JPH0829089B2

JPH0829089B2 - フアクタ−▲ｖｉｉｉ▼凝固因子ポリペプチド類

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Publication number: JPH0829089B2
Application number: JP6503884A
Authority: JP
Inventors: セオドア・エス・ズイマ−マン; キヤロル・エイ・フルチヤ−
Original assignee: スクリツプス・クリニツク・アンド・リサ−チ・フアンデ−シヨン
Priority date: 1983-03-31
Filing date: 1984-03-31
Publication date: 1996-03-27
Anticipated expiration: 2011-03-27
Also published as: ZA842418B; DK174984D0; JPS59184130A; DK50497A; EP0561427A1; IE80858B1; FI841281L; ATE135400T1; IE80638B1; DE3486453D1; NO167533B; EP0123945B2; DE3486423D1; AU2627284A; NO167533C; JPH0638790A; EP0561427B1; ATE155490T1; EP0123945B1; SG49675A1

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、新規なファクターVIIIポリペプチド類、
即ち、凝固活性を有するタンパク類に関するものであ
る。さらに詳しくは、本発明は、古典的な血友病の治
療、並びにヒトおよび哺乳類の血液に対して望ましい凝
固挙動を示す様なポリペプチドまたはポリペプチド複合
体のさらに進んだ研究、および確認を行なう上で有用な
ものである。

古くから、血漿フアクターVIIIが血液の凝固に重要な
役割を果していること、並びにトロンビンがこのフアク
ターVIIIの凝固作用を活性化すること、は知られてい
た。最近のフアクターVIII確認作業において、フアクタ
ーVIIIは少なくとも２個のポリペプチド、即ちVIII:Cお
よびVIII:Rと称するもの、の複合体であるとの仮定がな
され、しかもこのVIII:C部分に凝固活性が存在すること
が見出された。フアクターVIII:Cに対するトロンビンの
作用が研究され、トロンビンは、該フアクターを数個の
小ペプチドに分解することにより活性化する、という結
論が導き出された。しかしながら、これまでどの研究に
おいても、ヒトにおけるトロンビン−誘発性フアクター
VIII活性化作用と、ヒトのフアクターVII:Cから形成さ
れた、はつきりと決定されたポリペプチドのいずれかと
を関連づけることはできなかつた。

例えば、HoyerおよびTraboldは、「ヒトのフアクター
VIIIに対するトロンビンの影響」J.Lab.Clin.Med.97:50
−64（1981）、において、ウサギ由来のフアクターVII
I:Rに対する多クローン性抗体を用いた免疫吸着剤クロ
マトグラフイーにより、ヒトのフアクターVIII:Cを精製
することを追求している。次いで、彼らはフアクターVI
II:Cを精製ヒトα−トロンビンと共にインキユベート
し、トロンビンは、少量ではフアクターVIII:Cを活性化
するが、大量の場合には該フアクターを殆んど、または
全く活性化しないと結論している。彼らはまた、トロン
ビンの活性化作用はタンパクサイズの減少による、と結
論づけると共に、活性化されたフアクターVIII:Cの分子
量は約116,000であると提示した。しかし重要なこと
は、彼らはフアクターVIII:C活性を保持している特定の
ポリペプチド類、およびVIII:C抗原決定基を同定するこ
とができなかつた、という点である。

Fulcher,C.A.およびZimmerman,T.S.は、「ヘテロロー
ガスな沈降抗体によるヒトのフアクターVIII凝固促進性
タンパクの確認」Proc.Natl.Acad.of Sci.USA,79:1648
−1652（1982）において、血漿濃縮物をフアクターVII
I:Rに対するモノクローナル抗体を含有するカラムに通
し、吸着されたVIII:C/VIII:R複合体からVIII:Cを溶離
し、次いでフアクターVIII:Cを第２のカラムで濃縮する
ことにより、ヒト血漿濃縮物から精製度の高いヒト、フ
アクターVIII:Cを得た、と述べている。次いで、この純
化フアクターVIII:Cを、これにトロンビンを加える前、
および後に、ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（以下「SDS−PAGE」と呼称）により
分析した。純化フアクターVIII:Cは、トロンビン添加前
には、分子量（M_r）80,000および79,000の位置に比較的
強い二重線（ダブレツト）で示されるもの、並びにこれ
に加えてM_r約92,000の１個をはじめ、少なくとも６個の
より大きいM_rを有し僅かに染色されるポリペプチドなど
を含めて、様々な分子量のポリペプチドに対応する、広
範なバンド配列をSDS−PAGE上に示した。純化フアクタ
ーVIII:Cにトロンビンを加えると、トロンビン添加前に
認められたポリペプチド全てに、その減少または消失が
起きた。

血漿濃縮物の凝固活性はトロンビン添加に伴つて上昇
し、トロンビン添加前の該物質に対し最高３倍に達した
後、減少した。純化フアクターVIII:Cの凝固活性もま
た、活性化前の物質の最高３倍に上昇した。このこと
は、トロンビンがこれらの各場合において、本質的に同
じフアクターVIII:C活性化作用を有することを意味す
る。この様に、純化フアクターVIII:Cは出発物質の約32
80倍の比活性を持つていたと報告されているので、当該
技術分野の人ならば、比活性のこの様な増加は高度に達
成された精製度に起因するものと断定するであろう。こ
の論文には、賦活化された凝固活性をトロンビンによる
活性化前の純化フアクターVIIIについて観察されたバン
ド中の特定の１、または１以上の数のポリペプチドに帰
属する根拠となるものは一切含まれていない。

本発明は、以下の特徴を有する、１または１以上のポ
リペプチドを含有するフアクターVIII:C凝固因子に関す
るものである：（ｉ）１または１以上のポリペプチドは、M_r約92,000に
相当する位置にバンドを示す；あるいはM_r値約92,000、
約80,000、および約79,000に相当する位置；あるいは約
92,000、約72,000および約71,000に相当する位置；ある
いは約92,000、約80,000、約79,000、約72,000および約
71,000に相当する位置にバンドを示す（但し、M_rはドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドケル電機泳動
法で測定したものである）；（ii）該凝固因子は1800単位/mg以上の凝固比活性を示
す；（iii）該凝固因子は少なくとも10分間以上、持続した
期間中、第（ii）ステツプの活性を示す；そして（iv）該凝固因子はヒト、フアクターVIII:C抗体結合能
力を示す。

本発明はまた、該凝固因子を含有する生物学的製剤、
並びに該凝固因子またはその製剤を投与することによ
り、血友病における凝血異常を治療する方法に関するも
のでもある。さらにまた本発明は、ヒトのフアクターVI
II:Cをα−トロンビンで消化し、該消化作用を前述の凝
固因子の存在下に中断し、この凝固因子を回収すること
により凝固因子を調製する、あるいはその濃縮製剤を製
造することに関する。さらに進んで、本発明は、フアク
ターVIII:Cに対するモノクローナル抗体を含有している
免疫吸着剤から、凝固活性を喪失することなくVIII:Cポ
リペプチド類を回収する方法に関するものである。

加うるに、本発明はヒトのフアクターVIII:Cで予め免
疫化したマウスの脾臓細胞とマウスの骨髄腫からの細胞
を融合させることにより得られるハイブリドーマによつ
て調製されたIgGクラスのモノクローナル抗体であつ
て、ヒトのフアクターVIII:Cと反応し、該ヒトのフアク
ターVIII:Cから導かれるポリペプチド類との間で下記の
反応挙動のうちのいずれか１つを示す抗体を提供するも
のである：（Ａ）M_r＝92,000;M_r＝180,000およびそれ以上；並びに
54,000の、その様に導かれたポリペプチドとは反応し、
他方M_r＝44,00;71,000;72,000;79,000;並びに80,000
の、その様に導かれたポリペプチドとは反応しない；（Ｂ）M_r＝92,000;M_r＝108,000およびそれ以上；並びに
44,000の、その様に導かれたポリペプチドとは反応し、
他方M_r＝54,000;71,000;72,000;79,000;並びに80,000
の、その様に導かれたポリペプチドとは反応しない；（Ｃ）M_r＝79,000および80,000;並びにM_r＝108,000およ
びそれ以上の、その様に導かれたポリペプチドとは反応
し、他方M_r＝44,000;54,000;71,000;72,000;並びに92,0
00の、その様に導かれたポリペプチドとは反応しない；（Ｄ）M_r＝108,000およびそれ以上の、その様に導かれ
たポリペプチドとは反応し、他方、M_r108,000以下の、
その様に導かれたポリペプチドとは反応しない（但し、
ここで示したM_r値はポリペプチド類をドデシル硫酸ナト
リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけること
により得られた値である）。

既述した如く、本発明はフアクターVIII:C凝固活性お
よびフアクターVIII:C免疫学的挙動、を示すと共に、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（以下「SDS−PAGE」と呼称）法で分析した際に特徴
的なM_r値を示すポリペプチド凝血因子群を包含するもの
である。本明細書において、以後「ポリペプチド複合
物」という語句は、物理的にはつきりと区別できるポリ
ペプチド類の２またはそれ以上の組合わせからなる凝固
因子を意味するものとする、が、唯一個の識別可能なポ
リペプチド、即ち、M_r＝92,000にバンドを示すポリペプ
チドだけを含有する製剤をも意味するものとする。

また、本明細書において使用している「ファクターVI
II」なる用語は、天然に存在するいわゆる第VIII因子を
意味し、「ファクターVIII:C」および「ファクターVII
I:R」と称するものはこの第VIII因子の構成因子を意味
する。他方、本発明の目的とするポリペプチド類を表す
ためには、「ファクターVIII:C凝固因子」または単に
「凝固因子」なる用語を使用しており、上記天然のファ
クターVIII:Cと明確に区別している。

以下の記述はヒト、フアクターVIII:Cを用いた本発明
の特許請求に係る凝固因子の製造方法を示すものであつ
て、該フアクターVIII:Cは新規な生成物の同定並びに確
認を、余分なポリペプチドの影響を受けることなく、行
なうために高度に精製されている。しかしながら、特に
指示しない限り、本発明そのものは、それ以前に出発物
質がどの様に処理されたか、を問題にしないということ
を強調しておく必要がある。本発明に係る活性なフアク
ターVIII:Cポリペプチド群は、後に非常に詳しく述べる
如く、トロンビンによる消化、あるいは、同様の作用を
有するプロテアーゼ類、例えばファクターX_a、フアクタ
ーIX_a、またはラツセルのマムシ毒−Ｖなどによる消化
によつて製造される、のみならず、DNA組換え技術、即
ち、当該技術分野で通常の知識を有する人々にとつては
自明の方法により、所望のポリペプチドを製造するため
の１または１以上の遺伝子を導入された細菌、酵母また
はその他の細胞によつて所望のポリペプチドを製造する
ことによつても調製することができる。所望の複合物を
得るためのいずれの工程においても、１または１以上の
他のポリペプチド類を含んだ複合物が生成されることが
予測される。

ヒトのフアクターVIII:Cを含有するあらゆる血漿また
血漿濃縮物を利用することができる。新規な凝固因子
は、本明細書中に参考として引用したアメリカ特許第4,
361,509号、1982年11月30日発行、に記載されている方
法に従つて極めて高度に精製されたヒトのフアクターVI
II:Cから調製することができる。この方法においては、
血漿または血漿濃縮物の如きフアクターVIII:C源を、フ
アクターVIII:Rに対するモノクローナル抗体類の結合し
た免疫吸着剤カラムに通している。フアクターVIII:R/V
III:C複合体がカラムに吸着され、次いでフアクターVII
I:Cを溶離し、これをアミノヘキシルアガロースの如き
第２のカラムに通す。第２のカラムもまた、フアクター
VIII:Cに対する抗体を含有する免疫吸着剤であつてもよ
い、ということは注目すべきである。フアクターVIII:C
は、α−トロンビンおよび他のプロテアーゼ類を伴なう
ものであつてはならない。このフアクターVIII:Cは、例
えば0.3M塩化カルシウムを含有するpH約6.8〜約7.4の緩
衝化された食塩中で都合良く保存することができる。

次いで、ヒトのフアクターVIII:Cを、後述するような
ポリペプチド複合体の生成に有効な条件下でα−トロン
ビンにより消化する。純化α−トロンビンは、Fenton,
J.W.II;Fasco,M.J.;Stackrow,A.B.;Aronson,D.L.;Youn
g,A.M.;および Finlayson,J.S.著、「ヒトトロンビン。α−トロンビン
の製造、評価、並びに性質。」J.Biol.Chem.252:3587−
3598（1977）、に記載されている方法によつて得ること
ができる。

α−トロンビンおよびフアクターVIII:Cを水性の系、
好ましくはpH約6.8〜約7.4に緩衝化された系において一
緒にする。トロンビンは、フアクターVIII:Cと反応させ
るに充分な様、フアクターVIII:Cに相当するだけの量で
あつて、しかも所望の活性なポリペプチド複合物を回収
し得るよりも以前に、該フアクターVIII:Cが不活性なポ
リペプチドに分解されてしまう程には多くない量、存在
させる必要がある。例示の如く、1ml中にフアクターVII
I:C200−400単位を含む製剤（0.2mg/ml）は、α−トロ
ンビン約0.1〜約0.5単位/mlにより消化させる必要があ
る。消化は室温で行うことができる；温度が高すぎると
タンパクが変性し、低すぎると消化の進行が抑制され
る。

所望のポリペプチド複合体の生成に充分な長さの時
間、消化させておく。適当な時間は、0.1〜約60分、好
ましくは0.1〜30分である。１〜10分の間の時間が特に
適当であることが見出された。しかしながら、至適時間
は、処理されているフアクターVIII:C出発物質の一部を
用いて行う最小の実験により確認することができる、と
いうことは理解されるであろう。至適時間は、M_r約92,0
00を示すポリペプチドの最大量、およびこれに付随し
て、該M_r92,000ポリペプチドを著しく分解することな
く、約79,000および約80,000のM_rタブレツトを示すタン
パク複合物、の各々を生成する時間である。このM_r79,0
00−80,000ダブレツト複合物は、M_r値71,000−72,000に
ダブレツトを示す複合物に分解された後、作用を現わす
のかもしれない。しかし71,000−72,000ダブレツトは、
単独ではフアクターVIII:C活性を示さない。

次いで、反応混合物に有効量の（Ｐ−アミノフエニ
ル）メタンスルホニルフルオライド（以下「ｐ−APMS
F」と略す）または他のトロンビン阻害剤を加えること
により消化を中断する。ｐ−APMSFはα−トロンビンが
さらにフアクターVIII:Cタンパク類と反応することを阻
止するが、これらのタンパク類を分解するものではな
い。ｐ−APMSF添加量は、反応混合中に当初存在してい
たα−トロン活性１単位につき、約1.5〜約2.5ミリモル
であることが必要である。

ｐ−APMSFはCalifornia Medicinal Chemistry Compan
y,San Francisco,Californiaを通じて入手し得るが、そ
の製造方法は、Laura,R.;Robinson,D.J.;およびBing,D.
H.著「（ｐ−アミノフエニル）メタンスルホニルフルオ
ライド、セリンプロテアーゼの不可逆性阻害剤」 Biochemistry（1980）19,4859−4864,4861頁に記載され
ている。

次にこの反応混合物を、本発明に係るポリペプチド複
合物を濃縮するための処理に付すことができる。ポリペ
プチド複合物は、純化型複合体の有する非常に高い活性
を与える形で複合体を得るために、他のフアクターVIII
およびフアクターVIII以外のタンパク様物質に関して濃
縮することが好ましい。精製法としては、例えば限界
過法、超遠心分離法、イオン交換法、ゲル透過クロマト
グラフイー法、プレパラテイブ電気泳動法、等電点分画
電気泳動法、並びにゲルおよびアフイニテイクロマトグ
ラフイー法などを挙げることができる。

所望の複合物はまた、反応混合物（これは他の方法で
予め濃縮されていてもよい）を複合物のポリペプチド
（類）と反応しうる抗−ヒトVIII:C抗体あるいはヒト以
外のVIII:Cに対する同等の抗体を含有する免疫吸着剤カ
ラムに通すことにより、濃縮および／または回収するこ
とができる。抗体類はアガロースに結合している（実施
例１の下欄参照）。複合物の濃縮および／またはその中
のあるポリペプチドの分離に用いることのできる抗体類
については後述する。活性VIII:C複合物は優先的にカラ
ムに吸着し、次にカルシウムイオンを含む溶液（例、Ca
Cl₂）（所望により非イオン性界面活性剤をも含有して
よい）によつて溶離される。適当な界面活性剤には、ア
ルキルフエニルポリオキシエチレン類、例えばTriton−
Ｘ−100、−Ｎ−101、または−Ｘ−405（Eastman Chemi
cal Co.）;Tween−20、−60または−80（Sigma Chemica
l Co.）；およびNonidet P−40（Sigma Chemical Co.）
などが含まれるが、これらは全て化学式のわかつた周知
の商品である。

用いられるカルシウムイオンおよび界面活性剤の濃度
はポリペプチド複合物を脱着するに充分な濃度であるべ
きだが、溶離剤がポリペプチドを不活性化してしまう
程、高くないことを要する。カルシウムイオンの濃度は
約0.5Mまたは約1.0Mまで高めることができるが、0.25M
が好ましい。界面活性剤濃度は、約１重量％まで高める
ことができるが0.1重量％が好ましい。溶離剤を免疫吸
着剤カラムに約１〜約８床容量／時、好ましくは約３〜
約４床容量／時の速度で適用する。流速が高すぎるとカ
ラムが破壊され、ポリペプチド複合物の吸着が起こらな
い危険性がある。熟練した実施者ならば、これらの指示
を固定床カラム以外の免疫吸着工程に容易に適応させる
ことができるであろう。

VIII:Cポリペプチド複合物は、pH約6.8〜7.4において
適当な緩衝液中に回収され、この中には溶離溶液からの
カルシウムイオン並びに界面活性剤も含まれている。実
施例１において用いる様に、より低濃度のカルシウムイ
オンを含有するVIII:C緩衝液、等の緩衝液に対して上記
の溶液を透析することにより、カルシウム並びに界面活
性剤の濃度を下げ、好ましくは界面活性剤を除去するこ
とができる。本発明の複合物はこの溶液中に、あるいは
凍結乾燥して保持することができる。この複合物は血友
病性凝血異常の患者に対し、カルシウム濃度を生理学的
に許容し得る様に調節して投与することができ、その滅
菌食塩水溶液を注射投与することができる。

次に示す如くSDS−SPGEで分析すると、本発明の凝固
因子は、M_r約92,000を示し、正常な状態で約79,000およ
び約80,000のM_rダブレツトを示す物質（その内の幾分か
は分解して約71,000および約72,000のM_rダブレツトを示
す）を含むこともある。その純化型においては、このバ
ンドあるいはこれら一群のバンドが、本来、現われる唯
一のバンドである。しかしながら、本発明はまた、本発
明に係る凝固因子を含有することを示すタンパク性物質
を100％以下、即ち、95％、90％、または80％、70％、6
0％、さらに少量の30％、20％、10％、あるいは１％、
含有する生物学的製剤をも包含するものであることを認
識しておくことが必要である。本発明は従つて、そのフ
アクターVIII:C活性が本発明の凝固因子の存在に起因し
ている様な製剤をも包含するものである。

本発明に係るタンパク複合物は、精製したヒトのフア
クターVIII:C、前述のアメリカ特許第4,361,509号で開
示され請求されている方法で精製されたヒトのフアクタ
ーVIII:Cなど、よりも高いVIII:C凝固比活性（活性／総
タンパク量、mg）を有する。実際、純化複合物の活性は
数倍であり、例えば、精製したヒトのフアクターVIII:C
の３〜５倍、さらに好都合には少なくとも10倍、あるい
は50倍もの活性を示す。同様に、本発明の複合物を、１
または１以上の他のタンパク類と一緒に含有した、従来
知られている凝血剤製剤が与えるより高い比活性を有す
る生物学的製剤を得ることができる。複合物、並びにそ
れを含有する生物学的製剤の比活性は、1800単位/mg以
上、好都合には5,400単位/mg、より好都合な態様では7,
500、さらには10,000単位/mg以上にも達する。好ましい
のは、本発明製剤の比活性が本発明で用いた精製したヒ
トのフアクターVIII:Cの３〜５倍、好都合には少なくと
も10倍、50倍、あるいは100倍にも達することである。

本発明に係るタンパク複合物、およびその生物学的製
剤は、上記の優れた活性が少なくとも約10分間、好まし
くは少なくとも約30分間、持続的に存在することを特徴
とする。勿論、活性は一般にもつと長時間安定である。
複合物はまた、フアクターVIII:Cタンパクの免疫学的特
性、即ち、ヒトのフアクターVIII:Cに対する抗体と結合
する性質、を有している。このことは、例えば、以下に
述べる様にフアクターVIII:Cに対するモノクローナル抗
体を増大させ、この抗体をアガロースカラムに結合さ
せ、このカラムに複合物の水溶液を通し、得られた溶液
のフアクターVIII:C活性を分析することにより確認する
ことができる。

本発明は、M_r＝92,000およびM_r＝79,000−80,000のポ
リペプチドは、タンパク分解および破壊され易く、結果
的に凝血剤活性を喪失し易いことで有名な、天然のヒト
のフアクターVIII:Cに比べて安定である、という点にお
いても望ましい寄与を果すものである。この安定性はこ
の明細書で述べる処理段階を経てもポリペプチドの活性
が残存している、ということで証明される。

実施例１この実施例は、フアクターVIII:Cの市販濃縮物からの
精製並びに精製α−トロンビンによる消化の方法に関す
るものである。フアクターVIII:Cに対するモノクローナ
ル抗体を製造し、VIII:Cポリペプチドの同定に用いた。
消化過程において数回、消化混合物の一部分に関してVI
II:C（凝血）活性、並びにSDS−PAGEに基くタンパクの
バンドを分析した。

VIII:Cの精製全工程は室温で行なつた。化学薬品は全て試薬用であ
つた。市販のフアクターVIII濃縮物（Armour Pharmaceu
tical提供）をVIII:C緩衝液（0.02Mイミダゾール/0.15M
塩化ナトリウム/0.1ML−リジンHCl/0.02％ナトリウムア
ジド、pH6.8）中に入れて復元した。合計17,000単位のV
III:C活性を有するこの試料を床容量2.5−3.0lの免疫吸
着剤カラムに入れた。カラムは臭化シアン−活性化アガ
ロース（セフアロース4B、Pharmacia、Piscataway、New
Jersey）であり、これにVIII:Rに対するモノクローナ
ル抗体が共有結合で結合している。前述のアメリカ特許
第4,361,509号に記載されている方法に従つて抗体を調
製し、カラムに吸着させた。抗体は、50％硫酸アンモニ
ウムで腹水から沈殿させ、さらに２回再沈殿させた後、
セフアロースに対して密度２〜4mg/mlでカラムに吸着さ
せた。免疫吸着剤を、3Mチオシアン酸ナトリウムによつ
て予め溶離処理し、VIII:C緩衝液（0.02MインダゾールH
Cl pH7.0、0.15M NaCl、0.1ML−リジン−HCl、0.02％ナ
トリウムアジド）で洗浄し、2mMジ−イソプロピルフル
オロホスフエートで２回処理した後、濃縮物を加えた。

カラムを0.15M塩化ナトリウム含有VIII:C緩衝液20lで
洗浄し、0.35M塩化カルシウムを含有するVIII:C緩衝液
でVIII:RからVIII:Cを溶離した。活性な画分を集め、YM
−10膜を備えたAmicon攪拌室内で、窒素圧下100倍に濃
縮した。次いで、この濃縮物をVIII:C緩衝液で1:10に希
釈し、0.025M塩化カルシウム含有VIII:C緩衝液で平衡さ
せたアミノヘキシル−セフアロースの4mlカラムに適用
し、0.3M塩化カルシウム含有VIII:C緩衝液で流速10ml/
時で溶離すると、VIII:Cが高濃度で得られる。濃縮され
た免疫吸着剤プールを0.25M塩化カルシウムに調節し、
モノクローナル抗−フイブリノーゲン、抗−フイブロネ
クチンおよび抗−VWF抗体（これらは臭化シアン活性化
セフアアースに結合されている）の混合物に対し1/10
（V/V）の割合で、１時間づつ、２回吸着させた。

VIII:Cに対するモノクローナル抗体の製造モノクローナル抗体類は、アメリカ特許第4,361,509
号に記載されている如くにして、精製VIII:Cを抗原とし
て製造した。抗体類をLinbro−Titertek（Flow Laborat
ories、Inglewood、CA）プレート類、および、Engvall,
E.およびPerlmann,P.著「酵素結合免疫吸着剤分析（ELI
SA）、免疫グロブリンＧの定量分析」 Immunochemistry8:871−874（1971）に、記載の検出系
内において、共役ペルオキシダーゼ抗体（Zymed Labora
tories,Burlingame,CA）を使用し、固相分析法によつて
選別した。プレート類を、くぼみごとに精製VIII:C100n
gで被覆した。この研究に用いるために選別したクロー
ンのELISA−陽性培養上澄み液もまた血漿VIII:C活性を
阻害した。

精製VIII:Cのトロンビン活性化経時分析精製ヒトα−トロンビン（比活性2534U/mg、最終濃度0.
5U/ml）を、０、04MCaCl₂含有イミダゾール生理食塩水
緩衝液中に入れた精製VIII:C（最終濃度167μg/ml）に
加えた。対照部分には緩衝液のみを加えた。溶液を室温
でインキユベートし、種々の時間間隔をあけて,VIII:C
−トロンビン混合物試料を、トロンビンを迅速かつ非可
逆的に不活性化するためにｐ−APMSE（California Medi
cal Chemistry Co.）の入つた試験管に採取した。ｐ−A
PMSFに加水分解を最少限度に止めるため、ストツク溶液
（100mM/メタノール溶液）を、イミダゾール生理食塩水
緩衝液によりVIII:C−トロンビン試料との反応の60秒前
に、1/10の比率で希釈した。最終的なｐ−APMSF濃度は1
mMであつた。対照部分も、実験の初めにｐ−APMSFで同
様に処理した。60分間の時間的経過を終えた時点で全て
のVIII:C試料を文献記載の如く、活性化部分的トロンボ
プラスチン時間分析方法でVIII:C活性に関して分析し、
その後SDS−PAGEの調製に備えた。

SDS−PAGA「方法Ａ」不連続なSDSポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動
法は、Laemmli,U.K.,Nature227,680−685,1970の方法に
基いて行なつた。「方法Ａ」を次に示す： I.試料の調製（１）タンパク試料（理想的にはタンパク５−60μｇを
含有するもの50−100μｌ）を試料緩衝液に対して一
夜、室温で透析する。試料がカルシウムイオンを含有す
る場合には、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）10mMを試
料緩衝液中に含有させる。

（２）透析した試料を試験管に入れ、1/10容量の10％SD
Sを加える。試験管をアルミニウム箔で被う。試料を沸
騰中の水浴中で10分間加熱する。

（３）試料を水浴から出し、500mMジチオトレイツトを1
/10容量、加える。これを56℃で４時間、インキユベー
トする。

（４）試料を室温まで放冷し、グリセリンストツク溶液
およびブロムフエノールブルーストツク染料溶液を最終
濃度がそれぞれ10％および0.05％になる様に加え、ゲル
上に重層するため調製する。

II.ゲル溶液の調製（脱イオン化した蒸留水使用）（１）グリセリンストツク溶液： 50％グリセリン（２）ブロムフエノールブルーストツク染料溶液： 0.
5％ブロムフエノールブルー（３）下層ゲルストツク溶液：トリス塩基18.2g、10
％SDS4ml、最終容量を100mlにする。濃塩酸でpH8.8に調
節し、過する。

（４）上層ゲルストツク溶液：トリス塩基6.1g、10％
SDS4ml、最終容量を100mlにする。濃塩酸でpHを6.8に調
節し、過する。

（５）試料緩衝液： 0.01Mりん酸ナトリウム、1.0％SD
S、10mM二ナトリウムEDTA、最終容量を１にする。水
酸化ナトリウムまたはりん酸を加えてpHを7.0に調節す
る。

（６）アクリルアミドストツク溶液：アクリルアミド
30gを水50mlに溶かし、ビスアクリルアミド0.8mgを加え
て溶解させる。最終容量を100mlに調製する。この溶液
を過し、４℃で暗所に貯蔵する。

（７）ストツク用電極緩衝液：トリス塩基30.3g、グ
リシン144.1g、最終容量を１にする。

（８）電極緩衝液：ストツク用電極緩衝液100ml、水8
90ml、10％SDS10ml。

（９）ストツク用クマシーブルー染料溶液：１％クマ
シーブルーR250を水中に入れたものを少なくとも約30分
間室温で攪拌して溶解させ、過する。

（10）アンモニウムパーサルフエート溶液： 10％アン
モニウムパーサルフエート、暗所に保管する。毎週新ら
たに調製する。

III.ゲルの調製並びに操作：アクリルアミドの最濃縮度
＝7.5％（１）下層ゲル溶液下層ゲル、20ml 下層ゲルストツク溶液 5.0ml アクリルアミドストツク溶液 5.0ml 水 10.0ml N,N,N′,N′−テトラメチレンジアミン（TEMED）0.005m
l 10％アンモニウムパーサルフエート 0.1ml 上層ゲル溶液上層ゲル10ml 上層ゲルストツク溶液 2.5ml アクリルアミドストツク溶液 1.0ml 水 6.5ml N,N,N′,N′−テトラメチレンジアミン（TEMED）0.01ml
10％アンモニウムパーサルフエート 0.03ml （３）方法：ａ）14.5cm×9.0cm×0.8mmスラブゲルのためのスラブゲ
ル装置を調製する。この装置は標準的な電気泳動装置で
あつて、例えば、Hoeffer Scientific Instruments,San
Francisco、Californiaから入手可能である。

ｂ）TEMEDおよびアンモニウムパーサルフエート以外の
下層ゲル成分を50mlの耐圧フラスコに入れ、脱気する。
次いでTEMEDおよびアンモニウムパーサルフエートを加
えて静かに混合し、即座に下層ゲルを加える。下層ゲル
に水−飽和ブタノールを重層し少なくとも１時間、好ま
しくは２〜６時間、そのままにして重合させる。ｃ）ブ
タノール層を流し去り、下層ゲルの上面を完全な上層ゲ
ル混合物で洗浄する。（上層ゲル混合物は、上記の下層
ゲルと同様に、脱気し、TEMEDおよびアンモニウムパー
サルフエートを加えて調製する。）ｄ）上層ゲルを注ぎ入れ、くしを上層ゲル内に、そのく
しの歯の底部と上層ゲル−下層ゲル界面との間隔が少く
とも1.0cmとなる深さまで入れる。上層ゲル溶液で可能
な限り一杯に満す。このゲルに通す前、少なくとも１時
間上層ゲルを重合させる。

ｅ）くしを取除くには、電極緩衝液を上層ゲルの上面に
ピペット注入した後、しくを静かに取去る。上層ゲル上
面のくぼみを電極緩衝液を用いて数回洗浄する。

ｆ）作業のために装置を組立て、電極緩衝液を加える。
試料（類）を緩衝液層の下方の上層ゲルのくぼみに重層
して適用する。

ｇ）このゲルを定電流で作動させる：試料が上層ゲルにある間は８ミリアンペア、試料が下
層ゲルにある間は15ミリアンペアである。ブロムフエノ
ールブルー染料の先端が下層ゲルの底面から1.0cmにな
つた時点で電気泳動を止める。

IV.ゲルの固定および染色参考文献:Fairbanks,G.,Steck,T.L.,およびWallach,
D.F.N.,Biochemistry10,2606〜2617,1971。

（１）ゲルを少なくとも１夜、密閉容器内で、25％イソ
プロパノール、10％酢酸、１％クームシーブルーストツ
ク溶液10mlを含有する最終容量を400mlに調節した溶液
中で固定化する。

（２）次いで、ゲルを少なくとも１時間、10％イソプロ
パノール、10％酢酸および１％クームシーブルーストツ
ク溶液1.0mlを含有する最終容量を400mlに調節した液中
に浸す。

（３）このゲルを変化が現われるか、あるいは完全に脱
染色されるまで約４時間、10％酢酸中に浸漬する。

（４）この脱染色ゲルを、対照を明確にするためにゲル
乾燥機を用いて紙上で乾燥させることができる。

このゲルに５−20gのタンパクを適用した。VIII:CのM
_r値は還元フイブリノーゲン（M_r200,000）、ホスホリラ
ーゼｂ（M_r95,000）、ウシ血清アルブミニン（M_r68,00
0）、IgGのＨ鎖（M_r50,000）およびオバルミン（M_r43,0
00）を標準とし、移動距離に対してM_r値を片対数表にプ
ロツトすることにより、還元試料に関して算出した。

最終的なゲルの写真プリントによる走査並びに積分
は、Zeineh軟レーザースキヤニング濃度計を用いて行な
つた。

結果純化フアクターVIII:Cの比活性は2000単位/mg
であつた。トロンビンによる純化VIII:C活性に対する賦
活作用を60分間のタイム・コースで分析した。トロンビ
ンを作用させる前の非処理VIII:C試料は、M_r＝79,000−
80,000におけるダブレツト、ないしM_r＝188,000におけ
るバンドに至る特徴的なVIII:C型配列を示していた。M_r
＝188,000以上の１個のバンド、並びにM_r＝79,000以下
の２個のバンドはモノクローナル抗−VIII:C抗体免疫吸
着剤と結合しなかつた。また、M_r＝79,000およびM_r＝18
8,000の間のバンドは抗−VIII:C抗体と結合しなかつ
た。

トロンビンによる賦活化タイム・コースの最初の５分
間で、M_rが92,000以上であるモノクローナル抗−VIII:C
抗体反応性バンドは、１個を除き全てが徐々に消失し、
５分後にVIII:C活性が最高に達した時点で検出されなく
なつた。

M_r＝122,000におけるバンドはいくつかの実験におい
てのみトロンビン抵抗性を示したが、過剰なトロンビン
処理の後には、このバンドも、他のいかなるバンドも固
定化モノクローナル抗−VIII:C抗体とは反応しなかつ
た。

M_r＝92,000におけるバンドは、VIII:C活性が増すにつ
れて強くなつた。M_r＝79,000および80,000におけるダブ
レツトは、M_r＝71,000−72,000ダブレツトに変換される
と思われ、VIII:C活性の減少する５〜60分の間では、後
者の形態が優勢であつた。M_r＝54,000およびM_r＝44,000
の２個のバンドは５〜60分の間に明確に認め得る様にな
つた。いくつかの実験では、M_r＝44,000バンドもまたダ
ブレツトのように見えた。M_r＝71,000−72,000ダブレツ
ト、M_r＝54,000バンド並びにM_r＝44,000バンドは固定化
モノクローナル抗−VIII:C抗体によつては有意な程度に
除去されなかつた。

上で議論したゲルの走査および積分の結果から、ポリ
ペプチド濃度とVIII:C活性における変化との関連性が考
慮される。結果は表に示されている。表からわかる様
に、M_r＝92,000バンドはその濃度が増加した後、VIII:C
活性と並行して減少した。このことは、M_r＝92,000バン
ドが、トロンビンの賦活化作用でその濃度が増大された
活性型VIII:Cに相当することを示唆している。M_r＝54,0
00およびM_r＝44,000バンドの濃度は、いずれも、１〜40
分の間、混合物の活性が減少した後でさえも定常的に増
加した。

M_r＝79,000−80,000ダブレツトの大部分は、VIII:C活
性がピークに達する最初の0.1〜10分間の間に失なわ
れ、他方、M_r＝71,000−72,000ダブレツトの大部分はこ
の期間に現われ、VIII:C活性が減少した際にも優勢であ
つた。これらのデーターは、M_r＝71,000−72,000ダブレ
ツトがM_r＝79,000−80,000ダブレツトから導かれたもの
であること、並びにM_r＝71,000−72,000ダブルレツト自
身は不活性であることを示唆するものである。また、こ
の様なデーターは、M_r＝71,000−72,000ダブレツトのM_r
＝92,000ポリペプチドと複合体を形成する能力が保持さ
れている、ということと矛盾しないものである：この複
合体もまた活性を有するであろう。

M_r＝92,000ポリペプチドがM_r＝79,000−80,000ダブレ
ツト複合体を形成していることの直接的な証拠は、抗−
VIII:Cモノクローナル免疫吸着剤を用いた実験から導か
れる。モノクローナル抗体はM_r＝92,000ポリペプチドで
なく、M_r＝79,000−80,000ダブレツトと優先的に反応す
るということが初めて示された。即ち、このことは電気
泳動転移実験において明らかにされた。次いで、モノク
ローナル抗−免疫吸着剤は、M_r＝79,000−80,000ダブレ
ツトおよびM_r＝92,000ポリペプチドを共に溶液中から除
去するとが示された。M_r＝92,000ポリペプチドは、M_r7
9,000−80,000ダブレツトを結合させたままで、10mM ED
TAにより抗−VIII:C免疫吸着剤カラムから溶離すること
ができた。このダブレツトは、続いて3Mチオシアン酸ナ
トリウムにより溶離された。以上の実験の結果は、M_r＝
92,000ポリペプチドはM_r＝79,000−80,000ダブレツトと
複合体を形成していたために免疫吸着剤と結合したので
あり、免疫吸着剤と直接に結合していたのは、該ダブレ
ツトであつた、ということを証明している。

実施例II この実施例では、純化したヒトのフアクターVIII:C
を、既知の抗凝固酵素である純化したヒトの活性化蛋白
質Ｃ（以下、「APC」という）で処理した結果について
記述する。ヒトのフアクターVIII:Cを既述した様にして
純化した。APCは、トロンビンからAPCを分離するのにフ
アルマシア（Pharmacia）のFPLC系のモノＳカラムを使
用した以外はMarlar,R.A.らの方法（Blood、59巻、1067
（1982）、「トロンビン依存性抗凝固酵素、ヒトの活性
化蛋白質Ｃの作用機構」）に従つて純化した。

アツセイ血友病Ａ血漿基質を用いた活性化部分的トロンボプラ
スチン・タイムアツセイを使用して、前記の方法で試料
のVIII:C活性を分析した。

電気泳動のための試料の調製 APC活性にはカルシウムイオンが必要であるので、10
μＭのDAPAを含有している100mMEDTAの1/10容量を、VII
I:C＋APC部分、対照VIII:CおよびAPC部分に加えること
により、種々の時間にAPCを停止させた。これらの部分
標本に1/10容量の10％ドデシル硫酸ナトリウムを添加し
た。次いで沸騰水浴中でそれらを５分間加熱し、次いで
前記した様にSDS−PAGEで透析した。

還元したVIII:Cの非連続ドデシル硫酸ナトリウム7.5
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、Coomassi
eブルーR250による染色、ゲルの走査および積分は既述
した様に行なつた。

試料調製 0.3M塩化カルシウムを含有しているVIII:C緩衝液0.3m
l中のVIII:Cの試料339μｇを緩衝液（50mMトリス−クロ
リド、0.15M塩化ナトリウム、5mM塩化カルシウム、0.02
％ナトリウムアジド、pH7.4）に対して一夜透析した。
この透析したVIII:C試料に、緩衝液1.095ml、ウサギ脳
ケフアリン90μｌ（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MD,
製造業者の指示通り復元し、貯蔵し、融解した）、およ
び1mMダンシルアルギニンＮ−（３−エチル−1,5−ペン
タンジイル）アミド（DAPA）15μｌを加え、最終DAPA濃
度を10μＭとした。10μＭのDAPAはAPCを有意に阻害し
ないので、このDAPAはAPCに存在する痕跡量のトロンビ
ンを阻害するために含ませた。試料の最終容量は1.5m
l、最終VIII:C濃度は226μg/mlであつた。この1.5mlのV
III:C試料から400μｌを取り、対照とした（VIII:Cと呼
ぶ）。残りの1.1mlにAPC20μｌ（10μｇ）を加え、最終
APC濃度を９μg/mlとした（VIII:C＋APCと呼ぶ）。VII
I:Cを除いて全ての成分を同じ濃度で含有している第２
図の対照試料を調製した（APCと呼ぶ）。

タイム・ポイント VIII:C単独、VIII:CおよびAPCの混合物、APC単独を37
℃の水浴に入れ、一定のタイム・ポイントで試料の一部
を取り、SDS−PAGEおよび／またはVIII:C活性を分析し
た。また、長時間37℃でインキユベートした後、合成基
質Ｓ−2238の加水分解で活性を保持したAPCを、対照に
おいて測定した。

結果純化VIII:CをAPCを消化すると、対照のVIII:C活性の
ほぼ85％が失なわれた。VIII:C活性のAPC非活性化によ
り、M_rが92,000〜188,000の全てのVIII:Cポリペプチド
が減退し、M_r＝45,000のポリペプチドが生成し、一方M_r
＝79−80,000のダブレツトはそのまま残つた。

APCによる、純化VIII:Cの一定時間経過の非活性化に
より、360分間に渡つてVIII:C活性が減少するに従つ
て、特異なVIII:Cポリペプチドが次第に減少することが
わかつた。ゲルを走査および積分することにより、M_r＝
188,000のポリペプチドおよびM_r＝92,000のポリペプチ
ドがVIII:C活性と平行して減少していくことがわかつ
た。

中間的なM_rのもう１つのポリペプチドはAPCにより開
裂されたが、ゲル走査により容易に定量されなかつた。
この実験では、APCによる消化らしくなく、M_r＝92,000
〜188,000のある種のVIII:CポリペプチドはAPC消化に抵
抗した。しかし、M_r＝79−80,000のダブレツトポリペプ
チドは、APCよる消化の場合の様に、APCにより蛋白質分
解を受けなかつた。

M_r＝45,000ポリペプチドは、M_r＝188,000および92,00
0のポリペプチドの減少につれてその濃度が増加する様
であり、これは前者のポリペプチドが後者のポリペプチ
ドの分解フラグメントであることを暗示している。Coom
assieブルーの染色では、その他の消化生成物は観察さ
れなかつた。

実施例Ｉに示した様に、VIII:Cのトロンビン活性化の
間、M_r＝92,000のポリペプチドは、VIII:C活性と平行し
て増減した。M_r＝92,000のポリペプチドの蛋白分解とVI
II:C活性の消失との間に直線関係が存在するかどうかを
調べるために、この時間経過による非活性化実験のデー
タを再プロツトし、VIII:C活性％対M_r＝92,000のポリペ
プチド％を調べた。VIII:C活性の量は、M_r＝92,000のポ
リペプチドの量に比例している様であつた。

本発明のもう１つの目的は、フアクターVIII:Cと、α
トロンビンの様なプロテアーゼとの反応によつて形成さ
れる各種のポリペプチドに対して、予想し得ないことで
あるが、特異なモノクローナル抗体を提供することにあ
る。それぞれの抗体は、トロンビンまたは等価なプロテ
アーゼで活性化も消化もされていないヒトのフアクター
VIII:Cと反応する。これらの抗体は、以下に述べる様な
個々の性質によつて特徴づけられる。

（Ａ）１つは、ここに記載したM_r＝92,000のポリペプチ
ド、M_r＝108,000およびそれ以上のポリペプチド、およ
び終末−トロンビン消化物中に存在するM_r＝44,000のポ
リペプチドと反応する。それは、ここに記載したM_r＝7
9,000−80,000のダブレツトを示すポリペプチドとも、
ここに記載したM_r＝71,000−72,000のダブレツトを示す
ポリペプチドとも反応しない。

（Ｂ）１つは、ここに記載したM_r＝92,00のポリペプチ
ド、M_r＝108,000およびそれ以上のポリペプチド、およ
び終末トロンビン消化物中に存在するM_r＝54,000のポリ
ペプチドと反応する。それは、ここに記載したM_r＝79,0
00−80,000のダブレツトを示すポリペプチドとも、ここ
に記載したM_r＝71,000〜72,000のダブレツトを示すポリ
ペプチドとも反応しない。

（Ｃ）１つは、M_r＝79,000−80,000のダブレツトおよび
M_r＝108,000およびそれ以上のポリペプチドと反応する
が、M_r＝92,000のポリペプチド、M_r＝71,000−72,000、
M_r＝54,000、M_r＝44,000のポリペプチドとは反応しな
い。

（Ｄ）１つは、M_r＝108,000およびそれ以上のポリペプ
チドとのみ反応する。

これらの抗体はそれぞれ、他のポリペプチドをも含ん
でいる混合物から、前記の複合体を濃縮するために使用
することができる。この様な混合物の１つは、ヒトのフ
アクターVIII:Cをα−トロンビンまたは等価なプロテア
ーゼで部分的に消化することにより製造される。もう１
つのこの様な混合物は、組み換えDNA技術によつて製造
されるものであり、この場合、所望のポリペプチドまた
は複合体は微生物によつて発現され、混合物から他の蛋
白質様化合物で回収されなければならない。抗体
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）、あるいはこれら
の２つ、３つまたは全てを組み合せたものを実施例１に
記載した様にして免疫吸着剤に付着させることができ、
複合物を含んでいるポリペプチド含有している混合物の
充填液をカラムに通す。充填溶液中に存在するM_rが92,0
00、79,000,〜80,000および71,000−72,000であるポリ
ペプチドがカラムに吸着され、このカラムから、もとの
溶液をカラムから洗い流した後、前記した様にしてこれ
らのポリペプチドを溶出させることができる。得られた
溶出液は、所望の活性化VIII:C複合物について、充填液
とくらべて濃縮されている。

この新規な抗体は、ヒトのVIII:Cとトロンビンまたは
他のプロテアーゼとの反応があつたかどうかを検出する
ための、分析の目的にも有用である。というのは、これ
らの抗体は、その反応の生成物と反応する能力はあるか
らである。挙動（Ｂ）を持つた抗体および挙動（Ｃ）を
持つた抗体は、いづれかがフアクターVIII:Cと結合する
と、VIII:C凝固活性化を中和することがわかつた。この
性質は、血友病関連障害の診断に有用である。

これらの抗体の発見により、ここに記載したポリペプ
チド複合物の成分を更に特性化することができる。即
ち、M_r＝92,000のバンドを示すポリペプチドは、トロン
ビン消化によつて破壊されず、M_r＝79,000−80,000のダ
ブレツトを示すあるいはM_r＝71,000−72,000のダブレツ
トを示すポリペプチドには存在しない（少なくとも）２
つのエピトープ（即ち抗体結合部位）を含んでいる。こ
れらのエピトープの内の１つはM_r＝44,000のポリペプチ
ドの上にも存在し、他方はM_r＝54,000のポリペプチドに
存在する。即ち、M_r＝54,000およびM_r＝44,000のポリペ
プチドはM_r＝92,000のポリペプチドから誘導される。ま
た、M_r＝92,000およびM_r＝79,000−80,000のポリペプチ
ドは、共通の前駆体（群）から誘導される。フアクター
VIII:C凝固活性を中和する挙動（Ｂ）および（Ｃ）を示
す抗体の発見は、M_r＝92,000およびM_r＝79,000−80,000
のポリペプチドが凝固機能に重要であることを支持して
いる。M_r＝79,000−80,000のダブレツトを示すポリペプ
チドは、トロンビン消化によつて破壊される。そしてM_r
＝92,000のポリペプチドには存在しないエピトープを含
んでいる。

これらのモノクローナル抗体は、ヒトのフアクターVI
II:Cの一般的な精製工程によつて製造することができ
る：即ち、純化VIII:Cに対するモノクローナル抗体を生
成させ、純化VIII:Cを部分的に消化、活性化して前記の
ポリペプチド複合物を生成せしめ、特異なポリペプチド
を同定し、抗−VIII:C抗体を活性化生成物と反応させ、
それが反応したポリペプチド（群）を同定することによ
りその抗体を特性化する。この一連の操作は実施例III
で詳細に述べる。あるいはまた、部分的トロンビン消化
生成物から、所望の特定のポリペプチドを分離すること
により抗体を製造することもできる。例えば、所望のポ
リペプチドと反応することが知られているモノクローナ
ル抗体をカツプリングさせたアガロースを入れたカラム
に免疫吸着させ、次いで溶出し、実施例IIIに記載の方
法でそのペプチドに対するモノクローナル抗体を高め
る。

実施例III ヒトのフアクターVIII:Cに対するモノクローナル抗体
は、米国特許第4,361,509号に記載の方法によつて製造
された高純化VIII:Cを用いて、以下の手法によつて生成
させた。

以下の方法に従つて、高純化フアクターVIII:Cをマウ
スに注射した。初日に、0.05Mトリス、0.15M塩化ナトリ
ウム、0.02％アジ化ナトリウム、1mMフエニルメチルス
ルホニルフルオライド、トラシロール10単位/mlを含ん
でいるpH7.3の緩衝液0.1mlにこの蛋白質10μｇを溶解
（または懸濁）し、同容量のフロインドの完全アジユバ
ンドを加えて振盪することにより調製した組成物をマウ
スに腹腔内注射した。14日目に、フロインドの完全アジ
ユバンドに代りにフロインドの不完全アジユバントを用
いるほかは上に記載したものと同じものを再びマウスに
注射した。21日目には、14日目の注射をもう１度行なつ
た。38日目に、純化VIII:Cだけを注射した。42日目に、
マウスの脾臓を摘出し、J.P.Brownらの標準的手法（Jou
rnal of Biological Chemistry、225巻、pp4980−4983
（1980）、「モノクローナル抗体による免疫沈殿によつ
て同定される正常および悪性のヒト細胞の蛋白質抗
原」）に従つて融合した。この標準的手法に於いて、50
％ポリエチレングリコールの代りに35％ポリエチレング
リコール1000を用いたことが唯一の変更点であった。

実施例Ｉの「VIII:Cに対するモノクローナル抗体の製
造」の項に記載した分析法を使つて抗体を選択した。た
だし、VIII:C活性を中和しなかつた抗体もサブクローン
し、以下の如く処理した。

陽性であつたクローンを２回サブクローンし、VIII:C
に対する抗体を産生する安定なクローンを、細胞の注射
を行なう少なくとも４日前にプリスタン0.5mlを腹腔内
に入れて予め処置したBalb/Cマウスの腹膜腔に注射し
た。ハイブリドーマ細胞を、牛胎児血清を含まないDelb
eccoの改良イーグル培地0.5ml中、マウス当たり約５×1
0⁶細胞の濃度で注射した。むくんできたらマウスを穿刺
し、腹水を約10単位/mlでヘパリン中に集めた。複数の
マウスからの腹水を合わせ、モノクローナルIgGの単離
に都合の良い量とした。50％硫酸アンモニウムを使つて
腹水から抗体を沈殿させ、更に２回再沈殿させた。この
様にして生成せしめた前記の（Ｂ）、（Ｃ）および
（Ｄ）に相当する抗−VIII:C抗体はアガロースビーズに
結合され、溶液からの純化VIII:Cと結合することが示さ
れた。

VIII:Cの別のバッチ、１つは非処理、１つはトロンビ
ン蛋白分解にかけたものを実施例Ｉに記載したSDS−PAG
E工程で分析した。次いで各バンドを電気泳動法的に
（ウエスタン転移）、ゲルからニトロセルロース片に転
移させた。使用した装置はBio−Rad「Trans−Blot」cel
lおよびBio−Redモデル160.1.6動力供給（Bio−Red Lab
oratories,Richmond,California）であつた。転移緩衝
液は、pH8.3、20％メタノールに加えたグリシンを含む2
5mMトリスであつた。転移は90ボルト、10ミリアンペア
で16−24時間行なつた。

抗体のそれぞれと反応させた特定のポリペプチドは、
W.M.Burnetteの採用した方法、「ウエスタン・ブロツテ
イング」（Analytical Biochemistry、112巻、195−203
頁（1981）、「ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲルから非改良ニトロセルロースへの電気泳動法に
よる蛋白質の転移および抗体並びに放射性沃素化蛋白質
Ａを用いたＸ線撮影」）を用いて決定した。

「緩衝液Ｄ」は10mMトリス・クロライド、0.15M NaC
l、0.02％アジ化ナトリウム、pH7.4であつた。

1.緩衝液D100mlと0.25％ゼラチンを含んでいる皿に、転
移した蛋白質を持つたニトロセルロール片を入れる。こ
の皿を回転振盪器の上に置き、ゆつくりと30分間振盪さ
せる。

2.この皿にモノクローナル抗体を添加する（0.1〜１％
の腹水または純化IgG1mg）。120分間振盪する。

3.ニトロセルロース片を次の様にして洗浄する（ａ）緩衝液D100mlで10分間。

（ｂ）緩衝液D100mlおよび0.05％のNonidet−Ｐ−40で3
0分間、10および20分でかえる。

（ｃ）緩衝液D100mlで10分。

4.緩衝液Ｄ＋0.25％ゼラチンおよびI¹²⁵標識純化ウサギ
抗−マウスIgG中にニトロセルロース片を30分間浸す。

5.ニトロセルロース片を次の様にして洗浄する（ａ）緩衝液D100mlで10分間。

（ｂ）緩衝液Ｄ＋0.1％Nonidet P−40および0.5M NaCl
100mlで16−24時間。

（ｃ）緩衝液D100mlで10分間。

6.ニトロセルロース片を２枚の紙にはさんで吸い取
り、このニトロセルロース片を密封プラスチツク袋に入
れて保存する。

7.どの抗体とポリペプチド類が反応したかを調べるため
に、（ａ）文献に記載されている既知の標準的手法により、
ニトロセルロース片のオートラジオグラフを調製する。

（ｂ）このオートラジオグラフを、VIII:Cを移転させた
がモノクローナル抗体と反応させる代りに、Coomassie
ブルーR250で染色したニトロセルロール片と比較する。

これらの手順により、以下の個々の抗体が生成したこ
とがわかつた。

M_r＝92,000のポリペプチド、M_r＝108,000およびそれ
より大きいポリペプチド類、終末トロンビン消化物中に
存在するM_r＝54,000または44,000のポリペプチド類の一
方または他方、と反応した４つの抗体、その他のポリペ
プチドはなし。このことは、後者の２つのポリペプチド
類の起源は、M_r＝92,000のポリペプチドのトロンビン開
裂から来ていることを示している。これはまた、M_r＝9
2,000のポリペプチド上の２つのエピトープはその開裂
に生き残つたこと、およびこれらのエピトープはM_r＝7
9,000−80,000ダブレツト上に存在しないことを示して
いる。

５番目の抗体はM_r＝79,000−80,000のダブレツトおよ
びM_r＝108,000およびそれ以上のポリペプチド類と反応
したが、M_r＝92,000のポリペプチドおよび終末トロンビ
ン消化物中に存在するポリペプチドのいずれとも反応し
なかつた。このことは、M_r＝79,000−80,000のダブレツ
トはM_r＝92,000のポリペプチド上に存在しないエピトー
プを持つていること、およびそのエピトープはM_r＝79,0
00−80,000のダブレツトのトロンビン消化により破壊さ
れることを示している。

これら５つの抗体の反応挙動は、M_r＝92,000およびM_r
＝79,000−80,000のポリペプチドが、共通の前駆体
（群）から導かれることを示している。

第６番目の抗体は、M_r＝108,000およびそれ以上のポ
リペプチド類とだけ反応した。これは、終末トロンビン
消化物中に存在するいずれのポリペプチドとも反応しな
かつたので、それが反応したエピトープはトロンビン消
化によつて破壊されることがわかる。

これらの抗体の１つまたはそれ以上の生物学的製剤を
調製または貯蔵するには、相当するモノクロナールIgG
を、ヘパリン化した収集腹水から、収集後直ちに分離し
てもよいし、あるいは、その貯蔵溶液の冷凍部分を融解
してもよい。新しい試料であるか冷凍した試料であるか
に関係なく、この溶液は４℃にして、同容量の燐酸緩衝
食塩溶液（PBS）（PBS:1.6g燐酸ナトリウム、一塩基一
水和物;8.4g燐酸ナトリウム、二塩基無水物;61.4g塩化
ナトリウム；水を加えて7l;pH7.2）で処理する。この希
釈した腹水は、４℃で攪拌下に適加することにより沈殿
する。遠心分離は、好ましくは14,000rpmで60分間（30,
000×ｇ）で行なう。腹水の上澄液を更にSASで２回沈殿
させ、沈殿と上澄液の混合物を攪拌して、第１回目のサ
イクルと同様にして遠心分離する。３回目の沈殿から得
たペレットを希釈した腹水と同じ量のPBSに再懸濁し、P
BSに対して徹底的に透析する。透析袋中に現れた凝固物
は20℃で遠心分離して除去する。透析したIgGを、室温
で、５％水酸化アルミニウム水溶液と共に攪拌して吸着
させ、吸着後20℃で遠心分離する。この吸着処理を、第
１回目以降は2.5％水酸化アルミニウム溶液を用いて少
なくとも更に３回くり返す。この吸着させたIgGを４℃
にし、上記した様にSASで１回再沈殿させる。この沈殿
させたペレットは、使用するまで−20℃で貯蔵すること
ができる。

モノクローナル抗体類を精製し、それらを含有してい
る生物学的製剤を保持するための２つの好ましい方法が
P.L.Eyら（Immunochemistry、15巻、429−436頁、「蛋
白質Ａ−セフアロースを用いたマウス血清からの純化Ig
G₁、IgG_2aおよびIgG_2b免疫グロブリン類の分離」および
C.Bruckら（J.Immunological Methods,53巻、313−319
頁（1982）、「DEAE Affi−Gel Blueクロマトグラフイ
ーによる腹水からのマウスモノクローナル抗体の一工程
精製法」）によつて記載されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 9282−4Ｂ (56)参考文献Ｊ．Ｌａｄ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，97 （1981），Ｐ．50−64 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，79（1982），Ｐ．1648−1652

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】分子量92,000のペプチド及び分子量79,000
−80,000のペプチドの複合体、分子量92,000のペプチド
及び分子量71,000−72,000のペプチドの複合体及びこれ
らの複合体の組み合わせからなる群から選択される物質
から実質上なることを特徴とするファクターVIII:C凝固
因子。
【請求項２】該ペプチドがEDTAによってキレート化され
得る物質によって複合体を形成する第１項に記載のファ
クターVIII:C凝固因子。
【請求項３】該複合体のポリペプチドの少なくとも１つ
がα−トロンビン処理により得ることができる第１項に
記載のファクターVIII:C凝固因子。
【請求項４】凝固因子が1800単位/mgより高い凝固活性
を少なくとも10分間持続して示し、該ポリペプチドがヒ
トファクターVIII:C凝固因子抗体結合能力を有する第１
項から第３項までのいずれかに記載の凝固因子。
【請求項５】比活性が5400単位/mg以上である第１項か
ら第４項までのいずれかに記載の凝固因子。
【請求項６】比活性が6000単位/mg以上である第１項か
ら第５項までのいずれかに記載の凝固因子。
【請求項７】比活性が7500単位/mg以上である第１項か
ら第６項までのいずれかに記載の凝固因子。
【請求項８】比活性が10000単位/mg以上である第１項か
ら第７項までのいずれかに記載の凝固因子。
【請求項９】活性型のα−トロンビンおよび等価なプロ
テアーゼを含んでいない第１項から第８項までのいずれ
かに記載の凝固因子。
【請求項１０】該凝固因子が凍結乾燥されている第１項
から第９項までのいずれかに記載の凝固因子。
【請求項１１】分子量が約92,000よりも高いポリペプチ
ドを実質的に含んでいない第１項〜第10項のいずれかに
記載の凝固因子。
【請求項１２】薬学的に許容し得る食塩溶液に溶解され
ている状態の第１項〜第11項のいずれかに記載の凝固因
子。
【請求項１３】（ａ）トロンビン又は同様の活性を有す
るプロテアーゼを用い、適切な条件下、消化混合物中で
ヒトのファクターVIII:Cを消化して凝固因子を生成せし
め、（ｂ）該凝固因子が消化混合物中に存在する間に工程
（ａ）の消化を中止し、次いで（ｃ）得られた凝固因子を回収することを特徴とする分子量92,000のペプチド及び分子量7
9,000−80,000のペプチドの複合体、分子量92,000のペ
プチド及び分子量71,000−72,000のペプチドの複合体及
びこれらの複合体の組み合わせからなる群から選択され
る物質から実質上なることを特徴とするファクターVII
I:C凝固因子の調製法。
【請求項１４】該ファクターVIII:Cを予め精製しておく
第13項に記載の調製法。
【請求項１５】分子量92,000のペプチド及び分子量79,0
00−80,000のペプチドの複合体、分子量92,000のペプチ
ド及び分子量71,000−72,000のペプチドの複合体及びこ
れらの複合体の組み合わせからなる群から選択される物
質から実質上なることを特徴とするファクターVIII:C凝
固因子に記載の凝固因子の回収方法であって、ファクタ
ーVIII:Cに対するモノクローナル抗体を含んでいる免疫
吸着剤に活性型の該凝固因子を吸着させ、次いでその凝
固因子を変性させることのない、免疫吸着剤から凝固因
子を脱着させるに有効な溶離条件下でカルシウムイオン
を含有する溶液で免疫吸着剤から凝固因子を遊離させる
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】該溶液が約1.0Mまでのカルシウムイオン
を含んでおり、該溶液を１時間当たり約８ベッド容量ま
での容量で免疫吸着剤に適用する第15項に記載の回収方
法。
【請求項１７】モノクローナル抗体がヒトのファクター
VIII:Cと結合し、かつヒトのファクターVIII:Cから誘導
されるポリペプチドとの結合プロフィルが以下の（Ａ）
から（Ｄ）の中から選ばれる１つである第15項または第
16項に記載の回収方法：（Ａ）ヒトのファクターVIII:Cから誘導される分子量9
2,000、分子量108,000およびそれ以上、ならびに分子量
44,000のポリペプチドと結合し、ヒトのファクターVII
I:Cから誘導される分子量79,000−80,000の二量体、分
子量71,000−72,000の二量体のポリペプチドとはいずれ
とも結合しない、（Ｂ）ヒトのファクターVIII:Cから誘導される分子量9
2,000、分子量108,000およびそれ以上、ならびに分子量
54,000のポリペプチドと結合し、ヒトのファクターVII
I:Cから誘導される分子量79,000−80,000の二量体、分
子量71,000−72,000の二量体のポリペプチドとはいずれ
とも結合しない、（Ｃ）ヒトのファクターVIII:Cから誘導される分子量7
9,000−80,000の二量体ならびに分子量108,000およびそ
れ以上のポリペプチドと結合し、ヒトのファクターVII
I:Cから誘導される分子量44,000、54,000、92,000及び
分子量71,000−72,000の二量体のポリペプチドとはいず
れとも結合しない、および（Ｄ）ヒトのファクターVIII:Cから誘導される分子量10
8,000およびそれ以上のポリペプチドと結合し、ヒトの
ファクターVIII:Cから誘導される分子量が108,000より
も小さなポリペプチドとは反応しない、（ただし、上記分子量はポリペプチドを還元条件下、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけて測定した値である）。