JPH08504577A

JPH08504577A - ＴＧＦ−βの制御活性を改変するための組成物および方法

Info

Publication number: JPH08504577A
Application number: JP6511285A
Authority: JP
Inventors: レタルト，ミッチェル; マサーグ，ジョーン; ベルナビュー，カルメロ; チェイフェズ，セラ
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-26
Publication date: 1996-05-21
Also published as: CA2147754A1; EP0667870A1; AU5541094A; WO1994010187A1; EP0667870A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規な精製されたTGF-β結合性糖タンパク質、エンドグリン、およびTGF-β結合性糖タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子を提供する。また、可溶性のエンドグリン由来のポリペプチドおよびそのフラグメントが提供される。精製されたまたは組換え法により生産されたエンドグリン由来のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物、ならびに、患者に本発明の薬学的組成物を投与することにより患者を治療する方法がさらに提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 TGF-βの制御活性を改変するための組成物および方法発明の分野本発明は、細胞生物学および細胞制御因子の生物学的活性を改変するための方法に関する。さらに詳細には、本発明は新規TGF-β結合性糖タンパク質に関する。本出願を通して、種々の刊行物が括弧内に示されている。これらの刊行物の開示は全体として、本発明に関係する技術内容をさらに完全に記載するために参考として本明細書に援用されている。発明の背景翻訳後のプロセシングで、１つ以上の炭水化物ユニットがタンパク質に共有結合されている糖タンパク質が、広く分布している。免疫グロブリンを含む数種の分泌タンパク質は糖タンパク質であり、細胞膜レセプターのような原形質膜の大部分の成分であるので、その糖タンパク質は細胞-細胞付着に関係し得る。トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）は、多くの細胞型で種々の形態で産生される多重機能性の細胞制御因子のファミリーである（検討のためにSporn ら、J．Cell Biol．105:1039（1987）を参照のこと）。TGF-βの５つの異なる異性体（isoform）が同定された。TGF-β１およびTGF-β２は詳細に特徴づけられた。TGF-βは、本明細書に参考として援用されている、米国特許第4,863,899号、第4,816,561号、および第4,742,003号の主題である。T GF-βは、様々な型の細胞上に存在する細胞表面レセプターに結合し、細胞型に依存して、その他の増殖因子に対するほとんどの細胞の応答を増大あるいは抑制することが知られている。TGF-βはまた、ある種の細胞型の分化を制御し、その細胞増殖を促進あるいは抑制する。TGF-βのその他の顕著な効果は、細胞外マトリックスタンパク質およびそれらのレセプターの細胞産生の促進である（検討のために、Keski-Ojaら、J．Cell Biochem．33:95（1987）；Massague，Cell 49:4 37（1987）；RobertsおよびSporn，"Peptides Growth Factors and Their Recep tors"，Springer-Verlag（1989）を参照のこと）。有益なおよび必須の細胞制御機能がなされるにもかかわらず、TGF-β制御活性は、その宿主生物に対して有害であり得る。例えば、間葉細胞の成長および増殖がTGF-βにより促進されるが、TGF-βを自己分泌増殖因子として使用して、ある種の腫瘍細胞もまた促進され得る。その他の場合では、TGF-βによる細胞増殖の抑制は、同様にその宿主生物に対して有害である。その例は、組織損傷の修復を助けるための新たな細胞増殖の防止である。TGF-βによる細胞外マトリックスの生産の刺激は創傷治療に必要である。しかし、ある場合には、TGF-β応答は制御されず、細胞外マトリックスの過剰蓄積が生じる。細胞外マトリックスの過剰蓄積の例は、糸球体腎炎の病変で生じる「内部」瘢痕化および皮膚瘢痕組織形成である。大部分の間葉細胞および上皮細胞のトランスフォーミング増殖因子-βレセプター系は、数種の成分からなり（Massague，J．Ann．Rev．Cell Biol．6:597（1 990）；Lin，H．Y．ら、Cell 68:775（1992）；Georgi，L．L．ら、 Cell 61:63 5（1990）；Mathews. L.S.ら、 Cell 65:973（1991）；Attisano，L．ら、 Cell 68::97（1992）；Lopez-Casillasら、 Cell 67:785（1991）およびWangら、 Ce ll 67:796（1991））、その１つはβグリカンである膜アンカープロテオグリカンである。βグリカンに加えて、大部分の間葉細胞および上皮細胞のTGF-βレセプター系は、構造がまだ決定されていない、53-kDaの糖タンパク質であるI型レセプター、および、II型レセプターからなり、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼレセプターファミリーに属する。より限られた分布の、その他の細胞表面 TGF-β結合性タンパク質もまた記載されている。従って、TGF-βのような細胞制御因子の効果を改変し得る化合物の開発の必要性が存在する。本発明は、このような必要性を満たし、関連利益も提供する。発明の要旨本発明は新規な精製TGF-β結合性糖タンパク質を提供する。そのタンパク質であるエンドグリン（endoglin）は、ヒト血管内皮細胞上で高レベルで発現される。 TGF-βを、TGF-βに結合する能力を有する精製エンドグリン由来のポリペプチドあるいはそれらの任意のフラグメントの有効量に接触させることにより、TGF-β制御活性に仲介される病理学的症状を治療するための方法もまた、本発明により提供される。従って、無傷（intact）の天然のエンドグリンおよびそれらの可溶性フラグメントが、これらの方法に有用である。本発明は、完全長の可溶性エンドグリン由来のポリペプチドを調製および精製する方法を提供する。新規TGF-β結合性糖タンパク質および可溶性エンドグリン誘導ポリペプチドをコードする単離された核酸もまた、その核酸を含有するベクターおよびこのようなベクターで形質転換された組み換え宿主細胞とともに、提供される。図面の簡単な説明図１は、βグリカンおよびエンドグリンのドメイン構造を示す。853アミノ酸のトランスメンブランプロテオグリカンであるβグリカンの直鎖状配列と、各々 633アミノ酸の２つの同一サブユニットから構成されるジスルフィド結合トランスメンブランタンパク質であるエンドグリンの直鎖状配列間との類似の注目すべき領域が示されている概略図である。エンドグリンのトランスメンブラン領域および短い細胞質領域（黒四角）は、βグリカンの対応領域と高度に配列類似性を有する。これらのタンパク質の細胞外ドメイン（ectodomain）では、類似性の低い２つの領域がみとめられる（白四角）。数字は、βグリカンとエンドグリンとの示されたドメイン間のアミノ酸配列類似性のパーセントを示す。楕円はシステイン残基の位置を示す。βグリカン中のグリコサミノグリカン鎖接続のための２つの推定部位が示されている。図２は、HUVECで発現された、細胞表面TGF-β１結合性タンパク質を示す。HUV ECのコンフルエントに近い培養物を、100 pM ¹²⁵I-TGF-β１とのインキュベーション、その後の0.16mMのジスクシンイミジルスベレートとの化学架橋結合によって、アフィニティ標識した。A）アフィニティ標識HUVECのTritonX-100抽出物を、還元（R）あるいは非還元（NR）条件下でのSDS-PAGEゲル上で分離した。レーンCは、過剰の非標識TGF-β１の存在下でアフィニティ標識された細胞からの抽出物を含有する。TFG-βレセプターI（RI）およびII（RII）の移動位置を示す。矢印の180 kDaおよびより高分子量の主要アフィニティ標識タンパク質は、非還元ゲル上に現れた。矢じりは、還元ゲル上に認められた110-120 kDaのアフィニティ標識タンパク質である。B）アフィニティ標識HUVECの界面活性剤抽出物を、最初のゲル上で非還元条件下で分離し、次に、本明細書に参考として援用されているCheifetzおよびMassague，J．Biol．Chem．266:20767-20772（1991）に記載のように、２次元で還元条件下で分離した。110-120-kDaの対角線を離れて移動する標識種が示されている（矢じり）。図３は、TGF-β１-エンドグリン複合体の特異的免疫沈降を示す。HUVECは、図２に記載されているように、100pM ¹²⁵I-TGF-β１でアフィニティ標識した。A）アフィニティ標識細胞の界面活性剤抽出物をmAb 44G4とインキュベートし、免疫複合体をプロテインG-セファロースで回収した。洗浄後、試料の等量部分を、還元（R）あるいは非還元（NR）条件下でのSDS-PAGEにより分析した（5-8%濃度勾配ポリアクリルアミドゲル）。B）アフィニティ標識HUVEC溶解物を、4℃における100μlの44G4-IgG-Sephaorseとの連続２回の45分インキュベーションによって、エンドグリンを最大限に枯渇させた。S）第２回目の免疫沈降後の上清。I）83%エンドグリン含有の第１回目の44G4免疫沈降。T）枯渇実験に使用した総抽出物に対応する量。全ての試料は、還元条件下で操作したI_R以外は、SDS-PAGE上の非還元条件下で分析した。TGF-βレセプターII（RII）、およびエンドグリンモノマー、ダイマーならびにオリゴマーの移動位置を示す。図４は、COS-M6細胞で一過性発現されたエンドグリンが、TGF-β１に結合することを示す。COS-M6細胞は、完全長のL-エンドグリンをコードするcDNA（Endogl in）あるいはコントロールベクター（C）でトランスフェクトした。細胞は、150 pM ¹²⁵I-TGF-β１でアフィニティ標識し、界面活性剤抽出物を、mAb 44G4と、次いでプロテインG-セファロースとインキュベートした。免疫沈降されたタンパク質を、還元（R）および非還元（NR）条件下でSDS-PAGEにより分析し、オートラジオグラフィーで可視化した。図５は、COS細胞トランスフェクタントおよびHUVECで評価されたTGF-β異性体に対するエンドグリンの特異性を示す。A）エンドグリンベクターでトランスフェクトされたCOS-M6細胞を、150pM ¹²⁵I-TGF-β１のみでアフィニテイ標識するか、あるいは、１または10nMの非標識TGF-β１、-β２または-β３の存在下でアフィニティ標識した。B）HUVECを、100pM ¹²⁵I-TGF-β１のみでアフィニティ標識するか、あるいは、5nMの非標識TGF-β１またはTGF-β２の存在下でアフィニティ標識した。これらの細胞の溶解物を、MAb 44G4で免疫沈降させた。免疫沈降物を、SDS-PAGEゲル上て還元条件下にて分画した。モノマーエンドグリンを含有するゲルの領域を、100-kDaマーカーの移動位置とともに示す。図６は、1.7kbエンドグリンcDNA挿入フラグメントを有するベクターpcNeoSolE NDの制限酵素マップを示す。図７は、単離S-エンドグリンcDNAの部分ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。ヌクレオチドは右側に番号を付けてある。アミノ酸は左側に番号を付けてある。推定シグナル配列（ヌクレオチド283-357）、およびトランスメンブラン領域（ヌクレオチド2042-2116）は太字で示す。135bpの挿入フラグメント（下線を付けた）は、ドナー／アクセプター部位（2134位および2267位の、GT、AG）のスプライシングコンセンサス配列、および投げ縄型（lariat）の構造分枝点（ 2234位のCTGAC）を含有する。ヌクレオチド372-2021および2322-3073は、内皮エンドグリンの対応cDNA配列と同一であることが見いだされた（Gougos，A．およびLetarte，M．J.，J．Biol．Chem．265:8361（1990）、および表１）。図８は、２つの異なる形態のエンドグリンが存在することを示す細胞質領域の分析を示す。A．２つの選択可能な形態のエンドグリンの細胞質領域をコードするcDNAの図解。細胞質ドメインを有する3' 末端に対応する領域のみを示している。単離エンドグリンcDNA（S-エンドグリン）は、以前に記載された配列（L-エンドグリン）中には存在しない、135bpの挿入フラグメントを含有する（Gougos，A．およびLetarte，M．J.，J．Biol．Chem ． 265:8361（1990））。そのさらなる135bpの挿入フラグメントの配列は、図７に示されている。終止コドンの位置および対応する翻訳タンパク質配列（太線）を示す。B．L m．Biophys．Res．Commun．189:356（1992）、の対応する配列と、S-エンドグリンの細胞質ドメインおよびトランスメンブランドメインを並べた。囲いの中は、同じ配列を含む。番号は、全配列中の最初のアミノ酸の位置を示す。一致する２つの主要領域が認められた。第１の領域（73%一致）は、S-およびL-エンドグリンの587-617残基、およびβグリカンの780-810残基を含む。第２の領域（74%一致）は、L-エンドグリンの634-660残基およびβグリカンの823-849残基を含む。 S-エンドグリンのトランスメンブラン領域は太字で示す。ダッシュは整列目的のために挿入した。アスタリスクはタンパク質の最後の残基を示す。図９は、トランスフェクト細胞でのL-エンドグリンおよびS-エンドグリンの発現を示す。マウス線維芽細胞を、L-エンドグリンあるいはS-エンドグリンcDNAでトランスフェクトし、そしてエンドグリン分子の発現を分析した。A．細胞表面に存在するエンドグリンのサイトフルオロメトリー（cytefluorometry）による分析。トリプシン処理後に、間接免疫蛍光法のために、細胞をモノクローナル抗体8E 11（抗エンドグリン）で染色した。エンドグリン-偽（mock）トランスフェクタントのコントロール染色も示す。B．免疫沈降分析。細胞を［³⁵S］メチオニンで代謝標識し、溶解して、44G4（抗エンドグリン）あるいはHCl/l（抗CDllc）モノクロール抗体で免疫沈降させた。モノクロール抗体HCl/lを、陰性コントロールとして含有させた。試料を、非還元条件下での6-12%濃度勾配アクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。C．イムノブロッティング分析。偽（L細胞）cDNA、L- エンドグリン（L-Endo）cDNA、およびS-エンドグリン（S-Endo）cDNAでトランスフェクトされたマウス線維芽細胞およびPMA-処理U937細胞を、Triton X-100で溶解し、そして遠心分離で不溶性物質を除去した。上清に含まれているタンパク質を、非還条件下での6%アクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に移した。エンドグリンの免疫検出を、化学発光アッセイによる、44G4（抗エンドグリン）モノクロール抗体によって実施した。HCl/l（抗CD11c）およびX6 3モノクロール抗体を、陰性コントロールとして使用した。D．細胞表面標識エンドグリンの免疫沈降分析。偽、L-エンドグリン（L-Endo）およびS-エンドグリン（S-Endo）トランスフェクトマウス線維芽細胞を、¹²⁵I標識し、溶解して、44G4 モノクローナル抗体（抗エンドグリン）で免疫沈降させた。試料を、還元（R）あるいは非還元（NR）条件下で、10%アクリルアミドゲル上で電気泳動にかけた。図１０は、PCR増幅によるL-エンドグリンおよびS-エンドグリン転写物の検出を示す。胎盤、PMA処理HL-60細胞あるいはPMA処理U937細胞からの総RNA試料を、逆転写酵素の存在（+RT）あるいは非存在（-RT）下でインキュベートした。得られたcDNA試料を、pUC13のS-エンドグリン（S-Endo）あるいはL-エンドグリン（L -Endo）クローンからのcDNAおよび内皮細胞ライブラリーからのcDNAとともに、S -エンドグリンに特異的なオリゴヌクレオチド#14および#15の存在下（パネルA）、またはL-エンドグリンおよびS-エンドグリンに共通のオリゴヌクレオチド#12 および#11の存在下（パネルB）での、PCR増幅に使用した。RT反応を省略したときには、増幅は認められず、RNA試料を汚染するDNAの可能性を排除した。L-エンドグリンおよびS-エンドグリンの特異的増幅フラグメントの下方のその他のバンドは、おそらく、プライマー-ダイマー人工生成物を示す。図１１は、S-エンドグリンおよびL-エンドグリン両者のTGF-β１への結合を示す。S-エンドグリン（L+-S）およびL-エンドグリン（L+-L）トランスフェクタントのコンフルエントな培養物を、100pM ¹²⁵I-TGF-β１のみとインキュベートするか、あるいは4nMの非標識TGF-β１の存在下でインキュベートし、その後ジスクシンイミジルスベレートと化学架橋結合して、アフィニティ標識した。冷却（ cold）競合リガンドの存在下に対する非存在下でのcpm結合間の４倍比率により立証されるように、全試料は特異的にTGF-β１に結合し；親L細胞および偽トランスフェクタントは平均60,000比cpm、一方、エンドグリントランスフェクタントは平均110,000比cpm結合した。44G4-IgG セファロースによるL+-Sトランスフェクタントの免疫沈降物は、コントロールIgG-セファロースによる700cpmに対して、平均7700cpmを含有し；L+-Lトランスフェクタントの免疫沈降物は、コントロールの630cpmに対して4300cpmを含有した。これらの免疫沈降物は、還元（R ）あるいは非還元（NR）条件下で、6-9%濃度勾配アクリルアミドゲルにかけた。エンドグリンモノマー、ダイマーおよびオリゴマーの位置、および分子量マーカーの位置を示す。図１２は、pcDNAI/Neoの多重クローニング部位を示す。図１３は、「L-エンドグリン」のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。発明の詳細な説明エンドグリンは、ジスルフィド結合されたサブユニットから構成される、ホモダイマー性膜糖タンパク質である。ヒト由来のエンドグリンは、ヒトcDNAライブラリーから発現される少なくとも２つの異性体、推定約90kDaの「L-異性体」あるいはより小さい約85kDaの「S-異性体」が存在することが示された。組織から精製されたヒトエンドグリンは、各々約95kDaの２つのジスルフィド結合されたサブユニットから構成されることが示された。これは、ヒトpre-赤芽球、マクロファージ、および、リンパおよび骨髄系列の白血球に発現され、血管内皮細胞でより高レベルで発現される。それはまた、栄養細胞合胞体層である、母血液との界面を構成し、胎児の栄養交換および免疫防御を提供することにおいて重要な役割なす、多核化胎盤層に豊富である（Gougosら、Inter．Immunol．4:83-92（199 2））。エンドグリンは最初、mAb 44G4とのその反応性により、pre-B白血病細胞系で同定された（QuackenbushおよびLetarte，J．Immunol．134:1276-1285（1985））。それは、pre-Bリンパおよび骨髄表現型を有する、小児急性白血病（ALL）由来の細胞に、低レベルで存在し；T-ALLには存在しない（GougosおよびLetarte，J.Immunol． 141:1925-1933（1988b）；Kreindlerら、Leukemia and Lymphoma 3: 7-18（1990））。興味深いことに、ヒトエンドグリン遺伝子は、染色体9q34-qte rに配座し、フィラデルフィア染色体陽性白血病の22番染色体に転座された領域内であるようである（Fernandez-Ruizら、Cytogen．Cell Gen．64:204-207（1993 ））。正常成人骨髄には、単核細胞のほんの3-5%がエンドグリンを発現し、そしてそれらはpro-赤芽球表現型を有し；pre-Bおよび骨髄前駆体は、検出可能なレベルのエンドグリンを示さない（Buhringら、Leukemia 5:841-847（1991））。正常なBおよびTリンパ球ならびに非刺激単核球は、エンドグリンを発現しないが、活性化マクロファージには上昇制御が認められる（Lastresら、Eur．J．Immun ol． 22:393-397（1992））。エンドグリン発現は、内皮細胞増殖が生じることが知られている種々の病理学的皮膚損傷内皮で、かなり増加する（Westphalら、J．Invest．Dermatol．100:2 7-34（1993））。腫瘍では、活性な脈管形成を行なう毛細血管内皮細胞もまた、隣接組織の休止内皮よりも高いエンドグリンレベルを示す。精製ヒトエンドグリンには種々の異性型が存在し、Mr=95,000、90,000、あるいは85,000のジスルフィド結合された２つのサブユニットから構成され、N-およびO-結合オリゴ糖を有する。ヒトエンドグリンの一次配列は、25アミノ酸のシグナル配列、約561アミノ酸の細胞外ドメイン、25アミノ酸の１つのトランスメンブラン領域、および14から47アミノ酸残基の細胞質テールから構成される（Goug osおよびLetarte，J．Biol．Chem．265:8361-8364（1990））。ヒトエンドグリンとTGF-βレセプター系との関連性は、ラットTGF-β結合性プロテオグリカン、βグリカン（III型TGF- レセプターとしても知られる）の分子クローニングにより発見され、このことは、トランスメンブランドメインおよびこのタンパク質の比較的短い（43アミノ酸）細胞質テールが、エンドグリンの対応領域と非常に類似する（71%アミノ酸配列類似性および63%アミノ酸一致）ことを示した（図１を参照）。この２つのタンパク質の細胞外ドメインは、一次構造に限定された相同性を示し、エンドグリンはプロテオグリカンではないが、N-およびO-結合オリゴ糖を含有する。 TGF-βレセプターIIのクローニング（Linら、Cell 68:775-785（1992））は、¹²⁵ I-TGF-βに結合および化学的に架橋されたときに、以前に80kdのポリペプチドとして同定された、機能性のトランスメンブランセリン／トレオニンキナーゼを明らかにした（Cheifetzら、J．Biol．Chem．265:20533-20538（19 のレセプターは、I型レセプター（53kdタンパク質）と結び付いてTGF-βシグナルを変換する；レセプターIは、TGF-βに結合するためにレセプターIIを必要とし、レセプターIIは、シグナルを仲介するためレセプターIを必要とすると考えられている（Laihoら、J．Biol．Chem．266:9108-9112（1991）；Laihoら、J．B iol．Chem． 265:18518-18524（1990）；Wranaら、Cell 71:1003-1014（1992））。最近クローニングされたレセプターI、さらにセリン／トレオニンキナーゼによるトランスフェクション実験はまた、さらに、TGF-βを結合するためにレセプターIがレセプターIIに結び付かなければならない見解を、支持する（Ebnerら、Sc ience 260:1344-1348（1993））。本発明は、TGF-βに結合する可溶性エンドグリン由来のヒトポリペプチドを提供する。完全長の可溶性エンドグリン由来のポリペプチドは、プロセシング中に切断されるシグナル配列、成熟エンドグリンポリペプチドの561アミノ酸の細胞外ドメイン、細胞膜内膜タンパク質を有し、これは合計で約600あるいは633アミノ酸からなる。ヒトエンドグリンポリペプチドをコードする核酸配列は、表１および図１３に同定されている。可溶性エンドグリン由来のポリペプチドをコードする核酸配列は、表１（アミノ酸番号１近傍からアミノ酸番号561近傍）および図１３に示した配列内に包含される。さらに本発明により、挿入されたエンドグリンをコードするゲノムDNA分子を有するベクターが提供される。このベクターは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の条項に基づき、1993年10月21日に、Coleccion Espanola de Cultivos Tipo（CECT），461 00 Burjasot（Valencia），Spainに、CECT 4475で寄託された。従って、エンドグリンをコードする単離ゲノムDNAは、本発明の範囲内である。本発明はまた、細胞質領域中で互いに異なる２つの異性体をコードする、精製ヒトエンドグリンポリペプチドを提供する。「S-エンドグリン」は、細胞質領域に14個のアミノ酸残基を有し、「L-エンドグリン」は、細胞質領域に47個のアミノ酸残基を有する。成熟エンドグリン中の細胞外領域およびトランスメンブラン領域を配列する586アミノ酸は一致する。本明細書に使用されているように、用語「精製された」は、分子あるいは化合物が、未変性あるいは天然環境で通常会合する夾雑物を実質的に含まないことを意味する。例えば、成熟ヒトタンパク質は、多くの方法から得られ得る。膜タンパク質の精製のために利用可能な方法には、沈降、ゲル濾過、イオン交換、逆相およびアフィニティクロマトグラフィーが含まれる。その他周知の方法が、Deut scherら、Guide to Protein Purification：Methods in Enzymology 第182巻（A cademic Press 1990）に記載されており、これは本明細書に参考として援用されている。あるいは、本発明の精製ポリペプチドはまた、例えば、Sambrookら、Mo lecular Cloning：A Laboratory Manual 第２版（Cold Spring Harbor Laborator y 1989）に記載のような、周知の組み換え法によって得られ得、これもまた本明細書に参考として援用されている。可溶性エンドグリン由来のポリプチドを調製するためのこの方法の例は、当該技術分野で周知の方法による、細菌、酵母あるいは哺乳動物細胞のような適切な宿主細胞で、可溶性エンドグリンをコードする核酸を発現すること、および、当該技術分野で周知の方法を再度用いて、発現された可溶性タンパク質を回収することである。例証する目的のために、可溶性エンドグリンの発現が、pcEXV-L ENDOから完全長2.3kbのエンドグリンcDNAフラグメントを切り出し、Hind IIIリンカーを加えて、そして、Hind I IIでの消化後に、それをpBluescriptベクター（Stratagene）の多重クローニング部位にサブクローニングし、その後、Tth 111Iで消化して、達成された。（この酵素は、トランスメンブラン領域の約80bp上流のコーディング領域を切断する。）合成の相補的オリゴマーを、インフレーム終止コドンおよびBam HI突出を有するように作成し、線状化したプラスミドに連結した。Hind IIIおよびBam HIによる消化、および1.7kbフラグメントの精製後に、pcDNAI/Neo（Invitrogen，San D iego，図１２）に連結した。クローニング後に、そのクローンを、正確な向きについて制限酵素分析によりスクリーニングし、正確な向きであることを認めた。 cDNA挿入フラグメントの確認は、T7およびSP6配列決定プライマーを用いて行い、挿入フラグメントの5'および3'末端の開始および終止コドンの存在を確認した。 5'末端プライマー 3'末端プライマー構築物を発現するために、CHO-kl細胞（ATCC）をpCDNA/Neoでトランスフェクトし、G418に耐性である安定なトランスフェクタントを発生させるのに必要な最適条件を決定した。５つ（5）ｘ 10⁶細胞を、960 uFのコンデンサー（Biorad Ge ne Puls e）を用いた、電圧300ボルト、時間定数17.9msec.で、5μgのDNAによって、エレクトロポレーションを行い、死細胞を最少限にした最大量の安定なトランスフェクタントを得た。以下のフローチャートは、可溶性エンドグリンをコードする核酸を発現するための方法を例示する。可溶性ポリペプチドおよびその生物学的に活性なフラグメントはまた、化学合成により生成され得る。合成ポリペプチドは、Applied Biosystems，Inc．Model 430Aまたは431A自動ポリペプチド合成機、および製造者により提供される化学薬品を用いて製造され得る。可溶性ポリペプチドはまた、以下に詳細に記載される発現ベクターで形質転換された細胞から直接単離され得る。本明細書で使用される、エンドグリン由来のポリペプチドは、表１で示される 633個のアミノ酸配列または図13に示される658個のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、あるいはその活性なフラグメントを有するヒトポリペプチドを意味する。本明細書で使用される用語「可溶性エンドグリン由来のポリペプチド」は、この核酸の細胞外ドメインにより発現される、可溶性のヒトエンドグリンポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをいう。本明細書で使用される用語「活性フラグメント」または「生物学的に活性なフラグメント」は、TGF-βに結合するエンドグリンポリペプチドの任意の部分をいう。ポリペプチドがTGF-β に結合し得るか否かを決定する方法は、例えば、本明細書で提示されたように当業者には周知である。本発明はまた、表１で示される核酸分子とは異なるが、同一の表現型効果を生じる核酸分子、例えば、図13で示される配列核酸分子を包含する。これらの改変された、しかし表現型では等価の核酸分子は「等価な核酸」という。本発明はま、上記の核酸分子と比べたときに、そこから生成されるポリペプチドの表現型を改変しない非コーディング領域中の変化により特徴付けられる核酸分子を包含する。本発明はさらに、本発明の核酸分子またはそのその相補物にハイブリダイズする核酸分子を包含する。本明細書で使用される用語「核酸」は、mRNAおよびcR NA、ならびに一本鎖および二本鎖の、ゲノムDNA、DNA、およびcDNAを包含する。さらに、本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、S-エンドグリンならびにL-エンドグリンのような、天然に存在する任意の対立遺伝子変異体、および人工組換え形態を包含する。本発明は、可溶性エンドグリン由来のポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。本明細書で使用される用語「単離核酸分子」は、天然には生じない形態である核酸分子を意味する。ヒトエンドグリン核酸を単離する１つの手段は、当該技術分野で周知の方法（Gougos，A．ら、J．Biol Chem．265:8361（1990 ））および以下に示す実施例の方法を用いて、エンドグリンに対する天然のまたは人工的に設計された抗体で、ヒトcDNA発現ライブラリーを検索（probe）することである。ヒトエンドグリンポリペプチドをコードするDNAおよびcDNA分子は、ヒト、哺乳類、または他の動物の供給源から、相補ゲノムDNA、cDNA、またはR NAを得るために使用され得る。単離ゲノムDNAがまた、上記のように本発明により包含される。それは、本発明の核酸配列、およびSambrookら（前述）に記載されるような当業者に周知の方法を用いることにより単離される。本発明は、さらに、RNA転写のプロモーターおよび他の制御配列に作動可能に連結された単離核酸分子を提供する。本明細書で使用される用語「作動可能に連結された」は、プロモーターが核酸分子からRNAの転写を行い得るように配置されていることを意味する。このようなプロモーターの例は、SP6、T4、およびT7 である。プロモーターと、そこに挿入されたDNAのフラグメントがそのプロモーターに作動可能に連結されるクローニング部位との両方を有するベクターは、当該技術分野で周知である。好ましくは、これらのベクターは、インビトロまたはインビボでRNAを転写し得る。このようなベクターの例は、pGEMシリーズ（Prome ga Biotec、Madison、WI）である。本発明は、可溶性エンドグリン由来のポリペプチドをコードする、DNA、cDNA 、またはRNAのような本発明の単離核酸分子を含む発現ベクターまたは複製ベクターを提供する。ベクターの例は、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルスのようなウイルス、コスミド、プラスミド（pcEXV-2のような）、および他の組換えベクターである。核酸分子は、当該技術分野で周知の方法によりベクターゲノムに挿入される。例えば、挿入DNAおよびベクターDNAの両者は制限酵素に曝され得、両分子上に、その塩基対が互いに相補的な末端を生成し、次いでそれらは、リガーゼで連結される。あるいは、合成核酸リンカーが、ベクターDNA中の制限部位に対応する挿入DNAに連結され得、次いで特定のヌクレオチド配列を認識する制限酵素で消化される。さらに、終結コドンおよび適切な制限部位を含むオリゴヌクレオチドが、例えば、以下のいくつかまたはすべてを含むベクター中への挿入のために連結され得る：哺乳類細胞の安定なまたは一時的なトランスフェクタントの選択のための、ネオマイシン遺伝子のような選択可能なマーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトCMVの隣接する（i mmediate）初期遺伝子由来のエンハンサー/プロモーター配列；mRNA安定性のためのSV40由来の転写終結シグナルおよびRNAプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのSV40ポリオーマ複製起点およびColE1；多目的の多重クローニング部位；ならびにセンスおよびアンチセンスRNAのインビトロ転写用のT7およびSP6 RNAプロモーター。他の手段が利用可能である。エンドグリン由来のポリペプチド、またはその可溶性フラグメントをコードするDNA分子を含む、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞および他の動物細胞中での発現に適合するベクターがまた提供される。ベクターは、さらに、可溶性エンドグリンポリペプチドをコードするDNAに対して、その発現を許容するように配置される、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、または動物細胞中でDNAの発現に必要な制御要素を包含し得る。発現に必要な制御要素は、RNAポリメラーゼに結合するためのプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を含む。例えば、細菌発現ベクターは、1acプロモーターのようなプロモーター、および転写開始のためのShine-Dalgarno配列、および開始コドンAUG（Sambrookら、前述、1989）を含む。同様に、真核発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIのための異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化信号、開始コドンAUG、およびリボソームの脱着のための終止コドンを含む。このようなベクターは市販されており、または当該技術分野で周知の方法、例えば一般にベクターを構築するための上記の方法、に記載される配列によりアセンブルされ得る。発現ベクターが上記ポリペプチドを発現する細胞を生成するのに有用である。本発明は、エンドグリン由来のポリペプチドまたはその可溶性フラグメントをコードするcDNA分子を含む哺乳類細胞を提供する。例としては、哺乳類細胞中での発現に適合するプラスミドを含む哺乳類細胞がある。このプラスミドは、エンドグリン由来のポリペプチドをコードするcDNA分子およびこのポリペプチドの発現に必要な制御因子を含む。宿主として種々の哺乳類細胞が利用され得、例えば、マウス線維芽細胞NIH3T3、CHO細胞、HeLa細胞、Ltk-細胞などを含む。前述で記載されたような発現ベクターは、リン酸カルシウム沈澱法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションなどのような、当該技術分野で周知の方法により哺乳類細胞をトランスフェクトするために使用され得る。本発明は、薬学的キャリア、および、精製ポリペプチド、精製可溶性ポリペプチド、活性なそれらのフラグメント、または精製成熟タンパク質およびその活性フラグメントのいずれかを、単独または互いに組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、組換え体に由来し得、化学的に合成され得、または天然の供給源から精製され得る。本明細書で使用される用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、リン酸緩衝生理食塩水、水、および油/水または水/油エマルジョンのようなエマルジョン、ならびに種々のタイプの湿潤剤のような任意の標準の薬学的キャリアを包含する。任意のこれら薬学的組成物が、以下に記載される方法において、または以下に記載の症状を治療するための医薬の調製のために有用である。本発明のエンドグリン由来のTGF-β結合性ポリペプチドに対して特異的な反応性を有する、抗エンドグリン抗体44G4（Quackenbush，E．J.，およびLetarte、M ．J.，J．Immunol．134:1276-1285（1985））のような抗体、またはTGF-β結合性エンドグリンポリペプチドに対して特異的な反応性を有する任意の抗体もまた提供される。抗体の活性フラグメントは「抗体」の定義内に包含される。本発明の抗体およびフラグメントは、当該技術分野で公知の任意の方法により生成され得る。例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体が当該技術分野で周知の方法により生成され得、これらの方法は、例えば、本明細書に参考として援用される、HarlowおよびLane、Antibodies：A Laboratory Manual（Cold Spring H arbor Laboratory 1988）に記載される。ポリペプチドは、このような抗体を生成する免疫原として使用され得る。キメラ、ヒト化、CDR- 移植化、または２官能性抗体のような、改変抗体がまた、当業者に周知の方法により生成され得る。このような抗体はまた、例えば、Sambrookら（前述）に記載のように、ハイブリドーマ、化学合成、または組換え法により生成され得る。これらの抗体は、本発明のエンドグリン由来のポリペプチドまたはその可溶性フラグメントの存在の測定または精製に使用され得る。そのようなポリペプチドの検出に関して、これらの抗体は、エンドグリンの存在を測定するインビトロ診断方法またはインビボイメージング法に使用され得る。試料中の標的可溶性エンドグリン由来のポリペプチドのインビトロ検出に有用な免疫学的手法は、検出可能な抗体を使用する免疫アッセイを含む。そのような免疫アッセイは、例えば、当該技術分野で周知の、ELISA、Pandex微量蛍光アッセイ、凝集アッセイ、放射免疫アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイ、および免疫組織化学染色手法を含む。抗体は、当該技術分野で周知の種々の手段により検出可能とされ得る。例えば、検出可能なマーカーが、直接または間接に抗体に結合され得る。有用なマーカーは、例えば、放射性核種、酵素、蛍光発色団、発色団、および化学発光標識を含む。本発明は、TGF-βの制御活性により介在される生物学的機能を改変する方法であって、TGF-βを含む適切な試料を、有効量の生物学的に活性なエンドグリン由来のポリペプチド、例えば可溶性エンドグリン、または上記の薬学的組成物と接触させる工程を包含する方法を提供する。本明細書で使用する用語「有効量」は、TGF-βに結合するに十分なポリペプチド量を言い、そしてそれによってその制御活性を妨害または阻害する。この方法は、TGF-β１またはTGF-β３の制御活性を改変するために特に有用である。制御活性の例は、細胞増殖の刺激、細胞成長阻害、細胞外マトリックスタンパク質の促進、および免疫機能の制御を含むが、これらに限定されない。TGF-βは、単球の潜在的な化学的誘引剤（chemoattractant）であることが知られており、そしてIL-１、TNF-α、TGF-β、および表面FcγRIIIを誘導し得、それらすべては炎症応答に含まれる。反対に、TGF-βは、抗微生物活性およびスーパーオキシドアニオン発生を阻害することによりマクロファージを非活性化し得、そしてマクロファージによるクラスII制限の抗原提示の抑制を誘導する。本発明の方法は、インビトロまたはインビボで実施し得る。本発明の方法がインビトロで実施される場合は、試料と、上記のポリペプチド、タンパク質、または薬学的組成物とをインキュベートすることにより接触工程が実施される。インビトロでは、本発明の新規な核酸分子および抗体は、ヒト患者のような被験体から単離された試料中のTGF-βの量を検出および定量するために有用である。TGF-βの検出は、TGF-βの過剰発現に関連する疾患、例えば、糸球体腎炎、の進行をモニターするために有用である。しかし、好適な実施態様では、接触工程は、上記のように、被験体、例えば、ヒト患者にポリペプチド、タンパク質または薬学的組成物をインビボ投与することにより行われる。投与の方法は、当業者に周知であり、そして、経口投与、血管内投与、または非経口投与が含まれるが、これらに限定されない。制御活性が効果的に改変されるような用量で投与され得る。投与は、この量がその意図される目的に有効なように、連続的にまたは間欠的に実施され得る。本発明はまた、TGF-βで制御される活性により引き起こされる病的状態を治療する方法を提供し、この方法は、TGF-βを、精製した可溶性エンドグリン由来のポリペプチド、その活性フラグメント、エンドグリン由来のポリペプチドまたはその活性フラグメントのいずれかと接触させる工程を包含する。TGF-βは上記ポリペプチドと結合し、それによってTGF-β制御活性により引き起こされる病的状態を治療する。本明細書で使用される用語「病的状態」は、TGF-βに誘導された制御活性から生じる、例えば、炎症、リウマチ様間節炎、炎症性皮膚損傷、瘢痕組織形成、肺線繊症、肝線繊症、アテローム硬化症、および糸球体腎炎などの任意の病理を言う。間葉細胞の成長および増殖はTGF-βにより刺激されるが、しかしいくつかの腫瘍細胞はまた、TGF-βを自己分泌成長因子として用いてこのように刺激され得る。阻害状態の例は、潰瘍および免疫抑制については、組織損傷の修復を助ける新しい細胞成長が妨害されることである。TGF-βによる細胞外マトリックス生産の刺激は、損傷修復に必須である。しかし、いくつかの場合では、TGF-β応答が制御されず、そして過剰の細胞外マトリックスの蓄積が生じる。細胞外マトリックスの過剰蓄積の例は、糸球体腎炎である。別の病理例は癌である。１つの実施態様では、本発明の方法は、被験体、例えば、ヒト患者または哺乳類に、有効量の精製エンドグリンタンパク質またはエンドグリン由来の可溶性ポリペプチド、あるいは生物学的に活性なそのフラグメントあるいは上記の薬学的組成物を投与することにより実施される。投与方法は前記に概説した。本発明はまた、エンドグリンと、有効量のエンドグリンに結合し得るポリペプチドとを接触することにより、エンドグリンを結合させ、それによってエンドグリンの活性を阻害する、エンドグリンの活性を阻害する方法を開示する。本明細書で使用される用語「エンドグリンに結合し得るポリペプチド」は、エンドグリンと複合体を形成し得る任意の物質、例えば、TGF-β１またはTGF-β３、あるいはそれらの活性フラグメントを意味する。活性フラグメントは、エンドグリンに結合する能力を保持するTGF-β１またはTGF-β３のフラグメントに対応するアミノ酸の配列である。そのようなフラグメントを作成する方法は、フラグメントの結合活性を測定する方法のように、当業者に周知である。本発明はまた、エンドグリンに結合するそれらの活性を保持するが、レセプターへの機能的リガンドの結合が破壊され対応する生物学的応答をもはや仲介しないポリペプチドを包含する。このように、これら「変異した」ポリペプチドは、細胞上で正常に機能するリガンドのエンドグリンへの結合をブロックすることにより、リガンドにより仲介されるエンドグリンに対する生物学的機能に対するアンタゴニストとして作用し得る。本発明はまた、TGF-βにより制御される生物学的機能を改変するための薬剤の調製への上記で定義された組成物の使用を包含する。これらの生物学的機能は上記で詳細に記載される。本発明の種々の分子の活性に実質的に影響しない改変がまた、前記分子の定義に含まれることが理解される。以下の実施例は例示を意図し本発明を制限しない。Ａ．ヒトエンドグリンタンパク質およびヒトエンドグリンタンパク質をコードする核酸の単離実施例Ｉ細胞培養およびトランスフェクションヒト臍血管内皮細胞（HUVEC、CRL 1730 ATCC）を、供給者の指示に従って補填したα-最小必須培地中で維持するか、または先に述べたように（Gougos，A．ら、J．Immunol．141:1925（1988））臍血管から調製した。いずれの供給源からの細胞を用いても類似の結果が得られた。10%のウシ血清を添加したダルベッコの改変イーグル培地中で維持されたCOS-M6細胞を、哺乳類発現ベクターpcEXV（Mil ler，J．ら、J．Exp．Med．164:1478（1986））のEcoRI部位に連結した完全長のエンドグリンをコードするcDNA、またはcDNA挿入物のないコントロールベクター（pcMV5；Lopez-Cas illas，F．ら、Cell 67:785（1991））で、DEAE-デキストラン-クロロキン手法（Seed，B．ら、P.N.A.S．USA84:3365（1987））を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞をトリプシン処理し、そしてマルチクラスター皿中に再接種し、そして以下に述べるように¹²⁵I-TGF-β１でアフィニティ標識される前にさらに48時間生育させた。実施例II レセプターアフィニティ標識および免疫沈降 TGF-β１およびTGF-β２は、R & D Systems（Minneapolis．MN）から購入した。そして、TGF-β３は、Oncogene Science（Manhassett. NY）から得た。本発明の研究で用いた¹²⁵I-TGF-β１は、先に記載されたように（Cheifetz，S．ら、J ．Biol．Chem． 265:20533（1990））、クロラミン-T法により調製されるか、またはAmersham Corp．から購入した：両調製物とも同一の結果を生じた。¹²⁵I-TG F-β１およびジスクシンイミジルスベレート（Pierce Chemical Co．）で、細胞単層をアフィニティ標識する条件は、先に記載されている（Massague，J．、Met hods Enzymol． 146:174（1987））。各実験で使用される¹²⁵I-TGF-β１および競合する非標識のリガンドの濃度は、図説明中に示されている。アフィニティ標識された細胞のTriton X-100抽出物は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）上で直接分析されるか、または最初ヒトエンドグリンに対するモノクローナル抗体（mAb）44G4（Quackenbush，E．J．ら、J．Immunol．13 4:1276（1985））またはコントロール抗体（以下参照）とインキュベートした。免疫沈降のために、界面活性剤抽出物を等量の１% Triton X-100を含むリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、そしてmAb 44G4との４℃一晩インキュベーションの前に、プロテインG-セファロース（Pharmacia LKB Biotechnology Inc．）と４℃で2 0分間インキュベートすることにより予備清澄化した。免疫複合体を、プロテインG-セファロースと４℃で１時間インキュベートすることにより集めた。いくつかの実験では、mAb 44G4をセファロースに結合するために使用した。免疫沈降物を３回（１% Triton X-100を含む生理食塩水）洗浄し、そして次いでジチオトレイトール（DTT）の存在下または非存在下のSDS-PAGEにより分析し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化した。免疫沈降の特異性をモニターするためにコントロール実験で使用した無関係のmAb（44D7）は、任意のアフィニティ標識バンドを免疫沈降しなかった。実施例III SDS-PAGEおよび2Dゲル分析 HUVECのアフィニティ標識プロフィルの分析は、他の供給源からの血管内皮細胞のように、これらの細胞がβグリカンをほとんどまたは全く持たないことを示し、これは還元SDS-PAGE上で200KDaと400KDaとの間の拡散バンドとして特徴的に移動する（図２Ａ）。代わりに、HUVECはジスルフィド結合細胞表面タンパク質を発現し、それはTGF-βレセプターＩおよびIIとともに、¹²⁵I-TGF-β１と架橋することによりアフィニティ標識された。レセプターIおよびIIは、HUVEC中でそれぞれ約65KDaおよび100KDaの標識複合体として検出され、他のヒト細胞系について報告されたこれら標識レセプターのサイズと類似している。SDS-PAGE上で分画されるアフィニティ標識タンパク質の相対移動度の比較は、HUVECの主要アフィニティ標識タンパク質が還元ゲル上で95-120KDa 間に移動したことを示したが、その一方非還元ゲル上では主要アフィニティ標識タンパク質は、100-110KDa間（レセプターIIと推定される）ならびに180KDaおよびそれ以上（エンドグリン）に移動したことを示した（図２）。このパターンは、ジスルフィド結合したTGF-β結合性タンパク質の存在を示した。２次元ゲル上でのこれらジスルフィド結合TGF-β１結合性タンパク質の分析（図2B）は、ジスルフィド結合複合体（おそらくダイマーおよびより高次のオリゴマー）が約95KDa（還元した110KDaのアフィニティ標識複合体から架橋結合TGF- β１モノマー量の12.5KDaを引き算することにより推定した値）のサブユニットを含むことを確証した。II型レセプターとともに、ジスルフィド結合TGF-β１結合性タンパク質は、HUVECにより発現される主要アフィニティ標識種である。実施例ＩＶ抗エンドグリンmAbを用いる免疫沈降内皮細胞上のジスルフィド結合TGF-β結合性タンパク質がエンドグリンであったか否かを決定するために、アフィニティ標識したHUVEC抽出物を、ヒトエンドグリンに対して特異的なモノクローナル抗体（mAb）44G4（Georgi，L．L．ら、Cel1 61:635（1990）；MacKay，K．ら、J ．Biol．Chem． 266:9907（1992）；Merwin，J．R．ら、Am．J．Pathol．138:37 （1991））を用いて免疫沈降した。これらの免疫沈降物の電気泳動分析は、標識タンパク質複合体のサブユニット構造がエンドグリンのサブユニット構造に類似することを示した（図３Ａ）。このように、非還元条件下で分析されたとき180K Da、および200KDaより大きい複合体として移動する、還元条件下で約110KDaの主要アフィニティ標識バンドが見られた。より高次のオリゴマーは、それ自身がジスルフィド結合ダイマーであるTGF-β１が架橋した複数のエンドグリン分子を含み得た。44G4-IgG-セファロースを用いる繰り返し免疫沈降は、細胞抽出物からこれらの標識種を完全に枯渇化した（図３Ｂ）。エンドグリンを欠き、そしてこれらの実験の陰性コントロールとして使用した、３つの他のヒト細胞系（A549、 Hep G2、MCF-7）からはアフィニティ標識バンドは免疫沈降されなかった。ヒトエンドグリンに特異的なモノクローナル抗体は、このように、エンドグリンが、ヒト血管内皮細胞における主要TGF-β結合性タンパク質であることを示す。実施例Ｖ細胞におけるエンドグリンの異所性発現このHUVECのダイマー性TGF-β結合性タンパク質がエンドグリンと同一であることは、COSサル腎臓細胞中で完全長のエンドグリンcDNAを異所性発現することにより確認した。¹²⁵I-TGF-β１でアフィニティ標識した後、エンドグリンの特徴を有する標識種は、エンドグリントランスフェクタントの界面活性剤抽出物からのみ、mAb 44G4で特異的に沈降し得た（図４）。グリコシル化の違いは、HUVECの内因性エンドグリンに対してCOS細胞中で発現したエンドグリンがより小さなサイズであることを説明し得る。Ｂ．S-およびL-エンドグリンの単離実施例ＶＩエンドグリンcDNAのクローニングと配列決定 λgt10 cDNAライブラリーからの約2.5×10⁵個のクローンを、 J．6:4023（1987））から調製した。（50,000 pfu/150 mmの皿）を、エンドグリンcDNAからの700 bp PstIフラグメントでスクリーニングした（Gougos，A．およびLetarte，M．J.，J．Biol．Chem．265:8361（1990））。2.4-3.1 kbの範囲のサイズを有する３ラウンドのプラーク精製の後、13個のハイブリダイズするクローンを単離した。最長のクローン（クローン3.3；3073 bp）をpUC13にサブクローニングしそしてジデオキシチェーンターミネーション法（Sanger，F．ら、PNA S USA 74:5463（1977））を用いて配列決定した。 pUC13中のクローン3.3を、BbrPIおよびBam HIを用いて消化した。エンドグリンフラグメントを平滑末端化しそして哺乳類発現ベクターpcEXV（Miller．J．およびGermain，R.、J．Exp．Med．164:1478 （1986））中に挿入し、pcEXV-EndoSを生成した。cDNA（表Ｉ）中のリーダー配列の欠如（Gougos，A．およびLetarte，M．J.、J．Biol．Chem．265:8361（1990 ））は、pcEXV-EndoLの構築により克服した。pcEXV-EndoSを、Mlul/BamHIで消化し、そしてエンドグリンcDNA（表Ｉ）に特異的な563bp Mlul/BamHIフラグメントに連結し、pcEXV-EndoLを得た。トランスフェクタントを、pcEXV-EndoSまたはpc EXV-EndoLのいずれかと、psV2neoとの、マウスＬ細胞への同時トランスフェンションにより生成した。G418選択の後、エンドグリン陽性クローンを単離した。同じ実験で、エンドグリン陰性クローンを偽トランスフェクタントとして選択した。実施例VII 抗体、免疫蛍光、免疫沈降、および免疫ブロッティング用いたエンドグリン特異的モノクローナル抗体は、IgMクラスの8Ell（Lastres ，P．ら、Eur．J．Immunol．22:393（1992））、およびIgGlサブクラスの44G4（ Gougos，A．およびLetarte，M.、J．Immunol．141:1925（1988））であった。コントロールモノクローナル抗体は、IgGlサブクラスのHCl/l（抗CDllc）およびX6 3であった。FCMおよび免疫沈降分析は、Lastres，P．ら、Eur．J．Immunol．22: 393（1992）に記載のように実施し、この開示は本明細書に参考として援用されている。免疫ブロッティング研究には、５×10⁶細胞を、４℃で30分間、250μl のPBS中１% Triton X-100、１ mM PMSFで溶解した。不溶性物質を、1 00,000×gで１時間、Beckmam TL100遠心分離機で遠心分離して除去した。上清に含まれるタンパク質を、ミニゲルシステムを用いて非還元条件下でSDS-PAGEにより分離し、そしてニトロセルロース膜（Hybond、Amersham）に転写した。この膜を、最初、ブロック液（PBS中の、10%ウシ胎児血清、0.5% Tween-20、１ Mグルコース、および10%グリセロール）、次いで、モノクローナル抗体44G4とインキュベートした。エンドグリンの存在は、化学発光アッセイ（ECL検出キット、Ame rsham）を用いて示した。実施例VIII 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）全細胞RNAを、グアニジニウムイソチオシアネートおよび塩化セシウム超遠心分離工程により単離した（Chirgwin，J．M．ら、Biochemistry 18:5294（1979））。ポリ（A）+RNAをオリゴ（dT）アフィニティクロマトグラフィーにより精製した（Maniatis，T．ら、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」 Cold S pring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor（1982））。一本鎖cDNAをポリ（A）+RNA（0.5μg/40μl反応）から、AMV逆転写酵素により合成した。５μlのc DNAを50μl PCR反応に用いた（Gilliland，G．ら、Innis，M．A.、Gelfand，D． H.、Sninsky，J．J．およびWhite，T．J．編）（「PCR Protocols」 Academic P ress，San Diego 1990、60頁）。増幅に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、E#12（ヌクレオチド1945-1964）、E#11R（ヌクレオチド2475-2494の逆相補物）、E#14（ヌクレオチド2136-2158）、およびE#15（ヌクレオチド2247-2273の逆相補物）である。増幅は0.25μM濃度の各プライマーおよび0.25 U/50μlのTaq DNAポリメラーゼ（Promega）で、各0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTPを含む１×Taq緩衝液（Promega）中で実施した。増幅は以下のように熱サイクラー中で実施した：95℃５分；E#12-E#11Rのオリゴヌクレオチドペアについては、94℃で45秒、54℃で45秒、および72℃で１分の35サイクル、または、E#14-E#15のペアについては、94℃で45秒、68℃で45秒、および7 2℃で１分の35サイクル、そして次いで72℃で10分。逆転写酵素を省略したことを除いて同一のコントロール反応を同時に実施した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により分析した。実施例IX レセプターアフィニティ標識 TGF-β１はR&D Systems（Minneapolis，MN）から購入し、そして¹²⁵I-TGF-β １は2000 Ci/mmolの比活性でAmersham（Oakville、Canada）から得た。親のマウスＬ細胞、S-エンドグリンまたはL-エンドグリンを発現するトランスフェクタントマウスＬ細胞、および偽トランスフェクタントＬ細胞を、コンフルエントで（プレートあたり５×10⁶細胞）生育させ、そして４nMの競合する非標識TGF-β１の存在下または非存在下、４時間、100 pMの¹²⁵I-TGF-β１とインキュベートした。細胞を洗浄し、そして128 mM NaCl、５ mM KCl、５ mM MgSO₄、1.2 mM CaCl₂ 、50 mM Hepes、pH 7.5を含む緩衝液中、0.16 mMの最終濃度のジスクシンイミジルスベレート（Pierce Chemical Co.）（DSS）で、４℃15分間架橋した。細胞を４回洗浄し、そして１% Triton X-100および先に記載されたような（Massague，J.、Methods Enzymol．146:174（1987））タンパク質分解インヒビターを含む最小の可溶化緩衝液を含んだペトリ皿上で直接可溶化した。抽出物を免疫沈降、次いでSDS-PAGE分析した。結果エンドグリンcDNAクローンの単離および特徴付細胞質変異体の同定完全長cDNAクローンは、PMA処理されたHL60細胞から調製したλgt10ライブラリーに由来した。クローン番号3.3を、挿入物のサイズが大きいため、さらなる特徴付けのために選択した。クローン3.3からの3073 bp cDNA挿入物の部分配列を図７に示す。このクローンは、281 bpの５’非翻訳領域とそれに続く1875 bp のオープンリーディングフレームとを含む。推定されるタンパク質配列は、予期されるように（Gougos，A．およびLetarte，M．J.、J．Biol．Chem．265:8361（ 1990））、25アミノ酸（aa）を含むエンドグリンリーダーペプチド、次いで細胞外部分で561残基そして25アミノ酸に広がるトランスメンブラン領域を示す。しかし、クローン3.3は、既知のcDNA配列内に挿入された、ヌクレオチド（nt）213 4で始まる135 bpセグメントを含む（図８）。この挿入物の最初の21ヌクレオチドは、先行する配列とフレームがあっており、そして新しい７アミノ酸の配列をコードする。この配列はエンドグリンのＣ末端の40 個のアミノ酸を置き換え、従って先に報告された47残基（Gougos，A．およびLet arte，M．J.、J．Biol．Chem．265:8361（1990））とは異なる新規な14個のアミノ酸の細胞質テールをなし（図８）、エンドグリンの２つの選択可能な形態の存在を示唆する。骨髄単球細胞系HL60中のエンドグリンの優勢な形態は、細胞質ドメイン中の47残基を含む形態であるようである。何故なら、この配列が分析した 13クローンのうち12クローン中で存在したからである。14アミノ酸および47アミノ酸の細胞質テールを持つ異性体および対応するcDNAは、それぞれ、S-エンドグリンおよびL-エンドグリンと呼ばれる。２つの異なる形態のエンドグリンの発現２つの選択可能な形態をさらに特徴付けるために、エンドグリンの短形態および長形態に対応する独立の構築物を発現ベクターpcEXV中に挿入しそしてマウス線維芽細胞中にトランスフェクトした（図９）。S-エンドグリンおよびL-エンドグリンの両者は、FCMで測定されたように細胞表面上で高率に発現した（図９）。さらに、トランスフェクタントの代謝標識に次ぐ免疫沈降は、抗エンドグリンモノクローナル抗体により特異的に認識される170-kDa（L-エンドグリン）または160-kDa（S-エンドグリン）のタンパク質を示した（図９）。トランスフェクタント中のS-およびL-エンドグリンの明確なサイズはまた、非還元条件下の免疫ブロッティング分析により検出された（図９）。これらの実験では、L-エンドグリンは、U937細胞上で検出されたエンドグリンと同一のM_rを示し、これが前単球細胞系では優勢な形態であることを示唆する。トランスフェクタントの細胞表面放射標識後の免疫沈降は、異性体の両者が、ジスルフィド結合したホモダイマーとして発現し（図９）、細胞外部分中に存在するシステイン残基が鎖間ジスルフィド結合を介在することを示す。 S-エンドグリンおよびL-エンドグリンmRNAの分化発現 S-およびL-エンドグリンの個々の発現をRT-PCRにより分析した。S-エンドグリンcDNAの独特の３’領域由来の２つのプライマーを用いた増幅は、S-エンドグリントランスフェクタント上、ならびにPMA-処理単球細胞系、内皮細胞、および胎盤上に予想される137 bp産物を生成し（図10）、いくつかの細胞型中のこの異性体の存在を示した。L-エンドグリンおよびS-エンドグリンに共通のプライマーを使用したとき、411 bpのL-エンドグリン特異的フラグメントが、PMA-処理単球細胞系、胎盤細胞、内皮細胞上で増幅され得たが、その一方、546 bpのS-エンドグリンフラグメントは、コントロールのS-エンドグリントランスフェクタント上でのみ増幅された（図10）。PCRにより競合テンプレートが増幅されるとき、多量のテンプレートがより少ないテンプレートの増幅を抑制し得る（Gilliland，G．ら、In：［Innis，M．A.、Gelfand，D．H.、Sninsky，J．J．およびWhite，T．J ．編）「PCR Protocols」、Academic Press、San Diego 1990、60頁）。従って、これらの結果はL-エンドグリンが優勢な形態であり、そしてS-エンドグリンはこれらの細胞型中でより低いレベルで発現することを示す。このことは、トランスフェクタントL-エンドグリン上で観察されるエンドグリン分子と類似の M_rのエンドグリン分子がPMA処理U937細胞中に存在することと一致し（図９）、両細胞型上でグリコシル化レベルが類似すると推定される。 L-エンドグリンおよびS-エンドグリンのTGF-β１への結合エンドグリンは、TGF-βに対するレセプターシステムの成分であることが見いだされているので（Cheifetz，S．ら、J．Biol．Chem．267:19027（1992））、各異性体がこのリガンドに結合する能力を分析することは重要であった。短形態および長形態のエンドグリンを発現するトランスフェクタントと、親のＬ細胞および偽トランスフエクタントを、そのTGF-β１に結合する能力について比較した。免疫沈降分析は、TGF-β１-エンドグリン複合体の同定を可能にした（図11）。非還元条件下で、エンドグリンのダイマーは、M_rが170 kDa（短形態）および1 75 kDa（長形態）の放射標識バンドとして観察された。エンドグリンのオリゴマーは、両方の場合で、M_rが270 kDaを越えてで移動することが観察された。類似の複合体がまた、ヒト内皮細胞を用いた架橋実験で先に観察されており、TGF-β １により架橋されたエンドグリン分子がそれ自身のダイマーであることを示し得る（Roberts，A．B．およびSporns，M．B.、Sporn，M．B．およびRoberts，A．B ．編、「Peptide growth factors and their receptors」Springer-Verlag，Hei delberg 1990、419頁）。還元条件下、短形態のエンドグリンについて97 kDaおよび107 kDaの主要バンドが、そして長形態のエンドグリンについて102 kDaおよび112 kDaのバンドが観察された。これらの二量体は、先に内皮細胞について観察されており、そしてTGF-β１のモノマー（12.5 kDa）またはダイマー（25 kDa）に結合したエンドグリンを表し得た（Roberts，A．B．およびS porns，M．B.、Sporn，M．B．およびRoberts，A．B．編、「Peptide growth fac tors and their receptors」Springer-Verlag、Heidelb l．Chem．266:20767（1991））。TGF-β１の寄与を差し引くと、S-エンドグリンについては85 kDaの、そしてL-エンドグリンについては90 kDaの分子量を推定し得る。考察配列分析は、L-エンドグリンおよびS-エンドグリンと名付けられた２つの異なるcDNA変異体の存在を示した。これら２つの異性体は、合成される転写物の大多数は明らかにL-エンドグリン異性体に対応するが、骨髄細胞、内皮、および胎盤により同時発現される。２つの異性体が生じる機構が決定されるべきである。両異性体が選択可能なスプライシングにより生成される可能性が最も高い。事実、５’および３’末端のドナー/アクセプター部位のコンセンサス配列（GT、AG）、および、投げ縄型分岐点のコンセンサス配列（CTGAC）が、S-エンドグリンcDN Aの新規な135 bp挿入物上に見いだされた（図７）。「保持されたイントロン」のスプライシング機構により生成した細胞質変異体の類似の例は、TGF-βレセプターファミリーのアクチビンレセプターについて最近報告された（Attisan o，L．ら、Cell 68:97（1992））。２つのエンドグリン異性体の挙動をトランスフェクション研究により分析した。両形態は、ジスルフィド結合したホモダイマーとして細胞表面上で発現され、細胞外領域に存在するシステイン残基がダイマー化に関与することを示す。異なる細胞質ドメインにもかかわらず、両形態は、TGF-β１結合性タンパク質として挙動する。 S-エンドグリン、L-エンドグリン、およびβグリカンは、トランスメンブランドメインおよび隣接する細胞質ドメイン中に22個の同一残基を含む（図９）。これは、βグリカンと２つのエンドグリン形態との間の第１の保存モチーフの輪郭を描き、リン酸化状態が分析されるべき２つのチロシン残基および２つのSer/Th r残基を含む。細胞質テール中で高い同一性を有する第２の領域は、長形態のエンドグリンとβグリカンにのみ共有される。このモチーフにおけるSer/Thr残基の高い含有量（40%）およびTyrの不在は、この領域がSer/Thrキナーゼによりリン酸化を受け得ることを示唆する。興味深いことに、TGF-βレセプターIIの細胞質ドメインは、Ser/Thrキナーゼ活性を示す（Lin，H．Y．ら、Cell 68:775（199 2））。本発明を、開示の実施態様を参考に記載するが、種々の改変が、本発明の思想から逸脱することなく成され得ることが理解されるべきである。従って、本発明は添付の請求項によってのみ制限される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＢＧＡＢＸＡＣＪＡＣＳＡＤＳＣ０７Ｈ 21/02 8615−4Ｃ 21/04 Ｂ 8615−4ＣＣ０７Ｋ 14/47 8318−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＣＪＡＢＢＡＢＥＡＢＧＡＤＳＡＢＸＡＣＳ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (71)出願人コンセッホスペリオールデインベスティガシオネスシエンティフィカススペイン国 28006 マドリッド，ベラスケス 144 (72)発明者レタルト，ミッチェルカナダ国エム４ケー２ゼット７，オンタリオ，トロント，ハウランドロード 35 (72)発明者マサーグ，ジョーンアメリカ合衆国ニューヨーク 10021, ニューヨーク，ヨークアベニュー 1233 (72)発明者ベルナビュー，カルメロスペイン国 28006 マドリッド，ベラスケス 144，セントロインベスティガシオネスビオロヒカス (72)発明者チェイフェズ，セラカナダ国エル４ケー２アール８，オンタリオ，コンコード，ニューシーベリードライブ 88

Claims

【特許請求の範囲】１．エンドグリンポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントをコードする単離された核酸分子。２．可溶性のエンドグリン由来のポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントをコードする核酸分子。３．前記核酸がヒトエンドグリンポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の核酸。４．前記核酸が、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、またはcRNAである、請求項１または２に記載の核酸分子。５．前記ゲノムDNAがCECT 4475である、請求項４に記載の核酸分子。６．RNA転写のプロモーターに作動可能に連結された、請求項１または２に記載の核酸分子。７．請求項５に記載の核酸分子を含むベクター。８．請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。９．前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。１０．エンドグリン由来のポリペプチドまたは活性なそのフラグメントを調製する方法であって、以下の工程を包含する方法：ａ．エンドグリン由来のポリペプチドまたは活性なそのフラグメントをコードする核酸分子を適切な発現ベクター中に挿入する工程；ｂ．該得られたベクターを適切な宿主細胞中に挿入する工程；ｃ．該得られた宿主細胞を誘導してエンドグリン由来のポリペプチドまたは活性なそのフラグメントを発現する工程；およびｄ．そのように産生された該得られたエンドグリン由来のポリペプチドを精製する工程。１１．可溶性のエンドグリン由来のポリペプチド。１２．請求項１０に記載の方法により産生される、エンドグリン由来のポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメント。１３．請求項１１または１２に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。１４．薬学的に受容可能なキャリア、および、実質的に他の宿主細胞タンパク質を含まない、精製されたおよび単離されたヒトエンドグリン由来のポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントを含む、薬学的組成物。１５．TGF-βの制御活性により介在される生物学的機能を改変する方法であって、TGF-βを有効量のエンドグリン由来のポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントと接触させる工程を包含し、それによって該生物学的機能を改変する方法。１６．TGF-βがTGF-β１である、請求項１５に記載の方法。１７．TGF-βがTGF-β３である、請求項１５に記載の方法。１８．前記接触させる工程がインビトロで行われる、請求項１５に記載の方法。１９．前記接触させる工程がインビボで行われる、請求項１５に記載の方法。２０．前記制御活性が細胞増殖刺激または細胞成長阻害である、請求項１５に記載の方法。２１．前記制御活性が細胞外マトリックス産生の促進である、請求項１５に記載の方法。２２．前記制御活性が免疫機能の制御である、請求項１５に記載の方法。２３．前記ポリペプチドが、ジスルフィド結合した約80kDa〜約95kDaのサブユニットのホモダイマーを含む、精製されたヒトエンドグリン由来のポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントである、請求項１５に記載の方法。２４．前記精製されたポリペプチドが、実質的に他のヒトタンパク質を含まない、精製されたおよび単離されたヒトエンドグリン由来のタンパク質である、請求項２３に記載の方法。２５．前記ポリペプチドが、可溶性のエンドグリン由来のポリペプチドである、請求項１５に記載の方法。２６．TGF-βで制御される細胞成長刺激により引き起こされる病的状態を治療する方法であって、該TGF-βに結合するために有効な量の請求項１３または１４に記載の薬学的組成物を被験者に投与する工程を包含し、それによって細胞成長刺激により引き起こされる病的状態を治療する方法。２７．TGF-βがTGF-β１である、請求項２６に記載の方法。２８．TGF-βがTGF-β３である、請求項２６に記載の方法。２９．前記被験体がヒト患者である、請求項２６に記載の方法。３０．TGF-βで制御される細胞成長の阻害により引き起こされる病的状態を治療する方法であって、該TGF-βに結合するために有効な量の請求項１３または１４に記載の薬学的組成物を被験者に投与する工程を包含し、それによって細胞成長の阻害により引き起こされる病的状態を治療する方法。３１．TGF-βがTGF-β１である、請求項３０に記載の方法。３２．TGF-βがTGF-β３である、請求項３０に記載の方法。３３．前記病的状態が潰瘍または免疫抑制である、請求項３０に記載の方法。３４．前記被験体がヒト患者である、請求項３０に記載の方法。３５．TGF-βで制御される細胞外マトリックスの蓄積の促進により引き起こされる病的状態を治療する方法であって、TGF-βを結合するために有効な量の請求項１２または１３に記載の薬学的組成物を被験者に投与する工程を包含し、それによって細胞外マトリックスの促進により引き起こされる病的状態を治療する方法。３６．前記被験体がヒト患者である、請求項３５に記載の方法。３７．前記病的状態が、炎症、リウマチ様関節炎、炎症性皮膚損傷、瘢痕組織形成、肺線維症、肝線維症、アテローム硬化、または糸球体腎炎である、請求項３５に記載の方法。３８．エンドグリンと、エンドグリンを結合するために有効な量のエンドグリンに結合し得るポリペプチドとを接触させる工程を包含し、それによってエンドグリンの活性を阻害する方法。３９．前記ポリペプチドがTGF-βである、請求項３８に記載の方法。４０．前記ポリペプチドがエンドグリンに結合する能力を有するTGF-βのフラグメントに対応するアミノ酸配列を有する、請求項３８に記載の方法。４１．前記TGF-βがTGF-β１またはTGF-β３である、請求項３９に記載の方法。４２．前記TGF-βがTGF-β１またはTGF-β３である、請求項４０に記載の方法。４３．前記ポリペプチドが抗エンドグリン抗体である、請求項３８に記載の方法。４４．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４３に記載の方法。４５．前記接触する工程がインビボで行われる、請求項３８に記載の方法。４６．前記接触する工程がインビトロで行われる、請求項３８に記載の方法。