JPH08131172A - 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質ｂｃをコードしているｄｎａ - Google Patents
顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質ｂｃをコードしているｄｎａInfo
- Publication number
- JPH08131172A JPH08131172A JP6278841A JP27884194A JPH08131172A JP H08131172 A JPH08131172 A JP H08131172A JP 6278841 A JP6278841 A JP 6278841A JP 27884194 A JP27884194 A JP 27884194A JP H08131172 A JPH08131172 A JP H08131172A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- dna
- csf
- ligand
- domain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 108010054017 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 42
- 102100039622 Granulocyte colony-stimulating factor receptor Human genes 0.000 title claims abstract description 42
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 43
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 25
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims description 19
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 abstract description 33
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 abstract description 31
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 19
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 14
- 101000746363 Mus musculus Granulocyte colony-stimulating factor receptor Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 4
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 abstract description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 abstract 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 63
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 53
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 8
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 7
- 108010003384 Colony-Stimulating Factor Receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000004626 Colony-Stimulating Factor Receptors Human genes 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 4
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 3
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 3
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1 BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- CTAPSNCVKPOOSM-KKUMJFAQSA-N Arg-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O CTAPSNCVKPOOSM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- LGGHQRZIJSYRHA-GUBZILKMSA-N Asp-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CC(=O)O)N LGGHQRZIJSYRHA-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- ZUNMTUPRQMWMHX-LSJOCFKGSA-N Asp-Val-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZUNMTUPRQMWMHX-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- UVZFZTWNHOQWNK-NAKRPEOUSA-N Cys-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UVZFZTWNHOQWNK-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZSLYUUFFVHFRQ-FXQIFTODSA-N Gln-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RZSLYUUFFVHFRQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- DITJVHONFRJKJW-BPUTZDHNSA-N Gln-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N DITJVHONFRJKJW-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- DDXZHOHEABQXSE-NKIYYHGXSA-N Glu-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O DDXZHOHEABQXSE-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 2
- NZOAFWHVAFJERA-OALUTQOASA-N Gly-Phe-Trp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O NZOAFWHVAFJERA-OALUTQOASA-N 0.000 description 2
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- SVZFKLBRCYCIIY-CYDGBPFRSA-N Ile-Pro-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SVZFKLBRCYCIIY-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 2
- MGUTVMBNOMJLKC-VKOGCVSHSA-N Ile-Trp-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MGUTVMBNOMJLKC-VKOGCVSHSA-N 0.000 description 2
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- LOLUPZNNADDTAA-AVGNSLFASA-N Leu-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LOLUPZNNADDTAA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N Leu-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VHTIZYYHIUHMCA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- SQXZLVXQXWILKW-KKUMJFAQSA-N Lys-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQXZLVXQXWILKW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N Pro-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 MCWHYUWXVNRXFV-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 2
- QAAYIXYLEMRULP-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 QAAYIXYLEMRULP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N Pro-Thr-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RMJZWERKFFNNNS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- DSSOYPJWSWFOLK-CIUDSAMLSA-N Ser-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DSSOYPJWSWFOLK-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VXFXIBCCVLJCJT-JYJNAYRXSA-N Tyr-Pro-Pro Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VXFXIBCCVLJCJT-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- UXODSMTVPWXHBT-ULQDDVLXSA-N Val-Phe-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N UXODSMTVPWXHBT-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 2
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 2
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 108010014614 prolyl-glycyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- FYKDNWHPKQOZOT-UHFFFAOYSA-M sodium;dihydrogen phosphate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O FYKDNWHPKQOZOT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 2
- XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- WQVYAWIMAWTGMW-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N WQVYAWIMAWTGMW-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LJFNNUBZSZCZFN-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Cys Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O LJFNNUBZSZCZFN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N Ala-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N 0.000 description 1
- LBYMZCVBOKYZNS-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LBYMZCVBOKYZNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N Ala-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)N YHBDGLZYNIARKJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NZGRHTKZFSVPAN-BIIVOSGPSA-N Ala-Ser-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NZGRHTKZFSVPAN-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- UCDOXFBTMLKASE-HERUPUMHSA-N Ala-Ser-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N UCDOXFBTMLKASE-HERUPUMHSA-N 0.000 description 1
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- XTGGTAWGUFXJSV-NAKRPEOUSA-N Arg-Cys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N XTGGTAWGUFXJSV-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N Arg-Gly-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AUFHLLPVPSMEOG-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VENMDXUVHSKEIN-GUBZILKMSA-N Arg-Ser-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VENMDXUVHSKEIN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JKRPBTQDPJSQIT-RCWTZXSCSA-N Arg-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O JKRPBTQDPJSQIT-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- XYOVHPDDWCEUDY-CIUDSAMLSA-N Asn-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYOVHPDDWCEUDY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SPIPSJXLZVTXJL-ZLUOBGJFSA-N Asn-Cys-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SPIPSJXLZVTXJL-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- MYVBTYXSWILFCG-BQBZGAKWSA-N Asn-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MYVBTYXSWILFCG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AEZCCDMZZJOGII-DCAQKATOSA-N Asn-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AEZCCDMZZJOGII-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ULZOQOKFYMXHPZ-AQZXSJQPSA-N Asn-Trp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ULZOQOKFYMXHPZ-AQZXSJQPSA-N 0.000 description 1
- HAFCJCDJGIOYPW-WDSKDSINSA-N Asp-Gly-Gln Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HAFCJCDJGIOYPW-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SEMWSADZTMJELF-BYULHYEWSA-N Asp-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O SEMWSADZTMJELF-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- FAUPLTGRUBTXNU-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FAUPLTGRUBTXNU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DRCOAZZDQRCGGP-GHCJXIJMSA-N Asp-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DRCOAZZDQRCGGP-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- KBJVTFWQWXCYCQ-IUKAMOBKSA-N Asp-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KBJVTFWQWXCYCQ-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- KABHAOSDMIYXTR-GUBZILKMSA-N Cys-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N KABHAOSDMIYXTR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LBOLGUYQEPZSKM-YUMQZZPRSA-N Cys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)N LBOLGUYQEPZSKM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WKKKNGNJDGATNS-QEJZJMRPSA-N Cys-Trp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKKKNGNJDGATNS-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 description 1
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 description 1
- KVYVOGYEMPEXBT-GUBZILKMSA-N Gln-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O KVYVOGYEMPEXBT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TWTWUBHEWQPMQW-ZPFDUUQYSA-N Gln-Ile-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TWTWUBHEWQPMQW-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- IULKWYSYZSURJK-AVGNSLFASA-N Gln-Leu-Lys Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O IULKWYSYZSURJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LUGUNEGJNDEBLU-DCAQKATOSA-N Gln-Met-Arg Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LUGUNEGJNDEBLU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BZULIEARJFRINC-IHRRRGAJSA-N Gln-Phe-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N BZULIEARJFRINC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N Gln-Pro-Gly Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O FQCILXROGNOZON-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- PKYAVRMYTBBRLS-FXQIFTODSA-N Glu-Cys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PKYAVRMYTBBRLS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XHUCVVHRLNPZSZ-CIUDSAMLSA-N Glu-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XHUCVVHRLNPZSZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LZMQSTPFYJLVJB-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N LZMQSTPFYJLVJB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DCBSZJJHOTXMHY-DCAQKATOSA-N Glu-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DCBSZJJHOTXMHY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HMJULNMJWOZNFI-XHNCKOQMSA-N Glu-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O HMJULNMJWOZNFI-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- QEJKKJNDDDPSMU-KKUMJFAQSA-N Glu-Tyr-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O QEJKKJNDDDPSMU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BRFJMRSRMOMIMU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- SIYTVHWNKGIGMD-HOTGVXAUSA-N Gly-His-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)NC(=O)CN SIYTVHWNKGIGMD-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- TWTPDFFBLQEBOE-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O TWTPDFFBLQEBOE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WCORRBXVISTKQL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100022623 Hepatocyte growth factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 101710184069 Hepatocyte growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- JWTKVPMQCCRPQY-SRVKXCTJSA-N His-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O JWTKVPMQCCRPQY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UVUIXIVPKVMONA-CIUDSAMLSA-N His-Cys-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 UVUIXIVPKVMONA-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UPGJWSUYENXOPV-HGNGGELXSA-N His-Gln-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N UPGJWSUYENXOPV-HGNGGELXSA-N 0.000 description 1
- NELVFWFDOKRTOR-SDDRHHMPSA-N His-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O NELVFWFDOKRTOR-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- VJJSDSNFXCWCEJ-DJFWLOJKSA-N His-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VJJSDSNFXCWCEJ-DJFWLOJKSA-N 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000746364 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 108700039609 IRW peptide Proteins 0.000 description 1
- KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O KTGFOCFYOZQVRJ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- GQKSJYINYYWPMR-NGZCFLSTSA-N Ile-Gly-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N GQKSJYINYYWPMR-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N L-Leucyl-L-Arginyl-L-Proline Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCCC1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- FJUKMPUELVROGK-IHRRRGAJSA-N Leu-Arg-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N FJUKMPUELVROGK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N Leu-Arg-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(O)=O IBMVEYRWAWIOTN-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N FGNQZXKVAZIMCI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N Leu-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O IASQBRJGRVXNJI-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- AXZGZMGRBDQTEY-SRVKXCTJSA-N Leu-Gln-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O AXZGZMGRBDQTEY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N Leu-Gln-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KUEVMUXNILMJTK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DZQMXBALGUHGJT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N Leu-His-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- ORWTWZXGDBYVCP-BJDJZHNGSA-N Leu-Ile-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C ORWTWZXGDBYVCP-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPFOYSCDUWTZBF-IHPCNDPISA-N Leu-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 FPFOYSCDUWTZBF-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- NTEVEUCLFMWSND-SRVKXCTJSA-N Lys-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O NTEVEUCLFMWSND-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FACUGMGEFUEBTI-SRVKXCTJSA-N Lys-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FACUGMGEFUEBTI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HIIZIQUUHIXUJY-GUBZILKMSA-N Lys-Asp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O HIIZIQUUHIXUJY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZAENPHCEQXALHO-GUBZILKMSA-N Lys-Cys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZAENPHCEQXALHO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ITWQLSZTLBKWJM-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN ITWQLSZTLBKWJM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- OWRUUFUVXFREBD-KKUMJFAQSA-N Lys-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OWRUUFUVXFREBD-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SVSQSPICRKBMSZ-SRVKXCTJSA-N Lys-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O SVSQSPICRKBMSZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 101150028955 MBP gene Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- YNOVBMBQSQTLFM-DCAQKATOSA-N Met-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YNOVBMBQSQTLFM-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- TZHFJXDKXGZHEN-IHRRRGAJSA-N Met-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O TZHFJXDKXGZHEN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ZIIMORLEZLVRIP-SRVKXCTJSA-N Met-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZIIMORLEZLVRIP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PHURAEXVWLDIGT-LPEHRKFASA-N Met-Ser-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N PHURAEXVWLDIGT-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- KJJROSNFBRWPHS-JYJNAYRXSA-N Phe-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KJJROSNFBRWPHS-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- DVOCGBNHAUHKHJ-DKIMLUQUSA-N Phe-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DVOCGBNHAUHKHJ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N Phe-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- NGNNPLJHUFCOMZ-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Cys Chemical compound SC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NGNNPLJHUFCOMZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XUSDDSLCRPUKLP-QXEWZRGKSA-N Pro-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 XUSDDSLCRPUKLP-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- HJSCRFZVGXAGNG-SRVKXCTJSA-N Pro-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HJSCRFZVGXAGNG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LHALYDBUDCWMDY-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O LHALYDBUDCWMDY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FKLSMYYLJHYPHH-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FKLSMYYLJHYPHH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FYKUEXMZYFIZKA-DCAQKATOSA-N Pro-Pro-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FYKUEXMZYFIZKA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GXWRTSIVLSQACD-RCWTZXSCSA-N Pro-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)O GXWRTSIVLSQACD-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- GNFHQWNCSSPOBT-ULQDDVLXSA-N Pro-Trp-Gln Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O GNFHQWNCSSPOBT-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- FYXCBXDAMPEHIQ-FHWLQOOXSA-N Pro-Trp-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O FYXCBXDAMPEHIQ-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- PGSWNLRYYONGPE-JYJNAYRXSA-N Pro-Val-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O PGSWNLRYYONGPE-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N Ser-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NJSPTZXVPZDRCU-UBHSHLNASA-N Ser-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N NJSPTZXVPZDRCU-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N Ser-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N Ser-Pro-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BVLGVLWFIZFEAH-BPUTZDHNSA-N Ser-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O BVLGVLWFIZFEAH-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- XPVIVVLLLOFBRH-XIRDDKMYSA-N Ser-Trp-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(O)=O XPVIVVLLLOFBRH-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N Thr-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- UHBPFYOQQPFKQR-JHEQGTHGSA-N Thr-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O UHBPFYOQQPFKQR-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- KDGBLMDAPJTQIW-RHYQMDGZSA-N Thr-Met-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O KDGBLMDAPJTQIW-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N Thr-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WPSKTVVMQCXPRO-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N Thr-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VBMOVTMNHWPZJR-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- RWAYYYOZMHMEGD-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)=CNC2=C1 RWAYYYOZMHMEGD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- VDUJEEQMRQCLHB-YTQUADARSA-N Trp-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)O VDUJEEQMRQCLHB-YTQUADARSA-N 0.000 description 1
- GEGYPBOPIGNZIF-CWRNSKLLSA-N Trp-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)O GEGYPBOPIGNZIF-CWRNSKLLSA-N 0.000 description 1
- HTGJDTPQYFMKNC-VFAJRCTISA-N Trp-Thr-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)[C@@H](C)O)=CNC2=C1 HTGJDTPQYFMKNC-VFAJRCTISA-N 0.000 description 1
- RYSNTWVRSLCAJZ-RYUDHWBXSA-N Tyr-Gln-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RYSNTWVRSLCAJZ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- SBLZVFCEOCWRLS-BPNCWPANSA-N Tyr-Met-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N SBLZVFCEOCWRLS-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- XDGPTBVOSHKDFT-KKUMJFAQSA-N Tyr-Met-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XDGPTBVOSHKDFT-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N Val-Ala-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN RUCNAYOMFXRIKJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BGXVHVMJZCSOCA-AVGNSLFASA-N Val-Pro-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BGXVHVMJZCSOCA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- KRAHMIJVUPUOTQ-DCAQKATOSA-N Val-Ser-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N KRAHMIJVUPUOTQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N Val-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010056582 methionylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- FDPIMTJIUBPUKL-UHFFFAOYSA-N pentan-3-one Chemical compound CCC(=O)CC FDPIMTJIUBPUKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010071207 serylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｇ−ＣＳＦと結合活性を有する蛋白質の製
造。 【構成】 Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域のＢＣ
ドメインの蛋白質をコードしているＤＮＡ断片、該ＤＮ
Ａ断片を大腸菌遺伝子発現系の制御下に含有している組
換え体プラスミッドおよび該プラスミッドを用いて大腸
菌内でＧ−ＣＳＦと結合活性を有する蛋白質を製造する
方法。 【効果】 Ｇ−ＣＳＦ受容体とリガンドとの相互作用に
関連する疾患の研究、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異常、
例えば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治療ま
たは予防に有用である。
造。 【構成】 Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域のＢＣ
ドメインの蛋白質をコードしているＤＮＡ断片、該ＤＮ
Ａ断片を大腸菌遺伝子発現系の制御下に含有している組
換え体プラスミッドおよび該プラスミッドを用いて大腸
菌内でＧ−ＣＳＦと結合活性を有する蛋白質を製造する
方法。 【効果】 Ｇ−ＣＳＦ受容体とリガンドとの相互作用に
関連する疾患の研究、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異常、
例えば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治療ま
たは予防に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は顆粒球コロニー刺激因子
受容体（以下、Ｇ−ＣＳＦ受容体と呼称）の細胞質外領
域の内、リガンド結合領域の蛋白質（即ちＧ−ＣＳＦ結
合領域蛋白質）、さらに詳しくは、そのＣ末端側ドメイ
ンの蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発
現ベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、
及び該形質転換体を適当な培地で培養し、培養物から生
成物を回収することからなる、組換え蛋白質の製造方法
に関するものである。
受容体（以下、Ｇ−ＣＳＦ受容体と呼称）の細胞質外領
域の内、リガンド結合領域の蛋白質（即ちＧ−ＣＳＦ結
合領域蛋白質）、さらに詳しくは、そのＣ末端側ドメイ
ンの蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発
現ベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、
及び該形質転換体を適当な培地で培養し、培養物から生
成物を回収することからなる、組換え蛋白質の製造方法
に関するものである。
【０００２】
【従来技術】顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)は血
液細胞の増殖と分化に関与するコロニー刺激因子の１員
であり好中性顆粒球の増殖および分化に重要な役割を担
っている。この因子は、血液中の好中球濃度の制御、並
びに成熟好中球の賦活化に深く関与していることが分か
っている。例えば、Ｇ−ＣＳＦは好中球の前駆細胞等の
受容体(Ｇ−ＣＳＦ受容体)を介して該細胞に作用し、そ
の増殖、あるいは分化を刺激して主に好中性顆粒球を与
える。また、Ｇ−ＣＳＦには好中球の調節因子としての
作用や、臨床面では、がん患者の化学療法および骨髄移
植療法における有用性も示唆されている。他方、骨髄性
白血病細胞などのがん細胞の増殖を刺激する場合がある
ことも分かっている。Ｇ−ＣＳＦの作用する細胞は好中
球の前駆体および成熟した好中球、および種々の骨髄性
白血病細胞に限定されているのに対して、Ｇ−ＣＳＦ受
容体は非血液細胞、例えばヒト内皮細胞および胎盤にも
存在しており、これらのリガンド、つまりＧ−ＣＳＦと
Ｇ−ＣＳＦ受容体との複合体形成反応の機構を解明する
ことは、関連する疾患や異常の研究、治療または予防に
有効である。例えば、骨髄性白血病細胞などのがん細胞
がＧ−ＣＳＦにより増殖することが示唆されているが、
それをＧ−ＣＳＦ受容体に拮抗する物質で阻止すること
が可能である。既に、マウスおよびヒト由来のＧ−ＣＳ
Ｆ受容体をコードするＤＮＡはクローニングされ、配列
が明らかにされている［福永ら、Ｃell,６１ ３４１−
３５０(１９９０)；Ｐroc．Ｎatl．Ａcad,Ｓci．ＵＳ
Ａ．８７ ８７０２−８７０６；；ＷＯ９１／１４７７
６（１９９１年１０月３日公開］。福永らは、また、Ｇ
−ＣＳＦ受容体の発現に成功したことを報告しているが
（Cell,前掲，；Proc. Natl. Acad, Sci. ＵＳＡ. 前
掲，；ＥＭＢＯ Ｊ．１０ ２８５５−２８６５(１９
９１)）いずれも相補ＤＮＡの全配列を動物細胞を用い
て発現させたものであり、その発現量は極めて低く、需
要を満たすだけのＧ−ＣＳＦ受容体の製造には最適でな
く、構造解析、反応機構の研究も十分に行うことができ
なかった。
液細胞の増殖と分化に関与するコロニー刺激因子の１員
であり好中性顆粒球の増殖および分化に重要な役割を担
っている。この因子は、血液中の好中球濃度の制御、並
びに成熟好中球の賦活化に深く関与していることが分か
っている。例えば、Ｇ−ＣＳＦは好中球の前駆細胞等の
受容体(Ｇ−ＣＳＦ受容体)を介して該細胞に作用し、そ
の増殖、あるいは分化を刺激して主に好中性顆粒球を与
える。また、Ｇ−ＣＳＦには好中球の調節因子としての
作用や、臨床面では、がん患者の化学療法および骨髄移
植療法における有用性も示唆されている。他方、骨髄性
白血病細胞などのがん細胞の増殖を刺激する場合がある
ことも分かっている。Ｇ−ＣＳＦの作用する細胞は好中
球の前駆体および成熟した好中球、および種々の骨髄性
白血病細胞に限定されているのに対して、Ｇ−ＣＳＦ受
容体は非血液細胞、例えばヒト内皮細胞および胎盤にも
存在しており、これらのリガンド、つまりＧ−ＣＳＦと
Ｇ−ＣＳＦ受容体との複合体形成反応の機構を解明する
ことは、関連する疾患や異常の研究、治療または予防に
有効である。例えば、骨髄性白血病細胞などのがん細胞
がＧ−ＣＳＦにより増殖することが示唆されているが、
それをＧ−ＣＳＦ受容体に拮抗する物質で阻止すること
が可能である。既に、マウスおよびヒト由来のＧ−ＣＳ
Ｆ受容体をコードするＤＮＡはクローニングされ、配列
が明らかにされている［福永ら、Ｃell,６１ ３４１−
３５０(１９９０)；Ｐroc．Ｎatl．Ａcad,Ｓci．ＵＳ
Ａ．８７ ８７０２−８７０６；；ＷＯ９１／１４７７
６（１９９１年１０月３日公開］。福永らは、また、Ｇ
−ＣＳＦ受容体の発現に成功したことを報告しているが
（Cell,前掲，；Proc. Natl. Acad, Sci. ＵＳＡ. 前
掲，；ＥＭＢＯ Ｊ．１０ ２８５５−２８６５(１９
９１)）いずれも相補ＤＮＡの全配列を動物細胞を用い
て発現させたものであり、その発現量は極めて低く、需
要を満たすだけのＧ−ＣＳＦ受容体の製造には最適でな
く、構造解析、反応機構の研究も十分に行うことができ
なかった。
【０００３】
【発明が解決すべき課題】本発明者らは、上記の様々な
目的を達成するためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体の全分子を
用いる必要はなく、むしろ、Ｇ−ＣＳＦとの結合に最も
重要な役割を果す領域、即ちリガンド結合領域の蛋白質
が有用であることに着目し、そのような蛋白質の有効な
製造方法を確立するために研究を重ねてきた。本発明の
目的に有用なリガンド結合領域蛋白質のアミノ酸配列
は、上記文献により、ヒトおよびマウス等に関して既知
である。即ち、福永らはＧ−ＣＳＦ受容体をコードする
ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）をクローニングし、この受容体
はイムノグロブリン様領域、サイトカイン受容体相補領
域（以下ＣＲＨ領域と略す)、フィブロネクチンタイプ
ＩＩＩ領域からなることを示した（Ｃell、前掲；Ｐro
c.Ｎatl.Ａcad,Ｓci.ＵＳＡ.前掲)。
目的を達成するためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体の全分子を
用いる必要はなく、むしろ、Ｇ−ＣＳＦとの結合に最も
重要な役割を果す領域、即ちリガンド結合領域の蛋白質
が有用であることに着目し、そのような蛋白質の有効な
製造方法を確立するために研究を重ねてきた。本発明の
目的に有用なリガンド結合領域蛋白質のアミノ酸配列
は、上記文献により、ヒトおよびマウス等に関して既知
である。即ち、福永らはＧ−ＣＳＦ受容体をコードする
ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）をクローニングし、この受容体
はイムノグロブリン様領域、サイトカイン受容体相補領
域（以下ＣＲＨ領域と略す)、フィブロネクチンタイプ
ＩＩＩ領域からなることを示した（Ｃell、前掲；Ｐro
c.Ｎatl.Ａcad,Ｓci.ＵＳＡ.前掲)。
【０００４】ＣＲＨ領域とは、インターロイキン２−
７、エリスロポイエチン、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ
さらにインターフェロンα,β,γなどのサイトカイン系
受容体の細胞質外領域に見られる約２００アミン酸から
なる相補性領域で、これらの受容体のリガンド結合部位
と考えられている。このことから、これらの受容体はサ
イトカイン受容体ファミリーと呼ばれている［バザン
(Ｂazan Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci(１９９０)６９３４−
６９３８]。事実、Ｇ−ＣＳＦ受容体でもこのＣＲＨ領
域が必須であり、現在のところこのＣＲＨ領域がこのフ
ァミリーのリガンド結合、およびシグナル伝達のために
必要な１つのユニットと考えられている。このＣＲＨ領
域はさらにアミノ末端側ドメイン（以下ＢＮドメインと
略す）およびＣ末端側ドメイン（以下ＢＣドメインと略
す）の２つの部分からなり、ＢＮドメインを欠失させる
と、活性能が完全に失われる。このことは、リガンド結
合にはＢＮドメインが最も重要な役割を果たしているこ
とを示唆しているが、ＢＮドメインのみで活性が保持さ
れるか否かは未だ明瞭でなく、例えば成長ホルモンやイ
ンターロイキン６受容体の場合には、ＢＣドメインも必
要と考えられている。以上の結果は、本発明におけるリ
ガンド結合領域蛋白質として、ＢＣドメイン部分の蛋白
質もリガンド結合活性に関与する可能性を有するもので
あり、これらの課題を解決するためには、ＢＣドメイン
の蛋白質を大量に製造する必要がある。
７、エリスロポイエチン、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ
さらにインターフェロンα,β,γなどのサイトカイン系
受容体の細胞質外領域に見られる約２００アミン酸から
なる相補性領域で、これらの受容体のリガンド結合部位
と考えられている。このことから、これらの受容体はサ
イトカイン受容体ファミリーと呼ばれている［バザン
(Ｂazan Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci(１９９０)６９３４−
６９３８]。事実、Ｇ−ＣＳＦ受容体でもこのＣＲＨ領
域が必須であり、現在のところこのＣＲＨ領域がこのフ
ァミリーのリガンド結合、およびシグナル伝達のために
必要な１つのユニットと考えられている。このＣＲＨ領
域はさらにアミノ末端側ドメイン（以下ＢＮドメインと
略す）およびＣ末端側ドメイン（以下ＢＣドメインと略
す）の２つの部分からなり、ＢＮドメインを欠失させる
と、活性能が完全に失われる。このことは、リガンド結
合にはＢＮドメインが最も重要な役割を果たしているこ
とを示唆しているが、ＢＮドメインのみで活性が保持さ
れるか否かは未だ明瞭でなく、例えば成長ホルモンやイ
ンターロイキン６受容体の場合には、ＢＣドメインも必
要と考えられている。以上の結果は、本発明におけるリ
ガンド結合領域蛋白質として、ＢＣドメイン部分の蛋白
質もリガンド結合活性に関与する可能性を有するもので
あり、これらの課題を解決するためには、ＢＣドメイン
の蛋白質を大量に製造する必要がある。
【０００５】そのような活性を有する蛋白質（例、リガ
ンド結合領域蛋白質）の産生に大腸菌を用いることが出
来れば、その産生量の高さ、取り扱いの容易さ、および
変異体作成の有利さなどから、極めて好都合であり、意
義深い。従来、サイトカイン受容体のリガンド結合部位
（ＣＲＨ）の大腸菌での発現は非常に困難と考えられて
いた。その理由として、この結合部位は、多くのシステ
イン残基やプロリン残基を含み、容易にフォールデイン
グをしないことが挙げられていた。例外的にヒト成長ホ
ルモン受容体の場合には発現に成功しているが、その成
功の理由の一つは、ヒト成長ホルモン受容体では、同様
の他の受容体に比較してシステイン残基の含量が低いこ
とにあると考えられる。例えば、同じサイトカイン受容
体ファミリーでもエリスロポイエチン［ハリスら(Ｈarr
is),Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.(１９９２)１５２０５−１５２０
９］やインターフェロンγ［フォントラキスら(Ｆounto
ulakis),Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.(１９９０)１３２６８−１３
２７５］の受容体の場合、大腸菌で発現された産生物の
ほとんどが菌体内で不溶化されている。これらの受容体
の発現が困難である他の理由として、これら受容体が、
多くの複雑なドメインの複合によって成立していること
がある。Ｇ−ＣＳＦ受容体も、前述のように、ＣＲＨ領
域、イムノグロブリン様領域、フィブロネクチン様領域
からなる複雑な構成を示している。上記のヒト成長ホル
モン受容体の場合は細胞質外領域がＣＲＨ領域のみから
なっており、これもヒト成長ホルモン受容体の発現の成
功のもう一つの原因として考えられる。しかしながら、
この成長ホルモン受容体のＣＲＨ領域もＢＮドメインと
ＢＣドメイン領域からなっており、決して単純な構成を
有するとは断言できない。現に、前述のインターフェロ
ンγ、エリスロポイエチンはその細胞質外ドメインはほ
とんどＣＲＨ領域のみからなっているが、発現させると
その大部分は不溶化される。
ンド結合領域蛋白質）の産生に大腸菌を用いることが出
来れば、その産生量の高さ、取り扱いの容易さ、および
変異体作成の有利さなどから、極めて好都合であり、意
義深い。従来、サイトカイン受容体のリガンド結合部位
（ＣＲＨ）の大腸菌での発現は非常に困難と考えられて
いた。その理由として、この結合部位は、多くのシステ
イン残基やプロリン残基を含み、容易にフォールデイン
グをしないことが挙げられていた。例外的にヒト成長ホ
ルモン受容体の場合には発現に成功しているが、その成
功の理由の一つは、ヒト成長ホルモン受容体では、同様
の他の受容体に比較してシステイン残基の含量が低いこ
とにあると考えられる。例えば、同じサイトカイン受容
体ファミリーでもエリスロポイエチン［ハリスら(Ｈarr
is),Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.(１９９２)１５２０５−１５２０
９］やインターフェロンγ［フォントラキスら(Ｆounto
ulakis),Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.(１９９０)１３２６８−１３
２７５］の受容体の場合、大腸菌で発現された産生物の
ほとんどが菌体内で不溶化されている。これらの受容体
の発現が困難である他の理由として、これら受容体が、
多くの複雑なドメインの複合によって成立していること
がある。Ｇ−ＣＳＦ受容体も、前述のように、ＣＲＨ領
域、イムノグロブリン様領域、フィブロネクチン様領域
からなる複雑な構成を示している。上記のヒト成長ホル
モン受容体の場合は細胞質外領域がＣＲＨ領域のみから
なっており、これもヒト成長ホルモン受容体の発現の成
功のもう一つの原因として考えられる。しかしながら、
この成長ホルモン受容体のＣＲＨ領域もＢＮドメインと
ＢＣドメイン領域からなっており、決して単純な構成を
有するとは断言できない。現に、前述のインターフェロ
ンγ、エリスロポイエチンはその細胞質外ドメインはほ
とんどＣＲＨ領域のみからなっているが、発現させると
その大部分は不溶化される。
【０００６】ところで、シグナル伝達にはＢＣドメイン
も含めたＣＲＨ領域全体が必要である(前掲福永らＥＭ
ＢＯ.Ｊ.１０ ２８５５−２８６５(１９９１))、しかも
ＢＣドメインも結合活性を保持している可能性がある。
即ち約１００アミノ酸残基のＢＣドメインのみでも、天
然とほぼ同じ構造を維持してフォールドさせ、発現させ
ることが出来れば、従来、発現が困難であったＧ−ＣＳ
Ｆ受容体を始め、様々なサイトカイン受容体の機能的な
ドメインを大量に取り出すことが可能となる。次いで、
発現産物のリガンド結合活性を調べ、この部分のリガン
ド結合への寄与の程度を明確にすることができる。この
ようにして、小分子量のリガンド結合活性を有する蛋白
質を大量に得ることが可能となる。そのような小分子量
のリガンド結合蛋白質は、Ｘ線やＮＭＲの高次構造解析
において著しく有利である。上記の理由から、本発明で
開示する、Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域、特に
ＢＣドメインの蛋白質のＤＮＡ組換え法による製造は、
従来困難であった他の受容体のリガンド結合領域蛋白質
の製造への途をも開くものである。
も含めたＣＲＨ領域全体が必要である(前掲福永らＥＭ
ＢＯ.Ｊ.１０ ２８５５−２８６５(１９９１))、しかも
ＢＣドメインも結合活性を保持している可能性がある。
即ち約１００アミノ酸残基のＢＣドメインのみでも、天
然とほぼ同じ構造を維持してフォールドさせ、発現させ
ることが出来れば、従来、発現が困難であったＧ−ＣＳ
Ｆ受容体を始め、様々なサイトカイン受容体の機能的な
ドメインを大量に取り出すことが可能となる。次いで、
発現産物のリガンド結合活性を調べ、この部分のリガン
ド結合への寄与の程度を明確にすることができる。この
ようにして、小分子量のリガンド結合活性を有する蛋白
質を大量に得ることが可能となる。そのような小分子量
のリガンド結合蛋白質は、Ｘ線やＮＭＲの高次構造解析
において著しく有利である。上記の理由から、本発明で
開示する、Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域、特に
ＢＣドメインの蛋白質のＤＮＡ組換え法による製造は、
従来困難であった他の受容体のリガンド結合領域蛋白質
の製造への途をも開くものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、Ｇ−ＣＳＦ受
容体のリガンド結合領域蛋白質の組換え法による製造に
有用なＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該発
現ベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞および該形
質転換体を用いてＧ−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質を製
造する方法を提供するものである。本発明方法により製
造されたＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質
は、後述するように、天然のＧ−ＣＳＦ受容体とほぼ同
様な、特異的なＧ−ＣＳＦ結合活性を示した。従って、
該蛋白質は、Ｇ−ＣＳＦ受容体とリガンドとの相互作用
に関連する疾患の研究や治療に有用であり、臨床的に投
与した場合には、生体内のＧ−ＣＳＦ受容体に対する拮
抗作用を通して、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異常、例え
ば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治療または
予防にも有用である。さらに、本発明のリガンド結合領
域蛋白質は、ＢＣドメインとして約１００アミノ酸から
なる小分子量蛋白質であるために、以下の利点を有す
る。即ち、体内に投与した場合に抗体の生成させる可能
性が低く、治療目的に応じて適当なキャリアー蛋白質と
結合させる等、応用範囲が広い。しかも、Ｘ線やＮＭＲ
による高次構造の解析にも有利である。
容体のリガンド結合領域蛋白質の組換え法による製造に
有用なＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該発
現ベクターで形質転換された大腸菌宿主細胞および該形
質転換体を用いてＧ−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質を製
造する方法を提供するものである。本発明方法により製
造されたＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質
は、後述するように、天然のＧ−ＣＳＦ受容体とほぼ同
様な、特異的なＧ−ＣＳＦ結合活性を示した。従って、
該蛋白質は、Ｇ−ＣＳＦ受容体とリガンドとの相互作用
に関連する疾患の研究や治療に有用であり、臨床的に投
与した場合には、生体内のＧ−ＣＳＦ受容体に対する拮
抗作用を通して、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異常、例え
ば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治療または
予防にも有用である。さらに、本発明のリガンド結合領
域蛋白質は、ＢＣドメインとして約１００アミノ酸から
なる小分子量蛋白質であるために、以下の利点を有す
る。即ち、体内に投与した場合に抗体の生成させる可能
性が低く、治療目的に応じて適当なキャリアー蛋白質と
結合させる等、応用範囲が広い。しかも、Ｘ線やＮＭＲ
による高次構造の解析にも有利である。
【０００８】また、本発明のＧ−ＣＳＦ受容体結合領域
蛋白質は、ペプチドライブラリーなどを用いてのペプチ
ド性のＧ−ＣＳＦのアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング、非ペプチド性のＧ−ＣＳＦのアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニングを可能にす
る。また、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合の研究
（その立体構造の解析など）を飛躍的に発展させ、ひい
てはその解析結果より理論的な設計によってもＧ−ＣＳ
Ｆのアゴニスト、アンタゴニストの合成を可能にするも
のである。現在、Ｇ−ＣＳＦは、その骨髄性白血病細胞
の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進作用に基き、放射線
治療や抗ガン剤治療を受けたガン患者での白血球減少を
回復するための治療剤として有用性が期待されている
が、上記のＧ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニスト
は、それら白血球減少患者の治療において、Ｇ−ＣＳＦ
と同等またはそれ以上の効果を発揮し得ると予想され
る。
蛋白質は、ペプチドライブラリーなどを用いてのペプチ
ド性のＧ−ＣＳＦのアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング、非ペプチド性のＧ−ＣＳＦのアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニングを可能にす
る。また、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合の研究
（その立体構造の解析など）を飛躍的に発展させ、ひい
てはその解析結果より理論的な設計によってもＧ−ＣＳ
Ｆのアゴニスト、アンタゴニストの合成を可能にするも
のである。現在、Ｇ−ＣＳＦは、その骨髄性白血病細胞
の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進作用に基き、放射線
治療や抗ガン剤治療を受けたガン患者での白血球減少を
回復するための治療剤として有用性が期待されている
が、上記のＧ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニスト
は、それら白血球減少患者の治療において、Ｇ−ＣＳＦ
と同等またはそれ以上の効果を発揮し得ると予想され
る。
【０００９】本発明の目的に従い、本明細書で用いる語
句を以下に定義する。本発明において、Ｇ−ＣＳＦ受容
体という語句はヒトを含む天然のあらゆる哺乳動物起源
のＧ−ＣＳＦ受容体を意味すると共に、遺伝子操作によ
って作られるそれら天然のＧ−ＣＳＦ受容体の変異体も
含むものとする。Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
蛋白質とは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ−ＣＳＦとの結
合に関与する領域を構成する蛋白質を指す。該蛋白質
は、Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域、中でもそのＢＣド
メインを構成するアミノ酸配列を有する。発明の目的に
とっては、天然のアミノ酸配列を有するリガンド結合領
域蛋白質のみならず、当業者既知の方法で１またはそれ
以上のアミノ酸の変化によって得られる、同様の活性を
有する誘導体も有用である。従って、本明細書中、単
に、リガンド結合領域蛋白質と言うときは、天然のアミ
ノ酸配列を有する蛋白質のみならず、その誘導体（上記
の意味での変異体）をも包含するものとする。ＢＣ、ｍ
ＢＣ（マウス由来ＢＣ）とは、上記の定義に従うＧ−Ｃ
ＳＦ受容体のリガンド結合領域を意味するが、本明細書
では特記しない限り、該領域のタンパク質、およびその
誘導体をも表す。Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
蛋白質をコードするＤＮＡとは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の
内、Ｇ−ＣＳＦとの結合に関与する領域を構成するアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを指す。該ＤＮＡは、Ｇ−
ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域、中でもＢＣドメインを構成
するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するもので
ある。上記の蛋白質に関する定義と同様に、該ＤＮＡは
天然のリガンド結合領域蛋白質をコードするもののみな
らず、当業者既知の方法で得られた該蛋白質の誘導体を
コードするＤＮＡをも包含する。ＤＮＡは、相補ＤＮ
Ａ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
句を以下に定義する。本発明において、Ｇ−ＣＳＦ受容
体という語句はヒトを含む天然のあらゆる哺乳動物起源
のＧ−ＣＳＦ受容体を意味すると共に、遺伝子操作によ
って作られるそれら天然のＧ−ＣＳＦ受容体の変異体も
含むものとする。Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
蛋白質とは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ−ＣＳＦとの結
合に関与する領域を構成する蛋白質を指す。該蛋白質
は、Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域、中でもそのＢＣド
メインを構成するアミノ酸配列を有する。発明の目的に
とっては、天然のアミノ酸配列を有するリガンド結合領
域蛋白質のみならず、当業者既知の方法で１またはそれ
以上のアミノ酸の変化によって得られる、同様の活性を
有する誘導体も有用である。従って、本明細書中、単
に、リガンド結合領域蛋白質と言うときは、天然のアミ
ノ酸配列を有する蛋白質のみならず、その誘導体（上記
の意味での変異体）をも包含するものとする。ＢＣ、ｍ
ＢＣ（マウス由来ＢＣ）とは、上記の定義に従うＧ−Ｃ
ＳＦ受容体のリガンド結合領域を意味するが、本明細書
では特記しない限り、該領域のタンパク質、およびその
誘導体をも表す。Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
蛋白質をコードするＤＮＡとは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の
内、Ｇ−ＣＳＦとの結合に関与する領域を構成するアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを指す。該ＤＮＡは、Ｇ−
ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域、中でもＢＣドメインを構成
するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するもので
ある。上記の蛋白質に関する定義と同様に、該ＤＮＡは
天然のリガンド結合領域蛋白質をコードするもののみな
らず、当業者既知の方法で得られた該蛋白質の誘導体を
コードするＤＮＡをも包含する。ＤＮＡは、相補ＤＮ
Ａ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
【００１０】Ｇ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域とは、サイ
トカイン受容体相補領域を指し、該領域のアミノ酸配列
はマウス［配列表の配列番号１；福永ら,Ｃell ６１,３
４１−３５０(１９９０)］およびヒト［配列表の配列番
号２；福永ら,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad,Ｓci.ＵＳＡ.８７,８
７０２−８７０６(１９９０)］について既知である。本
明細書では、マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＣ部分に対応
する領域の相補ＤＮＡを用いてリガンド結合領域蛋白質
の発現を示したが、合成ＤＮＡでもよい。当業者ならば
容易に理解するように、コドンの異なるＤＮＡであって
も、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードする限り、
本発明の範囲に含まれる。また、ヒト由来のものであっ
てもよく、実施例の記載に限定されない。
トカイン受容体相補領域を指し、該領域のアミノ酸配列
はマウス［配列表の配列番号１；福永ら,Ｃell ６１,３
４１−３５０(１９９０)］およびヒト［配列表の配列番
号２；福永ら,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad,Ｓci.ＵＳＡ.８７,８
７０２−８７０６(１９９０)］について既知である。本
明細書では、マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＣ部分に対応
する領域の相補ＤＮＡを用いてリガンド結合領域蛋白質
の発現を示したが、合成ＤＮＡでもよい。当業者ならば
容易に理解するように、コドンの異なるＤＮＡであって
も、本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードする限り、
本発明の範囲に含まれる。また、ヒト由来のものであっ
てもよく、実施例の記載に限定されない。
【００１１】配列番号１に記載のアミノ酸配列をコード
している相補ＤＮＡはプラスミッドpＢＬＪ１７［福永
ら,Ｃell,６１,３４１−３５０(１９９０)］に組み込ま
れている。このプラスミッドｐＢＬＪ１７はＦＥＲＭ
ＢＰ−３３１２（寄託日平成２年３月９日）の下で通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる、Escherichia coli K12から入手可能である。Ｇ−
ＣＳＦ受容体のＢＣドメインとは、既述のごとく、Ｇ−
ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域を２分した場合、Ｃ末端側領
域であり、Ｇ−ＣＳＦ受容体のジェノミックＤＮＡ（ge
nomic ＤＮＡ）のエクソン７と８［セタら(Ｓeta),Ｊ.
Ｉmmunol.１４８,２５９−２６６(１９９２)］に対応す
る領域である。これは、具体的には上記の福永らの開示
した配列において、マウスＧ−ＣＳＦ受容体では、２０
３番目のロイシンから３０８番目のリジンに至る部分を
指す（配列番号１においては、それぞれ１０７番目のロ
イシンと２１２番目のリジンに相当する)。同様に、ヒ
トＧ−ＣＳＦ受容体では、２０４番目のロイシンから３
０９番目のアルギニン（配列番号２ではそれぞれ１０７
番目のロイシンと２１２番目のアルギニンに相当する）
に至る領域とされている。しかしながら、ＢＣドメイン
の開始部位および終了部位は必ずしも、本発明にとって
厳密でなく、該ＢＣドメイン全体の立体構造に大きな影
響を与えることはない。その機能が保持されることを条
件として、Ｎ末端および／またはＣ末端が、数残基いず
れかの方向にずれたもの、あるいは、Ｎ末端および／ま
たはＣ末端に数残基のアミノ酸が付加したものも包含さ
れる。通常、このような一次構造上の僅かな差異は該Ｂ
Ｃドメイン全体の立体構造に大きな影響を与えず、機能
は保たれると考えられる。実際に、後述する実施例で
は、マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＣドメインをコードす
るＤＮＡ断片を用いた。このＤＮＡ断片はグリシン−セ
リンから始まり、元の配列における２０３番目のロイシ
ンを経てＣ末端では、３０８番目のリジンに至るアミノ
酸配列をコードしている（配列番号３)。
している相補ＤＮＡはプラスミッドpＢＬＪ１７［福永
ら,Ｃell,６１,３４１−３５０(１９９０)］に組み込ま
れている。このプラスミッドｐＢＬＪ１７はＦＥＲＭ
ＢＰ−３３１２（寄託日平成２年３月９日）の下で通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる、Escherichia coli K12から入手可能である。Ｇ−
ＣＳＦ受容体のＢＣドメインとは、既述のごとく、Ｇ−
ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域を２分した場合、Ｃ末端側領
域であり、Ｇ−ＣＳＦ受容体のジェノミックＤＮＡ（ge
nomic ＤＮＡ）のエクソン７と８［セタら(Ｓeta),Ｊ.
Ｉmmunol.１４８,２５９−２６６(１９９２)］に対応す
る領域である。これは、具体的には上記の福永らの開示
した配列において、マウスＧ−ＣＳＦ受容体では、２０
３番目のロイシンから３０８番目のリジンに至る部分を
指す（配列番号１においては、それぞれ１０７番目のロ
イシンと２１２番目のリジンに相当する)。同様に、ヒ
トＧ−ＣＳＦ受容体では、２０４番目のロイシンから３
０９番目のアルギニン（配列番号２ではそれぞれ１０７
番目のロイシンと２１２番目のアルギニンに相当する）
に至る領域とされている。しかしながら、ＢＣドメイン
の開始部位および終了部位は必ずしも、本発明にとって
厳密でなく、該ＢＣドメイン全体の立体構造に大きな影
響を与えることはない。その機能が保持されることを条
件として、Ｎ末端および／またはＣ末端が、数残基いず
れかの方向にずれたもの、あるいは、Ｎ末端および／ま
たはＣ末端に数残基のアミノ酸が付加したものも包含さ
れる。通常、このような一次構造上の僅かな差異は該Ｂ
Ｃドメイン全体の立体構造に大きな影響を与えず、機能
は保たれると考えられる。実際に、後述する実施例で
は、マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＣドメインをコードす
るＤＮＡ断片を用いた。このＤＮＡ断片はグリシン−セ
リンから始まり、元の配列における２０３番目のロイシ
ンを経てＣ末端では、３０８番目のリジンに至るアミノ
酸配列をコードしている（配列番号３)。
【００１２】さらに、本発明のリガンド結合領域蛋白質
をコードするＤＮＡの配列を用い、当業者周知の方法で
１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置
換により修飾することにより、該ＤＮＡがコードするリ
ガンド結合領域蛋白質を構成するアミノ酸やペプチドを
修飾し、天然のリガンド結合領域蛋白質と同等またはそ
れ以上の望ましい生物学的特性を有する、ヒト由来の、
あるいはその他の哺乳動物由来の、改良されたリガンド
結合蛋白質を製造することができる。望ましい性質とは
個々の目的により異なるが、高いＧ−ＣＳＦとの結合活
性、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合を阻害する活
性等が含まれる。従って、そのような方法で改変された
ＤＮＡも本発明の範囲に包含される。本発明はまた、Ｇ
−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質の製造方法を提供するも
のである。そのような蛋白質の製造は、本発明のＤＮＡ
を適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主
細胞を形質転換し、形質転換体を培養することにより行
うことができる。
をコードするＤＮＡの配列を用い、当業者周知の方法で
１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置
換により修飾することにより、該ＤＮＡがコードするリ
ガンド結合領域蛋白質を構成するアミノ酸やペプチドを
修飾し、天然のリガンド結合領域蛋白質と同等またはそ
れ以上の望ましい生物学的特性を有する、ヒト由来の、
あるいはその他の哺乳動物由来の、改良されたリガンド
結合蛋白質を製造することができる。望ましい性質とは
個々の目的により異なるが、高いＧ−ＣＳＦとの結合活
性、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合を阻害する活
性等が含まれる。従って、そのような方法で改変された
ＤＮＡも本発明の範囲に包含される。本発明はまた、Ｇ
−ＣＳＦ受容体結合領域蛋白質の製造方法を提供するも
のである。そのような蛋白質の製造は、本発明のＤＮＡ
を適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主
細胞を形質転換し、形質転換体を培養することにより行
うことができる。
【００１３】本発明のＧ−ＣＳＦレセプターの発現に
は、例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ.セレビ
シエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用い
られる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例
えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な
宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等
は、当業者に既知であり、それらの内から本発明のＧ−
ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードするＤ
ＮＡの発現に適した系を任意に選択することができる。
しかしながら、本発明の目的には、上記の理由から、大
腸菌が好ましい。本明細書の実施例では、まず、リガン
ド結合領域蛋白質としてマウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＣ
ドメイン（以下、ｍＢＣと称する）蛋白質をコードする
ＤＮＡを用いた。該ｍＢＣドメインのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡは既知のプラスミッドpＢＬＪ１７から
ＰＣＲ法によって得ることができる。また、ＤＮＡ合成
法によっても得ることができる。
は、例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ.セレビ
シエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用い
られる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例
えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な
宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等
は、当業者に既知であり、それらの内から本発明のＧ−
ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードするＤ
ＮＡの発現に適した系を任意に選択することができる。
しかしながら、本発明の目的には、上記の理由から、大
腸菌が好ましい。本明細書の実施例では、まず、リガン
ド結合領域蛋白質としてマウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＣ
ドメイン（以下、ｍＢＣと称する）蛋白質をコードする
ＤＮＡを用いた。該ｍＢＣドメインのアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡは既知のプラスミッドpＢＬＪ１７から
ＰＣＲ法によって得ることができる。また、ＤＮＡ合成
法によっても得ることができる。
【００１４】mＢＣをコードするＤＮＡを大腸菌宿主中
で発現させるためには、あらかじめ、このＤＮＡを大腸
菌の遺伝子発現系に連結しておく必要がある。大腸菌の
発現系についてはすでに多くの成書があり、それらに従
って操作すればよい。即ち、大腸菌を用いる遺伝子操作
法は、当該技術分野で既知の文献［マニアティスら（Ｍ
aniatis)，(１９８２),Ｍoleular Ｃloning：Ａ Ｌabor
atory Ｍanual,ＣoldＳpring Ｈarbor Ｌaboratory］を
初めとして、近年出版された多くの実験書に詳述されて
いる。また蛋白質の精製などの基本的な方法も生化学実
験講座（日本生化学編,東京化学同人）などの多くの成
書に詳述されている。本発明方法はこれら文献既知の方
法を用いて行うことができるが、以下に、簡単に説明す
る。
で発現させるためには、あらかじめ、このＤＮＡを大腸
菌の遺伝子発現系に連結しておく必要がある。大腸菌の
発現系についてはすでに多くの成書があり、それらに従
って操作すればよい。即ち、大腸菌を用いる遺伝子操作
法は、当該技術分野で既知の文献［マニアティスら（Ｍ
aniatis)，(１９８２),Ｍoleular Ｃloning：Ａ Ｌabor
atory Ｍanual,ＣoldＳpring Ｈarbor Ｌaboratory］を
初めとして、近年出版された多くの実験書に詳述されて
いる。また蛋白質の精製などの基本的な方法も生化学実
験講座（日本生化学編,東京化学同人）などの多くの成
書に詳述されている。本発明方法はこれら文献既知の方
法を用いて行うことができるが、以下に、簡単に説明す
る。
【００１５】ｍＢＣドメインは、ポリメラーゼチェイン
リアクション法（以下ＰＣＲ法と略す）によって取り出
すことができる。次いで、上記のＢＣドメイン遺伝子を
大腸菌由来の発現プラスミッドに挿入する（図１）。大
腸菌由来の遺伝子発現系としては、それ自身の菌体内で
機能している遺伝子のプロモーター活性と翻訳能とを持
つＤＮＡ断片由来のものが多い。このようなものとして
は、トリプトファン遺伝子、ラクトース遺伝子、アルカ
リ性ホスファターゼ遺伝子、さらには、トリプトファン
遺伝子とラクトース遺伝子のハイブリッドであるtac遺
伝子などがある［中原,松原(１９８６),日本生化学会
編,“遺伝子工学研究法ＩＩ",１〜１７２,東京化学同
人］。通常は、これらのＤＮＡ断片を目的物の遺伝子の
前に連結させることによって、該遺伝子を発現させる。
通常、発現には菌体内発現と分泌発現の２種類があり、
各々について適当な発現系が存在する。
リアクション法（以下ＰＣＲ法と略す）によって取り出
すことができる。次いで、上記のＢＣドメイン遺伝子を
大腸菌由来の発現プラスミッドに挿入する（図１）。大
腸菌由来の遺伝子発現系としては、それ自身の菌体内で
機能している遺伝子のプロモーター活性と翻訳能とを持
つＤＮＡ断片由来のものが多い。このようなものとして
は、トリプトファン遺伝子、ラクトース遺伝子、アルカ
リ性ホスファターゼ遺伝子、さらには、トリプトファン
遺伝子とラクトース遺伝子のハイブリッドであるtac遺
伝子などがある［中原,松原(１９８６),日本生化学会
編,“遺伝子工学研究法ＩＩ",１〜１７２,東京化学同
人］。通常は、これらのＤＮＡ断片を目的物の遺伝子の
前に連結させることによって、該遺伝子を発現させる。
通常、発現には菌体内発現と分泌発現の２種類があり、
各々について適当な発現系が存在する。
【００１６】目的物が本来、細胞外に分泌される蛋白質
である場合には、目的物の遺伝子のＮ末端に大腸菌由来
の分泌蛋白質のシグナル配列の遺伝子を連結させて、発
現生成物がペリプラスムに分泌されるように発現系を構
築することが多い。また、目的物質を他の蛋白質との融
合蛋白質として発現させるために、後者をコードする遺
伝子の直後に、目的物質の遺伝子を連結させる方法が一
般的に用いられる。融合させる蛋白質としては大腸菌内
でよく発現するものなどから選択される。本発明のリガ
ンド結合領域蛋白質と融合させ得る蛋白質としては、β
−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼやマルトース結
合蛋白質（ＭＢＰ）などを挙げることができる。これら
の蛋白質は、大腸菌の発現制御下では非常によく発現す
るので、融合蛋白質としての発現も極めて良好である場
合が多い。融合蛋白質から目的蛋白質を分離する方法も
既知である。例えば目的物にメチオニンが含まれていな
い場合には、臭化シアン処理を行う。それ以外の場合に
は、例えば融合蛋白質の各々の遺伝子の連結部分に制限
プロテアーゼファクターＸaの認識配列を入れておき、
制限プロテアーゼファクターＸaによる切り出しを可能
にするなどの手法が用いられる。
である場合には、目的物の遺伝子のＮ末端に大腸菌由来
の分泌蛋白質のシグナル配列の遺伝子を連結させて、発
現生成物がペリプラスムに分泌されるように発現系を構
築することが多い。また、目的物質を他の蛋白質との融
合蛋白質として発現させるために、後者をコードする遺
伝子の直後に、目的物質の遺伝子を連結させる方法が一
般的に用いられる。融合させる蛋白質としては大腸菌内
でよく発現するものなどから選択される。本発明のリガ
ンド結合領域蛋白質と融合させ得る蛋白質としては、β
−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼやマルトース結
合蛋白質（ＭＢＰ）などを挙げることができる。これら
の蛋白質は、大腸菌の発現制御下では非常によく発現す
るので、融合蛋白質としての発現も極めて良好である場
合が多い。融合蛋白質から目的蛋白質を分離する方法も
既知である。例えば目的物にメチオニンが含まれていな
い場合には、臭化シアン処理を行う。それ以外の場合に
は、例えば融合蛋白質の各々の遺伝子の連結部分に制限
プロテアーゼファクターＸaの認識配列を入れておき、
制限プロテアーゼファクターＸaによる切り出しを可能
にするなどの手法が用いられる。
【００１７】後述の実施例では、mＢＣドメインをＭＢ
Ｐに融合させ、融合蛋白質として発現させた。この態様
では、発現プロモーターとして、ＩＰＴＧの添加によっ
て誘導がかかるtacプロモーターを用いている。ＭＢＰ
のＮ末端にはそのシグナル配列が付加されているので、
発現生成物はペリプラスムに蓄積される。細胞のペリプ
ラスムに蓄積した融合蛋白質を抽出し、疎水クロマト、
Ｓ−セファロース、Ｑ−セファロース、ファクターＸa
による目的ペプチドの切り出し、さらにＳ−セファロー
スの使用からなる一連の操作によって、目的とするＢＣ
ドメインを単一物質にまで精製することができる。これ
らの一連の方法は単なる例示にすぎず、当業者既知の他
の精製系を用いても、目的物質は得ることができる。
Ｐに融合させ、融合蛋白質として発現させた。この態様
では、発現プロモーターとして、ＩＰＴＧの添加によっ
て誘導がかかるtacプロモーターを用いている。ＭＢＰ
のＮ末端にはそのシグナル配列が付加されているので、
発現生成物はペリプラスムに蓄積される。細胞のペリプ
ラスムに蓄積した融合蛋白質を抽出し、疎水クロマト、
Ｓ−セファロース、Ｑ−セファロース、ファクターＸa
による目的ペプチドの切り出し、さらにＳ−セファロー
スの使用からなる一連の操作によって、目的とするＢＣ
ドメインを単一物質にまで精製することができる。これ
らの一連の方法は単なる例示にすぎず、当業者既知の他
の精製系を用いても、目的物質は得ることができる。
【００１８】本発明の１つの実施態様として、大腸菌内
でよく発現するＭＢＰとの融合蛋白質として発現するよ
う、ＭＢＰをコードするＤＮＡの下流にＢＮドメイン遺
伝子を挿入した。ＭＢＰ遺伝子の上流には、そのための
シグナル配列に対応する部分が含まれており、産生され
た融合蛋白質は、細胞質からペリプラスム画分に分泌発
現される。従って、上記発現プラスミッドで大腸菌宿主
を形質転換し、得られた形質転換体を培養すると、目的
の蛋白質を含む融合蛋白質が宿主菌体のペリプラスムに
蓄積された。次いで、融合蛋白質をオスモティックショ
ックにより抽出・精製し、マルトース結合蛋白質から切
り離すことにより、目的の蛋白質を得た。上記の方法に
より、天然のアミノ酸配列を有するｍＢＣ蛋白質を得る
ことができたが、１またはそれ以上のアミノ酸の変異
（欠失、挿入または置換）を有する該ｍＢＣの変異体も
同様にして大腸菌に発現させることができる。そのよう
な変異は、リガンド結合活性の改善、インビボの安定性
等を改善することを目的とする。
でよく発現するＭＢＰとの融合蛋白質として発現するよ
う、ＭＢＰをコードするＤＮＡの下流にＢＮドメイン遺
伝子を挿入した。ＭＢＰ遺伝子の上流には、そのための
シグナル配列に対応する部分が含まれており、産生され
た融合蛋白質は、細胞質からペリプラスム画分に分泌発
現される。従って、上記発現プラスミッドで大腸菌宿主
を形質転換し、得られた形質転換体を培養すると、目的
の蛋白質を含む融合蛋白質が宿主菌体のペリプラスムに
蓄積された。次いで、融合蛋白質をオスモティックショ
ックにより抽出・精製し、マルトース結合蛋白質から切
り離すことにより、目的の蛋白質を得た。上記の方法に
より、天然のアミノ酸配列を有するｍＢＣ蛋白質を得る
ことができたが、１またはそれ以上のアミノ酸の変異
（欠失、挿入または置換）を有する該ｍＢＣの変異体も
同様にして大腸菌に発現させることができる。そのよう
な変異は、リガンド結合活性の改善、インビボの安定性
等を改善することを目的とする。
【００１９】即ち、本発明は、好ましくは、大腸菌遺伝
子発現系の制御下にＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合部
位蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現プラスミ
ッド、および該発現プラスミッドによって形質転換され
た形質転換体を提供する。さらに本発明は、該形質転換
体を用いるリガンド結合部位蛋白質の製造方法、並びに
該製造方法によって得られるリガンド結合部位蛋白質を
提供する。リガンド結合部位蛋白質はｍＢＣドメイン蛋
白質を含有する。本発明法により大腸菌を宿主として生
産されたmＢＣドメインの生理活性を、リガンドへの結
合能を指標として測定したところ、mＢＣドメインのリ
ガンドへの結合能が認められた。この結果は、本発明方
法で得られた組換えリガンド結合領域（mＢＣドメイ
ン）蛋白質が、Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合活性を
保持しており、生理学的に活性であって、臨床面での有
用性を有すると同時に、立体構造解析などのＧ−ＣＳＦ
受容体の研究の飛躍的な発展をもたらし得ることを示す
ものである。
子発現系の制御下にＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合部
位蛋白質をコードするＤＮＡを組み込んだ発現プラスミ
ッド、および該発現プラスミッドによって形質転換され
た形質転換体を提供する。さらに本発明は、該形質転換
体を用いるリガンド結合部位蛋白質の製造方法、並びに
該製造方法によって得られるリガンド結合部位蛋白質を
提供する。リガンド結合部位蛋白質はｍＢＣドメイン蛋
白質を含有する。本発明法により大腸菌を宿主として生
産されたmＢＣドメインの生理活性を、リガンドへの結
合能を指標として測定したところ、mＢＣドメインのリ
ガンドへの結合能が認められた。この結果は、本発明方
法で得られた組換えリガンド結合領域（mＢＣドメイ
ン）蛋白質が、Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合活性を
保持しており、生理学的に活性であって、臨床面での有
用性を有すると同時に、立体構造解析などのＧ−ＣＳＦ
受容体の研究の飛躍的な発展をもたらし得ることを示す
ものである。
【００２０】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明する。実施例１ マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＣドメイン蛋白
質をコードするＤＮＡの調製および大腸菌発現ベクター
pＭＡＬp−mＢＣの構築 公知のマウスＧ−ＣＳＦ受容体のアミノ酸配列［福永
ら,Ｃell ６１,３４１−３５０(１９９０)］を基に、そ
のＢＣ−ドメイン（ｍＢＣドメイン）蛋白質をコードす
るＤＮＡを配列番号３で示すように設計した。このＤＮ
Ａ断片の調製に際しては、マウスのＧ−ＣＳＦ受容体の
２０３番ロイシンから３０８番リジンをコードすると共
に、その部分をＭＢＰとの融合蛋白質として発現させ、
発現された融合蛋白質から所望のｍＢＣドメイン蛋白質
を単離、精製することができるよう、ＭＢＰをコードす
るベクターに挿入可能な形に設計した。即ち、ＭＢＰと
mＢＣの間にファクターＸaの認識部位であるＩle−Ｇlu
−Ｇly−Ａrgをコードする配列がさらにＮ末端側に挿入
されるよう設計した。従って、ＭＢＰと融合した形で発
現したmＢＣは、制限プロテアーゼファクターＸaによる
切断によってＭＢＰから切り離される。配列番号３に示
すＤＮＡ断片では、ファクターＸaの作用をより効率的
にするために、２０３番チロシンのＮ末端側にグリシン
−セリンをコードする配列であるＧＧＴＴＣＴも付加さ
れている。またＣ末端には終結コドンＴＡＡをさらに付
加した。その上にＤＮＡ断片をpＭＡＬTMpのＢamＨＩと
ＸbaＩ部位に連結すべく、該ＤＮＡのＮ末端側とＣ末端
側をさらに延長して、その延長部にＢamＨＩとＸbaＩ認
識部位を形成した。
説明する。実施例１ マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＢＣドメイン蛋白
質をコードするＤＮＡの調製および大腸菌発現ベクター
pＭＡＬp−mＢＣの構築 公知のマウスＧ−ＣＳＦ受容体のアミノ酸配列［福永
ら,Ｃell ６１,３４１−３５０(１９９０)］を基に、そ
のＢＣ−ドメイン（ｍＢＣドメイン）蛋白質をコードす
るＤＮＡを配列番号３で示すように設計した。このＤＮ
Ａ断片の調製に際しては、マウスのＧ−ＣＳＦ受容体の
２０３番ロイシンから３０８番リジンをコードすると共
に、その部分をＭＢＰとの融合蛋白質として発現させ、
発現された融合蛋白質から所望のｍＢＣドメイン蛋白質
を単離、精製することができるよう、ＭＢＰをコードす
るベクターに挿入可能な形に設計した。即ち、ＭＢＰと
mＢＣの間にファクターＸaの認識部位であるＩle−Ｇlu
−Ｇly−Ａrgをコードする配列がさらにＮ末端側に挿入
されるよう設計した。従って、ＭＢＰと融合した形で発
現したmＢＣは、制限プロテアーゼファクターＸaによる
切断によってＭＢＰから切り離される。配列番号３に示
すＤＮＡ断片では、ファクターＸaの作用をより効率的
にするために、２０３番チロシンのＮ末端側にグリシン
−セリンをコードする配列であるＧＧＴＴＣＴも付加さ
れている。またＣ末端には終結コドンＴＡＡをさらに付
加した。その上にＤＮＡ断片をpＭＡＬTMpのＢamＨＩと
ＸbaＩ部位に連結すべく、該ＤＮＡのＮ末端側とＣ末端
側をさらに延長して、その延長部にＢamＨＩとＸbaＩ認
識部位を形成した。
【００２１】上記ＤＮＡ断片の実際の調製にはＰＣＲを
使った。具体的には、まず、それぞれ配列番号４及び配
列番号５に記載の塩基配列を有するＮ−末端プライマー
及びＣ−末端プライマーをアプライド・バイオシステム
社の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製する。次い
で、２μＭのＮ−末端プライマー、２μＭのＣ−末端プ
ライマー、pＢＬＪ１７ＤＮＡ（１ng)、１０×反応緩衝
液１０μl、各０.２５mＭのdＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴ
Ｐ、dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡポリメラーゼ０.５μlを
加えて最終の量を１００μlとする。ここで１０×反応
緩衝液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ、ＴaqＤ
ＮＡポリメラーゼは宝酒造のＧeneＡmpのキットのもの
を使用した。この反応液をＤＮＡサーマルサイクラー
（型式ＰＪ２０００,宝酒造）にセットし、９４℃，１
分間熱処理；３７℃２分間アニーリング；７２℃，３分
間反応のサイクルプログラムで２５回反応を繰り返すこ
とにより目的のＤＮＡ断片を合成する。さらに、上記Ｐ
ＣＲ反応液をフェノール処理することにより精製する。
その精製ＤＮＡのうち約１μgを、０.１Ｍ食塩及び１０
mＭ塩化マグネシウムを含む５０mＭトリス塩酸緩衝液
（pＨ７.５）５０μl及び制限酵素ＢamＨＩ（宝酒造）
と制限酵素ＸbaＩ（宝酒造）５単位ずつを加えて共に３
７℃で１時間インキュベートしてＤＮＡを消化する。こ
の消化液をフェノール処理及びエタノール沈澱した後、
１％アガロースゲルの電気泳動にかけ、約０.３kbpのバ
ンドを切り出し、スプレック−０１（宝酒造）に入れ、
−８０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキ
ュベートして融解する。これを５０００回転で１０分間
遠心して、その濾液を回収する。フェノール処理及びエ
タノール沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を
取り出す。
使った。具体的には、まず、それぞれ配列番号４及び配
列番号５に記載の塩基配列を有するＮ−末端プライマー
及びＣ−末端プライマーをアプライド・バイオシステム
社の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製する。次い
で、２μＭのＮ−末端プライマー、２μＭのＣ−末端プ
ライマー、pＢＬＪ１７ＤＮＡ（１ng)、１０×反応緩衝
液１０μl、各０.２５mＭのdＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴ
Ｐ、dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡポリメラーゼ０.５μlを
加えて最終の量を１００μlとする。ここで１０×反応
緩衝液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ、ＴaqＤ
ＮＡポリメラーゼは宝酒造のＧeneＡmpのキットのもの
を使用した。この反応液をＤＮＡサーマルサイクラー
（型式ＰＪ２０００,宝酒造）にセットし、９４℃，１
分間熱処理；３７℃２分間アニーリング；７２℃，３分
間反応のサイクルプログラムで２５回反応を繰り返すこ
とにより目的のＤＮＡ断片を合成する。さらに、上記Ｐ
ＣＲ反応液をフェノール処理することにより精製する。
その精製ＤＮＡのうち約１μgを、０.１Ｍ食塩及び１０
mＭ塩化マグネシウムを含む５０mＭトリス塩酸緩衝液
（pＨ７.５）５０μl及び制限酵素ＢamＨＩ（宝酒造）
と制限酵素ＸbaＩ（宝酒造）５単位ずつを加えて共に３
７℃で１時間インキュベートしてＤＮＡを消化する。こ
の消化液をフェノール処理及びエタノール沈澱した後、
１％アガロースゲルの電気泳動にかけ、約０.３kbpのバ
ンドを切り出し、スプレック−０１（宝酒造）に入れ、
−８０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキ
ュベートして融解する。これを５０００回転で１０分間
遠心して、その濾液を回収する。フェノール処理及びエ
タノール沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を
取り出す。
【００２２】続いて、上記ＤＮＡ断片を、pＭＡＬTMp
（ニューイングランドバイオラボ社から購入可能）のＭ
ＢＰの下流に凍結された制限プロテアーゼファクターＸ
aの認識配列Ｉle−Ｇlu−Ｇly−ＡrgのＮ末端とＣ末端
側に存在するＢamＨＩ部位と、ＸbaＩ部位の間に挿入す
る（図１)。
（ニューイングランドバイオラボ社から購入可能）のＭ
ＢＰの下流に凍結された制限プロテアーゼファクターＸ
aの認識配列Ｉle−Ｇlu−Ｇly−ＡrgのＮ末端とＣ末端
側に存在するＢamＨＩ部位と、ＸbaＩ部位の間に挿入す
る（図１)。
【００２３】具体的には、約１μgのpＭＡＬTMp ＤＮ
Ａを０.１Ｍ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む１
０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ７.５）５０μlに溶解し、
さらにそれぞれ５単位の制限酵素ＢamＨＩとＸbaＩを加
えて、３７℃で１時間インキュベートすることにより、
加えたＤＮＡを消化する。次に、１％アガロースゲルの
電気泳動にかけて大きい方のＤＮＡ断片に相当するバン
ドを切り出し、スプレック−０１（宝酒造）に入れ、−
８０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュ
ベートして融解する。これを５０００回転で１０分間遠
心して、その濾液を回収する。フェノール処理及びエタ
ノール沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取
り出す。続いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混合
し、１mＭのＥＤＴＡを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液
（pＨ７.４）を加えて４μlとする。
Ａを０.１Ｍ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む１
０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ７.５）５０μlに溶解し、
さらにそれぞれ５単位の制限酵素ＢamＨＩとＸbaＩを加
えて、３７℃で１時間インキュベートすることにより、
加えたＤＮＡを消化する。次に、１％アガロースゲルの
電気泳動にかけて大きい方のＤＮＡ断片に相当するバン
ドを切り出し、スプレック−０１（宝酒造）に入れ、−
８０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュ
ベートして融解する。これを５０００回転で１０分間遠
心して、その濾液を回収する。フェノール処理及びエタ
ノール沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取
り出す。続いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混合
し、１mＭのＥＤＴＡを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液
（pＨ７.４）を加えて４μlとする。
【００２４】これを１６μlのＡ液(ＤＮＡライゲーショ
ンキット;宝酒造)及び４μlのＢ液(ＤＮＡライゲーショ
ンキット;宝酒造)と混合し、１６℃で３０分間反応させ
る。さらに、これを１００μlの大腸菌Ｋ１２株コンピ
テントセルと混合し、０℃で３０分間、さらに４２℃で
２分間インキュベートすることで大腸菌へ移入し、発現
プラスミッドpＭＡＬp−mＢＣを構築した。このプラス
ミッドを導入した大腸菌Ｋ１２株／pＭＡＬp−mＢＣは
通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる（受託日：平成６年１０月２５日；受託番号：ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４６０２)。
ンキット;宝酒造)及び４μlのＢ液(ＤＮＡライゲーショ
ンキット;宝酒造)と混合し、１６℃で３０分間反応させ
る。さらに、これを１００μlの大腸菌Ｋ１２株コンピ
テントセルと混合し、０℃で３０分間、さらに４２℃で
２分間インキュベートすることで大腸菌へ移入し、発現
プラスミッドpＭＡＬp−mＢＣを構築した。このプラス
ミッドを導入した大腸菌Ｋ１２株／pＭＡＬp−mＢＣは
通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる（受託日：平成６年１０月２５日；受託番号：ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４６０２)。
【００２５】実施例２ プラスミッドｐＭＡＬｐ−ｍＢ
Ｃで形質転換された大腸菌によるｍＢＣの製造 ごく少量の消泡剤を添加した、バクトトリプトン(ディ
フコ)１０ｇ、イーストエキス(ディフコ)５ｇ、食塩５
ｇ、１００μg／mlアンピシリンおよび０．２％グルコ
ースを含む培地１リットルに上記形質変換体を接種し、
２３℃でミッドログフェーズ（Ａ６００＝約０．９)ま
で増殖させる。それにＩＰＴＧ(シグマ社)を最終濃度が
０．２mＭになるように添加する。続いて、約２時間培
養後、菌体を集める。集めた菌体は１００mlの２０％シ
ョ糖、２μg／mlアプロチニン、１μg／mlペプスタチン
Ａ、５μg／mlロイペプチンを含む３０mＭトリス緩衝液
pＨ７．５に懸濁して室温で１０分間保温する。続いて
再び集菌し、今度は５０mlの２μg／mlアプロチニン、
１μg／mlペプスタチンＡ、５μg／mlロイペプチンを含
む５mＭ硫酸マグネシウムに懸濁して０℃で１０分間保
温する。これを８,０００回転の遠心で除いた後、上清
を集めてペリプラスム画分とする。
Ｃで形質転換された大腸菌によるｍＢＣの製造 ごく少量の消泡剤を添加した、バクトトリプトン(ディ
フコ)１０ｇ、イーストエキス(ディフコ)５ｇ、食塩５
ｇ、１００μg／mlアンピシリンおよび０．２％グルコ
ースを含む培地１リットルに上記形質変換体を接種し、
２３℃でミッドログフェーズ（Ａ６００＝約０．９)ま
で増殖させる。それにＩＰＴＧ(シグマ社)を最終濃度が
０．２mＭになるように添加する。続いて、約２時間培
養後、菌体を集める。集めた菌体は１００mlの２０％シ
ョ糖、２μg／mlアプロチニン、１μg／mlペプスタチン
Ａ、５μg／mlロイペプチンを含む３０mＭトリス緩衝液
pＨ７．５に懸濁して室温で１０分間保温する。続いて
再び集菌し、今度は５０mlの２μg／mlアプロチニン、
１μg／mlペプスタチンＡ、５μg／mlロイペプチンを含
む５mＭ硫酸マグネシウムに懸濁して０℃で１０分間保
温する。これを８,０００回転の遠心で除いた後、上清
を集めてペリプラスム画分とする。
【００２６】ペリプラズム画分（２００ml）は２０mＭ
になるようにリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を
加えた後、固形硫酸アンモニウム（２２.８ｇ）を加え
て２０％飽和とする。これを疎水クロマト（３０ml；Ｔ
ＳＫ gel Ｂutyl-Ｔoyopearl６５０Ｍ；ＴＯＳＯＨ）に
３ml/minの流速で添加する。つぎにミキサーとしてＡ液
［２０％飽和硫酸アンモニウムを含む２０mＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（pＨ６.０)］、リザービアとしてＢ液
（1mＭリン酸ナトリウム緩衝液）を準備して、流速1.５
ml/minで２０分間、Ａ液→Ｂ液の硫酸アンモニウムの濃
度勾配で目的物を溶出する。さらに１２０分間Ｂ液で展
開を続ける。ＭＢＰとＢＣが融合した形態の目的とする
蛋白質は、２８０nmの吸光度で追跡すると、大部分の蛋
白質がカラムを素通りした後に、硫酸アンモニウムの濃
度を下げるに伴いピークとして溶出される。ＳＤＳを含
む１５％のポリアクリルアミド電気泳動で約５４キロダ
ルトンの分子量を示すことで確認することができる。
になるようにリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を
加えた後、固形硫酸アンモニウム（２２.８ｇ）を加え
て２０％飽和とする。これを疎水クロマト（３０ml；Ｔ
ＳＫ gel Ｂutyl-Ｔoyopearl６５０Ｍ；ＴＯＳＯＨ）に
３ml/minの流速で添加する。つぎにミキサーとしてＡ液
［２０％飽和硫酸アンモニウムを含む２０mＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（pＨ６.０)］、リザービアとしてＢ液
（1mＭリン酸ナトリウム緩衝液）を準備して、流速1.５
ml/minで２０分間、Ａ液→Ｂ液の硫酸アンモニウムの濃
度勾配で目的物を溶出する。さらに１２０分間Ｂ液で展
開を続ける。ＭＢＰとＢＣが融合した形態の目的とする
蛋白質は、２８０nmの吸光度で追跡すると、大部分の蛋
白質がカラムを素通りした後に、硫酸アンモニウムの濃
度を下げるに伴いピークとして溶出される。ＳＤＳを含
む１５％のポリアクリルアミド電気泳動で約５４キロダ
ルトンの分子量を示すことで確認することができる。
【００２７】目的物は、回収後２０ｍＭのリン酸ナトリ
ウムクエン酸緩衝液（ｐＨ５.５）に対して一晩透析す
る。次に、この透析物を２０mlのＳ−セファロース（Ｓ
−ＳepharoseＦＦ；Ｐharmacia）に、１.５ml/minの速
度で添加する。溶出は、０Ｍから０.４Ｍの食塩の濃度
勾配（全体１２０ml；流速１ml/min）で行う。目的物を
ポリアクリルアミド電気泳動で確認して、回収し、２０
mＭのリン酸ナトリウム（pＨ６.０）に対して透析す
る。これを同緩衝液で平衡化した１０mlのＱ−セファロ
ース（Ｑ−ＳepharoseＦＦ；Ｐharmacia）に添加し、０
Ｍから０.４Ｍの食塩の濃度勾配（全体２４０ml；流速
１ml/min)で溶出する。目的物は１５％のポリアクリル
アミドゲル電気泳動で約１２キロダルトンの分子量を示
すことで確認出来る。目的物の画分は回収して食塩濃度
を最終的に０.１Ｍにした後、最終濃度５μg/mlになる
ように、プロテアーゼファクターＸa（ニューイングラ
ンドバイオラボ社）を添加して１６℃で４日間反応させ
る。これによりmＢＣがＭＢＰから切り放される。
ウムクエン酸緩衝液（ｐＨ５.５）に対して一晩透析す
る。次に、この透析物を２０mlのＳ−セファロース（Ｓ
−ＳepharoseＦＦ；Ｐharmacia）に、１.５ml/minの速
度で添加する。溶出は、０Ｍから０.４Ｍの食塩の濃度
勾配（全体１２０ml；流速１ml/min）で行う。目的物を
ポリアクリルアミド電気泳動で確認して、回収し、２０
mＭのリン酸ナトリウム（pＨ６.０）に対して透析す
る。これを同緩衝液で平衡化した１０mlのＱ−セファロ
ース（Ｑ−ＳepharoseＦＦ；Ｐharmacia）に添加し、０
Ｍから０.４Ｍの食塩の濃度勾配（全体２４０ml；流速
１ml/min)で溶出する。目的物は１５％のポリアクリル
アミドゲル電気泳動で約１２キロダルトンの分子量を示
すことで確認出来る。目的物の画分は回収して食塩濃度
を最終的に０.１Ｍにした後、最終濃度５μg/mlになる
ように、プロテアーゼファクターＸa（ニューイングラ
ンドバイオラボ社）を添加して１６℃で４日間反応させ
る。これによりmＢＣがＭＢＰから切り放される。
【００２８】次いで、得られた画分を５倍量の２０mＭ
リン酸ナトリウムクエン酸緩衝液（ｐＨ５.５）で希釈
し、同緩衝液で平衡化したＳ−セファロース（５ml；Ｓ
−Ｓepharoseバイオラッドプレパックカラム）に１ml/m
inの流速で添加する。溶出は０Ｍ−０.４Ｍの食塩の濃
度勾配（全体３０ml；流速０.５ml/min）で行う。これ
により目的物は単一な標品に精製される。最終的に１ｌ
の培養からおよそ０.７mgの精製蛋白質が抽出される。
リン酸ナトリウムクエン酸緩衝液（ｐＨ５.５）で希釈
し、同緩衝液で平衡化したＳ−セファロース（５ml；Ｓ
−Ｓepharoseバイオラッドプレパックカラム）に１ml/m
inの流速で添加する。溶出は０Ｍ−０.４Ｍの食塩の濃
度勾配（全体３０ml；流速０.５ml/min）で行う。これ
により目的物は単一な標品に精製される。最終的に１ｌ
の培養からおよそ０.７mgの精製蛋白質が抽出される。
【００２９】実施例３ 組換えｍＢＣのリガンドとの結
合活性 実施例２で単一にまで精製したmＢＣの生理活性を下記
の方法により、リガンドであるＧ−ＣＳＦとの結合能を
指標として測定した。mＢＣと125Ｉで放射能標識したＧ
−ＣＳＦとを混合してmＢＣとＧ−ＣＳＦの複合体を形
成させる。形成された複合体に架橋剤を添加して固定し
た後、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で
展開し、ゲル上のバンドとして分離する。バンドの観察
は、ゲルをイメージングプレートで顕出することにより
行う。この時、放射能標識したＧ−ＣＳＦに非標識のＧ
−ＣＳＦを添加し、標識Ｇ−ＣＳＦの結合を非標識のそ
れと競争させることにより、ｍＢＣとＧ−ＣＳＦの複合
体の解離定数を測定することができる。実施例２で調製
した０.５μＭのmＢＣドメイン、１.２mＭ125Ｉ−ヒト
Ｇ−ＣＳＦ（１００,０００cpm、アムシャム社）および
様々な濃度の非標識ヒトＧ−ＣＳＦ（１０-5−１０-10
Ｍ;キリン株式会社より供与）の混合物を、０.００５％
ツイーン２０を含む０.１Ｍ酢酸緩衝液pＨ７.０中、最
終液量５０μlとして室温で９０分間保温する。次い
で、０.５μlのジメチルスルホキシドに溶解した０.１
Ｍジチオビスサクシニミジルプロピオーネ（ピアスケミ
カル社）を加え、０℃で３０分間保温する。５μlの２
Ｍトリス塩酸緩衝液を加えて反応を止める。続いて、反
応混合物をＳＤＳを含む１５％のポリアクリルアミド電
気泳動にかける。泳動後、ゲルをフジイメージィングプ
レート(アナライズ用、タイプＢＡ;（株）富士写真フィ
ルム）に感光させ、イメージアナライザー（バイオ・イ
メージアナライザーＢＡ１００；富士写真フィルム）で
解析すると、生成したmＢＣとＧ−ＣＳＦの複合体は、
ゲル上の３０キロダルトンのバンドとして顕出した。こ
の複合体の解離定数は、非標識Ｇ−ＣＳＦを加えて行っ
た実験における値との比較より、約４０nＭと測定され
た（図２)。この結果はＢＣドメインもＢＮドメイン同
様にリガンド結合活性を有することを示すものである。
合活性 実施例２で単一にまで精製したmＢＣの生理活性を下記
の方法により、リガンドであるＧ−ＣＳＦとの結合能を
指標として測定した。mＢＣと125Ｉで放射能標識したＧ
−ＣＳＦとを混合してmＢＣとＧ−ＣＳＦの複合体を形
成させる。形成された複合体に架橋剤を添加して固定し
た後、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で
展開し、ゲル上のバンドとして分離する。バンドの観察
は、ゲルをイメージングプレートで顕出することにより
行う。この時、放射能標識したＧ−ＣＳＦに非標識のＧ
−ＣＳＦを添加し、標識Ｇ−ＣＳＦの結合を非標識のそ
れと競争させることにより、ｍＢＣとＧ−ＣＳＦの複合
体の解離定数を測定することができる。実施例２で調製
した０.５μＭのmＢＣドメイン、１.２mＭ125Ｉ−ヒト
Ｇ−ＣＳＦ（１００,０００cpm、アムシャム社）および
様々な濃度の非標識ヒトＧ−ＣＳＦ（１０-5−１０-10
Ｍ;キリン株式会社より供与）の混合物を、０.００５％
ツイーン２０を含む０.１Ｍ酢酸緩衝液pＨ７.０中、最
終液量５０μlとして室温で９０分間保温する。次い
で、０.５μlのジメチルスルホキシドに溶解した０.１
Ｍジチオビスサクシニミジルプロピオーネ（ピアスケミ
カル社）を加え、０℃で３０分間保温する。５μlの２
Ｍトリス塩酸緩衝液を加えて反応を止める。続いて、反
応混合物をＳＤＳを含む１５％のポリアクリルアミド電
気泳動にかける。泳動後、ゲルをフジイメージィングプ
レート(アナライズ用、タイプＢＡ;（株）富士写真フィ
ルム）に感光させ、イメージアナライザー（バイオ・イ
メージアナライザーＢＡ１００；富士写真フィルム）で
解析すると、生成したmＢＣとＧ−ＣＳＦの複合体は、
ゲル上の３０キロダルトンのバンドとして顕出した。こ
の複合体の解離定数は、非標識Ｇ−ＣＳＦを加えて行っ
た実験における値との比較より、約４０nＭと測定され
た（図２)。この結果はＢＣドメインもＢＮドメイン同
様にリガンド結合活性を有することを示すものである。
【００３０】
【００３１】配列番号：１ 配列の長さ：６３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Mouse 細胞の種類：ＮＦＳ−６０ 配列 TAT CCC CCT GCC AGC CCC TCA AAC CTA TCC TGC CTC ATG CAC CTC ACC 48 Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser Asn Leu Ser Cys Leu Met His Leu Thr 1 5 10 15 ACC AAC AGC CTG GTC TGC CAG TGG GAG CCA GGT CCT GAG ACC CAC CTG 96 Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu 20 25 30 CCC ACC AGC TTC ATC CTA AAG AGC TTC AGG AGC CGC GCC GAC TGT CAG 144 Pro Thr Ser Phe Ile Leu Lys Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp Cys Gln 35 40 45 TAC CAA GGG GAC ACC ATC CCG GAT TGT GTG GCA AAG AAG AGG CAG AAC 192 Tyr Gln Gly Asp Thr Ile Pro Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg Gln Asn 50 55 60 AAC TGC TCC ATC CCC CGA AAA AAC TTG CTC CTG TAC CAG TAT ATG GCC 240 Asn Cys Ser Ile Pro Arg Lys Asn Leu Leu Leu Tyr Gln Tyr Met Ala 65 70 75 80 ATC TGG GTG CAA GCA GAG AAT ATG CTA GGG TCC AGC GAG TCC CCA AAG 288 Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser Pro Lys 85 90 95 CTG TGC CTC GAC CCC ATG GAT GTT GTG AAA TTG GAG CCT CCC ATG CTG 336 Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu 100 105 110 CAG GCC CTG GAC ATT GGC CCT GAT GTA GTC TCT CAC CAG CCT GGC TGC 384 Gln Ala Leu Asp Ile Gly Pro Asp Val Val Ser His Gln Pro Gly Cys 115 120 125 CTG TGG CTG AGC TGG AAG CCA TGG AAG CCC AGT GAG TAC ATG GAA CAG 432 Leu Trp Leu Ser Trp Lys Pro Trp Lys Pro Ser Glu Tyr Met Glu Gln 130 135 140 GAG TGT GAA CTT CGC TAC CAG CCA CAG CTC AAA GGA GCC AAC TGG ACT 480 Glu Cys Glu Leu Arg Tyr Gln Pro Gln Leu Lys Gly Ala Asn Trp Thr 145 150 155 160 CTG GTG TTC CAC CTG CCT TCC AGC AAG GAC CAG TTT GAG CTC TGC GGG 528 Leu Val Phe His Leu Pro Ser Ser Lys Asp Gln Phe Glu Leu Cys Gly 165 170 175 CTC CAT CAG GCC CCA GTC TAC ACC CTA CAG ATG CGA TGC ATT CGC TCA 576 Leu His Gln Ala Pro Val Tyr Thr Leu Gln Met Arg Cys Ile Arg Ser 180 185 190 TCT CTG CCT GGA TTC TGG AGC CCC TGG AGC CCC GGC CTG CAG CTG AGG 624 Ser Leu Pro Gly Phe Trp Ser Pro Trp Ser Pro Gly Leu Gln Leu Arg 195 200 205 CCT ACC ATG AAG GCC 639 Pro Thr Met Lys Ala 210
【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：６３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：Homo sapiens (ヒト) 組織の種類：胎盤またはＵ９３７ 配列 TAC CCT CCA GCC ATA CCC CAC AAC CTC TCC TGC CTC ATG AAC CTC ACA 48 Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu Thr 1 5 10 15 ACC AGC AGC CTC ATC TGC CAG TGG GAG CCA GGA CCT GAG ACC CAC CTA 96 Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu 20 25 30 CCC ACC AGC TTC ACT CTG AAG AGT TTC AAG AGC CGG GGC AAC TGT CAG 144 Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys Gln 35 40 45 ACC CAA GGG GAC TCC ATC CTG GAC TGC GTG CCC AAG GAC GGG CAG AGC 192 Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln Ser 50 55 60 CAC TGC TGC ATC CCA CGC AAA CAC CTG CTG TTG TAC CAG AAT ATG GGC 240 His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly 65 70 75 80 ATC TGG GTG CAG GCA GAG AAT GCG CTG GGG ACC AGC ATG TCC CCA CAA 288 Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln 85 90 95 CTG TGT CTT GAT CCC ATG GAT GTT GTG AAA CTG GAG CCC CCC ATG CTG 336 Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu 100 105 110 CGG ACC ATG GAC CCC AGC CCT GAA GCG GCC CCT CCC CAG GCA GGC TGC 384 Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys 115 120 125 CTA CAG CTG TGC TGG GAG CCA TGG CAG CCA GGC CTG CAC ATA AAT CAG 432 Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp Gln Pro Gly Leu His Ile Asn Gln 130 135 140 AAG TGT GAG CTG CGC CAC AAG CCG CAG CGT GGA GAA GCC AGC TGG GCA 480 Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp Ala 145 150 155 160 CTG GTG GGC CCC CTC CCC TTG GAG GCC CTT CAG TAT GAG CTC TGC GGG 528 Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys Gly 165 170 175 CTC CTC CCA GCC ACG GCC TAC ACC CTG CAG ATA CGC TGC ATC CGC TGG 576 Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp 180 185 190 CCC CTG CCT GGC CAC TGG AGC GAC TGG AGC CCC AGC CTG GAG CTG AGA 624 Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg 195 200 205 ACT ACC GAA CGG GCC 639 Thr Thr Glu Arg Ala 210
【００３３】配列番号：３ 配列の長さ：３２４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ GGT TCT TTG GAG CCT CCC ATG CTG CAG GCC CTG GAC ATT GGC CCT GAT 48 Gly Ser Leu Glu Pro Pro Met Leu Gln Ala Leu Asp Ile Gly Pro Asp 1 5 10 15 GTA GTC TCT CAC CAG CCT GGC TGC CTG TGG CTG AGC TGG AAG CCA TGG 96 Val Val Ser His Gln Pro Gly Cys Leu Trp Leu Ser Trp Lys Pro Trp 20 25 30 AAG CCC AGT GAG TAC ATG GAA CAG GAG TGT GAA CTT CGC TAC CAG CCA 144 Lys Pro Ser Glu Tyr Met Glu Gln Glu Cys Glu Leu Arg Tyr Gln Pro 35 40 45 CAG CTC AAA GGA GCC AAC TGG ACT CTG GTG TTC CAC CTG CCT TCC AGC 192 Gln Leu Lys Gly Ala Asn Trp Thr Leu Val Phe His Leu Pro Ser Ser 50 55 60 AAG GAC CAG TTT GAG CTC TGC GGG CTC CAT CAG GCC CCA GTC TAC ACC 240 Lys Asp Gln Phe Glu Leu Cys Gly Leu His Gln Ala Pro Val Tyr Thr 65 70 75 80 CTA CAG ATG CGA TGC ATT CGC TCA TCT CTG CCT GGA TTC TGG AGC CCC 288 Leu Gln Met Arg Cys Ile Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Trp Ser Pro 85 90 95 TGG AGC CCC GGC CTG CAG CTG AGG CCT ACC ATG AAG 324 Trp Ser Pro Gly Leu Gln Leu Arg Pro Thr Met Lys 100 105
【００３４】配列番号：４ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ GGG GAT CCA TCG AGG GTA GGG GTT CTT TGG AGC CTC CCA TGC TGC 45
【００３５】配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ GGG TCT AGA TTA CTT CAT GGT AGG CCT CAG CTG CAG 36
【図１】 Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質
の大腸菌での発現のための発現ベクターｐＭＡＬｐ−ｍ
ＢＣの構築模式図である。
の大腸菌での発現のための発現ベクターｐＭＡＬｐ−ｍ
ＢＣの構築模式図である。
【図２】 組換え法で製造したｍＢＣとＧ−ＣＳＦとの
解離定数の測定のためのグラフである。
解離定数の測定のためのグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガン
ド結合領域の、Ｃ末端側ドメインの蛋白質をコードして
いるＤＮＡ。 - 【請求項２】 該蛋白質が、配列番号３で示されるアミ
ノ酸配列を含有するものである請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１または２記載のＤＮＡを含有す
る発現ベクター。 - 【請求項４】 請求項１または２記載のＤＮＡを大腸菌
遺伝子発現系の制御下に含有している組換え体プラスミ
ッドである請求項３記載の発現ベクター。 - 【請求項５】 請求項１または２記載のＤＮＡを大腸菌
マルトース結合蛋白質をコードするＤＮＡの下流に含有
し、大腸菌に顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド
結合領域蛋白質と大腸菌マルトース結合蛋白質との融合
蛋白質を発現させ得る請求項４記載の発現ベクター。 - 【請求項６】 図１に記載のプラスミッドｐＭＡＬｐ−
ｍＢＣである請求項５記載の発現ベクター。 - 【請求項７】 請求項３〜６のいずれかに記載の発現ベ
クターで形質転換された形質転換体。 - 【請求項８】 大腸菌である請求項７記載の形質転換
体。 - 【請求項９】 請求項７または８記載の形質転換体を培
養し、培養物から組換え生成物を回収することからなる
顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域の、
Ｃ末端側ドメインの蛋白質を製造する方法。 - 【請求項１０】 請求項９記載の方法で製造された、実
質上純粋な、組換え顆粒球コロニー刺激因子受容体のリ
ガンド結合領域蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6278841A JP3002104B2 (ja) | 1994-11-14 | 1994-11-14 | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質ｂｃをコードしているｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6278841A JP3002104B2 (ja) | 1994-11-14 | 1994-11-14 | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質ｂｃをコードしているｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08131172A true JPH08131172A (ja) | 1996-05-28 |
| JP3002104B2 JP3002104B2 (ja) | 2000-01-24 |
Family
ID=17602902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6278841A Expired - Fee Related JP3002104B2 (ja) | 1994-11-14 | 1994-11-14 | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質ｂｃをコードしているｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3002104B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6126962A (en) * | 1996-12-10 | 2000-10-03 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutus Kagaku Kenkyujo | Crystalline powdery saccharide, its preparation and uses |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2134771T5 (es) | 1990-03-23 | 2008-05-01 | Osaka Bioscience Institute | Adn que codifica el receptor del factor estimulador de una colonia de granulocitos. |
-
1994
- 1994-11-14 JP JP6278841A patent/JP3002104B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6126962A (en) * | 1996-12-10 | 2000-10-03 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutus Kagaku Kenkyujo | Crystalline powdery saccharide, its preparation and uses |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3002104B2 (ja) | 2000-01-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kato et al. | Purification and characterization of thrombopoietin | |
| US5427925A (en) | Recombniant method for making leukemia inhibitor factor | |
| US20080108560A1 (en) | Heterologous G-Csf Fusion Proteins | |
| JP3860097B2 (ja) | エリスロポエチン生体内活性強化融合蛋白質 | |
| JPH01501283A (ja) | 新規な型のコロニー刺激因子―１ | |
| JPH06133793A (ja) | ミュレル管抑制物質様ポリペプチドおよびその製造方法 | |
| JPH06505631A (ja) | 巨核球刺激因子 | |
| JP2004515246A (ja) | 生体内エリスロポエチン活性が増強された融合蛋白質 | |
| JPH04506342A (ja) | 非グリコシル化ヒトインターロイキン―３類似蛋白質 | |
| JP4493854B2 (ja) | リガンドの生物学的活性を増強する方法 | |
| US6660257B1 (en) | Circular permuteins of flt3 ligand | |
| JPH0998787A (ja) | 変性低密度リポ蛋白質受容体 | |
| AU725547B2 (en) | Multi-functional chimeric hematopoietic receptor agonists | |
| US6730303B1 (en) | Fused G-CSF and IL-3 proteins and uses thereof | |
| EP0425536A1 (en) | Nonglycosylated human interleukin-3 compositions | |
| US5925548A (en) | Modified receptors that continuously signal | |
| US7863016B2 (en) | G-CSF polypeptides and uses thereof | |
| JP3002104B2 (ja) | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質ｂｃをコードしているｄｎａ | |
| JP2839837B2 (ja) | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域蛋白質をコードしているｄｎａ | |
| JPS6034915A (ja) | ポリペプチド | |
| JPH03502322A (ja) | ヒトコロニー形成刺激因子の非グリコシル化類似体 | |
| US6280968B1 (en) | Human PEC-60-like protein and DNA encoding the same | |
| JP3081761B2 (ja) | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のｃｒｈ領域を含むリガンド結合領域の蛋白質をコードしているｄｎａ | |
| JP3070913B2 (ja) | 膜局在型ｚａｐ−７０を用いた免疫賦活剤 | |
| WO1996033217A1 (fr) | Proteine d'adhesion de cellules, agent immunosuppresseur contenant cette proteine et agent immunosuppresseur renfermant des cellules ainsi induites |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |