JPH08506240A

JPH08506240A - ヒトセロトニン受容体（５−ｈｔ▲４ｂ▼）をコードするｄｎａ及びその使用

Info

Publication number: JPH08506240A
Application number: JP6511402A
Authority: JP
Inventors: バード、ジョナサン・エイ; ブランチェック、テレサ; ウエインスハンク、リチャード・エル
Original assignee: シナプティック・ファーマスーティカル・コーポレーション
Priority date: 1992-11-03
Filing date: 1993-10-29
Publication date: 1996-07-09
Also published as: GR950300029T1; AU5590994A; US5985585A; NO951689L; WO1994009828A1; US6376243B1; FI111337B; CA2127117A1; US6083749A; KR950704001A; ES2070104T1; EP0624100B1; FI952094A; US6432655B1; DE624100T1; EP0624100A4; FI952094A0; EP0624100A1; DE69328549T2; HUT72837A

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離された核酸分子およびヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離された核酸分子、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体である単離されたタンパク、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離された核酸分子を具備するベクター、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離された核酸分子を具備するベクター、このようなベクターを具備する哺乳動物細胞、該５−ＨＴ_4B受容体に向けられた抗体、哺乳動物若しくはヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸を検出するために有効な核酸プローブ、哺乳動物若しくはヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子の何れかの配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に関連した薬剤組成物を提供する。本発明は更に、リガンドの結合を検出すること、発現を検出すること、薬剤のスクリーニング、およびヒト５−ＨＴ_4B受容体に関連した異常を緩和するための治療を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトセロトニン受容体（５−ＨＴ _4B）をコードするＤＮＡ及びその使用〔発明の背景〕この出願の全体を通して、括弧内の部分的な引用により種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の完全な記述は、明細書の最後、即ち請求の範囲の直前に見出しうる。これら刊行物の開示は全体として、本発明が属する技術の状態をより完全に記述するために、参照としてこの出願に組み込まれる。この出願、即ちヒトセロトニン受容体（５−ＨＴ_4B）をコードするＤＮＡ及びその使用の主発明は、ＩＵＰＨＡＲの「セロトニン受容体命名委員会」によって「５−ＨＴ₇」と改名された「５−ＨＴ_4B」受容体に関する。従って、５−ＨＴ₄ _B 受容体及び５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子に直接又は間接に関連する全てのクレームは、５−ＨＴ₇受容体および５−ＨＴ₇受容体をコードする核酸分子も包含する。一次アミノ酸配列およびシグナルトランスダクションデーター（signal trans duction data）は、４種のクローン化された５−ＨＴ₁様受容体、３種のクローン化された５−ＨＴ₂受容体、および１種の５−ＨＴ₃受容体が現在確認されている。これらの受容体の配列相同性並びにシグナルトランスダクシヨン経路（signal transduction pathway）の分析により、これらの属性に基づいたグループ分けができる。５−ＨＴ₁サブファミリーは、５−ＨＴ₁ _A （Fargin，1988；Kobilka，1989）、５−ＨＴ_1B／５−ＨＴ_1Dβ（Weinshank e t al.，1991など）、５−ＨＴ_1Dα（Branchek et ａl.，1992；Hamblin and Met calf，1991；Weinshank et al.，1992）、５−ＨＴ_1E（Levyet ａl.，1992；McA llister et ａｌ.，1992，Zgombi-ck et al.，1992）および５ＨＴ_1F（Adham e t al.，1993）を含む。これらのサブタイプは、＞５０％のトランスメンブランアミノ酸の同一性を有し、アデニレートシクラーゼの阻害に結びつけれられる。５−ＨＴ₂ファミリーには、５−ＨＴ₂受容体（Pritchett et al.，1988）、５− ＨＴ_1c（Juliuset al.，1989）、および５−ＨＴ_2F（ラット胃基底部；Foquet e t al.，1992；Kursar etａl.，1992）が含まれる。これらの受容体は、＞７０％のアミノ酸の相同性を有し、ホスフィノイノシチド加水分解に結びつけられる。５−ＨＴ₃受容体は、リガンド依存性イオンチャンネルであることが示されている（Maricqet al.，1991）。他のリガンド依存性イオンチャンネルは十分な異質性を示すが、５−ＨＴ₃受容体の異質性については議論の余地がある。このシリーズから明らかに欠失しているのが５−ＨＴ₄受容体である。組織からのセカンドメッセンジャーカップリングの研究で、シグナルトランスダクションの一次形態（primary mode）としてアデニレートシクラーゼの活性化が示された（Dumiuset al.，1988；Bockaert etal.，1990）。我々は、アデニレートシクラーゼ活性の刺激に結びつけられる初めての哺乳動物５−ＨＴ受容体（これを我々は５−ＨＴ_4Bと命名することを提案する。）のクローニングを報告する。この受容体の薬理学的な性質は、ブタ大動脈（Trevethick et al.，198 4）、ネコ伏在静脈、冠状動脈（Cushing and Cohen，1992）において説明された一連の機能的に同定されている５−ＨＴ受容体、および幾つかの血管拡張作用（ Mylecharane and Phillips1989）と同様である。これらの受容体は、アンギーナ、冠状動脈疾患、アテローム硬化症、および発作となりうる大脳血管障害における治療の利益の可能性を示す単離された血管における収縮および弛緩応答の基礎となるように思われる。ＣＮＳにこのサブタイプがあることは、より高い認識過程の疾患並びに自立神経性の機能の制御に使用できる可能性も示唆する。〔本発明の概要〕本発明は、哺乳動物５−ＴＨ_4B受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明の好ましい態様では、単離された核酸分子は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする。本発明の他の態様では、該核酸分子は、ｐｃＥＸＶ−５−ＨＴ_4B （ＡＴＣＣ受付番号第７５３３２）と称されるプラスミドを含有する。本発明は、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子の配列の範囲に含まれる配列と特異的にハイブリダイズできる少なくとも１５のヌクレオチドよりなる核酸分子を含有する核酸プローブを提供する。本発明はまた、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子の配列の範囲に含まれる配列と特異的にハイブリダイズできる少なくとも１５のヌクレオチドよりなる核酸分子を提供する。本発明は、ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害するような哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡ分子に特異的に結合することができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害するようなヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡ分子に特異的に結合することができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体に向けられたモノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に対するモノクローナル抗体を提供する。本発明は、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現でもたらされる異常を緩和するのに効果的な量の物質および薬剤的に許容しうる担体を含有する薬剤組成物、並びに哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過少発現で起こる異常を緩和するのに有効な量の物質および薬剤的に許容しうる担体を含有する薬剤組成物を提供する。本発明は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現で起こる異常を緩和するのに有効な量の物質及び薬剤的に許容しうる担体を含有する薬剤組成物を提供する。本発明はまた、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過少発現で起こる異常を緩和するのに有効な量の物質及び薬剤的に許容しうる担体を含有する薬剤組成物を提供する。本発明は、そのゲノムが哺乳動物５−ＨＴ_4BをコードするＤＮＡを含有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、該ＤＮＡが、哺乳動物５−ＨＴ_4B 受容体をコードするｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスｍＲＮＡ中に転写されるようにゲノムの範囲内に位置され、該相補的なｍＲＮＡが、哺乳動物５− ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズされたとき、該相補的なｍＲＮＡが、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡの翻訳を低下させるものを提供する。本発明はまた、そのゲノムがヒト５−ＨＴ_4BをコードするＤＮＡを含有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、該ＤＮＡが、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写されるようにゲノムの範囲内に位置され、該アンチセンスｍＲＮＡが、ヒト５−ＨＴ_4B 受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズされたとき、該相補的なｍＲＮＡが、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡの翻訳を低下させるものを提供する。本発明は、そのゲノムが、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを含有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、該ＤＮＡが、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡに相補的であるアンチセンスｍＲＮＡに転写されるようにゲノムの範囲内に位置され、該アンチセンスｍＲＮＡが、該５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズされたとき、これによって該アンチセンスｍＲＮＡが、５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡの翻訳を妨害するものを提供する。本発明はまた、そのゲノムが、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを含有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、該ＤＮＡが、ヒト５− ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡに相補的であるアンチセンスｍＲＮＡに転写されるようにゲノムの範囲内に位置され、該アンチセンスｍＲＮＡが、ヒト５− ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズされたとき、該アンチセンスｍＲＮＡが、これによって５−ＨＴ_4B受容体の翻訳を妨害するものを提供する。本発明は、細胞表面の哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体と特異的に相互作用して結合する薬剤を同定するために薬剤をスクリーニングする方法であって、哺乳動物５ −ＨＴ_4B受容体をコードする単離されたＤＮＡを含有する哺乳動物細胞（これによって発現されたタンパクが細胞表面に発現される。）を複数の薬剤と接触させ、該哺乳動物細胞に結合するこれらの薬剤を決定し、これによって哺乳動物５− ＨＴ_4B受容体に特異的に相互作用し、結合する薬剤を同定する方法を提供する。本発明は、細胞表面上のヒト５−ＨＴ_4B受容体と特異的に相互作用して結合する薬剤を同定するために薬剤をスクリーニングする方法であって、ヒト５−ＨＴ_4B 受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞（これによってコードされたタンパクが細胞表面上に発現される。）を複数の薬剤と接触し、該哺乳動物細胞と結合するこれらの薬剤を決定し、これによってヒト５−ＨＴ_4B受容体と特異的に相互作用し、結合する薬剤を同定することを具備した方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を種々のレベルで発現することの生理学的影響を決定するための方法であって、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体発現を調節する誘導プロモータの使用により哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体発現のレベルが変化する、ヒト以外のトランスジェニック動物を製造することを具備した方法を提供する。本発明はまた、ヒト５−ＨＴ_4B受容体を種々のレベルで発現することの生理学的影響を決定するための方法であって、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を調節する誘導プロモータの使用によりヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現のレベルが変化するヒト以外のトランスジェニック動物を製造することを具備した方法を提供する。本発明は更に、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を種々のレベルで発現することの生理学的影響を決定するための方法であって、夫々が異なった量の哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック動物のパネルを製造することを具備した方法を提供する。本発明は更に、ヒト５−ＨＴ_4B受容体を種々のレベルで発現することの生理学的影響を決定するための方法であって、夫々が異なった量のヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック動物のパネルを製造することを具備した方法を提供する。本発明は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体対立遺伝子の発現に伴う疾患の疾病素因を診断するための方法であって、ａ）疾患に履患している対象（subjects）のＤＮＡを得ること；ｂ）制限酵素のパネルで該ＤＮＡの制限消化を行うこと；ｃ）得られたＤＮＡフラグメントをサイジングゲル上で電気泳動的に分離すること；ｄ）この得られたゲルを、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡと特異的にハイブリダイズでき且つ検出マーカーでラベルされた核酸プローブに接触させること；ｅ）検出マーカーでラベルされたヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡにハイブリダイズした標識バンドを検出し、該疾患に履患した対象のＤＮＡに特異的な独特のバンドパターンを形成すること；ｆ）ステップａ〜ｅによる診断のために、得られたＤＮＡを調製すること；およびｇ）ステップｅで得られた前記疾患に履患している対象のＤＮＡに特異的な独特のバンドパターンと、ステップｆで診断のために得られたＤＮＡのバンドパターンとを比較し、これらパターンが同一であるか又は異なっているかを決定し、これによって、パターンが同一であれば該疾患の疾病素因ありと診断することを具備した方法を提供する。本発明は、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体に結合しうることが知られていない物質であるかどうかを決定するための方法であって、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞と該物質とを、５−ＨＴ_4B受容体に結合することが知られている物質を結合する条件下で接触すること、５−ＨＴ_4B受容体に結合される任意の物質の存在を検出すること、およびこれによって、該物質が５−ＨＴ_4B受容体に結合するか否かを決定することを具備した方法を提供する。本発明は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に結合できることが知られていない物質が、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に結合できるか否かを決定するための方法であって、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子を含有する哺乳動物細胞と該物質とを、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に結合することが知られている物質を結合する条件下で接触させること、５−ＨＴ_4B受容体に結合された任意の物質を検出すること、およびこれによって該物質が、５−ＨＴ_4B受容体に結合するか否かを決定することを具備した方法を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１：新規なヒト５−ＨＴ_4Bセロトニン受容体のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列。ヌクレオチドは、５’から３’の方向で示されており、コード領域は、開始メチオニンから出発して終止コドンで終わるように番号がふられている。長い読み取り枠による推定アミノ酸配列が、５’および３’の翻訳されない領域と共に示されている。左右の余白の数字は、ヌクレオチド（上の行）およびアミノ酸（下の行）の番号を表し、最初の位置が、それぞれアデノシン（Ａ）および開始メチオニン（Ｍ）で開始されている。図２：ヒト５−ＨＴ_4B受容体クローン（ｈｐ７８ａと称される）と５ＨＴ_1A、５ＨＴ_1Dα 、５ＨＴ_1Dβ、５ＨＴ_1E、および５ＨＴ_1Fとの配列アライメントである。出発のメチオニン（Ｍ）から終止コドン（＊）までのヒト５−ＨＴ_4B受容体（第一行）の推定アミノ酸配列は、ヒト５ＨＴ_1Aセロトニン受容体クローン（Kobilka et al.，1987）、５ＨＴ_1Dαセロトニン受容体クローン（Hamblin et al.，1991 ；Wein-shank et al.，1992；Demchyshyn et al.，1992）、５ＨＴ_1Dβセロトニン受容体クローン（Jin et al.，1992；Weinshank et al.，1992）、５ＨＴ_1Eセロトニン受容体クローン（Zgombick et al.，1992；Mc-Allister et al.，1992 ）、および５ＨＴ_1Fセロトニン受容体クローン（Adham et al.，提出中）と共に並べられている。ハイフンは、完全なアライメントに対して必要な追加のスペースを表す。灰色の影は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体と同一な受容体クローン中の残基を示す。アミノ酸配列上の番号は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体のアミノ酸の位置に対応し、開始メチオニン（Ｍ）から始まって終止コドン（＊）で終了し、完全なアライメントを明らかにするためのスペースを含む。図３：５−ＨＴ_4B受容体遺伝子をコードするｍＲＮＡのヒト組織分布。種々のヒト組織から単離された全ＲＮＡは、逆転写酵素を用いたランダムプライミングによって一本鎖ＤＮＡに変換された。ｃＤＮＡは、機能的ｈｐ７８ａに特異的なＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ生成物は、１．５％アガロースゲルにかけられ、ナイロン膜上にブロッティングされ、内部の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた。陽性対照は、遺伝子特異的な組換えプラスミドよりなる；ｄＨ₂Ｏは陰性対照として用いられた。逆転写酵素で処理されないＲＮＡサンプルのＰＣＲ増幅およびサザンンブロッティングは陰性であった。図４：クローニングされたヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現する、一時的に形質導入されたＣｏｓ−７細胞中における５−ＨＴによってもたらされるｃＡＭＰ酸性の刺激。完全な細胞のｃＡＭＰ測定は、方法と材料で説明したとおりである。これらのデータポイントは少なくとも他の２つを代表する単独の実験を３回繰り返したものの平均を表す。垂直の棒は、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。データは、放出されたｃＡＭＰを基にしたパーセントとして示されている（基底、０．０５３±０．００４ pmol/ml/１０分）。図５：クローニングされたヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現する、一時的に形質導入されたＣｏｓ−７細胞中における５−ＣＴによってもたらされるｃＡＭＰ酸性の刺激。完全な細胞のｃＡＭＰ測定は、方法と材料で説明したとおりである。これらのデータポイントは少なくとも他の２つを代表する単独の実験を３回繰り返したものの平均を表す。垂直の棒は、Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。データは、放出されたｃＡＭＰを基にしたパーセントとして示されている（基底、０．０５３±０．００４pmol/ml/１０分）。〔発明の詳細な説明〕本発明は、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明は更に、ヒト５−ＴＨ_4B受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。ここで用いる「単離された核酸分子」の語は、天然に存在しない核酸分子、即ち天然に存在しない形態の分子を意味する。このような単離された核酸分子の例は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又は哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体又はヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離されたゲノミックＤＮＡである。ここで使用される「５−ＨＴ_4B受容体」は、生理学的条件下で、神経伝達物質セロトニンに対して実質的に特異的であり、飽和でき、セロトニンに対して高い親和性を有し、アデニレートシクラーゼの活性と関連した活性を有する分子を意味する。本発明の一態様は、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離された核酸分子である。他の好ましい態様は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離された核酸分子である。このような分子は、図１に示されたコーディング配列と実質的に同じコーディング配列を有しうる。図１のＤＮＡ分子は（配列番号１）、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の配列をコードする。哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を単離する１つの手段は、当該技術で周知の方法を用いて、天然または人工的にデザインされたＤＮＡプローブで哺乳動物のゲノミックライブラリーをプロービングすることである。本発明の好ましい態様では、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体は、ヒトタンパクであり、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子は、ヒトゲノミックライブラリーおよびヒトｃＤＮＡライブラリーから単離される。ショウジョウバエ（Drosophila）セロトニン受容体遺伝子ＤＲＯ５ＨＴＲから誘導されるオーバーラッピング膜内外オリゴヌクレオチドプローブは、この目的のための有効なプローブである。ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子は、ヒト、哺乳動物若しくは他の動物源から相補的ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを得るために使用されるか、または以下に詳細に説明する方法を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノミックライブラリーのスクリーニングによって関連するｃＤＮＡクローンまたはゲノミッククローンを単離するために使用され得る。これによって、単離されたクローンの５ ′非翻訳領域からの転写調節因子が得られ、また単離された遺伝子の３′および５′非翻訳領域からの他の安定性決定領域、プロセッシング決定領域、転写決定領域、翻訳決定領域および組織特異性決定領域が得られる。本発明は、正常な５−ＨＴ_4B受容体活性を有する分子をコードできないように突然変異され、且つ本来の５−ＨＴ_4B受容体を発現しない単離された核酸分子を提供する。本発明で提供される突然変異された核酸分子の例は、転写ＲＮＡがタンパクに翻訳されないようにコーディング配列に挿入されたインフレーム（in-frame）終止コドンを有する単離された核酸分子である。本発明は更に、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡ分子であって、該ｃＤＮＡ分子が、図１（配列番号１）に示されるコーディング配列と実質的に同様なコーディング配列を有する分子を提供する。本発明はまた、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡ分子であって、該ｃＤＮＡ分子が、図１（配列番号１）に示されたコーディング配列と実質的に同様であるコーディング配列を有する分子を提供する。これらの分子およびこれたらの等価体は、上記の手段によって得られる。本発明はまた、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体である単離されたタンパクを提供する。本発明の好ましい態様では、該タンパクは、図１（配列番号１および２）に示されたアミノ酸配列と実質的に同様なアミノ酸配列を有するヒト５−ＨＴ_4B受容体タンパクである。本発明の他の態様では、該タンパクは、図１（配列番号１および２）に示されるアミノ酸配列と実質的に同様のアミノ酸配列を有するネズミ５−ＨＴ_4B受容体タンパクである。ここで使用される「単離されたタンパク」の語は、他の細胞性成分を含まないタンパク分子を包含することを意図している。単離された哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体タンパクを得るための１つの手段は、当業者に周知の方法を用いて、バクテリア、酵母、または哺乳動物細胞のような適切なホスト中で、５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを発現し、該ＤＮＡがこのようなホスト中で発現された後に、再度当該技術で周知の方法を用いて受容体タンパクを回収することである。該受容体はまた、これを発現する細胞、特に、以下で更に詳細に説明される発現ベクターで形質導入された細胞からも単離される。本発明は、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡのような単離された核酸分子を具備するベクターを提供する。本発明は更に、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡのような単離された核酸分子を具備するベクターを提供する。ベクターの例には、バクテリオファージ（λファージを含むがこれに限定されない。）、動物ウイルス（バキュロウイルス、ネズミ白血病ウイルス、およびヘルペスウイルスが含まれるがこれらに限定されない。）、コスミド、プラスミド（ニュージャージー州ピスキャタウエイのファルマシア社から入手可能なｐＵＣ１８のようなもの。）および他の組換えベクターである。核酸分子は、当業者に周知の方法によってベクターゲノムに挿入される。このようなプラスミドの例は、図１（配列番号１）に示されるコーディング配列と実質的に同様なコーディング配列を有するｃＤＮＡを具備したプラスミドであり、ＡＴＴＣ受付番号７５３３２として寄託されたクローンｐｃＥＸＶ−５ＨＴ_4Bと称される。他の方法として、これらのベクターを得るためには、挿入ＤＮＡとベクターＤＮＡの両者を一つの制限酵素で処理し、両方の分子に塩基対が相互に相補的である末端を生成させ、次いでリガーゼで連結すればよい。或いは、ベクターＤＮＡの制限酵素部位に対応するリンカーを挿入ＤＮＡに連結し、次いで該部位で切断する制限酵素で消化してもよい。他の手段を用いることも可能である。本発明はまた、バクテリア細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞における発現に適合した哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子を具備するベクターおよびヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子を具備したベクターであって、更に、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡまたはヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを発現するように、これらのＤＮＡに対して相対的に配置された、前記バクテリア、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞内での前記ＤＮＡの発現のために必要な調節要素を具備するベクターを提供する。図１に示されるコーディング配列と実質的に同じコーディング配列を有するＤＮＡは、ヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現するこれらのベクターに有効に挿入されうる。発現に必要な調節要素は、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモータ配列およびリボゾームに結合するための転写開始配列を含有する。例えば、バクテリア発現ベクターにはｌａｃプロモータのようなプロモータと、転写開始のためのシャイン・ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧとが含まれる（Mani atis，et al.，Mole-cular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，1982）。同様に、真核細胞発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼのための異種または同種プロモータ、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧおよびリボゾーム脱離のための終止コドンが含まれる。更に、組換えバキュロウイルスのような昆虫細胞発現ベクターは、昆虫細胞中に挿入された遺伝子の発現のための多角形遺伝子（polyhedringene）を使用する。このようなベクターは、商業的に入手可能でありうるか、または当該技術において周知の方法、例えば一般にベクターを構築するための上記方法によって、記述された配列から組み立ててもよい。発現ベクターは、該受容体を発現する細胞を製造するために有用である。このような細胞の一定の使用について、以下により詳細に説明する。本発明の一態様では、プラスミドは、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または特に哺乳動物細胞における発現に適している。該プラスミドは、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子若しくはヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子、および、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡまたはヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを発現するように、これらのＤＮＡに対して相対的に配置された、該バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞中のＤＮＡの発現に必要な調節要素を具備する。適切なプラスミドには、哺乳動物細胞、例えばＥＶＪＢ、ＥＸＶ−３中の発現に適したプラスミドが含まれうるが、これらに限定されない。哺乳動物細胞中での発現に適したこのようなプラスミドの例は、図１（配列番号１）に示されるコーディング配列と実質的に同様なコーディング配列を有するｃＤＮＡ、および哺乳動物細胞中の該ＤＮＡの発現に必要な調節要素を具備したプラスミドである。このプラスミドは、ｐｃＥＸＶ−５ −ＨＴ_4Bと称され、ＡＴＣＣ受付番号７５３３２として寄託された。当業者であれば、哺乳動物またはヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ及びこのようなＤＮＡを哺乳動物細胞内で発現するために必要な調節要素を具備した哺乳動物細胞内での発現に適用される多くのプラスミが、現存するプラスミドを利用して、これを前記ＤＮＡの哺乳動物細胞内での発現に必要な調節要素を適切に含ませるために適用することによって構築され得ることを容易に認めるであろう。該プラスミドは、発現ベクターおよび一般のベクターについて説明した上記方法によって、並びに当該技術において周知の他の方法によって構築され得る。上記で述べた寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、これを満たすように、メリーランド州２０８５２ロックウイル１２３０１パークローンドライブのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に対して行なわれた。本発明は、哺乳動物細胞内での発現に適合したプラスミドを具備する哺乳動物細胞のような哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子を具備する哺乳動物細胞であって、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子および哺乳動物細胞内での前記ＤＮＡの発現のために必要な、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡに対してその発現を可能とするように相対的に配置された調節要素とを具備した哺乳動物細胞を提供する。本発明は、哺乳動物細胞内での発現に適合したプラスミドを具備する哺乳動物細胞のようなヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子を具備する哺乳動物細胞であって、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子および哺乳動物細胞内での前記ＤＮＡの発現のために必要な、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡに対してその発現を可能とするように相対的に配置された調節要素とを具備した哺乳動物細胞を提供する。マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、Ｃｏｓ細胞等を含む多くの哺乳動物細胞が、ホストとして用いられ得る。上述したような発現ベクターは、リン酸カルシウム沈殿法のような当該技術で周知の方法によって哺乳動物細胞を形質導入するために使用されうる。また、さもなければ、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを、例えばマイクロインジェクション法によって哺乳動物に挿入し、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ若しくはプラスミド）を具備した哺乳動物細胞を得ることができる。プラスミドｐｃＥＸＶ−５ＨＴ_4Bを具備し、発現するＬＭ（ｔＫ−）細胞は、上記のＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ１１１６６が付与された。本発明は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子の配列内に含まれる配列、例えば図１（配列番号１）に示される配列の範囲内に含まれるコーディング配列と特異的にハイブリダイズできる少なくとも１５の核酸分子を含有する核酸プローブを提供する。ここで使用される「特異的にハイブリダイズする」という語句は、核酸分子がそれ自身の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を認識し、相補的な塩基対の間の水素結合を介して二重螺旋セグメントを形成する能力を意味する。核酸プローブ技術は当業者に周知であり、該当業者は、このようなプローブはその長さが大きく変化し得ること、および該プローブの検出を容易にするために放射性アイソトープまたは蛍光色素のような検出ラベルで標識され得ることを容易に理解するであろう。ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸の検出は、５−ＨＴ_4B受容体の発現のレベルが変化される任意の疾患プロセスに対する診断テストとして有用である。ＤＮＡプローブ分子は、全て当該技術において周知の方法を用いて、５−ＨＴ_4B受容体またはこれらのフラグメントをコードするＤＮＡ分子を、プラスミド若しくはバクテリオファージのような適切なベクターに挿入し、次いでこれを適切なバクテリアホスト細胞に挿入し、ＤＮＡプローブを複製および回収することによって製造される。例えば、該ＤＮＡは、該ＤＮＡのフェノール若しくはエタノールを用いて細胞溶解物から抽出され、既述したベクター中への該ＤＮＡの挿入部位に対応する制限酵素で消化され、電気泳動され、得られたゲルから切り出され得る。このようなＤＮＡ分子の例は図１に示されている。該プローブは、「insitu」のハイブリダイゼーション又はこの遺伝子ファミリーを発現する組織の位置を捜し出すために有用であるか、または種々の生物学的組織におけるこれら遺伝子若しくはそのｍＲＮＡの存在を調べるための他のハイブリダイゼーションアッセイのために有用である。加えて、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子の配列に相補的であるか、またはヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子の配列に相補的な合成オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ合成機で製造されたもの）は、これら遺伝子若しくはその関連ｍＲＮＡのプローブとして有用であり、或いはゲノム若しくはｃＤＮＡライブラリーの相同性スクリーニングによる関連遺伝子の単離またはポリメラーゼ・チェーン反応のような増幅技術を用いることによる関連遺伝子の単離のために有用である。本発明はまた、５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡの存在を検出ことによる細胞表面のヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を検出する方法を提供する。本発明は更に、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡの存在を検出することによる細胞表面の哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の発現を検出する方法を提供する。これらの方法は、当該技術において周知の方法を用いて細胞から全ｍＲＮＡを得、そのようにして得られたｍＲＮＡを、ハイブリダイズする条件下で上記のような核酸プローブと接触させ、該プローブにハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を検出し、これによって細胞による該受容体の発現を検出することを具備する。ｍＲＮＡ分子のような標的核酸分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当該技術で周知の技術を用いる。しかし、本発明の一態様では、核酸は溶解された細胞から沈殿によって抽出され、ｍＲＮＡが、該ｍＲＮＡ分子のポリＡ−尾部を結合するカラムを用いて該抽出物から単離される（Maniatis，T．etal.，Molecular Cloning；Cold Spring Harbo rLaboratory，pp．197-98（1982））。次いで、該ｍＲＮＡはニトロセルロース膜上の放射能でラベルされたプローブに曝され、該プローブは相補的なｍＲＮＡ配列にハイブリダイズし、これをラベルする。結合は、オートラジオグラフィー又はシンチレーション計数によって検出され得る。しかし、これらのステップを実行するための他の方法が当業者に周知であり、上記の議論は単なる例に過ぎない。本発明は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡ分子の何れかの配列と特異的に結合してヒト５−ＨＴ_4B受容体の翻訳を妨害することができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はまた、哺乳動物５− ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡ分子の何れかの配列と特異的に結合して、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の翻訳を妨げることができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。ここで使用される「特異的に結合する」という語句は、核酸配列がそれ自身に相補的である核酸分子を認識し、相補的な塩基対の間の水素結合を介して二重螺旋セグメントを形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を意味する。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その配列が図１に示されているｃＤＮＡの何れかの配列と特異的に結合できる配列を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特別な例は、ヌクレオチドの化学的類似体を具備するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明はまた、細胞膜を通過し、細胞内の５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡと特異的に結合し、その翻訳を妨げることによってヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を低下させるのに効果的な上記オリゴヌクレオチドの有効量と、細胞膜を通過できる薬剤的に許容しうる疎水性の担体とを含有する薬剤組成物を提供する。本発明は更に、細胞膜を通過し、細胞内の哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡと特異的に結合し、その翻訳を妨げることによって哺乳動物５−ＨＴ_4B 受容体の発現を低下させるのに効果的な上記オリゴヌクレオチドの有効量と、細胞膜を通過できる薬剤的に許容しうる疎水性の担体とを含有する薬剤組成物を提供する。ここで使用される「薬剤的に許容しうる担体」の語には、リン酸塩で緩衝された生理食塩水、水、および油／水若しくは水／油エマルジョンのようなエマルジョン、並びに種々のタイプの湿潤剤のような何れかの標準的な薬剤担体が包含される。該オリゴヌクレオチドは、リボザイムのようなｍＲＮＡを不活性化する物質にカップリングしうる。細胞膜を通過することができる薬剤的に許容しうる疎水性担体も、選択された細胞のタイプに特異的なトランスポーターに結合し、これによって選択された細胞タイプの細胞によって取り込まれる構造を具備し得る。該構造は、細胞タイプに特異的なトランスポーターに結合することが知られたタンパク（例えば膵臓細胞を標的とするインスリン分子）の一部であり得る。図１に示したコーディング配列と実質的に同じコーディング配列を有するＤＮＡ分子は、この薬剤組成物のオリゴヌクレオチドとして使用され得る。本発明は、５−ＨＴ_4B受容体の発現を低下させることによって緩和される異常を治療する方法を提供する。この方法は、対象による５−ＨＴ_4B受容体の発現を低下するのに効果的な上記薬剤組成物の有効量を対象に投与することを具備する。本発明は更に、５−ＨＴ_4B受容体活性に関連した異常症状を治療する方法であって、対象による５−ＨＴ_4Bの発現を低下させるのに効果的な上記薬剤組成物の所定量を対象に投与することを具備した方法を提供する。このような異常症状の例には、アンギーナ、冠状動脈疾患、アテローム硬化症、および発作となりうる大脳血管障害、過敏性の腸の症候群（irritable bowel syndrome）若しくは他の消化器部分の疾患、ＣＮＳ疾患、痛みの感知、感情の疾患、精神分裂症を含む（但しこれに限定されない）より高度の認識的過程の疾患、並びに自律神経作用のコントロールがある。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害する。合成アンチセンスオリゴヌクレオチド、または他のアンチセンス化学構造は、５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡに結合し、５−ＨＴ_4B受容体の翻訳を阻害するように設計され、患者内の５−ＨＴ_4B受容体の発現を阻害する薬剤として有効である。本発明は、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B 受容体の発現レベルを、該５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害する合成アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤（ＳＡＯＤ）を使用することによって、治療的に変更するための手段を提供する。ｍＲＮＡを認識して選択的に結合するように設計された合成アンチセンスオリゴヌクレオチド、または他のアンチセンス化学構造は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的に修飾された人工核酸の図１に示したヌクレオチド配列の一部に対して相補的であるように構築される。このＳＡＯＤは、注射によって患者に投与するために、血流中で安定であるように設計される。或いは、患者から取り出した細胞に対して投与するために、実験室における細胞培養条件において安定であるように設計される。ＳＡＯＤは、細胞の細胞質内に入り込むことを目的として、細胞膜を透過できるように設計される。ＳＡＯＤの細胞質内への入り込みは、該ＳＡＯＤの細胞膜を透過可能とする物理的および化学的性質（例えば、小さい疎水性ＳＡＯＤ化学構造を設計することにより達成される）によって、或いは該ＳＡＯＤを認識してこれを細胞内に輸送する細胞内の特異的な輸送系によって可能になる。加えて、このＳＡＯＤは一定の選択された細胞ポピュレーションにだけ投与されるように設計され得る。これは、ＳＡＯＤを狙い撃ちする細胞の特異的な取り込みメカニズム、即ち、該ＳＡＯＤに結合してこれを一定の選択された細胞ポピュレーション内にのみ取り込むメカニズムが、該ＳＡＯＤを認識することによって達成される。例えば、ＳＡＯＤは、上記のように一定の細胞タイプにのみ見出されるトランスポーターと結合するように設計され得る。ＳＡＯＤはまた、標的ｍＲＮＡ配列（図１に示した配列内に含まれる配列に対応し得る）を認識し、該ｍＲＮＡに対する相補的な塩基対によってこれに選択的に結合するように設計される。結局のところ、このＳＡＯＤは次の三つのメカニズムの何れかによって、標的ｍＲＮＡ配列を不活性化するように設計される：１）標的ｍＲＮＡに結合して、ＲＮＡｓｅＩ消化のような固有の細胞メカニズムにより該ｍＲＮＡの分解を誘発させる；２）翻訳調節因子またはリボゾームの結合を妨害することにより、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する；３）リボザイム配列または反応性化学基のような、標的ｍＲＮＡを分解しまたは化学的に修飾する他の化学構造を含める。合成アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、ｍＲＮＡ標的に向けられたとき、上記の特性を発揮できることが示されている（J．S．Cohen，Trends in Pharm．Sci．10 ，435（1989）；H．M．Weintraub，Sci．Am．January（1990）p.40）。加えて、リボザイムをアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることは、標的ｍＲＮＡを不活性化するための有望な戦略である（N．Sarver et al.，Science 247，1 222（1990））。注射によって患者に投与されるように設計されれば、或いは患者の標的細胞を取り出し、実験室でＳＡＯＤで処理して患者に移植されれば、ＳＡＯＤは効果的な治療剤として働く。この方法において、ＳＡＯＤは、５−ＨＴ_4B 受容体の発現低下によって利益を受ける何れかの臨床的症状において、患者の特定の標的細胞における５−ＨＴ_4B受容体の発現を低下させるための治療として役立つ。本発明は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に向けられた抗体を提供する。本発明はまた、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体に向けられた抗体を提供する。この抗体は、例えば、細胞表面に存在するヒト５−ＨＴ_4B受容体のエピトープであって、且つ図１に示したアミノ酸配列に含まれるヒト５−ＨＴ_4B受容体の細胞表面エピトープのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するエピトープに向けられたモノクローナル抗体を具備する。アミノ酸配列は、これによって構築れるタンパク中に疎水性または親水性領域を生成するか否かを決定するために、当業者において周知の方法により分析される。水性環境下においては、細胞膜タンパクの場合、親水性領域が細胞表面に位置する一方、疎水性領域は細胞膜の脂質二重層内に挿入されるタンパク部分を形成することが周知である。従って、図１に示した親水性アミノ酸配列に対する抗体は、上記のように、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の表面エピトープに結合するであろう。このヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体に向けられる抗体は、血清由来の抗体またはモノクローナル抗体であり得、当該技術において周知の方法を用いて製造される。例えばモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いることにより、免疫化した動物からの抗体産生Ｂ細胞をミエローマ細胞と融合させ、得られた所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞ラインを選択することによって製造される。ＮＩＨ３Ｔ３細胞またはＬＭ（ｔｋ^-）細胞のような細胞が、このような抗体を作る免疫原として用いられうる。別の方法として、商業的に入手可能な機械および図１に示したアミノ酸配列を用いて、合成ペプチドを調製してもよい。更に別の方法として、ｃＤＮＡまたはそのフラグメントのようなＤＮＡをクローン化して発現させ、得られたポリペプチドを回収して免疫原に用いてもよい。これら抗体は、単離されたＤＮＡによりコードされるヒト５−ＨＴ_4B受容体の存在を検出するために有用であり、或いは生きた動物、ヒト、動物若しくはヒトから単離された生物学的組織若しくは体液中において、５−ＨＴ_4B受容体の機能を阻害するために有用である。本発明はまた、天然に存在する物質がヒト５−ＨＴ4B受容体に結合するのをブロックするために有効な、効果的な量のヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体のエピドープに向けられた抗体と、薬剤的に許容しうる担体とを含有する薬剤組成物を提供する。細胞表面に存在するヒト５−ＨＴ4B受容体のエピトープであって、且つ図１に示したアミノ酸配列に含まれるヒト５−ＨＴ_4B受容体の細胞表面エピトープのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するエピトープに向けられたモノクローナル抗体は、この目的のために有用である。本発明はまた、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の発現を低下させることにより緩和される対象における異常を治療する方法であって、対象に対して、天然に存在する物質の該受容体への結合をブロックするために有効な、効果的な量の上記薬剤組成物を投与することにより、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現からもたらされる異常を緩和することを具備した方法を提供する。前記抗体の受容体への結合は、該受容体が機能するのを阻害することによって過剰発現の影響を中和する。上記で述べたモノクローナル抗体は、この目的のために有用である。加えて、本発明は５−ＨＴ_4B受容体活性の過剰に関連する異常症状を治療する方法であって、対象に対して、天然に存在する物質の５−ＨＴ_4B受容体への結合をブロックするために有効な、所定量の上記薬剤組成物を投与することにより、前記異常症状を緩和することを具備した方法を提供する。このような過剰な５−ＨＴ_4B受容体活性に関連した異常症状の幾つかの例は、アンギーナ、冠状動脈疾患、アテローム硬化症、および発作となりうる大脳血管障害、より高度の認識的過程の疾患（例えば精神分裂症）、並びに自律神経作用のコントロールである。本発明は、細胞の表面における５−ＨＴ_4B受容体の存在を検出する方法であって、該５−ＨＴ_4B受容体に向けられた抗体が該受容体に結合される条件下で、前記細胞を前記抗体と接触させることと、該細胞に結合した前記抗体の存在を検出し、これにより前記細胞表面におけるヒト５−ＨＴ_4B受容体の存在を検出することとを具備する方法を提供する。このような方法は、所定の細胞が５−ＨＴ_4B受容体の発現を欠いているか否かを決定するために有用である。結合された抗体は、当該技術において周知の方法によって検出される。例えば、蛍光マーカーを該抗体に結合し、蛍光顕微鏡下で細胞サンプルを検査して、抗体の結合を示す細胞上の蛍光を検出する。上記に述べたモノクローナル抗体は、この目的のために有用である。本発明は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを発現する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、および哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。本発明はまた、正常な受容体活性もたないように突然変異されたヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを発現し、且つ本来の５−ＨＴ_4B受容体を発現しない、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。本発明は更に、そのゲノムがヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを具備するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、前記ＤＮＡが、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスｍＲＮＡ（これは５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズしてその翻訳を低下させる）中に転写されるように配置されているトランスジェニック哺乳動物を提供する。更に本発明は、そのゲノムが哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡを具備するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、前記ＤＮＡが、哺乳動物５−ＨＴ_4B 受容体をコードするｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスｍＲＮＡ（これは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズしてその翻訳を低下させる）中に転写されるように配置されているトランスジェニック哺乳動物を提供する。該ＤＮＡは、発現が誘導され又は特定の細胞タイプに限定され得るように、追加的に誘導プロモータを具備し、又は追加的に組織特異的な調節要素を具備し得る。ＤＮＡの例は、図１に示したコーディング配列と実質的に同じコーディング配列を有するＤＮＡ分子またはｃＤＮＡ分子である。トランスジェニック動物の一例は、トランスジェニックマウスである。組織特異性決定領域の例は、メタロチオネインプロモータ（Low，M．J.，Lechan，R．M.，Hammer，R ．E．etal．Science 231：1002-1004（1986））およびＬ７プロモータ（Oberdic k，J.，Smeyne，R．J.，Mann，J．R.，Jackson，S．and Morgan，J．I．Science 248：223-226（1990））である。種々の技術を用いて、５−ＨＴ_4B受容体の発現が増大もしくは減少され、または発現された５−ＨＴ_4B受容体タンパクのアミノ酸配列が変更されるようなトランスジェニック動物を創製することによって、哺乳動物受容体の生理学的役割および行動的役割を解明する動物モデル系が製造される。これら技術の例には次のものが含まれるが、これに限定されない。１）トランスジェニック動物を製造するために、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡの正常もしくは突然変異バージョン、またはこの遺伝子の相同性動物バージョンを、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染または当業者に周知の他の手段によって、適切な受精胚胎内に挿入すること（Hogan B．et al.，Manipulating theMouse Embryo，A L aboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory（1986））。２）この受容体の構造または発現調節を変えるために、これら遺伝子の突然変異若しくは正常なヒト若しくは動物バージョンと、トランスジェニック動物における天然の遺伝子座との相同性組換え（Capecchi M．R．Science 244：1288-1292（1989）；Zimmer，A．an d Gruss，P．Nature 338：150-153（1989））を行なうこと。相同性組換えの技術は、当該技術において周知である。これは天然遺伝子を挿入遺伝子で置き換えるから、天然の受容体を発現できないが、例えば、挿入された突然変異受容体（組換えにより、動物ゲノムの天然受容体と置換されたもの）を発現し、当該受容体の過少発現をもたらす動物を製造するために有用である。マイクロインジェクションはゲノムに遺伝子を加えるが、遺伝子を除去することはないから、それ自身の受容体および加えられた受容体を発現し、受容体の過剰発現をもたらす動物を製造するために有用である。トランスジェニック動物を製造するために用いることができる一つの手段について、マウスを例に説明すれば次の通りである。雌のマウスを交配させ、生じた受精卵を切開した輸卵管から取り出す。この卵子を、Ｍ２培地（Hogan B．etal. ，Manipulating the Mouse Embryo，ALaboratory Manual，Cold Spring HarborL aboratory（1986））のような適切な培地中に保存する。受容体をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡは、当該技術において周知の方法により、ベクター（例えば、上記のプラスミドｐｃＥＸＶ−５ＨＴ_4B）から精製される。導入遺伝子（trans-gene）の発現を調節する実験的手段を提供するために、誘導プロモータがＤＮＡのコーディング領域と融合され得る。その代わりに又はこれに加えて、導入遺伝子の組織特異的発現を可能とするために、組織特異性の調節要素がコーディング領域に融合され得る。適切な緩衝溶液中のＤＮＡをマイクロインジェクション針（ピペットプラー（pipetpuller）を用いてキャピラリー管から作製され得る）の中に収容し、遺伝子を注入すべき卵子を凹部スライド（de-pression slide）内に置く。針を卵子の前核中に挿入し、ＤＮＡ溶液を注入する。注入された卵子は、次いで擬妊娠マウス（実際には妊娠していないが、妊娠を維持するように適切なホルモンによって刺激されたマウス）の輸卵管中に移される。その後、卵子は子宮へ移動し、着床し、所定期間だけ発育する。先に述べたように、マイクロインジェクションは卵子細胞中にＤＮＡを挿入する唯一の方法ではなく、ここでは例示の目的のためだけに用いられている。受容体に特異的な薬剤の正常な作用は、該受容体の活性化又は阻害であるから、上記のトランスジェニック動物モデル系は、受容体に向けられた薬剤の生物学的活性を試験するために（このような薬剤が入手可能になる前であっても）有用である。これら動物モデル系は、生きた動物において、天然遺伝子または導入遺伝子の発現を誘導または阻害し、正常もしくは突然変異受容体の発現を増大もしくは減少させるため、受容体を活性化または阻害する薬剤の可能な治療的適用を予測しまたは評価するために有用である。こうして、この受容体に向けられた薬剤の生物学的活性を、そのような薬剤が入手可能になる前に評価できるモデル系が製造される。この受容体を過剰産生または過少産生するトランスジェニック動物は、その生理学的状態によって、この受容体の過剰産生または過少産生が治療的に有用であるか否かを示す。従って、トランスジェニックモデル系に基づいて薬剤作用を評価することは有用である。一つの用途は当該技術において周知の事実、即ち、抗欝剤のような薬剤は神経伝達物質の取込みをブロックすることにより、シナプス間隙における神経伝達物質の量を増大させるという事実に基づいている。この作用の生理学的結果は、影響された細胞がより少ない受容体を産生することを刺激し、結局は過少発現が導かれることである。従って、受容体を過少発現する動物は、過少発現をもたらすような薬剤の作用が実際に治療的であるか否かを研究するためのテスト系として有用である。もう一つの用途は、もし過剰発現が異常を導くことが見出だされれば、下方調節する薬剤またはこの受容体に対するアンタゴニストとして作用する薬剤を開発する価値があることが示されること、並びに、もし有望な治療的適用がこれらモデル系によって明らかにされないときは、この５−ＨＴ_4B受容体に向けられたアゴニスト又はアンタゴニスト薬剤を製造することによって、または人間でのこの５−ＨＴ_4B受容体の発現を増大または減少させる何等かの方法によって、５−ＨＴ_4B受容体の活性化または阻害が治療的に達成されることである。本発明は更に、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法であって、受容体の発現を調節する誘導プロモータを使用することにより、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体発現のレベルが変化されるようなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を製造することを具備した方法を提供する。本発明はまた、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を種々のレベルで発現することの生理学的効果を決定する方法であって、夫々が異なった量のヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物のパネルを製造することを具備した方法を提供する。このような動物は、発生によってトランスジェニック動物になるべき卵細胞中に、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする異なった量のＤＮＡを導入することによって製造されうる。本発明はまた、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現からもたらされる異常を緩和することができる物質を同定するための方法であって、少なくとも一つのヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする人為的に導入されたＤＮＡ分子を発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に物質を投与すること、およびヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現の結果としてヒト以外のトランスジェニック哺乳動物が示す身体的および行動的な異常を、前記物質が軽減するか否かを決定こととを具備する方法を提供する。ここで使用される「物質」の用語は、天然、合成、またはスクリーニングから導かれる産物でありうる化合物または組成物を意味する。ＤＮＡ分子の例は、図１に示されたコーディング配列と実質的に同様のコーディング配列を有するＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子である。本発明は、５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現からもたらされる異常を軽減するために有効な所定量の上記物質と、薬剤的に許容しうる担体とを含有する薬剤組成物を提供する。本発明は更に、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現の結果からもたらされる異常を治療するための方法であって、対象に対して、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現からもたらされる異常を軽減するために有効な所定量の上記薬剤組成物を投与することを具備した方法を提供する。本発明は、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過少発現からもたらされる異常を軽減できる物質を同定するための方法であって、非機能的なヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ4B受容体のみを発現する上記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に対して前記物質を投与すること、および該物質が、ヒトおよび哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過少発現の結果として前記ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物が示す身体的および行動的異常を軽減するか否かを決定することとを具備した方法を提供する。本発明はまた、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過少発現によりもたらされる異常を軽減するために有効な所定量の物質と、薬剤的に許容しうる担体とを含有する薬剤組成物を提供する。本発明は更に、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の過少発現の結果生じる異常を治療するための方法であって、対象に対して、ヒト若しくは哺乳動物５ −ＨＴ_4B受容体の過少発現の結果生じる異常を軽減するのに有効な所定量の上記薬剤組成物を投与することを具備した方法を提供する。本発明は、ヒと若しく哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体対立遺伝子の発現に伴う疾患の疾病素因を診断する方法であって：ａ）該疾患にかかった対象のＤＮＡを得ること；ｂ）制限酵素のパネルで前記ＤＮＡの制限切断を行うこと；ｃ）得られたＤＮＡフラグメントをサイジングゲル上で電気泳動により分離すること；ｄ）得られたゲルを、ヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができ、且つ検出マーカーでラベルされた核酸プローブに接触させること；ｅ）検出マーカーでラベルされたヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡにハイブリダイズされている標識バンドを検出し、該疾患に履患した対象のＤＮＡに特異的な独特のバンドパターンを得ること；ｆ）ステップａ−ｅによる診断のために得られたＤＮＡを調製すること；およびｇ）ステップｅで得られた前記疾患に履患している対象のＤＮＡに特異的な独特のバンドパターンと、ステップｆで診断のために得られたＤＮＡとを比較して、これらパターンが同一であるか又は異なっているかを決定することにより、パターンが同一であれば該疾患の疾病素因ありと診断することを具備した方法を提供する。この方法はまた、特異的な５−ＨＴ_4Bヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体対立遺伝子の発現が関与している病気を診断するためにも用いられ得る。本発明は、単離された５−ＨＴ_4B受容体を調製する方法であって、細胞に受容体の発現を誘導すること、得られた細胞から該受容体を回収すること、およびこうして回収された受容体を精製することを具備した方法を提供する。５−ＨＴ_4B 受容体の一例は、図１に示したアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する単離されたタンパクである。例えば、ホルモンのような物質に曝すことによって、細胞に受容体の発現を誘導できる。次いで、細胞はホモジナイズされ、該ホモジネートから、例えばセロトニン又は５−ＨＴ_4B受容体に結合することが知られた他の物質を含むアフィニティーカラムを使用して、前記受容体が単離される。次に、得られた分画は、これをイオン交換カラムと接触させ、どの分画が５− ＨＴ_4B受容体活性を有するか又は抗受容体抗体と結合するかを決定することによって精製されうる。本発明は、単離された５−ＨＴ_4B受容体を調製する方法であって、５−ＨＴ_4B 受容体をコードする核酸を適切なベクター中に挿入すること、得られたベクターを適切な宿主細胞内に挿入すること、得られた細胞によって生産された前記受容体を回収すること、およびこうして回収された前記受容体を精製することを具備した方法を提供する。単離された５−ＨＴ_4B受容体の一例は、図１に示したアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する単離されたタンパクである。これらの５−ＨＴ_4B受容体を調製する方法では、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用する。例えば、５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離された核酸が、発現ベクターのような適切なベクターに挿入される。適切な宿主細胞（例えばバクテリア細胞、または酵母細胞のような真核細胞）が、該ベクターで形質導入される。５−ＨＴ_4B受容体は、アフィニティー精製、クロマトグラフィー、或いは当業者に周知の他の方法によって培地から単離される。本発明は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に結合できることが知られていないリガンドが、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に結合できるか否かを決定するための方法であって、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡ分子を有する哺乳動物細胞（これによってコードされたタンパクは該細胞表面に発現される）と前記リガンドとを、５ −ＨＴ受容体に結合することが知られているリガンドが結合される条件下で接触させること、前記５−ＨＴ_4B受容体に結合した何らかのリガンドの存在を検出すること、およびこれによって前記リガンドが前記５−ＨＴ_4B受容体に結合するか否かを決定することを具備した方法を提供する。本発明はまた、ヒト５−ＨＴ_4B 受容体に結合できることが知られていないリガンドが、その活性を機能的に活性化しまたはそのように活性化するリガンドの作用を妨げることができるか否かを決定するための方法を提供する。この方法は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子を有する哺乳動物細胞と前記リガンドとを、機能的応答の活性化またはブロックを可能とする条件下で接触させること、バイオアッセイの手段によって前記哺乳動物細胞からの第二メッセンジャー応答を検出すること、およびこれによって前記リガンドが前記ヒト５−ＨＴ_4B受容体の機能的アウトプットを活性化しまたは妨げるか否かを決定することとを具備する。細胞内の前記ＤＮＡは、図１に示すコーディング配列と実質的に同じコーディング配列を有しうる。好ましくは、前記哺乳動物細胞は非神経細胞起源である。哺乳動物の非神経細胞の一例はＬｔｋ −細胞、特にＬ−５−ＨＴ_4Bと命名されたＬｔｋ−細胞である。機能的アッセイのために使用される非神経系哺乳動物細胞のもう一つの例は、ネズミ繊維芽細胞系、特にＮＩＨ３Ｔ３細胞である。リガンドがヒト５−ＨＴ_4B受容体に結合できるか否かを決定するための好ましい方法は、その表面に５−ＨＴ_4B受容体を発現する形質導入された非神経系哺乳動物細胞（即ち、本来的には何れのタイプの５ −ＨＴまたはＧタンパク結合受容体をも発現せず、該細胞内に形質導入されると、このような受容体のみを発現する細胞）とリガンド、又はこのような形質導入細胞から誘導された膜プレパレーションとリガンドとを、該リガンドの５−ＨＴ_4B 受容体へのin vivo結合に効果があり、従ってこの結合に関連することが知られている条件下で接触させること、前記細胞表面の５−ＨＴ_4B受容体に結合した何れかの被験リガンドの存在を検出すること、およびこれによって、該リガンドが５−ＨＴ_4B受容体に結合し、これを活性化し又はその活性化を阻害するか否かを決定することを具備する。この応答系は、ホスホイノシチド加水分解、アデニレートシクラーゼ、グアニレートシクラーゼ又はイオンチャンネルのような望ましい第二メッションジャー系を含む適切なホスト細胞内に、単離されたＤＮＡを形質導入することによって得られる。このようなホスト系は先在する細胞ラインから単離され、或いは第二メッセンジャー系の適切な成分を現存の細胞ラインに挿入することによって創製され得る。このような形質導入系は、上記リガンドでのヒト５−ＨＴ_4B受容体の活性化を研究またはアッセイするための完全な応答系を提供する。形質導入系は、公知の薬剤または候補薬剤と、前記受容体に結合し且つ放射性試薬、分光学的試薬または他の試薬でラベルされたリガンドとの間で競争結合アッセイを行なうための生細胞培養体として有用である。形質導入細胞から単離された受容体を含む膜プレパレーションもまた、これら競争結合アッセイのために有用である。形質導入系における第二メッセンジャー系またはその結果の機能的アッセイは、受容体機能の活性化における結合親和性および効率のためのアッセイとして働く。形質導入系は、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の本来の機能を活性化または阻害する治療薬剤として直接使用され得、または該治療薬剤として更に改変され得るような、薬剤開発のための可能性をもった天然化合物または合成化合物を同定するために有用な「薬剤発見系」を構成する。該形質導入系はまた、ヒト５−ＨＴ_4B受容体部位における公知薬剤の親和性および効率を測定するためにも有用である。本発明はまた、細胞表面のヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体と特異的に相互作用してこれに結合する薬剤を同定するために、薬剤をスクリーニングする方法であって、細胞表面におけるヒト若しくは哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離されたＤＮＡ分子を有する哺乳動物細胞と複数の薬剤とを接触させること、前記哺乳動物細胞に結合するこれらの薬剤を決定すること、およびこれによってヒトおよび／または哺乳動物５ −ＨＴ_4B受容体と特異的に相互作用してこれに結合する薬剤を同定することとを具備する方法を提供する。種々の検出方法が使用されうる。該薬剤は、検出マーカ物質（例えば放射性標識またはビオチンのような非同位体標識）との関連で「標識され」うる。該細胞内のＤＮＡは、図１に示したコーディング配列と実質的に同じコーディング配列を有しうる。好ましくは、該哺乳動物細胞は、非神経細胞起源である。非神経系哺乳類細胞の一例は、Ｃｏｓ７細胞である。候補薬剤は、当該技術において周知の放射性リガンドを結合する方法（この例は本明細書で説明される結合アッセイにおいて示される）を用いて、形質導入された細胞において発現された５−ＨＴ_4B受容体タンパクに高い親和性で結合する化学化合物を選択することによって同定される。候補薬剤はまた、一種類の特定の受容体に対して高い親和性で結合するが、何れかの他の受容体サブタイプまたは何れかの他の公知の受容体とは高い親和性で結合しない化合物を同定することによって選択性に対してスクリーニングされる。選択的で高親和性の化合物が、患者に投与された後、主として標的５−ＨＴ_4B受容体部位と相互作用するので、望まない副作用を有する薬剤を生成する機会は、このアプローチによって最小になる。本発明は、上記の方法によって同定される薬剤および薬剤的に許容しうる担体を含有する薬剤組成物を提供する。ここで使用する「薬剤的に許容しうる担体」の語には、リン酸塩で緩衝された生理食塩水、水、および油／水若しくは水／油エマルジョンのようなエマルジョン、並びに種々のタイプの湿潤剤のような何れかの標準的な薬剤担体が包含される。候補薬剤が、例えば経口若しくは注射（十分な治療濃度が、十分な期間作用部位で維持され、所望の治療効果が得られなければならない）のような投与の特別な経路に従って十分に生物学的に利用しうることが示され、適切な疾患モデルで無毒であり、治療的に効果があることが一度示されれば、該薬剤は、適切な固体若しくは液体の形態で、その薬剤が生物学的に利用しうると決定されたその投与経路で患者に投与され、所望の治療効果が得られる。出願人は、５−ＨＴ_4Bと称される新規なヒト５−ＨＴ受容体サブタイプのタンパクを同定し、また治療のための薬理学的化合物を同定する方法を記載した。特定の受容体サブタイプに向けられた薬理学的化合物は、効果的で且つ副作用が最小限である新しい治療法を提供する。神経性セロトニン受容体の分子構造を明らかにすることは、セロトニン作動性神経伝達物質の理解における重要なステップとなる。この開示には、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする新規なｃＤＮＡクローンの単離、アミノ酸配列および機能発現が報告されている。５−ＨＴ受容体サブタイプの同定は、セロトニン作動性伝達物質の基礎となる分子メカニズムを説明するのに重要な役割を担っており、新規な治療薬の開発の手助けともなるであろう。セロトニン受容体サブタイプをコードする相補的ＤＮＡクローン（これはｈｐ７８ａと称される）は、ヒト、ヒトｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーから単離され、その機能性は、哺乳動物細胞内で試験される。ヌクレオチド配列から、膜に広がるドメインに適合した７つの高度に疎水的な領域を有する４４５のアミノ酸のタンパク質が予測される。５−ＨＴ_4Bの構造および機能の分析は、アンギーナ、冠状動脈疾患、アテローム硬化症、および発作となりうる大脳血管障害、過敏性の腸の症候群（irritable bowel syndrome）若しくは他の消化器部分の疾患、ＣＮＳ疾患、痛みの感知、感情の疾患、精神分裂症を含む（但しこれに限定されない）より高度の認識的過程の疾患、並びに自律神経作用のコントロールの治療に有用である。本発明は、哺乳動物セロトニン受容体、そのアミノ酸配列、およびその哺乳動物遺伝子を初めて同定する。本発明は、この発見によりもたらされる情報および実験手段を提供し、本発明が促進されることは、この新しい受容体タンパク、その関連ｍＲＮＡ分子またはその関連ゲノムＤＮＡに対する新しい治療薬および新しい治療もしくは診断試験を生み出す手助けとなる。この発見により提供される情報および実験手段は、この新しい受容体タンパク、その関連ｍＲＮＡ分子またはその関連ゲノムＤＮＡのための新しい治療薬および新しい治療もしくは診断試験を生み出すために有用であろう。特に、本発明は、５−ＨＴ_4Bと称される新規なセロトニン受容体をコードする哺乳動物ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡクローンの単離に関する。ｈｐ７８ａとしてここに同定されたこの受容体のための新しいヒト遺伝子が同定され、特徴付けられた。また、一連の関連ｃＤＮＡおよび関連ゲノムクローンが単離された。加えて、ヒト５−ＨＴ_4B受容体が、Ｃｏｓ７細胞をプラスミドｐｃＥＸＶ−５ＨＴ_4B で形質導入することによって該細胞内で発現される。コードされた５−ＨＴ_4B 受容体の薬理学的結合特性が決定され、該結合特性によって、該受容体は新規なセロトニン受容体に分類される。このヒト５−ＨＴ_4B受容体を細胞表面に発現する哺乳動物の細胞ラインが構築され、該新規な５−ＨＴ_4B受容体を研究するために用いられる十分に定義された初めての培養細胞ラインが確立された。本発明は、以下に示す実験の詳細を参照することによって更によく理解されるであろう。しかし、詳述された個々の実験は、ここで説明され、後記の請求の範囲によって定義された本発明の単なる例示であり、本発明を制限することを意味するものではないことを当業者は容易に承認するであろう。方法と材料クローニングおよび配列決定： λｄａｓｈII（〜１．５×１０⁶全組換体、ストラタジーン、ラジョーラ、ＣＡ）中のヒト胎盤ゲノムライブラリーはショウジョウバエセロトニン受容体遺伝子、Ｄｏｒ５ＨＴＲ（ウィッツら、１９９０）から誘導された、オーバラップした膜貫通（ＴＭ）オリゴヌクレオチドプローブ（ＴＭ３、５、６および７）を用いてスクリーニングされた。オーバラッピングオリゴマーはＤＮＡポリメラーゼの大きな断片で合成することによって［³²Ｐ］ｄＡＴＰおよび［³²Ｐ］ｄＣＴＰでラベルされた。ハイブリダイゼイションは以下の中程度に厳格な条件で行われた：４５℃、３７．５％ホルムアミド、１０％デキストラン硫酸、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、１×デンハーツ溶液（０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ファイコール、０．０２％牛血清アルブミン）、および２００μｇ／μｌの超音波処理済みサケ精子ＤＮＡを含む溶液中。フィルターは４５℃にて０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．１×ＳＳＣ中で洗浄され、−７０℃にて増感紙の存在下コダックＸＡＲフィルムに露光された。プローブとハイブリダイズしたラムダファージクローンはプラーク精製され、ＤＮＡがサザンブロット分析するために調製された（サザン、１９７５；サムブルックラ、１９８９）。サブクローニングおよび更なるサザンブロット分析に対して、ＤＮＡはｐＵＣ１８（ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ）、ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（プロメガ、マディソン、ＷＩ）あるいはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン、ラジョーラ、ＣＡ）中にクローニングされた。ヌクレオチド配列分析は変成した二重鎖プラスミド鋳型上で、シークエナーゼ（ＵＳバイオケミカル社、クリーブランド、ＯＨ）、ＢｓｔＤＮＡ配列決定キット（バイオラド研究所、リッチモンド、ＣＡ）、あるいはＴａｑＴｒａｃｋ配列決定キット（プロメガ社、マディソン、ＷＩ）を用いて、ザンガーのジデオキシヌクレオチドチェインターミネイション法（ザンガーら、１９７７）によって行われた。全部の長さを持つクローンを単離するために、ヒトｃＤＮＡライブラリーは以下の単離されたゲノムクローンから作られた各々１μＭの特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）によってスクリーニングされた：センス鎖（ヌクレオチド５１２−５３５）は、５′ＴＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＡＴＣＡＧＣＡＴＴＧ３′から、およびアンチセンス鎖（ヌクレオチド９４５−９７４）は、５′ＧＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＣＴＴＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＴＧ３′から（図１参照）。プライマーはＴｍ３の３′終末からであり、各々は、上流と下流のプライマーに対するＴｍ５／Ｔｍ６ループ領域であった。ｃＤＮＡライブラリー（λＺａｐII；ストラタジーン、ラジョーラ、ＣＡ）からのファージＤＮＡ、１から２μｌは、〜１０⁶−１０⁷ｐｆｕとして表現され、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、および２．５単位のサーマスアキュアティクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ；パーキン −エルマー−シータス、ノルウォーク、ＣＴ）中で増幅された。増幅プロフィールは３０サイクル行われた：５分間９５℃で初期（すなわち１サイクル）変成、続いて９４℃で２分間、６８℃で２分間、７２℃で３分間、３秒間伸張して、続いて最後の１０分間７２℃にて伸張させた。ＰＣＲ産物は臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色されたアガロースゲルにより分析されて、ＥｔＢｒ染色ゲル上にバンドが存在する幾つかのサンプルは陽性であると考えられた。次に、陽性のライブラリーはプレート化され、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰおよび［ α−³²Ｐ］ｄＡＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片を使って満たされたオーバラッピングした４５量体のオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングされた。このプローブは上記で考察した増幅プライマーに対して内側に存在した：センス鎖（ヌクレオチド８６４−９０８）からは、５′ＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＧＣ３′、およびアンチセンス鎖（ヌクレオチド８８９−９３３）からは、５′ＡＴＧＣＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴＣＧＡＡＡＧＧＴＴＴＧＣＡＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴ３′（図１参照）。陽性のｃＤＮＡファージクローンはプラーク精製され、商品取扱い説明書（ストラタジーン、ラジョーラ、ＣＡ）によって記載されているように、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ組換えＤＮＡｓがヘルパーファージＲ４０８を使ってλＺａｐIIからレスキューにより切り出された。挿入サイズは制限酵素切断分析によって確認されて、組換え体は上述したように配列決定された。３つの追加のオーバラップしたオリゴヌクレオチドの組み合わせが、全部で３つの部分的ではあるがオーバラップしたｃＤＮＡクローンを単離するために使われた。これらのオリゴヌクレオチドおよび対応するｃＤＮＡクローンの名前は次の通りである：ｈＦＢ９ａ（Ｔｍ３／４ループ中）からは、センス鎖（ｎｔ．５２９−５７３）、５′ＡＧＣＡＴＴＧＡＣＡＧＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＡＴＣＡＣＡＡＧＧＣＣＣＣＴＣＡＣＡＴＡＣＣＣＴ３′、およびアンチセンス鎖（ｎｔ．５５４−５９９）、５′ＣＣＡＴＧＣＡＴＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＣＡＣＡＧＧＧＴＡＴＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＴＴＧ３′；ｈＦＢ４４ａ（Ｔｍ２／３ループ中）からは、センス鎖（ｎｔ．４１２−４５６）、５′ＧＴＣＡＧＣＧＴＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣＡＴＣＧＧＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＴＴＧＧＡＣＡＣ３′、およびアンチセンス鎖（ｎｔ．４３７−４８１）、５′ＴＧＧＣＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＴＧＴＣＣＡＡＡＧＡＴＣＣＡＣＴＴＧＣ３′；ｈＦＢ４１ａ（ＮＨ₂末端中）からは、センス鎖（ｎｔ．１０７−１５０）、５′ＧＧＣＧＣＣＧＡＣＣＣＧＧＴＣＧＣＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣ３′、およびアンチセンス（ｎｔ．１３１−１７５）、５′ＴＧＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＧＧＴＧＣＣＣ３′。発現：５′非翻訳（５′ＵＴ）の２７ｂｐおよび３′非翻訳配列（３′ＵＴ）の５０ｂｐを含む、ヒト５−ＨＴ_4B受容体（１３３８ｂｐ）の全体をコードする領域は、ＥＸＪ．ＨＲ（未公開データ）と呼ばれる、ポリリンカーで修飾された真核生物発現ベクターｐＣＥＸＶ−３（ミラーら、１９８６）のＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた。その構築体には部分的にオーバーラップしたヒト胎盤ゲノムおよび胎児脳ｃＤＮＡクローン由来の３つのフラグメントの連結が含まれる：０．５ｋｂＮｃｏＩ−ＮｃｏＩゲノム断片上の開始コドンからＴＭ３（ベクターから誘導されたＳａｌＩ部位は、５′終末で、内部の挿入で誘導されたＮｃｏＩ部位の代わりにサブクローニングに使われた）、ＮｃｏＩ末端およびＫｐｎＩ端末を有するオーバラップしたオリゴヌクレオチド（先に決定したｃＤＮＡ配列を基にして）として合成されたＴＭ３単独、および０．８ｋｂＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩｃＤＮＡ断片上のＴＭ３／４ループから停止コドンおよび３′ＵＴまでである。サル腎臓細胞（Ｃｏｓ−７）はＤＥＡＥデキストラン方法論（スペシャリティーメディア、ラベレット、ＮＪから入手した）を使ってプラスミドｈｐ７８ａ／ＥＸＪ（ヒト５−ＨＴ_4B受容体遺伝子をコードする発現ベクター）で一時的に形質導入された。細胞は制御された環境（３７℃、５％ＣＯ₂）中でダルベッコ変法イーグル培地（ギブコ、グランドアイランド、Ｎ．Ｙ．；２３）で単層になるように成育された。安定した細胞ラインは、カルシウムリン酸法を用いて、プラスミドｈｐ７８ａ／ＥＸＪ（ヒト５−ＨＴ_4B受容体遺伝子を含む発現ベクター）およびプラスミドｐＧＣｃｏｓ３ｎｅｏをＬＭ（ｔｋ^-）細胞中に共形質導入（cotransfection）することによって得られた。細胞は、制御された環境（３７℃、５％ＣＯ₂）で、２５ｍＭグルコースを有し、１０％胎児牛血清、１００ユニット／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを補われた、ダルベッコ変法イーグル培地（ギブコ、グランドアイランド、Ｎ．Ｙ．；２３）中で単層になるように成育された。次に、安定なクローンは以前記載（ベインシャックら、１９９０）したように抗生物質Ｇ−４１８（１ｍｇ／ｍｌ）に対する耐性に対して選択され、膜を集め、上述したように（放射リガンド結合測定参照）［³Ｈ］ハイドロキシトリプタミンへの結合に対する能力が測定された。マクロ局在化（ＰＣＲ／組織転写発現実験）：ヒト組織は（ＮＤＲＩ）ホモジネートされ、全ＲＮＡは以前記載したようにグアニジンイソチオシアネート／ＣｓＣｌｃｕｓｈｉｏｎ法（キングストン、１９８７）を用いて抽出された。ｃＤＮＡは４０ＵＲＮａｓｉｎ、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌおよび１ｍＭｄＮＴＰｓを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．３中で、４２℃ にて一時間スーパースクリプト逆転写酵素（ＢＲＬ）を用いてランダムヘキサヌクレオチドプライマー（５００pmol）で全ＲＮＡ５μｇから調製された。ＲＮａｓｅＨ（２Ｕ）が添加されて、２０分間３７℃でインキュベートされ、続いて９５℃で５分間加熱され、氷上で冷やされた。ファーストストランドｃＤＮＡのアリコートは、製造社（シータス社）によって供給されたバッファー中のＴａｑポリメラーゼ１．２５ＵおよびＰＣＲプルトコール中の１μＭプライマーを含んでいる５０μｌＰＣＲ反応液（最終濃度２００μＭｄＮＴＰｓ）中に希釈（１：５）された（５′および３′オリゴはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用されたものと同じであった；上記参照）。ＰＣＲ増幅反応は最初に５分間９５℃でインキュベートし、続いて以下のサイクルで３０ラウンド行った：９４℃で２分間、６８℃で２分間、７２℃で３分間、更に最後に７２℃でインキュベーションを１０分間行った。ＤＮＡ（ＲＮＡ抽出の間に持ち込まれたものを）増幅をコントロールするために、コントロールＰＣＲ反応はｃＤＮＡ試料と同様の方法で希釈されたＲＮＡを用いて平行して行われた。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲル上で泳動され、荷電したナイロン膜（ゼータプローブ、バイオラド）に移された。フィルターはＰＣＲプライマー（このオリゴは最初のヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用されたものと同じであった；上記参照）に対する末端ラベルした（［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ）内部プローブでハイブリダズされ、高度に厳密な条件で（５０℃）洗浄されて、上述したように、増感紙の存在下コダックＸＡＲフィルムに−７０℃ にて露光された。ミクロ局在化（in situハイブリダイゼイション）： in situハイブリダイゼイションおよび受容体オートラジオグラフィー実験に対して使用されたラットは、ＣＯ₂で安楽死させ、断頭され、脳を解剖して冷却したイソペンタン中で凍結された。それから組織はクライオスタット上に乗せされて、−２０℃に維持されたクライオスタット中で、in situハイブリダイゼイション用に１１μｍに連続的に切断されるか、または受容体オートラジオグラフィー用に２０μｍに連続的に切断された。切片はポリ−１−リジンでコートされた顕微鏡スライド上に融解−マウント（thaw-mount）され、室温で１時間空気乾燥され、使用するまで−８０℃で保存された。ラット５−ＨＴ_4BｍＲＮＡに対するアンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチド（４５量体）はサイクロンプラスＤＮＡシンセサイザー（ミリゲン／バイオサーチ）上で合成された。プローブは、末端デオキシヌイクレオチジル転移酵素（ベーリンガーマンハイム；インディアナポリス、ＩＮ）を用いて比放射能１０⁹ｄｐｍ／μｇまで、³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（１２００Ｃｉ／mmol、ニューイングランドヌクレアー、ボストン、ＭＡ）を用いて３′−末端ラベルされた。放射ラベルされたプローブはバイオスピン６クロマトグラフィーカラム（バイオラド；リッチモンド、ＣＡ）で精製され、１．５×１０⁴ｃｐｍ／μｌの濃度にハイブリダイゼイションバッファーで希釈された。ハイブリダイゼイションバッファーは５０％ホルムアミド、４×クエン酸ナトリウムバッファー（ＳＳＣ；１Ｘ＝０．１５ＭＮａＣｌおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、１×デンハーツ溶液（０．２％ポリビニルピローリジン、０．２％ファイコール、０．２％牛血清アルブミン）、５０ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、および１０％硫酸デキストランからなっていた。組織切片は使用する前に１時間室温まで暖められた。該切片は１０ｍＭリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中で４％（Ｗ／Ｖ）パラホルムアルデヒドで固定されて、ＰＢＳで２回洗浄されて、５ｍＭＤＴＴを含む水でリンスされ、０．１Ｍトリエタノールアミン中０．２５％（Ｖ／Ｖ）無水酢酸で１０分間アセチル化されて、２×ＳＳＣで２回リンスされた。次に、該切片は特級エタノールで脱水されて、クロロホルムで脱脂されて、空気乾燥された。希釈されたプローブの１００μｌは各々の切片に加えられ、次いでパラフィルムカバースリップで覆われた。ハイブリダイゼイションは４０から５５℃で加湿チャンバー中で一晩中行われた。翌日、切片を室温で１時間に２×ＳＳＣを２回取り替えて洗浄し、５０から６０℃にて３０分間２×ＳＳＣで洗浄し、最後に室温にて３０分間０．１× ＳＳＣで洗浄した。組織を特級エタノールで脱水し、−２０℃にて３日から２週間コダックＸＡＲ−５フィルムに並べ、次いで０．２％グリセロール水で１：１に希釈されたコダックＮＴＢ３オートラジオグラフィーエマルジョンに浸した。２から４週間４℃にて露光された後、スライドをコダックＤ−１９現像機で現像され、固定され、ヘマトキシリンおよびエオシンで逆染色した。ミクロ局在化（受容体オートラジオグラフィー）：［³Ｈ］５−ＣＴ結合は次の通り行われた。マウントされた組織切片（２０μ ｍ）を室温に戻し、０．１７Ｍトリス−ＨＣｌ、４. ０ｍＭＣａＣｌ₂、０．０１％（Ｗ／Ｖ）アスコルビン酸、および１０μＭパージリンを含むバッファーで１５分間前もってインキュベートした。スライドは０．５ｎＭ［³Ｈ］５−カルボキシアミドチプタミン（ＮＥＮ、５０．４Ｃｉ／mmol）で、室温にて１時間インキュベートされた。［³Ｈ］５−ＣＴも結合する他のセロトニン受容体から、５−ＨＴ_4B受容体を識別するために、１００ｎＭＰＡＰＰおよび１６０ｎＭ（− ）ピンドロールがマスクとして使用された。５−ＨＴ_4B受容体はメチオテピンに対し非常に高い親和性を持つので、５ｎＭメチオテピンが５−ＨＴ_4B受容体に対する［³Ｈ］５−ＣＴ結合を消去するために放射リガンドに添加された。非特異的結合は放射リガンドに１μＭエルゴタミンを添加することによって決定された。続いて放射リガンド中でインキュベートされ、スライドは４℃にて上記のバッファー中で２０分間２回洗浄され、氷冷水で手短ににリンスされ、穏やかな流れの暖かい空気のもとで乾燥された。スライドは４〜６週間室温てハイパーフィルム（アマシャム）に並べられ、その後フイルムはＤ−１９（コダック）で現像され、固定され、空気乾燥された。膜調製：ヒト５−ＨＴ_4B受容体遺伝子を一時的に形質導入させたＣｏｓ−７細胞は、４８時間成育され、膜が以前記載したように（ブランチェックら、１９９０）集められた。膜懸濁液は氷上に保持され、放射リガンド結合実験に対して１時間以内に使用された。タンパク濃度は標準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドフォード（ブラッドフォード、１９７６）の方法によって決定された。放射リガンド結合実験：結合実験は放射リガンドとして［³Ｈ］５−ＨＴを使用して以前記載したように行った（ゾンビックら、１９９１）。［³Ｈ］５−ＨＴの８種類の濃度（１− １００ｎＭ）を飽和実験に使用した；７種類の濃度の非ラベル化合物および５ｎＭ［³Ｈ］５−ＨＴを競合実験に使用した。非ラベル５−ＨＴ（１０μＭ）を非特異的結合を明らかにするために使用した。測定を減圧濾過（ブランデル、ガイサーバーグ、ＭＤ）によって終了し、残存する放射活性を、ベックマン５００ＴＡ液体シンチレイションカウンター（ベックマン機器、フラートン、ＣＡ）を用いて定量した。ｃＡＭＰ形成測定：ヒト５−ＨＴ_4B受容体遺伝子を発現する一時的に形質導入されたＣｏｓ−７細胞、モック形質導入されたＣｏｓ−７細胞、非形質導入Ｃｏｓ−７細胞および安定に形質導入されたＬＭ（ｔｋ−）細胞を、細胞内ｃＡＭＰレベルを修飾する５ −ＨＴの能力に対して試験した。ｃＡＭＰレベルの５−ＨＴが関与する阻害および剌激の両方を、これらの３種類のインタクト細胞で実験した。細胞内ｃＡＭＰ形成をゾンビックら（１９９１）によって概説された方法論を用いて、放射免疫測定（ｃＡＭＰ放射免疫測定キット、アドバンストマグネティクス、ケンブリッジ、ＭＡ）によって測定した。放射活性はパッカードＣＯＢＲＡ自動ガンマーカウンター（データ減算ソフトウエアーが装備されている）を用いて定量化された。データ分析：結合データは非線型回帰分析によって分析された（アキュフィットアンドアキュカンプ、ロンドンソフトウエアー、チャーリンフォール、ＯＨ）。チェング−プラソフ式がＩＣ₅₀値をＫ_i値に変換するために使用された。機能的データは、応答パラメーターを得るために４種類のパラメーターの論理計算式にフィットされた（ＥＣ₅₀、Ｅ_MAX、ｎＨ；インプロット、グラフパッド、サンディエゴ、ＣＡ）。全ての実験は最低３回行われた。薬剤：薬剤は次に示す会社から入手した；［³Ｈ］５−ＨＴ比放射性＝２０．４−２８．０Ｃｉ／mmol；ニューイングランドヌクレアー、ボストンＭＡ）；５−ＨＴ、エルゴタミン、エルゴノビン、オキシメタゾリン、（±）−ピンドロール、５′−グアニリルイミド二リン酸（シグマ、セントルイス、ＭＯ）；５−ＣＴ、ＤＰ−５−ＣＴ、５−ＭｅＯＴ、５−ＭｅＯ−ＤＭＴ、（±）−α−Ｍｅ−５− ＨＴ、２−Ｍｅ−５−ＨＴ、トリプタミン、ＤＰＡＴ、ＤＯＩ、ケタンセリン、メチセルギド、１−ナフチルピペラジン、ＰＡＰＰ、スピペロン、ＴＦＭＰＰ、ヨヒンビン、ザコプリド（リザーチバイオケミカル社、ナティック、ＭＡ）；リセルゴール、メチルエルゴノビン（アルドリッヒケミカルズ、ミルウォーキー、ＷＩ）、ラウボルスシン（アキュレートケミカルズ、ウエストバリー、ＮＹ）、メチオテピン（バイオモールリザーチ研究所、プリマウスミーティング、ＰＡ）。他の全ての化合物は商品として入手可能な最高純度の物であった。結果中程度に厳密な条件下で、ショウジョウバエセロトニン受容体遺伝子、Ｄｒｏ５ＨＴＲ（ウィッツら、１９９０）の３番、５番、６番そして７番目の膜貫通領域に向けられたオリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノム胎盤ライブラリーをスクリーニングした。全部で３つの陽性クローンを単離し、サザンブロット分析によって特徴付けた。２つのクローンは同一であり、そして他のクローンは他の２つのクローンのオーバラッピング断片であった。２つの同一のクローンのうち１つは、ｈｐ７８ａと表現され、１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片を含んでおり、これはショウジョウバエから誘導されたオリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイゼイションされ、ｐＵＣベクターにサブクローンされた。ＤＮＡ配列分析はショウジョウバエ５ＨＴ受容体に対して最も大きな相同性を示し、それはアデニレートサイクラーゼの行進と共役されている（ウッツら、１９９０）。このサブクローンの疎水性プロットは、親水性アミノ酸残基の部分を挟み込む疎水性アミノ酸領域を示しており、７つの膜貫通Ｇ−タンパクがカップリングされた受容体遺伝子スーパーファミリー（サバレーゼら、１９９２）のメンバーと一致する。さらに、このクローンは予測された５番目の膜貫通領域中にアラニン残基を含んでおり、それがセロトニンサブファミリーのメンバーであることと一致する；このアラニン残基によってセロトニンサブファミリーは他のカテコールアミン受容体（この位置にセリン残基を持っている；ベインシャンクら、１９９２ｂ）から区別される。このクローンはＴＭ４からカルボキシルをコードしていて、予測された第２の細胞内ループの上流にイントロンを含んでいる。全長のクローンを得るために、総数〜１．５×１０⁶組換体を持つヒトｃＤＮＡライブラリーのアリコートが、ゲノムクローンから決定された配列の特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するポリメラーゼチェイン反応によってスクリーニングされた（材料と方法参照）。λＺａｐII（〜１．５×１０⁶組換体）内に、陽性のものを含んだヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーは（ストラタジーン、ラジョーラ、ＣＡ）内部プローブを用いる伝統的なプラークハイブリダイゼイション（材料と方法参照）を用いてスクリーニングされ、その結果１つの部分的な長さを持つｃＤＮＡクローン、ｈＦＢ９ａが単離された。これは、ＴＭ３から停止コドンまでを含んでおり、本来のゲノムクローン、ｈｐ７８ａとオーバーラップしていた（Ｔｍ３とＴｍ４の間のイントロンはｍＲＮＡスプライシングのために存在していなかった）。このｃＤＮＡクローンは全長でなかったので、同じヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーは、Ｔｍ３／４ループに対応しているｈＦＢ９ａｃＤＮＡクローンの最上流の非保存領域から誘導されたプローブでスクリーニングされた（材料と方法参照）。このスクリーニングによって、もう一つの陽性であるが部分的な長さのｃＤＮＡクローン、ｈＦＢ４４ａが単離され、それはＴＭ２からＴＭ３までのみを含み、ＴＭ３内でｈＦＢ９ａｃＤＮＡクローンとオーバーラップしていた。再度、５′ｃＤＮＡクローンを得るために、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーは、ＴＭ２／３ループに対応しているｈＦＢ４４ａｃＤＮＡクローンの最上流の非保存領域から誘導されるプローブでスクリーニングされた（材料と方法参照）。このスクリーニングによって、他の陽性であるが部分的な長さのｃＤＮＡクローン、ｈＦＢ４１ａが単離され、これはアミノ末端の一部からＴＭ３までを含んでいるが、開始メチオニン残基から約２０個のアミノ酸が欠落していた（同様に、このクローンはＴＭ２からＴＭ３までにおいてｈＦＢ４４ａとｃＤＮＡがオーバーラップしていた）。最後に、完全なアミノ末端を得るために、ヒトゲノム胎盤ライブラリーがｈＦＢ４１ａｃＤＮＡクローンの非保存アミノ末端領域から誘導されたプローブを用いて、高度に厳密な条件下でスクリーニングされた。全部で２つの異なる陽性クローンが、このゲノムのスクリーニングから単離され、サザンブロット分析によって特徴付けられた。１つのクローンは５−ＨＴ_4B受容体の偽遺伝子だった（非公開データ）、一方、もう１つのゲノムクローンは開始メチオニン残基からＴＭ３とＴＭ４の間のイントロンまでを含んでいた。開始メチオニンからＴＭ３の中のＮｃｏＩ部位を含む０．５ｋｂＮｃｏＩ／ＮｃｏＩ断片がｐＧＥＭにサブクローニングされた。完全な全長遺伝子は２つの部分から構築された：第１の部分は、２つのｃＤＮＡクローンからの２つの断片および合成された２重鎖オリゴヌクレオチドをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に連結させることを含んでおり、第２の部分は、アミノ末端を含むゲノム断片および第一の部分構成物からの断片を発現ベクター中に連結させることを含んでいる。構築の最初の部分は、ｈＦＢ４１ａｃＤＮＡクローンからの０．４ｋｂＳａｌＩ／ＮｃｏＩ（ＳａｌＩ部位はベクター由来であり、一方ＮｃｏＩ部位はＴｍ３中にある）、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩ末端をもつ様にデザインしたアニールされた相補的な２重鎖オリゴヌクレオチド断片（〜１００ｂｐ；配列はｈＦＢ９ａ、ｈＦＢ４４ａ、およびｈＦＢ４１ａｃＤＮＡクローンからのデータを基礎としていた）およびｈＦＢ９ａｃＤＮＡクローンからの０．８ｋｂＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ断片（ＥｃｏＲＩはベクター由来であり、一方ＫｐｎＩ部位はＴＭ３／４中にある）は，ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に連結させることを含んでいる。構築の第２の部分は、開始メチオニンからＴＭ３までを含んでいる０．５ｋｂＳａｌＩ／ＮｃｏＩゲノムサブクローン（ＳａｌＩはベクター由来で、一方ＮｃｏＩはＴＭ３の範囲内にある；この断片は、ＮｃｏＩで部分的に切断およびＳａｌＩで完全に切断されることによって得られた）を、第１の部分構造からの０．９ｋｂＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ合成オリゴヌクレオチド／ｃＤＮＡ断片（ＴＭ３から停止コドンまでを含んでいる）を用いて、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで切断された発現ベクター中に、連結することによって行われた。発現ベクター（ｈｐ７８ａ／ＥＸＪと呼ばれる）中のゲノム／ｃＤＮＡの全長の構築は１３３５ｂｐのオープンリーディングフレーム（２７ｂｐの５′ＵＴおよび５０ｂｐの３′ＵＴを有する）を含み、長さが４４５ａａ、相対的な分子量が〜４９、０００ダルトンであるタンパクをコードしている。タンパクのハイドロパシー分析は、Ｇタンパクがカップリングした受容体ファミリーを示す７つの膜貫通領域の推定上のトポグラフィーと一致する。最初の配列分析により、ＴＭ２およびＴＭ３中の保存されたアスパラギン酸残基、ＴＭ３末でのＡｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ配列、５番目の膜貫通領域中の保存されたアラニン残基、およびＴｍ４−７の保存されたプロリン残基（ハーティング１９８９；ハーティングら、１９９０）を含んでいるセロトニン受容体ファミリーのメンバー間で観察される多くの保存された構造的特徴／残基を、クローンｈｐ７８ａ／ＥＸＪが持っていたので、該クローンが、セロトニン受容体と最も関連していることが示された。このヒト５−ＨＴ_4B受容体遺伝子の他の特徴は、アミノ末端中のＮ−結合グリコシレーションのための２つの潜在的部位が存在すること（アスパラジン残基５および６６；図１）および、タンパクキナーゼによる潜在的なリン酸化のための部位として役立ちうるカルボキシル末端および細胞内ループ中の幾つかのセリンおよびスレオニンが存在することである。５−ＨＴ_4B受容体遺伝子をコードするＲＮＡのヒト組織分布。様々なヒト組織から単離された全ＲＮＡは、逆転写酵素でランダム−プライミング法によって１本鎖ｃＤＮＡに変換された。ｃＤＮＡはヒト５−ＨＴ_4B受容体遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルで電気泳動され、ナイロン膜上でブロッティングされ、内部遺伝子特異的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた。ハイブリダイゼイションに続いて、ブロットは高度に厳密な条件下で洗浄された。陽性対照は遺伝子特異的組換えプラスミドからなっていた；ｄＨ₂Ｏは、鋳型ｃＤＮＡ、ＲＮＡあるいはプラスミドを除く全ての試薬を含んでいる陰性対照として使われた。逆転写酵素で処理されなかったＲＮＡ試料のＰＣＲ増幅およびサザンブロッティングは陰性であった。ｈｐ７８ａ転写物の発現を様々なヒト組織から単離されたＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡの増幅によって分析した（逆転写ＰＣＲあるいはＲＴ−ＰＣＲ）（図３）。遺伝子特異的ＰＣＲプライマーおよび遺伝子特異的内部オリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、機能的なｈｐ７８ａクローン（擬遺伝子（ps eudegene）ではない）の組織分布を選択的に実験することができたが、これによって擬遺伝子を検出できなかった。適度に高いレベルで構成的に発現される遺伝子、アクチンおよびグリセルアルデヒド三−リン酸脱水素酵素に対するプライマーを用いて、対照のＲＴ−ＰＣＲを行うことによって、全ての組織に対して比較しうる量の開始ＲＮＡがもたらされた（クロンテック；結果は示されない）。５ −ＨＴ_4B受容体（ｈｐ７８ａ）受容体をコードするｍＲＮＡは脳内において高いレベルで発現され、様々な末梢組織（腎臓、肝臓、すい臓、精巣、子宮、腸間膜（mesentary）そして脾臓）では低いレベルで発現される。５−ＨＴ_4B受容体の薬理学的プロフィールおよび平滑筋弛緩に関与する既に特徴付けられた５−ＨＴ受容体とのその関連性を基にして、ＲＮＡ発現に対して更に多くの組織を試験した。興味深いことに、平滑筋弛緩受容体としての５−ＨＴ_4Bの役割の可能性と一致した冠状動脈および胃、膀胱、下行結腸および回腸を含む、胃腸管の様々な領域における５−ＨＴ_4Bに対する高いレベルのｍＲＮＡが検出された（図３）。 in situハイブリダイゼイション研究の結果により（表２）、５−ＨＴ_4BｍＲＮＡの分布は、幾つかの領域で５−ＨＴ_4B受容体の分布と重なり合っていたことが示された。最も強いハイブリダイゼイションシグナルは視床中のニューロンに渡って、前方海馬痕跡、および海馬中のＣＡ３に渡って観察された。ハイブリダイゼイションシグナルを含んでいるほかの領域は中隔、視床下部、中央内部の扁桃体及び中脳水道周囲の灰白質を含んでいた。興味深いことに、強い受容体結合シグナルが存在する２つの領域、淡蒼球および黒質は、５−ＨＴ_4Bハイブリダイゼイションシグナルを含んでおらず、このことはこれら２つの関連した構造において５−ＨＴ_4B受容体は前シナプスに局在することを示唆している。［³Ｈ］５−ＣＴの特異的結合はラット脳の多くの領域で観察された。１μＭのエルゴタミンを用いたインキュベートの後、この結合は完全に解離された。放射リガンドにＰＡＰＰおよび（−）ピンドロールを添加すると多くの領域で、最も著しくは、大脳皮質の深層、海馬、背面の縫線、および脊髄で、結合が顕著に減少した。マスクを添加した後、［³Ｈ］５−ＣＴ結合が残っていた領域は皮質の層１−３、中隔、淡蒼球、視床、視床下部、中央内部の扁桃体、黒質、中脳水道周囲の灰白質、および上丘であった。これらの領域全てにおける放射リガンド結合は、インキュベートレジメン（regi-menn）に５μＭメチトロピンを添加することよって失われた。このことは、観察された結合が５−ＨＴ_4B受容体によるものであることを示している。新規ヒト５−ＨＴ受容体をコードする遺伝子を一時的に発現するサル腎臓細胞を、薬理学的実験に使用した。一時的に形質導入されたＣｏｓ−７細胞から集められた膜は、高い親和性で、飽和しうる［³Ｈ］５−ＨＴ結合を示した。［³Ｈ］５−ＨＴ飽和データの非線形解析から平行解離定数（Ｋ_d）８．５±０．８ｎＭおよび結合部位密度（Ｂ_MAX）６．６±０．８pmol／mgタンパクが得られた。特異的［³Ｈ］５−ＨＴ結合は、Ｋ_d値と等しい放射リガンド濃度において全結合の９０％以上であった。一次的形質導入体から調製された膜に対する高親和性の［³Ｈ］５−ＨＴ結合は、１００μＭのＧｐｐ（ＮＨ）ｐ（これは、ＧＴＰの非加水分解され得ない類似物である）によって有意に（７５％）減少された。非形質導入宿主細胞では特異的［³Ｈ］５−ＨＴ結合は見られなかった。新しく単離されたセロトニン受容体遺伝子の薬理学的特徴（identity）をさらに評価するために、クローンｈｐ７８ａの詳細な結合特性が、高い親和性［³Ｈ］５−ＨＴ結合に対する競合を非線形解析することにより決定された。特異的［³ Ｈ］５−ＨＴ結合は、種々の構造的に異なったセロトニン作動性リガンドによって一相性の仕方（monophasicmanner）で（ｎ_H＝１）完全に置換された。特異的［³Ｈ］５−ＨＴ結合を置換するこれらの化合物の効果の順位は、５−ＣＴ＞メチオテピン＞メテルゴリン＝ＤＨＥ＝５−ＭｅＯＴ＞５−ＨＴ＞２−Ｂｒ−ＬＳＤ＞ＤＰ−５−ＣＴ＞ＤＰＡＴ＞スマトリプタン＞ＩＣＳ２０３９３０であった（表３および４）。幾つかのエルゴット誘導体は、クローン５−ＨＴ_4B受容体に対して高い親和性（Ｋｉ＜２０ｎＭ）を示し、これらの誘導体にはメテルゴリン、ジヒドロエルゴタミン、エルゴタミン、およびメサレルギンが含まれる。サブタイプを選択的に表示し、クローンｆｐ７８ａに対して低い親和性（Ｋ_i＞１００ｎＭ）を示すセロトニン作動性リガンドには、ＤＰＡＴ（５−ＨＴ_1A）、スマトリプタン（５−ＨＴ_1D）、ケタンセリン（５−ＨＴ₂）、およびザコプリド（５−ＨＴ₃）が含まれる。機能的な５−ＨＴ₄受容体に活性である化合物、置換ベンザミド（ＩＣＳ２０３９３０、ＭＤＬ２９４２９、ザコプリド）も５−ＨＴ_4B受容体に対して低い親和性（Ｋ_i＞５００ｎＭ）を示した。他の生理活性アミンは、クローンｈｐ７８ａに対して感知できる親和性（Ｋ_i＞１μＭ）を示さなかった（表３および４）。アデニレートシクラーゼと機能的にカップリングするクローンｈｐ７８ａの能力を、ｈｐ７８ａをコードする遺伝子を一時的に発現するインタクトＣｏｓ−７細胞を用いて試験した。基底（basal）ｃＡＭＰ放出の刺激およびＦＳＫで刺激されたｃＡＭＰ応答の阻害の両方について試験した。５−ＨＴ（１μＭ）は、形質導入されていないＣｏｓ−７細胞あるいはモックで形質導入されたＣｏｓ７細胞における基底あるいはＦＳＫで刺激されたアデニレートシクラーゼ活性のいずれにも影響しなかった（結果は示されない）。この結果は、内在性シクラーゼカップリングされたセロトニン受容体が形質導入されていない細胞では発現されていないということを示している。形質導入されたＣｏｓ−７細胞へ５−ＨＴ（１ μＭ）を添加すると基底ｃＡＭＰ放出が７倍刺激される結果となった（０．０３５±０．００４pmol／ml／１０分）；基底あるいはＦＳＫで剌激されたｃＡＭＰ放出の阻害は観察されなかった。１μＭＦＳＫおよび１μＭ５−ＨＴを同時にインキュベーショントすると、相乗作用でｃＡＭＰ応答が引き起こされ、細胞内ｃＡＭＰの蓄積が７５倍刺激された（結果は示されない）。５−ＣＴおよび５−ＭｅＯＴも１μＭで強力なアゴニストであったが、興味深いことに５−ＣＴは５− ＨＴ自身よりさらに効果が高いようだった。一方８−ＯＨ−ＤＰＡＴは１μＭで約２倍だけ基低ｃＡＭＰ応答を刺激した。１０μＭでメチセルギド、メテルゴリンおよびメチオテピンは、ほとんど完全に５−ＨＴ応答を拮抗したが、ＩＣＳ− ２０５−９３０は１００μＭで弱い阻害効果を持っていただけであった。完全な用量−反応曲線が５−ＨＴおよび５−ＣＴについて決定された。５−ＨＴは９９２±３４５ｎＭのＥＣ₅₀値および２，１９１±７１５％の基底ｃＡＭＰ放出（ｎ＝４）の最大剌激（Ｅ_MAX値）を示し、一方５−ＣＴは同様なＥ_MAX（２０２９±４７％の基礎ｃＡＭＰ放出、ｎ＝４）を持つより高い親和性（ＥＣ₅₀＝７５±１５ｎＭ）を持っていた（表５；図４および５）。安定的に形質導入されたＬＭ（ｔｋ-）細胞では、５−ＨＴは基底ｃＡＭＰの蓄積の４００％の最高刺激を示した。基底あるいはＦＳＫで刺激されたｃＡＭＰ放出のいずれかの阻害は観察されなかった。様々な試験化合物の親和性値が表６にまとめられている。一般に機能的な研究から得られたアゴニストのＥＣ₅₀値は、結合アッセイから得られたＫ_i値よりも大きさが約１ケタ低くなっていた。５−ＣＴおよび５−ＭｅＯＴは５−ＨＴに匹敵する本質的な活性を持っている強力な作働薬であった。しかし５−ＣＴは５−ＨＴよりも顕著に高い親和性（約１０倍）を有していた。８−ＯＨ−ＤＰＡＴは５−ＨＴによって引き出される最大の応答の約半分の値を示す弱いアゴニストであった。全ての試験されたエルゴットアルカロイドは、結合アッセイから得られたＫ_iから大きく離れていないＫ_B値をもつサイレントアンタゴニストとしてふるまった。メチオテピンも強力なサイレントアンタゴニストであった（表６）。考察我々は、ヒト脳ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから新規なヒトセロトニン受容体（ｈｐ７８ａあるいは５ＨＴ_4B）を表すＤＮＡをクローニングした。全ての既知のＧタンパクがカップリングする受容体配列（ＥＭＢＬ／ジーンバンクデータベース）のうち、最も大きな相同性が、クローンｈｐ７８ａ受容体遺伝子とショウジョウバエ５ＨＴＲセロトニン受容体遺伝子（ウィッツら、１９９０）間に存在した。既知のＧタンパクがカップリングする受容体配列とクローンｈｐ７８ａ推定アミノ酸配列とを比較すると、一致するアミノ酸が膜貫通ドメインに最も高い濃度で存在することが示される。これらのＴＭ領域内では、ｈｐ７８ａクローンに対する一致率がＤｒｏ５ＨＴＲ１と比較して５７％、セロトニン受容体サブファミリーとでは３９−５３％（図２参照）、アドレナリン作動性受容体サブファミリーとでは４０−５０％、ドーパミン受容体サブファミリーとでは４４−４９％、ヒスタミン受容体サブファミリーとでは３７−４１％、ペプチド受容体とでは２７−２８％およびアデノシン受容体とでは３２−３３％である。他のＧタンパクがカップリングする受容体あるいはセロトニン作動性サブファミリーの他のメンバーと比較すると、このヒトｈｐ７８ａ配列の並び方および一致率は共に、これが新しい受容体であるということを強く示唆している。クローンｈｐ７８ａ受容体と既知の何れかのセロトニン受容体間のＴＭ相同性が５５％より低く、この受容体がアデニレートシクラーゼに陽性にカップリングしているという事実があるので（結果および以下参照）、我々はこのクローンを５−ＨＴ_4Bと命名している。この受容体の転写産物の局在化は比較的広い組織分布を示す。調べられた組織のうち、ヒト５−ＨＴ_4B（クローンｈｐ７８ａ）受容体ｍＲＮＡは脳、精巣および膀胱中で、最も豊富に検出され、他の末梢組織中では中程度から低いレベルで観察され、皮膚および舌ではシグナルは検出されなかった。ここで記載された５−ＨＴ_4B受容体およびそのｍＲＮＡの分布は、この新規なセロトニン受容体が、幾つかの脳システム内で機能を補助しているのかもしれないということを示している。縁システム（中隔、中央内側の扁桃体、前方海馬痕跡、視床下部）では、特に良く表われており、感情の過程における５−ＨＴ_4B受容体の役割が示唆される。この受容体がクロザピンに非常に良く結合するという調査結果は、この見解を支持しており、５−ＨＴ_4B受容体が精神分裂病あるいは他の神経学的に基礎とされる感情の疾患に関与しうることを暗示している。加えて、新皮質に突出する視床核でのクローンｈｐ７８ａｍＲＮＡの局在化は、この受容体が感覚の過程に関与していることを示唆している。縫線核における局在化は、不安解消あるいは抗うつ作用における５−ＨＴ_4Bの機能を介する新規な治療法としての目標になりうオートレセプターとして機能しうることを示している。５−ＨＴ受容体の分布が一般に種に渡って保存されているので、ラットあるいはモルモットのようなヒト以外の種で起こる局在化の結果は、ヒト脳に対して最もありそうな類似結果であると考えられている。クローンｈｐ７８ａ受容体で得られた結合プロフィールは、その独特な薬理学的プロフィールを基にした異なったセロトニン受容体サブタイプを表わしていると考えられる。［³Ｈ］５−ＨＴ結合に置換する化合物の順位は（表３）、他の［³Ｈ］５−ＨＴ結合部位で得られた結合特性（ＸｉｏｎｇおよびＮｅｌｓｏｎ、１９８９；ゼムイリンら、１９９１）、あるいは様々な機能的プレパレーション（preparations）で示された薬理学的に定義されたセロトニン受容体の薬理学的性質（以下参照）とは一致しない。クローンｈｐ７８ａ受容体に対する５−ＣＴの高い親和性（Ｋ_i＝０．５ｎＭ）およびスマトリプタンの低い親和性（Ｋ_i＞７５０ｎＭ）は、モルモット線条体のホモジネートで最近同定された［³Ｈ］５ −ＣＴ結合部位の結合特性と一致する（マーレら、１９９２）。しかしながら、結合部位の完全な特徴付けが欠如していること、そして機能的反応が示されていないことから、［³Ｈ］５−ＣＴ結合部位の薬理学的性質に対するクローンｈｐ７８ａ受容体の薬理学的性質を直接比較することはできない。５−ＨＴ₁受容体サブタイプを分類するために使用されている結合の基準には、５−ＨＴおよび５−ＣＴに対する高い親和性が含まれる。これらの２つの化合物はクローンｈｐ７８ａ受容体に対して高い親和性を示す（表３）。しかし、最近クローニングされたヒト５−ＨＴ_1E（マックアリスターら、１９９２；ゾンビックら、１９９２）および５−ＨＴ_1F （アダムら、１９９２）両受容体は、５−ＨＴに対して高い親和性（Ｋ_i＜１０ｎＭ）を示し、５−ＣＴに対して低い親和性（Ｋ_i＞７００ｎＭ）を示している。５−ＨＴ_1Eと５−ＨＴ_1F受容体は、５−ＨＴ₁受容体ファミリーの他のクローニングされたメンバー（５−ＨＴ_1A、５−ＨＴ_1B、５−ＨＴ_1Dα、５−ＨＴ_1D _β ）のＴＭ相同性に対する５−ＨＴ_1Eおよび５−ＨＴ_1F受容体のＴＭ相同性、およびセカンドメッセンジャーカップリング（アデニレートシクラーゼの阻害）を根拠とすると、５−ＨＴ₁受容体ファミリーのメンバーである。さらに、クローニングされた５−ＨＴ_1c受容体は高い親和性で［³Ｈ］５−ＨＴに結合するが、クローニングされた５−ＨＴ₂受容体に対する高いＴＭ相同性（７５％）およびホスフォリパーゼＣに対する機能的カップリングを根拠にすれば、該５−ＨＴ_1c は５−ＨＴ₂受容体であると考えられる（ハーティングら、１９９０；ジュリウス、１９９２）。これらの観察を基にすると、５−ＨＴ₁受容体サブタイプとしてクローンｈｐ７８ａ受容体を分類することは、その放射リガンド結合性質のみを根拠として難しい。クローンｈｐ７８ａ受容体の機能的応答は、その同定に対してさらに洞察を与える。Ｃｏｓ−７細胞で一時的に発現されたクローンｈｐ７８ａ受容体遺伝子はアデニレートシクラーゼの刺激にカップリングしていた。５−ＨＴおよび５−ＣＴは両方とも基底レベルを越えてｃＡＭＰ放出を２０倍増加させた。結合アッセイで得られた５−ＨＴおよび５−ＣＴのＫ_i値は機能的アッセイから得られたこれらのアゴニストのＥＣ₅₀値よりも約１００倍高い親和性であった。機能的アッセイで観察されたアゴニストの強さの順位、即ち５−ＣＴ＞５−ＨＴ≧５−ＭｅＯＴ＞８−ＯＨ−ＤＰＡＴは、特異的［³Ｈ］５−ＨＴ結合と置換するこれらの化合物の順位と非常によく似ている。５−ＨＴ_4B受容体を発現する安定なＬＭ（ｔｋ^-）細胞は、一時的に形質導入されたＣＯＳ−７細胞に対するのと非常によく似ている薬理作用を示し、アゴニストは、本質的に同一の強さの順位を示した。しかし、アゴニストでもたらされる最大のｃＡＭＰ応答は、ＬＭ（ｔｋ^-）細胞においてより低かった。アンタゴニストは次に示す強さの順位を有していた：ｄ−ＬＳＤ＞メチオテピン≧２−Ｂｒ−ＬＳＤ＞メスレルギン＝ＤＨＥ。アデニレートシクラーゼを活性化するセロトニンの能力は幾つかの系で示されている。それらの系は：マウス胚の小丘（５−ＨＴ₄、ダミウスら、１９８８）、ウマ脳グリア膜（５−ＨＴ₁様、フィリオンら、１９８０）、ラットおよびモルモット海馬膜（５−ＨＴ_1A、シェンカーら、１９８７）、ヒト心房（５−ＨＴ₄ 、カンマンら、１９８９）、ＮＣＢ２０神経芽細胞腫ハイブリッド細胞（５− ＨＴ₄様、コーナーおよびマンサー、１９９０；コーサリーら、１９９０）およびブタ新生児大動脈（５−ＨＴ₁様、トラベシックら、１９８４）。ＨＴ_4B遺伝子によってコードされる受容体は、幾つかの共通する性質を持つけれども、これらのプレパレーションで同定された５−ＨＴ₄受容体とは異なっている。小丘、心房およびＮＣＢ２０細胞で見出された５−ＨＴ₄受容体とクローンｈｐ７８ａ受容体は共に、低い親和性でｃＡＭＰ放出を剌激する５−ＨＴおよび５−ＭｅＯＴに対して同等の強さを有している。加えて、８−ＯＨ−ＤＰＡＴ、スピペロン、ケタンセリン、およびピンドロールに対して、両方とも比較的非感受性である。しかし、メチオテピンは小丘および心房の５−ＨＴ₄受容体のアンタゴニストではないが、クローンｈｐ７８ａ受容体によって媒介される機能的応答の強力なアンタゴニストである。最も厳密には、「古典的な」５−ＨＴ₄受容体を同定するために使われる化合物は（アゴニスト：シサプリド、ザコプリド、ＢＲＬ２９４２９；弱いアンタゴニスト：ＩＣＳ−２０５−９３０）、クローンｈｐ７８ａ受容体に対して全て弱い活性かあるいは不活性である。幾分密接した薬理学的関係が、クローンｈｐ７８ａ受容体とＮＣＢ２０細胞の５−ＨＴ₄様受容体間に存在し、この関係にはメチオテピンの強力なアンタゴニスト活性が含まれている。しかし、次に示す違いを根拠にした異なる実体がある：ａ）［³Ｈ］５−ＨＴはクローンｈｐ７８ａ受容体に対して高い親和性（Ｋｄ＝８．５ｎＭ）で結合するが、ＮＣＢ２０細胞の５−ＨＴ受容体では非常に低い親和性（〜２００ｎＭ）である（ベリー−クラビスおよびダウソン、１９８３）、ｂ）ｈｐ７８ａへのアゴニストの強さの順位は５−ＣＴ＞５−ＨＴ≧５−ＭｅＯＴであり、一方ＮＣＢ２０細胞では順位は５−ＨＴ≧５−ＭｅＯＴ＞５−ＣＴである（コーナーおよびマンソアー、１９９０）。加えて、クローンｈｐ７８ａ受容体はグリア膜に存在する５−ＨＴ受容体と幾つかの性質を共有している（フィリオンら、１９８０）。これらには：（ａ）［³Ｈ］５−ＨＴの平行解離定数、Ｋ_d＝１０Ｎｍ；（ｂ）ｃＡＭＰの５−ＨＴ刺激に対するＥＣ₅₀値（５００−１０００ｎＭ）、および（ｃ）２−臭化ＬＳＤ、メチセルギドおよびメチオテピンによる強力な拮抗作用が含まれる。５−ＨＴ₁、５−ＨＴ₂、５−ＨＴ₃、および５−ＨＴ₄と命名された４つの異なるクラスにセロトニン受容体を分類するために使われる基準は、結合の性質、シグナルトランスダクション機構（signal transduction mechanisms）、および推定アミノ酸配列が基となっている。ブラッドリーら（１９８６）によって提唱されたセロトニン受容体の分類概要によれば、５−ＣＴはアゴニストとして働き、その応答は非選択的な５−ＨＴ₁アンタゴニストメチオテピンによって強力に拮抗されるので、クローンｈｐ７８ａ受容体は、５−ＨＴ₁受容体ファミリーのメンバーであると考えることができる。しかし、ここで観察されたアデニレートシクラーゼへのクローンｈｐ７８ａ受容体の陽性カップリングは、５−ＨＴ₁受容体サブファミリーのクローニングされたメンバーに対する報告と一致していない。ここで、前記サブファミリーは、ＦＳＫで刺激されるｃＡＭＰ放出の阻害にカップリングし、５−ＨＴ_1A（コビルカら、１９８７；ファーギンら、１９８８）、５−ＨＴ_1B（アダムら、１９９２；マロテオックスら、１９９２）、５−ＨＴ_1Dα（ハンブリンおよびメトカーフ、１９９１；バインシャンクら１９９２）；５−ＨＴ_1Dβ（デンチシンら、１９９２；ジンら、１９９２；バインシャンクら１９９２）；５−ＨＴ_1E（レビーら、１９９２；マックアッリスターら、１９９２；ゾンンビックら、１９９２）；そして５−ＨＴ_1F（アダムら、提出中）を含む。便利な構築体ではあるが、結合の性質だけを根拠にセロトニン受容体を分類すると間違うことがある。例えば、結合基準によって最初に命名された５−ＨＴ_1c 受容体は、（［³Ｈ］５−ＨＴはこのサブタイプに対して高い親和性で結合する）５−ＨＴ₂受容体に対するＴＭドメイン内での高い程度の相同性、およびセカンドメッセンジャーカップリング（イノシトールリン酸加水分解）を根拠にすれば、現在は５−ＨＴ₂サブタイプと考えられている［ハーティングら、１９９０、ジュリウス、１９９２］。同様に、クローンｈｐ７８ａ受容体は高い親和性で［³Ｈ］５−ＨＴと結合するが、アデニレートシクラーゼに対する陽性カップリングおよび５−ＨＴ₁受容体ファミリーの他にクローニングされたメンバーに対する低いＴＭ相同性（〜５０％）により、クローンｈｐ７８ａは５−ＨＴ₁サブタイプをコードする可能性を除外することができるだろう。従って、ＴＭ相同性の比較およびセカンドメッセンジャーカップリングは、放射リガンド結合特性よりも受容体の分類に対してより正確な予測法であると思われる。これらの分析を基に、我々はクローンｈｐ７８ａを５−ＨＴ₄受容体サブファミリーの最初のメンバーとして命名することを提案する。クローンｈｐ７８ａの薬理学的プロフィールは薬理学的に定義された５−ＨＴ₄受容体のプロフィールとは異なる。従って、様々な単離された組織プレパレーションで開示された５−ＨＴ₄受容体の薬理学的プロフィールを示しているクローンに対して５−ＨＴ_4Aの命名を残しながら、クローンｈｐ７８ａは５−ＨＴ_4Bと呼ばれるだろう（ボカートら、１９９２）。結論として、ｈｐ７８ａ遺伝子の一次構造、並びにその独特な薬理学的プロフィールおよび一時的に形質導入された細胞から得られたアデニレートシクラーゼに対する陽性カップリングは、この遺伝子が５−ＨＴ_4B受容体ファミリーの最初のメンバーをコードしうることを示している。クローンｈｐ７８ａは、薬理学的に定義された５−ＨＴ₄受容体の薬理学的性質を示さないので、５−ＨＴ_4B受容体サブタイプとして命名されることが提案される。さらにクローニングをする努力が、この新たに認識されたセロトニン受容体ファミリーのさらなるメンバーを単離するために必要であろう（ボッカートら、１９９２）。組織モデルで定義された５−ＨＴ_4Bとセロトニン受容体の薬理学的関係との比較から、脈管系で記載された関連受容体収集物と同一である可能性が示される。これらの受容体の幾つかは、単離された血管で弛緩反応を起こすと考えられており、アンギーナ、冠状動脈疾患、アテローム硬化症、発作を引き起こす可能性のある大脳血管障害において、潜在的な治療の有益性を示している。ＣＮＳにおけるこのサブタイプの存在はまた、より高度な認識的過程の疾患、並びに自律神経作用のコントロールにおける潜在的な利用を示している。さらに、５−ＨＴ₇受容体に対する非典型的な抗精神病剤クロザピンの比較的高い親和性（Ｋ_i＝７８ｎＭ）、並びに縁および皮質領域でのこのサブタイプの局在化は、セロトニン作動性神経伝達が関与する精神分裂病のような神経精神医学的疾患での５−ＨＴ₇サブタイプの潜在的な役割を示している。参照文献配列表（１）一般情報（ｉ）出願人：Bard A．Jonathan Branchek A．Theresa Weinshank L．Richard （ii）発明の名称：ヒトセロトニン受容体（５−ＨＴ４Ｂ）をコードするＤＮＡおよびその使用（iii）配列の数：２（iv）宛名住所：（Ａ）宛名人：Cooper & Dunham （Ｂ）ストリート：３０ロックフェラープラザ（Ｃ）シティー：ニューヨーク（Ｄ）州：ミューヨーク（Ｅ）国：米国（Ｆ）郵便番号：１０１１２（ｖ）コンピユータ読み込み可能形式（Ａ）メディアのタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：パテントインリリース＃１．２４（vi）本出願のデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（viii）代理人／エージェント情報（Ａ）氏名：white P.，John （Ｂ）登録番号：２８，６７８（Ｃ）参照／事件番号：４１９０８−Ａ−ＰＣＴ／ＪＰＷ/ＴＥＰ（ix）通信情報：（Ａ）電話：（２１２）９７７−９５５０（Ｂ）ファックス：（２１２）３１５−１９３１（Ｃ）テレックス：４２２５２３ＣＯＯＰＵＩ（２）配列番号１に対する情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：１４０６塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖：二重鎖（Ｄ）トポロジー：未知（ii）分子のタイプ：ｃＤＮＡ（iii）仮定：Ｎ（iv）アンチセンス：Ｎ（vii）直接の源（Ａ）ライブラリー：ヒト脳（Ｂ）クローン：ｈｐ７８ａ（ix）特性：（Ａ）名前／鍵：ＣＤＳ（Ｂ）位置：２８．．１３６２（Ｄ）その他の情報：（xi）配列の説明：配列番号：１（２）配列番号２に対する情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：４４５アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直線（ii）分子のタイプ：タンパク（xi）配列の説明：配列番号：２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4ＢＧ０１Ｎ 33/566 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4ＣＮ 9284−4Ｃ (72)発明者ウエインスハンク、リチャード・エルアメリカ合衆国、ニューヨーク州 10024、ニューヨーク、ウエスト・エイティーセブンス・ストリート 302

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする単離された核酸分子。２．請求の範囲第１項に記載の核酸分子であって、該核酸分子がヒト５−ＨＴ_4B 受容体をコードするもの。３．請求の範囲第１項に記載の核酸分子であって、該核酸分子がＤＮＡ分子であるもの。４．請求の範囲第３項に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子であるもの。５．請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子がゲノムＤＮＡから誘導されるもの。６．１以上のヌクレオチドにおいて５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子の配列と異なった核酸配列を有し、５ＨＴ_4B受容体活性を有するタンパクをコードしない単離された核酸分子。７．請求の範囲第６項に記載の核酸分子であって、該核酸分子がＤＮＡ分子であるもの。８．請求の範囲第７項に記載のＤＮＡ分子であって、該ＤＮＡ分子がｃＤＮＡ分子であるもの。９．請求の範囲第４項に記載のｃＤＮＡ分子を具備したベクター。１０．請求の範囲第９項に記載のプラスミドベクター。１１．バクテリア細胞内での発現に適した請求の範囲第９項に記載のベクターであって、５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡの発現を可能にするようにｃＤＮＡに相対的に配置された、バクテリア細胞内での５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡの発現に必要な調節要素を具備したベクター。１２．酵母細胞内での発現に適した請求の範囲第９項に記載のベクターであって、５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡの発現を可能にするようにｃＤＮＡに相対的に配置された、酵母細胞内での５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡの発現に必要な調節要素を具備したベクター。１３．哺乳動物細胞内での発現に適した請求の範囲第９項に記載のベクターであって、５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡの発現を可能にするようにｃＤＮＡに相対的に配置された、哺乳動物細胞内での５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡの発現に必要な調節要素を具備したベクター。１４．哺乳動物細胞内での発現に適した請求の範囲第１０項に記載のプラスミドであって、５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡの発現を可能にするようにＤＮＡに相対的に配置された、哺乳動物細胞内でのＤＮＡの発現に必要な調節要素を具備したベクター。１５．ｐｃＥＸＶ−５ＨＴ_4B（ＡＴＣＣ受付番号７５３３２）と称される請求の範囲第１４項に記載のプラスミド。１６．請求の範囲第１０項に記載のプラスミドを具備した哺乳動物細胞。１７．請求の範囲第１６項に記載の哺乳動物細胞であって、該哺乳動物細胞がＬＭ（ｔｋ−）細胞であるもの。１８．Ｌ−５−ＨＴ_4B（ＡＴＣＣ受付番号１１１６６）と称される請求の範囲第１４項に記載のプラスミドを具備したＬＭ（ｔｋ−）細胞。１９．哺乳動物５−ＨＴ4B受容体をコードする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１５のヌクレオチドの核酸分子を具備した核酸プローブ。２０．ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１５のヌクレオチドの核酸分子を具備した核酸プローブ。２１．請求の範囲第１９項に記載の核酸プローブであって、該核酸がＤＮＡであるもの。２２．請求の範囲第１９項に記載の核酸プローブの混合物であって、このようなプローブが予め定義された位置でお互いに異なった配列を有するもの。２３．ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害するように哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡ分子に特異的に結合することができる配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。２４．ｍＲＮＡ分子の翻訳を阻害するようにヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡ分子に特異的に結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド。２５．ヌクレオチドの化学的類似体を具備する請求の範囲第２３項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。２６．請求の範囲第２３項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物であって、このようなオリゴヌクレオチドが予め定義された位置でお互いに異なっている配列を有す、るもの。２７．哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の発現を検出するための方法であって、細胞または組織からＲＮＡを得ること、そのようにして得られたＲＮＡをハイブリダイズする条件下で請求の範囲第１９項に記載の核酸プローブと接触すること、該プローブにハイブリダイズされた何れかのｍＲＮＡの存在、該プローブにハイブリダイズされたｍＲＮＡの存在、該哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の発現を示すプローブにハイブリダイズされたｍＲＮＡの存在を検出すること、およびこれによって該哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の発現を検出することを具備した方法。２８．ヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を検出するための方法であって、細胞または組織からＲＮＡを得ること、そのようにして得られたＲＮＡをハイブリダイズする条件下で請求の範囲第２０項に記載の核酸プローブと接触し、該プローブにハイブリダイズされた何れかのｍＲＮＡの存在、即ち該ヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を示すプローブにハイブリダイズされたｍＲＮＡの存在を検出すること、およびこれによって該ヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を検出することを具備した方法。２９．iｎｓituのハイブリダイゼイションによって細胞または組織内の哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の発現を検出する方法であって、該細胞または組織を、ハイブリダイズする条件下で請求の範囲第１９項に記載の核酸プローブと接触し、該プローブにハイブリダイズされた何れかのｍＲＮＡの存在、即ち哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の発現を示すプローブにハイブリダイズされたｍＲＮＡの存在を検出し、これによって哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の発現を検出することを具備した方法。３０．in situのハイブリダイゼイションによって細胞または組織内のヒト５ −ＨＴ_4B受容体の発現を検出する方法であって、該細胞または組織を、ハイブリダイズする条件下で請求の範囲第２０項に記載の核酸プローブと接触し、該プローブにハイブリダイズされた何れかのｍＲＮＡの存在、即ちヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を示すプローブにハイブリダイズされたｍＲＮＡの存在を検出し、これによってヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を検出することを具備した方法。３１．遺伝子ライブラリーから５−ＨＴ_4B受容体以外の受容体をコードする遺伝子を単離する方法であって、該ライブラリーを、ハイブリダイズする条件下で請求の範囲第２１項に記載のプローブと接触し、該プローブがハイブリダイズした何れかの遺伝子を単離することを具備した方法。３２．請求の範囲第３１項に記載の方法であって、該ライブラリーを具備したＤＮＡを、ハイブリダイズする条件下で、該第一のプローブがハイブリダイズする該遺伝子のＤＮＡの相補的ストランドのＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる配列を具備した第二の核酸プローブと同時に接触し、該遺伝子配列の複数のコピーを製造するように両プローブがハイブリダイズする何れかの遺伝子配列を処理し、増幅された遺伝子配列を単離し、遺伝しライブラリーから該増幅されたＤＮＡ配列がハイブリダイズした遺伝子を単離するためのプローブとして該単離された遺伝子配列を使用することを具備した方法。３３．請求の範囲第３１項または第３２項の方法によって単離される遺伝子。３４．合成遺伝子から転写されたＲＮＡ分子の数を増加するように請求の範囲第１項に記載の単離された核酸分子およびこれに結合された少なくとも１つの調節要素を具備した合成遺伝子。３５．合成遺伝子から転写されたＲＮＡ分子の数を減少するように請求の範囲第１項に記載の単離された核酸分子およびこれに結合された少なくとも１つの調節要素を具備した合成遺伝子。３６．単離された哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体タンパク。３７．請求の範囲第３６項に記載の受容体タンパクであって、該哺乳動物５− ＨＴ_4B受容体タンパクがヒト５−ＨＴ_4B受容体であるもの。３８．請求の範囲第３６項に記載の哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を製造するための方法であって、哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を発現する細胞を誘導し、生じた細胞から哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を回収することを具備した方法。３９．請求の範囲第３６項に記載の哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を製造する方法であって、適切なベクター内に哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子を挿入すること、適切なホスト細胞内に生じたベクターを挿入すること、および生じた細胞によって製造される哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体を回収することを具備した方法。４０．請求の範囲第３７項に記載のヒト５−ＨＴ_4B受容体を製造するための方法であって、ヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現する細胞を誘導すること、および生じた細胞からヒト５−ＨＴ_4B受容体を回収することとを具備した方法。４１．請求の範囲第３７項に記載のヒト５−ＨＴ_4B受容体を製造するための方法であって、適切なベクター内にヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードする核酸分子を挿入し、生じたベクターを適切なホスト細胞に挿入し、生じた細胞によって製造されるヒト５−ＨＴ_4B受容体を回収することを具備した方法。４２．哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体に向けられた抗体または哺乳動物５−ＨＴ_4B 受容体のタンパクフラグメントに向けられた抗体。４３．ヒト５−ＨＴ_4B受容体に向けられた抗体またはヒト５−ＨＴ_4B受容体のタンパクフラグメントに向けられた抗体。４４．請求の範囲第４２項に記載の抗体であって、該抗体がモノクローナル抗体であるもの。４５．請求の範囲第４３項に記載の抗体であって、該抗体がモノクローナル抗体であるもの。４６．請求の範囲第４４項に記載のモノクローナル抗体であって、該抗体が、哺乳動物細胞表面の５−ＨＴ_4B受容体のエピドープに向けられており、該哺乳動物５−ＨＴ_4B受容体の細胞表面エピドープのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するもの。４７．請求の範囲第４５項に記載のモノクローナル抗体であって、該抗体が、ヒト細胞表面の５−ＨＴ_4B受容体のエピドープに向けられており、該ヒト５−ＨＴ_4B受容体の細胞表面エピドープのアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するもの。４８．ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現から生じる異常を緩和するのに効果的な所定量の物質および薬剤的に許容しうる担体を含有する薬剤組成物。４９．ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過小発現から生じる異常を緩和するのに効果的な所定量の物質および薬剤的に許容しうる担体を含有する薬剤組成物。５０．細胞膜を通過することによってヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を低下するのに効果的であり、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するように細胞内においてヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡと特異的に結合するのに効果的である、有効量の請求の範囲第２４項に記載のオリゴヌクレオチド、並びに細胞膜を通過することができる薬剤的に許容しうる担体を含有した薬剤組成物。５１．請求の範囲第５０項に記載の薬剤組成物であって、該ヌクレオチドがｍＲＮＡを不活性化する物質にカップリングされる組成物。５２．請求の範囲第５１項に記載の薬剤組成物であって、該ｍＲＮＡを不活性化する物質がリボザイムである組成物。５３．請求の範囲第５１項に記載の薬剤組成物であって、細胞膜を通過できる該薬剤的に許容しうる疎水性担体が選択された細胞タイプに対して特異的なトランスポーターに結合する構造を具備し、これによって該選択された細胞タイプの細胞によって取り上げられる組成物。５４．ヒト５−ＨＴ_4B受容体への天然に存在する物質の結合をブロックするのに効果的な所定量の請求の範囲第４３項の抗体および薬剤的に許容しうる担体を含有する薬剤組成物。５５．請求の範囲第１項に記載の核酸分子を含有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。５６．請求の範囲第６項に記載の核酸分子を含有するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。５７．ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、そのゲノムが、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写されるように配置された請求の範囲第１項に記載の核酸分子を含有し、該相補的なアンチセンスｍＲＮＡがヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズされ、これによってその翻訳を低下するもの。５８．請求の範囲第５５項に記載のヒト以外のトランスジェニック動物であって、該核酸分子が更に誘導プロモータを具備するもの。５９．請求の範囲第５５項または５８項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、該核酸分子が、更に、組織特異的な調節要素を具備するもの。６０．請求の範囲第５５項に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、該ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物がマウスであるもの。６１．ヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現のレベルを変化することの生理学的な影響を決定するための方法であって、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現のレベルが誘導プロモータの使用によって変化しうるヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を製造すること具備した方法。６２．種々のレベルのヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現することの生理学的影響を決定するための方法であって、夫々が異なった量のヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物のパネルを製造することを具備した方法。６３．ヒト５−ＨＴ_4B受容体に特異的に結合できることがわかっていない化合物が、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に特異的に結合しうるか否かを決定する方法であって、哺乳動物細胞内での発現に適したプラスミド（このプラスミドは細胞の表面でヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現するＤＮＡを更に含有する）を含有する哺乳動物細胞と前記化合物とを、５−ＨＴ_4B受容体に結合することが知られているリガンドの結合を可能にする条件下で接触させること、前記ヒト５−ＨＴ_4B受容体に結合した何らかの化合物の存在を検出すること、即ち該化合物が該ヒト５−ＨＴ_4B受容体に特異的に結合しうることを示す結合された化合物の存在を検出することを具備した方法。６４．請求の範囲第６３項に記載の方法であって、該哺乳動物細胞が神経細胞以外のものである方法。６５．細胞表面のヒト５−ＨＴ_4B受容体と相互作用してこれに特異的に結合する薬剤を同定するために、化合物をスクリーニングする方法であって、哺乳動物細胞内での発現に適したプラスミド（このプラスミドは、細胞表面上でヒト５− ＨＴ_4B受容体を発現するＤＮＡを更に含有する）を含有する哺乳動物細胞と複数の薬剤とを接触させること、前記哺乳動物細胞の細胞表上で発現されるヒト５− ＨＴ_4B受容体に結合するこれらの化合物を決定すること、およびこれによってヒト５−ＨＴ_4B受容体と相互作用してこれに特異的に結合する化合物を同定することとを具備する方法。６６．請求の範囲第６５項に記載の方法であって該哺乳動物細胞が非神経細胞である方法。６７．ヒト５−ＨＴ_4B受容体に特異的に結合できることが知られていない化合物が、ヒト５−ＨＴ_4B受容体に特異的に結合できるか否かを決定する方法であって、哺乳動物中での発現に適したプラスミド（このプラスミドは細胞表面においてヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現するＤＮＡを更に含有する）を含有する哺乳動物細胞から細胞抽出物を調製すること、該細胞抽出物から膜フラクションを単離すること、該化合物と該膜フラクションとをヒト５−ＨＴ_4B受容体と結合することが知られているリガンドの結合を可能にする条件下でインキュベートすること、何れかの結合された化合物の存在を検出すること、およびこれによって該化合物がヒト５−ＨＴ_4B受容体と特異的に結合することができるか否かを決定することを具備した方法。６８．請求の範囲第６７項に記載の方法であって、該哺乳動物細胞が非神経細胞である方法。６９．ヒト５−ＨＴ_4B受容体と相互作用し、これと特異的に結合する薬剤を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、哺乳動物細胞内での発現に適したプラスミド（このプラスミドは該細胞表面上でヒト５−ＨＴ_4B受容体を発現するＤＮＡを更に含有する）を含有する哺乳動物細胞から細胞抽出物を調製すること、該細胞抽出物から膜フラクションを単離すること、該膜フラクションと複数の化合物とをインキュベートすること、ヒト５−ＨＴ_4B受容体と相互作用し、これと結合するこれらの化合物を決定すること、およびこれによってヒト５−ＨＴ_4B受容体と相互作用し、これと特異的に結合する化合物を同定することを具備した方法。７０．請求の範囲第６９項に記載の方法であって、該哺乳動物細胞が非神経細胞である方法。７１．ヒト５−ＨＴ_4B受容体に結合できることが知られていない化合物が、哺乳動物細胞表面でヒト５−ＨＴ_4B受容体を活性化するかまたはそのように活性化するリガンドを妨害するか否かを同定する方法であって、哺乳動物細胞（この細胞は、該哺乳動物細胞内での発現に適したプラスミドを含有し、このようなプラスミドは該哺乳動物細胞の細胞表面でヒト５−ＨＴ_4Bを発現するＤＮＡを更に含有する）と該化合物とを、機能的応答のブロック若しくは活性化を可能にする条件下で接触すること、該化合物がヒト５−ＨＴ_4B受容体を活性化するかまたはそのように活性化するリガンドを妨害するか否かを決定すること、およびこれによってヒト５−ＨＴ_4B受容体と結合して活性化する化合物またはそのように活性化するリガンドによるヒト５−ＨＴ_4Bの活性化を妨害する化合物として該化合物を同定することを具備した方法。７２．請求の範囲第７１項に記載の方法であって、該哺乳動物細胞が第二メッセンジャーを製造するのに必要な細胞成分を含有する非神経細胞であり、該化合物がヒト５−ＨＴ_4Bの活性化をブロックするかまたは活性化するか否かの決定が、該第二メッセンジャーの濃度の変化を検出することを具備した方法。７３．請求の範囲第７２項に記載の方法であって、該第二メッセンジャーがサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）である方法。７４．請求の範囲第７２項に記載の方法であって、該非神経細胞がＣＯＳ−７細胞である方法。７５．請求の範囲第７２項に記載の方法であって、該第二メッセンジャーがイノシトールリン酸塩代謝物である方法。７６．請求の範囲第７２項に記載の方法であって、該第二メッセンジャーが細胞内カルシウムである方法。７７．請求の範囲第６３項、第６７項、第７１項、第７２項、第７３項、第７５項または第７６項に記載の方法によって同定される化合物。７８．請求の範囲第６５項、第６９項、第７１項、第７２項、第７３項、第７５項または第７６項に記載の方法によって同定される薬剤の薬剤組成物。７９．細胞表面上のヒト５−ＨＴ_4B受容体の存在を検出するための方法であって、該細胞と請求の範囲第４４項に記載の抗体とを、該受容体への抗体の結合を可能にする条件下で接触し、該細胞に結合した何れかの抗体の存在を検出し、これによって該細胞表面上のヒト５−ＨＴ_4B受容体の存在を検出することを具備した方法。８０．ヒト５−ＨＴ_4B受容体の活性の発現に関連した異常症状を治療するための方法であって、該５−ＨＴ_4B受容体に結合して活性化する、天然に存在する物質の結果として５−ＨＴ_4B活性を低下するのに効果的な所定量の請求の範囲第８２項に記載の薬剤組成物を患者に投与することを具備した方法。８１．ヒト５−ＨＴ_4B受容体対立遺伝子の発現に関連した疾患の疾病素因を診断するための方法であって、ａ）該疾患にかかった対象からＤＮＡを得ること；ｂ）制限酵素のパネルで前記ＤＮＡの制限切断を行うこと；ｃ）得られたＤＮＡフラグメントをサイジングゲル上で電気泳動的に分離すること；ｄ）該ゲルを、ヒト５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができ、且つ検出マーカーでラベルされた核酸プローブに接触させること；ｅ）検出マーカーでラベルされた５−ＨＴ_4B受容体をコードするＤＮＡにハイブリダイズされている標識バンドを検出し、該疾患に履患した対象のＤＮＡに特異的な独特のバンドパターンを得ること；ｆ）ステップａ〜ｅによる診断のためのＤＮＡを調製すること；およびｇ）ステップｅからの前記疾患に履患している患者のＤＮＡに特異的な独特のバンドパターンと、ステップｆから診断のために得られたＤＮＡとを比較して、これらパターンが同一であるか又は異なっているかを決定することにより、パターンが同一であれば該疾患の疾病素因ありと診断することを具備した方法。８２．５−ＨＴ_4B受容体の活性の増加によって緩和される異常を治療するための方法であって、５−ＨＴ_4B受容体の活性を増加するのに効果的な、所定量の請求の範囲第８１項に記載の薬剤組成物を患者に投与し、これによって異常に低い受容体活性から生じる異常を緩和することを具備した方法。８３．請求の範囲第８１項に記載の方法であって、特異的なヒト５−ＨＴ_4B受容体対立遺伝子の発現に関連した疾患が診断される方法。８４．ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現から生じる異常を緩和することができる物質を同定する方法であって、請求の範囲第６１項または第６２項に記載のヒト以外のトランスジェニック動物に物質を投与すること、および該物質が、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過剰発現の結果として該ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物によって示される身体的および行動的な異常を緩和するか否かを決定することを具備した方法。８５．ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過小発現から生じる異常を緩和することができる物質を同定する方法であって、請求の範囲第５６項または第５７項に記載のトランスジェニック哺乳動物に物質を投与すること、および該物質が、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過小発現の結果として該ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物によって示される身体的および行動的異常を緩和するか否かを決定することを具備した方法。８６．対象における異常を治療する方法であって、該異常がヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を低下することによって緩和され、該方法が、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の発現を低下するのに効果的な有効量の請求の範囲第４８項、第５０項、第７７項または第７８項に記載の薬剤組成物を対象に投与することを具備した方法。８７．ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過小発現から生じる異常を治療する方法であって、ヒト５−ＨＴ_4B受容体の過小発現から生じる異常を緩和するのに効果的な所定量の請求の範囲第第４９項、第７７項または第７８項に記載の薬剤組成物を対象に投与することを具備した方法。８８．昆虫細胞内での発現に適した請求の範囲第９項に記載のベクターであって、昆虫細胞内の５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡの発現を可能にするように該ｃＤＮＡに対して相対的に位置された、昆虫細胞内での該５−ＨＴ_4B受容体をコードするｃＤＮＡの発現に必要な調節要素を具備したベクター。