JPH08508735A - ポリペプチドの存在の検出方法及びその変換方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ポリペプチドの検出及び処理方法。成長ホルモンの疎水性誘導体を、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び硫酸アンモニウムのグラジエントを用いた溶出により、その後のペプチド・マッピングにより検出することができる。この誘導体を、成長ホルモンの誘導体をその生来の形態に変換するためにメルカプト化合物により処理することができる。好ましくは、成長ホルモンは、ヒト成長ホルモンであり、そして、メルカプト化合物は、１〜２mMの濃度におけるシステインである。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチドの存在の検出方法及びその変換方法 発明の分野 本発明は、成長ホルモンの疎水性誘導体の存在の検出方法及びその成長ホルモ ンの生来の形態へのその誘導体の変換方法に関する。 発明の背景 ヒト由来及び一般的な家畜由来の成長ホルモンは、下垂体（pituitary gland ）の前葉（anterior lope）から分泌され、そして合成された約191アミノ酸のタ ンパク質である。ヒト成長ホルモンは、22125Ｄの分子量をもつ191アミノ酸から 成る。４つのシステイン残基が存在し、２つのジスルフィド結合を作っている。 Cys（53）とCys（165）との間に形成されたジスルフィド結合は、大きなループ をもたらし、そしてCys（182）とCys（189）との間のジスルフィド結合は、小さ なループをもたらす。 成長ホルモンは、体の成長の調節だけではなく、タンパク質、炭水化物及び脂 質の代謝の調節にも関係する。 成長ホルモンにより影響を受ける臓器系は、骨格、結合組織、筋肉、及び内臓 （viscera）、例えば肝臓、腸、及び腎臓を含む。 例えば現存工業的規模におけるヒト成長ホルモン（hGH）及びMet-hGHの生産を 生じさせる成長ホルモン遺伝子の組換え技術及びクローニングが開発されるまで は、ヒト成長ホルモンは、ヒトの死体の下垂体からの抽出によってのみ得られる ことができた。 成長ホルモンのひじょうに限定された供給は、たとえそれがとりわけ、（成長 ホルモン不全、正常な短身長及びターナー症候群に因 る）短身長の治療、大人における成長ホルモン不全、不妊症、火傷の治療、外傷 治癒、ジストロフィー、骨の癒合、骨粗しょう症、散在性の胃出血、及び偽関節 のために提案されたとしても、その使用を、子供における身長成長促進及びこび と症の治療のための思春期に制限された。 さらに、成長ホルモンは、家畜動物の成長速度の増加、ヒト消費のために屠殺 されるべき動物における脂肪率の減少、及び泌乳動物における乳の生産の増加の ために、提案された。 組換え技術においては、成長ホルモンは、正常には、ヒト成長ホルモンをコー ドする遺伝子であって微生物内に挿入されるものを発現させることにより生産さ れる。次にこの成長ホルモンは、場合によりその微生物を溶解した後にそのブロ スから単離される。hGHを発現させるために最も一般的に使用される宿主は、大 腸菌（E.coli）である。 下垂体から抽出された成長ホルモン又は組換え技術により生産された成長ホル モンは、真正製品との同一性を確保するために好適な標準と常に比較される。 下垂体から抽出されたhGHは、異常形態を検出し、そしてそれらの比活性を測 定するために検査される。成長ホルモンは上述のような分子量をもつけれども、 アミノ酸残基32−46が省かれた変異体一本鎖形態も生産され、いわゆるhGHの20 Ｋ形態をもたらす。この変異体は、そのm-RNAレベルにおける他のスプライシン グの結果である。質量、電荷、再配置、酸化形態、及び分裂形態に関する変異体 も、下垂体から単離されたhGH・調製物中に存在することが記載されている。 新規検定法の開発は、調製物及び標準中にひじょうに少量存在する成長ホルモ ンの誘導体の検出を可能にした。従って、これまで未 知の疎水性不純物は、特殊な条件下で疎水性相互作用クロマトグラフイー（Hydr ophobic Interaction Chromatography（HIC））を使用してヒト成長ホルモン調 製物の精製との結びつきにおいて検出された。この誘導体は、正常には、SDS-PA GE，RP-HPLC，IE-HPLC及びGPCを含むヒト成長ホルモンのサンプルをテストする ために使用された他の方法のいずれかにより又は他の条件下で走らされたHIC法 によっては検出されない。 医薬調製物の調製のために、一般的には、可能な限り純粋な形態で活性成分を 使用することが好ましく、そして、可能であれば、単一成分の化合物である活性 成分を使用することが好ましい。 本明細書中に開示する成長ホルモンの疎水性誘導体の存在の容易な検出方法並 びに成長ホルモンのバッチからそれらの誘導体を除去する方法についての必要性 を見い出すことが望ましい。 物理的な分離技術により上記疎水性誘導体を除去することもできる。しかしな がら、このような手順単独は、活性成分の損失のためにあまり好ましくない。 従って、生来の製品へ成長ホルモンの上記疎水性誘導体を直接的に定量的に変 換することを確保するであろう方法についての必要性も存在する。 発明の簡単な説明 本明細書中に開示するヒト成長ホルモンの疎水性誘導体がクロマトグラフィー 法により容易に検出されることができ、そしてヒト成長ホルモンの生来の形態に 容易に変換されることができることが今般発見された。 従って、第一の態様においては、本発明は、生来の成長ホルモンと比較すると き余分な硫黄原子を含んで成る成長ホルモンの疎水性 誘導体の存在を検出するための方法であって、その成長ホルモンを、硫酸アンモ ニウムのグラジエントを用いてそのカラムを溶出する疎水性相互作用クロマトグ ラフィーに供し、そしてその疎水性誘導体の存在を検出することを特徴とする方 法に関する。 疎水性相互作用クロマトグラフィーは、とりわけ、LC & GC．INTL Vol.5，No. 11（1992）24〜29中に記載されている。 このHICは、FPLC機器内のフェニル・スペロース（phenyl superose）のカラム を用いて行われることができる。便利な機器は、Pharmaciaにより提供されるFPL C機器Phenyl Superose HR 5/5である。 溶出は、好適な塩、例えば硫酸アンモニウム及び／又は酢酸アンモニウムを用 いて行われることができる。 成長ホルモンの疎水性誘導体を含んで成るHICからの溶出液の画分を次に、Cha pter ９ in High Performance Liquid Chromatography in Biotechnology，Edit ed by William S．Hancock，Published by John Wiley & Sons，Inc，1990中に 記載されたようなペプチド・マッピングに供することができる。 成長ホルモンの疎水性誘導体は、保持時間を比較することにより検出されるこ とができる。なぜなら、トリフルフィド結合を含んで成る断片が、ジスルフィド 結合を含んで成る対応断片に比べてより長い保持間をもつからである。 さらなる態様においては、本発明は、成長ホルモンの疎水性誘導体を成長ホル モンの生来の形態に変換する方法に関する。 驚くべきことに、ヒト成長ホルモンの疎水性誘導体が、メルカプト化合物によ りその誘導体を処理することによりその生来の形態に変換されることができるこ とが発見された。この処理は、便利には、溶媒中にヒト成長ホルモンの疎水性誘 導体を含んで成る溶液中で行われる。 このような疎水性誘導体が、メルカプト化合物を用いた穏やかな処理によりそ の生来の形態に直接的に変換されることができることも発見された。従って、こ の変換又は“再折り畳み（refolding）”は、本発明に従って、タンパク質の再 折り畳みについて便利なバッファーを使用するが、タンパク質を再折り畳むとき 正常に頼られるジスルフィド結合を壊すための先行する還元又は変性を伴わずに 、行われることができる。 本発明のさらなる態様に従えば、hGHの疎水性誘導体は、生来のhGHへの変換を 行う前に単離される。 その成長ホルモン誘導体を単離せずにhGHの疎水性誘導体を含んで成る成長ホ ルモンのバッチ全体を直接的に処理することが好ましい。 このメルカプト化合物は、その反応条件下で成長ホルモンに対する有害効果を もたないいずれかのメルカプト化合物であることができる。好ましい化合物は、 生来の成長ホルモン内に存在する硫黄結合の両方を全体として壊すその成長ホル モンの還元を必要とせずに、その成長ホルモン誘導体をその生来の形態に直接的 に変換することができるような化合物である。このメルカプト化合物は、例えば システイン、グルタチオン、２−メルカプト・エタノール又はジチオトレイトー ル（DTT）であることができる。好ましい化合物は、システイン及びグルタチオ ンから成る群から選ばれる。最も好ましいのはシステインである。 このメルカプト化合物は、正常には溶液中、0.1〜５mMの濃度において存在す る。好ましくは、この濃度は、0.5〜３mMの間にある。本発明の好ましい態様に 従えば、この成長ホルモンは、１〜２mMの濃度においてシステインにより処理さ れる。 本文脈中、“成長ホルモン”は、いずれかの起源由来の成長ホル モン、例えばトリ、ウシ、イヌ、ヒト、ヒツジ、ブタ、サケ、マス又はマグロの 成長ホルモン、好ましくはウシ、ヒト又はブタの成長ホルモンであることができ 、ヒト成長ホルモンが最も好ましい。本発明に従って処理されるであろう成長ホ ルモンは、例えば常法により下垂体を抽出することにより天然の源から単離され た成長ホルモン、又は例えばE.B．Jensen and S．Carlsen in Biotech and Bioe ng．36，1-11（1990）中に記載されたような組換え技術により製造された成長ホ ルモンであることができる。好ましい成長ホルモンは、hGHである。 この“成長ホルモン”は、１以上のアミノ酸残基が欠失した成長ホルモンの切 り詰められた形態；その生来の分子内の１以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸 残基、好ましくは天然のアミノ酸残基により置換され、但しその置換が有害効果 、例えば抗原性又は減少作用のいずれをももたないようなそのアナログ；又はそ の誘導体であって、例えば、Ｎ−著しくはＣ−末端伸長、例えばMet-hGH，Met-L ys-hGH，Ala-Glu-hGH，Thr-Glu-Ala-Glu-hGH，Ala-Glu-Ala-Glu-hGH，Met-Glu-A la-Glu-hGH，Met-Phe-Glu-Glu-hGH，Met-Asp-Ala-Asp-hGH，又はMet-Glu-Ala-As p-hGHをもつものであることもできる。 処理されるべき成長ホルモンの誘導体の溶媒を調製するために使用される溶媒 は、例えば５〜10のpHにおいて緩衝化された水性バッファーであることができる 。pH＞６に緩衝化された溶液が好ましい。この溶媒は、好ましくは、トリス、ト リエチルアミン、クエン酸、リン酸塩バッファー、及びヒスチヂンから成る群か ら選ばれ、トリスが好ましいバッファーである。 好ましい緩衝溶液は、20mMトリス及び10mMクエン酸を用いてpH7.5に緩衝化さ れる。 発明の詳細な説明 ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列と、ヒト成長ホルモンの疎水性変異体のアミ ノ酸配列との同一性は、トリプティック・ペプチド・マッピング、すなわち、単 離ペプチド断片のアミノ酸配列分析により決定された。さらに、質量分析が行わ れた。 この質量分析は、生来のhGHと比べたときhGHの疎水性誘導体の32ダルトンの質 量の増加を示した。これは、余分の硫黄原子の存在のせいだとされることができ る。 この疎水性成長ホルモン誘導体の特徴の結果から、この誘導体が、１のジスル フィド結合（Cys53-Cys165）をもち且つ１のトリスルフィド結合（Cys182-S-Cys 189）をもち、そして生来のhGHのアミノ酸配列も同一であるアミノ酸配列をもつ ヒト成長ホルモンであると結論された。 実験パート実施例１ ヒト成長ホルモンの疎水性誘導体の検出 その生来の形態と比べたとき余分な硫黄原子を含んで成る組換えヒト成長ホル モンの疎水性誘導体の存在を、本発明に従って、FPLC機器（Pharmacia）及びPha rmaciaからのPhenyl Superose HR 5/5のカラムを用いて成長ホルモンをHICに供 することにより、検出した。 溶出のために、硫酸アンモニウムのグラジエントを使用する。 このバッファー系は： バッファーＡ： 1.2Ｍ硫酸アンモニウム、20mMトリスpH7.4 バッファーＢ： 20mMトリスpH7.4 使用した化学物質は全てMerck p.aであった。 溶出を以下のグラジエントを使用して行った： 上記バッファーを、0.50ml／分の速度で添加し、そして記録紙の供給速度は0. 50cm／分であった。 疎水性誘導体を含んで成る溶離液の画分を、先に記載したようなペプチド・マ ッピングに供した。ヒト成長ホルモンの疎水性誘導体の別の検出方法 hGHサンプルを、溶出液ＣとＤ並びに30分間の40から50％までの溶出液Ｄのグ ラジエントを使用して周囲温度においてTSK Ether ５PW（75×4.6mmID）カラム 上で分析した。溶出液Ｃ：２M（NH₄）₂SO₄，20mM Na₂HPO₄×２H₂O，pH6.0。溶出 液Ｄ：２mM Na₂HPO₄×２H₂O，0.1％PEG，pH6.0。検出を、280nmにおいて行った 。流速：0.5ml/min。HPLC機器：Data取扱い及び制御：Waters 860 Networking コンピュータ・システム、ポンプ：Waters ポンプ・モデル 510，サンプル・イ ンジェクター：Waters Wisp 712，検出器：Waters M481 分光光度計。 組換えヒト成長ホルモン（rhGH′）の疎水性誘導体を、組換えヒト成長ホルモ ン（rhGH）のペプチド・マッピングにおけるアミノ酸残基179−191に対応するピ ーク７（第７ペプチド）の消失とカップルするピーク８とピーク９との間の新た なピークの出現により同 定した。これらのピークの番号付けは、Chapter ９ in High Performence Liqui d Chromatographi（前掲）中に開示されたものと同じである。ヒト成長ホルモンの疎水性誘導体の単離 hGHのサンプルから疎水性誘導体を単離することが望ましい場合、このような 単離は、先に記載したような手順をスチール・アップすることにより行われるこ とができ、又はこのような単離は、例えばBio/Technology５（1987）161-164中 に記載されたような方法を使用して行われることができる。質量分析によるヒト成長ホルモンの疎水性誘導体の特徴付け 組換えヒト成長ホルモンを、それぞれPlasma Desorption Mass Spectroscopy （PDMS）及びElectro-Spray Mass Spectroscopy （ESMS）により分析した。 上記分析は、無傷のrhGHとrhGH′、並びにそれぞれその対応の７と７′トリプ ティック・ペプチドの差異を検出することに集中した。無傷のrhGHとrhGH′の質量の測定 無傷のrhGHとrhGH′の質量を、API IIILC/MS/MSシステム（Sciex．Thornhill ，Ontario，Canada）を使用して行ったESMSにより分析した。この３連４重極装 置（triple quadropople instrument）は、2400の質量対電荷（m/z）レンジをも ち、そして真空支援エレクトロスプレー（イオン・スプレーともいう）インター フェース（Ｐ１，Ｐ１）を装備されていた。サンプル導入を、0.5−１μｌ／分 における液体流速設定によりフューズド・キャピラリー（内径75μｍ）を通して シリンジ注入ポンプ（Sage Instruments，Cambridge，MA）により行った。この 機器のm/zスケールを、ユニット分解（unit resolution）下ポリ（プロピレン・ グリコール）（PPG'S）の１価の電 荷のアンモニウム付加物イオンにより換算した。質量測定の精度は、一般的に0. 02％よりもよいが、低強度スペクトルは、より低い精度の質量測定をもたらすこ とができる。 プラズマ脱着質量分析（PDMS）分析を、BIO-ION 20K 252-Californian time o f flight機器（ABI Nordic A/S，Uppsala，Sweden）を使用して行った。（DTTを 用いたその場の還元を含む）サンプル適用の標準的な手順及び分析を行った（Ｐ ３，Ｐ４）。質量測定の精度は、約0.1％であった。 分析前に、rhGHとrhGH′の両方を、Sep-pak（Watersからの固定相Ｃ₁₈）上で 脱塩した。rhGH′は、rhGHと比べたとき31±２amuの質量の増加を示した。DTTを 用いて還元した後は、rhGH′の質量は、還元されたhGHについて計算された質量 と同一である。 これらの結果を以下の表Ｉ中に示す。 rhGHとrhGH′のトリプティック断片番号７の質量の測定 rhGHとrhGH′のトリプティック断片番号７、それぞれ７と７′断片の質量をPD MSにより測定した。この７断片は、rhGHのトリプティック・ペプチド・マッピン グから生じる。 １mg/mlの濃度におけるhGHを、４℃において24時間、50mMトリス、２mM CaCl₂ ，６H₂0，pH7.8に対して透析した。１mlの１mM HCl，２mM CaCl₂・６H₂O当り１m gのトリプシン（ウシ，DPCC処理，SigmaからのＴ−1005）を溶解することにより 調製された10μｌのトリプシ ン溶液の10μｌを、１mgのhGH当りに添加した。この消化を37℃において６時間 行った。消化生成物を、RP-HPLCを使用して分析した（25μｌ）：カラム：Nucle osil RPC18，250×４mm，120Å，７u（Macherey-Nagel，Art．720042。検出：21 5nm流速：１ml/分。溶出液Ｅ：水中0.05％（vol/vol）TFA，溶出液Ｆ：水中70％ アクリロニトリル中0.05％（vol/vol）TFA。グラジエント：０から70％溶出液Ｆ 60分間。次に、このグラジエントを５分間100％Ｆへ変更し、その後100％Ｆにお ける10分間のイソクラティック溶離を行った。このグラジエントを１分間０％Ｆ まで戻し、そしてこのカラムを次のランの前に15分間平衡化した。 トリプティック解裂により作られたrhGHの７断片は、1401の計算質量及び以下 の式（Ｉ） をもつ。 ７と７′ペプチドの間の32amuの質量における差異が観察される。DTTを用いた 還元の後、この７と７′ペプチドの両方について同一の質量が発見され、これは 、その還元されたペプチドについての計算された質量に対応する。 結果を以下の表II中に示す。 ７′断片は、先に記載したようなトリプシン消化物のRP-HPLCによる新たなピ ークに対応する画分を集めることにより単離された。 PDMS分析と組合された部分的エドマン分解並びにESMSを、７′断片上で直接 的に行った。４段階を通して、その切り詰められたペプチドを分析することによ り手動分解をトレースすることができた。各段階において、２つのアミノ酸残基 を解裂させた（各Ｎ−末端からのもの）。７と７′ペプチドの間の32amuの質量 における差異は、これらの４つの解裂の間には変更されなかった。 ESMSによるMS/MS分析は、そのペプチドのＮ−末端部分に関連するイオン化配 列の１シリーズを与えた。このMS/MSは、質量717amu及び２電荷をもつ７′ペプ チドの分子イオンを使用して行われた。“上鎖（upper chain）”の断片化（fra gmentation）は、m/z 1320，1221、及び1094に頂上（tops）を生じ、一方、“下 鎖（lower chain）”の断片化は、m/z 1247，1118，1061、及び974に頂上を生じ た。結論は、システイン残基までの、各“鎖”内の最初の４アミノ酸残基が正常 な質量を示すということである。 従って、rhGHとrhGH′との間の32amuの質量における差異は、正常なジスルフ ィドに対してトリスルフィドの存在のためであると推定される。hGH′における余分の硫黄の存在の証明 トリスルフィド結合の存在を、以下に記載するように酢酸鉛を使 用して証明した。 以下に記載するようなシステインによるrhGH′の処理は、rhGH′を生来のrhGH に変換することが証明され、その間に、硫化水素の顕出が検出された。 濾紙（Whatmanガラス微細繊維フィルター）を、蒸留水中の酢酸鉛の0.1M溶液 中に浸漬し、そして風乾した。 以下の表III中に掲げるような内容物をもつ６つの試験管を調製した。 試験管を、以下の表IV中に掲げるような２シリーズに分けた。 シリーズＩの全試験管に、2.5mlの蒸留水を添加した。 シリーズIIの全試験管に、蒸留水中2.5mMシステインの2.5mlを添加した。 濾紙を６片（直径3.5cmの輪型（ronbels））に切断し、そして上記８つの試験 管の上に置いた。この輪型を、２〜３滴の蒸留水を添加することによりモニター し、そしてこれらの試験管を、40℃において24時間放置した。 24時間後、これらの濾紙輪型を検査した。水を添加された試験管 について変化は全く見られなかった。 システインを添加された試験管４と６上の濾紙上に、ひじょうに僅かな茶色の 着色が観察された。 試験管５上の濾紙は、硫化鉛の形成に帰される濃い黒色スポットを示した。こ の黒色スポットは、10〜15分後に現れた。実施例２ 生来のヒト成長ホルモンへのヒト成長ホルモンの疎水性誘導体の変換 rhGH′を含んで成るサンプルから凍結乾燥されたrhGHを、生来のhGHへhGHの疎 水性誘導体を変換するために、以下のように処理した。 Ａ：４IU hGHを2.5mlの蒸留水中に溶解した。 Ｂ：４IU hGHを2.5mlの蒸留水中に溶解し、その後、周囲温度において10分間1 00μｌのメルカプトエタノールを使用して還元した。次に、得られた混合物を、 （Pharmacia，Sephadex G 25からの）PD10を使用して20mMトリス、pH8.6に脱塩 した。この溶液を、４℃において２時間放置し、そして実施例１中に記載したよ うに疎水性相互作用クロマトグラフィーにより分析した。 Ｃ：４IU hGHを、20mMトリス、pH8.6の2.5ml中に溶解した。この溶液を、４℃ において２時間放置し、そして実施例１中に記載したように疎水性相互作用クロ マトグラフィーにより分析した。 Ｄ：12IU hGHを、WO 92/03477中に開示されたような再折り畳みバッファーの7 .5ml中に溶解させた：20mMトリス、２mM EDTA，２mMシステイン。この溶液は、 ４℃において２時間放置し、そして実施例１中に記載したように疎水性相互作用 クロマトグラフィーにより分析した。次にサンプルを２mM His，pH6.5中に脱塩 し、そして実施例１中に記載したように疎水性相互作用クロマトグラフィーによ り 分析した。 これらの結果は、弱く還元性であるが有効なジスルフィド形成を保証する上記 折り畳みバッファー中の再溶解が、生来のrhGHへのrhGH′の変換を引き起こすと いうことを示す。 水又はトリス、pH8.5中への再溶解は、変換を引き起こさない（サンプルＡ及 びＣ）。このrhGH′が、均一化の前に（２硫化水素の存在を伴わずに）大腸菌（E.Coli ）中にある形態と同一のhGHの形態を与えるメルカプトエタノールを使用 して完全に還元される場合、正しい折り畳みは、システインの添加を伴わずにト リス、pH8.5中に得られることができる（サンプルＢ）。 先に示したように、rhGH′は、２mMシステインの存在中生来へのhGHへ形質転 換されることができる。アミノ末端伸長をもつ前駆体としての発現rhGHがDAP1を 用いて解裂されるとき、この解裂は、正しいジスルフィド結合をもつ生来の生成 物の形成を強化するシステインを含んで成る媒質中に存在することができる。 この場合においては、変換及び解裂は、好適には、２段階において行われ、最 初に、この疎水性誘導体を変換するための高いpHにおいて行われ、その後、この pHは、そのアミノ末端の伸長の解裂を行うために低下される。 塩化物イオンを含んで成る20mMトリスpH7.5，10mMクエン酸中の４℃における 正常な精製における第一精製段階からの4.5mlの溶出液に、蒸留水中20mMのシス テイン溶液の0.5mlを添加した。 サンプルを、１，２，４，８，16，32及び64分後に取り出し、NAP-５カラム（ Pharmacia）を使用してその製造者の指示に従って脱塩して、25mMトリスにより 溶出した。溶出後、このpHを7.5に調整し、そして７′ペプチドの内容物を、実 施例１中に記載したように疎水性相互作用クロマトグラフィーにより行った。１ 分後、７′タン パク質に対応するピークは、〜75％程減少され、そして４分後、その頂上は、全 体的に消失した。従って、７′タンパク質は、４℃４分間の２mMシステインによ る処理により生来のタンパク質に定量的に変換されることができる。 次に、このpHを、それが存在する場合に、伸長物を解裂するために４−4.5に 調整した。実施例３ 生来のヒト成長ホルモンへのヒト成長ホルモンの疎水性誘導体の変換 折り畳み実験を、異なるpH（4.3，6.0，7.5）において２mM Cysの濃度により 行った。出発材料としてhGH′を含むhGHを使用した。１mlの出発材料（濃度0.7m g/ml）を、選択pHに調整し、そして１ml４mM EDTA，４mM Cys，40mM トリス、20 mMクエン酸と混合した。さまざまな間隔でサンプルを取り出し、そして直ちに、 上記のような選択pHに調整された20mMトリス、10mMクエン酸に対してNAP-５カラ ム（Pharmacia）上で脱塩した。HIC分析を、実施例1中で最初に述べたシステム を使用して行った。 周囲温度において行われた実験の結果は、以下のようなものであつた： 出発材料は、８％のhGH′含量をもっていた。 pH4.3においては、hGH′含量は、４分後に7.7％に減少され、そしてさらに一 夜放置されたサンプルは、６％のhGH′含量をもっていた。 pH6.0においては、hGH′の含量は、４分後に6.0％に減少され、そして64分後 に1.7％まで減少された。20時間後、hGH′は全く検出されなかった。 pH7.5においては、hGH′の含量は、ひじょうに速く減少された 。１分後に2.6％まで、２分後に1.6％まで減少され、そして４分後、hGH′は全 く検出されなかった。 ４℃の温度及びpH7.3における変換実施の結果は、以下のようであった： ２分後、hGH′の含量は2.5％に、4分後、１％まで減少され、そして８分後、h GH′は全く検出されることができなかった。 この結果は、上記変換が、7.5のpHにおいては速く且つ定量的に進行し、そし てより低いpHにおいてはより遅く且つ不完全に進行することを示している。 温度の影響は、ほとんど重要ではない。 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名称：Novo Nordisk A/S （Ｂ）街：Novo Alle （Ｃ）市：DK-2880 Bagsvaerd （Ｅ）国：Denmark （Ｇ）電話：＋45 44448888 （Ｈ）ファックス：＋45 44490555 （Ｉ）テレックス：37173 （ii）発明の名称：ポリペプチドの存在の検出及びその変換方法 （iii）配列の数：２ （iv）コンピュータ読込み形態： （Ａ）媒質タイプ：フロッピー・ディスク （Ｂ）コンピュータ：IBM PC互換 （Ｃ）オペレーティング・システム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア：Patentln Release♯1.0，Version♯1.25 （EPO） （ｖ）最近出願データ： 出願番号： （vi）先の出願データ： （Ａ）出願番号：DK 0445/93 （Ｂ）出願日：20-APR-1993 （２）配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （iii）ハイポセティカル：No （iv）アンチ−センス：No （ｖ）フラグメント型：内部 （xi）配列： （２）配列番号：２の情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/74 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/74 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＶ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．成長ホルモンの疎水性誘導体をその成長ホルモンの生来の形態に変換する 方法であって、その成長ホルモンの誘導体をメルカプト化合物により処理する方 法。 ２．メルカプト化合物が、システイン及びグルタチオン、２−メルカプト・エ タノール並びにジチオトレイトールから成る群から選ばれる、請求項１に記載の 方法。 ３．メルカプト化合物がシステインである、請求項２に記載の方法。 ４．メルカプト化合物の濃度が５mMまでである、請求項１〜３のいずれかに記 載の方法。 ５．メルカプト化合物が、１〜２mMの濃度におけるシステインである、請求項 ４に記載の方法。 ６．成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求項１〜５のいずれかに記載 の方法。 ７．その生来の成長ホルモンと比較したとき余分の硫黄原子を含んで成る成長 ホルモンの疎水性誘導体の存在を検出する方法であって、その成長ホルモンを疎 水性相互作用クロマトグラフィーに供して、塩グラジエントによりそのカラムを 溶出し、そしてその疎水性誘導体の存在を検出することを特徴とする方法。