JPH0798754B2 - 炎症治療用組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗炎症性化合物の分野に
あり，特に，リンパ組織球性炎，肉芽性炎および急性炎
を含む炎症の進行を抑制する因子として，軟骨誘導因子
（CIF）と呼ばれるポリペプチドおよびそれと機能上関
連のあるポリペプチドを使用することに関する。

【０００２】

【従来の技術】共同出願されている特開昭61-36223号
（公開日1986年２月20日）に，CIF-ＡおよびCIF-Ｂとい
う名の２つのウシの骨由来のCIF が記載されている。い
ずれも SDS-PAGE による分子量は約26,000ダルトンでダ
イマーである。これらはそれぞれ，ラット胎児間葉細胞
を用いたアガロースゲル培養モデルで軟骨に特異的なプ
ロテオグリカン（PG）の産生を調べたところ，それ自身
in vitro で軟骨形成活性を示す。しかし，いずれもin
vivoでは，それ自身では軟骨形成活性を持たない。CI
F-Ａのアミノ酸配列決定により，それは，β型トランス
フォーム成長因子（TGF-β）と呼ばれるヒト胎盤由来の
ポリペプチドについて報告されているのと同じ部分的な
（30個のアミノ酸の）Ｎ末端配列を有することが示され
た。CIF-Ｂの部分的Ｎ末端配列はTGF-βのそれとは異な
る。両CIF ともTGF-β検定において活性（軟寒天におい
て正常ラット腎細胞コロニーの固定非依存性の増殖を誘
導する能力）を示す。

【０００３】ウシ腎，ヒト胎盤あるいはヒト血小板に由
来するTGF-βが国際特許出願番号 PCT/US83/01460 （公
開日1984年３月29日，公開番号 WO84/01106)および EPA
84450016.5(公開日1984年12月19日，公開番号0128849)
に記載されている。これら出願は，このようなTGF-βが
EGFあるいはTGF-αと結合すると，1)上記軟寒天培養検
定において細胞増殖を促進し，また2)ラット軟組織傷治
癒モデルで細胞増殖および蛋白沈着を促進することを示
すデータを提供している。これら出願により，TGF-βは
SDS-PAGEによる分子量が約26,000のダイマーであると特
徴付けられている。

【０００４】

【発明の要旨】本発明は，上記２つのウシ由来CIF が抗
炎症活性を示すという発見に基づいている。CIF を含む
移植片の評価は，CIF が急性炎および／もしくは慢性炎
の抑制に対し局部的にもまた全身的にも活性を有するこ
とを示している。これらポリペプチドのTGF-βとの類似
性（あるいは，CIF-Ａの場合はおそらく同一性）から，
TGF-βもまたこれらの新しく発見された活性を有すると
考えられる。これら活性は活性剤もしくは助因子の存在
とは無関係のようであり，既報の軟骨形成活性や細胞増
殖活性とは異なる。便宜上，本節およびクレームでは，
CIF-Ａ，CIF-Ｂ，TGF-βおよびこれらと機能的に等価物
を包含する一般用語として，CIF という言葉を用いる。

【０００５】その後，CIF が造血部位およびリンパ球生
成部位に局在してインターロイキン−１（IL-1）に対す
る胸腺細胞の応答を抑制することが発見され，これは，
CIFが赤血球および／もしくはリンパ球の分化の機能障
害あるいは機能不全の治療においても有効である可能性
を示している。

【０００６】従って，本発明はCIF の２つの新しい使用
法を提供する。

【０００７】１つは，炎症治療に使用される組成物であ
って，この組成物は軟骨誘導因子を含有する。急性およ
び慢性の両型の炎症がこれにより治療される。また治療
は全身的でもよく，あるいはCIF は所定部位の炎症を治
療する目的で局部的に投与されてもよい。

【０００８】他方は，造血あるいはリンパ球生成の機能
障害あるいは機能不全の治療に使用される組成物であっ
て，この組成物は軟骨誘導因子を含有する。

【０００９】以下に本発明を詳細に説明する。

【００１０】ここで用いられているように，「炎症」と
いう言葉は，急性反応（すなわち，炎症の進行が活発で
ある反応）および慢性反応（すなわち，進行が遅くしか
も新しい結合組織が形成される反応）の両方を包含する
ものとする。慢性炎と急性炎とは含有される細胞の型に
より区別されよう。急性炎は多形核好中球を含むことが
よくあり，これに対し慢性炎は通常リンパ組織球性反応
および／もしくは肉芽性反応により特徴付けられる。特
別な型の炎症としては，例えば広範性炎，局在性炎，ク
ループ性炎，間質性炎，閉塞性炎，実質性炎，反応性
炎，特異性炎，毒性炎および外傷性炎がある。

【００１１】ここで用いられているように，「治療す
る」という言葉は予防あるいは現状の減弱化を意味する
ものとする。従って，炎症の場合，本発明方法は炎症を
予防するかあるいは存在する炎症を軽減する目的で使用
されよう。

【００１２】ポリペプチドの記載で用いられているよう
な「機能的に等価な」という言葉は，天然あるいは人工
のものにかかわらず，また種あるいは起源にかかわら
ず，言及されているポリペプチドと同じアミノ酸配列を
有するポリペプチド，また実質的に相同である（すなわ
ち，アミノ酸配列が少なくとも90％同一である）がアミ
ノ酸配列が異なり，この相違が抗炎症活性に逆効果をお
よぼさないようなポリペプチドを意味するものとする。

【００１３】CIF-Ａ，CIF-ＢおよびTGF-βは Methods f
or Preparation of Media, Supplements, and Sub- st
rate for Serum-Free Animal Cell Culture ( 1984) pp
181-194, Alan R. Liss, Inc.に記載されているTGF-β
検定で活性を示す。この検定は，軟寒天中の細胞コロニ
ー形成を調べて，非新生物性の正常ラット腎（NRK)線維
芽細胞における固定非依存性増殖の誘導能を決定するも
のである。血小板，胎盤および腎の組織からTGF-βを得
る手順は国際特許公報 WO84/01106 号および EPA公報01
28849 号に記載されている。簡単に言えば，この手順に
は，供給源材料を酸−エタノールで抽出し，ゲル濾過に
よりこの抽出物を分画し，そして高速液体クロマトグラ
フィー（HPLC）によりこの濾過物からTGF-βを分離する
ことが含まれる。

【００１４】ウシ骨からCIF を分離する手順は特開昭61
-36223号（公開日1986年２月20日）に記載されている。
それには，脱無機質化した骨（DMB)を非線維性蛋白を可
溶化する抽出液（例えば，≧４M 塩酸グアニジン，８M
尿素）で抽出し，この抽出物をゲル濾過にかけて30Kdよ
り小さい分画を得，この分画をpH 4.5〜5.5 ，好ましく
はpH 4.8でカルボキシメチルセルロース（CMC)のクロマ
トグラフィーにかけ，CMC に吸着された分画をNaCl勾配
により溶出し，そして約 150〜250mM NaClで溶出した部
分の蛋白を RP-HPLCあるいはゲル電気泳動により精製す
ることが含まれる。

【００１５】現在までに天然源から分離されているCIF-
Ａ，CIF-ＢおよびTGF-βは，SDS-PAGEにより決定した分
子量が約25から26Kdのポリペプチドダイマーである。Na
ture(1985) 316 : 701-705 には，血小板由来のヒトTGF
-βのヌクレオチド配列および推定上のアミノ酸配列が
報告されている。成熱血小板由来のヒトTGF-βは 112ア
ミノ酸長のモノマーからなるホモダイマーとして特徴付
けられている。

【００１６】血小板／胎盤／腎由来のTGF-β，CIF-Ａお
よびCIF-Ｂは，TGF-β活性については非種特異的であ
る。それゆえ，これらポリペプチドは動物種間で高く保
存されており（すなわち，異なる哺乳動物種に由来する
所定のポリペプチドのアミノ酸配列は，あったところで
１つ以上のアミノ酸残基の付加，欠失もしくは置換によ
り変化し，これにより分子の非種特異的な活性に逆効果
が生じることはない），しかも交叉種機能性を有すると
考えられる。従って，CIF-Ａ，CIF-ＢおよびTGF-βは，
様々な動物源の細胞もしくは組織に由来するものであっ
てよく，あるいは組み換えDNA 工学により得てもよい。
これと相関して，ある脊椎動物種由来のCIF （TGF-β）
を他の脊椎動物種の治療に使用することができる。CIF
（TGF-β）の抗炎症剤としての最も一般的な使用法は，
ヒト，家畜例えばウシ，ヒツジおよびブタ，および競技
動物またはペット動物例えばイヌ，ネコおよびウマの治
療にある。CIF-ＡおよびCIF-Ｂは本発明方法で使用され
るのが好ましい。

【００１７】

【実施例】以下の実施例は本発明の特別な実施態様を説
明するものである。それらはいかなる場合においても本
発明を限定するものではない。

【００１８】１．骨からのCIF の調製 Ａ．無機質脱落化骨の調製 屠殺場から新鮮ウシ中足骨を新しく得，ドライアイス上
で輸送した。骨を清掃して骨髄と非骨組織を除き，破壊
して径が１cmより小さい破片にし，そして４℃にてミル
で破砕した。破砕骨を骨１kg当たり 9.4lの２回蒸留水
によりそれぞれ約15分間で２回洗い，次いで0.01N HCl
で４℃にて一晩洗った。洗浄した骨を３×３容量のエタ
ノール，続いて３×３容量のジエチルエーテルを用いて
脱脂した。各洗浄は20分間，終始室温で行なった。得ら
れた脱脂骨粉末を次に0.5N HCl（25l／kg脱脂骨）で４
℃にて無機質脱落化した。酸をデカントしそして得られ
たDMB を洗浄pHが４より高くなるまで洗い，そしてDMB
を吸引濾過にて乾燥した。

【００１９】Ｂ．非コラーゲン性タンパク質の抽出 Ａ項で調製されたDMB を，１kg当たり 3.3lの4M塩酸グ
アニジン，10mMエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）
（pH 6.8），１mM PMSF,および10mM NEMで16時間抽出し
た。浮遊液を吸引濾過し，そして非可溶性材料を再度４
時間抽出した。可溶性分画を合わせ，アミコン限外濾過
（10Ｋ）ユニットを用いた限外濾過により少なくとも５
倍に濃縮し，濃縮物を４日間にわたり35容量の冷却脱イ
オン水６回交換に対して透析し，次いで凍結乾燥した。
本項における全操作は４℃にて行なった。但し，凍結乾
燥は標準的な凍結乾燥条件下にて行なった。

【００２０】Ｃ．ゲル濾過 4M塩酸グアニジンに再溶解したＢ項の抽出物を，4M塩酸
グアニジン，0.02％ソディウム アジド，および10mM E
DTA (pH6.8）で平衡化したセファクリルＳ-200カラム上
で分離した。分画を 280nmの吸光度で分析し，分画を第
２図に示すように合わせた。第２図の分画Ｆ２は低分子
量（LMW,10,000から30,000ダルトン）のタンパク質分画
を構成するが，これを 180容量の脱イオン水６回交換に
対して透析し，凍結乾燥した。凍結乾燥および透析（４
℃）以外の全操作は室温にて行なった。

【００２１】Ｄ．イオン交換クロマトグラフィー Ｃ項の分画Ｆ２を，6M尿素，10mM NaCl,１mM NEM, およ
び50mM酢酸ナトリウム（pH4.8)に溶解し，10,000rpm に
て５分間遠心分離した。上清を，同じ緩衝液で平衡化し
たCM52（市販のCMC ）カラムで分離した。結合タンパク
質を，同じ緩衝液に溶かした10mMから400mM のNaCl濃度
勾配を用いて，総容量350ml，流速 27ml／時間で，カラ
ムから溶出した。CM-1，CM-2 およびCM-3と名付けた３
つの主要分画を第３図に示すように集めた。CM-2および
CM-3は約 150〜250mM NaClで溶出した。各分画を110 容
量の脱イオン水６回交換に対して４日間透析し，凍結乾
燥した。前述の操作は透析（４℃）以外は全て室温で行
なった。

【００２２】Ｅ．RP-HPLC Ｄ項で合わせ凍結乾燥した分画CM-2およびCM-3をそれぞ
れ0.1 ％トリフルオロ酢酸（TFA)に溶解し，溶液の一部
をVydac C18 RP-HPLC カラム（4.6 mm ID ×25cm）にの
せ，そして 0.1％TFA を用いて1ml／分で５分間洗っ
た。溶離溶媒は 0.1％TFA に溶かした０％から60％のア
セトニトリル濃度勾配で，速度は２％／分とした。

【００２３】合わせたCM-2およびCM-3の RP-HPLCから，
約29.5分のピークＡおよび約31.2分のピークＢの２つの
ピークが得られた。これらピークの蛋白は前記米国特許
出願番号 630,938の主題である。これらはそれぞれCIF-
ＡおよびCIF-Ｂと名付けられている。

【００２４】蛋白は使用するまで 0.1％ TFA／アセトニ
トリル溶離液中にて−20℃で貯蔵した。

【００２５】Ｆ．CIF-ＡおよびCIF-Ｂの特徴付け 以下の表１はCIF-ＡおよびCIF-Ｂの部分的なアミノ酸組
成を示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】CIF-ＡおよびCIF-Ｂの SDS-PAGE 分析は，
いずれも約26,000ダルトンの分子量を有することを示し
ている。両蛋白とも，上述のTGF-β検定において，ヒト
血小板，ヒト胎盤あるいはウシ腎に由来するTGF-βで報
告されているのに匹敵する活性を示した。

【００２８】CIF-ＡおよびCIF-Ｂの最初30個のアミノ酸
のＮ末端アミノ酸配列決定を行い以下の通りであった。

【００２９】

【化１】

【００３０】CIF-ＡのＮ末端アミノ酸は，血小板由来の
ヒトTGF-βで報告されているもの（Nature，下記，参
照）と同じである。

【００３１】２．CIF の抗炎症活性 Ａ．CIF-A/CIF-B を含む移植片の調製 溶液中コラーゲン（CIS,１−３mg蛋白/ml；コラーゲン
コーポレーションからVITROGEN 100 の登録商標で販
売）と骨コラーゲン末（BCP,骨コラーゲンの凍結乾燥固
形物）を混合し，CIS 由来のコラーゲンの最低最終濃度
が10％になるようにして，コラーゲン性担体を調製し
た。CIF-A とCIF-B との重量比２：１の混合物（0.1 ％
TFA 中）を担体に重量比１：1200，１：4500，１：600
0，１：8000および１：20000 で添加した。これら処方
物を４℃で１−２時間攪拌し，そして直接凍結乾燥する
かあるいは水で透析した後凍結乾燥した。担体のみのも
のを比較対照として使用した。

【００３２】Ｂ．Ａ項の移植処方物の組織学的評価 １．移植 凍結乾燥した処方物を２重量部の冷却滅菌水で再水和さ
せ，混合して均質なペーストにした。再水和させた材料
を密に詰まったペレット（湿重量80−100mg）にした。
このペレットを若い雄ラットの腹部胸郭領域に皮下移植
した。各ラットは左右両側に移植を受けた。移植後３，
10および14日目に体外移植組織を回収し，組織学的に評
価した。

【００３３】２．組織学的評価 体外移植組織を10％中性ホルマリンで固定し，通常の方
法によりパラフィン包埋した。続いて切片をヘマトキシ
リン−エオジンあるいはゴモリ三重染色法のいずれかで
染色した。

【００３４】３．結果 組織学的評価の結果を以下に概括する。

【００３５】＜移植後３日＞ １．担体のみ 移植後３日目，移植片は大部分が非細胞性であった。ま
ばらな好中球が最も明白な細胞型であった。

【００３６】２．CIF-担体 移植片は３日目ではやはり相対的に非細胞性であった。
しかし，隣接筋や周辺の皮下組織から線維芽細胞が明ら
かに活発化していた。これら線維芽細胞は細胞質に富ん
でおり，しかもたいてい正染性であり，これは細胞が大
いに活発化されていることを示していた。線維芽細胞の
浸潤は移植片の縁に始まっていた。

【００３７】＜移植後10日＞ １．担体のみ 移植後10日までに炎症のプロフィールは顕著に変化し
た。移植片には，散在性に混合された炎症細胞浸潤物が
含まれており，これは主にリンパ球および組織球で占め
られていた。顆粒球（好中球および好酸球）および巨大
細胞の焦点領域がいくつかの骨コラーゲン粒子の周辺で
明らかに見られた。

【００３８】２．CIF-担体 この時点では，移植片に関連した炎症細胞はほとんどな
かった。移植片全体に多くの増殖性線維芽細胞が存在し
た。骨コラーゲン末粒子の周辺および周囲にコラーゲン
性結合組織のマトリクスが明らかに見られた。

【００３９】＜移植後14日＞ １．担体のみ 移植後14日までに大部分の骨コラーゲン粒子は，リンパ
球，組織球および巨大細胞から成る肉芽腫により隔離さ
れていた。好酸球の多焦点領域とともに，移植片に関連
した線維形成が明らかに観察された。

【００４０】２．CIF-担体 対照の移植片に比べ，移植片に関連した炎症は無視でき
るほどであった。移植片全体に密なコラーゲン性結合組
織のマトリクスが明らかに観察された。形態学的には，
線維芽細胞はより初期の時点に比べ代謝的に活性が低い
ようであった。

【００４１】これらの組織学的観察は，CIF がin vivo
で炎症細胞の機能を抑制することを示している。CIF を
含む移植片部位で多形核好中球，リンパ球および組織球
が存在しないことから，CIF が効能を有する抗炎症剤と
して作用する可能性が示唆される。

【００４２】CIF 対担体の重量比が１：8000および１：
20000 の移植片では，担体のみの移植片に比べて，移植
片に関連した炎症は顕著に減少していた。CIF 対担体の
重量比がより高い移植片では移植片全体に密なコラーゲ
ン性結合組織のマトリクスが発達いていた。全てのCIF
レベルにおいて，移植片に関連した炎症はCIF が無い場
合に比べ無視できるほどであった。

【００４３】同様なin vivo実験として，CIF 含有抽出
物を含む移植片と含まない移植片とをラットの左右両側
に付けたが，CIF を含む移植片から離れた移植片におい
て炎症が減少するかあるいは存在しないことが注目され
た。これらの観察はCIF が局所的にも全身的にも作用す
ることを示している。

【００４４】局所性抗炎症剤として使用する場合，CIF
（および／もしくはTGF-β）は通常その有効量が製剤的
に受け入れ可能な担体とともに処方され，その担体に対
する重量比は１：1000から１：20000 の範囲にある。そ
の部位での組織沈着が望ましくない場合は，担体に対す
るCIF のレベルを組織沈着を促進するレベルより下に
（例えば，コラーゲン担体の場合は約１：6000より低い
重量比に）下げてもよい。CIF は，注入可能なものとし
て処方される以外に，例えばコラーゲン性のやわらかい
あるいはかたい組織移植片，プロテーゼ，スポンジ，傷
包帯および縫合糸のような固体の浸透性移植片に組み込
ませて（分散させて），これら固形本体に対する局所的
な炎症反応を緩和することができる。このような移植片
は浸透性の材料でできているので，CIF は移植片から拡
散してその抗炎症特性を発揮することができる。CIF の
他の活性（細胞増殖，組織沈着）を最小限に抑えること
が望ましい場合は，CIF は，活性剤あるいは助因子無し
で，好ましくは組織沈着を促進するレベルより低いレベ
ルで組み込ませる。

【００４５】体内部位の炎症を局所的に治療する目的で
使用する場合，CIF あるいはTGF-βを含む処方物は，そ
の特別な処方形式および炎症の制御が望まれる部位に応
じて，局所的に注入，吸入，外科的に配置あるいは別法
で投与される。

【００４６】全身性の投与用としては，CIF は，循環中
注射用の水溶性蛋白とともに使用される従来の担体と一
緒に処方してよい。あるいは，治療指示により必要とさ
れるならば，持続放出性の移植片処方物として処方して
もよい。

【００４７】炎症治療のためのCIF （TGF-β）の投与量
は患者，治療しようとする炎症の状態，および投与方式
に依る。一般には，ヒト成人用量は約 0.1から1000μg
の範囲であろう。CIF を局所的に投与する場合は，この
範囲のより低い量が通常使用され，典型的には 0.1から
10μg であろう。これに相当して，全身性投与の場合は
典型的には10から1000μg の範囲の量であろう。

【００４８】CIF は呼吸系を含む炎症の治療に特に有効
であろう。この適用においては，CIF は適当なエーロゾ
ルとともに吸入投与すればよい。この型では，これら因
子は，石綿沈着症，珪肺症あるいは炭坑夫の肺塵症のよ
うな肺の広範間質性疾患の治療；リューマチ性関節炎，
紅斑性狼瘡あるいはグッドパスチャー症候群のような気
道を含む免疫学的疾患の治療；およびヴェーゲナー肉芽
腫症および好酸性肉芽腫症のような肺や肺管の肉芽性炎
の治療に有用であろう。

【００４９】これら抗炎症性のペプチドは，膏薬，軟膏
あるいは他の局所処方の型で担体に結合させてもよく，
よって局所適用することにより皮膚炎の制御に有用とな
ろう。このような処方は特に，尋常性乾癬，接触皮膚
炎，皮膚潰瘍，および急性あるいは慢性の湿疹性皮膚炎
の局所治療に有用であろう。

【００５０】CIF は単独で使用するかあるいは徐放性担
体と結合させるかして，関節，骨あるいは筋肉の中もし
くはその周辺に注射し，様々な疾患に伴う炎症を制御す
るようにしてもよい。いくつかの例として，筋炎（ウィ
ルス性，細菌性，寄生虫性，菌類性あるいは自己免疫
性），重症筋無力症，骨髄炎，変形性関節症およびリュ
ーマチ性関節炎が含まれる。

【００５１】CIF 分子は低pHで安定でしかも酵素消化に
抵抗性であることが示されているので，これら因子は摂
取により全身的に投与してもよい。このような性質によ
りこれら因子は特に消化管の炎症を制御するのに有用と
なる。特に，胃潰瘍や十二指腸潰瘍，肉芽性胃炎，食道
炎（多くの原因による）；腸炎（多くの原因による）；
および大腸炎（多くの原因による）の治療に有用であろ
う。

【００５２】３．CIF-A （TGF-β）の免疫組織化学的部
位決定材料および方法 Ａ．合成ポリペプチドの合成 合成ポリペプチド（A1/30 とする）を，CIF-A およびTG
F-βのＮ末端アミノ酸配列（１〜30残基）と同じになる
ように構築した。ペプチドA1/30 は固相法により合成し
た。ペプチドをｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂上
に集め，樹脂から切り離し，２段階のフッ化水素処理に
より保護をはずし，そしてオクタデシルシリカでの逆相
液体クロマトグラフィーにより精製した。ペプチドA1/3
0 は，RP-HPLC および薄層クロマトグラフィーにより均
質であることを決定し，また気相連続分析によりそのア
ミノ酸配列を確かめた。

【００５３】Ｂ．放射性ヨー素化 精製したCIF-A およびCIF-B を，ラクトペルオキシダー
ゼ法を用いてNa¹²⁵Iで放射性ヨー素化した。比活性は
0.8〜1.0 ×10⁷cpm／μg 蛋白であった。

【００５４】Ｃ．免疫化 ニュージーランド白ウサギをペプチドA1/30 で免疫化し
た。１回の注射で 250から 500μg のペプチドA1/30 を
使用し，６から10週間にわたり隔週で，筋肉内の多数箇
所に注射した。初回の免疫化はFreundの完全アジュバン
ドで，その後のブースター注射はFreundの不完全アジュ
バンドで行なった。最後のブースター注射後10日目に，
ウサギの心臓に穴をあけて放血させた。血液を22℃で４
時間，そして４℃で一晩おいて凝固させ，血清を集めて
−70℃にて貯蔵した。

【００５５】Ｄ．抗体の精製 血清IgG をセファロース プロテイン−Ａを用いて精製
した。簡単に言えば，血清を等量の0.15M NaCl含有0.01
M トリス（pH7.2)で稀釈した。pH8.0 に調整した等量の
飽和硫安を用いて４℃にて抗体を沈降させ，そして100,
000 ×ｇで30分間遠心分離して集めた。この蛋白のペレ
ットをpH7.2 のPBS 最小量に再浮遊させ，PBS に対して
透析した。リテンテート（retentate ）を遠心分離によ
り清澄化し，この上清をセファロース プロテイン−Ａ
の10 mlカラムにかけた。結合IgGを0.1Mグリシン−HCl
(pH2.0)で溶出させた。すぐ抗体を中和し（4.0Mトリ
ス），PBS で透析し，凍結乾燥した。

【００５６】Ｅ．酵素結合イムノソルベント検定（ELIS
A) 抗血清の，ペプチドA1/30 ，CIF-A あるいは低分子量骨
抽出物との反応性について，ELISA により評価した。ペ
プチドA1/30 をPBS 中で可溶化し，これに対し精製CIF-
A あるいは部分精製した骨抽出物は0.01N HCl 中で可溶
化した。抗原を0.01M 炭酸塩緩衝液（pH9.6)で稀釈し，
100μl容量中 400ngの蛋白をマイクロタイタープレー
トのウェルに加えた。ペプチドA1/30 とCIF-A はウェル
上で一晩空気乾燥させた。部分精製抽出物を含むプレー
トは密封して４℃で一晩置いた。使用前に，１％（w/v)
BSA を含むPBS と１時間インキュベートして，ELISA プ
レートへの非特異性の蛋白結合をブロックした。抗血清
を連続２倍稀釈し，各ウェルに 100μlずつ加えて１時
間置いた。プレートを，0.05％(v/v) Tween-20と１％
（w/v)BSA とを含むPBS で洗い，そしてペルオキシダー
ゼ結合ヤギＦ（ab')₂抗ウサギIgG を加えて２時間置い
た。プレートを５〜８回洗い，ペルオキシダーゼの基質
を加えた。この基質は，0.1Mクエン酸塩緩衝液（pH4.0)
に２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリ
ン）スルフォン酸（ABTS，0.03％w/v)と0.03％(v/v) H₂
O₂とを含むものから成る。30分間発色させて，414nm の
吸光度を測定した。

【００５７】Ｆ．抗体競合ELISA 抗体競合ELISA を用いて，ELISA で検出された抗体が抗
原特異的であるか否かを決定した。様々な濃度（１から
100ng)の可溶性競合抗原ペプチド（A1/30)をウェルに加
え，合成樹脂に吸着された合成ポリペプチドへの抗体の
結合を競合させた：この研究では，抗血清を１：5000に
稀釈し，抗体を洗い流し，そして結合抗体をELISA で検
出した。

【００５８】Ｇ．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動 精製蛋白と部分精製蛋白とをSDS-PAGEにより分離した。
濃縮用ゲルは４％，分離用ゲルは15％のポリアクリルア
ミドとした。ゲルは銀染色するか，あるいは電気泳動的
にニトロセルロースヘ移した。いくつかの場合では，内
部標準としての¹²⁵I標識CIF-A でゲルを“スパイク（sp
ike)”し，ゲル中のCIF-A あるいはブロット蛋白を同定
した。

【００５９】Ｈ．二次元酢酸−尿素 PAGE 部分精製した低分子量骨抽出物を二次元ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により評価した。蛋白（20から40μ
ｇ）を，ガラス管（２×４×125 mm）内の2.5M尿素と酢
酸とを含む15％ポリアクリルアミド中で160V（一定電
圧）にて５〜６時間一次元的に泳動させ，次に15％SDS-
ポリアクリルアミドスラブゲル中で二次元的に泳動させ
て，（その大きさと電荷により）分離した。ゲルを銀染
色するか，あるいは蛋白をニトロセルロースへ移した
（下記）。いくつかの場合では，ゲルを¹²⁵I標識したCI
F-A およびCIF-B で“スパイク（spike)”し，続いてオ
ートラジオグラフィーにかけて銀染色ゲル上の因子を同
定した。

【００６０】Ｉ．イムノブロッティング 試料をまず一次元あるいは二次元電気泳動により分離し
た。分離後，25mMトリス（pH8.3)と192 mMグリシン（pH
8.3)とで満たし20％(v/v) メタノールを含むトランスブ
ロット装置を用いて，蛋白をニトロセルロースへ移し
た。蛋白は170mA(一定電流）にて18時間かけて移した。
移した後，0.05％(v/v) Tween-20と１％（w/v)BSA とを
含むPBS 緩衝液を用い１〜２時間かけて，非特異的な蛋
白結合をブロックした。次いで蛋白ブロットを，ウサギ
抗A1/30 血清の１：100 稀釈液中で２時間インキュベー
トした。ブロットを同じ緩衝液で30分洗い，次いで200,
000cpm/ml〔¹²⁵I〕プロテイン−Ａと１時間インキュベ
ートした。イムノブロットを洗い，空気乾燥させ，そし
てコダックXAR-5 フィルムを用いて−80℃にて１〜18時
間オートラジオグラフィーにかけた。

【００６１】Ｊ．免疫組織化学的染色 CIF-A の細胞連合性および細胞分布性を免疫組織化学的
染色法により決定した。胎児ウシ組織は妊娠６ヶ月目の
１匹のウシから集めた。組織を10％中性ホルマリンで固
定した。硬組織は10％蟻酸で無機質脱落化した。組織を
脱水し，FisherHistomatic Tissue Processorモデル 16
6A (150時間サイクル）を用いてパラフィン包埋した。
切片をキシレンで脱パラフィンし，0.15M NaClを含む0.
01M トリスに0.1 ％過酸化水素を溶かした溶液で内在性
ペルオキシダーゼをブロックした（15分）。次に切片
を，0.1M酢酸ナトリウム（pH5.5)の食塩水溶液に１mg/m
l睾丸ヒアルロニダーゼを含む溶液で，37℃にて30分間
処理した。非特異的蛋白結合は，トリス−食塩水に0.5
％（w/v)BSA を含む溶液で15分間ブロックした。切片
を，至適稀釈（１：50）したウサギ（IgG)抗A1/30 ある
いは免疫性のないウサギIgG と１時間インキュベート
し，トリス−食塩水で洗い，そしてペルオキシダーゼ結
合ヤギＦ(ab')₂抗ウサギIgG と１時間インキュベートし
た。スライドをジアミノベンジディン基質緩衝液で処理
した。この基質緩衝液は，0.1 ％過酸化水素を含む0.05
M トリス（pH）−食塩水に0.5mg/mlジアミノベンジディ
ンを溶かして成る。切片をMayer のヘマトキシリンで対
比染色した。

【００６２】結果 Ａ．抗体反応性 抗血清の力価は，A1／30およびCIF-Ａでは１：10,000，
またCIF-Ａを含む部分精製骨抽出物では１：1,000 であ
った。抗体はまた予想通り血小板のTGF-βとも反応し，
これはＮ末端配列が等しいからである。

【００６３】競合 ELISA法を用いて，ELISA で検出され
た抗体が抗原特異性抗体であるか否かを決定した。この
実験では，合成樹脂に結合した 400ngのペプチドA1／30
への抗血清至適稀釈液（１：5,000 ）の結合を，様々な
量（１〜100ng)の可溶性合成ポリペプチドで競合させ
た。抗体結合の競合は直線型の用量反応様式を示し，10
0ng の可溶性競合物質では結合は80％以上競合された。
抗体の直線的タイトレーション特性および結合における
直線的かつほぼ完全な競合から，抗体は抗原特異的であ
ることが示唆される。抗体の特異性はまたイムノブロッ
ティング法によっても確認され，この方法では，抗体は
ペプチドA1／30と同様非還元CIF-Ａともβ−メルカプト
エタノールで還元したCIF-Ａとも免疫反応性を有してい
た。ペプチドA1／30に対する抗体はCIF-Ａと免疫反応性
を有することが決定されたので，それらを用いて骨粗抽
出物中に他の分子量種のCIF-Ａが含まれているか否かを
決定した。高分子量および低分子量の骨抽出物を調製
し，ゲル電気泳動により成分蛋白を分離した。銀染色ゲ
ルおよび二重イムノブロットを調製した。試験により，
高分子量および低分子量の骨抽出物のいずれにおいても
CIF-Ａと同じ分子量の蛋白のみがペプチドA1／30に対す
る抗体により検出されることが示された。

【００６４】Ｂ．細胞連合性および組織分布 染色により大腿骨網状骨内の骨細胞が特異的に標識され
た。さらに，関節軟骨細胞，特に軟骨管に強く連合して
いる細胞が強く染色された。骨端軟骨内の軟骨細胞は抗
体により標識されなかった。

【００６５】腎組織および血小板を調べた。腎杯に沿っ
て並ぶ上皮細胞が特異的に染色されたのに対し，周囲の
間質細胞や実質細胞は抗A1／30抗体で標識されなかっ
た。骨髄も調べたが，血小板産生巨核球が抗体で特異的
に標識された。いくつかの単核性骨髄細胞もまた抗体に
より染色された。

【００６６】また染色を行って，CIF-Ａが造血およびリ
ンパ球生成の中心とも連合しているか否かを決定した。
胎児肝内の造血幹細胞群の細胞質は強く染色されたが，
肝実質細胞や間質細胞は標識されなかった。骨髄中の造
血幹細胞は抗体により特異的に染色された。胸腺を調べ
たが，ハッサル小体といくつかの胸腺髄質細胞が特異的
に染色されるのが観察された。より未分化の胸腺皮質細
胞では特異的な染色はみられなかった。さらに染色の研
究を行って，CIF-Ａの胸腺局在を確かめた。CIF-Ａに対
する抗体により，胸腺髄質部の網状上皮細胞およびハッ
サル小体含有上皮細胞が特異的に染色された。皮質部の
上皮細胞およびそれを取り囲む被膜は抗体で染色されな
かった。被膜下の皮質性あるいは髄質性の胸腺細胞では
検出可能な染色はみられなかった。

【００６７】大動脈とともに，甲状腺，副腎および下顎
唾液腺を含む他の組織を調べた。これら組織のいずれに
おいても，CIF-Ａは染色技術により検出されなかった。

【００６８】造血中心（骨髄および肝）およびリンパ球
生成中心（胸腺）におけるCIF-Ａ／TGF-βの局在は，こ
の分子がin vivoで赤血球および／もしくはリンパ球の
分化を調節している可能性を示唆している。従って，CI
F は，先天性胸腺形成不全，重症連合免疫欠損，遺伝性
溶血性貧血および後天性溶血性貧血のような，造血およ
び／もしくはリンパ球生成における機能障害あるいは機
能不全に伴う適応症の治療に使用されるであろう。

【００６９】４．発達中のＴリンパ球に対するCIF の活
性 発達中のＴリンパ球に本来CIF が関連していることが確
立されているので，以下の試験を行って，胸腺細胞のマ
イトジェン反応に対するCIF の効果を決定した。

【００７０】Ａ．細胞培養の調製 ネズミ科（C3H/HeJ)胸腺細胞の単細胞浮遊液を調製し
た。細胞は，５％胎児ウシ血清，100U/mlペニシリン，1
00μg /mlストレプトマイシン，２mM Ｌ−グルタミン
および５×10^-5M ２−メルカプトエタノールを添加した
Eagleの最少必須培地に浮遊させた。細胞形態およびト
リパン青による除外により細胞の生存能力を決定した。

【００７１】Ｂ．IL-1検定 胸腺細胞（１×10⁶ ）を平底96ウェルマイクロタイター
プレートにまいた。細胞を，至適濃度のフィトヘムアグ
ルチニン（PHA)とIL-1（２U IL-1とPHA ）とで共同刺激
した。エンドトキシンを含まない精製ヒト単核血球に由
来する，IL-1あるいは組み換えIL-1（rIL-1 ）を使用し
た。胸腺細胞の増殖反応が最大限の半分に達するIL-1の
量を１ユニットの比活性と定義した。異なる量のCIF-Ａ
（TGF-β）あるいはCIF-Ｂを胸腺細胞培養に加えた（第
４図〜第７図参照）。湿らせたインキュベーター中，５
％CO₂ ，37℃で72時間細胞を培養した。採集に先立ち
（24時間），培養物を 0.5μCiの ³Ｈ−チミジンでパル
スした。半自動細胞採集機を用いて培養物を集め，標準
的な液体シンチレーション法により ³Ｈ−チミジン取込
量を，決定した。

【００７２】結果 第４図から第７図に試験結果をグラフで示す。 第４図
Ａに示されるように，1.9×10^-11Mおよび 1.5×10^-10M
の濃度のTGF-βでは，２U から40UのrIL-1 で処理した
胸腺細胞培養物による ³Ｈ−チミジン取込みが（対照の
86％から92％）阻害された。培養濃度 1.9×10^-12MのTG
F-βは，試験した各濃度のrIL-1 で増殖反応を49％から
59％阻害した。同様に ，1.9×10^-10M CIF-Ｂは，試験
した全ての濃度のrIL-1 に対して胸腺細胞の増殖を（対
照の90％）阻害した。対照の未処理培養物に比べ， 1.5
×10^-11M CIF-Ｂを含む胸腺細胞培養物では50％から60
％阻害され，これに対し，1.9×10^-12M CIF-Ｂで処理し
た培養物では17％から26％阻害された。TGF-βあるいは
CIF-Ｂで処理した培養物の細胞生存能力は，細胞形態お
よびトリパン青による除外で判定した場合，未処理培養
物に匹敵し得るものであった。

【００７３】TGF-βおよびCIF-Ｂの有効量の範囲を第５
図に示す。両因子とも有効両の範囲は10^-12Mと10^-10Mと
の間にあった。両因子とも約２×10^-10Mの培養濃度で最
大阻害（対照の90％）を示した。最大阻害の半分を示す
濃度はTGF-βおよびCIF-Ｂでそれぞれ６×10^-12Mおよび
４×10^-12Mであった。

【００７４】第４図および第５図に示された結果から，
培養物にTGF-βあるいはCIF-ＢをIL-1およびPHA と同時
に加えると，増殖反応が用量依存性に阻害されることが
わかる。第６図は，前もってマイトジェンで刺激された
胸腺細胞に対するこれら因子の効果を示している。この
実験では，TGF-βあるいはCIF-Ｂ（ 1.9×10^-10M）を加
える前に，胸腺細胞培養物を２U IL-1とPHA とで１時間
から48時間刺激した。第６図の結果は，前もってマイト
ジェンで１時間から６時間刺激された培養物では外因性
のTGF-βあるいはCIF-Ｂの添加により有意に（対照の86
％）阻害されることを示している。24時間前刺激された
胸腺細胞はTGF-βあるいはCIF-Ｂ処理により一部（対照
の47％から63％）阻害された。48時間前刺激された胸腺
細胞はTGF-βあるいはCIF-Ｂ処理により影響を受けない
か，あるいはほんのわずか（対照の27％）阻害されるだ
けであった。

【００７５】第６図に示されるように，細胞を初期誘導
段階でTGF-βあるいはCIF-Ｂにさらした場合，これら因
子は最も効果的にマイトジェン反応を抑制した。阻害効
果を維持するためにはこれら因子に連続的にさらす必要
があるか否かは第７図の結果からわかる。これらの実験
では，異なる濃度のTGF-βあるいはCIF-Ｂを入れた培養
管で胸腺細胞を前処理（１時間から４時間）した。前処
理細胞を全体的に洗浄して外因性因子を除き，次いで２
U IL-1とPHA とを入れたミクロ培養に移してさらに72時
間おいた。対照の培養としては，TGF-βあるいはCIF-Ｂ
を直接ミクロ培養用ウェルに加えた以外は，前処理培養
の場合と同じように処理した。結果は，TGF-βあるいは
CIF-Ｂ（10^-10M）で４時間前処理した細胞は，未処理の
対照培養物に比べ，その後のマイトジェン刺激に対する
反応性が低かった（対照の50％）ことを示している。10
^-10MのTGF-βあるいはCIF-Ｂで１時間から２時間前処理
した細胞はマイトジェン刺激にほんのわずかの反応性
（それぞれ，20％から30％）しか示さなかった。低濃度
（10^-12Mおよび10^-11M）の因子で１時間から２時間前処
理した細胞はIL-1誘導に対する反応が阻害されなかっ
た。

【００７６】実施例４の結果は，免疫局在の結果と関連
して，TGF-β（そしておそらくCIF-Ｂ）が発達中のＴリ
ンパ球のクローン増大を制御することにより生理学的な
機能を果たす可能性を示唆している。またさらに，ハッ
サル小体を有する細胞はおそらく胸腺中でTGF-β産生に
寄与する細胞型であろうことが示唆される。この概念
は，一部は，動物全体を放射性標識する研究により支持
される。この研究では，胸腺細胞増殖の大半は胸腺の被
膜下領域と皮質部とに限定されており，また胸腺細胞の
成熟は胸腺の髄質部内に区画されていることが示されて
いる。

【００７７】TGF-βやCIF-Ｂが胸腺細胞の増殖反応を阻
害するメカニズムはわかっていないが，おそらく，IL-1
処理した胸腺細胞によるIL-2産生およびIL-2レセプター
発現がこれら因子により混乱されるからと説明されよ
う。細胞がこの成長因子あるいはレセプターのいずれか
を産生しそこなえば，Ｔリンパ球は活性化されそこなう
であろう。

【００７８】５．成熟リンパ球に対するCIF の活性 材料および方法 Ａ．末梢血リンパ球の精製 健常成人給血者のヘパリン処理した血液から，Ficoll-H
ypaque密度勾配で末梢血単核細胞を単離した。赤血球を
含まない淡黄膜を水−フィコール界面から集めた。10％
胎児ウシ血清（FCS)を含むRPMI 1640 培地中の組織培養
プラスチック上で37℃，１時間インキュベートして，単
球を除去した。0.25％ヒツジ赤血球（Ｅ−ロゼット）を
用い37℃，２時間，ロゼット法によりＴ−リンパ球を非
粘着性細胞から単離した。Ficoll-Hypaque中， 500×ｇ
で30分から40分遠心分離して，Ｅ−ロゼットを形成した
Ｔ−リンパ球をロゼットを形成しないＢリンパ球と分離
した。そのペレットは＞95％がＥ−ロゼットを形成した
細胞であった。ヒツジ赤血球を0.83％塩化アンモニウム
で溶血した。

【００７９】ロゼットを形成しないＢリンパ球をフィコ
ール−水界面から集めた。

【００８０】Ｂ．Ｔ細胞のマイトジェン検定 Ｔリンパ球の増殖をマイトジェンマイクロアッセイによ
り評価した。検定は96ウェルマイクロアッセイプレート
に 0.2×10⁵ Ｔ細胞をまくことから成る。細胞を，Ｌ−
グルタミン，ペニシリン−ストレプトマイシンおよび10
％FCS を添加したRPMI 1640培地で培養した。この培養
物をコンカナバリン−Ａ（6.2 から24μg/ml）でマイト
ジェン刺激した。このミクロ培養物中にCIF-AあるいはC
IF-B を0.01から40ng/mlの間で加えた。最終培養容量を
250μlに調整し，この混合物を湿らせたインキュベー
ター中，５％CO₂ 大気下，37℃で５日間インキュベート
した。自動細胞採集機で採集する18時間前に，培養物を
1.0 μCiの³H−チミジン（比活性25Ci/mモル）でパルス
した。種々の濃度のCIF-A あるいはCIF-B による3H−チ
ミジン取込みの阻害を，３組の培養物から次式により決
定した。

【００８１】

【数１】

【００８２】Ｃ．Ｂ細胞の活性化検定 10⁵ Ｔリンパ球を 2.5×10⁵ の新鮮な自己由来Ｂリンパ
球と混合して，リンパ球培養物を作った。細胞を，Ｌ−
グルタミン，ペニシリン−ストレプトマイシンおよび10
％FCS を添加したRPMI 1640 培地1ml中で５％CO₂ ，37
℃にて培養した。この培養物を12×75mm培養管に入れ
た。Pokeweedマイトジェンを1/100 稀釈して培養物に加
えた。これら培養物に，種々の濃度（1.9 ×10^-12M，1.
9 ×10^-10Mあるいは 1.5×10^-9M)のCIF-A あるいはCIF-
B のいずれかを加えた。細胞を７日間培養した。

【００８３】培養期間の最後で，細胞を含まない培養上
澄液をサンドウィッチELISA 法によりIgM あるいはIgG
について検定した。平底の塩化ポリビニル マイクロタ
イタープレートを，リン酸塩で緩衝化した食塩水（PBS)
中で約120 から 500μｇのアフィニティ精製済ヤギ抗ヒ
トIgM あるいはIgG と，４℃で一晩インキュベートし
た。非結合抗体を除去するために，プレートを0.05％Tw
een-20を含むPBS （PT緩衝液）で洗った。培養上澄液
を，0.05％Tween-20と0.5 ％ウシ血清アルブミンとを含
むPBS (PTB緩衝液）で1/10か1/100 に稀釈した。標準曲
線作製のため，種々の濃度（２から10ng）の精製ヒトIg
G あるいはIgM を適当なウェルに加えた。室温で２時間
置いた後，プレートをPT緩衝液で洗った。1/5000稀釈し
たペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG あるいは抗ヒト
IgM を 100μlずつウェルに加えた。１時間インキュベ
ートした後，プレートをPT緩衝液で洗い， 100μlの新
しく調製した基質を加えた。この基質は0.1Mクエン酸塩
緩衝液（pH4.0)に0.03％（w/v)ABTSと0.03％(v/v) 過酸
化水素を含むものからなる。30分間発色させ，414nm の
吸光度を決定した。IgG あるいはIgM の濃度は，この検
定と同時に作製した標準曲線から算出した。Ｂ細胞によ
るIgG 産生あるいはIgM 産生の阻害は，CIF-A あるいは
CIF-B で処理した培養物をCIF 処理していない対照の培
養物と比較することにより算出した。次式を用いた。

【００８４】

【数２】

【００８５】結果 Ｔ細胞の増殖検定の結果を第８図にプロットする。この
図からわかるように，CIF-A とCIF-B のいずれもＴリン
パ球増殖に対し匹敵する活性を有することが見出され
た。³H−チミジン取込みは，約38×10^-12MのCIF-A ある
いはCIF-B により78％から80％阻害された。CIF-A では
１×10^-12Mより低い濃度で最大活性の半分が得られた。
CIF-B で最大活性の半分が得られる濃度は約 1.9×10
^-12Mと概算された。これらの結果は明らかに，両CIF と
もヒトＴリンパ球増殖の有力な阻害剤であることを示し
ている。

【００８６】Ｂ細胞の活性化検定の結果を以下の表２に
概括する。示されたデータは３つの実験に対する平均±
SDで表してある。

【００８７】

【表２】

【００８８】表２に示されるように，未処理の対照培養
と比べた場合， 1.9×10^-12MのCIF-A では産生IgM 量が
33％減少しIgG は16％減少した。 1.9×10^-10Mあるいは
1.5×10^-9M の濃度のCIF-A を含む培養ではIgM 産生は
完全に阻害された。同様の濃度のCIF-A でIgG 産生は54
％から56％阻害された。

【００８９】CIF-B はCIF-A に匹敵し得ることが見出さ
れた。表２に示されるように，未処理の対照培養と比べ
た場合， 1.9×10^-10M濃度のCIF-B を含む培養ではIgM
は含まれず，またIgG は54％だけであった。1.5 ×10^-9
M 濃度のCIF-B で処理した培養では，測定可能なIgM は
含まれず，またIgG はほんのわずか（89％阻害）である
か全く無かった。これらの結果は，CIF-A とCIF-B のい
ずれも血漿細胞による抗体産生に対し非常に有力な阻害
剤であることを示している。

【００９０】これらin vitro でのＴ細胞増殖およびＢ
細胞活性化の実験は，リンパ球制御が，既に観察されて
いるin vivoでのCIF によるリンパ組織球性抗炎症活性
に含まれる１機構である可能性を示唆している。これら
試験の結果はKehrl, j.h., et al, Clinical Research
(1985) 610Aが報告した研究を確証するものである。 ６．齧歯類関節炎モデルにおけるCIF を用いたin vivo
試験 実験的なコラーゲン誘導関節炎（ECIA）は，Freundの不
完全アジュバント中に乳状化させた天然II型コラーゲン
（ウシあるいはラット）をラットの皮膚内に注射するこ
とにより誘導できる。同系繁殖のLewis ラット系 LEW
（RT1¹) では，免疫後14日から30日以内で末梢性多関節
炎が生じることがわかっている。関節および耳の軟骨で
広範性の単核細胞の浸潤物が生じる。感作ラットは皮膚
内の皮膚チャレンジ試験に応答して，天然II型コラーゲ
ンに対する循環抗体を生じる。

【００９１】LEW ラット（12−15週令）12匹を４匹ずつ
３群に分ける。第I群および第II群は，Freundの完全ア
ジュバント中ウシII型コラーゲンを2.5ml／Kg体重，皮
膚内注射して，ウシII型コラーゲンに感作させる。第II
I群は非感作の対照とする。感作前および試験の間定期
的に，足くびの測定と関節炎の主観的なグレーディング
（０から＋４）を行う。関節炎のグレーディングは指，
足および足くびの炎症や膨張の程度に基づいて行う。有
意な炎症反応を示した第Ｉ群のラットは，反応が観察さ
れてから１，３，５および７日目に，CIF （0.05 ml滅
菌PBS に500ng溶かしたもの）を直接関節に注射して処
理する。同様な反応を示した第II群のラットは，CIF を
含まないPBS を注射して同様に処理する。

【００９２】処理前および処理後に，ラットから血清を
集め，ELISA によりII型コラーゲンに対する抗体につい
て検定する。ラットは，殺す３日前に腹部に50μｇのII
型コラーゲンを用いて皮膚内の皮膚チャレンジ試験を施
す。チャレンジ後24，48および72時間目に，紅斑と硬化
を測定する。72時間目にチャレンジ部位を生検し，また
組織学的に調べる。

【００９３】最後に注射して５から７日目にラットを殺
し，放血し，組織学的検査用にその足を10％中性ホルマ
リン中で固定する。

【００９４】これら試験の結果は，CIF による処理が未
処理の対照群に比べて有意に炎症を低下させることを示
している。CIF 処理群は未処理対照群と比べた場合，II
型コラーゲンの皮膚チャレンジテストに対する反応が低
下する。さらに，処理群ではII型コラーゲンに対する抗
体力価が有意に低下している。これらの結果は，病気に
おかされた関節にCIF を投与すると炎症を局所的に制御
するだけでなく，関節炎治療用の全身性免疫抑制剤とし
ても作用することを示唆している。

【００９５】

【発明の効果】急性および／もしくは慢性の炎症をCIF
（TGF-β）により治療する。CIF は適応症によって局所
的あるいは全身的に投与でき，しかも効力用に活性剤あ
るいは助因子を共に投与する必要はない。

【図面の簡単な説明】

【図１】血小板由来のヒトTGF-βモノマーのアミノ酸配
列である。

【図２】実施例１（Ｃ項）のゲル濾過分画の吸光度（吸
収）（280nm)のグラフである。

【図３】実施例１（Ｄ項）の予備のイオン交換クロマト
グラフィーの溶出分画の吸光度（280nm)のグラフであ
る。

【図４】ＡおよびＢは異なる量の組み換えIL-1（rIL-1)
刺激によるネズミ科胸腺細胞の増殖に対する，CIF-A
（TGF-β）およびCIF-B の効果をグラフで示している
（実施例４）。

【図５】TGF-βおよびCIF-B による，刺激されたネズミ
科胸腺細胞の増殖の用量依存性の阻害を示すグラフであ
る（実施例４）。

【図６】IL-1で異なる時間前刺激した胸腺細胞培養に対
するTGF-βおよびCIF-Bの効果を示すグラフである（実
施例４）。

【図７】ＡおよびＢはIL-1による増殖への反応性に対す
るTGF-βおよびCIF-Bの前処理の効果をグラフで示して
いる（実施例４）。

【図８】実施例５（Ｂ項）に記載のＴ細胞増殖検定の結
果のグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 35/32 ＡＢＥ 7431−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 14/475 8318−4Ｈ (72)発明者 ラリー エリングスワース アメリカ合衆国 カリフォルニア 94148 サン ホセ，スプリング ブルック 3716 (72)発明者 ローザ アームストロング アメリカ合衆国 カリフォルニア 94303 パロ アルト，ルイス ロード 2106

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】造血あるいはリンパ球生成の機能障害ある
   いは機能不全の治療に使用される組成物であって，軟骨
   誘導因子CIF-AあるいはCIF-Bを含有する組成物。