JPH08114597A - 抗リン脂質抗体測定試薬および抗リン脂質抗体の免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新たな血液中のコファクターに基づいて、抗リン脂
質抗体症候群のスクリーニンク゛試薬として十分な感度を有する
新たな抗リン脂質抗体測定試薬および抗リン脂質抗体の
免疫学的測定法の提供。 【構成】 ウシ血清中の糖蛋白質の内、分子量が100KDa
の分画(GP100)をコファクターとし、ホスファチシ゛ルセリンをリン脂質と
して作製された抗リン脂質抗体測定試薬と、コファクターを全
く添加しないで他は同様に作製した従来型の抗リン脂質
抗体測定試薬にて、抗リン脂質抗体症候群患者のうちGP
100に反応性を示した患者検体4検体[GP100(+)]、GP100
に反応性を示さなかった検体4検体[GP100(-)]、および正
常人検体1例について測定を行った。従来型の抗リン脂
質抗体測定試薬では、GP100の存在・不存在の間でほと
んど差は出ていないが、GP100に反応性を示した検体4例
ではすべての検体でGP100のコファクターの存在下で抗体に対
する反応性が増強された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、自己免疫疾患診断に関
するものであり、特に抗リン脂質抗体症候群に特異的に
出現する自己抗体である抗リン脂質抗体を測定するため
の抗リン脂質抗体測定試薬および抗リン脂質抗体の免疫
学的測定法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】膠原病をはじめとする自己免疫疾患にお
いては、血清中に検出される自己抗体の測定が疾患の診
断、病型分類、治療方針の決定、予後の推定等に大変有
用であることから、既に抗核抗体、抗ＥＮＡ抗体等が測
定されている。近年このような自己抗体の一つとして生
体の重要な構成成分であるリン脂質に対する抗体が注目
を集めている。

【０００３】従来より、全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）患者が妊娠した場合、自然流産や子宮内胎児死亡を
起こしやすいことが知られていたが、このような患者に
おいては、血清中に抗カルジオリピン抗体が高い頻度で
存在することが知られている。また、心筋梗塞や、肺梗
塞、脳血栓などの血栓症および血小板減少症と抗カルジ
オリピン抗体の出現とが良く相関することが知られるよ
うになり、１９８６年、ヒューズ、ハリス（Ｈｕｇｈｅ
ｓ，Ｈａｒｒｉｓ）らは、「抗カルジオリピン抗体症候
群」という疾患概念を提唱した。その後、カルジオリピ
ンばかりでなく、他の陰性荷電を有するリン脂質、例え
ばホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノール、
ホスファチジルイノシトール等に対する抗体も同時に認
められることから、「抗リン脂質抗体症候群」と呼ばれ
るようになった。

【０００４】リン脂質に対する抗体としては上記の抗カ
ルジオリピン抗体や抗ホスファチジルセリン抗体、抗ホ
スファチジルエタノール抗体、抗ホスファチジルイノシ
トール抗体等の他に、梅毒反応生物学的偽陽性（ＢＦ
Ｐ： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉ
ｖｅ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒｓ
ｙｐｈｉｌｉｓ）や、ループス抗凝固因子（ＬＡＣ：Ｌ
ｕｐｕｓ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ）などが知られ
ている。

【０００５】これらリン脂質に対する抗体を検出する方
法としては、主としてＥＩＡ法若しくはＲＩＡ法が用い
られるが、現在では主に２つの方法が用いられている。
１つは１９８３年にハリスら（Ｈａｒｒｉｓ，Ｅ．Ｎ．
ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔｔ，１２１１−１２１４，
（１９８３））によって開発されたＲＩＡ法であって、
その後アルカリホスファターゼ等の酵素をラベルした標
識抗体を用いるＥＩＡ法が開発されてきている。これは
カルジオリピンを結合させた不溶性支持体に動物血清で
希釈した患者検体を反応させた後、標識した抗ヒトイム
ノグロブリン抗体を反応させ、結合した標識物の反応量
から検体中の抗カルジオリピン抗体の量を測定するもの
である。

【０００６】他の方法としては、松浦（ＷＯ ９１／０
６００６）およびオーストラリアのマクニールら（Ｍｃ
Ｎｅｉｌ，Ｈ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ｖｏｌ．８７，４１２
０−４１２４，（１９９０））によって開発された方法
が挙げられる。

【０００７】即ち、松浦らは抗リン脂質抗体症候群の患
者血中に特異的に存在する抗体は、カルジオリピン単独
では反応性が弱いものの、血清中の特定の分画（コファ
クター）を加えることにより反応性が増強されることを
見いだした。一方、感染症によって惹起される抗カルジ
オリピン抗体は逆に、これらコファクターを添加するこ
とによって反応性が弱められることから、コファクター
を反応系に添加した場合に初めて抗リン脂質抗体症候群
に特異的な抗体を検出することができるとした。このコ
ファクターは後に血液中に存在するβ２ＧＰ−Ｉ（ａｐ
ｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｈ）であることがマクニー
ルらによって明かにされている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ハリス
らによって開発されたＥＩＡ法による抗カルジオリピン
抗体の測定は感度が高く定量的に測定できる反面、ＳＬ
Ｅ等抗リン脂質抗体症候群に由来する抗カルジオリピン
抗体と、感染症等の外来性要因による抗カルジオリピン
抗体とを区別できないという問題を伴っていた。一方、
β2グリコプロテイン−Ｉ（β２ＧＰ−Ｉ）をコファク
ターとして添加したＥＩＡ法の系では、従来より行われ
ていたハリスの方法に比べ予想外に陽性率が低く、抗リ
ン脂質抗体症候群のスクリーニングとして用いるには不
十分なものであった。

【０００９】本発明の目的とするところは、反応系に添
加した場合に抗リン脂質抗体症候群患者由来の抗体との
反応性が増強されるとともに、陰性荷電を有する不溶性
支持体に直接結合させた場合に抗リン脂質抗体症候群の
患者血清中に特異的に存在する抗体と結合することがで
きる新たな血液中のコファクターに基づいて、抗リン脂
質抗体症候群のスクリーニング試薬として十分な感度を
有する新たな抗リン脂質抗体測定試薬および抗リン脂質
抗体の免疫学的測定法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段、作用及び発明の効果】本
発明者らは、血液中の蛋白質を分画し、抗リン脂質抗体
症候群患者由来抗体との反応性を増強する物質を検索し
たところ、新たに４種類の分画を見いだし、これらの分
画を用いた抗リン脂質抗体症候群の診断用試薬を完成し
た。

【００１１】即ち、請求項１〜４記載の発明は、哺乳動
物の血清若しくは血漿中から得られた分子量が３６ＫＤ
ａ、６５ＫＤａ、８２ＫＤａまたは１００ＫＤａである
分画物を含む抗リン脂質抗体測定試薬である。

【００１２】請求項５記載の発明は、哺乳動物の血清若
しくは血漿中から得られた分子量が３６ＫＤａ、６５Ｋ
Ｄａ、８２ＫＤａおよび１００ＫＤａである分画物群か
ら選ばれた２種以上の分画物を含む抗リン脂質抗体測定
試薬である。

【００１３】請求項６記載の発明は、上記分画物が、陰
性荷電を有するリン脂質または陰性荷電を有する不溶性
支持体と結合してなる請求項１〜５のいずれか記載の抗
リン脂質抗体測定試薬である。

【００１４】請求項７記載の発明は、請求項６記載の抗
リン脂質抗体測定試薬に検体を反応させた後、酵素にて
標識された抗ヒトγ鎖モノクロナール抗体を反応させ、
更に該酵素に対する基質を反応させて抗リン脂質抗体測
定試薬に結合している酵素の酵素活性を検出することに
より、検体中の抗リン脂質抗体量を測定する抗リン脂質
抗体の免疫学的測定法である。

【００１５】請求項８記載の発明は、請求項６記載の抗
リン脂質抗体測定試薬に検体を反応させた後、ラジオア
イソトープにて標識された抗ヒトγ鎖モノクロナール抗
体を反応させ、更に該抗リン脂質抗体測定試薬に結合し
ているラジオアイソトープの放射能を検出することによ
り、検体中の抗リン脂質抗体量を測定する抗リン脂質抗
体の免疫学的測定法である。

【００１６】請求項９記載の発明は、請求項１〜４，６
のいずれかに記載の抗リン脂質抗体測定試薬を複数の分
子量にわたって複数用いて、分子量毎に反応する検体中
の抗リン脂質抗体を測定し、複数の分子量にわたる測定
値の分布パターンを得る抗リン脂質抗体の免疫学的測定
法である。

【００１７】請求項１０記載の発明は、上記複数の分子
量が３６ＫＤａ、６５ＫＤａ、８２ＫＤａおよび１００
ＫＤａを含む請求項９記載の抗リン脂質抗体の免疫学的
測定法である。抗リン脂質抗体症候群の患者血清中に特
異的に存在する抗体を検出する方法としては、マクニー
ルらによって報告されているように酵素免疫測定法（Ｅ
ＩＡ）あるいは放射免疫測定法（ＲＩＡ）によるのが一
般的であり、その際、反応液中にリン脂質と該特異抗体
との反応性を増強する物質（コファクター）としてβ2
グリコプロテイン−Ｉを添加することが報告されている
が、本発明者らは血清中のコファクター活性を持つ物質
について鋭意検討を行い、新たなコファクター活性を持
つ物質を見いだした。即ち、これらコファクター活性を
有する物質としては、ウシ血清若しくは血漿をゲル濾過
等を用いて分子量により分画するとき得られる、分子量
１００ＫＤａ（キロドルトン）、８２ＫＤａ、６５ＫＤ
ａおよび３６ＫＤａにある４種類の糖蛋白質の分画が該
当するものである。

【００１８】分画に用いる血清若しくは血漿としては、
ヒト、ヤギ、ウサギ等哺乳動物に由来するものであれば
よいが、測定しようとする検体の由来する動物の血清若
しくは血漿であることが望ましい。これらの新たなコフ
ァクターを、不溶性支持体上に不溶化した適当なリン脂
質に接触させて抗リン脂質抗体測定試薬としてもよい
し、不溶性支持体に、直接接触させ、反応させることに
より抗リン脂質抗体測定試薬としてもよい。この抗リン
脂質抗体測定試薬を用いることにより、抗リン脂質抗体
症候群患者に特異的に存在する抗体を検出することがで
きる。各コファクターはこれら単独でリン脂質や不溶性
支持体に反応させてもよいし、複数のコファクターを混
合して反応させることにより、複数またはすべてのコフ
ァクターに感受性のある抗体を検出することもできる。
更に、各コファクターをその分子量毎に単独でリン脂質
や不溶性支持体に反応させた分子量毎の複数の抗リン脂
質抗体測定試薬を用意し、その複数の測定結果を分子量
に応じた分布パターンとして得てもよい。この分布パタ
ーンによれば、抗体の違いが一層比較し易くなる。

【００１９】また、コファクターは、血清の測定時に抗
リン脂質抗体検出用の不溶性支持体上に添加してもよい
し、予めコファクターを結合させた抗リン脂質抗体検出
用不溶性支持体を作製し、これに、測定時に調製した検
体を反応させることによっても検出することができる。

【００２０】コファクターを予め不溶性支持体に結合さ
せる場合には、コファクター濃度として、好ましくは１
検体当たり１ｍｇ／ｍｌ乃至１００ｍｇ／ｍｌ、より好
ましくは５ｍｇ／ｍｌ乃至４０ｍｇ／ｍｌとなるように
調製した溶液に不溶性支持体を接触させることによって
行う。

【００２１】この際に用いるリン脂質としては、通常用
いられるカルジオリピンのほかにホスファチジルセリ
ン、ホスファチジルエタノール、ホスファチジルイノシ
トール、ホスファチジルグリセロホスフェート、ホスフ
ァチジル酸、またはそれらの同族体もしくは類縁体等陰
性荷電を有するリン脂質であり、これ以外のリン脂質で
も陰性荷電を有するものであればよい。

【００２２】請求項１〜４記載の抗リン脂質抗体測定試
薬は、哺乳動物の血清若しくは血漿中から得られた分子
量が３６ＫＤａ、６５ＫＤａ、８２ＫＤａまたは１００
ＫＤａである分画物を含む。３６ＫＤａ、６５ＫＤａ、
８２ＫＤａまたは１００ＫＤａの分画物は、コファクタ
ーとして用いて、リン脂質に対する特異抗体の反応性を
増強するので、抗リン脂質抗体を高感度で測定すること
ができる。

【００２３】請求項５記載の抗リン脂質抗体測定試薬
は、哺乳動物の血清若しくは血漿中から得られた分子量
が３６ＫＤａ、６５ＫＤａ、８２ＫＤａおよび１００Ｋ
Ｄａである分画物群から選ばれた２種以上の分画物を含
む。このため、コファクターとして用いて、より感度の
高い測定が可能である。

【００２４】上記分画物をコファクターしてい用いる場
合は、陰性荷電を有するもの、例えば、陰性荷電を有す
るリン脂質または陰性荷電を有する不溶性支持体と結合
して測定に用いる。特に、不溶性支持体上に陰性荷電を
有するリン脂質を結合させたものに、上記コファクター
としての分画物を結合させた抗リン脂質抗体測定試薬が
好ましい。リン脂質を結合させなくても、不溶性支持体
自体が陰性荷電を有するものであれば、コファクターを
直接、不溶性支持体に結合させてもよい。特に不溶性支
持体に陰性荷電を持たせる処理としてγ線照射する方法
がある。

【００２５】上記抗リン脂質抗体測定試薬のコファクタ
ーに結合した抗リン脂質抗体の測定法としては、ＥＩＡ
法、ＲＩＡ法等が存在する。ＥＩＡ法としては、上記抗
リン脂質抗体測定試薬に検体を反応させた後、酵素にて
標識された抗ヒトγ鎖モノクロナール抗体［例えば、後
述するアルカリフォスファダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヤ
ギ）、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヤギ）等が
挙げられる。］を反応させ、更に該酵素に対する基質を
反応させることにより抗リン脂質抗体測定試薬に結合し
ている酵素の酵素活性を検出することにより、検体中の
抗リン脂質抗体量を測定する。ＲＩＡ法としては、抗リ
ン脂質抗体測定試薬に検体を反応させた後、ラジオアイ
ソトープにて標識された抗ヒトγ鎖モノクロナール抗体
を反応させ、更に該抗リン脂質抗体測定試薬に結合して
いるラジオアイソトープの放射能を検出することによ
り、検体中の抗リン脂質抗体量を測定する。

【００２６】測定は、一種類のコファクターにより行う
のではなく、分子量毎に複数種類で行い、そのコファク
ターの分子量における測定値の分布パターンを得れば、
疾患の特徴がより明確化される。この分子量として、３
６ＫＤａ、６５ＫＤａ、８２ＫＤａおよび１００ＫＤａ
を含むことが、明解な分布パターンを得る上で望まし
い。

【００２７】本発明によれば、上述したコファクター
（糖蛋白質）と検体とを接触させることにより、従来知
られていた抗リン脂質抗体測定試薬によるＥＩＡ法以上
の陽性率で、抗リン脂質抗体症候群患者血清中に特異的
に存在する抗体を検出することが可能である。このこと
により、抗リン脂質抗体症候群のスクリーニング試薬と
して十分な感度を有する新たな抗リン脂質抗体測定試薬
および抗リン脂質抗体の免疫学的測定法を提供すること
ができる。

【００２８】特に、１００ＫＤａと３６ＫＤａのコファ
クターを抗原感作プレートのブロッキングのステップで
添加、あるいは、アッセイ系の１次反応直前にマイクロ
プレート内でインキュベーションすることにより、抗リ
ン脂質抗体症候群患者検体中の抗カルジオリピン抗体の
反応性がより増強される。したがって、スクリーニング
試薬として従来の測定法と比較して、抗リン脂質抗体症
候群患者で充分な陽性率の得られる測定系を提供するこ
とができる。

【００２９】以下に実施例によって本発明を具体的に説
明する。

【００３０】

【実施例】

［実施例１］ コファクター（糖蛋白質）の精製方法 ここでのコファクターは、ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ ｃａｌ
ｆ ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清）から精製された糖蛋白
質を示す。つまり、１ｌのＦＣＳをヘパリンアフィニテ
ィーカラム（１０×１５０ｍｍ，Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｈ
ｅｐａｒｉｎ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ＣＡ）にかけた。そして、
そのカラムを、３０ｍＭトリス塩酸緩衝５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した後、３０ｍＭトリス塩酸
緩衝３５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）でその蛋白質
分画を溶出させ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝１０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ７．４）で透析を行った。その後、その蛋
白質分画を１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で
懸濁した後、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎ
ｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：
ＬＫＢ，Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）にかけた。この
ＨＰＬＣは、ゲルクロマトグラフィー用カラム（ＴＳＫ
−３０００ ８．０×２４０ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ，Ｊａｐ
ａｎ）を使用して充填剤内部への浸透性の差異を利用し
て溶質を分離する液相クロマトグラフィーである。溶出
は１００ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で実施し、
各分画は炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で透析を行った。

【００３１】その後、リームリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）の
方法に従い１２．５％のＳＤＳ（ソディウムドデシル硫
酸）−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を
実施した。この電気泳動後、クマシーブリリアントブル
ーで染色し図１の写真に示す通り目的のバンド（本実施
例では、１００ＫＤａ，３６ＫＤａの糖蛋白質であ
る。）を確認した。そして、目的のバンドをカッターナ
イフなどで切り出し脱イオン水に約３０分間浸して置い
た後、１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）でホモジ
ナイズして精製した。

【００３２】［実施例２］ コファクターを結合させた
抗リン脂質抗体測定試薬の作製とこの試薬を用いたコフ
ァクター依存性の抗リン脂質抗体の測定 本実施例で使用するリン脂質は、任意の陰性に荷電した
リン脂質、例えば、カルジオリピン、ホスファチジルイ
ノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグ
リセロホスフェート、ホスファチジル酸、またはそれら
の同族体もしくは類縁体が使用できる。次の例ではカル
ジオリピンが用いられた。

【００３３】まず、カルジオリピンーエタノール溶液を
５０μｇ／ｍｌに調製後、マイクロタイタープレート
（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍ ｕｎｏ ｐｌａｔｅ，Ｐｏｌｙｓ
ｏａｐ，Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒ
ｋ）に１００μｌ／ｗｅｌｌの容量を入れ風乾後、実施
例１の精製方法で調製した糖蛋白質を最終濃度が１０μ
ｇ／ｍｌになるように添加して、０．３％ＢＳＡ（ウシ
血清アルブミン：Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕ
ｍｉｎ，Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，
ＮＹ）加ＰＢＳ−−ＨＥＰＥＳをマイクロタイタープレ
ートに２５０μｌ／ｗｅｌｌの容量を入れ１８時間、４
℃でブロッキングを行った。その後ＰＢＳ−界面活性剤
（商品名：トゥイーン２０［Ｔｗｅｅｎ２０］）で洗浄
して、コファクターをマイクロタイタープレート上のカ
ルジオリピンに結合させた抗リン脂質抗体測定試薬を作
製した。

【００３４】この抗リン脂質抗体測定試薬のプレートウ
エル内に、０．３％ＢＳＡ−ＰＢＳで種々の倍数で希釈
した抗リン脂質抗体症候群患者血清を５０μｌ入れて１
時間、室温でインキュベートした。そしてＰＢＳ−界面
活性剤（商品名：トゥイーン２０）で３回洗浄後アルカ
リフォスファダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヤギ）をプレー
トウエル内に５０μｌ入れて１時間、室温でインキュベ
ートした。そして同様に洗浄後、酵素基質であるｐ−ニ
トロフェニルリン酸をプレートウエル内に５０μｌ入れ
て３０分間、室温でインキュベートした。その後、水酸
化ナトリウム溶液をプレートウエル内に５０μｌ入れて
反応を停止させた。そして、プレートリーダーを使用し
てＡ４０５ｎｍで吸光度を測定した。上記抗リン脂質抗
体症候群患者血清の希釈倍数として、２，８，４，１６
倍に希釈した血清を測定して得られた検量線の例を図２
に示す。希釈濃度に比例して検出されていることから、
本抗リン脂質抗体測定試薬により定量的に抗リン脂質抗
体の測定が可能であることが判明した。

【００３５】［実施例３］ 抗リン脂質抗体症候群患者
検体の測定（１） 実施例１で精製した糖蛋白質のうち分子量が１００ＫＤ
ａの分画（以下「ＧＰ１００」と言う）をコファクター
とし、ホスファチジルセリンをリン脂質として、実施例
２の手順で作製された抗リン脂質抗体測定試薬と、コフ
ァクターを全く添加しないで、単にリン脂質としてホス
ファチジルセリンを用い、他は実施例２と同様に作製し
た従来型の抗リン脂質抗体測定試薬にて、抗リン脂質抗
体症候群患者のうちＧＰ１００に反応性を示した患者検
体４検体［ＧＰ１００（＋）］、ＧＰ１００に反応性を
示さなかった検体４検体［ＧＰ１００（−）］、および
正常人検体１例について測定を行った。

【００３６】結果は図３に示すように、従来型の抗リン
脂質抗体測定試薬では、ＧＰ１００の存在・不存在の間
で有意と言えるほどの差は出ていないが、本実施例の抗
リン脂質抗体測定試薬では、検体により反応の増強程度
に差はあるが、ＧＰ１００に反応性を示した検体４例で
はすべての検体でＧＰ１００のコファクター（糖蛋白
質）の存在下で抗体に対する反応性が増強された。

【００３７】［実施例４］ 抗リン脂質抗体症候群患者
検体の測定（２） 抗リン脂質抗体患者血清２例（ＡＰＳ−１およびＡＰＳ
−２）につき、実施例１で述べたウシ血清のゲル濾過の
１５分画を各々コファクターとして添加し、抗リン脂質
抗体価を測定した。その結果を図４に示す。

【００３８】ＡＰＳ−１とＡＰＳ−２とでは反応性を増
強するコファクターの分画が異なるが、ＡＰＳ−１では
６２ＫＤａおよび３６ＫＤａの両糖蛋白質により、ＡＰ
Ｓ−２では１００ＫＤａおよび６２ＫＤａの両糖蛋白質
の添加により反応性の増強が認められた。６２ＫＤａは
β2グリコプロテイン−Ｉであることから、それぞれ３
６ＫＤａあるいは１００ＫＤａにてβ2グリコプロテイ
ン−Ｉ（６２ＫＤａ）に比較しても、劣らない反応性の
増強が認められた。しかも、β2グリコプロテイン−Ｉ
（６２ＫＤａ）のみでは、同じような測定結果となる検
体が、複数の分画により測定することにより、分子量に
応じた測定値の分布パターンが異なることから、全く異
なる性質を示していることが明確となった。

【００３９】［実施例５］ コファクターすなわち糖蛋
白質抗体の測定（１） 上記実施例２では陰性に荷電しているリン脂質により糖
蛋白質の立体構造の一部に変化を引き起こすことが可能
であるが、ここでは、予めγ線照射することにより陰性
荷電化してあるマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−
Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ，Ｍａｘｉｓｏａｐ，Ｎｕｎ
ｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に糖蛋白質を
感作してＥＩＡ法で測定した。即ち、実施例１で精製し
た糖蛋白質を炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）で２０μｇ／
ｍｌの濃度に調製後、プレート内に５０μｌ入れて４時
間、室温でインキュベートした。その後、ＰＢＳ−界面
活性剤（商品名：トゥイーン２０）で３回洗浄し、５％
スキムミルク（ブロックエース：大日本ファーマシィ社
製）−ＰＢＳを２００μｌ入れて１８時間、４℃でブロ
ッキングを行った。その後、ＰＢＳ−界面活性剤（商品
名：トゥイーン２０）で３回洗浄し、５％スキムミルク
（ブロックエース：大日本ファーマシィ社製）−ＰＢＳ
で５０倍希釈した血清をプレートウエル内に５０μｌ入
れて１時間、室温でインキュベートした。その後の測定
方法は上記実施例３に準じた。

【００４０】本実施例の結果、表１のようにβ2グリコ
プロテイン−Ｉ抗体陽性血清は、１００ＫＤａ，６５Ｋ
Ｄａの糖蛋白質に各々７６．９％，６１．５％の反応性
を示した。さらにβ2グリコプロテイン−Ｉ抗体陰性血
清の１５．８％は１００ＫＤａの糖蛋白質と反応した。

【００４１】

【表１】

【００４２】このように、β2グリコプロテイン−Ｉ抗
体陽性血清とβ2グリコプロテイン−Ｉ抗体陰性血清と
を測定により明確に区別することができた。 ［実施例６］ コファクターすなわち糖蛋白質抗体の測
定（２） 測定方法は実施例５に準じる。今回本発明者らが見いだ
した新たな４種類の糖蛋白質（１００ＫＤａ，８２ＫＤ
ａ，６５ＫＤａ，３６ＫＤａ）に対する反応性を各種疾
患別検体を用いて検討した。

【００４３】本実施例の結果、表２，３のようにＳＬＥ
の合併の有無に関わらず抗リン脂質抗体症候群（ＡＰ
Ｓ）患者で他の疾患群と比較して高い陽性率を示した。
４種類の糖蛋白質に対する抗体のなかでとくに１００Ｋ
Ｄａの糖蛋白質に対する抗体の出現頻度が高かった。表
２は、種々の疾患における４種の糖蛋白質に対する抗体
の出現頻度を表している。表３は、抗リン脂質抗体症候
群（ＡＰＳ）患者のＳＬＥの合併の有無と４種の糖蛋白
質抗体との関係を表している。

【００４４】

【表２】

【００４５】ここで、ＡＰＳは抗リン脂質抗体症候群、
ＳＬＥは全身性エリテマトーデス（全身性紅斑性狼
瘡）、ＰＳＳは強皮症、ＲＡは慢性関節リウマチ炎であ
る（以下同じ）。表２において、抗リン脂質抗体症候群
（ＡＰＳ）患者では約４割近くの患者で１００ＫＤａの
コファクター（糖蛋白質）に対する抗体が存在する。更
に、複数の糖蛋白質に対する抗体を持っている患者も見
られる。他の抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）を伴わな
いＳＬＥやＲＡ患者でも１００ＫＤａの糖蛋白質に対す
る抗体の出現頻度が他の糖蛋白質に対する抗体と比較し
て若干高い。

【００４６】

【表３】

【００４７】表３において、ＳＬＥの合併が無い患者で
は５０．０％が１００ＫＤａの糖蛋白質と反応する。そ
して、ＳＬＥの合併が有る患者では１００ＫＤａの糖蛋
白質との反応性は減少し、６５ＫＤａの糖蛋白質との反
応性が増加する。表２，３から、複数の糖蛋白質を用い
て、あるいは特に１００ＫＤａの糖蛋白質をコファクタ
ーとして用いて各種症候群の傾向を、より明確に測定す
ることが可能となった。

【００４８】［実施例７］ コファクターすなわち糖蛋
白質抗体の測定（３） 実施例１にてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜
に電気的にトランスファーし、その後、抗リン脂質抗体
症候群（ＡＰＳ）患者検体を用いて免疫染色を実施し
た。具体的には、電気泳動の終了したゲルをブロッティ
ング用緩衝液（２５ｍＭトリス塩酸，１９２ｍＭグリシ
ン，２０％メタノール，ｐＨ７．４）に約１５分浸して
おき、同様にニトロセルロース膜もブロッティング用緩
衝液に浸しておいた。そして、約２００ｍＡ、１時間で
転写を完了しその後、２％スキムミルクでブロッキング
を４℃で約１８時間実施した。各々の患者検体はＥＩＡ
測定系と同様に０．３％ＢＳＡ−ＰＢＳで２００倍希釈
し幅約５ｍｍ〜１０ｍｍに切断したニトロセルロース膜
上に約１０００μｌを載せ、室温で１時間インキュベー
トした。その後、ＰＢＳ−界面活性剤（商品名：トゥイ
ーン２０）に浸し１時間洗浄した。洗浄後、ペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ヤギ）を１次反応と同様にニ
トロセルロース膜上に約１０００μｌを載せ、室温で１
時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ−界面活性剤
（商品名：トゥイーン２０）に浸し１時間洗浄した。洗
浄後、０．５ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン４塩酸塩、
０．０１％過酸化水素溶液をニトロセルロース膜上に約
１０００μｌを載せ、室温で約１５分間インキュベート
して目的のサイズのバンドが発色してきたら脱イオン水
で反応を停止した。

【００４９】結果は図５，図６に示すように、検体によ
り反応する糖蛋白質は様々であった。つまり１種類の糖
蛋白質に反応する検体もあれば、４種類すべての糖蛋白
質と反応する検体も存在した。 ［実施例８］ コファクターすなわち糖蛋白質抗体の測
定（４） 測定方法は実施例５に準じる。今回本発明者らが見いだ
した新たな４種類の糖蛋白質（１００ＫＤａ，８２ＫＤ
ａ，６５ＫＤａ，３６ＫＤａ）に対する反応性を各種疾
患別検体を用いて検討した。

【００５０】本実施例の結果、表４に示すように、疾患
毎に異なる結果を得た。

【００５１】

【表４】

【００５２】括弧内の分母の内、陰性の「８」は、上記
４種類の糖蛋白質（１００ＫＤａ，８２ＫＤａ，６５Ｋ
Ｄａ，３６ＫＤａ）のいずれにも陰性であった人数、陽
性の「２４」はいずれかにて陽性であった人数を表し、
分子はその疾患に該当する人数を表す。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ウシ血清糖蛋白質の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の電気泳動の写真である。

【図２】 抗リン脂質抗体症候群患者の希釈血清を測定
して得られた検量線を表すグラフである。

【図３】 抗ホスファチジルセリン抗体分析におけるウ
シの１００ＫＤａ糖蛋白質（ＧＰ）のコファクター効果
を示すグラフである。

【図４】 抗リン脂質抗体患者血清につき、ウシ血清の
ゲル濾過の１５分画を各々コファクターとして添加して
抗リン脂質抗体価を測定した結果を示すグラフである。

【図５】 検体に反応するコファクター（糖蛋白質抗
体）を示す電気泳動の写真である。

【図６】 検体に反応するコファクター（糖蛋白質抗
体）を示す電気泳動の写真である。

フロントページの続き (72)発明者 近藤 啓文 神奈川県相模原市北里１−15−１ 北里大 学医学部内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】哺乳動物の血清若しくは血漿中から得られ
   た分子量が３６ＫＤａである分画物を含む抗リン脂質抗
   体測定試薬。
2. 【請求項２】哺乳動物の血清若しくは血漿中から得られ
   た分子量が６５ＫＤａである分画物を含む抗リン脂質抗
   体測定試薬。
3. 【請求項３】哺乳動物の血清若しくは血漿中から得られ
   た分子量が８２ＫＤａである分画物を含む抗リン脂質抗
   体測定試薬。
4. 【請求項４】哺乳動物の血清若しくは血漿中から得られ
   た分子量が１００ＫＤａである分画物を含む抗リン脂質
   抗体測定試薬。
5. 【請求項５】哺乳動物の血清若しくは血漿中から得られ
   た分子量が３６ＫＤａ、６５ＫＤａ、８２ＫＤａおよび
   １００ＫＤａである分画物群から選ばれた２種以上の分
   画物を含む抗リン脂質抗体測定試薬。
6. 【請求項６】上記分画物が、陰性荷電を有するリン脂質
   または陰性荷電を有する不溶性支持体と結合してなる請
   求項１〜５のいずれか記載の抗リン脂質抗体測定試薬。
7. 【請求項７】請求項６記載の抗リン脂質抗体測定試薬に
   検体を反応させた後、酵素にて標識された抗ヒトγ鎖モ
   ノクロナール抗体を反応させ、更に該酵素に対する基質
   を反応させて抗リン脂質抗体測定試薬に結合している酵
   素の酵素活性を検出することにより、検体中の抗リン脂
   質抗体量を測定する抗リン脂質抗体の免疫学的測定法。
8. 【請求項８】請求項６記載の抗リン脂質抗体測定試薬に
   検体を反応させた後、ラジオアイソトープにて標識され
   た抗ヒトγ鎖モノクロナール抗体を反応させ、更に該抗
   リン脂質抗体測定試薬に結合しているラジオアイソトー
   プの放射能を検出することにより、検体中の抗リン脂質
   抗体量を測定する抗リン脂質抗体の免疫学的測定法。
9. 【請求項９】請求項１〜４，６のいずれかに記載の抗リ
   ン脂質抗体測定試薬を複数の分子量にわたって複数用い
   て、分子量毎に反応する検体中の抗リン脂質抗体を測定
   し、複数の分子量にわたる測定値の分布パターンを得る
   抗リン脂質抗体の免疫学的測定法。
10. 【請求項１０】上記複数の分子量が３６ＫＤａ、６５Ｋ
    Ｄａ、８２ＫＤａおよび１００ＫＤａを含む請求項９記
    載の抗リン脂質抗体の免疫学的測定法。