JPH08504096A

JPH08504096A - Ｅ型肝炎パキスタン株の組換えタンパク質ならびに診断法およびワクチンにおけるそれらの利用

Info

Publication number: JPH08504096A
Application number: JP6508363A
Authority: JP
Inventors: トゥサレヴ，セルゲイ・エイ; エマーソン，スザンヌ・ユー; パーセル・ロバート・エイチ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1992-09-18
Filing date: 1993-09-17
Publication date: 1996-05-07
Also published as: US6706873B1; AU689447B2; CA2144855C; KR100318516B1; AU5162593A; KR100332602B1; ATE449178T1; WO1994006913A2; ES2336282T3; JP2005013220A; JP2006149393A; DE69334299D1; US6696242B1; EP0662133B1; EP0662133A1; US6287759B1; CA2144855A1; WO1994006913A3

Abstract

(57)【要約】腸伝染性非Ａ型、非Ｂ型の肝炎（Ｅ型肝炎）の流行病に関与するパキスタン（ＳＡＲ−５５）由来のＥ型肝炎のウイルスが開示される。本発明は、ＳＡＲ−５５の構造領域全体（オープンリーディングフレーム−２；ＯＲＦ−２）の真核細胞発現系での発現に関する。発現されたタンパク質はＨＥＶウイルス様粒子を形成することができ、この粒子は、診断免疫分析における抗原およびＥ型肝炎による感染に対して防御する免疫原またはワクチンとして機能できる。

Description

【発明の詳細な説明】Ｅ型肝炎パキスタン株の組換えタンパク質ならびに診断法およびワクチンにおけるそれらの利用発明の分野本発明は肝炎ウイルス学の分野に関する。特に、本発明は、腸伝染性のＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５由来の組み換えタンパク質、並びにこれらのタンパク質を使った診断法およびワクチン応用に関する。従来の技術腸伝染性非Ａ／非Ｂ型肝炎であるＥ型肝炎の流行は、アジア、アフリカおよび中央アメリカにおいて報告されている（バラヤン(Balayan)，M.S.(1987)、Sovie t Medical Reviews,Section E,Virology Reviews,ズダノフ(Zhdanov)，V.M.（編）、クール、スイス： Harwood Academic Publishers，vol.2,235-261；ザッカーマン(Zuckerman)，A.J.（編）、パーセル(Purcell)，R.G.ら、(1988)、"Viral Hepatitis and Liver Disease",ニューヨーク：アラン R．リス(Alan R.Liss), 131-137;ブラドレー(Bradley)，D.W.(1990)，British Medical Bulletin，46:44 2-461;ホリンガー(Hollinger)，F.B.、レモン(Lemon)，S.M.、マーゴリス(Margo lis)，H.S.（編）、ティチェハースト(Ticehurst)，J.R.(1991)： "Viral Hepat itis and Liver Disease"，Williams and Wilkins，バルチモア，501-513）。散発性肝炎のケース（Ｅ型肝炎と推定される）は、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）が風土病である国では、報告される肝炎の９０％にまで達する。感染した個体の血清中の抗ＨＥＶ抗体の検出に関する血清学的試験の開発の必要性は、当該分野で広く認識されているが、しかし感染個体もしくは動物から排出されるＨＥＶが非常に低濃度なため、そのようなＨＥＶを血清学的試験用の抗原のソースとして利用することは不可能であった。そして細胞培養でのＨＥＶの増殖において制限付きの成功が報告された（ファン(Huang)，R.T.ら（1992），J.Gen.Virol.，73:11 43-1148）が、血清学的試験に必要な量の抗原を生産するには、細胞培養は現行ではあまりにも非能率的である。最近、世界中の多くの労力がＥ型肝炎に関するウイルスゲノム配列を同定するために払われたことにより、数は限られているが幾つかのＨＥＶ株のゲノムがクローン化された（タン(Tam)，A.M.ら（1991），Virology，185:120-131;ツァレフ(Tsarev)，S.A.ら（1992），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:559-563；フライ(F ry)，K.E.ら（1992），Virus Genes，6:173-185）。ＤＮＡ配列の解析から、研究者たちは、ＨＥＶゲノムが３つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に組織されているという仮説、並びにこれらのＯＲＦがインタクトなＨＥＶタンパク質をコードするという仮説を立てるに至った。ビルマ（ミャンマー）からのＨＥＶ株のゲノムの部分ＤＮＡ配列がレイエス（ Reyes）ら 1990，Science，247:1335-1339 に開示されている。タンら、1991、およびレイエスら、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１５６０３号（1991年10月17日公開）は、ＨＥＶビルマ株の完全なヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を開示している。これらの著者たちは、３つの順方向のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が本株の配列内に含まれると仮説を立てた。イチカワ（Ichikawa）ら、1991，Microbiol.Immunol.，35:535-543は、ＨＥＶ感染したカニクイザルからの血清でλｇｔ１１発現ライブラリーをスクリーニングした際に、長さ２４０−３２０ヌクレオチドの一連のクローンが単離されたことを開示している。１つのクローンにより発現される組み換えタンパク質を大腸菌で発現させた。この融合タンパク質は、ＨＥＶミャンマー株のＯＲＦ−２の３ ´領域にコードされる。ＨＥＶメキシコ株およびＨＥＶビルマ株のＯＲＦ−２の３´領域内にコードされるさらに別のタンパク質の発現について、ヤーボー（Yarbough）ら、1991 J.V irology，65:5790-5797 が記載している。この論文は、ＨＥＶ由来の２つのｃＤＮＡクローンの単離を記載している。これらのクローンがＯＲＦ−２の３´領域のタンパク質群をコードする。そのクローンを大腸菌内で融合タンパク質として発現させた。パーディ（Purdy）ら、1992，Archives of Virology，123:335-349、およびファボロフ（Favorov）ら、1992，J.of Medical Virology，36:246-250は、ビルマ株からのより大きなＯＲＦ−２タンパク質断片の大腸菌での発現を開示している。これらの参考文献は、以前に考察したものと同様に、細菌発現系を用いたＯＲＦ− ２遺伝子の一部の発現の開示でしかない。ＯＲＦ−２タンパク質全長を首尾よく発現させることは、本発明までは開示されたことがなかった。ＨＥＶのゲノム構成および形態学的構造を他のウイルスのそれと比較することにより、ＨＥＶがカリチウイルス（calicivirus）に最も近縁であることがあきらかとなった。興味深いことに、カリチウイルスの構造タンパク質群はゲノムの３´部分にコードされる（ネイル(Neil)，J.D.ら、(1991) J.Virol.，65:5440-5 447；およびカーター(Carter)，M.J.ら、(1992)，J.Arch.Virol.，122:223-235 ）。そしてＨＥＶゲノムの３´端部分も構造タンパク質群をコードするという直接的証拠は無いが、３´ゲノム領域のある小さな部分を細菌細胞で発現させると、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにおいて抗ＨＥＶ血清と反応するタンパク質群が生産される（ヤーボーら、(1991)；イチカワら、(1991)；ファボロフら、(1992)およびドーソン(Dawson)，G.J.ら、(1992) J.Virol.Meth.，38:175-186 ）。しかし、構造タンパク質としてのＯＲＦ−２タンパク質の機能は、本発明までは証明されなかった。ＯＲＦ−２遺伝子の一部によりコードされる小さなタンパク質群は、動物血清中のＨＥＶに対する抗体を検出するイムノアッセイに利用されてきた。細菌で発現された小さなタンパク質群を血清学的なイムノアッセイにおいて抗原として利用することは、幾つかの潜在的な欠点を有している。第１に、細菌細胞でのこれらの小タンパク質の発現は、可溶性に関する問題、ならびにイムノアッセイに大腸菌の粗溶解物を抗原として用いた場合の、患者血清の大腸菌タンパク質との非特異的交差反応をもたらす（パーディら、(1992)）。第２に、ルーチン疫学において抗ＨＥＶ抗体に関する血清学的試験の最初のラインとしてウェスタンブロットを用いることは、時間的および経済的制約から実践的ではない。ＨＥＶゲノムの３´端部分由来の小ペプチドを用いたＥＬＩＳＡは、既知のＨＥＶ感染患者中の４１％しか陽性として検出できなかった。第３に、Caliciviridaeに最も近い科であるPicornaviridaeを含め、多くのウイルスに関して、重要な抗原および免疫原エピトープは立体構造性が高い（ホリンガー，F.B. 、レモン(Lemon)，S.M. 、マーゴリス，H.S. （編）、レモン，S.M. ら、(1991)："Viral Hepatitis and L iver Disease"，Williams and Wilkins，バルチモア、20-24）。それゆえ、インタクトなＨＥＶ遺伝子をコードする完全なＯＲＦを真核細胞系で発現させれば、ＨＥＶウイルス様粒子を形成し得るタンパク質の生産をもたらすのではないかと考えられる。そのような完全なＯＲＦタンパク質であれば、上記のより小さなタンパク質（ＨＥＶ構造タンパク質の一部しか表していない）よりも天然のキャプシドタンパク質（群）の免疫学的構造に近い構造を持つだろう。それ故、これらの完全なＯＲＦタンパク質は、現在使われているより小さなタンパク質よりも、より代表的な抗原として並びにより有効な免疫原として役立ちそうである。発明の概要本発明は、分離されて実質的に純粋な、ヒトＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５の調製品に関する。本発明はまた、分離されて実質的に純粋な、ヒトＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ− ５５のゲノムＲＮＡの調製品に関する。本発明はさらに、ヒトＥ型肝炎ウイルス株ＳＡＲ−５５のｃＤＮＡに関する。本発明の目的は、組み換えＨＥＶタンパク質を生産させることのできる合成核酸配列を、等価な天然核酸配列以外に提供することである。そのような核酸配列は、ＨＥＶタンパク質を合成させることのできる遺伝子を同定し分離することのできるｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーから分離することができる。本発明はさらに、ＳＡＲ−５５ｃＤＮＡ由来のプライマーを用いたＥ型肝炎遺伝子断片の選択的増幅に基づいた、生物試料中のＥ型肝炎ウイルスの検出法に関する。本発明はまた、ＳＡＲ−５５ｃＤＮＡ由来の一本鎖アンチセンスのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドを用いて、Ｅ型肝炎遺伝子の発現を阻害することに関する。本発明はまた、ＳＡＲ−５５のＨＥＶゲノムにコードされる、または合成核酸配列によりコードされる、単離され実質的に精製されたＨＥＶタンパク質およびその変異体に、特に少なくとも１つの完全なＨＥＶオープンリーディングフレームにコードされる組み換えタンパク質に関する。本発明はまた、核酸をクローン化し、ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、そして宿主細胞中で組み換えタンパク質を発現させることによって、ＨＥＶゲノム配列由来の組み換えＨＥＶタンパク質を調製する方法に関する。本発明はまた、得られた組み換えタンパク質を診断薬およびワクチンとして利用することに関する。本発明はまた、生物試料中のＥ型肝炎ウイルスに特異的な抗体を検出する方法も含む。そのような方法は、ＨＥＶが引き起こす感染症および疾患の診断、並びにそのような疾患の進行の監視に有用である。そのような方法はまた、哺乳動物でのＨＥＶ感染症および疾患の治療過程において治療薬の効力をモニターするのにも有用である。本発明はまた、哺乳動物でのＥ型肝炎の予防もしくは治療に使われる医薬構成物にも関する。図面の簡単な説明図１はＨＥＶ株ＳＡＲ−５５の完全なＯＲＦ−２タンパク質の発現に使われる組み換えベクターを示す。図２ＡおよびＢは、野生型バキュロイウルス若しくは組み換えバキュロウイルス（ＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む）を感染させた昆虫細胞の細胞溶解物を、クマシーブルーで染めた（Ａ）若しくはＨＥＶ感染チンパンジーの血清でウェスタンブロットにかけた（Ｂ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。図３ＡおよびＢはそれぞれ、３０および２０ｎｍのウイルス様粒子（組み換え感染昆虫細胞でＯＲＦ−２タンパク質の発現結果として形成される）の免疫電子ミクログラフ（ＩＥＭ）を示す。図４は、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中の抗ＨＥＶ抗体レベルは、ＨＥＶメキシコ株（Cyno-80A82，Cyno-9A97およびCyno 83 ）若しくはパキスタン株（Cyno-374）をカニクイザルに接種してからの様々な時間で決定した。図５Ａ−Ｄは、完全なＯＲＦ−２をコードする遺伝子を含む昆虫細胞から発現された組み換えＯＲＦ−２を抗原として用いた、ＥＬＩＳＡの結果を示す。血清中のＩｇＧもしくはＩｇＭの抗ＨＥＶレベルは、ＨＥＶを２匹のチンパンジーに接種してからの時間に渡って決定した。図６Ａ−Ｊは、ＳＡＲ−５５由来の完全な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータと、ＨＥＶビルマ株（Genelabs）由来の部分的な組み換えＯＲＦ−２タンパク質を抗原として用いて得られたＥＬＩＳＡデータの比較を示す。発明の詳細な説明本発明は、分離されて実質的に純粋な、パキスタンからのＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）ＳＡＲ−５５株に関する。本発明はまた、ＨＥＶタンパク質をコードするウイルス遺伝子のクローン化および発現系を用いた組み換えタンパク質の発現にも関する。本発明は分離されたタンパク質に関する。望ましくは、本発明のＨＥＶタンパク質は天然のＨＥＶタンパク質に実質的に相同であり、最も望ましくはそれと生物学的に等価である。本明細書および特許請求の範囲を通して使われる「生物学的に等価」によって意味されることは、その構成物がウイルス様粒子を形成でき、免疫原たりうることである。本発明のＨＥＶタンパク質はまた、哺乳動物に注射すると、野生型ＨＥＶに挑戦するときに該哺乳動物を防御してくれる防御抗体の生産を刺激することもできる。本明細書の以下の部分および特許請求の範囲を通して使われる「実質的に相同」によって意味されることは、アミノ酸配列の天然ＨＥＶタンパク質との相同性の度合いである。望ましくは相同性の度合いは７０％より大きく、好適には９０％を越え、特に好適なタンパク質のグループについては天然のＨＥＶタンパク質との相同性が９９％を越える。好適なＨＥＶタンパク質はＯＲＦ遺伝子にコードされるタンパク質である。ＨＥＶのＯＲＦ−２遺伝子にコードされるタンパク質は特に興味深く、ＨＥＶのＳＡＲ−５５株のＯＲＦ−２遺伝子にコードされるタンパク質は最も興味深い。ＯＲＦ−１、ＯＲＦ−２およびＯＲＦ−３タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、ＳＥＱＩＤＮＯ．：１、ＳＥＱＩＤＮＯ．：２およびＳＥＱＩＤＮＯ．：３として以下に示される： SEQ ID NO: 1: SEQ ID NO:2: SEQ ID NO:3: ３文字の略号は、２０の天然に存在するアミノ酸に対する慣例のアミノ酸速記法に従う。好適な組み換えＨＥＶタンパク質は少なくとも１つのＯＲＦタンパク質を含む。同じもしくは異なるＯＲＦタンパク質群を複数含む他の組み換えタンパク質を、該タンパク質の生物学的特性を変更するように作製することもできる。種々のアミノ酸もしくは種々のアミノ酸配列の付加、置換もしくは欠失が該ＨＥＶタンパク質の生物学的活性を高めうることも予期される。本発明はまた、上述のＨＥＶタンパク質もしくは該ＨＥＶタンパク質群に実質的に相同なタンパク質群を生産させることのできる核酸配列である。この核酸配列は、ＳＡＲ−５５と名付けられ、ＳＥＱＩＤＮＯ．：４として以下に示され、１９９２年９月１７日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。ヌクレオチドに用いた略号は当該分野で標準的に用いられるものである。一方向の配列を、RNA ウイルスのタンパク質をコードする鎖であることから、慣習により「プラス」配列と表記するが、これは上でSEQ ID. NO.:4として示した配列である。 SAR-55のオープンリーディングフレームの推定されるアミノ酸配列は、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3である。ORF-1はSEQ ID NO.4のヌクレオチド2 8から始まり5078ヌクレオチド広がる。ORF-2はSEQ ID NO.4のヌクレオチド5147 から始まり1979ヌクレオチド広がる。ORF-3はSEQ ID NO.4のヌクレオチド5106から始まり368ヌクレオチド広がる。 DNA 配列中の変異の結果、ORF-2 タンパク質の類似物の産生を指示しうるDNA 配列となることもありうると考えられる。上述のDNA 配列は、本発明の好ましい態様を表すものであることに注意されたい。遺伝コードの縮重により、上記のOR F タンパク質またはその類似体の産生を指示しうるDNA 配列とするのに、莫大なヌクレオチドの選択を行えることを、理解すべきである。従って、上述の配列と機能的に同じDNA 配列、またはORF タンパク質の類似物を上述のアミノ酸配列に準じて産生するよう指示する配列と機能的に同じDNA 配列は、本発明に含まれるものとする。本発明は生物試料中のＥ型肝炎ウイルスを、Ｅ型肝炎遺伝子断片の選択的増幅に基づいて検出する方法に関するものである。望ましい形では、本方法はDNA 二重鎖断片の相補鎖の非相同領域に由来する一組の一本鎖プライマーを使用するが、そのＤＮＡ二重鎖断片はSEQ ID No.:4に示したSAR-55配列に相同性をもつ領域を含むゲノムを有するＥ型肝炎ウイルスに由来するものである。これらのプライマーを、米国特許第4,683,202 号に規定される特定の核酸配列の増幅過程に従う方法に用いることができる。本発明はまた、SAR-55 cDNA に相同性をもつ配列に由来する一本鎖アンチセンスのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを用いて、Ｅ型肝炎遺伝子の発現を阻害することに関するものである。これらのアンチセンスのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、DNA でもRNA でもよい。標的とする配列は典型的にはメッセンジャーRNA であり、より好ましいのはRNA のプロセッシングと翻訳に必要なシグナル配列である。アンチセンスのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、レマイター、M ら（Lemaitre，M．etal.（1989）Proc．Natl． Acad．Sci．USA 84:648-652）の記述のようにポリリジンなどのポリ陽イオンに結合することができ、この結合物の十分量を哺乳類に投与し、メッセンジャーRN A にハイブリダイズさせ、その機能を阻害することができる。本発明はHEV タンパク質の作製のための組換えDNA 法を含み、HEV タンパク質として望ましいのは少なくとも一つのORF タンパク質から構成されるタンパク質、最も望ましいのは少なくとも一つのORF-2 タンパク質から構成されるタンパク質である。組換えORF タンパク質は一つのORF タンパク質で構成されるか、または同種あるいは異なるORF タンパク質の組合せで構成される。天然の核酸配列または合成核酸配列を用いて、HEV タンパク質の産生を指示することができる。本発明の一つの態様では、方法は以下の工程を包含する： (a)宿主生物にHEV タンパク質の産生を指示できる核酸配列を調製し； (b)宿主生物に導入し複製できるベクターで、核酸配列に対する調節要素を含むようなベクターへ核酸配列をクローン化し； (c)タンパク質を発現できる宿主生物へ、核酸配列と調節要素を含むベクターを導入し； (d)ベクターの増幅とタンパク質の発現に適当な条件下で宿主生物を培養し；そして (e)タンパク質を回収する。本発明のもう一つの態様では、HEV の核酸でコードされるタンパク質の組換え DNA 合成法は以下のものを包含する。ここでHEV タンパク質は望ましくは少なくとも一つのHE VORF でコードされるか、または同種あるいは異なるORF タンパク質の組合せでコードされ、最も望ましくは少なくとも一つのORF-2核酸配列でコードされる： (a)宿主生物を形質転換またはトランスフェクションして、宿主生物にタンパク質産生を指示しうる核酸配列を持たせ、タンパク質を産生する条件下でこれを培養すること。ここで前述のタンパク質は、HEV から単離されたSEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3の生来のHEV タンパク質、またはこの組み合わせと実質的に相同性を示すアミノ酸配列を持つものである。一つの態様ではHEV 株SAR-55のウイルスゲノムの RNA配列を単離し、以下のようにクローン化しcDNAとした。SAR-55を感染させたカニクイザルから集めた生物試料より、ウイルスRNA を抽出した後、ウイルスRNA を逆転写し、Burma（タムら(Tam et al.)）由来のHEV 株のゲノムまたはSAR-55ゲノムのプラス鎖またはマイナス鎖に相補的なプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅する。PCR 断片はpBR322またはpGEM-32 にサブクローン化し、二重鎖PCR 断片の配列を決定した。本発明に用いることが考えられるベクターには、上に記載した核酸配列を望ましいまたは必要な任意の調節要素と共に挿入することが可能で、さらにその後宿主生物に導入し、そうした生物中で複製可能な全てのベクターが含まれる。望ましいベクターは制限部位がよく記録され、核酸配列の転写に望ましいまたは必要な調節要素を含むものである。本明細書で論じる「調節要素」には、少なくとも一つのプロモーター、少なくとも一つのオペレーター、少なくとも一つのリーダー配列、少なくとも一つの終止コドン、およびベクター上の核酸の適当な転写とその後の翻訳に必要または望ましい配列全てを含む。特にこうしたベクターとして考えられるのは、宿主生物が認識する少なくとも一つの複製起点を含み、また少なくとも一つの選択マーカー、核酸配列の転写開始を可能とする少なくとも一つのプロモーター配列が存在するものである。本発明のクローン化ベクターの構築では、核酸配列とこれに付随する調節要素を多コピーで各ベクターに挿入できることを、付加的に記さねばならない。こうした態様では宿主生物は、望みのHEV タンパク質をベクターあたり大量に産生する。ベクターに挿入できるDNA 配列の多コピー数を制限するのは、結果として生じるベクターがその大きさで、適当な宿主微生物に導入され複製、転写される能力を持つか否かだけである。もう一つの態様では、HEV タンパク質のコーディング配列を含んだ制限酵素消化断片を、原核または真核細胞中で機能する適当な発現ベクターに挿入することができる。ここで適当というのは、HEV タンパク質をコードする完全な核酸配列を、望ましくは少なくとも一つの完全なORF タンパク質をコードする完全な核酸配列を、ベクターが運搬し発現できることを意味する。ORF-2 の場合には、発現されたタンパク質はウイルス様の粒子を形成しなければならない。望ましい発現ベクターは、真核細胞で機能するものである。こうしたベクターの例にはワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス、望ましいものとしてバキュロウイルス導入ベクターであるpBlueBacが含まれるが、これらに制限される訳ではない。望ましいベクターは完全なORF-2 遺伝子を含むp63-2 、および完全なORF-3 とORF-2 遺伝子を含むP59-4 である。これらのベクターは1992 年 9月10日にAmerican Type Culture Collection，12301 Parklawn Drive，Rock ville，MD 20852 USAに寄託された。実施例１はORF-2 遺伝子をpBlueBacにクローン化しp63-2 を作製した例を説明している。この方法に含まれるのは、SAR-55 HEV株のゲノムの制限酵素NruIおよびBglIIによる消化、ベクター上の唯一のNhe I部位へのBlnII およびBglII 部位を含むポリリンカーの挿入、および NruI-Bgl II ORF-2断片のBlnI-BglII Pbluebac へのアダプターを用いた挿入である。さらにもう一つの態様では、組換えタンパク質の発現を目的として、選択した組換え発現ベクターを適当な真核細胞系に導入することもできる。こうした真核細胞系に含まれるのは、HeLa、MRC-5 またはCv-1などの細胞系であるが、これらに制限される訳ではない。望ましい真核細胞系はＳＦ９昆虫細胞である。一つの望ましい方法にはPbluebac発現ベクターの使用が含まれるが、ここでは昆虫細胞系ＳＦ−９を組換えPbluebacとAcMNPV バキュロウイルスDNA でCa沈澱法により同時形質転換する。発現した組換えタンパク質は当該分野で知られる方法で検出することができ、これにはクマジーブルー染色、および実施例２に示すような抗HEV 抗体を含んだ血清を用いたウェスタンブロッティングが含まれる。もう一つの方法は実施例３に示すような、免疫電子顕微鏡によるウイルス様粒子の検出である。さらに他の態様では、ＳＦ−９細胞で発現された組換えタンパク質を粗抽出物として調製したり、または当該分野で知られる標準的なタンパク質精製操作で精製することも可能であり、こうした操作には分離沈澱、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点焦点電気泳動、ゲル電気泳動、親和性および免疫親和性クロマトグラフィーなどが含まれる。免疫親和性クロマトグラフィーの場合には、ORF タンパク質に特異的な抗体を結合させたレジンを含むカラムを通過させることで、組換えタンパク質を精製できる。もう一つの態様では、本発明で発現した組換えタンパク質を用いて、哺乳類のＥ型肝炎の診断、予後のための免疫検定を行うことができる。ここで哺乳類にはヒト、チンパンジー、旧世界サル、新世界サル、その他の霊長類などが含まれるが、これに制限される訳ではない。望ましい態様では、免疫検定はヒトのＥ型肝炎感染の診断に有用である。HEV タンパク質、特にORF タンパク質、とりわけOR F-2 タンパク質を用いた免疫検定は、部分的なORF タンパク質を用いた免疫検定とは対照的に、特異性、感受性、再現性の高いHEV 感染の診断法を供給する。本発明の免疫検定は放射性免疫検定、ウェスタンブロット検定、免疫蛍光検定、酵素免疫検定、化学発光検定、免疫組織化学検定などでよい。当該技術分野で知られる標準的なELISA の手法は、Methods in Immunodiagnosis，2nd Edition ローズとビガッジ編（Rose & Bigazzi eds.）John Wiley and Sons，1980とキャンベルら（Campbell et al.）Methods of Immunology W.A. Benjamin，Inc.，19 64に記載されており、両者は本明細書に参考文献として取り入れてある。こうした検定は当該技術分野に記載されているように、直接、間接、競争または非競争の免疫検定でありうる。（オレリッヒ，M（Oollerich，M．1984．J．Clin．Chem ．Clin ．Biochem．22:895-904）こうした検出検定に適した生物試料に含まれるのは、組織生検抽出物、全血液、血漿、血清、脳脊髄液、胸膜液、尿などが含まれるが、これらに限定される訳ではない。一つの態様では、試験する血清を固体相試薬と反応させるが、この固体相試薬の表面には組換えHEV タンパク質を抗原として結合してあり、特に一つのORF タンパク質またはORF-2 およびORF-3 といった異なるORF タンパク質の組合せを、抗原として結合してあるのが望ましい。より望ましい形では、HEV タンパク質はウイルス様粒子を形成するORF-2 タンパク質である。固体表面試薬は、タンパク質を固体支持物質に結合させる既知の手法により調製できる。こうした結合法にはタンパク質の支持体への非特異的吸収、または支持体上の反応基へのタンパク質の共有結合が含まれる。抗原を抗HEV 抗体と反応させた後、結合しなかった血清成分を洗浄して除き、抗原抗体複合体を、標識した抗ヒト抗体などの二次抗体と反応させる。固体支持体を適当な蛍光または比色試薬の存在下でインキュベートすることにより検出できるような酵素を、標識として用いることもできる。放射性標識または金コロイドなどの他の検出標識を用いることもできる。望ましい態様では、SAR-55のORF-2 配列全体を含んだPbluebac組換えベクターにより発現されるタンパク質は、抗HEV 抗体、望ましい形ではIgG またはIgM 抗体を検出する特異的な結合試薬として使用できる。実施例４および５は、固体相試薬が組換えORF-2 を表面抗原としてもつようなELISA の結果を示す。ORF-2 核酸配列全体でコードされるこのタンパク質は、部分的なORF-2 タンパク質より優れる。なぜならHEV を感染させた異なる霊長類種のより多くの抗血清に対して、このタンパク質は部分的なORF-2 抗原よりも反応するからである。本発明のタンパク質はHEV の異なる株に応答して産生された抗体も検出できるが、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型肝炎またはＤ型肝炎に応答した抗体は検出しない。 HEV タンパク質およびその類似体は単体として、または二次抗体などの他の試薬との組合せとして、免疫検定用のキットの形で調製できる。本発明の組換えHEV タンパク質は、望ましい形では単独のORF タンパク質またはORF タンパク質の組合せ、さらに望ましいのはORF-2 タンパク質であるが、このタンパク質および実質的に相同性をもつタンパク質、および類似体は、哺乳類のＥ型肝炎による感染を防ぐワクチンとして用いることができる。免疫原として作用するワクチンは、細胞、組換え発現ベクターで形質転換した細胞の細胞溶解物または発現されたタンパク質を含んだ培養上清が考えられる。この代わりに免疫原は部分的または実質的に精製された組換えタンパク質でもよい。免疫原を純粋な形または実質的に純粋な形で投与することも可能であるが、薬剤組成物、処方薬、製剤として提示する方が望ましい。本発明の処方薬は、家畜の治療およびヒトへのの用法のいずれでも、上に記載の免疫原と薬学的に受理できる一種または複数の担体、および随意に他の治療上の成分を含む。担体は、処方薬中の他の成分と両立し、薬の受血者に有害ではないという意味で「受容できる」ものでなければならない。処方薬は投薬量単位という形で便利に提示することが可能であり、薬学技術分野でよく知られるいかなる方法でも調製できる。全ての方法には、活性のある成分を一種または複数の付属成分を構成する担体と結合させる段階が含まれる。一般に処方薬の調製の際には、均一かつ精細に活性のある成分を、液体担体または細かく砕いた固体担体またはその両者に結合させ、後に必要であれば調製物を望みの処方薬の形にする。静脈、筋肉、皮下、腹腔内投与に適した処方薬は、披投与者の血液と等張であることが望ましい溶液に、活性のある成分を溶かした無菌水溶液を含むのが、便利である。こうした処方薬を調製するには、塩化ナトリウム（たとえば0.1-2.0M ）、グリシンなどの生理的に害のない基質を含み、水溶液を作製するのに生理的条件と両立するような緩衝化Phをもつ水に固体活性成分を溶解させ、この水溶液を滅菌するのが便利である。これらはたとえば封印したアンプルまたはバイアル瓶といった、投薬量単位または複数の投薬量の入った入れ物で提供することもできる。本発明の処方薬は安定剤を含むこともできる。実例となる安定剤はポリエチレングリコール、タンパク質、糖、アミノ酸、無機酸、有機酸であり、これらは単独でまたは添加物として用いることができる。これらの安定剤は免疫原の単位重量あたり0.11-10,000 の重量部で取り込ませるのが望ましい。二種またはそれ以上の安定剤を用いるのであれば、その総量を上に規定した範囲内にするのが望ましい。これらの安定剤は適当な濃度とPhの水溶液で用いる。こうした水溶液の特異的浸透圧は一般に0.1-3.0 オスモルの範囲で、0.8-1.2 の範囲が望ましい。水溶液のPhは5.0-9.0 の範囲に調整するべきで、6-8 の範囲が望ましい。本発明の免疫原を処方薬とする際には、抗吸着試薬を用いることもできる。作用の持続期間を制御するために、付加的な薬学的方法を使用することもできる。制御放出製剤は、重合体を用いてタンパク質およびその派生物を複合体とする、または吸収させることで作製することができる。制御された放出を果たすには、適当な巨大分子（たとえばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニル酢酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン）を選択し、巨大分子の濃度と、制御放出のための取り込みの方法を選択すればよい。制御放出製剤による作用の持続期間の制御として可能なもう一つの方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ酪酸、エチレンビニル酪酸共重合体などの重合体物質の粒子に、タンパク質、タンパク質類似体およびこれらの機能的な派生物を取り込ませることである。一方これらの試薬を重合体粒子に取り込ませる代わりに、これらの物質を微量カプセルまたはコロイド薬剤放出系またはマクロ乳剤に入れることも可能であり、こうしたカプセルの調製はたとえばコアセルベーション技術や界面重合化が考えられ、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン微量カプセル、ポリメチルメタクリレート微量カプセルを例として挙げられるし、コロイド薬剤放出系としてたとえばリポソーム、アルブミン微小球、微小乳剤、ナノ粒子、ナノカプセルが考えられる。経口調剤が望ましい場合には、組成物をとりわけラクトース、スクロース、デンプン、ステアリン酸マグネシウムタルク、クリスタリンセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴムといった典型的な担体に結合させることもできる。本発明のタンパク質は、キットの形で、単独で、または上に記載した薬剤組成物の形で供給することもできる。ワクチン化は一般な方法で行える。たとえば生理的食塩水または水などの適当な希釈剤中で、または完全あるいは不完全なアジュバント中で免疫原を用いることができる。さらに免疫原を担体に結合させて、免疫原タンパク質を作製することもできるし、また特にそのようにしなくてもよい。こうした担体分子の例にはウシ血清アルブミン（BSA）、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、破傷風トキソイドなどが含まれるが、これに制限される訳ではない。免疫原は、静脈、腹腔内、筋肉、皮下などの抗体作製に適当ないかなる経路によっても、投与することができる。免疫原は有意な力価の抗HEV 抗体が産生されるまで、一回または定期的な期間で投与する。血清中の抗体は、免疫検定を用いて検出できる。本発明の免疫原の投与は予防または治療を目的とすることができる。予防のための供給の場合には、免疫原はHEV へのいかなる被曝よりも先んじて、あるいは HEV 感染によるいかなる徴候よりも先んじて投与される。免疫原を予防用として投与することで、哺乳類でのその後のHEV のいかなる感染をも防止あるいは緩和することができる。治療用として供給する際には、感染の始めに（またはそのすぐ後に）、またはHEV に起因する感染または症状の始めに、免疫原を投与する。免疫原を治療投与することで、感染または症状を緩和できる。望ましい態様はHEV 株SAR-55のORF-2 配列で発現される組換えORF-2 タンパク質、またはその同等物を用いて調製したワクチンである。ORF-2 タンパク質は様々なHEV 陽性血清に反応することが既に示されているので、様々なHEV 株に対する防御の際のこれらの有用性が指摘される。ワクチンとして用いるのに加えて、本組成はHEV 用粒子に対する抗体の調製に用いることができる。抗体は直接抗ウイルス試薬として用いることができる。抗体を調製するには、ウイルス粒子、または適切な場合には、ウイルス粒子の生来の非粒子抗原を上に記載したような担体に結合させてワクチンとしたものを用いて、宿主動物を免疫する。宿主の血清または血漿を、適当な時間間隔の後に集めて、ウイルス粒子に反応する抗体を含む組成物を供給する。ガンマグロブリン画分またはIgG 抗体を、たとえば飽和硫酸アンモニウムやDEAE Sephadex または当業者の既知の他の手法を用いることで、調製できる。こうした抗体は、薬剤などの他の抗ウイルス試薬に付随する多くの有害な副作用を実質的に持たない。抗体組成物は、潜在する有害な免疫系応答を低減することで、さらに宿主系に害の少ないものとすることができる。これは外来種の抗体のFc部分の全体または一部を取り除くか、宿主動物と同種の抗体たとえばヒト／ヒトハイブリドーマ由来の抗体を用いることにより、可能となる。ヒト化された抗体（すなわちヒトでは免疫原とならない）を作製するには、たとえば抗体の免疫原となる部分を、対応するが免疫原とはならない部分で置換すればよい（すなわちキメラ抗体）。こうしたキメラ抗体は、一つの種由来の抗体の反応性部分または抗原結合部分と、異なる種の抗体のFc部分（免疫原とならない）を含んでいる。キメラ抗体の例には、ヒト以外の哺乳類とヒトのキメラ、醤歯類とヒトのキメラ、マウスとヒトおよびラットとヒトのキメラが含まれるが、これに限定されない。（ロビンソンら（Robinson et al.）国際特許出願（International Patent Application）184,1 87；タニグチ M.（Taniguchi M.）欧州特許出願（European Patent Application ）171，496；モリソンら（Morrison et al.）欧州特許出願（European Pate nt Application）173，494；ノイバーガーら（Neuberger et al.）ＰＣＴ出願ＷＯ／８６／０１５３３；カビリイら（Cabilly et al.），1987 Proc．Natl．A cad．Sci．USA 84:3439；ニシムラら（Nishimura et al.）,1987 Canc．Res．47 :999；ウッドら（Wood et al.）,1985 Nature 314:446；ショーら（Shaw et al. ） 1988 J．Natl．Cancer Inst．80:15553、これらは全て本明細書に参考文献として取り込んだ。） ”ヒト化”キメラ抗体についての概論は、モリソンおよびオイらにより提供されている。Morrison S.，1985 Science 229:1202およびOi et al.，1986 BioTec hniques 4:214 適切な”ヒト化”抗体は、CDRまたはCEA置換によってつくられる（ジョーンズら、Jones et al.，1986 Nature 321:552;ヴァーホイアンら、Verhoeyan et al. ，1988 Science 239:1534;ビードレレットら、Biedleret et al.，1988 J.Immun ol. 141:4053,参照により本明細書に含まれる）。抗体または抗原結合断片は、また遺伝子工学によってもつくられる。大腸菌で重鎖および軽鎖遺伝子を発現させる技術は、PCT特許出願の国際公開番号W090144 3，WO901443およびWO9014424、およびフセらHuse et al.，1989 Science 246:12 75-1281の主題とされている。抗体はまた免疫反応を増強させる方法としても使用できる。抗体は、他の治療上の抗体の投与と同程度の量投与できる。例えば、狂犬病、はしか、およびＢ型肝炎などの他のウイルス病の初期潜伏期に、プールしたガンマグロブリンがウイルスの細胞への侵入を阻止するため、体重１ポンド当たり0.02-0.1ml投与される。そこで、HEVウイルス顆粒と反応する抗体は、HEVが感染した宿主に、免疫反応および/または抗ウイルス薬剤の効果を増強するため、単独で、または他の抗ウイルス薬剤とともに受動的に投与できる。また、抗HEV抗体は、抗原として抗イデオタイプ抗体を投与することで誘導できる。好適には、上に記載された様な精製抗HEV抗体の調製物を宿主動物でイデオタイプ抗体を誘導するのに用いる。調製物が適当な希釈で宿主動物へ投与される。投与に続いて、通常は繰り返しの投与に続いて、宿主は抗イデオタイプ抗体を産生する。Fc領域に対する抗原反応を排除するために、宿主動物と同種の動物によって産生された抗体を用いるか、または、投与する抗体のFc領域を除いて用いてもよい。宿主動物での抗イデオタイプ抗体の誘導に続き、血清または血漿を採取して抗体調製物を産する。抗体調製物は、抗HEV抗体について上に記載されたようにして、または親和性マトリクスに結合された抗HEV抗体を用いた親和性クロマトグラフィーによって、精製される。産生された抗イデオタイプ抗体は構造的に本来のHEV抗原に似ており、HEV粒子抗原を用いる代わりにHEVワクチンを調製するのに用いられる。動物中で抗HEVウイルス抗体を誘導する方法としてもちられる場合、抗体を注入する方法は、予防接種を目的とする場合と同様である。つまり、アジュバントを用いたり、あるいは用いないで、生理学的に適切な希釈液で希釈した効果的濃度で筋肉、腹腔、皮下などへ行う注射である。１回以上の追加投与を用いるのが望ましい。本発明のHEV由来タンパク質はまた、感染前予防、または感染後予防のために計画的に抗血清を産生するのに用いられる。ここでは、ひとつのHEVタンパク質またはタンパク質の混合物が、ヒト抗血清を産生する既知の方法に従って、適当なアジュバントとともに処方され、志願者（ボランティア）に注射によって投与される。注射されたタンパク質に反応する抗体は免疫処置後数週間にわたって、一定間隔で血清を取り、ここで記載された免疫アッセイを用いて抗HEV血清抗体の存在を同定することでモニターされる。免疫された人からの血清は、感染の危機にある人の前予防の方法として投与することもできる。血清はまた、Ｂ型肝炎ウイルスに対する高力価の抗血清の後予防としての使用の場合と同様に、後予防で用いるのにも有用である。 HEVウイルス様粒子およびタンパク質に対する抗体および抗イデオタイプ抗体の生体内での（ｉｎｖｉｖｏ）使用および治療上での使用の両方でモノクローン抗体を用いることが好ましい。モノクローン抗ウイルス粒子抗体または抗イデオタイプ抗体は以下の方法で産生できる。免疫された動物から脾臓またはリンパ球を取り出し、不死化するか、または当業者には既知の方法でハイブリドーマを調製するのに用いる。（ゴーディング、Goding，J.W. 1983.Monoclonal Antibod ies:Principles and Practice，Pladermic Press，Inc.，NY，NY，pp56-97）。ヒトーヒトハイブリドーマを産生するために、ヒトリンパ球の提供者が選択される。HEVに感染していることが分かっている提供者は（この場合、感染は例えば血液中の抗ウイルス抗体の存在によって、またはウイルス培養によって示される）、適当なリンパ球の提供者として役立つ。リンパ球は抹消の血液試料から単離できる。また、提供者が脾臓摘出を受けるなら脾臓細胞が用いられる。エプスタインーバーウイルス（EBV）がヒトリンパ球を不死化するのに用いられる。また、ヒト融合パートナーがヒトーヒトハイブリドーマを産生するのに用いられる。主に試験管内での（ｉｎｖｉｔｒｏ）ペプチドを用いた免疫化がまた、ヒトモノクローン抗体を産するのに用いられる。不死化細胞から分泌された抗体は、望まれた特異性をもつ抗体を分泌するクローンを決定するために選別される。モノクローン抗ウイルス粒子抗体としては、抗体はHEVウイルス粒子に結合しなければならない。モノクローン抗イデオタイプ抗体としては、抗ウイルス粒子に結合しなければならない。望まれる特異性をもつ抗体を産する細胞が選択される。上述の抗体およびその抗原結合断片は単独のキットの形態で、または生体内使用用の薬剤組成物として供給される。抗体は、治療用、免疫アッセイでの診断用、または本明細書中に記載されたようなORFタンパク質を精製するための免疫親和性試薬として用いられる。材料以下の実施例で用いられる材料はいかのようなものであった：霊長類．チンパンジー(Chimp)(Pan troglodytes)。旧世界サル：カニクイザル(Cyno)(Macaca fascicularis)、アカゲザル(Rhesus)(M.mulatta)、ブタオザル(PT)(M.nemestrina)、およびアフリアカミドリザル(AGM)(Cercopithecus aeth iops)。新世界サル：クチヒゲタマリン(Tam)(Saguinus mystax)、リスザル(SQM) (Saimiri sciureus)、およびヨザル(OWL)(Aotus trivigatus)。霊長類は生物学的危険物の封じ込め条件下で一匹ずつ飼われた。動物の飼育場、飼育、および世話は、霊長類の飼育上のすべての要求にかなっていたか、十分すぎるほど満たしていた。多くの動物は、ツァレヴら（Tsarev，S.A. et al.(1992)，Proc.Natl.Acad.Sc i.USA ，89:559-563、およびTsarev，S.A.et al.(1992)，J.Infect.Dis.(投稿中) ）によって記載されたようにウシ胎児血清で希釈された0.5mlの便（ｓｔｏｏｌ）懸濁液中に含まれたHEV、SAR-55株を静脈注射された。Chimp-1313および1310は７人のパキスタン人Ｅ型肝炎の患者から採集した便のプールを接種された。血清試料は接種の前と後のほぼ週２回採集された。肝臓の酵素、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(ICD)、およびガンマグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)が商品化された試験法を用いてアッセイされた（メドパス社、メリーランド州ロックビル、Medpath Inc.，Rockville ，MD）。血清学的試験は上記のように行った。実施例１ HEV SAR-55株のゲノムのDNA配列の同定 PCR用の鋳型ウイルスRNAの調製 HEV感染カニクイザルの胆汁（10μl）、20 %（wt/vol）SDS（最終濃度1%）、プロテイナーゼK（10mg/ml；最終濃度1mg/ml）、1μlのtRNA（10mg/ml）、および3μlの0.5M EDTAを最終的に250μlとして混合し、30分間55度で保温した。全核酸を胆汁から、フェノール/クロロフォルム、1 :1（vol/vol）を用いて65度で2回、クロロフォルムを用いて1回処理し抽出し、エタノールで沈殿させ、95%エタノールで洗い、RT-PCRに用いた。糞からの、特に血清からのHEV RNAのRT-PCR増幅は、RNAがもっと大量に精製された場合に、より効果的である。血清（100μl）または10%糞懸濁液（200μl）を上記のようにプロテイナーゼKで処理した。30分の保温の後、300μlのCHAOSバッファー（4.2M グアニジンチオシアネート/0.5N ラウロイルサルコシン/0.025M Tris-HCI，pH8. 0）を加えた。核酸は65度でフェノール/クロロフォルムを用いて2回、続いて室温でクロロフォルムを用いて1回処理し抽出した。そして、上層に7.5M酢酸アンモニウム（225μl）を加え、核酸を0.68mlの2-プロパノールで沈殿させた。沈殿を300μlのCHAOSバッファーで融解し、100μlの水を加えた。クロロフォロム抽出および2-プロパノール沈殿を繰り返した。核酸を水に溶かし、エタノールで沈殿させ、95%エタノールで洗い、RT-PCRに用いた。プライマー 21-40ヌクレオチド（nt）で、ビルマからのHEV株（BUR-121）（タムら、Tam，A.W. et al.(1991)，Virology，185:120-131）のゲノムまたはS AR-55ゲノムのプラスまたはマイナス鎖に相補的である、94個のプライマーをアプライドバイオシステムズモデル391 DNA合成機（Applied Biosystems model 39 1 DNA synthesizer）を用いて合成した。これらの94個のプライマーの配列はSEQ. ID NO.5からはじまりSEQ. ID NO.98 まで以下に示してある： HEV プライマーリスト配列の左の略語は以下のものを表す：RおよびDはそれそれ逆向き（reverse）および純向き（forward）プライマーを表す；BおよびSはそれぞれE型肝炎のBurm a-121株およびE型肝炎のSAR-55株由来の配列を表す；5'NCおよび3'NCはそれそれ HEVゲノムの5'および3'ノンコーディング領域を表す；1,2および3はそれぞれオープンリーディングフレーム1,2および3由来の配列を表す。幾つかの配列の右側に示した()の記号はこれらの配列に人為的に挿入した制限酵素部位を表す。 PCR断片のクローニング用に、3-7nt上流にEcoRI，BamHIまたはBglII制限酵素部位をプライマーの5'末端に加えた。ＲＴ−ＰＣＲ通常の100μlのRT-PCR混合液は、鋳型、10mM Tris-HCl（pH8 .4）、50mM KCl、2.5mM MgCl₂、4種すべてのdNTPs（それぞれ0.2mM）、50pmolのダイレクトプライマー、50pmolのリバースプライマー、40unitsのRNasin（プロメガPromega）、16unitsの鳥のミエロブラストシスウイルス逆転写酵素（プロメガ）、4unitsのAmpliTaq（シータスCetus）からなり、100μlの軽ミネラルオイルをのせた。この混合液を、42度で1時間保温し、35回のPCRサイクルで増幅した；94度1分、45度1分、72度1分。PCR産物を1%アガロースゲルを用いて解析した。 PCR断片のクローニング末端に制限酵素部位をもつPCR断片を制限酵素EcoR IおよびBamHI、またはEcoRIおよびBglIIで消化し、EcoRI/BamHIで消化したpBR32 2またはpGEM-3Z（プロメガ）にクローン化した。あるいは、PCR断片をTAクローニングキット（インビトロゲン Invitrogen）を用いてpCR1000（インビトロゲン）にクローン化した。 PCR断片およびプラスミドの塩基配列決定 PCR断片を1%アガロースゲルから切り出し、ジーンクリーン（バイオ101 Bio 101、カリフォルニア州ラジョラ）によって精製した。2本鎖PCR断片の塩基配列を、ウインシップ（Winship，P.R.( 1984)，Nucleic Acids Rev.，17:1226）により記載されているように、シークエナーゼ（ユナイテッドステーツバイオケミカル United States Biochemical）によって決定した。CsCl勾配により精製した2本鎖プラスミドの塩基配列を、シークエナーゼキット（ユナイテッドステーツバイオケミカル）を用いて決定した。塩基配列のコンピュータ解析 HEV株のヌクレオチド配列をジェネティックスコンピュータグループ（ウイスコンシン州マジソン）ソフトウエアーパッケージ（デベリュークスら Devereaux，J. et al.(1984),Nucleic Acids Rev.，12 :387-395，version7.5、VAX 8650コンピュータを使用（国立ガン研究所 the Nat ional Cancer Institute、メリーランド州フレデリック））を用いて比較した。実施例２組換え発現ベクター，P63-2の構築 HEV株SAR-55のゲノムのORF-2の全長を含むプラスミド（ツァレブら Tsarev，S .A. et al.(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:559-563）をNruI-BglII制限酵素断片を得るのに用いた。NruIはHEV cDNAのORF-2のATG開始コドンの5ヌクレオチド上流を切断する。BglII部位は、前以て、HEVゲノムの3'末端のポリA配列の直前に人為的におかれている（ツァレフら(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89 :559-563）。この断片をpBlueBac-Transfer ベクター（インビトロゲン）に挿入するために、合成ポリリンカーをベクターの唯一のNheI部位に導入した。このポリリンカーは、HEV cDNA配列およびpBlueBac配列の両方に無いBlnIおよびBglII 部位を含む。NruI-BglII ORF-2断片を、図1に示すようなアダプターを用いてBln I-BglII pBlueBacに挿入した。実施例３ＳＦ９昆虫細胞中でのＰ６３−２の発現ｐ６３−２およびＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスＤＮＡ（ＩＮｖｉｔｒｏｇｅｎ社（インビトロゲン））を、インビトロゲン手順に従ったカルシウム沈澱法によってＳＦ９細胞（インビトロゲン）中に共形質転換した一本手順に従って；ＡｃＭＮＰＶバキュロウイルスＤＮＡはｐ６３−２をパッケージして組換えバキュロウイルスを形成できる生きたバキュロウイルスを生産できる。この組換えバキュロウイルスは、４回プラーク精製した。生じた組換えバクロウイルス６３−２ −ＩＶ−２を昆虫ＳＦ９細胞を感染させるのに使用した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット昆虫細胞をローディング緩衝液（５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ６．８、１００ｍＭＤＴＴ，２％ＳＤＳ，０．１％ブロモフェノールブルーおよび１０％グリセロール）中に再懸濁し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動をラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、イギリス（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０に記載されたように行った。ゲルをクマシーブルーで染色するまたはタンパク質をＢＡ−８５ニトロセルロースフィルター（シュライヒャー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）＆シュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ））上に電気ブロットした。トランスファーの後、ニトロセルロースメンブレンを１０％胎児牛血清および０．５％ゼラチンを含むＰＢＳ中でブロックした。一次抗体として１：１０００に希釈したチンパンジー−１３１３の高度免疫血清を使用した。二次抗体として、１：２０００に希釈したヒトＩｇＧに対するホスファターゼでラベルした親和精製済みのやぎ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した。フィルターをアルカリホスファターゼに対する基質を固定したウエスタンブルー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で現像した。全てのインキュベーションはブロッキング溶液中で行い、洗いは０．０５％トゥイーン−２０（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳで行った。ＨＥＶＯＲＦ−２の発現組換えバキュロウイルス６３−２−ＩＶ−２を感染させたＳＦ９細胞中で合成される主要なタンパク質は、見かけの分子量７４ｋＤのタンパク質であった（図２Ａ）。この大きさはＯＲＦ−２全体から予測されるものよりも（７１ｋＤ）少し大きい。大きさの違いは、Ｎ末端部分に少なくとも１つの潜在的な糖鎖付加部位（アスパラギン−ロイシン−セリン）が存在するため、タンパク質の糖鎖付加による可能性がある。このタンパク質は感染していない細胞または野生型の組換え体でないバキュロウイルスを感染させた細胞中では検出されなかった。後者の場合には、検出された主要なタンパク質は多面性ウイルス性タンパク質であった。同じ抽出物をチンパンジー−１３１３血清（ＨＥＶで高度に免疫済み）によるウエスタンブロットで解析すると、組換え細胞抽出物中のタンパク質のみが反応し、主要なバンドは再び７４ｋＤタンパク質として現れた（図２Ｂ）。少ない方のバンドはウエスタンブロットにおいてもまた存在した。これら中には糖鎖付加の程度の違いによる可能性がある７４ｋＤよりも大きい分子量のものがあり、また中にはプロセッシングおよび／または分解を反映したと思われるより低い分子量のものもあった。ＨＥＶで接種する前のチンパンジー−１３１３由来の血清は、ウエスタンブロットによるとどのタンパク質とも反応しなかった。実施例４組換え体を感染させたＳＦ９細胞の免疫電子顕微鏡観察組換え体を感染させたＳＦ９細胞５×１０⁶を、１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．４、０．３％サルコシルを含む塩化セシウム（１．３０ｇ／ｍｌ）中で音波処理し、６８時間４０，０００ｒｐｍで遠心した（ＳＷ６０Ｔｉ）。ＥＬＩＳＡ反応の最も高く、浮遊密度が１．３０ｇ／ｍｌである５０μｌの画分を１ｍｌＰＢＳ中に希釈し、５μｌのチンパンジー−１３１３高度免疫血清を加えた。高度免疫血清は、先に感染させたチンパンジーに肝炎Ｅの第二の株（メキシコのＨＥＶ）で再免疫を行うことによって調製した。試料は１時間室温、それから一晩４℃でインキュベートした。免疫複合体をＳＷ６０Ｔｉローターを使用して３０，０００ｒｐｍ，４℃、２時間で沈澱させた。ペレットを蒸留水中に再溶解し、３％ＰＴＡでネガティブに染色し、炭素グリッドに載せて電子顕微鏡ＥＭ−１０、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ、オバーコッヘン、ドイツ中で４０，０００倍率にて調べた。ＶＰＬの検出野生型または組換え体バキュロウイルス６３−２−ＩＶ−２を感染させた昆虫細胞由来の細胞抽出液を塩化セシウム密度勾配遠心によって画分化した。組換え体を感染させた昆虫細胞由来の塩化セシウム勾配の画分をチンパンジー−１３１３高度免疫血清と共にインキュベートすると、抗体で覆われたウイルス様の粒子（ＶＬＰ）二種類が浮遊密度１．３０ｇ／ｍｌの画分中に観察された：１つは（図３Ａ）、抗体で覆われた、ＨＥＶであることを示唆する大きさ（３０ｎｍ）および形態的構造を持つ個々の粒子、２つ目は（図３Ｂ）、ＨＥＶより小さい粒子であるがその他はＨＥＶに類似する抗体で覆われた粒子の塊（約２０ｎｍ）であった。直接的な電子顕微鏡の使用は、ウイルス粒子に似ているが抗体が結合していないのでＨＥＶとして確定できない、直径３０および２０ｎｍ等を含む非常にヘテロな集団の存在を示した。多くのＩＥＭ実験は、ＨＥＶゲノムのＯＲＦ−２領域から合成される少なくてもいくつかのタンパク質は粒子構造に組み立てられたことを示唆した。小さい方のタンパク質の比率が多い感染後期の昆虫細胞はＥＬＩＳＡで常に良い結果を与えたことが観察された。従って、感染後期の組換え昆虫細胞の未分画抽出液を以下の試験におけるＥＬＩＳＡ用の抗原として使用した。実施例５抗ＨＥＶの完全なＯＲＦ−２を発現し、後にＨＥＶの異なる株で感染させた昆虫細胞の抗原に基づくＥＬＩＳＡによる検出６３−２−ＩＶ−２ウイルスを感染させた５×１０⁶のＳＦ９細胞を１ｍｌの１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ塩化ナトリウム中に再懸濁し、それから３回凍結と融解を行った。この懸濁液１０μｌを１０ｍｌの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に溶解し、簡易マイクロタイター測定プレート（Ｆａｌｃｏｎ）を覆うのに使用した。血清試料を１：２０、１：４００および１：８０００、または１：１００、１：１０００および１：１００００に希釈した。ウエスタンブロット用に上記に記載したのと同様のブロッキング溶液および洗い溶液をＥＬＩＳＡに使用した。二次抗体として、ヒトＩｇＧに対するペルオキシダーゼを結合させたヤギＩｇＧ画分または旧または新世界サルに対する西洋わさびペルオキシダーゼでラベルしたヤギ免疫グロブリンを使用した。結果は、４０５ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．）を測定することによって決定した。ＨＥＶパキスタン株を代表する昆虫細胞由来の抗原がＨＥＶメキシコ株で感染させたカニクイザル中の抗ＨＥＶ抗体を検出できるかを決定するために、３匹のサルを調査した（図４）。サイノ（カニクイザル）−８０Ａ８２およびサイノ− ９Ａ９７の二匹のサルをメキシコ’８６ＨＥＶ株（チセハースト、Ｊ．ら．（１９９２）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６５：８３５−８４５）を含む沈澱物で感染させ、および３匹目のサル、サイノ−８３を同じ株の二次培養物で感染させた。コントロールとして、パキスタンＨＥＶ株ＳＡＲ−５５で感染させたサイノ−３７４由来の血清試料を同様の実験で試験した。メキシコ株を感染させた３匹のサルはすべて抗ＨＥＶに血清が変換した。一次培養物感染由来の動物は１５週で血清が変換し、二次培養物感染由来のものは５週で変換した。興味深いことに、４匹の動物の中で最も高い抗ＨＥＶ力価はメキシコ株の二次培養物を接種したサイノ−８３であった。メキシコ株の一次培養物を接種したサイノは最も低い力価を示し、一方パキスタン株の一次培養物を接種したサイノは中間の力価を示した。実施例６完全なＯＲＦ−２を発現する昆虫細胞由来の抗原に基ずく抗ＨＥＶＥＬＩＳＡの特異性本明細書中で記載したＥＬＩＳＡが、他の型の肝炎に関連する抗体を除外して、抗ＨＥＶを特異的に検出するかを調べるために、チンパンジーの血清試料を既知の他の肝炎ウイルスで感染させた４匹に付いて分析した（ガルシ、Ｐら．（１９９２），Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６５：１００６−１００１；ファルシ，Ｐら．（１９９２），Ｓｃｌｅｎｃｅ（投稿中）；ポンゼットＡ．ら．（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：７２−７７；リゼット；ｍら．（１９８１）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１：５６７−５７４；チンパンジー−１４１３、１３７３、１４４２、１５５１（ＨＡＶ）についての参考；およびチンパンジー−９８２、１４４２、１４２０、１７１１０（ＨＢＶ）についての参考；はパーセルらの未発表データである。）（表１）。接種前の血清試料および接種後５週および１５週の血清試料を血清希釈１：１００、１：１０００および１：１００００にてＨＥＶＥＬＩＳＡ中で分析した。ＨＡＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，およびＨＤＶで感染させた動物由来の血清はどれもＨＥＶ抗体に対するＥＬＩＳＡで反応しなかったが、ＨＥＶで感染させた４匹全てのチンパンジーは抗ＨＥＶのＩｇＭおよびＩｇＧを発現した。実施例７ヒト以外の霊鳥類におけるＨＥＶＳＡＲ−５５株の宿主範囲の決定異なる霊鳥類の種に、ＨＥＶの標準的な便懸濁液を接種し、一連の血清試料を感染を測定するために集めた。血清ＡＬＴレベルを肝炎の指標として決定し、血清変換は抗ＨＥＶの検出によって決定された。ＨＥＶで感染させたアカゲザル（表２）はどちらも、血清変換と同様にＡＬＴ活性の非常に突出したピークを示した。増加するＡＬＴ活性の最初の徴候は両動物とも１４日目に観察され、決定的な血清変換は２１日目におきた。抗ＨＥＶの最大力価は２９日目に得られた。本実験で使用したアフリカミドリザルはどちらも（表２）ＡＬＴ活性および抗ＨＥＶの増大を表した。ＡＧＭ−２３０は接種後７週で死亡したが、感染の徴候はその時点より前に観察された。ＡＧＭ−７４は他の種で報告されているように（Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（印刷中））ＡＬＴ活性の２型性の増加を示した。ＡＧＭ−７４およびＡＧＭ−２３０の血清変換は各々２７日目および２１日目に最初に観察された。接種した短い尾のマカク（ｍａｃａｑｕｅｓ）はどちらもＡＬＴ活性が僅かに増加したが、これらの増加は先に記載した動物の場合のように顕著ではなかった。しかし、両サルとも２１日目に血清変換し、抗ＨＥＶ力価はチンパンジーおよび他の旧世界サルと等しかった。本実験で接種したタマリンはどれもＡＬＴ活性の上昇または抗ＨＥＶへの血清変換を示さなかった（表２）。リスザルはチンパンジーおよび旧世界ザルよりも明らかに低い抗ＨＥＶレベルで反応した（表２）。血清変換の時期もまたこれら他の動物と比較すると遅延していた。ＳＱＭ−８６８は４１日目に血清変換し、ＳＱＭ−８６９は３５日目に血清変換した。抗ＨＥＶ力価は調査した３カ月以上の間どの時点でも１：４００より高くならず、どちらの動物でも４７−５４日目にピークに達してから明らかに衰微した。しかし、ＡＬＴ活性の増加は両動物においてかなり際だっていた。フクロウザルはＨＥＶ感染に対して旧世界ザル種とほぼ同様の反応を示した（表２）。どちらのＯＷＭも２１日目に血清変換し、２８日目までには抗ＨＥＶ力価が１：８０００の値まで到達した。ＡＬＴ活性はＯＷＮ−９２４では３５日目にピークになったが、ＯＷＭ−９２５では９１日目までピークにならなかった。実施例８チンパンジーにおける抗ＨＥＶＩｇＭおよびＩｇＧの検出両チンパンジーにおいて、血清ＡＬＴレベルは接種後約４週で増加した（表２、図５）。両チンパンジーともＡＬＴ酵素の上昇の時期またはそれより早くに血清変換した（図５Ａ、５Ｃ）。抗ＨＥＶＩｇＭのレベルもまたチンパンジーについて決定された。チンパンジー−１３７４では抗ＨＥＶＩｇＭの力価（図５Ｂ）はＩｇＧ力価（図５Ａ）ほど高くなく、２週で衰微した。ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体はこの動物に付いて２０日目に最初に検出されたが、その日に抗ＨＥＶＩｇＭ力価は最も高く、一方、ＩｇＧ力価はその日に最も低く、それから上昇して３カ月以上およそ同じレベルにとどまった。チンパンジー−１３７５では、抗ＨＥＶＩｇＭのみが２０日目に検出された（図５Ｄ）。力価はチンパンジー−１３７４よりも高く、抗ＨＥＶＩｇＭは調査の期間中ずっと検出された。抗ＨＥＶＩｇＧはこの動物中で２７日目に最初に観察され（図５Ｃ）、実験中およそ同じレベルを保持した。実施例９昆虫細胞中で発現させた完全なＯＲＦ−２タンパク質に基づくＥＬＩＳＡと大腸菌中で発現させた構造タンパク質の断片に基づくＥＬＩＳＡの比較真核細胞中におけるＨＥＶゲノムの完全なＯＲＦ−２領域の発現は、大腸菌中での構造タンパク質断片の発現に対して何らかの利点があるかを調べるために、細菌中で発現させた抗原断片を使用して（表３）、我々はＥＬＩＳＡ中で以前の抗原を使用して先に分析したサイノモルガスザルの血清（Ｔｒａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＡＳ、８９：５５９−５６３；およびＴｒａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（投稿中））を再試験した。血清はより感受性の低いＯＲＦ−３抗原でも試験した。Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（印刷中）ＥＬＩＳＡで調べた６匹のサルの３匹に付いて、昆虫細胞中で発現させた抗原は大腸菌中で発現させた抗原より早く血清変換を検出した。昆虫細胞由来の抗原を使用して、我々は最も高度に希釈した試験（１：８０００）ですべての６匹のサル由来の血清中に抗ＨＥＶ抗体を検出することができた。全ての血清を１：１００希釈で試験したが、大腸菌細胞由来の抗原（ブルマ株）では抗ＨＥＶ力価に付いて何の情報も得られなかった（Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；８９：５５９−５６３；Ｔｓａｒｅｖ，Ｓ．Ａ．ら．（１９９２）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（投稿中））。別の実験で、肝炎ＥウイルスＳＡＲ−５５株を１０倍ずつ一連に希釈し、１０_- ¹ から１０_- ⁵希釈をウイルス力価を調べるために２匹のサイノモルガスザルに接種した。血清ＡＬＴレベルを測定して肝炎を決定し、ＨＥＶに対する血清抗体を本発明のＥＬＩＳＡ方法（図のデータ）またはＧｅｎｅｌａｂのＥＬＩＳＡ（図６ａ−ｇの下に陽性（＋）または陰性（−）試験で示したデータ）によって決定した。全ての試料はコード下で試験した。本発明のＥＬＩＳＡ法は接種した全てのサイノ中の抗ＨＥＶＩｇＧへの血清変換および全ての希釈ウイルスを検出した。反対に、Ｇｅｎｌａｂの結果は以下にまとめたように著しく多様であった。表４ウイルス希釈ＧｅｎｌａｂのＥＬＩＳＡ本発明のＥＬＩＳＡ１０^-1 試験せず陽性１０^-2 限られた期間両動物で陽性陽性１０^-3 両動物で陰性陽性１０^-4 サイノ３８９：ＩｇＭおよび陽性ＩｇＧについて陽性サイノ３８３：陰性陽性１０^-5 サイノ３８６：陰性陽性サイノ３８５：陽性陽性サイノ３８５（１０_- ⁵）はＧｅｎｅｌａｂおよび本発明による両ＥＬＩＳＡ試験において陽性であるので、１０_- ⁴（１０回以上ウイルス接種した）および１０_- ³ （１００回以上ウイルス接種した）もまた陽性であると予想された。サイノ３８３および３９３のＡＬＴレベルは活性型の肝炎であることを示唆したが、１０_- ³ および１０_- ⁴の一つで両方陽性ではないというＧｅｎｌａｂのＥＬＩＳＡとは反対に、本発明はそれらを陽性として数えた。それ故、データはＨＥＶの抗体を検出する先の技術の方法よりも本ＥＬＩＳＡ方法が優ることを支持した。実施例１０ワクチンとしての完全なＯＲＦ−２タンパク質の使用以前に上述したように、組換えＯＲＦ−２タンパク質は免疫反応性がある。さらに、異なるＨＥＶ株で感染させた異なる動物種から得た様々な血清と反応することが示された。これは様々なＨＥＶ株を予防するためのワクチンとしてのこの組換えタンパク質の使用が支持されることを示す。哺乳類は保護抗体の生産を刺激するのに十分な量の精製または部分的に精製した組換えＯＲＦ−２タンパク質で免疫される。ＨＥＶの野生株で免疫性試験した免疫済みの動物は保護される。全ての引用文献、すなわち論文刊行物、特許および類似物の内容は、本明細書中に参照として組み入れてある。本明細書中に記載された実施例および態様は実例を示す目的であり、当該技術分野に従事する人によるこれらの若干の修飾および改変は本出願の思想及び範囲、並びに請求の範囲の範囲内に含むものとする。配列表 (2) 配列情報 SEQ ID NO: 1 (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ： 1693アミノ酸残基 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (xi) 配列：SEQ ID NO: 1: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 2: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：660アミノ酸残基 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (xi) 配列：SEQ ID NO:2: 2) 配列情報 SEQ ID NO: 3: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ： 123アミノ酸残基 (B) 型：アミノ酸 (C) 鎖の数：不明 (D) トポロジー：不明 (xi) 配列：SEQ ID NO:3: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 4: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ： 7168 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:4: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 5: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：25 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:5: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 6: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：26 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:6: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 7: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：26 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:7: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 8: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：25 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:8: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 9: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：22 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:9: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 10: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：22 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:10: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 11: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:11: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 12: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:12: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 13: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：26 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:13: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 14: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:14: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 15: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:15: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 16: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：24 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:16: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 17: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:17: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 18: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：22 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:18: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 19: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：24 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:19: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 20: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:20: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 21: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:21: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 22: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：23 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:22: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 23: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:23: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 24: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:24: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 25: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:25: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 26: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：23 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:26: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 27: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:27: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 28: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:28: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 29: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:29: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 30: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：19 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:30: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 31: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:31: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 32: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:32: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 33: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:33: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 34: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:34: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 35: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:35: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 36: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:36: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 37: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：24 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー：直線状 (xi) 配列：SEQ ID NO:37: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 38: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:38: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 39: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 22 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:39: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 40: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:40: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 41: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:41: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 42: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ：19 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数：一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:42: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 43: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列： SEQ ID NO:43: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 44: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列： SEQ ID NO:44: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 45: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:45: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 46: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 22 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:46: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 47: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 25 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:47: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 48: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:48: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 49: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:49: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 50: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:50: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 51: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 19 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:51: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 52: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:52: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 53: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 18 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:53: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 54: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 33 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:54: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 55: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 18 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:55: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 56: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 20 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:56: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 57: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 19 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:57: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 58: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:58: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 59: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:59: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 60: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 19 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:60: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 61: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 19 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:61: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 62: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 33 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:62: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 63: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トボロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:63: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 64: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:64: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 65: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:65: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 66: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:66: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 67: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:67: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 68: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:68: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 69: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 33 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:69: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 70: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:70: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 71: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:71: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 72: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:72: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 73: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 31 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:73: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 74: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:74: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 75: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:75: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 76: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:76: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 77: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 34 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:77: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 78: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 25 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:78: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 79: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:79: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 80: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 25 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:80: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 81: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:81: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 82: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:82: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 83: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:83: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 84: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 29 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:84: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 85: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:85: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 86: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:86: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 87: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:87: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 88: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 25 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:88: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 89: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:89: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 90: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:90: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 91: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 22 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:91: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 92: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 22 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:92: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 93: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:93: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 94: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 22 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:94: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 95: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 22 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:95: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 96: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:96: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 97: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:97: (2) 配列情報 SEQ ID NO: 98: (i) 配列の特性： (A) 配列の長さ: 24 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:98:

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年９月２３日【補正内容】３４条補正（当初請求の範囲を全て削除し、下記の内容に差し替える）請求の範囲１．Ｅ型肝炎ウイルスの完全なオープンリーディングフレーム２によってコードされる、５０キロダルトンより大きいタンパク質。２．ＳＥＱＩＤＮＯ：４のｃＤＮＡの完全なオープンリーディングフレーム２によってコードされるタンパク質である、請求項１のタンパク質。３．図２Ｂのレーン３に示される５０キロダルトンより大きいバンドの一つから選択されるタンパク質である、請求項２のタンパク質。４．分子量が５５キロダルトンである、請求項３のタンパク質。５．分子量が７４キロダルトンである、請求項３のタンパク質。６．ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項５のタンパク質。７．（a）ＳＡＲ−５５株ＨＥＶのｃＤＮＡ配列をクローニングし；（b）該ｃＤＮＡ配列を発現べクターに挿入し；（c）該発現ベクターを宿主生物に導入し；（d）該べクターが増殖して該タンパク質が発現するのに適する条件下で該宿主生物を培養し；そして（e）該タンパク質を収穫する、ことよりなる、組換えＨＥＶタンパク質の製造方法。８．工程（a）のｃＤＮＡ配列が完全なオープンリーディングフレーム２をコードする、請求項８の方法。９．発現ベクターが真核発現ベクターである、請求項８の方法。１０．発現ベクターがバキュロウイルス（baculovirus）ベクターである、請求項８の方法。１１．宿主生物が真核細胞である、請求項８の方法。１２．真核細胞が昆虫細胞である、請求項８の方法。１３．タンパク質が図２Ｂのレーン３に示される５０キロダルトンより大きいバンドの一つから選択されるタンパク質である、請求項８の方法。１４．タンパク質の分子量が５５キロダルトンである、請求項１３の方法。１５．タンパク質の分子量が７４キロダルトンである、請求項８の方法。１６．タンパク質がＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１５の方法。１７．Ｅ型肝炎ウイルスｃＤＮＡの完全なオープンリーディングフレーム２を含んでなる、組換え発現ベクター。１８．Ｅ型肝炎ウイルスｃＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ：４のｃＤＮＡ配列を有する、請求項１７の組換え発現ベクター。１９．図１に示す成分がベクターに含まれる、請求項１８の組換え発現ベクター。２０．請求項１７、１８または１９の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主生物。２１．（a）Ｅ型肝炎ウイルス抗体を含むと考えられる生物学的サンプルを請求項１のＨＥＶタンパク質と接触させて抗体の免疫複合体を形成させ；そして（b）該免疫複合体の存在を検出する、ことよりなる、生物学的サンプル中のＥ型肝炎ウイルス抗体の検出方法。２２．生物学的サンプルが、全血、血漿、血清、脳脊髄液、組織、尿及び胸水（pleural fluid）である、請求項２１の方法。２３．ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を検出する請求項２１の方法。２４．組換えＨＥＶタンパク質が固体支持体に結合されている請求項２１の方法。２５．免疫複合体が標識抗体を用いて検出される請求項２１の方法。２６．請求項１のタンパク質を含む、請求項２１の方法に用いるキット。２７．標識された二次抗体をさらに含む、請求項２６のキット。２８．請求項１のタンパク質及び適当な助剤、希釈剤または担体を含む薬剤組成物。２９．防御抗体の産生を剌激するために有効な量の請求項２８の薬剤組成物を哺乳類に投与することよりなる、Ｅ型肝炎の予防方法。３０．薬学的に許容される担体中に請求項１のタンパク質を含んでなる、哺乳類をＥ型肝炎感染に対して免疫するためのワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ (72)発明者エマーソン，スザンヌ・ユーアメリカ合衆国メリーランド州20853，ロックヴィル，ウッドクレスト・ドライヴ 14201 (72)発明者パーセル・ロバート・エイチアメリカ合衆国メリーランド州20841，ボイズ，ホワイト・グラウンズ・ロード 17517

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｅ型肝炎ＳＡＲ−５５株からなる単離及び精製されたウイルス。２．ＳＥＱＩＤＮＯ：４のｃＤＮＡ配列を有するＥ型肝炎のｃＤＮＡ。３．ＨＥＶのタンパク質もしくは該タンパク質の変異体に実質的ホモロジーを有するタンパク質の、少なくとも一つの完全なオープンリーディングフレームタンパク質を合成するように宿主生物に指令することができる配列を含む、合成ＤＮＡ配列。４．ｃＤＮＡ配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列からなるタンパク質またはその変異体をコードする、請求項３のｃＤＮＡ。５．請求項２のｃＤＮＡ由来である組換えタンパク質。６．完全なＯＲＦを含むｃＤＮＡ配列によりコードされる、請求項５の組換えタンパク質。７．ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列またはそれと実質的に相同の配列を有するタンパク質。８．(a)ＨＥＶのｃＤＮＡ配列をクローニングし； (b)該ｃＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入し； (c)該発現ベクターを宿主生物に導入し； (d)該ベクターが増殖して該タンパク質が発現するのに適する条件下で該宿主生物を培養し；そして (e)該タンパク質を収穫する、ことよりなる、組換えＨＥＶタンパク質の製造方法。９．発現ベクターが真核発現ベクターである、請求項８の方法。１０．発現ベクターがバキュロウイルス（baculovirus）ベクターである、請求項８の方法。１１．宿主生物が真核細胞である、請求項８の方法。１２．真核細胞が昆虫細胞である、請求項１１の方法。１３．ｃＤＮＡ配列が完全オープンリーディングフレームをコードする、請求項８の方法。１４．ｃＤＮＡ配列が完全オープンリーディングフレーム２をコードする、請求項８の方法。１５．ＨＥＶの完全なオープンリーディングフレームを含んでなる、組換え発現ベクター。１６．ＳＥＱＩＤＮＯ：４のｃＤＮＡ配列を有してなる組換え発現ベクター。１７．ｃＤＮＡ配列が完全なオープンリーディングフレーム２をコードする、請求項１５の組換え発現ベクター。１８．ｐ６３−２である請求項１５の組換え発現ベクター。１９．請求項１５の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主生物。２０．(a)オープンリーディングフレームタンパク質を製造するよう宿主生物に指令することができるＤＮＡ配列を含む形質転換またはトランスフェクトされた宿主生物を、ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列を有するタンパク質に実質的に相同なタンパク質が製造される条件で培養し；そして (b)タンパク質を回収することよりなる、ＨＥＶの少なくとも一つの完全なオープンリーディングフレームタンパク質の組換えＤＮＡ合成方法。２１．(a)Ｅ型肝炎ウイルス抗体を含むと考えられる生物学的サンプルを請求項７の組換えＨＥＶタンパク質と接触させて抗体の免疫複合体を形成させ；そして (b)該免疫複合体の存在を検出する、ことよりなる、生物学的サンプル中のＥ型肝炎ウイルス抗体の検出方法。２２．生物学的サンプルが、全血、血漿、血清、脳脊髄液、組織、尿及び胸水（pleural fluid）からなる群から選択される、請求項２１の方法。２３．ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体を検出する請求項２１の方法。２４．組換えＨＥＶタンパク質が固体支持体に結合されている請求項２１の方法。２５．免疫複合体が標識抗体を用いて検出される請求項２１の方法。２６．ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列またはそれと実質的に相同な配列を有する組換えＨＥＶタンパク質を含んでなる、請求項２１の方法に用いるキット。２７．標識された二次抗体をさらに含む、請求項２６のキット。２８．請求項５または６の組換えタンパク質及び適当な助剤、希釈剤または担体を含む薬剤組成物。２９．防御抗体の産生を刺激するために有効な量の請求項２８の薬剤組成物を哺乳類に投与することよりなる、Ｅ型肝炎の予防方法。３０．薬学的に許容される担体中に請求項６または７の組換えタンパク質を含んでなる、哺乳類をＥ型肝炎感染に対して免疫するためのワクチン。３１．組換えタンパク質が完全なオープンリーディングフレーム２に由来するものである、請求項３０のワクチン。