。４０．ＭＴＳ遺伝子プローブが、配列番号：３のヌクレオチド８９１から１０１６までおよび配列番号：４のヌクレオチド１９２から４９８までからなる群より選択されるエキソンにハイブリダイズする請求項３９の方法。４１．該組織におけるＭＴＳ遺伝子のすべてまたは一部を増幅して増幅された配列を得、次いで、増幅された配列を配列決定することにより野生型ＭＴＳ遺伝子が検出される請求項３２の方法。４２．該組織におけるＭＴＳ遺伝子のすべてまたは一部を分子クローニングしてクローン化された配列を得、次いで、クローン化された配列を配列決定することにより野生型ＭＴＳ遺伝子が検出される請求項３２の方法。４３．ＭＴＳ遺伝子とＭＴＳ遺伝子からなる核酸プローブとのインサイチュにおけるハイブリダイゼーションにより野生型ＭＴＳ遺伝子が検出される請求項３２の方法。４４．発現産物が蛋白分子である請求項３２の方法。４５．イムノブロッティングにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求項４４の方法。４６．免疫細胞化学により野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求項４４の方法。４７．該組織から単離されたＭＴＳ遺伝子の蛋白とＣｄｋとの間の結合相互作用をアッセイすることにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求項４４の方法。４８．該ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項４７の方法。４９．Ｃｄｋの生化学的活性の阻害をアッセイすることにより野生型ＭＴＳ遺伝子の蛋白の変化が検出される請求項４４の方法。５０．該ＣｄｋがＣｄｋ４である請求項４９の方法。５１．ヌクレオチド３５３においてＡを有する配列番号：１からなる単離ＤＮＡ。５２．ヌクレオチド２２７においてＴを有する配列番号：１からなる単離ＤＮＡ。５３．ヌクレオチド３５３においてＡを有する配列番号：１からなるＭＴＳ遺伝子の一部にハイブリダイズする、ヒトの変化したＭＴＳ遺伝子配列に相補的な核酸プローブ。５４．ヌクレオチド２７７においてＴを有する配列番号：１からなるＭＴＳ遺伝子の一部にハイブリダイズする、ヒトの変化したＭＴＳ遺伝子配列に相補的な核酸プローブ。５５．請求項５１または５２の単離ＤＮＡおよび宿主細胞において作動するレプリコンからなる、複製するクローニングベクター。５６．適当な調節配列に作動可能に連結された請求項５１または５２の単離ＤＮＡからなる発現系。５７．請求項５５の複製するクローニングベクターで形質転換された組み換え型宿主細胞。５８．請求項５６の発現系で形質転換された組み換え型宿主細胞。５９．ＭＴＳポリペプチドの産生に効果的な条件下で請求項５８の細胞を培養することを特徴とする、組み換え型ＭＴＳポリペプチドの製造方法。