JPH0759187B2

JPH0759187B2 - 糖蜜からのエタノ−ル製造に適した細菌

Info

Publication number: JPH0759187B2
Application number: JP61221040A
Authority: JP
Inventors: 博田口; 亮田端
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1986-09-19
Filing date: 1986-09-19
Publication date: 1995-06-28
Anticipated expiration: 2010-06-28
Also published as: JPS6374482A

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕産業上の利用分野本発明は、糖蜜からの燃料用アルコール製造に利用しう
る細菌に関する。

従来の技術糖質からの工業的エタノール製造には、従来より酵母が
用いられているが、近年、ザイモモナス（Zymomonas）
等の細菌によるエタノール発酵が注目され始めている。

ザイモモナス属細菌は、酵母と同様に、グルコース１モ
ルからエタノールを約２モル生成するが、エタノールの
生産性が酵母よりもはるかに高く、更に発酵速度も酵母
より大きいことから、本菌を用いたバイオマスからの燃
料用アルコール製造が高い関心を集めている。しかし、
ザイモモナス属細菌は、発酵性糖がグルコース、フラク
トース及びスクロースに限られている等、酵母に比べて
劣る点もある。

また、発酵法による燃料用アルコール製造に使用する糖
質原料としては、ケーンジュース、糖蜜、穀物の糖化液
等が一般的であるが、我が国の代表的糖質原料である糖
蜜は、塩類濃度が高いことから、耐塩性の弱い既存のザ
イモモナス属細菌では、糖蜜からのエタノール生成量は
低い。

したがって、ザイモモナス属細菌を用いた糖蜜からの燃
料用アルコール製造の工業的実用化のためには、耐塩性
等の面で既存のザイモモナス属細菌を凌駕する性質を有
する菌株の取得が必須と考えられる。

〔発明の概要〕

本発明の目的は、耐塩性等の面で既存のザイモモナス属
細菌を凌駕する性質を有する、糖蜜からの燃料用アルコ
ール製造に適した新規な微生物菌株を提供することにあ
る。

本発明者は、耐塩性、発酵温度、糖資化性等の面で既存
のザイモモナス属細菌を凌駕する微生物を自然界に求め
て鋭意探索を続けてきた。その結果、ブラジルで採取し
たサトウキビ搾汁より分離した細菌が、耐塩性において
既存のザイモモナス属細菌より優れていて、糖蜜からの
エタノール生成量が改善されることを見出して本発明を
完成した。

要旨本発明によるザイモモナス・モビリスは、グルコース5.
0（w/v）％、リン酸一カリウム0.2（w/v）％、酵母エキ
ス1.0（w/v）％および塩化カリウム2.0（w/v）％より成
る液体培地（pH6.5）で、初菌数10⁵cells/mlレベルで30
℃で３日間静置培養したときに、少なくとも1.75（w/v
培養液）％のエタノールを生産する、ものである。

このような細菌の具体例は、ザイモモナス・モビリス・
サブスピーシーズ・モビリス B53（微工研菌寄第8922
号）およびザイモモナス・モビリス・サブスピーシーズ
・モビリス B69（微工研菌寄第8923号）である。

効果本発明細菌は耐塩性にすぐれていて、KC1濃度が2.0（w/
v）％である上記の培地においてエタノール生産能が少
なくとも1.75（w/v培養液）％、たとえば少なくとも1.9
0％（B53株）または少なくとも1.75％（B69株）であ
る。

従来のザイモモナス属細菌が耐塩性の劣るものであった
ことを考えれば（後記実験例参照）、本発明の細菌の強
い耐塩性は思いがけなかったことというべきである。

〔発明の具体的説明〕

微生物採取地本発明細菌の具体例であるB53株およびB69株は、ブラジ
ルで採取したサトウキビ搾汁より本発明者が分離したも
のである。

受託番号 B53株およびB69株はいずれも通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されていて、下記の受託番号を
得ている。菌株受託番号 B53 微工研菌寄第8922号 B69 微工研菌寄第8923号菌学的性質 B53株およびB69株の菌学的性質の主なものは、下記の通
りである。

１）形態的性質（標準寒天培地^＊で30℃、24時間培養）（１）菌形：桿菌（２）大きさ:1.6〜8.0μｍ×1.2〜1.6μｍ（３）多形性：なし（４）運動性：なし（５）芽胞：なし（６）グラム染色性：陰性（７）培養所見：肉汁培地では生育しない。標準培地
^＊＊（standard medium）では良好な生育を示し、寒天
平板培養においては、表面は滑らか、周縁部は全縁に光
沢を有する。色は白色〜クリーム色。ゼラチン液化能は
陰性。

＊標準寒天培地 D-グルコース 20g/リットル酵母エキス 10g/リットル寒天 20g/リットル＊＊標準培地（standard medium） D-グルコース 20g/リットル酵母エキス 10g/リットル２）生理学的性質（１）硝酸塩の還元：認められない（２）脱窒反応：認められない（３）MRテスト：陰性（４）VPテスト：陽性（５）インドールの生成：認められない（６）硫化水素の生成：認められない（７）デンプンの加水分解：認められない（８）クエン酸の利用：認められない（９）無機態窒素の利用：アンモニウム塩の形で利用
できる（10）色素の生成：認められない（11）ウレアーゼ：陰性（12）オキシダーゼ：陰性（13）カタラーゼ：陽性（14）生育範囲 pH ：生育pH 4.0〜8.5 至適pH 5.5〜7.0 温度：生育温度15℃〜40℃ 至適温度30℃〜35℃ （15）酸素に対する態度：通性嫌気性（16）O-Fテスト：発酵的（Fermentative）（17）糖類からの酸及びガスの生成： D-グルコース、D-フルクトース、スクロースより酸及び
ガスを生成する。L-アラビノース、D-キシロース、D-マ
ンノース、D-ガラクトース、麦芽糖、乳糖、トレハロー
ス、D-ソルビット、D-マンニット、イノシット、グリセ
リン、デンプンより酸及びガスは生成しない。

（18）糖類の分解生成物:1モルグルコースあるいはフル
クトースより、約２モルのエタノール及び炭酸ガスを生
成する。

（19）栄養要求性：パントテン酸以上の菌学的性質から、「バージーズ・マニュアル・オ
ブ・システマティック・バクテリオロジー」第１巻（19
84）（Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology,
vol.1（1984）及び「インターナショナル・ジャーナル
・オブ・システマティック・バクテリロオジー」第26
巻、146−157頁（1976）（Int.J.Syst.Bacteriol.,vol.
26,p146−157（1976））に従い、本菌はザイモモナス・
モビリス・サブスピーシーズ・モビリス（Zymomonas mo
bilis subsp.mobilis）に属する。しかし、本菌と既知
のザイモモナス・モビリス・サブスピーシーズ・モビリ
スとは、電気泳動パターンからみて保有プラスミドが異
なり、また、第１〜２図及び第３〜４表に示す様に耐塩
性が異なる。このため、本菌をザイモモナス・モビリス
・サブスピーシーズ・モビリスB53および同B69と命名し
た。

培養本発明細菌は、合目的的な任意の培地および培養条件で
培養することによって、増殖させて、所要菌体量を得る
ことができる。

培地および培養条件の具体例の一つは、後記実験例に示
した通りである。

エタノールの生産糖蜜にザイモモナス属細菌を作用させてエタノールを生
産することが公知であることは前記したところであり、
本発明細菌による糖蜜からのエタノールの生産も、使用
菌が耐塩性の本発明菌であることを除けば、従来公知の
方法と本質的には変らない。

なお、本発明細菌が対象とする糖蜜は、ショ糖搾汁から
ショ糖をその晶出が生じなくなるまで十分に回収した後
の母液、すなわち廃糖蜜、が代表的であり、またこのよ
うな糖蜜は塩が濃縮されているから本発明細菌の効果が
最大限に享受できるという点でも適当なものである。し
かし、本発明細菌が対象とする糖蜜は上記のような廃糖
蜜に限定されず、必要に応じて、ショ糖の晶出が未だ可
能であるほどにショ糖を含有するショ糖搾汁濃縮母液ま
たは粗糖濃縮母液、ならびにテンサイ糖についての対応
糖蜜ないし濃縮母液、を包含するものである。上記の典
型的な糖蜜であるショ糖搾汁廃糖蜜の塩含有量は、たと
えば本多紀元著「アルコールハンドブック」（醗酵協会
1963年刊）に示されている。

実験例実施例ブラジル（サンパウロ州）で採取したサトウキビ搾汁少
量を、下記組成の集積用培地に接種した。

集積用培地組成酵母エキス〔オキソイド社製〕 1.0％（w/v） KH₂PO₄ 0.2％（〃）グルコース 2.5％（〃）フルクトース 2.5％（〃）エタノール 5.0（v/v）％カビシジン（Kabicidin） 100ppm（w/v）エリスロマイシン 1ppm（〃） pH6.2 次いで、これを30℃で２〜３日間培養し、生育及び著量
のガス産生が認められた培養液を、下記組成の分離用寒
天平板培地に塗布した。

分離用寒天平板培地酵母エキス〔オキソイド社製〕 1.0％（w/v） KH₂PO₄ 0.2％（〃）グルコース 1.0％（〃）フルクトース 1.0％（〃）カビシジン 100ppm（〃）寒天 1.5％（〃） pH6.2 嫌気条件下に30℃で２〜３日間培養し、出現したコロニ
ーを上記寒天平板培地に画線培養し、同様に培養して、
純粋分離を行なった。

純粋分離後、再度、寒天平板培地に塗布するとともに、
顕微鏡観察を行なって、純化を確認した。

上記菌部の形態的性質、各培地上での性状及び生理学的
性質は前記の通りであり、本発明者は、これをザイモモ
ナス・モビリス・サブスピーシーズ・モビリス B53と
命名した。

ザイモモナス・モビリス・サブスピーシーズ・モビリス
B69も、同様にして、ブラジルで採取したサトウキビ
搾汁から分離した。

上記試験の結果、本発明の微生物２株は自然界より純粋
に分離された菌株であることが判る。

参考例１実施例で得た菌株を利用して、糖蜜からエタノールを製
造した。なお、培養液からのエタノールの回収は、蒸
留、抽出、膜分離等の公知の手段を用いて行なう。

第１表に組成を示す培地に菌株を接種し、30℃で24時間
静置培養した後、この培養液を第２表に組成を示す培地
に10（v/v）％量接種して、30℃で24時間静置培養す
る。この培養液を前培養液とする。

この前培養液を、糖濃度200g/リットルの糖蜜希釈液に1
0（v/v）％量接種し、30℃あるいは37℃で静置培養す
る。

培養温度30℃での糖蜜発酵特性を第１図に、培養温度37
℃での糖蜜発酵特性を第２図に（糖濃度は、いずれも20
（w/v）％）、もろみ中のエタノール濃度を第３表に示
す。

本発明による菌株は、公知のザイモモナス属細菌に比べ
て糖蜜からのエタノール生成速度が大きく、また高温条
件下においても発酵阻害を受けにくい株であることが判
る。

第１表培地組成酵母エキス 1.0％（w/v）グルコース 2.0％（〃） pH 未調整第２表培地組成酵母エキス 1.0％（w/v）グルコース 5.0％（〃） pH 未調整参考例２本発明によるザイモモナス・モビリスB53株および同B69
株を、それぞれ、酵母エキス（オキソイド社製）1.0（w
/v）％、リン酸一カリウム0.2（w/v）％、グルコース2.
0（w/v）％、寒天2.0（w/v）％より成るRM斜面培地（pH
6.5）に一白金耳植菌し、30℃で24時間培養した。この
スラントから同様組成の液体培地（RM液体培地）に一白
金耳接種し、30℃で24時間静置培養したものを前々培養
液とした。この前々培養液を再度、RM液体培地100部
（容量）に対して１部（容量）添加し、30℃で18時間静
置培養したものを前培養液とした。

この前培養液を０〜３（w/v）％のKClを含むグルコース
濃度5.0（w/v）％のRM液体培地100部（容量）に対して
１部（容量）添加して、30℃で３日間静置培養した。培
養終了後、培養液を0.45μ孔径のフィルターで過し、
高速液体クロマトグラフあるいはガスクロマトグラフを
用いてエタノール濃度を測定した。

同様の実験をザイモモナス・モビリスの公知菌であるNR
RL B-14023株およびATCC 29191株についても行なった。

５回の実験を行なった結果は、次表にまとめた通りであ
る。

参考例３本例は、本発明B53株およびB69株と公知菌のNRRL B-140
23株およびATCC29191株との差をそれらの保有するプラ
スミドに着目して検討したものである。

各菌株のプラスミドDNAは、BirnboimおよびDolyのアル
カリ抽出法（Nucleic acids Res.７、1513（1979））に
より調製し、フェノール／クロロホルム抽出およびエタ
ノール沈澱を行なって精製したのち、TE緩衝液（N-トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン10mM＋エチレンジ
アミンテトラ酢酸1mM、pH8.0）に溶解した。

各プラスミドならびにそのHindIII（（株）宝酒造）分
解物について、またλDNA-HindIII/φ×174RF−HaeIII
分子量マーカー（（株）ファルマシア）について、常法
に従ってアガロースゲル電気泳動を行なった。たゞし、
プラスミドそのものについての電気泳動はアガロースゲ
ル濃度0.7％で、プラスミドのHindIII分解物および上記
マーカーについてのそれは1.0％で、行なった。

B53株は約5kbの低分子量のプラスミドと数10kb以上のプ
ラスミドとを有していたのに対して、B69は数10kb以上
のプラスミドのみを有していた。一方、プラスミドをHi
ndIIIで消化した切断フラグメントの電気泳動パターン
はB53株およびB69株相互で明瞭に異なっており、またこ
れらはタイプカルチャーのザイモモナス・モビリスNRRL
B-14023やATCC 29191に含まれるプラスミドとも明瞭に
異なっていた。

【図面の簡単な説明】

図面は、４種の菌株についての糖蜜発酵特性を示すグラ
フであって、第１図は発酵温度が30℃、第２図は同37℃
の場合を示すものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グルコース5.0（w/v）％、リン酸一カリウ
ム0.2（w/v）％、酵母エキス1.0（w/v）％および塩化カ
リウム2.0（w/v）％より成る液体培地（pH6.5）で、初
菌数10⁵cells/mlレベルで30℃で３日間静置培養したと
きに、少なくとも1.75（w/v培養液）％のエタノールを
生産する、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobili
s）。
【請求項２】上記液体培地で初菌数10⁵cells/mlレベル
で30℃で３日間静置培養したときに少なくとも1.90（w/
v培養液）％のエタノールを生産するザイモモナス・モ
ビリス・サブスピーシーズ・モビリス B53（Zymomonas
mobilis subsp.mobilis B53:微工研菌寄第8922号）で
ある、特許請求の範囲第１項記載のザイモモナス・モビ
リス。
【請求項３】上記液体培地で初菌数10⁵cells/mlレベル
で30℃で３日間静置培養したときに少なくとも1.75（w/
v培養液）％のエタノールを生産するザイモモナス・モ
ビリス・サブスピーシーズ・モビリス B69（Zymomonas
mobilis subsp.mobilis B69:微工研菌寄第8923号）で
ある、特許請求の範囲第１項記載のザイモモナス・モビ
リス。