JPH0767619A - 高親和性細菌のスクリーニング方法及びフェノール高親和性細菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 基質である炭素化合物に対して親和性の高い
菌を獲得するためのスクリーニング法を提供すること。 【構成】 基質を唯一の炭素源とする培地で連続培養を
行い、希釈率を一定としながら供給培地中の基質濃度を
徐々に上げ、分解能の高い菌株を選択することからなる
方法、及び該方法により獲得される細菌。 【効果】 低濃度領域でも十分な分解活性を有する、親
和性の高い菌株が得られた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は基質化合物に対して親和
性の高い細菌（微生物）をスクリーニングする方法を提
供するものである。

【０００２】

【従来の技術】微生物を応用する技術は、その培養法と
共に進歩及び発展してきた。そのなかには産業廃棄物等
の中の化合物を微生物により資化（生分解）する技術も
含まれており、特に、大量に排出される排水の処理方法
として、活性汚泥などを使用する生物学的方法が操作性
及びコスト面で有利であると考えられている。

【０００３】かかる微生物による資化技術においては、
微生物の基質親和性又は特異性が問題となり、各基質に
対して親和性の高い微生物を選択することが必要であ
る。これらの微生物を選択するために、従来、バッチ培
養法によるスクリーニング方法が用いられてきた。

【０００４】しかしながら、生分解しようとする基質に
殺菌活性がある場合は、微生物には殺菌活性を有する基
質の存在下でも生存、増殖及び機能保持できる耐性も必
要になる。しかし、従来のバッチ培養法では基質親和性
と耐性の両立が困難であった。

【０００５】これら殺菌活性を有する基質の代表がフェ
ノール化合物である。フェノール化合物は、石炭ガス及
びコークスの製造工場並びにフェノール樹脂製造工場、
及び有機薬品工場などの排水中に多く含まれるＣＯＤ成
分であり、従来、これらを含む排水の処理には化学的酸
化、溶媒抽出、活性炭吸着などの方法が採用されてき
た。

【０００６】フェノール化合物はそれ自体が多くの微生
物に対する生育阻害又は殺菌作用を有しているため、難
生分解汚染物質の一つに数えられている。

【０００７】従って、フェノール資化性細菌を用いた生
物処理槽を確立することは、産業上及び環境汚染防止上
意義のあることである。

【０００８】従来、フェノール分解能を有する微生物に
は例えば、シュードモナス属、ノカルジア属、バチルス
属及びアシネトバクター属などの細菌、オーレオバシデ
ィウム属及びフサリウム属などの真菌、並びにトリコス
ポロン属及びカンジタ属などの酵母が知られている。

【０００９】しかしながら、これらのフェノール分解菌
は従来のバッチ培養法（初期フェノール濃度、数百ｐｐ
ｍ）でスクリーニングされたものであるので、高濃度の
フェノールに対して耐性が高いものであったが、低濃度
のフェノールを効率良く分解することのできる高親和性
細菌ではなかった［Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＡＳ２（特開
平３−６７５８１）、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＡＳ２０２
（特願平４−３４１４３０）、及びＡｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ（橋本ら、発酵工学会誌７０ ２６７−２７１
１９９２）］。即ち、これらバッチ培養法では、フェ
ノールに対して耐性が高い菌をスクリーニングしたにす
ぎなく、選択された菌のフェノール分解能とは必ずしも
両立しないことが分かる。

【００１０】また、これらの菌を微生物製剤化し活性汚
泥などに投入する試みもなされているが、高濃度でこれ
らの菌を残存させることに成功した例はない。その原因
は、これらの菌はフェノール親和性が低いためと考えら
れている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】前述のようにバッチ培
養法でスクリーニングされた菌のフェノール親和性は低
く、これらの菌によるフェノール連続処理の最大負荷量
は、ＷＡＳ２０２により得られた５．５ ｇｒａｍ ｐ
ｈｅｎｏｌ／ｌｉｔｅｒ，ｄａｙ程度が最高である。

【００１２】また、無機塩培地中において分解し得るフ
ェノール濃度が低く、分解を完結するまでに長時間を要
する、及びフェノールに対する馴養期間を長くとる必要
がある等の欠点を有しており、微生物製剤分野への応用
は困難であった。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、かかる課題を
解決することを目的としてなされたものである。即ち、
本発明者らは、基質に対して親和性が高く生分解能力も
高い細菌を獲得するためのスクリーニング法を開発し、
本発明を完成させた。

【００１４】本発明は様々な化合物に応用可能であるス
クリーニング法、及び該化合物に対して親和性の高い微
生物を提供するものであり、特にフェノール化合物に対
して親和性の高い細菌（微生物）を獲得するために有用
である。

【００１５】即ち、本発明は、細菌混合物を連続培養す
ることによって基質である炭素化合物を生分解する能力
が高い菌をスクリーニングする方法であって、供給培地
中の唯一の炭素源としての該炭素化合物の濃度を徐々に
上昇させ、供給培地中の該炭素化合物濃度を一定の値ま
で到達させ、好ましくは、さらに、培養した細菌混合物
の一部を取り出し、非選択性培地中で再び培養して形成
されるコロニーのうち、コロニー数が最大のものを選出
する前記スクリーニング方法、並びに該方法により得ら
れた細菌である。 本発明は、連続培養培地中の炭素源
に、基質となる炭素化合物のみを用いることが特徴であ
る。通常の培地はグルコース等の糖類を含有するもので
あるが、本発明でベースとなるのは無機塩培地である。
基質である炭素化合物としては、例えば、フェノール、
ベンゼン、トルエン、クレゾール、クロロベンゼン、カ
テコール、アニリン、ピリジン、クロロフェノール、ジ
メチルフェノール、クロロクレゾール等が挙げられる
が、この限りではない。

【００１６】非選択性培地は通常の培養に使用するもの
であればどのようなものでも良いが、基質である炭素化
合物又はその類似化合物を含有させることも可能であ
り、必要に応じて各種抗生剤等の添加剤成分を含ませて
も良い。

【００１７】また本発明は、通常の振盪培養等のバッチ
培養法と異なり、新鮮培地を供給し続ける連続培養法を
行う。即ち、バッチ培養法では細菌の生分解により培地
中の基質の濃度が変化（低下）するが、連続培養法では
新鮮培地を供給し続けるため基質濃度を適宜制御するこ
とができる。本発明は供給培地中の基質濃度を徐々に上
昇させながら、さらに好ましくは上昇割合を一定として
基質濃度を徐々に上昇させながら培養を行うことに特徴
がある。

【００１８】前記細菌混合物として活性汚泥、及び前記
炭素化合物としてフェノールを用いたスクリーニング法
により得られる細菌は産業上、特に有用であり、好まし
い。

【００１９】この場合は、活性汚泥を連続培養槽に投入
し、フェノールを唯一の炭素源とする培地で連続培養を
行った後、希釈率を一定にしながら供給培地のフェノー
ル濃度を徐々に上昇させ、基質濃度が一定の高負荷状態
に到達させた（この際に、連続培養槽内のフェノール濃
度は常に１ｐｐｍ以下と低いものとする）。

【００２０】更に、その中の溶液又は細菌混合物の一部
を取りだし、非選択性の天然培地プレートに蒔き培養す
ることでスクリーニングした細菌を増殖させることがで
きる。

【００２１】前述のようにしてプレート上に形成された
コロニーの中から、コロニー面積、コロニー数及びコロ
ニー形態を考慮して最大のコロニーを選択することで高
親和性細菌を選択することができる。

【００２２】本発明のスクリーニング方法により得られ
る細菌は、非選択性の天然培地プレート上で形成される
コロニー数が最大のものが好ましいが、コロニー数が２
番目以降の細菌にも親和性がある程度のレベルで存在こ
とも考えられるので、これらを利用することも可能であ
る。

【００２３】本発明方法の好適実施態様として以下の方
法を挙げることができる。

【００２４】１． さらに、培養した細菌混合物の一部
を取り出し、非選択性培地中で再び培養する工程を含む
スクリーニング方法。

【００２５】２． 前記非選択性培地による培養で形成
されるコロニーのうち、コロニー数が最大のものを選出
する工程を含むスクリーニング方法。

【００２６】３． 前記非選択性培地中に基質である炭
素化合物又はその類似化合物を含有させることを特徴と
するスクリーニング方法。

【００２７】４． 供給培地中の炭素化合物濃度を徐々
に上昇させるに際し、上昇割合を一定にすることを特徴
とするスクリーニング方法。

【００２８】５． 前記細菌混合物が活性汚泥であるス
クリーニング方法。

【００２９】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
るが、本発明はこの範囲に限定されるものではない。

【００３０】

【実施例】

１． 高親和性菌のスクリーニング 実験用の活性汚泥槽を用い合成フェノール排水で馴養し
た活性汚泥を連続培養槽にとり、供給培地を１５００ｐ
ｐｍのＭＰ培地（Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ２．７５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ
₄ ２．２５ｇ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ １．０ｇ、ＭｇＣｌ
₂ ・６Ｈ₂ Ｏ０．２ｇ、ＮａＣｌ０．１ｇ、ＦｅＣｌ₃
・６Ｈ₂ Ｏ０．０２ｇ、ＣａＣｌ₂ ０．０１ｇ、フェノ
ール１．５００ｇを１ｌ中に含む）として連続培養を開
始した。培養時、温度は２５℃、溶存酸素濃度は５〜７
ｐｐｍとした。フェノールの負荷は希釈率により変化さ
せ、本実験は０．６ｇ／ｌ、ｄａｙの負荷で開始した。
その後４〜５日毎に０．６ｇ／ｌ、ｄａｙずつ負荷を上
昇させ、３．０ｇ／ｌ、ｄａｙの時にその中の溶液を一
部採取した。この溶液を１×１０⁸ 倍に希釈し、Ｎｕｔ
ｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地のプレート（Ｂａｃｔｏｐ
ｅｐｔｏｎ ５ｇ、Ｂｅｅｆｅｘｔｒａｃｔ ３ｇ、Ｎ
ａＣｌ ５ｇ、Ｂａｃｔｏａｇａｒ １５ｇを１ｌ中に
含む）に塗布し、３０℃で４日培養した。ここに形成さ
れたコロニーは、その形態から見て５種類に分類され
た。それぞれを寒天平板法で単離してＲ１、Ｒ２、Ｒ
３、Ｒ４及びＲ５菌株とした。これらの同定をＢｅｒｇ
ｅｙ′ｓＭａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙに記載されている方法に基づ
き行った結果を表１に示す。

【００３１】

【表１】

【００３２】また、これらのうちＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂ
ｒｏｔｈ 培地のプレート上で最も多数見られたものは
Ｒ２であった。

【００３３】２． 高親和性菌Ｒ２の同定 このように、フェノールを基質化合物とした本発明の方
法でスクリーニングして得たフェノール分解菌Ｒ２株
は、菌の分類学的性質を調べた結果、Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ｓｐ．に属することが判明した（表１参照）。

【００３４】本菌は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．
Ｒ２（平成５年８月１８日付で工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託された受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ− １
３８０５である微生物）と命名した。

【００３５】３． Ｒ２のフェノール分解活性 本菌をフェノールを唯一の炭素源とする無機塩培地（Ｍ
Ｐ培地）５ｍｌに接種し、３０℃でバッチ振盪培養し
た。その結果、図１に示すように本菌は初期フェノール
濃度５００ｐｐｍの場合まで増殖可能であった。

【００３６】同様にして、２００ｐｐｍのフェノールを
含むＭＰ培地で本菌を培養し、対数増殖期後期に菌体を
集菌した。この菌体についてギルソン社のオキシグラフ
酸素電極を用いて以下の通り本菌のフェノール分解活性
を測定した。

【００３７】まず、反応セルに２ｍｌのＭＰ培地を入れ
溶存酸素濃度が安定した後、菌体５ｍｇをセルに添加し
た。次に、１Ｍシアン化カリウムを２０μｌ添加し、菌
の呼吸による酸素消費を抑制した後、フェノールを添加
し、フェノールの分解に伴う特異的な酸素消費を測定し
た。フェノール添加量を調節し、各種基質濃度での酸素
消費を求めた。

【００３８】１分子のフェノールの分解に１分子の酸素
が必要であるとすると、フェノール分解活性はフェノー
ル分解に伴う特異的な酸素消費速度を添加菌体量で割る
ことにより求められる。

【００３９】基質が低濃度の時、この分解反応はＭｉｃ
ｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式に従うと考えられるの
で、Ｋｍ（基質親和性）値及び最大分解速度Ｖｍａｘ値
は下記のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式を用い
て

【００４０】

【数１】

【００４１】Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｋプロット
によりＸ軸に１／Ｓ、Ｙ軸に１／Ｖをプロットすること
で求めた。

【００４２】図２に、基質濃度と分解活性の関係を調べ
た結果を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ ＷＡ
Ｓ２の結果と合わせて示す。

【００４３】このように、本菌は、フェノール分解反応
に関しては、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＡＳ２に比べ低濃度
において分解活性が高く、最大活性の値は約４倍と大き
いものであった。

【００４４】Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式に
基づいてこの結果の解析を行い、表２に示す。

【００４５】

【表２】

【００４６】これより、本菌Ｒ２のＫｍ値（基質親和
性）は０．３４ｐｐｍであり、ＷＡＳ２に比べ約１／７
であり、本菌がフェノールに対して非常に親和性が高い
ことが解かる。

【００４７】また、本菌Ｒ２のＶｍａｘ値（最大分解速
度、酸素電極法による）は２８．１μｍｏｌＯ₂ ／ｍｉ
ｎ．、ｇｒａｍ ｃｅｌｌｓであり、ＷＡＳ２の約２．
５倍と大きいものであった。

【００４８】同様の菌体を用いて、Ｒ２が分解可能な基
質について、上記の酸素電極を用いる方法で調べた。そ
の結果を表３に示す。

【００４９】

【表３】

【００５０】このように本菌は、ベンゼン、トルエン、
クレゾール、クロロフェノール、カテコール、アニリ
ン、ピリジンも資化でき、基質特異性が比較的低いもの
であることが解かった。

【００５１】従来のフェノール資化性菌であるＰ．ｐｕ
ｔｉｄａ ＷＡＳ２は、そのＫｍ値が２．５ｐｐｍ、及
びＶｍａｘ値が７．９μｍｏｌＯ₂ ／ｍｉｎ．、ｇｒａ
ｍｃｅｌｌｓである。このように本発明の菌はＫｍ値が
低く（親和性が高い）、分解速度も大きいことが特徴で
あるといえる。

【００５２】４． フェノール連続処理実験 包括固定した菌体を用いて、フェノールの連続処理実験
を行った。菌体の包括固定は、橋本らが開発したＰＶＡ
冷凍法を用い、菌体濃度２０ｍｇ／ｍｌ、ゲル濃度１５
％で行った。これを一辺約５ｍｍの立方体に成形し、３
０％（Ｖ／Ｖ）の濃度で処理槽に投入した。処理水とし
て１５００ｐｐｍのフェノールを唯一の炭素源とするＭ
Ｐ培地を用い、負荷は希釈率により変化させた。この結
果を図３に示す。

【００５３】これより、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＷＡＳ２及
びＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．Ｒ２の限界最大負荷
はそれぞれ３ｇ／ｌ，ｄａｙ、及び７ｇ／ｌ，ｄａｙで
あることが解かる。このように、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｓｐ．Ｒ２を用いることでフェノール高負荷型のリ
アクターが作製できることが明らかになった。

【００５４】

【発明の効果】培地中の炭素源である基質を変えること
で、様々な基質に対して親和性の高い微生物を獲得する
スクリーニング方法が確立された。例えば、基質にフェ
ノールを用いることで得られたフェノール資化性菌は、
製鉄工業等のように工場排水に多量のフェノール化合物
を含む場合の生物学的排水処理（例えば、活性汚泥）の
能力向上のために、微生物製剤として用いることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】フェノールを唯一の炭素源とする無機塩培地中
で振盪培養した際の、本発明の菌の増殖挙動を示すもの
である。初期濃度５００ｐｐｍまで増殖が可能であるこ
とが解かる。

【図２】各種フェノール濃度における本発明の菌のフェ
ノール分解活性を示す図である。特に、低濃度において
従来菌（ＷＡＳ２）の約４倍もの活性を有することが解
かる。

【図３】本発明の菌体を包括固定し、フェノールで負荷
処理した際の挙動である。処理水のフェノール濃度を追
うことで限界最大負荷値が７ｇ／ｌ，ｄａｙまで伸びて
いることが解かる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｆ 7236−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:05） (72)発明者 小野寺 康 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細菌混合物を連続培養することによって
   基質である炭素化合物を生分解する能力が高い菌をスク
   リーニングする方法であって、供給培地中の唯一の炭素
   源としての該炭素化合物の濃度を徐々に上昇させ、供給
   培地中の該炭素化合物濃度を一定の値まで到達させる工
   程を含むことを特徴とする前記スクリーニング方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のスクリーニング方法か
   ら選択され得る、基質である炭素化合物を資化又は分解
   する能力を有する高親和性細菌。
3. 【請求項３】 Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｓｐ．Ｒ２株
   由来であることを特徴とするフェノール高親和性細菌。