JPH0829075B2

JPH0829075B2 - 或る種の鱗翅類害虫に対して改良された活性を有するバチルス・スリンギエンシスの株の製法及びそれにより製造さた新規株

Info

Publication number: JPH0829075B2
Application number: JP60223910A
Authority: JP
Inventors: デニス、ホーラス、バージス; ポール、ジヤレツト
Original assignee: アグリカルチユラル、ジエネテイツクス、カンパニ−、リミテツド
Priority date: 1984-10-09
Filing date: 1985-10-09
Publication date: 1996-03-27
Anticipated expiration: 2011-03-27
Also published as: GB8524826D0; NL971029I2; TR22990A; GB2165261B; EP0178151A3; GR852425B; EG19367A; CN85108207A; US4935353A; IL76580A; AU4835285A; MY100319A; AU603541B2; JPS61181372A; GB2165261A; GB8425487D0; IL76580A0; ES8609476A1; EP0178151B1; US5063055A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は殺昆虫活性を有する毒素生成細菌の新規株の
製法、それにより製造される新規株およびこの細菌の或
る種の害虫に感染する植物を保護する用途に関する。

より詳しくは、本発明は鱗翅類害虫に対して改良され
た殺昆虫活性を有するバチルス・スリンギエンシス（Ba
cillus thuringiensis）の新株に関する。

商業的および／または家庭的に重要な多くの植物は鱗
翅類害虫による侵略および損傷に曝される。これらの害
虫は世界中に見出され、現在それらの抑制は利用可能な
殺虫剤の繰返された且つ費用のかかる適用を必要とす
る。

多くの穀物は数多くの鱗翅類害虫に感染する。最も重
大な害虫の中には綿羽虫（Spodoptera littoralis）、
蛾の幼虫（Heliothis armigera）、タバコ青虫（Heliot
his virescens）、Plutellamaculipennis、Mamestra sp
pおよびPieris brassicaeなどがある。

広いスペクトルの殺虫剤は穀物保護のための有用且つ
貴重な道具であるが、しかし、広いスペクトルの化学的
殺昆虫剤の見境のない使用は多くの天然抑制剤を破壊す
る可能性がある。殆んどの化学的殺昆虫剤は比較的非選
択的であるので破壊的害虫の有益な捕食者および寄生虫
を含む非目標生物体を破壊し得る。或る種の昆虫はま
た、化学的殺昆虫剤に対して耐性を発達させ、それはし
ばしば弱小の害虫を強大な害虫にすることがある。

天然に存在する細菌を活性且つ宿主−特異性成分とし
て用いる選択的微生物殺昆虫剤の導入はこれらの多くの
問題を克服するのを助けてきた。

微生物殺昆虫剤の具体例はバチルス・スリンギエンシ
スであり、それらの多くの株は市販されており、感染性
幼虫特に昆虫目の鱗翅目のそれらにより食べられた際の
独特な殺昆虫活性に対して現在開発が行われている。

これらの株は有益な昆虫に対する悪影響なしに使用さ
れる。バチルス・スリンギエンシスは有害な昆虫を抑制
するために天然に存在する生物体の使用を支持する現在
の農業理論にうまく適合している。それは広く分布した
桿状の、胞子形成性、好気性、グラム陽性微生物であ
り、胞子形成周期時に１以上の蛋白質副胞子結晶の生
成、その鱗翅類害虫に対する病原性、そのクエン酸塩を
唯一の炭素源とする利用能力およびその胞子の極めて高
いリン酸塩含量により特徴付けられる。

バチルス・スリンギエンシスは環境の普通の生息物で
あり、或る種の土壌において生育することができる。そ
れは人、ペット類、鳥類、魚類、土中の虫、最も有益な
昆虫類或いは植物に対しては悪影響が知られていない。
その感染昆虫に対する病原性は本質的に胞子形成時に細
胞の乾燥重量の30〜40％を占める。副胞子結晶の存在に
よるものである。

バチルス・スリンギエンシスは摂取された場合にのみ
活性である。摂取後数時間後に鱗翅類害虫は食べること
を止め、植物に対する損傷が停止される。殆んどの種は
結晶毒物による毒血症により約24〜72時間後に死亡す
る。これには胞子の存在の結果として敗血症が伴うこと
がある。

この様に、主たる効果は幼虫の腸内におけるその溶解
後にのみ作用する結晶によるものである。

結晶の活性化は消化管内容物中のアルカリ性pHおよび
蛋白質分解酵素の組合せにより生ずる。この反応は結晶
の毒性成分の放出を行う鱗翅類幼虫の高消化管pH（pH＞
７）に依存する。これらの毒素は中腸壁を破壊し食べる
ことを停止させる。

この様に、腹腔内に放出された細菌の生育の結果、昆
虫の死亡に一部の役割も果す敗血症を生じさせる。

バチルス・スリンギエンシスの殺昆虫剤としての使用
は鱗翅類害虫を取扱うための有効且つ環境的に許容可能
な方法を提供することは明らかである。

この理由により、与えられた種に対してより大きな毒
性を有するか或いはより広い活性スペクトルを有する意
味での改良された殺昆虫活性を有する新たな株が現在探
索されている。しかしながら、高毒性と広い活性スペク
トルの組合せは実際には極めて達成が困難であった。

本発明においてバチルス・スリンギエンシスの新株GC
91が或る種の鱗翅類害虫に対して改良された殺昆虫活
性を有することが見出された。

従って、本発明は、その試料がナショナル・コレクシ
ョン・オブ・タイプ・カルチャーズ（NCTC）、セントラ
ル・パブリック・ヘルス・ラボラトリー（コリンドール
通、ロンドン NW9 5HT）にブダペスト条約上の国際寄
託として受託番号（NCTC 11821）で寄託された（1984年
９月７日寄託）鱗翅類害虫に対して殺昆虫活性を有する
バチルス・スリンギエンシスの新株GC 91、或いはその
誘導体または突然変異体を提供する。

この新株はバチルス・スリンギエンシスの二つの株の
潜在的殺昆虫活性を有効に組合せるものであり、その一
つは胞子形成不能突然変異体であり、従ってこのもの
は、それが実際に胞子或いは結晶を生成するならば殺昆
虫活性を示すようにさせうる遺伝子物質を含有していて
も殺昆虫活性は示さないものである。この様に、新株GC
91の驚くべき能力は二つの突然変異株の単なる混合物
の使用によっては達成することができないものである。

この新規株は、Galleria、Mamestra、Heliothis、Spo
dopteraおよびPieris属における鱗翅類害虫に対して改
良された殺昆虫活性を有する。

本発明はまた、単一株中に二つの各出発株の異った殺
昆虫特性を組合せて導入することにより改良された殺昆
虫特性を有するバチルス・スリンギエンシスの株を製造
する方法において、（ａ）第一の出発株から、結晶蛋白質の部分を形成する
ポリペプチドをコードするプラスミドの損失により特徴
付けられる突然変異体を選択し、および（ｂ）第二の出発株（供与体）或いはその突然変異体か
ら、デルタ−エンドトキシン結晶合成をコードするプラ
スミドを工程（ａ）において生成された突然変異体（受
容体）中に移して所望の新規株を生成することを特徴とする方法提供する。

好ましくは、先ず第二の出発株から第二の出発株のそれ
と実質的に同一のプラスミドプロフィールを有する胞子
形成不能突然変異体が選択される。このプラスミドを次
いで胞子形成不能突然変異体から工程（ａ）において生
成された受容体突然変異体に移す。

好ましくは、第一の出発株は株HD 135であり、工程
（ａ）において生成される突然変異体は株135−S4（NCT
C 11822）である。

好ましくは、第二の出発株は株HD 191であり、胞子形
成不能突然変異体は株191−A2（NCTC 11823）である。

なお、上記突然変異体菌株135−S4及び191−A2はいず
れもブダペスト条約上の国際寄託に基づきそれぞれNCTC
11822及びNCTC 11823の受託番号が付与されている。

本発明は更に、バチルス・スリンギエンシス株191−A
2（NCTC 11823）からバチルス・スリンギエンシス株135
−S4（NCTC 11822）中に株191−A2におけるデルタ−エ
ンドトキシン結晶合成をコードするプラスミドを移すこ
とを特徴とするバチルス・スリンギエンシスGC 91（NCT
C 11821）の製造方法を提供する。

この方法の一つの実施態様において、株191−A2および1
35−S4を一緒に混合培養液中において生育させ、接合様
プラスミド転移を行わせ、混合培養液を稀釈し、固体培
地に移して単一コロニーを得、株GC 91のコロニーを増
大した大きさの副胞子結晶により選択し、株GC 91をそ
れから培養する。

本発明はまた、バチルス・スリンギエンシス株GC 91
（NCTC 11821）、或いはその誘導体または突然変異体或
いは上記方法により製造された株に由来する殺昆虫物質
にも関する。一つの実施態様において、この殺昆虫物質
は胞子−結晶複合体である。

本発明は更に、バチルス・スリンギエンシス株GC 91
（NCTC 11821）或いはその誘導体または突然変異体或い
はその培養物を担体、稀釈剤、界面活性剤、或いは適用
促進アジュバントと共に含んでなることを特徴とする殺
昆虫剤組成物を提供する。この組成物はまた、更に、肥
料、微量養分供与体、植物成長調剤、殺草剤、殺虫剤、
殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤および軟体動物駆除剤お
よびそれらの混合物から選ばれる生物学的に活性な化合
物を含むことができる。この組成物は、0.1〜99重量％
のバチルス・スリンギエンシスGC 91或いはその誘導体
または突然変異体或いはその培養物、１〜99.9重量％の
固体または液体アジュバント、および０〜25重量％の界
面活性剤よりなることができる。

本発明は更に、害虫或いはそれらの環境に殺昆虫的に
有効量のバチルス・スリンギエンシス株GC 91（NCTC 11
821）或いはその誘導体または突然変異体、或いはその
培養物を適用することを特徴とする鱗翅類害虫の対抗方
法を提供する。

バチルス・スリンギエンシスの株GC 91或いはそれを
含む組成物は或る種の他の殺昆虫剤或いは化学薬品と共
に効力を失うことなく保護されるべき植物或いは穀物に
投与することができる。

それは殆んどの他の通常使用される農業スプレー材料
と相溶性であるが、極端にアルカリ性のスプレー溶液中
においては使用されるべきではない。

それはまた、粉末、懸濁液、浸潤剤或いはその他の任
意の農業用に適した剤形において投与することができ
る。

バチルス・スリンギエンシスの正常な生育後、母細胞
が溶解し、胞子および結晶を生育培地中に放出する。こ
れらの胞子および結晶は遠心分離、スプレー乾燥或いは
ダルメージ（Dulmage）など〔ジャーナル・オブ・イン
バータブレート・パソロジー（Journal of Invertebrat
e Pathology）15、15−20、1970〕に報告されるような
ラクトース共沈澱技術のような沈澱法により採取され
る。得られる胞子−結晶複合体は長期間安定であり、穀
物への適用に適した製品に配合することができる。

本発明による殺昆虫組成物の製造方法はバチルス・ス
リンギエンシス株GC 91を培養することよりなり、培養
は、Ａ）この株を凍結乾燥されたアンプル中に維持し、Ｂ）この株を寒天斜面上に接種し、Ｃ）これらの斜面を20〜40℃、好ましくは25〜33℃で１
〜５日間インキュベートし、Ｄ）これらの斜面から水性培養培地を含む振盪フラスコ
に接種し、Ｅ）この容器を20〜40℃、好ましくは30℃の温度におい
て１〜５日間、好ましくは１〜２日間振盪し、任意にこ
の成長期を別のフラスコ内で少なくとも１回繰返し、Ｆ）予備培養ファーメンター内において水性培養培地に
段階Ｅ）の培養液を接種し、Ｇ）接種液を含有する培地を20〜40℃、好ましくは30〜
35℃の温度で攪拌および通気し、任意にこの予備培養発
酵段階を別のより大きい容器内において少なくとも１回
繰返し、Ｈ）段階Ｇ）のインキュベーション用の液の２〜20重量
％を水性培養培地を含有する製造ファーメンター中に導
入し、Ｉ）培地を20〜40℃、好ましくは30〜35℃の温度で攪拌
および通気し、Ｊ）バチルス・スリンギエンシスGC 91培養液を製造フ
ァーメンター内の胞子形成および結晶生成が最大に達し
た時点で採取することにより行われ、Ｋ）Ａ〜Ｄにおける寒天および培養液は少なくとも一つ
の窒素源、少なくとも一つの炭素源および少なくとも一
つの塩、好ましくはペプトン、グルコースおよび少なく
とも一つの塩を含有すべきである。Ｆ〜Ｊにおける培地
は少なくとも一つの窒素源（例、ペプトン、酵母エキ
ス、コーンスティーブリカー、大豆ミール、綿実ミー
ル、魚ミール）、少なくとも一つの炭水化物源（例、グ
ルコース、ラクトース、スクロース、デンプン或いはこ
れらの成分に富んだ原料）、および少なくとも一つの鉱
物塩を含有すべきである。窒素および炭水化物はなるべ
く同時に消費されるようにバランスが取られるべきであ
る。

この胞子−結晶複合体或いはそれを含む組成物はある
種のその他の殺昆虫剤或いは化学薬品と共に効力の損失
なしに保護されるべき植物或いは穀物に投与することが
できる。

胞子−結晶複合体における胞子を例えばガンマ線照射
或いは結晶を損傷しないその他の方法で殺すことが可能
であり、それにより生存不能生成物を形成することがで
きる。生存不能生成物は安全の理由により細菌の広がり
を防止することが望ましい或る種の状況において或いは
有益な鱗翅類例えばカイコにおける病気を引起こすこと
を避けるために有利な場合がある。しかしながら、生存
不能生成物は一般的に生きた胞子を含むもの程活性でな
く、更に欠点として胞子を殺すためのコストの上昇があ
る。

本発明は更に殺昆虫的に有効量のB.スリンギエンシス
GC 91或いはその組成物を適用することを特徴とする植
物の処理方法に関する。

本発明の範囲内において保護されるべき目標穀物に
は、例えば次の植物種が含まれる：穀類（コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、コ
メ、サトウモロコシ、および関連した穀類）、ビート
（サトウビートおよび飼料ビート）、石果、仁果、およ
び小果樹（リンゴ、セイヨウナシ、プラム、モモ、アー
モンド、サクランボ、イチゴ、ラズベリーおよびブラッ
クベリー）、豆科植物（インゲンマメ、ヒラマメ、ピー
ス、大豆）、油植物（ナタネ、アブラナ、ケシ、オリー
ブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマシ油植物、ココアマ
メ、ナンキンマメ）、キューリ植物（キューリ、マロ
ー、メロン）、繊維植物（ワタ、アマ、アサ、ジュー
ト）柑橘果物（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、
マンダリン）、野菜（ホーレンソー、レタス、アスパラ
ガス、キャベツ、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガ
イモ、パプリカ）、クスノキ（アボカド、シナモン、シ
ョーノー）、落葉樹および針葉樹（ボダイジュ、セイヨ
ウイチイ、カシノキ、ハンノキ、ポプラ、ブナ、モミ、
カラマツ、マツ）、或いはメイズ、タバコ、ナッツ、コ
ーヒー、サトーキビ、紅茶、ブドー、ホップ、バナナお
よび天然ゴム植物並びに観賞植物（複合体）。

バチルス・スリンギエンシスGC 91は通常組成物の形
態で適用され、被処理作物面積或いは植物に更に生物学
的活性化合物と同時に或いは順次適用することができ
る。これらの化合物はいづれも肥料或いは微量養分供与
体或いはその他の植物生育に影響を及ぼす調剤である。
それらはまた、選択的殺草剤、殺昆虫剤、殺真菌剤、殺
細菌剤、殺線虫剤、軟体動物駆除剤或いはこれらの調剤
のいくつかの混合物でもよく、必要に応じて更に通常配
合技術において用いられる担体、界面活性剤、或いは適
用促進アジュバントと共に用いられる。適当な担体およ
びアジュバントは固体または液体であり、通常配合技術
において用いられる物質例えば天然或いは再生鉱物物
質、溶媒、分散剤、湿潤剤、貼着剤、バインダー、或い
は肥料などに対応する。

これらのB.スリンギエンシスGC 91を活性成分として
或いはそれと他の活性成分との組合せを含み、また適当
な場合には固体或いは液体アジュバントを含む配合物即
ち組成物、調剤或いは混合物は公知の方法例えば活性成
分を増量剤例えば溶媒、固体担体および場合に応じては
界面活性化合物（界面活性剤）と共に均一に混合および
／または摩砕することにより調製される。

適当な溶媒は芳香族炭化水素、好ましくは、８〜12の
炭素数を有する画分例えばキシレン混合物或いは置換ナ
フタレン類、ジブチルフタレート或いはジオクチルフタ
レートなどのフタレート類、シクロヘキサン或いはパラ
フィン類などのような脂肪族炭化水素類、アルコール類
およびグリコール類およびそれらのエーテル類およびエ
ステル類例えばエタノール、エチレングリコールモノメ
チル或いはモノエチルエーテル、シクロヘキサノンなど
のケトン類、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルス
ルホキシド或いはジメチルホルムアミドなどの強極性溶
媒、植物油或いはエポキシ化ヤシ油或いは大豆油などの
エポキシ化植物油、或いは水である。

例えば、粉末および分散性粉末に使用される固体担体
は通常は方解石、タルク、カオリン、モンモリロナイト
或いはアタパルガイドなどの天然鉱物充填剤である。物
理的性質を改良するためには高度分散ケイ酸或いは高度
分散吸着剤重合体を添加することも可能である。適当な
顆粒化吸着性担体は多孔質タイプ、例えば、軽石、破砕
レンガ、海泡石、或いはベントナイトであり、適当な非
吸着性担体は方解石或いは砂のような物質である。加え
て、無機質或いは有機質の数多くの予備顆粒化材料例え
ば特にドロマイト或いは粒状化植物残渣を使用すること
ができる。

配合されるべき活性成分の性質に応じて、適当な表面
活性化合物は良好な乳化、分散および湿潤特性を有する
非イオン性、カチオン性および／またはアニオン性界面
活性剤である。「界面活性剤」という用語は界面活性剤
の混合物を含むものとしても理解される。

適当なアニオン性界面活性剤は水溶性石ケンおよび水
溶性合成界面活性化合物の両者であり得る。

適当な石ケンは高級脂肪酸（C₁₀−C₂₂）のアルカリ金
属塩、アルカリ土類金属塩或いは未置換或いは置換アン
モニウム塩例えばオレイン酸或いはステアリン酸のナト
リウム或いはカリウム塩、或いは例えばヤシ油或いは牛
脂から得ることのできる天然脂肪酸混合物のこれらの塩
である。更に適当な界面活性剤はまた脂肪酸メチルタウ
リン塩並びに変性および未変性リン脂質である。

しかしながら、より頻繁には所謂合成界面活性剤、特
に脂肪族スルホネート類、脂肪族サルフェート類、スル
ホン化ベンズイミダゾール誘導体或いはアルキルアリー
ルスルホネート類が使用される。

脂肪族スルホネート類或いはサルフェート類は通常ア
ルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩或いは未置換或いは
置換アンモニウム塩の形態であり、一般的にアシル基の
アルキル部分も含むC₈−C₂₂アルキル基を含み、例えば
リグノスルホン酸、ドデシルサルフェート或いは天然脂
肪酸から得られた脂肪アルコールサルフェートの混合物
のナトリウム或いはカルシウム塩である。これらの化合
物はまた硫酸エステルおよび脂肪アルコール／エチレン
オキシドアダクトのスルホン酸の塩も含む。スルホン化
ベンズイミダゾール誘導体は好ましくは２個のスルホン
酸基および８〜22の炭素数を含む一つの脂肪酸基を含有
する。アルキルアリールスルホネート類の具体例は、ド
デシルベンゼンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホ
ン酸、或いはナフタレンスルホン酸／ホルムアルデヒド
縮合生成物のナトリウム、カルシウム或いはトリエタノ
ールアミン塩である。また対応するホスフェート例えば
ｐ−ノニルフェノールと４〜14モルのエチレンオキシド
とのアダクトのリン酸エステルの塩も適当である。

非イオン性界面活性剤は、好ましくは、脂肪族或いは
環式脂肪族アルコール類、或いは飽和或いは不飽和脂肪
酸およびアルキルフェノール類のポリグリコールエーテ
ル誘導体であり、該誘導体は３〜30個のグリコールエー
テル基および（脂肪族）炭化水素部分に８〜20個の炭素
原子およびアルキルフェノールのアルキル部分に６〜18
個の炭素原子を含有する。

更に適当な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオ
キシドとポリプロピレングリコール、エチレンジアミノ
ポリプロピレングリコールおよびアルキル鎖に１〜10個
の炭素原子を含むアルキルポリプロピレングリコールと
の水溶性アダクトであり、これらのアダクトは20〜250
個のエチレングリコールエーテル基および10〜100個の
プロピレングリコールエーテル基を含む。これらの化合
物は通常プロピレングリコール単位当り１〜５個のエチ
レングリコール単位を含有する。

非イオン性界面活性剤の代表例はノニルフェノールポ
リエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコールエーテ
ル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシドアダクト、
トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエ
チレングリコールおよびオクチルフェノキシポリエトキ
シエタノールである。ポリオキシエチレンソルビタンの
脂肪酸エステル例えばポリオキシエチレンソルビタント
リオレエートもまた適当な非イオン性界面活性剤であ
る。

カチオン性界面活性剤は、好ましくは、Ｎ−置換基と
して少なくとも１個のC₈−C₂₂アルキル基および更に置
換基として低級未置換或いはハロゲン化アルキル、ベン
ジル或いはヒドロキシ−低級アルキル基を含む四級アン
モニウム塩である。これらの塩は、好ましくは、ハロゲ
ン化物、メチルサルフェート或いはエチルサルフェート
の形態、例えばステアリルトリメチルアンモニウムクロ
ライド或いはベンジルジ−（２−クロロエチル）エチル
アンモニウムブロマイドである。

配合技術において通常使用される界面活性剤は、例え
ば「マッカッチョンの洗剤および乳化剤年報」（“McCu
tcheon's Detergents and Emulsifiers Annual",MC Pub
lishing Corp. Ridgewood, New Jersey, 1979）；ヘル
ムート・スタツヘ博士（Dr. Helmut Stache）「界面活
性剤ハンドブック」（″Tensid Taschenbuch″、Carl H
anser Verlag,Munich/Vienna）などに記載されている。

本発明の殺昆虫組成物は、通常、0.1〜99％、好まし
くは0.1〜95％のバチルス・スリンギエンシスGC 91、或
いはそれと他の活性成分との組合せ、１〜99.9％の固体
または液体アジュバント、および０〜25％、好ましくは
0.1〜20％の界面活性剤を含む。

市販品は濃縮物として配合されるのが好ましいが、末
端ユーザーは通常実質的により低い濃度の稀釈配合物を
使用する。

これらの組成物はまた、更に安定剤、消泡剤、粘度調
節剤、バインダー、粘着剤並びに肥料その他の活性成分
を特別の効果を得るために含有することができる。

以下、野性タイプ、突然変異体供与体、突然変異体受
容体および組換え株GC 91のプラスミドプロフィールを
示す添付図面を参照する。括弧（〕）は染色体DNAの位
置を示す。

バチルス・スリンギエンシスGC 91の新株は、具体例
に示される、下記の実験処方を用いて二つの他のバチル
ス・スリンギエンシス株から作成された。

例１−株135−S4の調製出発株はバチルス・スリンギエンシスHD 135野性種の
Ｈ−セロタイプaizawai株であった（テキサス州ブラウ
ンスビル、米国農務省、綿昆虫研究室、Ｈ、Ｔ、ダルメ
ージ博士より自由に入手可能）。株HD 135は「米国農務
省から利用可能なバチルス・スリンギエンシス培養物」
と題されるカタログ（Agricultural Reviews and Manua
ls ARM−Ｓ−30、1982年10月）に掲載されている。それ
はまた、″Collection de Souches de Bacillus thring
iensis 1983″と称されるカタログ〔パスツール研究
所、25 rue de Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15,Fr
ance（インデックス番号７−28）〕にも利用可能なもの
として掲載されている。

株HD 135は、ピエリス・ブラシカエ（Pieris brassic
ae）、マメストラ・ブラシカエ（Mamestra brassica
e）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis Virescen
s）、ヘリオチス・アルミゲラ（Heliothis armiger
a）、ガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）およ
びスポドプテラ・リトラリス（Spodoptera littorali
s）に対して殺虫活性を示した（表１参照）。

株HD 135は栄養ブロス（Oxoid社、英国）（組成:Lab
−Lemco Powder 1.0g/1、酵母エキスＬ−20 2.0g/1、ペ
プトンＬ−37 5.0g/1、NaCL 5.0g/1）中において42℃で
16時間生育した。培養液を次いで0.8％（W/V）バクトペ
プトン（Difco）中で稀釈し、栄養寒天（Oxoid社、英
国）（栄養ブロスと同様な組成物但し、寒天No.315.0g/
1を添加）上にプレート培養し、プレート当りほぼ100コ
ロニーを達成した。次いで、インキュベーションを30℃
において48時間行った。個々のコロニーを顕微鏡で検査
したところ、一つのコロニーが減少した大きさの副胞子
結晶を生成することが見出された。このコロニーはHD 1
35の突然変異株であることが判明し、135−S4と命名さ
れた。株135−S4はNCTCに受託番号NCTC 11822として寄
託されている（寄託日1984年９月７日）。突然変異体13
5−S4中のプラスミドのジャレット（Jarret,P.）、（19
83年）、〔FEMS Microbiology Letters 16、PP50−60〕
の方法による分析は、それが親株に存在した53Mdプラス
ミドおよび8.8Mdプラスミドが欠けることを示した（図
面参照）。野性種HD 135および135−S4からの可溶化結
晶蛋白質のSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリ
ルアミドゲル上の電気泳動は135−S4の副胞子結晶は130
Kのポリペプチドを欠いていることを示した。結晶の精
製、それらの溶解およびそれらをSDSポリアクリルアミ
ドゲル上で操作する方法は公知であり、例えばP.ジャレ
ット（P.Jarrett,Journal of Applied Bacteriology 19
85、58、437−448）に記載されている。株135−S4のバ
イオアッセイは殺虫活性がピエリス・ブラシカエおよび
ヘリオチス・ビレセンスに対しては失われたが、しか
し、マメストラ・ブラシカエ、ガレリア・メロネラ、ヘ
リオチス・アルミゲラおよびスポドプテラ・リトラリス
においては保持されたことを示した（表１）。

この細菌株のガレリア・メロネラに対する活性はバー
ジェス（Burges,H.D.）（1976年）〔Entomologia Exper
imentalis et Applicate 19,217−222〕の方法を用いて
行った。

ヘリオチス・アルミゲラ、ヘリオチス・ビレセンス、
マメストラ・ブラシカエおよびスポドプテラ・リットラ
リスに対する細菌株の活性は、幼虫が飼育された人口の
寒天−ベース食餌に対して一連の濃度の細菌を添加する
ことにより行った。使用された培地はペイン（Payne,C.
C.）（1981年）〔Journal of Invertebrate Pathology3
8,71−77〕により記載されている。

ピエリス・ブラシカエに対してはダビッド（David,W.A.
C.）およびガーディナー（Gardiner,R.O.C）（1965年）
〔Nature,London 207,No.4999、pp882−883〕の準−合
成食餌を使用した。バイオアッセイに使用した全ての幼
虫は生後６日目のものであった。死亡率は、温度を25℃
に保って６日後に記録された。

幾つかの鱗翅類害虫に対する株135−S4の殺昆虫活性
を表１に示す。

例２−株191−A2の調製 191−A2の記号で示される第二の突然変異株は野性種
Ｈ−セロタイプkurstaki株HD 191（テキサス州、ブラウ
ンズビル、米国農務省綿昆虫研究室、H.T.ダルマージ博
士より入手）から得られたものであった。株HD 191は例
１において言及した米国農務省およびパスツール研究所
（インデックス番号30−49）のカタログにおいて利用可
能なものとして掲載されている。

株HD 191を栄養寒天（培地の組成:Lab−Lemcopowder
（Ｌ−29）1.0g/1、酵母エキス（Ｌ−20）2.0g/1、ペプ
トン（Ｌ−37）5.0g/1、塩化ナトリウム5.0g/1、寒天N
o.3 15.0g/1）の表面上に条痕接種し、42℃で48時間イ
ンキュベートした。インキュベーション後プレートを約
８倍の倍率において解剖顕微鏡の下に検査した。多くの
小さな隆起領域即ち乳頭状突起が条痕内に散在して見ら
れ、非−胞子形成コロニーを示した。これらを突つき出
し栄養寒天上に再条痕接種し、30℃で48時間インキュベ
ートした。得られた生育物は191−A2と命名された安定
な胞子形成不能突然変異株の単一コロニーとしての単離
を可能にした。株191−A2はNCTCに受託番号NCTC 11823
として寄託された（寄託日1984年９月７日）。

親株および突然変異株の両者のプラスミドプロフィー
ルをアガロースゲル電気泳動（図面参照）により分析し
た際に両者間に何等の差異も検出されなかった。これは
殺昆虫活性に対するプラスミドプロフィールは胞子形成
親株HD 191のそれとおそらく同一であること即ちヘリオ
チス・アルミゲラ、ヘリオチス・ビレセンスおよびピエ
リス・ブラシカエに対する殺昆虫活性を有することを示
した（表１）。

例３−株GC 91の調製ゴンザレス（Gonzalez,J.M.Jr.）、ブラウン（Brown,
B.J.）およびカールトン（Carlton,B.C.）（1982年）
〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol 79 pp 6951−55〕によ
り報告された接合様プラスミド転移系を次の変更を加え
て用いて突然変異株191−A2について、どのプラスミド
が毒素生成を担うものであるかを決定する試験を行っ
た。

供与体191−A2およびバチルス・スリンギエンシス株H
D 1に由来する非結晶産生（acrys−taliferous）突然変
異体である受容体株を別々に脳心臓注入寒天（Oxoid）
プレート上に生育した〔g/1で表わした成分：仔ウシ脳
注入物固形分12.5、ウシ心臓注入物固形分5.0、プロテ
アーゼペプトン（Oxoid L 46）10.0、塩化ナトリウム5.
0、デキストロース2.0、無水リン酸ナトリウム2.5およ
び寒天No.3 15.0〕。30℃で16時間インキュベーション
後、各株からのループ一杯の細胞を脳心臓注入寒天プレ
ートの表面上で混ぜ合せ更に30℃で24時間インキュベー
トした。得られた生育物を次いで栄養寒天プレート（Ox
oid）上に条痕接種し、30℃において48時間インキュベ
ートして受容体に胞子形成させた。栄養寒天プレートか
らのループ一杯の生育物を次いで10mlの無菌蒸留水中に
懸濁させ60℃で15分間加熱して胞子形成不能供与体191
−A2を殺した（胞子形成受容体は無傷である）。供与体
191−A2の耐熱性内生胞子を生成するための転換は栄養
寒天プレート上での生育後、10⁷個の生きた細胞中１よ
りも大の頻度で生じた。

加熱後、培養液を稀釈し、栄養寒天上にプレート培養
して個々のコロニーを得た。30℃で48時間インキュベー
ション後コロニーを顕微鏡検査してデルタ−エンドトキ
シン結晶合成の存在を探した。四つの別々の実験におけ
る結晶を生成するコロニーのパーセントは59％、41％、
22％および31％であった。結晶生成を再取得する受容体
からのプラスミドプロフィールは結晶合成に供与体191
−A2からの50Mdプラスミドの転移が伴うことが示され
た。20個の個々のコロニーを調べたところ全てが50Mdプ
ラスミドを含有した。191−A2から50Mdプラスミドを受
取る受容体は供与体野性種親HD 191の完全な生物学的活
性を示した。結果を表２に示す。このデータから50Mdプ
ラスミドが191−A2におけるデルタ−エンドトキシン結
晶合成をコードしたものと結論付けられた。

上記プラスミド転移および耐熱性胞子形成受容体の選
択の方法を用いて191−A2からの50Mdプラスミドを突然
変異体135−S4に移した。先ず、50Mdプラスミドを含有
する可能性のある個々の135−S4のコロニーを選択する
ためにコロニーを顕微鏡で検査して増大した大きさの結
晶を生成するものを選択した。二つの別々の実験におけ
るプラスミド転移後の増大した大きさの結晶を生成する
135−S4コロニーのパーセントは29％および21％であっ
た。その様なコロニーのプラスミドプロフィールは分析
された全ての（10）大結晶形成コロニーにおいて50Mdプ
ラスミドの存在を示した。50Mdプラスミドの取込みの結
果、副胞子結晶の大きさの増大および同時に突然変異体
135−S4の殺昆虫活性の変更および増大が生じたものと
結論付けられた。

組合された殺昆虫活性は害虫種スポドプテラ・リトラ
リス、ヘリオチス・アルミゲラ、ヘリオチス・ビレセン
ス、マメストラ・ブラシカエ、ガレリア・メロネラおよ
びピエリス・ブラシカエに関して改良された。

更に50Mdプラスミドを含有する突然変異体135−S4は
突然変異体GC 91と命名された。

株GC 91およびバチルス・スリンギエンシスのその他
の株の殺昆虫活性は表１に示される。

また野性種、突然変異体供与体、突然変異体受容体お
よび組換え株GC 91のプラスミドプロフィールを示す添
付図面が参照される。括弧（〕）は染色体DNAの位置を
示す。

バチルス・スリンギエンシスGC 91の固体活性成分或い
はそれと他の活性成分の組合せのための配合例（パーセ
ントは全て重量基準である）バチルス・スリンギエンシスGC 91をアジュバントと
供に十分に混合し、混合物を適当なミル内で十分に摩砕
し、水で稀釈して所望の濃度の懸濁液を与えることので
きる湿潤性粉末を得た。

2.乳化可能濃縮物バチルス・スリンギエンシスGC 91 10％オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル
（４〜５モルのエチレンオキサイド）３％ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム３％ヒマシ油ポリグリコールエーテル（36モルのエチレンオ
キサイド）４％シクロヘキサノン 30％キシレン混合物 50％任意の濃度のエマルジョンをこの濃縮液から稀釈する
ことにより得ることができる。

3.粉剤 a） b）バチルス・スリンギエンシスGC 91 5％ 8％タルク 95％ − カオリン − 92％直ぐに使用できる粉剤は活性成分を担体と混合し、混
合物を適当なミル内で摩砕することにより得られる。

4.押出し顆粒剤バチルス・スリンギエンシスGC 91 10％リグノスルホン酸ナトリウム 2％カルボキシメチルセルロース 1％カオリン 87％活性成分或いは組合せをアジュバントと混合および摩
砕し、混合物を引続き水で湿潤する。この混合物を押出
し、顆粒化し、次いで空気流中で乾燥させる。

5.被覆顆粒剤バチルス・スリンギエンシスGC 91 40％ポリエチレングリコール（モル重量200） 3％カオリン 94％微細に摩砕された活性成分或いは組合せをミキサー中
においてポリエチレングリコールで湿潤されたカオリン
に均一に適用する。この様にして非粉末状被覆顆粒が得
られる。

6.懸濁液濃縮物バチルス・スリンギエンシスGC 91 40％エチレングリコール 10％ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル（15
モルのエチレンオキサイド） 6％リグノスルホン酸ナトリウム 10％カルボキシメチルセルロース 1％ 37％ホルムアルデヒド水溶液 0.2％ 75％水性エマルジョンの形態でのシリコーンオイル 0.8
％水 32％微細に摩砕された活性成分或いは組合せをアジュバン
トと緊密に混合し、任意の濃度の懸濁液が水で稀釈して
得ることのできる懸濁液濃縮物を得る。

本発明において開示されるバチルス・スリンギエンシ
スの新規株即ちGC 91、135−S4および191−A2は全て特
別に述べた例外の他はこの属および種の典型的な形態学
的および生化学的特性を有する。異った変種はH.ドバル
ジャック（H.deBarjac）（1981年）〔害虫および植物病
の微生物学的抑制（Microbiol Control of Pests and P
lant Diseases）の第３章、1970−1980、H.D.Burges編A
cademic Press、1981年〕に記載されるＨ−セロタイピ
ング（鞭毛或いはＨ−抗原に基づく）により区別するこ
とができる。

下記のNCTC 11821（＝GC91）、NCTC 11822（＝135−S
4）、およびNCTC 11823（＝191−A2）の生化学的特性の
試験を行った：

【図面の簡単な説明】

添付図面は野性種、突然変異体供与体、突然変異受容体
および組換え株GC 91のプラスミドプロフィールを示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:07）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】その試料が受託番号NCTC 11821で寄託され
ている、鱗翅類害虫に対して殺昆虫活性を有するバチル
ス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）GC 9
1株或いはその誘導体または突然変異体。
【請求項２】単一株中に二つの各出発株の異った殺昆虫
特性を組み合わせて導入することにより改良された殺昆
虫特性を有するバチルス・スリンギエンシスの株を製造
する方法において、（ａ）第一の出発株から、結晶蛋白質の部分を形成する
ポリペプチドをコードするプラスミドの損失により特徴
付けられる突然変異体を選択し、および（ｂ）第二の出発株或いはその突然変異体から、デルタ
−エンドトキシン結晶合成をコードするプラスミドを工
程（ａ）において生成された突然変異体中に移して所望
の新規株を生成することを特徴とする方法。
【請求項３】第二出発株のそれと実質的に同一のプラス
ミドプロフィールを有する第二出発株の胞子形成不能突
然変異体からプラスミドが移される、特許請求の範囲第
２項記載の方法。
【請求項４】第一出発株が株HD 135であり、工程（ａ）
において生成される突然変異体が株135−S4（NCTC 1182
2）である、特許請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項５】第二出発株が株HD 191であり、胞子形成不
能突然変異体が株191−A2（NCTC 11823）である、特許
請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項６】バチルス・スリンギエンシス株191−A2（N
CTC 11823）からバチルス・スリンギエンシス株135−S4
（NCTC 11822）中に株191−A2におけるデルタ−エンド
トキシン結晶合成をコードするプラスミドを移すことを
特徴とするバチルス・スリンギエンシスGC 91（NCTC 11
821）の製造方法。
【請求項７】株191−A2および135−S4が供に混合培養液
中に生育されて接合様プラスミド転移を行い、混合培養
液を稀釈し、固体培地に移して単一コロニーを得、株GC
91のコロニーを増大した大きさの副胞子結晶により選
択し、および株GC 91をそれから培養する、特許請求の
範囲第６項記載の方法。
【請求項８】バチルス・スリンギエンシス株GC 91（NCT
C 11821）或いはその誘導体または突然変異体或いはそ
の培養物を担体、稀釈剤、界面活性剤或いは適用促進ア
ジュバントと供に含んでなることを特徴とする殺昆虫剤
組成物。
【請求項９】肥料、微量養分供与体、植物成長調剤、殺
草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤および軟
体動物駆除剤、およびそれらの混合物から選択される生
物学的に活性な混合物を更に含む、特許請求の範囲第８
項記載の組成物。
【請求項１０】0.1〜99重量％のバチルス・スリンギエ
ンシスGC 91或いはその誘導体または突然変異体或いは
その培養物、１〜99.9重量％の固体または液体アジュバ
ント、および０〜25重量％の界面活性剤を含んでなる、
特許請求の範囲第８項記載の組成物。
【請求項１１】害虫或いはそれらの環境に殺昆虫的に有
効量のバチルス・スリンギエンシス株GC 91（NCTC 1182
1）或いはその誘導体または突然変異体、或いはその培
養物を適用することを特徴とする鱗翅類害虫の対抗方
法。