JPH08504751A - ビオチニル化した化学発光性標識、結合体、測定法及び測定法キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 なかんずくストレプタビジン及び（又は）アビジン結合体を使用する化学発光測定法に好適である、ビオチン置換基を含有する新規な種類の化学発光性標識に関する。本発明の化学発光性標識はストレプタビジン及び（又は）アビジン自体に或いは分析物と結合したストレプタビジン及び（又は）アビジンに対して結合する能力を有する。最も厳しい商業的な測定条件を満たす加水分解安定性を有する標識構造を開示する。本発明は、標識付け化合物の会台変形体を含有する結合体、この結合体を使用する測定法並びにそのような測定法を達成するためのキットを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 ビオチニル化した化学発光性標識、結合体、 測定法及び測定法キット発明の分野 本発明は、なかんずくストレプタビジン及び（又は）アビジン結合体を使用す る化学発光測定法に好適である、ビオチン置換基を含有する新規な種類の化学発 光性標識に関する。本発明の化学発光性標識はストレプタビジン及び（又は）ア ビジン自体に或いは分析物と結合したストレプタビジン及び（又は）アビジンに 対して結合する能力を有する。最も厳しい商業的な測定法条件を満たす加水分解 安定性を有する標識構造を開示する。本発明は、標識用化合物の会合改変体を含 有する結合体、この結合体を使用する測定法並びにそのような測定法を達成する ためのキットを包含する。発明の背景 文献には、例えば、高いｐＨにおいて過酸化物又は分子状酸素による化学処理 によって反応させることにより光即ち”ルミネセンス”を発する化合物群が記載 されている。この能力を有する化合物は、化学発光性物質と称される。光は、連 鎖又は環若しくは環系の一部である化合物内のｓｐ²又はｓｐ³混成炭素において 過酸化物又は分子状酸素により誘発された反応により形成された一 過性の（”中間体”）構造の崩壊により発生する。 文献に記載されるように、中間体 を生成するどの一連の反応も中ないし強い化学ルミネセ ルミネセンスについては、約≦１１、好ましくは＜１１、最も好ましくは約５〜 約８のＰＫ_aを有するＸＨでもって離脱する良好な離脱基であるような構造であ る。反応は塩基触媒作用を要求しよう。この中間体は、式 こで、Ｙはハロゲン、−ＳＯ₂Ｒなどである）又は式 で）。Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ Vol．23，No．117（1973），p．140；「作用におけ るバイオルミネセンス」（Ｐ．Ｊ．ヘリング編、アカデミック・プレス、ロンド ン、1978，p．64-5）の中の”バイオルミネセンスの化学”；Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓ ｏｃ．Ｌｏｎｄ．B215，p．256（1982）；Ｏ「有機化学の進歩」（Ｗ．カルサー ズ及びＪ．Ｋ．スサ ーランド編、バターワース、ロンドン、1973，p．261（全て著者はＦ．マッカプ ラである）を参照されたい。 例えば、このような混成炭素を含有する化学発光性アリールエステル（標識用 化合物と称される）は次の一般反応 （ここで、Ａはアリール環又はアリール環系であり、Ｂは複素環又は複素環系で ある） に従って反応する。この反応においては、離脱基である−Ｏ−Ａは加過酸化水素 分解によって解裂されて一過性の中間体Ｂ＝Ｏを生じ、このものが崩壊して化学 ルミネセンスを発生する過程を生じることになる。 これらの化学発光性化合物のいくつかの特性、それらの製造の化学及びそれら に関するその他のファクターは、「有機化学の進歩」vol．8（カルサーズ及びス サーランド編、ウィリー＆ソンズ（1973））の中のＦ．マッカプラの”有機化合 物の化学ルミネセンス”；「バイオルミネセンス及び化学ルミネセンスの分析へ の応用」（アカデミック・プレス社（1984））の中のコーヘン、ベーヤー、ウイ ルチェック、バーナード、キム、コリンズ、ベーシュチ、リチャードソン及びマ ッカプラの”ハプテン及びペプチドホルモンのためのルミネセンスに基づく免疫 検定法の問発”p．149-158；リチャードソン、キム 、バーナード、コリンズ及びマッカプラのＣｌｉｎｉｃａ１ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，vol．31，No．10，p．1664-1668（1985）；「アメリカ臨床化学者協会第４ ０回会議」（ルイジアナ州ニューオリンズ、１９８８年７月２８日）におけるマ ッカプラの”診断への化学ルミネセンスの応用”；Ｑｕａｒｔｅｒ１ｙ Ｒｅｖ ｉｅｗｓ，Vol．20，p．485-510（1966）の中のマッカプラの”有機化合物の化 学ルミネセンス”；Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐ１ｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Vol．24，p．611-629（1970）の中のマッカプラの”有機化合物の化学ルミネセ ンス”；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｒｏｙａ１ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Vol．B 215，p．247-278（1982）の中のマッカプラの”バイオルミネセンスの化学”； 「バイオルミネセンスと化学ルミネセンス：装置と応用」（ＣＲＣプレス）、Vo l．1，Chapter2，p．9-37（1985）の中のマッカプラ及びベースチの”光を発す る選定された化学反応”；「アクリジン」（Ｒ．Ｍ．アチソン編、p．615-630、 ジョン・ウイリー＆ソンズ社、1973）のマッカプラの”アクリジンの化学発光性 反応”Chapt．IX；Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａ１ Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ，Vol．9，No．6，p．201-208（june 1976）の中のマッカプラの”バイオル ミネセンスにおける化学機構”；そしてこの主題に関する多くのその他の刊行物 及び文献に詳細に説明されている。 上記の文献に記載のように、各種の構造の化学発光性 化合物が、免疫検定法も含めて各種の測定法のための標識として企図された（こ れに関しては、米国特許第４，３８３，０３１号、同４，３８０，５８０号及び 同４，２２６，９９３号を参照されたい）。エステル、チオールエステル及びア ミドが単独で又は結合体として（即ち、他の物質に化学的に結合させて）化学発 光性標識の特に望ましい形態である。しかし、これらは、水性系において時間が 系かするにつれてそのルミネセンス能力を失う。何故ならば、これらは測定法に 利用できない物質に加水分解するからである。現在まで、これらの化合物は商業 的な測定法には使用されなかった。本発明に至るまでは、この種の物質のエステ ル、チオールエステル及びアミド形態は、水性系の一成分として長時間にわたり 最も都合のよい形態で貯蔵するのに十分な加水分解安定性を欠いていた。 化学的には、カルボン酸エステル、チオールエステル及びアミドは加水分解に よる攻撃を受けやすく、カルボン酸と、エステル、チオールエステル又はアミド の理論的な又は実際の先駆体であるヒドロキシ、メルカプト又はアミノ成分とを 生成させることは十分に理解される。酸性又は塩基性条件下では加水分解は明白 である。また、化学的には、結合に対して化学的に立体的に障害となる適当に配 置されたかさばった基を導入することによりある程度の加水分解を阻害できるこ とが認められる。西岡他Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Vol．40，No．17，p．2520- 2525（1975）；Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｐｈｙｓ ｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｄｈｅｍｉｓｔｒｙ，Vol．8，p．49-48（1976）の中の藤田他の”オルト効果 の分析”；モリソン及びボイドの「有機化学」第５版、p．842-843（1987）；マ ーチの「進んだ有機化学」第３版（ジョン・ウイリー＆ソンズ社、ニューヨーク （1985）p．240を参照されたい。マーチによれば、 「別の例の立体障害が、２又は６位にある基の共鳴又はＦ効果がどうであれエ ステル化するのが困難である２，６−二置換安息香酸に見出される。同様に、２ ，６−二置換安息香酸が一度エステル化されると、そのエステルは加水分解が困 難になる。」（原文で強調） ２，６−二置換フェノールからエステルを製造する場合にはエステル化の困難 性は上記の場合と同じではないが、マーチにより報告された一般原理は、オルト 置換基が電子供与性である限り、生成するエステルの加水分解安定性を高めるの に適用することができる。本発明が立証するように、有効なレベルの加水分解安 定性は、伝統的な化学的立体障害因子と共に（及びこの因子に加えて）選定され たレベルの電子吸引性化学効果の存在を要求する。 有機化合物におけるある基の官能性電子吸引性又は電子供与性は、一般的には 水素と比較して測定される。この相対的なランク付けは、分子上の全ての基が何 らかの電子吸引効果を与えることを認め、分子の性能に及ぼす その基が有する効果の性質によってそれらを区別している。正の数により特徴づ けられる電子吸引性官能基は、分子の同じ位置を占めていても水素よりも多く自 分自身に電子を吸引する。反対のことが、”電子供与性の基”、即ち、化学的な 約束によって負の数により特徴づけられる電子吸引性の小さい基について起こる 。シグマパラ値（σ_p）は、安息香酸のパラ位にある官能基の電子吸引性又は電 子供与性の相対的な測定値である。前記のマーチの文献のｐ．２４２−２５０及 び６１７−８を参照されたい。種々の基についてのσ_p値の表がハンシュ他 Ｊ ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，16（11），1209-1213（1977）並びにハンシュ及びレオ の「化学及び生物学においける相関分析のための置換基定数」第６章、p．49-52 （ジョン・ウイリー＆ソンズ社、ニューヨーク（1979））に見出される。このハ ンシュの文献に報告されたσ_p値は、メタ及びパラ位置の双方にある基について の相対的な値の特徴付けに頼っている。 ビタミンＢ複合体であり且つカルボキシルか反応に関係する酵素のための補酵 素であるビオチンは、次の構造 を有する。このものは、本来的に、ストレプトマイセス・アビジニイ及び卵白か らそれぞれ誘導される蛋白質であるストレプタビジン及びアビジンに対して非常 に高い親和性を有する。これらの蛋白質のいずれか一方とビオチンとの結合体が 免疫検定法及びＤＮＡプローブにおける標識系として使用されてきた。Ｃｌｉｎ ．Ｃｈｅｍ．，Vol．37/1，p．58-63（1991）の中のコスラビ他の”ビオチニル 化検出プローブを使用する競合免疫検定法への蛋白質−トレーサー結合体として のストレプタビジン−ハプテン誘導体の新規な応用”並びにＪ．ｏｆ Ｂｉｏｌ ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉ１ｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，Vol ．4，p．112-188の中のストラスバーガー及びコーエンの”ステロイド及びペプ チドの免疫検定法における万能標識としての化学発光性標識付けストレプタビジ ン（ＳＴＡＶ）”を参照されたい。アビジンは、〜６８ｋＤａの塩基性糖蛋白で あり、ビオチンに対して異例なほどに高い結合親和性（１０¹⁵Ｌ−ｍｏ１^-1）を 有する。 測定法の用途における化学発光性標識の機能は、基質分子に対する標識化合物 の結合を包含する。このような結合は、溶媒相互作用（例えば、分子の相容性） 、化学的手段により誘発され且つ時間、温度及び（又は）質量作用のような物理 的効果により影響される任意の異種溶解又は同種溶解機構により達成することが できる。例えば、反応は求核性でも求電子性でもよく、又は遊離基機構を伴うこ とができる。最も広い見方をすれば、結合は、強ないし弱い結合力を介して達成 できるものとみなすことができる。 測定法における化学発光性標識は、結合用物質の会合部分である。この部分は 、それだけで化学発光能力を有する化合物から誘導される。以下の記載において 、用語「部分」とは、そういうものとして標識に適用するときは、結合用物質と 会合される前の化合物をいう。用語「会合」とは、標識を基質分子に結合させる ための全ての又は任意の機構を含めることを意図するものである。 化学において用語「官能性」とは、典型的に、化学物質の性能に影響を与える か或いは同種溶解又は異種溶解反応のための部位を構成する基についていう。例 えば、官能性アルキル置換基とは、その基を介する相互反応の関係で使用する場 合には、これがその反応に影響を与え得るように置換されたアルキル基を意味す る。しかし、それが分子内で誘発させる電子効果について官能性であると称され るアルキル基は、アルキル基自体をいう。発明の概要 本発明は、なかんずくストレプタビジン及び（又は）アビジン結合体を使用す る化学発光測定法に好適であるビオチン置換基を含有する新規な種類の化学発光 性標識に関する。本発明の化学発光性標識は、ストレプタビジン及び（又は）ア ビジン自体に対して或いは分析物と結合したストレプタビジン及び（又は）アビ ジンに対して結合する能力を有する。最も厳しい商業的な測定法条件を満たす加 水分解安定性を有する標識構造を開示する。本発明は、標識用化合物の会合変形 体を含有する結合体、この結合体を使用する測定法並びにそのような測定法を達 成するためのキットを包含する。本発明の測定法は、競合型か又は非競合型のい ずれかである実質的にどんな免疫検定法にも有用である。 本発明のビオチニル化した化学発光性標識化合物は、塩基の存在下に過酸化水 素と反応したときに化学ルミネセンスを示す能力を有する任意のビオチニル置換 複素環式部分である。本発明の基本的な化学発光性標識構造は、結合前は、次式 （ここで、Ｒ¹は、好ましくは脂肪族であり、１〜約１ ０個の炭素原子、最も好ましくは少なくとも５個の炭素原子を含有する２価の有 機基であり、Ｒ²はビオチンの随意の基であり、存在するときは、これは少なく とも１個の炭素原子、好ましくは少なくとも５個の炭素原子を含有する２価の部 分であり、典型的な場合には、窒素及び酸素のようなヘテロ原子を含有する。ま た、Ｒ²はビオチンをビオチン部分を含有する構造と反応する１個以上の補足官 能基を含有する化合物と求核置換することにより形成される反復単位であってよ い。Ｒ^oは複素環式構造からなり、ビオチン又は置換ビオチンに直接結合してい る） を有する。 本発明の標識化合物の特に好ましい具体例は、次のビオチニル化した複素環式 化合物 （ここで、Ａはビオチン部分であり、ＢはＲ¹及び前記のような随意のＲ²であり 、Ｃは化学発光性を有する複素環式縮合環であり、Ｒ^V、Ｒ^W及びＲ^Xは水素、炭 素 に結合したアミノ、炭素に結合したカルボキシ、炭素に結合したハロゲン、炭素 に結合したスルホニル、炭素に結合したヒドロキシル、炭素に結合したアミド、 炭素に結合したチオール及び場合によっては炭素又は窒素に直接結合した１価の 有機基であってよく、Ｒ^yはアリール置換オキシ、アリール置換スルフィド部分 、或いは場合によっては酸素、硫黄若し＜は窒素結合により隣接カルボニルに結 合した有機置換スルホンイミノ部分であり、Ｚのうちの一つは窒素であり、残り は炭素である。ただし、Ｒ^V、Ｒ^W、Ｒ^X及びＲ^yの一つはＲ²（存在するならば） 又はＲ¹に直接結合して結合Ａ−Ｃを形成し、また窒素であるＺに結合するＲ^Vは 炭素−窒素結合によりその窒素に結合し、さらに場合により炭素に結合している Ｒ^Vは一緒になってアクリジニウム及びフェナントロリジニウムのような芳香族 縮合環構造を形成する） を包含する。 さらに好ましいのは、次式 （ここで、Ｒ^V-Z及びＲ^1-2は前記の定義を有する） のビオチニル化構造である。特に望ましいものは、次式 （ここで、Ｒ²は前記の通りであり、存在するときはＲ_a-eの一つに結合し、また Ｒ²が存在しないときはカルボニルがＲ_a-eの一つに結合し、Ｒ_a-eはそれぞれ水 素、１〜約１２個の炭素原子を含有するアルキル、アリール又は縮合アリール（ これによりビスアリール、ジシクロアリール、トリシクロアリール、５〜８個の 炭素原子を含有するシクロアルキルを形成する）の一つ、或いは環の炭素に直接 結合しているか又は環に無機の若しくは有機の基を介して間接的に結合している 官能基の一つであり、その官能基はＡのビオチンに場合によりＲ²を介して又は ビオチン部分のカルボニルを介して共有結合又はイオン結合している） によって包含される化合物である。 上記の化合物のうちで特に望ましい種類は、次式 の化合物である。 また、本発明は、試料中の分析物の存在を測定する方法を包含する。この方法 は、分析物を前記の化学ルミネセンスで標識した特異的結合用物質（”結合体” ）と接触させ、この結合体から解離した中間体の崩壊により化学ルミネセンスを 誘発させ、それから発するルミネセンスを測定して分析物を定量することからな る。 本発明の改良化学発光性標識の測定法における機能を考慮して、本発明は、化 学的に誘発される反応により化学発光性を示し且つ特異的結合用物質に結合され た前記の化学発光性標識を含有する結合体を入れた小びんから なる特異的結合測定法キットを具体化するものである。発明の詳細な説明 ビオチンのカルボン酸部分は、ビオチンをその他の有機及び無機化合物に結合 させる官能基である。例えば、カルボン酸は、ＤＣＣのようなカルボジイミドの 存在下にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と反応することができる。生 じたＮＨＳエステルは、求核反応に入るのに好適な活性水素を含有する種々の補 足官能基と全く具合よく反応して求核反応生成物を形成することができる。この ような基の例は、アミン、ヒドロキシル（アルコール性又は芳香族ヒドロキシル ）、チオール、アミド、ウレタン、カルボキシル（安定な無水物を形成する）な どである。商業的に入手できる官能性を付与されたビオチンは下記のものを包含 する。 本発明を実施するのに好適であり且つ本発明の化学発光性標識を生成させる際 に有利な中間体を創成させる特に好ましい種類のビオチニル化した化合物は、前 記のようなＮＨＳ置換ビオチンとアミノ酸、特に活性水素を含有するものとの反 応生成物である。例えば、Ｉ．）の化合物とリジンとの反応は、ビオシチンと呼 ばれる構造を生じる。 Ｎ_E−ビオチニル−Ｌ−リジン この反応は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、 フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、グリシン、セリン、トレオニン、チ ロシン、アスパラギン、グルタミン、シテイン、リジン、アル ギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸のようなアミノ酸のいず れによっても行うことができる。この反応は、アミノカルボン酸、ヒドロキシカ ルボン酸、メルカプトカルボン酸などのいずれによっても行われる。特に好まし いのは、蛋白質を構成する２０個の天然アミノ酸とビオチンのＮＨＳエステルと の反応生成物である。この反応を以下に例示する。これは、反応体を所望の反応 生成物を形成させるのに十分な化学量論的な割合で存在させて種々の溶媒中で約 −２０℃〜約１００℃の間の温度で行うことができる反応である。 前記のＩ．）〜III．）の化合物のいずれかのような置換ビオチン又はそれら の反応生成物とアミノ酸又はその他の官能基との反応は、水、ニトリル、エーテ ル、エステルのような好適な溶媒中で、約−２０℃〜約１００℃の温和な温度で 、所望の反応度をえるのに十分な時間にわたり行われる。反応生成物は、沈殿、 蒸留、結晶化、及び類似の操作により回収される。所望ならば、生成物は、反応 媒体中に保持し、化学発光能力を与える複素環式化合物とさらに反応させること ができる。 官能性を付与されたビオチンと複素環式化合物との反応は、官能性を付与され たビオチンの官能基に対して補足となる官能基を含有する複素環式化合物を使用 するこにより行うことができる。このような化合物の例は、共に継続中の米国特 許出願第２９１，８４３号（１９８８年１２月２９日出願）、同５４９，５６４ 号（１９９０ 年７月６日出願）、同８２７，７２７号（１９９０年１月２９日出願）、そして 同８５９，９５６号、同８６０，４１０号、同８５９，６７６号、同８５９，９ ９５号、同８５９，６７６号、同８５９，９５５号、同８５９，９９４号及び同 ８６０，００１号（いずれも１９９２年３月３０日出願）に開示されている官能 性複素環式化合物である。また、ヨーロッパ特許出願公開第０２７３１１５号及 び同０２５７５４１号に記載のスルホンアミドも包含される。これらは、本発明 の範囲内の標識を生成するように官能性を付与されたビオチン及びビオチン含有 化合物と反応させることができる下記のアクリジニウム及びフェナントロリジニ ウム構造を包含する。 （ここで、Ｘ^1-3はビオチン含有化合物の官能基と反応できる官能基、又は水素 、又は好ましくは１２個以下のの炭素原子を有する１価の有機基であってよく、 Ｒ’、Ｒ”及びＲ^pは窒素及びスルホニルに炭素結合した２価の有機基であり、 これらは胎肪族、芳香族、シクロ脂肪 族、複素環式及び類似の部分であってよい） 特に望ましいビオチニル化した化学発光性の複素環式化合物は、次式により包 含されるものである。 これらの場合において、置換基は上で定義した通りである。この場合の反応は 、アクリジニウム環に結合した 官能基Ｒ^oを含み、官能基を付与されたビオチンとそれとの反応を伴う。この場 合おいて、Ｒ^oは複素環式環上の官能基からなり、ビオチニル化合物の補足基が これに結合する。例えば、アミノが２、３又は４位のいずれかにあるアミノ置換 アクリジニウムエステルは、前記したＮＨＳ置換ビオチンの一つと反応すること ができる。しかし、官能基がカルボキシ又はスルホニル型であるならば、ビオチ ン置換体は、ビオシチン、ビオシチンヒドラジド及び類似の物質により提供され るようなアミノ又はヒドロキシ置換基を含有する。 複素環式構造は、好適な環置換基Ｒ^W及びＲ^X（官能性であっても官能性でなく てもよい）を含有することができる。官能性は、化合物の加水分解安定性を高め るか或いは同種溶解若しくは異種溶解反応又は標識化合物をその基質に結合させ るその他の会合形態を経て結合能を提供する目的のものである。このような置換 基は、エステル、チオールエステル又はアミドの加水分解安定性を高めるように 複素環式結合の周囲にペリ相互作用を生じさせ、蛋白質及びその他の物質に補足 官能基を結合させるための官能性を化合物に提供し、且つ、化合物の溶解性及び 化学発光効率を増大させる目的のものである。本発明の化学発光性標識化合物が 結合された状態で機能するように化合物を蛋白質及びその他の物質と会合させる のに有用な基は、前記の共に継続中の米国特許出願に記載されたものであるが、 もちろんこれらに限定されな い。 ペリ置換基は、エステル、チオールエステル又はアミド結合が結合している炭 素に関して及び（又は）エステル、チオールエステル又はアミド結合内の炭素に 関して立体障害を起こすことができる任意の基を包含する。好ましいペリ置換基 は、短鎖アルキル基（Ｃ_1-4、例えば、メチル、エチルなど）、アリール基（例 えば、フェニル）、アラルキル（例えば、トリル、キシリルなど）、アルコキシ アルキル（Ｃ_1-4アルコキシ、例えば、メ卜キシメチル、エトキシエチルなど） を包含する。ペリ置換基は、存在するならば、エステル、チオールエステル又は アミド結合が結合している炭素に”隣接して”いる複素環式環又は環系内の炭素 原子上に位置している。部分は、１個よりも多いペリ置換基を含有できる。例え ば、ペリ置換基は、下記の位置に存在できる。 １．アクリジニウム及びアクリダンではＣ₁及びＣ₈ ２．フェナントロリジニウム及び還元フェナントロリジニウムではＣ₇ ３．キノリニウム及び還元キノリニウムではＣ₃ 前記の改良化学発光性化合物は、試料中の分析物の存在についての広範な特異 的結合測定法において有用である。ここで、”存在”とは、分析物の定性的及び （又は）定量的な検出を意昧する。このような測定法は、改良化学発光性化合物 を特異的結合反応と共に使用してその上に部分を形成させることによって検出で きる任意の 分析物に適用することができる。これらの測定法には、免疫検定法、蛋白結合測 定法及び核酸ハイブリダイゼーション測定法などがあるが、これらに限定されな い。 典型的な免疫検定法においては、分析物は免疫反応性であり、試料中のその存 在は分析試薬との免疫反応により決定される。典型的な蛋白結合測定法において は、試料中の分析物の存在は分析物と分析試薬との特異的結合反応によって決定 されが、この場合の反応性は免疫反応性以外のものである。この例としては、酵 素−基質の再認及びビオチンに対するアビジンの結合親和性がある。典型的な核 酸ハイブリダイセーション測定法においては、試料中の分析物の存在は、分析物 と分析試薬とのハイブリダイゼーション反応によって決定される。分析物の核酸 （通常は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡとして存在する）は通常まず一本鎖形に転換さ れ、キャリアー（例えば、ニトロセルロース紙）上に固定化される。別法として 、分析物の核酸はゲルマトリックス中に電気泳動させることができる。次いで、 固定化された分析物は、核酸の相補的配列によりハイブリダイセーション（即ち 、特異的に結合）させることができる。 前記した特異的結合測定法は各種の測定法で達成することができる。これらの 測定法ば二つの広いカテゴリーに入る。第一のカテゴリーでは、この測定法は、 特異的結合用物質にくつけられた改良化学発光性部分からなる化学発光性結合体 を使用ずる。ここで、”特異的結合用 物質”とは、免疫反応、蛋白結合反応、核酸ハイブリダイゼーション反応、そし てその物質が限られた生物学的、生化学的又は化学的な種と特異的に反応する任 意のその他の反応によって特異的に結合する任意の物質を意味する。このカテゴ リーの測定法においては、化学発光性結合体が特異的結合反応に関わり、試料中 の分析物の存在は化学発光性結合体を含有する１種以上の特異的結合反応生成物 の形成と比例する。この測定法は、所要の特異的結合反応を好適な反応条件下で 起こさせることによって達成される。化学発光性結合体を含有する特異的結合反 応生成物の形成は、そのような化学発光性結合体を含有する生成物の化学ルミネ センスを測定し又はそのような生成物に含まれなかった未反応の若しくは部分的 に反応した化学発光性結合体の化学ルミネセンスを測定することによって決定さ れる。 この第一カテゴリーの測定法をサンドイッチ測定法、競合測定法、表面抗原測 定法、逐次飽和測定法、競合置換測定法及び消光測定法によって例示する。 サンドイッチ法においては、化学発光性部分がくつけられる特異的結合用物質 は、分析物と特異的に結合することができる。この測定法は、さらに、分析物に 特異的に結合して試薬−分析物−化学発光性結合体複合物を形成できる試薬を利 用する。試薬は、浸漬棒、ビーズ、チューブ、紙又は重合体シートを含む（これ らに限定されない）固相にくつけることができる。そのような場合に は、試料中の分析物の存在は、特異的結合反応が終了した後の固相の化学ルミネ センスと比例する。このような測定法は、米国特許第４，６５２，５３３号、同 ４，３８３，０３１号、同４，３８０，５８０号及び同４，２２６，９９３号（ これらはここで参照することによりその内容を本明細書に含めるものとする）に おいてさらに検討されている。 競合法においては、この測定法は、分析物と特異的に結合して分析物−試薬複 合物を形成し且つ化学発光性部分がくつけられた特異的結合用物質と特異的に結 合して化学発光性結合体−試薬複合物を形成できる試薬を利用する。試薬は固相 にくつけることができ、或いは別法として試薬を含有する反応生成物を第二の抗 体を使用して又はその他の方法により沈殿させることができる。この競合法にお いては、分析物の存在は、固相又は沈殿の化学ルミネセンスと ”比例する”、 即ち、反比例する。この測定法は、すぐ上に述べた米国特許においてさらに詳述 されている。 その他の測定法においては、分析物は、それよりも大きい生物学的、生化学的 又は化学的な種の上に生じさせ又はこれらに結合させることができる。このタイ プの方法は表面抗原測定法により例示される。この方法においては、特異的結合 用物質は分析物と特異的に結合でき、分析物の存在は反応生成物として形成され た分析物−化学発光性結合体複合物と比例する。これは、細胞上の表 面抗原に特異的である抗体にストレプタビジンを介して化学発光性部分をくつけ ることによって例示される。細胞表面抗原の存在は、反応の競合の後の細胞の化 学ルミネセンスによって指示させる。細胞それ自体は、濾過系と組合せて使用し て細胞の表面に形成された分析物−化学発光性結合体複合物を未反応の化学発光 性結合体から分離することができる。これは、米国特許第４，６５２，５３３号 においてさらに詳述されている。 さらに、本発明の改良化学発光性部分は、逐次飽和法及び競合置換法を含む（ これらに限定されない）斯界において周知の測定法に使用することができる。こ れらの二つの方法はいずれも化学発光性結合体を利用し、共に（１）化学発光性 部分がくつけられた特異的結合用物質及び（２）分析物が試薬と特異的に結合す る。逐次飽和法の場合には、分析物はまず試薬と反応し、次いで化学発光性結合 体と残っている未反応の試薬との反応が行われる。競合置換法の場合には、化学 発光性結合体が、試薬にすでに結合している分析物を競合的に置換する。 消光法においては、この測定法は、分析物と特異的に結合して分析物−試薬複 合物を形成し且つ化学発光性部分がくつけられた特異的結合用物質と特異的に結 合して化学発光性結合体−試薬複合物を形成できる試薬を利用する。消光性部分 は試薬にくつけられる。この消光性部分は、化学発光性部分に最接近すると、化 学発光性部分の化学ルミネセンスを減少又は消光させる。この消光法 においては、分析物の存在は、化学発光性部分の化学ルミネセンスと比例する。 この方法の検討は、米国特許第４，２２０，４５０号及び同４，２２７，４３７ 号（これらはここで参照することによりその内容を本明細書に含めるものとする ）においてなされている。 上で検討した測定法を考慮に入れれば、以下に検討する方法において、分析試 薬を添加し反応させる順序は、斯界で周知のように広範に変えることができる。 例えば、サンドイッチ測定法においては、固相に結合させた試薬を試料中に含ま れる分析物と反応させ、この反応の後に複合化された分析物を含有する固相を残 りの試料から分離し、この分離工程の後に、化学発光性結合体を固相上の複合物 と反応させることができる。別法として、分離する前に、固相、試料及び化学発 光性結合体を一緒に同時に添加し、反応させることができる。それほど好ましい ものではないがさらに使用できる別法としては、固相に試薬を添加する前に試料 中の分析物と化学発光性結合体を反応させることができる。これと類似の混合及 び反応工程の変法を競合測定法並びに斯界において周知のその他の方法んみも適 用することができる。特異的結合反応生成物を”好適な条件下で実質的に形成さ せる”には、検定試薬の添加及び反応順序において多くの変更が可能であること を理解されたい。 第二のカテゴリーに入る測定法においては、この測定法は、結合されていない 改良化学発光性化合物を利用す る。試料中の分析物の存在は、それ自体は化学発光性部分を含有しない１種以上 の特異的結合反応生成物の形成と比例する。その代わりに、化学発光性化合物の 化学ルミネセンスはそのような反応生成物の形成と比例する。この第二のカテゴ リーの測定法の一例においては、この測定法は分析物と結合して分析物−試薬複 合物を形成させ、これにより化学発光性化合物に化学ルミネセンスを生じさせる ことができる試薬を利用する。 上記のカテゴリーの測定法に含まれる測定法は不均質系でも均質系でもよい。 不均質系の測定法では、反応生成物は、その形成が試料中の分析物の存在と比例 するので、その他の反応生成物から分離される。分離は、濾過による液相と固相 との分離、微小濾過、二重抗体沈殿、遠心分離、粒度選別クロマトグラフィー、 試料溶液からの固相の除去（例えば、浸漬棒）又は電気泳動（これらに限定され ない）を含めて任意の手段により達成することができる。例えば、サンドイッチ 測定法においては、試薬−分析物−化学発光性結合体複合物が未反応の化学発光 性結合体から分離される。表面抗原測定法においては、分析物−化学発光性結合 体複合物が未反応の化学発光性結合体から分離される。競合測定法においては、 試薬−化学発光性結合体複合物が未反応の化学発光性結合体から分離される。逐 次飽和測定法及び競合置換測定法においては、試薬−化学発光性結合体複合物が 未反応の化学発光性結合体から分離される。別法として、均質系 の測定法においては、反応生成物は分離されない。分析試薬を反応させた後、全 測定混合物から化学ルミネセンスを測定することができるが、この混合物は液状 で固相上に存在していても或いは浸漬棒又はその他の固体支持体の種々の膜層の 間に分布していてもよい。 最後に、”化学ルミネセンスの測定”には、特異的結合反応生成物の形成が試 料中の分析物の存在と比例するので、これらをその他の反応生成物から分離する 行為が含まれる。また、反応生成物の形成がそれ自体化学発光性部分の発光を開 始させないような測定法の場合には化学発光性部分が発光するのを開始させる行 為が含まれよう。実施例 標識の合成 下記の実施例は、本発明のある種の化学発光性標識の合成を示す。これらの化 学発光性標識は典型的に少量で製造され、従ってこれらの製造に使用された操作 は一般に行われている大規模の化学的製造法を反映していない。しかし、これら の反応においては、本発明の化学発光性標識を製造するために一般に使用されて いる反応を使用した。生成物を単離するのに好適な精製操作は、非溶媒の添加よ る溶媒溶液からの結晶化、溶媒抽出などのような慣用されている実験室の操作で あった。このような場合には、多くの種々の溶媒及び非溶媒が好適である。収率 は使用された反応体の％として回収された量であ る。 例１ ビオシチン（０．３ｍｇ、０．０８ミリモル）を重炭酸塩緩衝液（１５ｍＭ、 ｐＨ９．６、１００μＬ）に溶解した。２，６−ジメチル−３−クロルスルホニ ルフェニルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネート（０． ２８ｍｇ、０．０５ミリモル）をＤＭＦ（１００μＬ）に溶解し、重炭酸塩緩衝 液（２５μＬ）を添加した。二つの溶液を一緒に混合し、室温で反応させた。反 応混合物をＨＰＬＣ系を使用してＣ−１８逆相カラムでモニターした。生成物を ３６３ｎｍで検出した。０．１％のトリフルオル酢酸を含有するアセトニトリル と水との容量で９：１の混合物からなる溶離溶媒を使用した。出発物質のアクリ ジニウムエステル又はその加水分解形と全く異なる生成物に相当するピークを集 め、溶媒を蒸発させた。 得られたビオチニルアクリジニウム［２，６−ジメチル−３−（Ｎ_E−ビオチ ニル−Ｌ−リジルスルホニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カ ルボキシレート］ＢＡ を、ストレプタビジンプロゲステロン結合体を使用するプロゲステロンの定量の ための免疫検定系において試験をした。 ヤギの抗ウサギ抗体を被覆したビーズを、ウサギ抗プロゲステロン抗体（５０ μＬ、原料から１：６０，０００の希釈）、プロゲステロン含有標準物質（５０ μＬ、ステロイドを含まないヒト血清中に、０、０．１、０．５、２．０）１０ ．０、２０．０及び４０．０ｎｇ／ｍＬ）、ストレプタビジン−プロゲステロン 結合体（５０μＬ）及びビオチニルアクリジニウム［ＢＡ］（１００μＬ）燐酸 塩緩衝液、ｐＨ６．０）と共に室温で４時間インキュベート した。４時間後に、ビーズを洗浄し、ベルトホールド（商標）ルミノメーターで カウントした。 下記のデータが得られた。 例２ ビオシチン（６ｍｇ、１．６ミリモル）をアセトニトリル（４００μＬ）に溶 解し、二塩基性燐酸ナトリウム（０．１Ｍ、１ｍＬ）を添加した。２，６−ジメ チル−３−クロルスルホニルフェニルアクリジニウム−９−カルボキシレート（ ５．２ｍｇ、０．９３ミリモル）をアセトニトリル（４００μＬ）に溶解し、二 塩基性燐酸ナトリウム（０．０１Ｍ、４００μＬ）を添加した。二つの溶液を一 緒に混合し、室温で２時間放置した。反応混合物をＨＰ ＬＣ系を使用してＣ−１８逆相カラムで単離した。０．１％のトリフルオル酢酸 を含有するアセトニトリルと水との容量で９：１の混合物からなる溶離溶媒を使 用した。出発物質のアクリジニウムエステル又はその加水分解形と全く異なる生 成物に相当するピークを集め、溶媒を蒸発させた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ストレプタビジン又はアビジン複合体を形成するビオチン置換基を含有す る化学発光性標識化合物。 ２． ストレプタビジン又はアビジン或いは分析物と複合化されたストレプタビ ジン又はアビジンと複合化された請求項１記載の化学発光性標識化合物。 ３． 加水分解安定性を有する請求項１記載の化学発光性標識化合物。 ４． 特異的結合用物質に結合された化学発光性標識を使用する分析物の検出の ための診断測定法において、標識が請求項１記載の化学発光性標識化合物である 診断測定法。 ５． 特異的結合用物質に結合された請求項１記載の化学発光性標識よりなる化 学発光性標識付け結合体。 ６． 測定法が競合型又は非競合型の免疫検定法である請求項４記載の診断測定 法。 ７． ビオチン置換基が、塩基の存在下に過酸化水素と反応したときに化学ルミ ネセンスを発する能力を有するビオチニル置換複素環式部分を含有するビオチニ ル化標識化合物を形成する請求項１記載の化学発光性標識化合物。 ８． 次式 （ここで、Ｒ¹は２価の有機基であり、Ｒ²はビオチンの随意の基であり、存在ず るときは、これは少なくとも１個の炭素原子を含有する２価の部分であり、Ｒ^o は複素環式構造からなり、ビオチン又は置換ビオチンに直接結合している） を有する請求項１記載の化学発光性標識化合物。 ９． Ｒ¹が１〜約１０個の炭素原子を含有する脂肪族基からなる請求項８記載 の化学発光性標識化合物。 １０． Ｒ¹が少なくとも５個の炭素原子を含有する脂肪族基からなる請求項９ 記載の化学発光性標識化合物。 １１． Ｒ²が少なくとも５個の炭素原子を含む請求項８記載の化学発光性標識 化合物。 １２． Ｒ²がヘテロ原子を含む請求項１１記載の化学発光性標識化合物。 １３． ヘテロ原子が窒素又は酸素をからなる請求項１２記載の化学発光性標識 化合物。 １４． Ｒ²がビオチンを、ビオチン部分を含有する構造と反応する１個以上の 補足官能基を含有する化合物と求核置換することにより形成される反復単位から なる請求項８記載の化学発光性標識化合物。 １５． 次式 （ここで、Ａはビオチン部分であり、ＢはＲ¹及び随意のＲ²であり、Ｃは化学発 光性を有する複素環式縮合環であり、Ｒ^V、Ｒ^W及びＲ^Xはそれぞれ水素、炭素に 結合したアミノ、炭素に結合したカルボキシ、炭素に結合したハロゲン、炭素に 結合したスルホニル、炭素に結合したヒドロキシル、炭素に結合したアミド、炭 素に結合したチオール又は場合いより炭素若しくは窒素に直接結合した１価の有 機基であり、Ｒ^yはアリール置換オキシ、アリール置換スルフィド部分、或いは 場合により酸素、硫黄若しくは窒素結合により隣接カルボニルに結合した有機置 換スルホンイミノ部分であり、Ｚのうちの一つは窒素であり、残りは炭素である 。ただし、Ｒ^V、Ｒ^W、Ｒ^X及びＲ^yの一つはＲ²（存在するならば）又はＲ¹に直接 結合して結合Ａ〜Ｃを形成し、また窒素であるＺに結合するＲ^Vは炭素−窒素結 合によりその窒素に結合し、さらに場合により炭素に結合しているＲ^Vは一緒に なって芳香族縮合環構造を形成する） ビチオニル化複素環式構造を有する請求項８記載の化学発光性標識化合物。 １６． 複素環式縮合環がアクリジニウム及びフェナントロリジニウムである請 求項１５記載の化学発光性標識化合物。 １７． 複素環式縮合環がアクリジニウムである請求項１６記載の化学発光性標 識化合物。 １８． 複素環式縮合環がフェナントロリジニウムである請求項１６記載の化学 発光性標識化合物。 を有する請求項１７記載の化学発光性標識化合物。 ２０． ビオチニル化複素環式構造が次式 （ここで、Ｒ²は存在するときはＲ_a-eの一つに結合し、またＲ²が存在しないと きはカルボニルがＲ_a-eの一つに結合し、Ｒ_a-eはそれぞれ水素、１〜約１２個の 炭素原子を含有するアルキル、アリール又は縮合アリール（これによりビスアリ ール、ジシクロアリール、トリシクロアリール、５〜８個の炭素原子を含有する シクロアルキルを形成する）の一つ、或いは環の炭素に直接結合しているか又は 環に無機の若しくは有機の基を介して間接的に結合している官能基の一つであり 、その官能基はＡのビオチンに場合によりＲ²を介して又はビオチン部分のカル ボニルを介して共有結合又はイオン結合している） を有する請求項１９記載の化学発光性標識化合物。 ２１． 特異的結合用物質に結合させた化学発光性標識を 使用する分析物の検出のための請求項４記載の診断測定法において、請求項１記 載の化学発光性標識化合物を使用し、分析物を化学発光性標識付け特異的結合用 物質と混合し、結合体から解離する中間体の崩壊により化学ルミネセンスを誘発 させ、それからのルミネセンスを測定して分析物を定量することを特徴とする診 断測定法。 ２２． 化学発光性を有する標識付け複合体を入れた小びんを備え、標識の崩壊 により発生する化学ルミネセンスを測定することにより分析物を診断する診断測 定用キットにおいて、複合体が請求項２記載の複合体である診断測定用キット。 ２３． ビオチニル化複素環式構造が次式 を有する請求項１９記載の化学発光性標識化合物。 ２４． ビオチニル化複素環式構造が次式 を有する請求項２０記載の化学発光性標識化合物。 ２５． 官能性ビオチン含有化合物と化学発光性複素環式化合物との反応によっ てビオチニル化した化学発光性標識を製造する方法。 ２６． ビオチンがＮＨＳ置換化合物である請求項２５記載の方法。 ２７． ビオチンが次式 の化合物の一つである請求項２６記載の方法。 ２８． ビオチンがアミノ酸に結合される請求項２５記載の方法。 ２９． アミノ酸がリジンである請求項２８記載の方法。 ３０． リジンと反応されるビオチンが次式 を有する請求項２９記載の方法。 ３１． 化学発光性複素環式化合物が次式 （ここで、各Ｘ_1-3はビオチン含有化合物の官能基と反応できる官能基の一つ、 又は水素、又は１価の有機基であり、Ｒ’、Ｒ”及びＲ^Pは窒素及びスルホニル に炭素結合した２価の有機基である） の一つを有するスルホンアミドである請求項２５記載の方法。