JPH0797993B2 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
ポリペプチドの製造方法Info
- Publication number
- JPH0797993B2 JPH0797993B2 JP60102801A JP10280185A JPH0797993B2 JP H0797993 B2 JPH0797993 B2 JP H0797993B2 JP 60102801 A JP60102801 A JP 60102801A JP 10280185 A JP10280185 A JP 10280185A JP H0797993 B2 JPH0797993 B2 JP H0797993B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- sequence
- isolation
- pst
- arg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は信号ペプチドを切除する信号ペプチダーゼを含
有する宿主生物を使用することからなるポルペプチドの
製造方法に関する。本発明の内容およびその好適なる態
様を下記に詳述する。
有する宿主生物を使用することからなるポルペプチドの
製造方法に関する。本発明の内容およびその好適なる態
様を下記に詳述する。
ストレプトミセス・テンダエ菌（Streptomyces tenda
e）の発酵によるテンダミスタツト（tendamistat）の調
製法は、すでに西独特許出願P 33 31 860.3号において
提起され、その調製法は、テンダミスタツトを産生し、
また亜致死量（subletnal dose）のアクリフラビンによ
り処理されたストレプトミセス・テンダエ菌株を用いる
ことよりなるものである。テンダミスタツトの遺伝子を
含有するDNA断片がこの処理を受けた菌株から単離され
るが、すなわちそれは2.3kb（キロベース）のPst I断片
（fragment）である。このDNAを大腸菌中において増幅
せしめ、このDNAを純粋な形において再単離すること
は、予めPstにより切断されたプラスミドpBR 322にこの
DNA断片をとりこませることにより可能となつた。
e）の発酵によるテンダミスタツト（tendamistat）の調
製法は、すでに西独特許出願P 33 31 860.3号において
提起され、その調製法は、テンダミスタツトを産生し、
また亜致死量（subletnal dose）のアクリフラビンによ
り処理されたストレプトミセス・テンダエ菌株を用いる
ことよりなるものである。テンダミスタツトの遺伝子を
含有するDNA断片がこの処理を受けた菌株から単離され
るが、すなわちそれは2.3kb（キロベース）のPst I断片
（fragment）である。このDNAを大腸菌中において増幅
せしめ、このDNAを純粋な形において再単離すること
は、予めPstにより切断されたプラスミドpBR 322にこの
DNA断片をとりこませることにより可能となつた。
そして現在、次の式（Ｉ） Met−Arg−Val−Arg−Ale−Leu−Arg−Ｘ−Ala−Ser−A
la （Ｉ） （式中、Ｘはアミノ酸10ないし25個、好適には17ないし
20個（最適には20個）よりなる疎水性領域を表わす）で
示される信号ペプチド（signal peptide）（前ペプチ
ド）が、この2.3kb断片上のテンダミスタツト構造遺伝
子のすぐ上流部位においてコードされることが見いださ
れたのである。
la （Ｉ） （式中、Ｘはアミノ酸10ないし25個、好適には17ないし
20個（最適には20個）よりなる疎水性領域を表わす）で
示される信号ペプチド（signal peptide）（前ペプチ
ド）が、この2.3kb断片上のテンダミスタツト構造遺伝
子のすぐ上流部位においてコードされることが見いださ
れたのである。
さらにまた、この信号ペプチドの使用により、適当な信
号プチチダーゼを含有する宿主細胞から他のペプチドが
培地中へ排出されることも見いだされたのである。かく
して本発明はまた次の式（II） Sig−Ｒ （II） （式中Sigは式（Ｉ）中のアミノ酸配列を表わし、Ｒは
酸性アミノ酸、特にアスパラギン酸が好適にはアミノ末
端に位置するアミノ末端により結合された遺伝的にコー
ド可能なペプチドの残基を表わす）で示される原ペプチ
ド（propeptide）に関するものである。
号プチチダーゼを含有する宿主細胞から他のペプチドが
培地中へ排出されることも見いだされたのである。かく
して本発明はまた次の式（II） Sig−Ｒ （II） （式中Sigは式（Ｉ）中のアミノ酸配列を表わし、Ｒは
酸性アミノ酸、特にアスパラギン酸が好適にはアミノ末
端に位置するアミノ末端により結合された遺伝的にコー
ド可能なペプチドの残基を表わす）で示される原ペプチ
ド（propeptide）に関するものである。
従つて本発明の一つの局面では、Ｒが水素またはペプチ
ド残基例えばテンダミスタツトを表わす式（II）のペプ
チドに関するものである。本発明の他の一つの局面で
は、テンダミスタツトを産生し、好適には予め亜致死量
のアクリフラビンで処理されたストレプトミセス・テン
ダエ菌株からDNA全量単離、Pst Iによる分解、DNA配列
Ａすなわち５′−（32P−）CCT TCA CTG TCG TCT TCG T
A−３′とのサザンハイブリダイゼーシヨン（Southern
hybridization）、2.3kbのPst I断片の単離、Bam HIに
よる切断、配列Ａ（sequence A）とのサザンハイブリダ
イゼーシヨン、0.94kbのPst I Bam HIの小断片の単離、
Sau 3aによる切断、配列Ａとのサザンハイブリダイゼー
シヨン、0.525kbのBam HI Sau 3a小断片の単離およびDN
Aの配列決定によつて得られ、下記の特性を有する対応
するDNA配列に関する。すなわちａ）テンダミスタツト
構造遺伝子のすぐ上流に位置し、 ｂ）それはアミノ末端において Met−Arg−Val−Arg−Ala−Leu−Arg をコードし、 ｃ）それはカルボキシ末端において Ala−Ser−Ala をコードし、また ｄ）それは中央部においてアミノ酸10ないし25個、好適
には17ないし20個よりなる疎水性の領域をコードするも
のである。
ド残基例えばテンダミスタツトを表わす式（II）のペプ
チドに関するものである。本発明の他の一つの局面で
は、テンダミスタツトを産生し、好適には予め亜致死量
のアクリフラビンで処理されたストレプトミセス・テン
ダエ菌株からDNA全量単離、Pst Iによる分解、DNA配列
Ａすなわち５′−（32P−）CCT TCA CTG TCG TCT TCG T
A−３′とのサザンハイブリダイゼーシヨン（Southern
hybridization）、2.3kbのPst I断片の単離、Bam HIに
よる切断、配列Ａ（sequence A）とのサザンハイブリダ
イゼーシヨン、0.94kbのPst I Bam HIの小断片の単離、
Sau 3aによる切断、配列Ａとのサザンハイブリダイゼー
シヨン、0.525kbのBam HI Sau 3a小断片の単離およびDN
Aの配列決定によつて得られ、下記の特性を有する対応
するDNA配列に関する。すなわちａ）テンダミスタツト
構造遺伝子のすぐ上流に位置し、 ｂ）それはアミノ末端において Met−Arg−Val−Arg−Ala−Leu−Arg をコードし、 ｃ）それはカルボキシ末端において Ala−Ser−Ala をコードし、また ｄ）それは中央部においてアミノ酸10ないし25個、好適
には17ないし20個よりなる疎水性の領域をコードするも
のである。
このDNA配列は、以後の本明細書中においてＢ配列また
は信号ペプチドとよばれる。
は信号ペプチドとよばれる。
標準マーカーとの比較により算定されたkb数値は通常の
精度を有する。
精度を有する。
Ａ配列の代わりに、テンダミスタツト遺伝子またはそれ
に対応するDNA鎖に対して相補的な所要のいずれの配列
をも、サザンハイブイダイゼーシヨンにより選択するこ
とが可能である。
に対応するDNA鎖に対して相補的な所要のいずれの配列
をも、サザンハイブイダイゼーシヨンにより選択するこ
とが可能である。
DNAのＢ配列の特徴づけのために、いずれの場合の実施
法においても、DNAは適当なベクターに導入され、後者
は宿主細胞中において形質転換され、そこにおいて増幅
され、形質転換体はＡ配列とのコロニー交雑により判別
され、そしてDNAが再単離される。これらの操作段階は
自体が既知である。
法においても、DNAは適当なベクターに導入され、後者
は宿主細胞中において形質転換され、そこにおいて増幅
され、形質転換体はＡ配列とのコロニー交雑により判別
され、そしてDNAが再単離される。これらの操作段階は
自体が既知である。
DNAのＣ配列は、そのコードする鎖が附着体に表わされ
ており、ストレプトミセス・テンダエよりのテンダミス
タツト構造遺伝子を有する。
ており、ストレプトミセス・テンダエよりのテンダミス
タツト構造遺伝子を有する。
従つて上記の遺伝子構造は、読み枠内にDNAのＢ配列
を、例えばテンダミスタツト、好適にはDNAのＣ配列を
コードする構造遺伝子とともに含有する。
を、例えばテンダミスタツト、好適にはDNAのＣ配列を
コードする構造遺伝子とともに含有する。
本発明はまた、読み枠内にDNAのＢ配列を、例えばテン
ダミスタツト、好適にはDNAのＣ配列をコードする構造
遺伝子とともに包有するプラスミドに関する。これらの
プラスミドは、大腸菌において有効なレプリコンを含有
することができ、従つて大腸菌内においてDNAを増幅
し、また多分発現することが可能である。
ダミスタツト、好適にはDNAのＣ配列をコードする構造
遺伝子とともに包有するプラスミドに関する。これらの
プラスミドは、大腸菌において有効なレプリコンを含有
することができ、従つて大腸菌内においてDNAを増幅
し、また多分発現することが可能である。
好適なプラスミドは、これに加えて放線菌中において有
効なレプリコンを含有する。もしあるストレプトミセス
菌がこの型のプラスミドにより形質転換されれば、その
菌は構造遺伝子により決定されるペプチドを式IIの原ペ
プチドの形において発原することが可能になり、その原
ペプチドは産生の途中で信号ペプチダーゼにより分解さ
れ、所望のペプチドが培地中に排出される。
効なレプリコンを含有する。もしあるストレプトミセス
菌がこの型のプラスミドにより形質転換されれば、その
菌は構造遺伝子により決定されるペプチドを式IIの原ペ
プチドの形において発原することが可能になり、その原
ペプチドは産生の途中で信号ペプチダーゼにより分解さ
れ、所望のペプチドが培地中に排出される。
大腸菌中において有効なレプリコンおよび放線菌中にお
いて有効なレプリコンと共に含有するいわゆるシヤトル
・ベクターもまた有利である。これらのシヤトル・ベク
ターは大腸菌中において増幅され再単離した後に放線菌
内で形質転換せしめることが可能で、その後には所望の
ポリペプチドの産生が起こる。
いて有効なレプリコンと共に含有するいわゆるシヤトル
・ベクターもまた有利である。これらのシヤトル・ベク
ターは大腸菌中において増幅され再単離した後に放線菌
内で形質転換せしめることが可能で、その後には所望の
ポリペプチドの産生が起こる。
本発明はまた、前記のベクターにより形質転換された宿
主生物、特にストレプトミセス属の宿主生物、殊にセト
レプトミセス・テンダエ種、さらに特別にはストレプト
ミセス・リビダンスの宿主生物に関する。
主生物、特にストレプトミセス属の宿主生物、殊にセト
レプトミセス・テンダエ種、さらに特別にはストレプト
ミセス・リビダンスの宿主生物に関する。
さらにまた、本発明は一般式（III） H2N−Ｒ （III） （式中Ｒは式（III）に示された意味を有する）で示さ
れるポリペプチドを、式（II）の原ペプチドを分解する
信号ペプチダーゼを含有し所望のポリペプチドを培地中
に分泌する、上述の形質転換された宿主生物を用いて調
製する方法に関する。
れるポリペプチドを、式（II）の原ペプチドを分解する
信号ペプチダーゼを含有し所望のポリペプチドを培地中
に分泌する、上述の形質転換された宿主生物を用いて調
製する方法に関する。
グラム陰性細菌については各種のベクターが利用可能で
あるのに対し、グラム陽性細菌、特に放線菌類について
はごく少数のベクターのみしかこれまで記述されていな
い。細菌の種ストレプトミセス・テンダエのためのベク
ターは現在にいたるまで開示されたことがない。従つ
て、セトレプトミセス・テンダエを宿主生物として利用
する方策は、本発明によつて可能となつた。
あるのに対し、グラム陽性細菌、特に放線菌類について
はごく少数のベクターのみしかこれまで記述されていな
い。細菌の種ストレプトミセス・テンダエのためのベク
ターは現在にいたるまで開示されたことがない。従つ
て、セトレプトミセス・テンダエを宿主生物として利用
する方策は、本発明によつて可能となつた。
本発明の特別な有利性は、形質転換されたストレプトミ
セス類の菌株、特にストレプトミセス・リビンダンスの
菌株は最適に胞子形成する、すなわち組換えプラスミド
の含有はこれらの菌株のはん殖期に有害な影響を及ぼさ
ない。従つて形質転換された生物は、例えば胞子の利用
をも含む代謝突然変異体の生成および選抜のような菌株
の改良を重ねるのにも適する。
セス類の菌株、特にストレプトミセス・リビンダンスの
菌株は最適に胞子形成する、すなわち組換えプラスミド
の含有はこれらの菌株のはん殖期に有害な影響を及ぼさ
ない。従つて形質転換された生物は、例えば胞子の利用
をも含む代謝突然変異体の生成および選抜のような菌株
の改良を重ねるのにも適する。
ストレプトミセス・テンダエの形質転換されない菌株に
比較して、形質転換された菌株、特にセトレプトミセス
・リビダンスは、メラニンを形成しない。従つてそれを
除去する必要がないので、例えばテンダミスタツトのよ
うな所望のペプチドの単離を著しく容易ならしめ、収量
のロスを防止する。
比較して、形質転換された菌株、特にセトレプトミセス
・リビダンスは、メラニンを形成しない。従つてそれを
除去する必要がないので、例えばテンダミスタツトのよ
うな所望のペプチドの単離を著しく容易ならしめ、収量
のロスを防止する。
本発明の一層の有利性は、ストレプトミセス・リビダン
スにおいて外来の遺伝子が発現され、それに対応するポ
リペプチドが排出され、それが菌株の改良および生産さ
れるポリペプチドの修飾のための多様なる可能性を提供
することである。
スにおいて外来の遺伝子が発現され、それに対応するポ
リペプチドが排出され、それが菌株の改良および生産さ
れるポリペプチドの修飾のための多様なる可能性を提供
することである。
また本発明によれば、ストレプトミセス属の他の種類例
えばストレプトミセス・ガーナエンシスまたはオーレオ
フアシエンスを形質転換することが可能である。
えばストレプトミセス・ガーナエンシスまたはオーレオ
フアシエンスを形質転換することが可能である。
プラスミドを含有せず、また特定の信号ペプチダーゼを
合成し得る菌株が、本発明による雑種プラスミドにより
形質転換された場合には、コードされたペプチドを発現
して分泌する安定な形質転換体が得られる。
合成し得る菌株が、本発明による雑種プラスミドにより
形質転換された場合には、コードされたペプチドを発現
して分泌する安定な形質転換体が得られる。
本発明の特に好適な態様は下記の実施例中に詳述され
る。これらの実施例において、パーセントデータは特に
記すもの以外はすべて重量ベースである。雑種プラスミ
ドを示す図中において、数字は実際のスケール通りの制
限切断位置を示す。
る。これらの実施例において、パーセントデータは特に
記すもの以外はすべて重量ベースである。雑種プラスミ
ドを示す図中において、数字は実際のスケール通りの制
限切断位置を示す。
実施例中では、文献により既知の、下記の各種ベクター
すなわちメツシング（Messing）氏等による「ジーン」
（Gene）第19巻（1982年）第269頁の一重鎖フアージM 1
3 mp 8およびM 13 mp 9、ビエラ（Vierra）氏等による
「ジーン」（Gene）第19巻（1982年）第259頁のpUC8、
チヤン（Chang）氏等による、「ジエイ．バクテリオロ
ジー」（J.Bacteriology）第134巻（1978年）第1141頁
のpAC177および184、キーサー（Kieser）氏等による
「ジエイ．モル．ジエン．ジネツト」（J.Mol.Gen.Gene
t.）第185巻（1982年）第223頁のpIJ102および350を用
いた。
すなわちメツシング（Messing）氏等による「ジーン」
（Gene）第19巻（1982年）第269頁の一重鎖フアージM 1
3 mp 8およびM 13 mp 9、ビエラ（Vierra）氏等による
「ジーン」（Gene）第19巻（1982年）第259頁のpUC8、
チヤン（Chang）氏等による、「ジエイ．バクテリオロ
ジー」（J.Bacteriology）第134巻（1978年）第1141頁
のpAC177および184、キーサー（Kieser）氏等による
「ジエイ．モル．ジエン．ジネツト」（J.Mol.Gen.Gene
t.）第185巻（1982年）第223頁のpIJ102および350を用
いた。
ストレプトミセス・テンダエ菌株の維持法は、米国特許
第4,226,764号に記載されている。原理的には、テンダ
ミスタツト遺伝子はテンダミスタツドを産生するいずれ
の菌株からでも単離され得る。しかし西独特許出願P 33
31 860.3号の操作法が特に有利であり、DNAの単離法は
その実施例３中に記載されている。単離された完全DNA
は、下記の実施例１の出発物質である。
第4,226,764号に記載されている。原理的には、テンダ
ミスタツト遺伝子はテンダミスタツドを産生するいずれ
の菌株からでも単離され得る。しかし西独特許出願P 33
31 860.3号の操作法が特に有利であり、DNAの単離法は
その実施例３中に記載されている。単離された完全DNA
は、下記の実施例１の出発物質である。
実施例 １ ５μｇのDNAは制限酵素Pst Iにより完全に分解され、0.
8％アガロースゲル中で分画の後にニトロセルロースフ
イルターに移された（サザン転移）。結合され編成され
たDNAを含むフイルターは、予備交雑媒液（0.6モルNaC
l、0.06モルNa EDTA、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム溶
液、100μg/mlの超音波処理子牛胸膜DNA、および４倍濃
縮のデンハルト氏溶液）5mlにおいて６時間予備交雑さ
れた。それは次に予め500.000cpm/mlの放射能標識付DNA
を添加した予備交雑媒液5mlで再び処理された。この放
射能標識付プローブは下記のようにして得られる。
8％アガロースゲル中で分画の後にニトロセルロースフ
イルターに移された（サザン転移）。結合され編成され
たDNAを含むフイルターは、予備交雑媒液（0.6モルNaC
l、0.06モルNa EDTA、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム溶
液、100μg/mlの超音波処理子牛胸膜DNA、および４倍濃
縮のデンハルト氏溶液）5mlにおいて６時間予備交雑さ
れた。それは次に予め500.000cpm/mlの放射能標識付DNA
を添加した予備交雑媒液5mlで再び処理された。この放
射能標識付プローブは下記のようにして得られる。
DNAのＡ配列は亜燐酸法により化学的に合成される。そ
れはヌクレオチド20個（分子量約13,000）を含有し、大
腸菌により選好される三連記号を用いてテンダミスタツ
トの第37番アミノ酸より始まるテンダミスタツトのアミ
ノ酸配列から誘導されたテンダミスタツトの推定DNA配
列に対して相補性である。このDNAのＡ配列は、γ−32P
−ATPおよびヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端に
放射能標識される。
れはヌクレオチド20個（分子量約13,000）を含有し、大
腸菌により選好される三連記号を用いてテンダミスタツ
トの第37番アミノ酸より始まるテンダミスタツトのアミ
ノ酸配列から誘導されたテンダミスタツトの推定DNA配
列に対して相補性である。このDNAのＡ配列は、γ−32P
−ATPおよびヌクレオチドキナーゼを用いて５′末端に
放射能標識される。
この放射性プローブを完全なDNA中の相補性DNA配列と交
雑させるために、混合液は37℃に24時間静置される。つ
ぎに結合されなかつた放射性DNAは除去され、フイルタ
ーは37℃において毎回200mlの交雑媒液中で５回洗浄さ
れ、ついでラジオオートグラフイーに付される。24時間
露出の後に、交雑信号は遺伝子の所在が2.3kbのPst I断
片上にあることを示す。この断片は、Pstで分解された
全DNAが分画された調製用アガロースゲルから切り取ら
れたこの断片のサイズに対応する切片の電気溶離により
得られる。溶離されたDNAは、プラスミドpUC8のPst I制
限切断部位においてクローニングされる。
雑させるために、混合液は37℃に24時間静置される。つ
ぎに結合されなかつた放射性DNAは除去され、フイルタ
ーは37℃において毎回200mlの交雑媒液中で５回洗浄さ
れ、ついでラジオオートグラフイーに付される。24時間
露出の後に、交雑信号は遺伝子の所在が2.3kbのPst I断
片上にあることを示す。この断片は、Pstで分解された
全DNAが分画された調製用アガロースゲルから切り取ら
れたこの断片のサイズに対応する切片の電気溶離により
得られる。溶離されたDNAは、プラスミドpUC8のPst I制
限切断部位においてクローニングされる。
これらの雑種プラスミドは大腸菌のJM103殊に導入され
増幅される。所望のテンダミスタツト遺伝子を含む挿入
部を有するクローンは、放射性DNAプローブＡを用いる
コロニー交雑法により検出される。こうして得られる雑
種プラスミドpKAI 1aおよび1bは第1aおよび1b図に示さ
れる。
増幅される。所望のテンダミスタツト遺伝子を含む挿入
部を有するクローンは、放射性DNAプローブＡを用いる
コロニー交雑法により検出される。こうして得られる雑
種プラスミドpKAI 1aおよび1bは第1aおよび1b図に示さ
れる。
遺伝子の所在は、単離された2.3kbのPet I断片およびそ
の小断片に対してサザンハイブリダイゼーシヨンを重ね
て行うことにより正確に決定される（第2a〜2c図）。
の小断片に対してサザンハイブリダイゼーシヨンを重ね
て行うことにより正確に決定される（第2a〜2c図）。
実施例 ２ ストレプトミセス・テンダエよりの2.3kbのPet I断片
は、プラスミドpIJ102中の特有のPst I制限切断部位に
クローニングされる。こうして得られた雑種プラスミド
pAX 1aおよび1bは、挿入部分の方向性が異なつている
が、ストレプトミセス・リビダンスの菌株に導入された
後には、その菌株にテンダミスタツトを産生する能力を
付与する。第３図は、プラスミドpAX 1aを示す。
は、プラスミドpIJ102中の特有のPst I制限切断部位に
クローニングされる。こうして得られた雑種プラスミド
pAX 1aおよび1bは、挿入部分の方向性が異なつている
が、ストレプトミセス・リビダンスの菌株に導入された
後には、その菌株にテンダミスタツトを産生する能力を
付与する。第３図は、プラスミドpAX 1aを示す。
実施例 ３ ストレプトミセス・リビダンスの市販の菌株TK24（英国
ノーリツジ市所在、ジヨン・インネス研究所）は、既知
方法によりプロトプラストに変えられ、プロトプラスト
108個が20％のポリエチレングリコール6000の存在下で
雑種プラスミドpAX 1aの１μｇに加えられる。形質転換
されたプロトプラストは再生用培地（Thompson氏等Natu
re第286巻、1980年、第525頁）上で30℃、５日間加温さ
れる。
ノーリツジ市所在、ジヨン・インネス研究所）は、既知
方法によりプロトプラストに変えられ、プロトプラスト
108個が20％のポリエチレングリコール6000の存在下で
雑種プラスミドpAX 1aの１μｇに加えられる。形質転換
されたプロトプラストは再生用培地（Thompson氏等Natu
re第286巻、1980年、第525頁）上で30℃、５日間加温さ
れる。
細胞外アミラーゼ不活性化物質の生成は平板培地テスト
により証明される。
により証明される。
0.4〜1.0mg/mlのペンクレアチンを含有する水溶液が再
生したコロニーの上へ注加され、混合物は37℃に１時間
保温される。溶液は除去され、２％のデンプ寒天5mlと
交換される。平板培地を37℃に２時間保温した後に、ヨ
ード／ヨウ加カリウム溶液5mlを注加して発色せしめ
る。青色の光背を有するコロニーは、そのクローンがテ
ンダミスタツトを合成し排出することを示す。
生したコロニーの上へ注加され、混合物は37℃に１時間
保温される。溶液は除去され、２％のデンプ寒天5mlと
交換される。平板培地を37℃に２時間保温した後に、ヨ
ード／ヨウ加カリウム溶液5mlを注加して発色せしめ
る。青色の光背を有するコロニーは、そのクローンがテ
ンダミスタツトを合成し排出することを示す。
照合のために、テンダミスタツトを産生し、かつよく胞
子形成する菌株のプラスミドDNAが単離され遺伝子地図
化される。テンダミスタツトを産生するすべての菌株は
pAX IプラスミドDNAを保有する。
子形成する菌株のプラスミドDNAが単離され遺伝子地図
化される。テンダミスタツトを産生するすべての菌株は
pAX IプラスミドDNAを保有する。
実施例 ４ 操作は実施例２に従つて行われたが、ストレプトミセス
類における選択可能なマーカーとしてチオストレプトン
耐性遺伝子を保有するプラスミドpIJ350が用いられる。
こうして雑種プラスミドpAX350aおよびｂ（両者は挿入
部分の方向性が異なる）が得られる。第４図は、プラス
ミドpAX350aを示す。
類における選択可能なマーカーとしてチオストレプトン
耐性遺伝子を保有するプラスミドpIJ350が用いられる。
こうして雑種プラスミドpAX350aおよびｂ（両者は挿入
部分の方向性が異なる）が得られる。第４図は、プラス
ミドpAX350aを示す。
実施例３に従つて形質転換せしめた後に、耐性のクロー
ンは50μg/mlのチオストレプトンの存在下において最少
培地（ホツプウツド（Hopwood）氏、「バクテリオロジ
カル・レビユーズ」（Bacteriological Reviews）第31
巻、1967年、第373〜403頁）上で選択され、テンダミス
タツトの産生について最少培地上で直接にまたは非選択
性のR2YE寒天上においてテストされる。
ンは50μg/mlのチオストレプトンの存在下において最少
培地（ホツプウツド（Hopwood）氏、「バクテリオロジ
カル・レビユーズ」（Bacteriological Reviews）第31
巻、1967年、第373〜403頁）上で選択され、テンダミス
タツトの産生について最少培地上で直接にまたは非選択
性のR2YE寒天上においてテストされる。
実施例 ５ 2.3kbのPst I断片を含有し、さらにストレプトミセスの
レプリコンに加えて大腸菌のレプリコンを含有する雑種
プラスミドは、シヤトルベクターとして数多くの有利点
を有する。すなわち大腸菌のレプリコンおよび大腸菌に
おいて有効な耐性マーカーがあるために、それらはこの
生物中においてよく増幅される。単離およびストレプト
ミセス類特にストレプトミセス・リビダンスの導入の後
にはそれらは高度の安定性を有する。ストレウトミセス
類において有効な選択マーカーおびストレプトミセスレ
プリコンの存在により、それらはこの生物中でよく増幅
され、テンダミスタツトを発現しまた分泌する。
レプリコンに加えて大腸菌のレプリコンを含有する雑種
プラスミドは、シヤトルベクターとして数多くの有利点
を有する。すなわち大腸菌のレプリコンおよび大腸菌に
おいて有効な耐性マーカーがあるために、それらはこの
生物中においてよく増幅される。単離およびストレプト
ミセス類特にストレプトミセス・リビダンスの導入の後
にはそれらは高度の安定性を有する。ストレウトミセス
類において有効な選択マーカーおびストレプトミセスレ
プリコンの存在により、それらはこの生物中でよく増幅
され、テンダミスタツトを発現しまた分泌する。
プラスミドpAC184は、制限酵素Sal Iにより完全に分解
され、酵素はフエノール／クロロホルム液を用いる抽出
により除去される。突出している５′末端は、ATP、CT
P、GTPおよびTTPの存在下で酵素DNAポリメラーゼ（クレ
ノー断片（Klenow fragment））を用いて充填される。
され、酵素はフエノール／クロロホルム液を用いる抽出
により除去される。突出している５′末端は、ATP、CT
P、GTPおよびTTPの存在下で酵素DNAポリメラーゼ（クレ
ノー断片（Klenow fragment））を用いて充填される。
５′TCG AGC TGC AGC TCG A 3′ ３′ACG TCG ACG TCG AGO T 5′ なる構造のPst I接続体は、22℃におけるリガーゼ反応
（DNA0.4μｇに対して接続体２μｇ）により空白の末端
に接続される。DNAはフエノール／クロロホルム液で抽
出され、沈殿の後、接続され得るPst末端を得るために
酵素Pst Iにより分解される。ベクターのPst末端は次に
脱燐酸され、再びフエノール／クロロホルムで抽出さ
れ、予めPst Iで部分的に分解されたプラスミドpAX Iと
接続された。接続反応混合液は大腸菌（HB101株またはM
C1061株）中へ転換導入される。クロラムフエニコール
耐性のクローンが平板培地から洗い取つて集められ、プ
ラスミドDNAが単離される。ストレプトミセス・リビダ
ンスのTK24株は１〜２μｇのプラスミドDNAで形質転換
され、テンダミスタツトの産生についてテストされる。
（DNA0.4μｇに対して接続体２μｇ）により空白の末端
に接続される。DNAはフエノール／クロロホルム液で抽
出され、沈殿の後、接続され得るPst末端を得るために
酵素Pst Iにより分解される。ベクターのPst末端は次に
脱燐酸され、再びフエノール／クロロホルムで抽出さ
れ、予めPst Iで部分的に分解されたプラスミドpAX Iと
接続された。接続反応混合液は大腸菌（HB101株またはM
C1061株）中へ転換導入される。クロラムフエニコール
耐性のクローンが平板培地から洗い取つて集められ、プ
ラスミドDNAが単離される。ストレプトミセス・リビダ
ンスのTK24株は１〜２μｇのプラスミドDNAで形質転換
され、テンダミスタツトの産生についてテストされる。
テンダミスタツトテストにおいて反応陽性を示すクロー
ンが単離され、プラスミドDNAは迅速アルカリ分解法に
より単離され、逆形質転換により大腸菌のHB101またはM
C1061株に導入される。増幅の後に再単離されたプラス
ミドは、ストレプトミセス・リビダンスの菌株から単離
されたプラスミドと異ならない。組換えプラスミドは、
テンダミスタツト遺伝子を保有する挿入部分の方向性に
よりpSA 2aまたはｂ（第5aおよび5b図）と指定される。
ンが単離され、プラスミドDNAは迅速アルカリ分解法に
より単離され、逆形質転換により大腸菌のHB101またはM
C1061株に導入される。増幅の後に再単離されたプラス
ミドは、ストレプトミセス・リビダンスの菌株から単離
されたプラスミドと異ならない。組換えプラスミドは、
テンダミスタツト遺伝子を保有する挿入部分の方向性に
よりpSA 2aまたはｂ（第5aおよび5b図）と指定される。
実施例 ６ 操作は実施例５に従つて行われるが、プラスミドpAX350
aから出発し、大腸菌中においてクロラムフエニコール
耐性について選別し、ストレプトミセス・リビダンス中
においてチオストレプト耐性およびテンダミスタツト産
生について選別し、プラスミドpSA351aおよびｂ（第6a
および6b図）が得られる。
aから出発し、大腸菌中においてクロラムフエニコール
耐性について選別し、ストレプトミセス・リビダンス中
においてチオストレプト耐性およびテンダミスタツト産
生について選別し、プラスミドpSA351aおよびｂ（第6a
および6b図）が得られる。
実施例 ７ 操作は実施例５に従つて行われるが、プラスミドpAC184
に代えてpAC177から出発し、プラスミドpSA3aおよびｂ
（第7aおよび7b図）が得られる。
に代えてpAC177から出発し、プラスミドpSA3aおよびｂ
（第7aおよび7b図）が得られる。
この目的のために、プラスミドpAX1aはPst Iで部分的に
切断され、酵素は68℃に15分間加熱することにより熱不
活性化される。DNAは、予めPst Iで切断され、脱燐酸お
よび脱蛋白されたプラスミドpAC177に接続される。大腸
菌HB101またはMC1061株の形質転換後にカナマイシン耐
性クローンが平板培地から洗い取つて集められ、プラス
ミドDNAが単離され、ストレプトミセス・リビダンスのT
K24株がこのDNAにより形質転換される。テンダミスタツ
トを産生するクローンが選別され、プラスミドの特徴が
決定される。
切断され、酵素は68℃に15分間加熱することにより熱不
活性化される。DNAは、予めPst Iで切断され、脱燐酸お
よび脱蛋白されたプラスミドpAC177に接続される。大腸
菌HB101またはMC1061株の形質転換後にカナマイシン耐
性クローンが平板培地から洗い取つて集められ、プラス
ミドDNAが単離され、ストレプトミセス・リビダンスのT
K24株がこのDNAにより形質転換される。テンダミスタツ
トを産生するクローンが選別され、プラスミドの特徴が
決定される。
実施例 ８ 操作は実施例７に従つて行われるが、プラスミドpAX1に
代えてプラスミドpAX350が用いられ、ストレプトミセス
・リビダンスにおいてチオストレプトン耐性について選
別が行われ、プラスミドpSA352aおよびｂ（第8aおよび8
b図）が得られる。
代えてプラスミドpAX350が用いられ、ストレプトミセス
・リビダンスにおいてチオストレプトン耐性について選
別が行われ、プラスミドpSA352aおよびｂ（第8aおよび8
b図）が得られる。
実施例 ９ 第２図により明かな通り、テンダミスタツトおよび信号
配列をコードする遺伝子は〜0.3kbの長さがある。上に
詳述した実施例中に用いられる2.3kbの断片は従つてテ
ンダミスタツトの産生を引き起こす雑種プラスミドの構
成のために短縮した形で用いることができる。
配列をコードする遺伝子は〜0.3kbの長さがある。上に
詳述した実施例中に用いられる2.3kbの断片は従つてテ
ンダミスタツトの産生を引き起こす雑種プラスミドの構
成のために短縮した形で用いることができる。
すなわちプラスミドpKAI1はSal Iにより分解され、再接
続される。この方法により約750塩基対分短縮されたプ
ラスミドpKAI2が得られる。それは単離され、クローニ
ングされ、Pst Iにより切断される。そのDNAは子牛の腸
よりのアルカリ生ホスフアターゼにより脱燐酸され、フ
エノール／クロロホルムにより脱蛋白される。
続される。この方法により約750塩基対分短縮されたプ
ラスミドpKAI2が得られる。それは単離され、クローニ
ングされ、Pst Iにより切断される。そのDNAは子牛の腸
よりのアルカリ生ホスフアターゼにより脱燐酸され、フ
エノール／クロロホルムにより脱蛋白される。
プラスミドpIJ102はPet Iにより完全に切断され、酵素
が熱不活性化された後、断片はpKAI2のPst Iによる制限
切断部位に接続される。接続反応混合液は、大腸菌のHB
101またはMC1061株中へ転換導入される。プラスミドDNA
がアンピシリン耐性のクローンから迅速アルカリ分解法
により単離され、ストレプトミセス・リビダンスTK24株
がこのDNA1〜２μｇを用いて形質転換される。テンダミ
スタツトを産生するクローンが選別され、それらからプ
ラスミドDNAが迅速アルカリ分解法により単離される。
大腸菌HB101またはMC1061株中へ再転換導入の後、およ
び形質転換された大腸菌株よりプラスミドDNAの単離の
後に、プラスミドpSA1が得られ、その特徴が制限切断分
析により決定される（第９図）。プラスミドは、ストレ
プトミセス・リビダンスの株より単離されたプラスミド
との間に差はないが、大腸菌よりのDNA後処理はより生
産的であり、短時間内に可能である。
が熱不活性化された後、断片はpKAI2のPst Iによる制限
切断部位に接続される。接続反応混合液は、大腸菌のHB
101またはMC1061株中へ転換導入される。プラスミドDNA
がアンピシリン耐性のクローンから迅速アルカリ分解法
により単離され、ストレプトミセス・リビダンスTK24株
がこのDNA1〜２μｇを用いて形質転換される。テンダミ
スタツトを産生するクローンが選別され、それらからプ
ラスミドDNAが迅速アルカリ分解法により単離される。
大腸菌HB101またはMC1061株中へ再転換導入の後、およ
び形質転換された大腸菌株よりプラスミドDNAの単離の
後に、プラスミドpSA1が得られ、その特徴が制限切断分
析により決定される（第９図）。プラスミドは、ストレ
プトミセス・リビダンスの株より単離されたプラスミド
との間に差はないが、大腸菌よりのDNA後処理はより生
産的であり、短時間内に可能である。
実施例 10 操作は実施例９に従つて行われたが、プラスミドpIJ102
に代えてpIJ350が用いられ、従つてストレプトミセス・
リビダンスにおいてチオストレプトン耐性を選別するこ
とが付加的に可能になり、プラスミドpSA350aおよびｂ
が得られる。第10図はプラスミドpSA350aを示す。振盪
培養において、このプラスミドは、テンダミスタツト遺
伝子が逆方向に含有される挿入部分を有するプラスミド
pSA350bよりもテンダミスタツトの高い収量をもたら
す。これと反対に、挿入部分のサイズを1.5kbにまで縮
小しても、産物の形成に認め得べき影響はない。
に代えてpIJ350が用いられ、従つてストレプトミセス・
リビダンスにおいてチオストレプトン耐性を選別するこ
とが付加的に可能になり、プラスミドpSA350aおよびｂ
が得られる。第10図はプラスミドpSA350aを示す。振盪
培養において、このプラスミドは、テンダミスタツト遺
伝子が逆方向に含有される挿入部分を有するプラスミド
pSA350bよりもテンダミスタツトの高い収量をもたら
す。これと反対に、挿入部分のサイズを1.5kbにまで縮
小しても、産物の形成に認め得べき影響はない。
実施例 11 テンダミスタツト遺伝子の構造およびヌクレオチド配列
を決定するために、0.94kbのPst I/Bam HI小断片（第2a
および2b図）ならびに295塩基対のSau 3a/Bam HI小断片
（第2c図）が一重鎖のフアージM 13mp 8およびM 13 mp
9中にクローニングされる。ジデオキシ配列決定反応に
用いられるプライマーは20ヌクレオチドのDNA A配列お
よび市販（ノイ・イセンブルグ市所在ベセスダリセーチ
ラボラトリーズ株式会社）の15塩基対プライマーであ
る。DNAのＣ配列が発見された。
を決定するために、0.94kbのPst I/Bam HI小断片（第2a
および2b図）ならびに295塩基対のSau 3a/Bam HI小断片
（第2c図）が一重鎖のフアージM 13mp 8およびM 13 mp
9中にクローニングされる。ジデオキシ配列決定反応に
用いられるプライマーは20ヌクレオチドのDNA A配列お
よび市販（ノイ・イセンブルグ市所在ベセスダリセーチ
ラボラトリーズ株式会社）の15塩基対プライマーであ
る。DNAのＣ配列が発見された。
このDNAのＣ配列は次のとおりである。
実施例 12 テンダミスタツト構造遺伝子の上流のDNA上に、テンダ
ミスタツトのアミノ末端の直上流に位置する蛋白質のコ
ドンATG（Met）を開始する開放読み枠が存在する。この
信号ペプチドはDNAのＢ配列に対応する。
ミスタツトのアミノ末端の直上流に位置する蛋白質のコ
ドンATG（Met）を開始する開放読み枠が存在する。この
信号ペプチドはDNAのＢ配列に対応する。
なお参考のために次にここで用いたDNAの単離法につい
て、西独特許出願P 33 31 860.3号の実施例１（参考実
施例１）および３（参考実施例２）に基づいて説明す
る。
て、西独特許出願P 33 31 860.3号の実施例１（参考実
施例１）および３（参考実施例２）に基づいて説明す
る。
参考実施例 １ 突然変異操作：予めオートミール寒天培地（欧州特許出
願A49,847号）上で培養されたDSM2727株の胞子形成した
菌糸約0.25cm2を、下記の培地25mlを含有する100ml容量
のコニカルフラスコ中に移す。すなわち 大 豆 粉 ２％ グルコース ３％ コーンスターチ 0.2％ 尿 素 0.1％ くえん酸アンモニウム 0.1％ 麦芽エキス 0.5％ KH2PO4 0.2％ 培地は121℃１バール下において30分オートクレーブさ
れ、pHは約7.0である。接種されたフラスコは30℃で振
盪機上で２日間保温される。予め生育した前培養2mlが1
00ml容量のコニカルフラスコ中の主培養液20ml中に移さ
れる（欧州特許出願A49,847号）：すなわち 可溶性殿粉 ２〜４％ 大 豆 粉 0.4％ コーンステイーブ・リカー 0.4％ 脱脂粉乳 0.7％ グルコース １％ （NH4）2HPO4 1.2％ オートクレーブ殺菌の後培地のpHは7.6である。
願A49,847号）上で培養されたDSM2727株の胞子形成した
菌糸約0.25cm2を、下記の培地25mlを含有する100ml容量
のコニカルフラスコ中に移す。すなわち 大 豆 粉 ２％ グルコース ３％ コーンスターチ 0.2％ 尿 素 0.1％ くえん酸アンモニウム 0.1％ 麦芽エキス 0.5％ KH2PO4 0.2％ 培地は121℃１バール下において30分オートクレーブさ
れ、pHは約7.0である。接種されたフラスコは30℃で振
盪機上で２日間保温される。予め生育した前培養2mlが1
00ml容量のコニカルフラスコ中の主培養液20ml中に移さ
れる（欧州特許出願A49,847号）：すなわち 可溶性殿粉 ２〜４％ 大 豆 粉 0.4％ コーンステイーブ・リカー 0.4％ 脱脂粉乳 0.7％ グルコース １％ （NH4）2HPO4 1.2％ オートクレーブ殺菌の後培地のpHは7.6である。
アクリフラビンが突然変異誘発剤としてこの培地に10〜
25μg/mlの濃度に添加される。培養は毎分220回転で５
分間28℃において振盪される。次に培養液は遠心にかけ
られ（1,300×ｇ、５分間）、細胞沈降物は主培養液で
洗浄される。洗浄された細胞は、ガラス製ホモゲナイザ
ーを用いて分散され、下記の組成の寒天平板培地上に接
種される。
25μg/mlの濃度に添加される。培養は毎分220回転で５
分間28℃において振盪される。次に培養液は遠心にかけ
られ（1,300×ｇ、５分間）、細胞沈降物は主培養液で
洗浄される。洗浄された細胞は、ガラス製ホモゲナイザ
ーを用いて分散され、下記の組成の寒天平板培地上に接
種される。
しよ糖 0.3％ デキストリン 1.5％ NaCl 0.05％ K2HPO4 0.05％ FeSO4・7H2O 0.001％ トリプトン大豆液（オキソイド社製） 0.5％ 肉エキス（デイフコ社製） 0.1％ 酵母エキス（デイフコ社製） 0.2％ 寒 天（メルク社製） 1.5％ 培養液のpHは7.1（オートクレーブ殺菌の条件は前記と
同じ）である。
同じ）である。
平板培地は28℃において５日間保温され、個々のコロニ
ーはオートミール寒天を含有する試験管斜面培地に移さ
れる。それらは上記の通りに菌糸が胞子形成するまで保
温される。胞子形成した菌糸は、前記の通りに前培養お
よび主培養により増殖され、５日を経た主培養液はテ
ンダミスタツトの含有量についてテストされる（欧州特
許出願A49,847号参照）。この方法により、前記の条件
下において生育の期間中に培養液１当り約90,000〜10
0,000IUのテンダスミスタツトすなわち不活性化物質1.5
〜1.8g/に相当する量を産生するＩ−9353、Ｉ−936
2、Ｉ−9417およびＩ−9418株を選別することが可能で
あつた。
ーはオートミール寒天を含有する試験管斜面培地に移さ
れる。それらは上記の通りに菌糸が胞子形成するまで保
温される。胞子形成した菌糸は、前記の通りに前培養お
よび主培養により増殖され、５日を経た主培養液はテ
ンダミスタツトの含有量についてテストされる（欧州特
許出願A49,847号参照）。この方法により、前記の条件
下において生育の期間中に培養液１当り約90,000〜10
0,000IUのテンダスミスタツトすなわち不活性化物質1.5
〜1.8g/に相当する量を産生するＩ−9353、Ｉ−936
2、Ｉ−9417およびＩ−9418株を選別することが可能で
あつた。
参考実施例 ２ ストレプトミセス・テンダエよりDNAの単離およびその
分子生物的特徴の決定 細胞は参考実施例１に従つて培養される。主培養培地で
３日間生育の後に、コニカルフラスコ中の細胞は3,000
×ｇ、４℃において５分間の遠心により集菌され、50ミ
リモルのトリス／塩酸緩衝剤、100ミリモルのNaClおよ
び25ミリモルのEDTAの溶液50mlで５回洗浄される。
分子生物的特徴の決定 細胞は参考実施例１に従つて培養される。主培養培地で
３日間生育の後に、コニカルフラスコ中の細胞は3,000
×ｇ、４℃において５分間の遠心により集菌され、50ミ
リモルのトリス／塩酸緩衝剤、100ミリモルのNaClおよ
び25ミリモルのEDTAの溶液50mlで５回洗浄される。
典型的な調製法においては、遠沈により固められた細胞
3gが−198℃の液体窒素により瞬間に凍結され、N2の存
在下でブレードホモゲナイザー（ウオリング社製業務用
ブレンダー）を用いて細粉化される。この細粉は前記の
緩衝液10ml中に入れられ、氷上で溶解され、リゾチーム
溶液（30mg/ml）0.8mlと共に20分間28℃においてゆるや
かに振盪しつつ保温される。次にプロテイナーゼＫ溶液
（15mg/ml）0.8mlおよびＮ−ラウロイルサルコシンナト
リウム塩の20％溶液0.8mlが懸濁液に添加される。注意
深く混合の後に、混合液は氷上に30分間、その後室温に
15分間保たれる。固形の塩化セシウム22gの添加および
溶解の後に、液量は前記の懸濁液を用いて22mlとされ、
懸濁液は12,000×ｇおよび４℃において25分間遠心され
る。臭化エチジウムが透明な遠心液に添加され、屈折率
はCsClで屈折形を用いてｎ＝1.3920に調整される。調製
用遠心（120,000×ｇ、36時間、15℃）の後染色体DNAの
バンドは遠心管から除去され、同じ条件下で再遠心され
る。臭化エチジウムは、単離されたバンドからｎ−ブタ
ノール抽出により除去され、バンドは全部のCsClを除去
するために透析される。こうして得られたDNAは、例え
ば酵素Pet I、Bam HI、San 3A、Gla I、Bgl IIおよびXh
o Iにより切断されるが、例えばエンドヌクレアーゼEco
RIおよびHind IIIによつては切断され得ない。
3gが−198℃の液体窒素により瞬間に凍結され、N2の存
在下でブレードホモゲナイザー（ウオリング社製業務用
ブレンダー）を用いて細粉化される。この細粉は前記の
緩衝液10ml中に入れられ、氷上で溶解され、リゾチーム
溶液（30mg/ml）0.8mlと共に20分間28℃においてゆるや
かに振盪しつつ保温される。次にプロテイナーゼＫ溶液
（15mg/ml）0.8mlおよびＮ−ラウロイルサルコシンナト
リウム塩の20％溶液0.8mlが懸濁液に添加される。注意
深く混合の後に、混合液は氷上に30分間、その後室温に
15分間保たれる。固形の塩化セシウム22gの添加および
溶解の後に、液量は前記の懸濁液を用いて22mlとされ、
懸濁液は12,000×ｇおよび４℃において25分間遠心され
る。臭化エチジウムが透明な遠心液に添加され、屈折率
はCsClで屈折形を用いてｎ＝1.3920に調整される。調製
用遠心（120,000×ｇ、36時間、15℃）の後染色体DNAの
バンドは遠心管から除去され、同じ条件下で再遠心され
る。臭化エチジウムは、単離されたバンドからｎ−ブタ
ノール抽出により除去され、バンドは全部のCsClを除去
するために透析される。こうして得られたDNAは、例え
ば酵素Pet I、Bam HI、San 3A、Gla I、Bgl IIおよびXh
o Iにより切断されるが、例えばエンドヌクレアーゼEco
RIおよびHind IIIによつては切断され得ない。
ATCC31210株およびDSM2727株よりのDNAに比べて、例え
ば突然変異株Ｉ−9353およびＩ−9362より得られるDNA
は増幅された遺伝要素を有し、その断片は螢光色素臭化
エチジウムで染色後には明らかに可視性で、背景となる
断片から突出する。増幅された要素のサイズおよび制限
エンドヌクレアーゼにより分解後の特徴のある個々の断
片は下記に示される。
ば突然変異株Ｉ−9353およびＩ−9362より得られるDNA
は増幅された遺伝要素を有し、その断片は螢光色素臭化
エチジウムで染色後には明らかに可視性で、背景となる
断片から突出する。増幅された要素のサイズおよび制限
エンドヌクレアーゼにより分解後の特徴のある個々の断
片は下記に示される。
第1a図および第1b図は、雑種プラスミドpKAI1aおよびpK
AI1bを、第2a図、第2b図、および第2c図は、Pst I断片
における遺伝子の所在を、第３図はプラスミドpAX1a
を、第４図はプラスミドpAX350aを、第5a図および第5b
図はプラスミドpSA2aおよびプラスミドpSA2bを、第6a図
および第6b図はプラスミドpSA351aおよびプラスミドpSA
351bを、第7a図および第7b図はプラスミドpSA3aおよび
プラスミドpSA3bを、第8a図および第8b図はプラスミドp
SA352aおよびプラスミドpSA352bを、第９図はプラスミ
ドpSA1をそして第10図はプラスミドpSA350aを示す。
AI1bを、第2a図、第2b図、および第2c図は、Pst I断片
における遺伝子の所在を、第３図はプラスミドpAX1a
を、第４図はプラスミドpAX350aを、第5a図および第5b
図はプラスミドpSA2aおよびプラスミドpSA2bを、第6a図
および第6b図はプラスミドpSA351aおよびプラスミドpSA
351bを、第7a図および第7b図はプラスミドpSA3aおよび
プラスミドpSA3bを、第8a図および第8b図はプラスミドp
SA352aおよびプラスミドpSA352bを、第９図はプラスミ
ドpSA1をそして第10図はプラスミドpSA350aを示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） Ｃ１２Ｒ 1:465）
Claims (2)
- 【請求項１】下記のDNAのＢ配列に対応する信号ペプチ
ドを切除する信号ペプチダーゼを含有する宿主生物を使
用することからなり、該宿主生物は下記のDNAのＢ配列
を含有する構造遺伝子を有するプラスミドを含有するス
トレプトミセス属に属する菌であることを特徴とするポ
リペプチドの製造方法。 DNAのＢ配列： テンダミスタットを産生し、また予め亜致死量のアクリ
フラビンで処理されたストレプトミセス・テンダエの菌
株から、完全DNAの単離、Pst Iによる分解、DNAのＡ配
列すなわち ５′（32P−）CCT TCA GTG TCG TCT TCG TA−３′
（Ａ） とのサザンハイブリダイゼーション、2.3kbのPst I断片
の単離、Bam HIによる切断、Ａ配列とのサザハイブリダ
イゼーション、0.94kbのPst I Bam HI小断片の単離、Sa
u 3aによる切断、Ａ配列とのサザンハイブリダイゼーシ
ョン、0.525kbのBam HI Sau 3a小断片の単離、およびD
NAの配列決定によって得られ、且つ ａ）テンダミスタット構造遺伝子のすぐ上流に位置し、 ｂ）アミノ末端において Met−Arg−Val−Arg−Alg−Leu−Arg をコードし、 ｃ）カルボキシ末端において Ala−Ser−Ala をコードし、 ｄ）中央部においてアミノ酸10〜25個よりなる疎水性領
域をコードする。 - 【請求項２】上記構造遺伝子がテンダミスタットをコー
ドするものである特許請求の範囲第１項記載の製造方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3418274.8 | 1984-05-17 | ||
| DE19843418274 DE3418274A1 (de) | 1984-05-17 | 1984-05-17 | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60260598A JPS60260598A (ja) | 1985-12-23 |
| JPH0797993B2 true JPH0797993B2 (ja) | 1995-10-25 |
Family
ID=6236073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60102801A Expired - Lifetime JPH0797993B2 (ja) | 1984-05-17 | 1985-05-16 | ポリペプチドの製造方法 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0161629B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0797993B2 (ja) |
| AT (1) | ATE36167T1 (ja) |
| AU (1) | AU580062B2 (ja) |
| CA (1) | CA1309674C (ja) |
| DE (2) | DE3418274A1 (ja) |
| DK (1) | DK172458B1 (ja) |
| ES (1) | ES8704540A1 (ja) |
| FI (1) | FI81113C (ja) |
| GR (1) | GR851184B (ja) |
| HU (1) | HU197351B (ja) |
| IE (1) | IE58385B1 (ja) |
| IL (1) | IL75214A (ja) |
| NO (1) | NO173452C (ja) |
| NZ (1) | NZ212085A (ja) |
| PT (1) | PT80483B (ja) |
| ZA (1) | ZA853672B (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1295563C (en) * | 1985-11-01 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Production of active proteins containing cystine residues |
| CA1295566C (en) * | 1987-07-21 | 1992-02-11 | Robert T. Garvin | Characterization and structure of genes for protease a and protease b from streptomyces griseus |
| DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
| US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
| DE3714866A1 (de) * | 1987-05-05 | 1988-11-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| DE4012818A1 (de) | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| DE3837271A1 (de) * | 1988-11-03 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen |
| ES2081826T3 (es) * | 1988-11-03 | 1996-03-16 | Hoechst Ag | Procedimiento para la preparacion de un producto previo de insulina en estreptomicetos. |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3331860A1 (de) * | 1983-09-03 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von tendamistat |
-
1984
- 1984-05-17 DE DE19843418274 patent/DE3418274A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-05-08 DE DE8585105610T patent/DE3564118D1/de not_active Expired
- 1985-05-08 AT AT85105610T patent/ATE36167T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-08 EP EP85105610A patent/EP0161629B1/de not_active Expired
- 1985-05-10 HU HU851786A patent/HU197351B/hu unknown
- 1985-05-14 ES ES543120A patent/ES8704540A1/es not_active Expired
- 1985-05-15 NZ NZ212085A patent/NZ212085A/xx unknown
- 1985-05-15 FI FI851929A patent/FI81113C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 NO NO851971A patent/NO173452C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 GR GR851184A patent/GR851184B/el unknown
- 1985-05-15 ZA ZA853672A patent/ZA853672B/xx unknown
- 1985-05-15 DK DK198502172A patent/DK172458B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-15 CA CA000481600A patent/CA1309674C/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-05-16 IE IE122585A patent/IE58385B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-05-16 AU AU42640/85A patent/AU580062B2/en not_active Ceased
- 1985-05-16 JP JP60102801A patent/JPH0797993B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-16 IL IL75214A patent/IL75214A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-05-17 PT PT80483A patent/PT80483B/pt not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO173452C (no) | 1993-12-22 |
| ES8704540A1 (es) | 1987-04-01 |
| HU197351B (en) | 1989-03-28 |
| FI851929A0 (fi) | 1985-05-15 |
| DE3418274A1 (de) | 1985-11-21 |
| EP0161629A1 (de) | 1985-11-21 |
| HUT38670A (en) | 1986-06-30 |
| IE58385B1 (en) | 1993-09-08 |
| AU4264085A (en) | 1985-11-21 |
| JPS60260598A (ja) | 1985-12-23 |
| FI851929L (fi) | 1985-11-18 |
| DK217285D0 (da) | 1985-05-15 |
| DE3564118D1 (en) | 1988-09-08 |
| PT80483A (de) | 1985-06-01 |
| DK172458B1 (da) | 1998-08-24 |
| ES543120A0 (es) | 1987-04-01 |
| IL75214A0 (en) | 1985-09-29 |
| AU580062B2 (en) | 1988-12-22 |
| FI81113C (fi) | 1990-09-10 |
| IE851225L (en) | 1985-11-17 |
| NO173452B (no) | 1993-09-06 |
| DK217285A (da) | 1985-11-18 |
| PT80483B (pt) | 1987-09-30 |
| NZ212085A (en) | 1989-03-29 |
| NO851971L (no) | 1985-11-18 |
| ATE36167T1 (de) | 1988-08-15 |
| ZA853672B (en) | 1985-12-24 |
| IL75214A (en) | 1991-03-10 |
| EP0161629B1 (de) | 1988-08-03 |
| FI81113B (fi) | 1990-05-31 |
| GR851184B (ja) | 1985-11-25 |
| CA1309674C (en) | 1992-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3005618B2 (ja) | アスペルギルス属酵母のプロモーター | |
| HU204097B (en) | Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species | |
| GB2091271A (en) | Recombinant dna | |
| JP3878207B2 (ja) | ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド | |
| AU643511B2 (en) | Bacterial vectors | |
| WO1992014819A1 (en) | A positive selection vector for the bacteriophage p1 cloning system | |
| WO1984004535A1 (en) | Heat regulated production of selected and fused proteins in yeast | |
| US5011772A (en) | High yield protein production system | |
| JPH0797993B2 (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| NO302899B1 (no) | Rekombinant DNA-molekyl, transformert vertscelle, anvendelse av rekombinant DNA-molekyl og hybridvektor, og pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF i ren form | |
| EP0133756A2 (en) | Vector for expression of polypeptides | |
| WO1988007079A1 (en) | Expression of heterologous genes in streptomyces species | |
| JP2574142B2 (ja) | 組換えリシン毒素フラグメント | |
| AU630387B2 (en) | A method of site-specific mutagenesis of dna and development of plasmid vectors | |
| EP0228726B1 (en) | Method for preparing proteins using transformed lactic acid bacteria | |
| EP0157604B1 (en) | Porcine pancreatic elastase | |
| JPH062050B2 (ja) | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 | |
| JPH05284973A (ja) | 組換プラスミドおよびこれをベクターとして用いる異種蛋白質の分泌生産方法 | |
| AU6051590A (en) | Modified proteases and their use in foodstuffs | |
| US6197548B1 (en) | Transformed Pichia expressing the pertactin antigen | |
| JP2501779B2 (ja) | アルカリプロテア―ゼの製造方法 | |
| JP3302053B2 (ja) | オキセタノシン−ａの産生に関与する遺伝子及びそれを含む組換ｄｎａ | |
| Goyard et al. | An Escherichia coli insertion element (IS2) provides a functional promoter in Bordetella pertussis | |
| CA1324093C (en) | Recombinant ricin a fragment and ricin toxin | |
| JPS60188073A (ja) | バチルス・ブレビスを宿主とするプラスミド |