JPH07509264A - 分析物応答ポリマーによる分析物検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分析物応答ポリマーによる分析物検出 技術分野 本発明は、液状サンプル内の分析物を検出する方法に関するものであり、この方 法は、センサーに連係させた（ｉｎｔｅｒｆａｃｅｄ）ポリマーが示す音および 光エネルギー伝播特性を利用している。

茸！ 化学および生物学的物質をナノモル範囲で検出可能な検出機構は、食品、ヘルス ケア、環境および廃棄物処理産業を含む多様な商業分野で益々利用されるであろ う。このような検出要求に合致する敏感性を示す装置が数多く開発されてきてお り、これらには、共振振動数シフトの利点を利用したもの、例えば圧電変換器な ど、並びに屈折率の変化を基礎にして作動する光学センサーなどが含まれる。

圧電変換器の場合、これを液体の中に浸漬しながらそれらの表面で質量、粘度お よび密度の小さな変化を検出することができることから、これらは、非常に少量 の材料を溶液内で測定しなければならない時の分析道具として特に有効性を示し ていた。圧電型センサーに関する設計方策は、主に、結果として結晶表面の所で 質量変化がもたらされる出来事を伴っていた。これに関して最も広範に研究され た変換器は、水晶結晶微量天秤（ｑｕａｒｔｚ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｍｉｃｒｏｂ ａｌａｎｃｅ）（ＱＣＭ）と通常呼ばれているせん断モードＡＴ−カット（ｓｈ ｅａｒｍｏｄｅ　ＡＴ−ｃｕｔ）水晶振動子であり、これには、２個の金属励起 電極の間の挟まれているＡＴ＝カット水晶結晶が備わっている。生物学的分析物 を検出する目的で用いられているＱＣＭの使用実施例はヨーロッパ特許出願公開 筒０　２１５　６６９号（Ｋａｒｕｂｅ他）の中に見いだされ、ここでは、圧電 型装置の表面上に固定されているレセプタ材料に加えられた分析物の重量が引き 起こす共振振動数の変化（Δｆ）を基礎にして溶液内の分析物濃度が計算されて いる。Ｋａｒｕｂｅの発明は、ある種の生物学的分析物の濃度測定で圧電変換器 が有効であることを示していた。

圧電変換器は溶液環境内で用いるに有効な道具であるが、その検出すべき分析物 に関する特異性尺度をそれに与えるには、その表面を改質する必要があると共に 、このような改質圧電型装置の製造は操作的に複雑であり、しばしば困難である 。検出すべき分析物が現実に生物学的物質である場合、この結晶表面の上にレセ プタ剤（抗原、抗体または他のリガンド）を固定する必要がある。しかしながら 、このような方法は有意な固有限界を有している、と言うのは、この固定化過程 の間にそのレセプタ剤が失活するか或は固定化後に結晶表面からそれが分離して くる可能性があるからである。

このＱＣＭのレセプタ改質を容易にする目的で、より高い効率を示す特異的なレ セプタ剤結合を可能にするポリマー被覆水晶振動体が開発された。Ｍｕｌ　１ｅ ｒ−８ｃｈｕｌｔｅ　（ドイツ特許第３７３３９８６Ａ１号）は、種々の生分子 （ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の吸着を容易にする水に不溶なポリマーで圧電振 動体を被覆することを記述している。

次に、これらの固定化した生分子が抗原またはりガントと結合し、その結果とし て生じる、振動体である水晶の質量上昇が共振振動数の変化に翻訳され、これを 用いてその分析物の定量を行うことができる。

圧電型センサーを用いることに関する上記例は有効性を示すが、これらは全て、 共振振動数の変化をもたらすセンサー表面上の質量変化に依存している点で限界 を有している。単に質量変化を基礎にしたセンサー設計は、その分析物の分子質 量が低い場合、限界を示し得る。例えば、せん断モードＡＴ−カット結晶が有す る活性表面に蛋白質が結合することに関連した質量上昇は、一般に、実際の振動 数応答にとって充分でない。池の考慮としては、その結合した分析物が示す剛性 などが含まれ、例えばＱＣＭの表面に結合するニュートンフィルムが与える振動 数シフトは、５ａｕｅｒｂｒｅｙ方程式で予測されるシフトよりもずっと小さイ （Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ、　Ｐｈｙｓ、　（１９５９）　１５５：２０６）。

更に、圧電振動体技術は、有機体が示す生物学的活性を連続的にリアルタイム（ 動的）測定するにはあまり適合しておらず、レセプタ改質圧電方法の有効性は、 公知試薬が示す特異性、即ち異なる有機体型が存在していることを評価するには 試験を繰り返す必要があるといったことによって制限されている。

このような制限に打ち勝つための、この検出方法が示す特異性を増大させる試み の中で、特定の試薬、イオンまたは代謝物との反応を生じさせるようにポリマー フィルムの設計が行われた。例えば米国特許第４゜７３５．８８７号（Ｆｏｓｓ 他）には、開環機構を通してポリ両性電解質（ｐｏｌｙａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ） と反応して第一級アミン類を生じるプロピレンイミンが開示されている。これら の第一級アミン類はタンニング現像液および通常のアルデヒド架橋剤と反応して 架橋した網目構造を生じ得る。Ｅｂｅｒｓｏｌｅ他（国際特許公開番号ＷＯ９１ １０１３８１）は、溶液内でポリ両性電解質を用いることを記述しており、これ らは、有機体の代謝産物と接触すると圧電型装置の上に堆積して共振振動数の変 化をもたらし、これは、代謝産物の存在下で濃度変化または変化率に相関関係を 示す。ここでは、サンプル内に存在していると予測される分析物に暴露するに先 立って、このポリ両性電解質をそのセンサー表面に固定していない。Ｔａｎａｋ ａｌｌｈ（米国特許第４．　７３２゜９３０号）により、モノマーを含む金属イ オン、架橋剤および適切な液状媒体の存在下でイソプロピルアクリルアミドを重 合させることによって生じさせた特定のイオン性ゲルは溶媒組成、温度およびｐ Ｈの変化またはイオン組成に応答して劇的に体積変化を生じ得ることが示された 。

しかしながら、Ｔａｎａｋａ他は、これらのゲルが示す性質を圧電型振動子利用 測定装置または屈折率変化検出に連結させて分析物感知性を達成する試みは全く 行っていない。

ポリマーフィルムが示す動的な物理的寸法特性を分析物検出システムの中に組み 込む試みはほとんどなく、あまり開発されていなかった。酸素などの如き気体が 示す分圧変化（Ｉ　ｒａｎ　ｉ他、「酸素が豊富な雰囲気内で材料が示す引火性 および敏感性」、第３巻、ＡＳＴＭ　５ＴＰ９８６、Ｄ、　Ｗ、Ｓｃｈ　ｒｏ　 ｌ　Ｉ編集、Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　ａ ｎｄ　ＭａｔｅｒｉａｌＳＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、（１９８８）３４６−３ ５８頁）、並びに湿度および塩１度変化、に応答する架橋ポリマー類に関して種 々の物理的寸法変化が報告された。特開昭６３−２０６６５３号には、塩濃度に 応じて相変化または体積変化を生じる支持体上に有機ポリマーゲル層または塊が 保持されていることによって特徴づけられる塩濃度センサーが記述されている。

特開平２−２１２７４４号には、圧電セル表面に接触している感湿性ポリマーが 示す膨張または収縮を基礎にして大気湿度を検出する半導体湿度センサーが記述 されている。このセルが示す圧抵抗変化が大気湿度パーセントに翻訳されている 。

ゲルおよび架橋ポリマー類が種々の生物学的およびイオン性分析物に応答するこ とは、上記技術の中に示されているように公知であるが、全ての場合において、 これらの製造は、塩または湿度変化に応答して膨潤するポリマーに関する共通の 物理的原理に依存している。更に、そのポリマーゲルの中には、水または個々の イオンに対する応答を特異的にする固有なものは全く存在しておらず、そしてこ れらのゲルが機能を果すには全てのゲルを予め膨潤した状態にしておく必要があ る。

分析物の検出を行うための光学センサーは、一般に、この分析物が存在している ことに応答する小さな屈折率変化に頼うている。通常に用いられている光学セン サーには平板導波管、光学繊維および回折分級が含まれる。一般に、この種類の 光学センサーは、圧電振動体と同じ欠点の多くを示し、例えば分析物への特異性 が不足しており、表面調製が困難であると共に、生物学的活性の連続的なリアル タイム（動的）変化を測定するに困難さを示す。今日まで、光学センサー分野に おける上記困難さは処理されないままである。

従って、（１）光および／または音エネルギーを伝播させる能力が変化すること によって分析物の存在に応答し、（２）個々の分析物に特異性を示し、そして（ ３）この伝播特性の変化をセンサーが検出するようにセンサー表面と複合体を生 じる能力を保有している、新規な、分析物応答（ａｎａｌｙｔｅ−ｒｅｓｐｏｎ ｓｉｖｅ）ポリマーに対する要求が依然として存在している。

本発明の主題事項は、１つの面として、分析物応答ポリマーが示す音および／ま たは光エネルギー伝播特性に頼って分析物を検出する方法を包含している。この 方法は、 ａ、　音響もしくは光学検出システムのどちらかを分析物に接触させ、ここで、 この検出システムに含まれている分析物応答ポリマーがこの分析物に応答し、 ｂ、　本発明の光学態様の場合、該分析物応答ポリマーが示す光伝播の変化を検 出する手段に段階ａのシステムを連係させ、Ｃ０この検出システムが示す特性の 伝播変化を測定し、モしてｄ、　段階Ｃで測定した伝播変化とこの分析物の存在 、濃度または産生率とを相互に関係付ける、 ことを含んでいる。

本発明の別の面は、５．０から８．０のｐＨを示す、アクリル酸、メタアクリル 酸アルキルおよびメタアクリル酸Ｎ、　Ｎ−ジメチル−アミノエチルの両性コー もしくはターポリマー類から成る群から選択される、ポリマー１分子当たり１− ２０個の架橋を有する変換用ポリマーを含んでいる組成物であり、ここで、これ らの両性コーもしくはターポリマー類は表面に固定されている。本発明のさらな る面は、この請求する組成物の製造方法である。

図の簡単な説明 図１は、２段階から成るポリ両性電解質の製造方法を説明するものである。

図２は、狭い組成分布を示す材料と広い組成分布を示す材料に関する、ｐＩに到 達する効果を示すグラフである。

図３は、架橋した分析物応答ポリマーの製造を行うに典型的な図式を示している 。

図４（ａ）は、架橋したポリマーフィルムで被覆されている５ＭＨｚＡＴ−カッ ト水晶振動子に関する、異なるｐＨ値におけるｆ　Ｇｖｍａヮ変化を示している 。（■）フィルム厚＝０．４ｐｍ、（ロ）フィルムｉ＝ｏ。

８　ｐｍ　。

図４（ｂ）は、架橋したポリマーフィルムで被覆されている５　Ｍ　ＨｚＡＴ− カット水晶振動子に関する、異なるｐＨ値におけるｒ。７．変化を示している。

（■）フィルム厚＝０．　４μｍ、（ロ）フィルム厚＝０゜８μｍ０ 図５は、架橋したポリマーフィルムで被覆されている５ＭＨｚ　ＡＴ−カット振 動子が３つの異なるウレアーゼ濃度で尿素のウレアーゼ触媒加水分解に対して示 す振動数応答を説明している。０．８３μｇ／ｍＬ（小さい黒画角）　、０．４ ３ｕｇ／ｍＬ　（白四角）　、０．　２２１１ｇ／ｍＬ（大きい黒画角）。差込 み図：ウレアーゼ濃度に対して最小振動数が示す時間依存関係。

図６は、架橋したポリマーフィルムで被覆されている５ＭＨｚ　ＡＴ−カット振 動子が異なる炭水化物内の大腸菌に対して示す振動子応答を説明している。

図７は、異なるウレアーゼ濃度における尿素のウレアーゼ触媒加水分解に応答し て架橋ポリマーフィルムの屈折率が経時的に変化することを説明している。

発明の詳細な説明 出願者らは、架橋したポリマーフィルムが示す固有の伝播特性を利用した機構を 通して溶液内の特定分析物を検出する方法を発明した。

この伝播特性の変化が示す正確な性質を完全には理解していないが、これは、仮 説として、この分析物応答ポリマーフィルムが示す粘弾性、剛性および音と光波 を伝播する能力が変化することに起因している。質量変化も生じ得るが、本発明 は重量上昇を測定するものでないと理解する。本発明は、むしろ、結果として生 じるポリマー−分析物複合体が元の変換用ポリマーのそれとは異なる伝播特性を 示すことによるものである。このポリマー−分析物複合体に関連させたセンサー を用いて、上記伝播変化を検出する。このような変化は、その存在している分析 物の量に定量的に相関関係を示し得る。

本発明の主題事項はまた、センサー表面に固定した架橋ポリマー類のユニークな 組成物を包含している。これらのポリマー類は、個々の分析物、例えばイオン、 リガンド、抗体などに特異的なレセプタを含んでいるか或は含んでいなくてもよ い。水素イオンの検出を行う特定ケースとして、架橋した分析物応答ポリマーで 出来ている特定の不溶フィルムのインピーダンス分析を行うことで、その媒体の ｐＨが変化するとそのポリマーフィルムの特性が変化することを示す。上記ポリ マーを水晶微量天秤の表面に固定すると、このポリマー／水晶複合体振動子の共 振振動数は等１領域内で有意に低下する。ｐｉに近付くと、共振等価抵抗（ｒｅ ｓｏｎａｎｔ　ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）および帯域幅が 増大するが、９１点では、イオン形態で観察される値に近い値にまで低下する。

このポリマーが完全にプロトン化されている（カチオン性を示す）か或は完全に 脱プロトン化されている（アニオン性を示す）極端なｐＨ値では、類似した電荷 を有する部位間の静電反発が原因でこのポリマーは膨潤する。それとは逆に、ｐ ｉの所では、そのフィルム内の静電架橋が原因でそのポリマーの膨潤が小さくな る。膨潤の変化、そしてそれに伴う粘弾性特性の変化、並びに音および光波伝播 の変化により、予想外に大きな振動数変化がもたらされる。

本発明では、分析物の影響が原因で薄ポリマーフィルム内に生じる変化を検出す る２つのアプローチを記述し、ここでは、圧電型音波装置の上か、或はこのポリ マーフィルムが示す屈折率変化を測定することができる装置の上に、このポリマ ーフィルムを被覆する。これらの２つのアプローチに関する変換原理は、両方と も、このポリマーフィルム内の波伝播が分析物で誘発されて変化することに依存 している点で類似している。厚みせん断モード音波装［１（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ 　５ｈｅａｒ　ｍｏｄｅ　ａｃｏｕｓｔｉｃ　ｗａｖｅ　ｄｅｖｉｃｅ）、例え ばポリマーフィルムで被覆したΔ］゛−カット水晶結晶で上記を説明することが でき、この組み合わせを本明細書では複合体振動子と呼ぶ。この音波は、この水 晶結晶の厚みを通り、このポリマーフィルム−水晶接触面を横切り、そしてこの ポリマーフィルムを通り、行き戻りして伝播する。その結果として、共振振動数 に相当する振動数を有する定常波がこの複合体振動子内に樹立される。この複合 体振動子の厚みおよびその音波の伝播速度を用いてその共振振動数を測定する。

伝播している間の音波が遭遇する粘性損失（ｖｉｓｃｏｕｓ　１ｏｓｓｅｓ）に よって、その音波のエネルギー減衰（ｅｎｅｒｇｙ　ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ） が影響を受ける。この水晶結晶の厚み、伝播速度およびエネルギー減衰はその分 析物の影響を受けないことから、この複合体振動子が敏感性を示すのは、このポ リマーフィルム内に生じる、その分析物で誘発された特性変化に対してのみであ る。従って、この共振振動数は、その分析物が誘発する伝播変化およびポリマー フィルムのモジュラスの影響を受け、そしてそのエネルギー減衰は、このポリマ ーフィルム内の粘性損失の影響を受ける。即ち、このエネルギー減衰は、振動し ている間にこの複合体振動子の中に「反射して」戻されるエネルギー量に依存し ている。通常、これを定性ファクターＱとして定義し、これは、この振動子が振 動している間に失われたエネルギーに対する、蓄えられたエネルギーの比率であ る。

エネルギー減衰が増大すると、その結果として、Ｑの値が低くなり、等価抵抗値 Ｒが高くなると共に、導電帯域幅が広がる。

光学的に感知するアプローチは、支持体に連係させたポリマーフィルムを横切っ て光波が行き戻りして伝播しそしてポリマーの中に入る点で類似している。本質 的に、複合体である光学センサーの中に定常波を樹立する。この定常波は単一振 動数のものであるが、或はより通常には、ある範囲の振動数のものであってもよ い。反射して検出器の中に戻って来る光量は、このポリマーフィルムの屈折率に 依存している。この支持体の屈折率は分析物から独立していることがら、分析物 の影響が原因でこのポリマーフィルムの屈折率が変化するのは、反射して戻って 来る光量が変化することが原因となっており、そしてこれを最終的に光学センサ ーで検出する。従って、結果として生じる光強度の変化は、音波装置におけるエ ネルギー減衰変化に類似している。これらの２種の装置は、両方ともがポリマー フィルム特性に対して分析物が与える影響から生じる彼エネルギーの伝達変化に 感受性を示す点で、概念的に関連している。

加つるに、このポリマーフィルムは特定の光波長を吸収する可能性があり、この ポリマーが分析物と相互作用する払その吸収度合が影響を受ける可能性がある。

その結果として、異なる波長の強度が変化する可能性があり、従って、このセン サーを出る重量平均光振動数が変化する可能性がある。これは、音波装置で検出 する共振振動数変化に類似している。従って、両方の装置とも、波伝播の原理に 従って記述する場合、概念的に類似している。

本発明の開示を支持するにおいて、以下に示す言葉に下記の意味を持たせること を意図する。

「分析物」　（”Δ”）は、生物学的レセプタを含んでいる分析物応答ポリマー 類を含む分析物応答ポリマーと相互作用もしくは反応し得る如何なる物質も意味 している。この分析物は、細胞、微生物またはそれらの細胞上成分の増殖および 代謝過程を含む化学もしくは生物学的過程で産生されるか或は消費され得る。分 析物は媒体内に自由に浮いているか、細胞表面に付着しているか、細胞内に含ま れているか、或は酵素触媒作用の結果として分析物応答ポリマーの表面上で産生 され得る。また、この分析物は、触媒反応、酵素イムノアッセイまたはＤＮＡプ ローブアッセイの産物であってもよい。この分析物は酸、緩衝剤、塩、酵素、蛋 白質、炭水化物、脂質または同様な生物学的産物であるか、或は生物学的活性で 濃度低下または上昇を示す物質であってもよい。

「生物学的レセプタ」は、分析物と特異的結合対を形成する物質である。これら は各種キレ−１−剤、抗体、レクチン類、組織レセプタ、細胞接着因子、リガン ド結合蛋白質および同様な分析物レセプタ剤物質であってもよい。

「変換用ポリマー」は、分析物と相互作用する結果として音または光エネルギー の伝播挙動を支配している特性の変化を表す如何なるポリマーも意味している。

この変換用ポリマーは両性を示すか或は示さなくてもよい。

「分析物応答ポリマー」　（”八ＲＰ”）は、１）分析物と選択的に相互作用ま たは反応する能力を有しており、モして２）分析物と相互作用する結果として音 または光エネルギーの伝播挙動を支配している特性の変化を表す、架橋している 両性ポリマーを意味している。このＡＲＰは、分析物と特異的結合対を形成し得 る生物学的レセプタを含んでいてもよい。

イオン対、複合体形成反応、酸化還元反応または共有カップリングを含む多様な 反応を通して分析物と反応させるようにこのポリマーを選択するか或は設計する 。このような適合性により、本発明は高分子量分析物もしくは低分子量分析物に 対して同様によく適応し得る。

「両性ポリマー」は、酸性基と塩基性基の両方を含んでいる分析物応答ポリマー （天然もしくは合成）を意味している。アミノ酸および蛋白質は酸性基（−ＣＯ ＯＨ）および塩基性基（ＮＲｔ）の両方を含んでいることからこれらは両性であ る。

「ポリマー−分析物複合体」　（”Ｃｎ）は、分析物応答ポリマーまたは両性ポ リマーが分析物と反応または相互作用した時化じる複合体を意味している。便利 さの目的で、本明細書で用いる「複合体」は、関与している特定の機構に関係な く分析物応答ポリマーと分析物とが反応する結果として生じる物質を表している 。

「伝播変化」は、分析物応答ポリマーが分析物と複合体形成するか或は反応する 結果としてこのポリマーの特性が変化することを意味しており、これは、このポ リマー単独のそれと比較して、１）音エネルギーまたは光エネルギーのどちらか を伝播させる能力が変化すること、或は２）ポリマー−分析物複合体の剛性、弾 性および／または粘度が変化すること、或は３）このポリマーの相組成が何らか の変化を生じることを伴う可能性がある。このポリマー−分析物複合体における 伝播変化は、その付着しているポリマー上か或はその中のミクロドメイン内に不 均一に分布しているか或はそのポリマーマトリックス上か或はその中に均一に分 布していてもよい。

「センサー」　（“Ｓ”）は、ポリマー被覆材料内の伝播変化を検出する装置を 表している。圧電振動体、水晶結晶微量天秤およびＱＣＭは、上記変化を検出す る基礎として圧電原理を利用している装置の名称である。加つるに、せん断水平 音響プレートモード（ｓｈｅａｒ　ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ　ａｃｏｕｓｔｉｃ　 ｐｌａｔｅ　ｍｏｄｅ）（Ｓｌ（ＡＰＭ）装置は、上記変化を検出する時に用い る代替装置である。複合体が示す光伝播特性変化の検出では導波管光学バイオセ ンサー（ＷＢ）を用いることができる。この変換用ポリマーは、ファイバーオプ ティックス（ｆｉｂｅｒ　ｏｐｔｉｃｓ）、干渉計、屈折計、マツハ・ツエンダ −（Ｍａｃｈ−Ｚｅｎｄｅ　ｒ）および光学分級装置を含む平板および繊維状（ 筒状）両方の導波管フォーマントに適用可能である。

ｒＱＣＭＪは、２個の励起電極の間に水晶が挟まれているＡＴもしくはＢＴカッ ト水晶が典型的に備わっている、せん断モードで作動するバルクな音波装置を表 している。

「インピーダンス分析」は、水晶結晶の表面を横切る電流を特定範囲の振動数に 渡り一定電圧で測定する如何なる分析技術も表している。

「複合体センサー」は、センサーの表面に分析物応答ポリマーフィルムを接着さ せたユニットを表している。

「検出システム」は、分析物応答ポリマー、センサーおよび試験媒体が備わって いるユニットを表している。

「有機体」は、本発明の方法で検出もしくは同定可能なこの有機体にユニークな 産物を代謝の結果として生じる如何なる有機体も包含させることを意味している 。しかしながら、本発明で最も有効な有機体は、水系培養物内で通常に増殖する 微生物、例えば細菌、菌・カビおよび組繊細胞などである。

「増殖調節因子」は、有機体の増殖を刺激するか或は遅らせる物質である。

「栄養素」は、有機体が代謝しそしてそれの増殖に必要とされる物質である。

言葉「ＸＡＭＡ−７（商標）」は、ペンタエリスリトール−トリス−（Ｂ−アジ リジニル）プロピオネートが入っている全ての純粋な化学組成物を表している。

ＸＡＭＡ−７（商標）は、Ｖｉｒｇｉｎｉａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、の登録 商標である。

架橋している分析物応答ポリマー（ＡＲＰ）は、分析物に感受性を示す部分を含 んでおり、そしてこれは、センサーの表面に付着して複合体センサーを形成する 。分析物が入っていると考えられる試験媒体のサンプルをこのセンサーに接触さ せ、そして存在している何らかの分析物がこのＡＲＰと相互作用または反応して ポリマー−分析物複合体を生じる。

この複合体内で生じる伝播変化を、複合体形成していないＡＲＰのそれと比較す ることで検出を行う。この変化を、圧電振動体が示す共振振動数の変化としてか 、或は光伝播特性の変化として、導波管光学センサーまたは他の光学検出装置で 明らかにする。

本発明は、生物系の監視で用いて、細胞代謝物、酵素反応産物、薬学組成物、工 業用化学品、或は連続的リアルタイム（動的）測定が必要とされる生物系の全て の産物を含む多様な物質の濃度変化を検出または測定するに特に有効である。本 発明はまた、本発明の方法で検出または同定可能な有機体に特徴的な産物を代謝 の結果として生じるか或は利用する全ての有機体を検出する能力を有している。

本発明は、水系培養物内で通常に増殖する有機体、例えば細菌、菌・カビおよび 組繊細胞などを検出する目的で利用可能である。しかしながら、これらの有機体 は無傷のままである必要はない。本発明は、崩壊させたか或は可溶化させた有機 体成分も同様に取り扱うことを意図している。

本発明の更に特定的な説明は、ｐＨが変化する結果として生じる分析物との反応 を生じさせるように設計したポリマーを利用した説明である。

このような分析物の例は■（“基である。有機体が産生ずる代謝有機酸または二 酸化炭素が増殖媒体を酸性にする場合、この分析物応答ポリマー上のプロトンレ セプタ基とその代謝産物とが反応する結果としてプロトン（分析物）が放出され 、それによって、このポリマーの音伝播特性が変化する。この媒体のｐＨがその 複合体の等電点に近付くにつれて、伝播変化が生じる。このようなＡＲＰ内の伝 播変化により圧電振動体の共振振動数が変化し、これを電子的に読み取ることに よって、培養物の代謝率および細胞増殖率を測定することができる。また、導波 管光学センサーまたは池の光学検出装置を用いることで、このポリマーとプロト ンとの反応を光伝播特性の変化として検出することができる。

また、このポリマーの設計を通して、ポリマー／分析物が示す相互作用の選択率 を調節することができる。例えば、抗体、ポリ核酸、レセプタ、キレート剤、細 胞接着因子およびリガンド結合分子などをこのポリマーに連結させることができ る。このポリマー上に存在させるこれらのレセプタ部位の組成を変化させること により、特定の分析物に高い選択性を示すようにするが或は数多くの分析物に対 して幅広（応答するように、本発明を仕上げることができる。

より特定的な説明を行うことにより、本発明の分析物選択性を明らかにする。良 好な例は、生物学的レセプタとして相補的抗体を含ませるように構築したＡＲＰ と複合体を形成させた抗原である。その結果として生じる抗原／抗体−ポリマー 複合体の架橋度が変化することで、ＡＲＰ内に伝播変化が誘発され、圧電バイオ センサーの共振振動数変化がもたらされる。別の例として、圧電振動体の共振振 動数を監視することで、媒体内の代謝産物量または代謝産物産生率を特定的に測 定する。光伝播または光学センサーを用いることでもまた測定を行うことができ る。

圧電振動体 圧電変換器を用い、これを液体の中に浸漬しながらそれの表面で質量、粘度およ び密度の小さい変化を検出することができることは、本技術分野でよく知られて いる（Ｗａｒｄ他、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）２４９　：１０００−１００ ７およびＦｒｙｅ他、Ａｐｐｌ、５ｐｅｃｔｒ。

５ｃｏｐ、Ｒｅｖ、（１９９１）２６＋７３）。加つるに、センサーとして用い る目的で、せん新表面音響、たわみおよびせん断水平音響プレートモード装置を 適当に改質することができる（ＬｕおよびＣｚａｎｄｅ　ｒｎａ編集、Ｅｌｓｅ ｖｉｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８４）３５１−３８８頁およびＧｕｉｌｂ ａｕｌｔ他、ＣＲＣＣｒ１ｔ、Ｒｅｖ。

Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、（１９８８）１９：１およびＷｏｈｌｔｊｅｎ他、ＡＣ３ Ｓｙｍｐ、Ｓｅｒ、（１９８９）４０３：１５７）、本発明に最も適用可能なも のは、水晶微量天秤（ＱＣＭ）と通常呼ばれているせん断モードＡＴ−カット水 晶振動子であり、これには、２個の金属励起電極の間に挟まれているＡＴ−カッ ト水晶結晶が備わっていて、これは、この水晶結晶の厚みを横切る定常せん断波 を生じる。このせん断波は、この水晶結晶表面で波腹を経験した後、伝播してこ の結晶表面上のフィルムの中に入り、ここで、このフィルムの厚みと、このフィ ルム内でそのせん断波伝播が示す性質により振動数応答が決定される。このＱＣ Ｍの振動数応答は、一般に、その振動子表面上の質量上昇に換算して翻訳サレ１ ．：、ノ１ｌＪＪ、ｌｉ、下記（７）Ｓａｕｅｒｂｒｅｙ関係（Ｓａｕｅｒｂｒ ｅｙＳＰｈｙｓ、（１９５９）１５５：２０６）（方程式１）［ここで、Δｆは 、水晶結晶が示す初期（共振）振動数（「）の測定振動数ノットであり、６ｍは 質量変化であり、Δは、２個の励起電極で限定される圧電活性領域であり、Ｐｑ は水晶の密度（２，６４８ｇ／ｃｍ−３）であり、モしてＵｑはせん断モジュラ ス（ＡＴ−カット水晶では２゜９４７ｘｌＯ”ダインｃｍ−２）である］に従い 、相当する共振振動数低下を引き起こす。

表面音波（ＳＡＷ）およびせん断水平音響プレートモード（ＳＨ−ＡＰＭ）装置 は、本発明に適用可能な代替圧電変換技術を代表するものである。これらの装置 には、圧電水晶基質表面上に並んでいるインターデジチーティラド（ｉｎｔｅｒ ｄｉｇｉ　ｔａｔｅｄ）微小電極が備わっている。これらは、横表面波の速度変 化から生じる、それらの表面における質量変化または剛性係数（ｓｔｉｆｆｎｅ ｓｓ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）に相関関係を示し得る振動数変化を表す。これ らの装置をまた粘度センサーとしても利用した。

光学センサー 種々の分析物の存在を検出する目的で光学バイオセンサーを用いることは通常に 行われており、そして本技術分野で数多くの例を見付は出すことができる。（Ｐ ｌａｃｅ他、０ｐｔｉｃａｌ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏ ｒ：ｒ連続表面における光学イムノアッセイの再考Ｊ、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、 ｌ、３２１−３５３）、１ＮｎｔＮ類の光学センサー装置には、平板導波管（Ｂ ｕｒｇｅｓｓ、Ｐｒｏｃ。

５ＰＩＥ−１ｎｔ、Ｓｏｃ、Ｏｐｔ、Ｅｎｇ、　、１３６８　（Ｃｈｅｍ、、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｆｉｂｅｒ　５ｅｎｓ、２）、２２４−９　 （１９９１）　）、光学繊維（Ｂｌｕｅｓｔｅｉｎ他［医学診断用ファイバーオ プティック−過性波センサーＪ　、ＴＩ　ＢＴＥＣＨ，８，１６１１６８（１９ ９０））　、金属蒸着プリズム（Ｋｏｏｙｍａｎ他「表面プラズモン共振イムノ センサーＪ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ。

Ａｃｔａ、　、２１３．３５−４５　（１９８８））および回折分級が含まれる 。光学センサーに備わっている検出表面は平板または筒状（繊維）であってもよ い。

一般に、光学バイオセンサーは、導波管表面における小さい屈折率変化に応答す る。このような屈折率変化は、この光学センサー表面上に固定した分析物−レセ プタに分析物が選択的に結合することがら生じる。

この導波管内を通る光が、この導波管の上に存在している試験媒体内に一過性の 波を誘発する。この一過性の波と分析物／レセプタ複合体とが相互作用する結果 として、この−過性波の強度が変化するか、或はこの導波管内を伝播する光の干 渉性が変化する。その生じる分析物／レセプタ複合体が示す蛍光、吸着または光 散乱特性が変化することで、−過性波の強度が変化し得る。このように、分析物 ／レセプタ複合体が生じるとその光強度が変化し得る。また、分析物／レセプタ の相互作用で、単一モードの導波管を通る光の相または干渉性が変化する可能性 があり、干渉計（例えばマツハ・ツエンダ−）を用いて、その分析物／レセプタ 相互作用の結果として生じる相または干渉性の変化を測定することができる。

分析物応答ポリマー類 分析物応答ポリマーマトリックスの製造で用いるポリマー類は、明らかな等電点 （ｐ　Ｉ）を示す、酸性および塩基性両方の官能性を含んでいるポリ両性電解質 である。合成および生物源両方のポリ両性電解質を用いることができ、そしてこ れらは、合成（例えばアクリル系など）または生物学的（例えばアミノ酸など） モノマー類の両方で出来ていてもよい。これらのポリ両性電解質の分子量は一般 に５００から５００．０００の範囲、より好適には１０００から１００，０００ の範囲である。これらのポリ両性電解質の架橋を行うことで、１分子から数ミク ロン、より好適には０．０５から５ミクロンの範囲の厚さを有しそして架橋密度 がポリマー１分子当たり１から２０個の架橋体である分析物応答ポリマーマトリ ックスを生じさせることによって、分析物に特異的なポリマーを作り上げる。

音もしくは光エネルギーを利用した感知装置の実施例で分析物応答ポリマー類と して用いる特定ポリマー類は、アクリル酸（ＡＡ）　、メタアクリル酸アルキル （ＲＭＡ）およびメタアクリル酸Ｎ、　Ｎ−ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥＭ Ａ）のコーもしくはターポリマー類である。構造的には、これらのポリマー類は 線状であるか、或はペンダント型または架橋している鎖を含んでいてもよい。米 国特許第４．７４９．７６２号（引用することによって本明細書に組み入れられ る）の中に概略を示す２段階方法を用いてこれらの製造を行う。第一段階で、ア クリル酸メチル（ＭＡ）　、ＲＭＡおよびＤＭＡＥＭＡがらプレポリマーを生じ させる。第二段階で、そのアクリル酸メチルセグメントの加水分解を選択的に制 御して行うことで、ペンダント型の酸性基または塩基性基を有する生成物を生じ させる。この２段階から成るポリ両性電解質製造方法を図１に説明する。グルー プトランスファー重合（ＧＴＰ）を含む他の合成方法もまた、両性ポリマー類の 製造に組み入れられる。

下記の理由で、直接的溶液重合よりも２段階乳化方法の方が好適である。アミン がアクリル酸モノマーにミハエル付加するのがより容易に防止されること。溶液 重合よりも、プレポリマーを乳化重合させる方が、有意に速いと共に調節が容易 であること。加つるに、供給量を調節する方法を用いると、このポリマー内に存 在しているモノマー単位の組成分布をずっと容易に調節することができること。

これらのポリマー類は、一般に、それらの等電点（ｐｉ）以外の全てのｐＨで水 に溶解性を示す。

この酸性基対塩基性基の比率によって等電点が決定され、従って、適当な比率で ポリマー類を合成することによって等電点を変化させることができる。本発明で 用いるモノマー類に好適な比率は、そのポリマーのｐＩが生理学的領域（ｐＨ＝ ６．２−８．０）内に入るような比率である。

これは、通常、アクリル酸とＤＭＡＥＭＡの場合、２．　０対０．　８の酸性基 対塩基性基比に相当している。（このｐｌは必ずその成分基のｐＫａｍに依存し ている）。この成分である酸性部分および塩基性部分が示すｐＫに影響を与え得 る中性の非イオンセグメントの性質および大きさによってもまた応答が影響を受 ける可能性がある。これらのポリマー類が示す溶解性は、それらのイオン含有量 の影響を大きく受ける。中性の炭化水素セグメントを有意量で有するポリマー類 が示す等電点における水溶性は、この中性セグメントを全く有していないか或は 有していても若干のみであるポリマー類よりも低い。出願者らは、多様なセグメ ント画分を有しておりそして異なるメタアクリル酸アルキルを含んでいる一連の ポリマー類を調製したが、これらは全て、生理学的範囲内にそれのｐＩを示す。

異なる溶解性および関連した特質を示す他のポリマー類のいくつかもまた適切で あると予測される。このようなポリマー類のいくつかを表Δの中に挙げる。

表へ 細菌増殖の検出に適したポリ両性電解質モル比＊ 組成 （１ｖ　Ｅｓｔ零　Ｃ，ｌＩ、Ｎから計算　Ｘ　Ｍ、Ｓｆ。

ＡＡ＝アクリル酸 ＲＭＡ＝メタアクリル酸アルキル ＤＭＡＥＭＡ＝メタアクリル酸Ｎ、　Ｎ−ジメチルアミノエチルＭＡ＝アクリル 酸メチル ＥＭＡ＝メタアクリル酸エチル ＨＭＡ＝メタアクリル酸ブチル ＭＭＡ−メタアクリル酸メチル Ｍｗ＝重量平均分子量 Ｍ　ｖ　＝粘度平均分子量 ＊　挙げたおおよそのモル比 このポリマーが示す、小さなｐＨ変化に対する感受性は、それの組成分布の狭さ に太き（依存している。これを図２に表す。反応媒体内で反応させるモノマーの 比率を調節することによって、狭い組成分布を生じさせる。この比率はそのポリ マー内で確認される比率ではな（、その成分であるモノマー類の反応性比によっ て決定される。均衡供給反応方法または欠乏供給反応方法のどちらかを用いてこ の比率を維持することができる。米国特許第４，７３５，８８７号および４，７ ４９，７６２号（これらは引用することによって本明細書に組み入れられる）の 中に記述されている均衡供給方法では、注意深く反応を調節する必要があるが、 ここでは、高分子量生成物の迅速生成がもたらされる。高分子量製品を迅速に生 じさせる必要がない場合、欠乏供給方法が好適である。この欠乏供給方法は、混 ぜものなしの媒体内で生じるバルク反応率よりもずっと低い割合で供給モノマー を添加することを伴っている。この反応は、本質的に、生きているフリーラジカ ル過程になり、この反応が生じるのは、生きているラジカルを含んでいるエマル ジョン粒子にモノマーが遭遇した時のみである。開始剤の添加を始めるに先立っ て、この水相を飽和させる（この溶液が半透明になる地点として決定）に充分な ［均衡モノ？−（ｂａｌａｎｃｅ　ｍｏｎｏｍｅｒ）Ｊを添加する。また、正確 な生成物組成を得るには、ＭＡを若干過剰量で維持する必要がある。アクリレー ト−メタアクリレート系では、全固有反応率と反応性比との間の関係が好適であ ることから、これの達成は容易である。生理学的ｐＨ範囲内にｐｌを示すポリマ ーを生じ得るモノマー組み合わせは数多く存在している。以下に挙げる下記の組 のモノマー類を種々に組み合わせることで両性ポリマー類の製造を行うことがで きる。

Ａ、　酸性モノマー類　−新規な物質を生じさせるための、水素イオンをもたら し得る分子またはイオン性物質。その例はアクリル酸、メタアクリル酸、並びに 燐酸およびスルフィン酸基を含んでいるモノマー類である。

Ｂ、　塩基性七ツマー類　−新規な化合物を生じさせるための、水素イオンと結 合し得る分子またはイオン性物質。その例はＤＭＡＥＭＡ。

メタアクリル酸ジエチルアミノエチル、メタアクリル酸ｔ−ブチルアミノエチル 、メタアクリル酸モルホリノエチル、メタアクリル酸ピペリジノエチルである。

Ｃ１中性モノマー類　−酸性または塩基性のどちらでもない分子またはイオン性 物質。その例はメタアクリル酸アルキル（メチルＭＡ、エチルＭＡ、ブチルＭＡ ）、メタアクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタアクリル酸ヒドロキシ プロピル、ビニルピロリドン、酢酸ビニル（加水分解を行うとビニルアルコール になる）、アクリルアミド類、ビニルエーテル類、スチレンである。（幅広く異 なる反応性比を示すコモノマー類を反応させる場合、非常に注意深く反応を調整 する必要があり、従って好適でない）。

表Ａおよび上に挙げた例に加えて、生理学的範囲内にｐｉを示す如何なる水溶性 両性ポリマーも、ｐＨに敏感性を示す分析物応答ポリマーとして有効であり得る 。その特定例には下記が含まれる：１）ジメチルアミノエタノールおよび同様な 化合物とメチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー類とを反応させるこ とによって生じるポリマー類。

ＰＭＶＥ　ＤＭＡＥ　ポリ両性電解質 ２）ビニルピリジンとアクリル酸メチルのコポリマー類の加水分解物任意に、こ の分析物応答ポリマーは、選択的に分析物と結合し得る分析物レセプタ剤（ａｎ ａｌｙｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｒｅａｇｅｎｔ）を含んでいてもよい。これら のレセプタ剤を化学的にこのポリマー上のペンダント型官能基（例えばヒドロキ シル、カルボキシル、アミ八チオール、アルデヒド、無水物、イミドおよびエポ キシ）に連結させるか、或はこれらをこのポリマーマトリックス内に捕捉させる ことによってその分析物応答層内に固定してもよい。また、ポリマーまたはポリ マーマトリックス成分との吸着相互作用によってこれらの分析物レセプタ剤を固 定してもよい。これにより、この分析物に反応性を示す中間基が生じる。アンセ イでは、この中間のカップリング基と分析物とが反応することによって、この分 析物がその活性化されたポリマーに付着する。

幅広い多様な分析物レセプタ剤が考えられる。これらには、分析物に特異的な結 合対の一員が含まれる。特異的な結合対の一員は、免疫もしくは非免疫型のもの であってもよい。免疫型のものには、ポリクローナル、モノクローナル、或はＦ ａｂ型の如き免疫反応性フラグメントであるか否かに拘らず、抗体が含まれ、こ れらは、抗体のＦｃ部分が含まれていないフラグメント（例えばＦａｂＳＦａｂ ’　およびｆ　（ａｂ’　）　！フラグメントか、或は重鎮に連結している二硫 化した結合が還元的に開裂することによって生じるいわゆる「半分子」フラグメ ント）として定義される。この特異的結合対の抗原員が免疫原性を示さない場合 （例えばハプテンである場合）、これを共有結合的に担体蛋白質に連結させて、 免疫原性を示すようすることができる。分析物レセプタ剤としてはまたポリ核酸 およびレセプタ類も考えられる。

非免疫型の結合対置には、２つの成分が互いに自然親和力を共有しているが抗体 でない系が含まれる。例となる非免疫型分析物レセプタ剤には、アビジン、スト レプトアビジン、相補的プローブ核酸、結合蛋白質、キレート剤、細胞接着因子 およびリガンド結合蛋白質などが含まれる。

グルタルアルデヒド、臭化シアノゲン、ヒドラジン、ビスエポキシラン、ジビニ ルスルホン、エビクロロヒドリン、過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、ジア ゾニウム塩、カルボニルジイミダゾール、カルポジミド類、Ｎ−ヒドロキシスク シニミドおよびトシレート類を伴う、分析物レセプタ剤を付着させるに適した連 結化学は、本技術で広範に記述されている。これらの化学および操作に関する論 評は、［アフィニティークロマトグラフィーおよび関連技術で用いる実用ガイド Ｊ、Ｒｅａｃｔｉｆｓ　ＩＢＦ−８ｏｃｉｅｔｅ　Ｃｈｉｍｉｑｕｅ　Ｐｏ１ｎ ｔｅｔ−Ｃ；１ｒａｒｄ、Ｖｉ　Ｉ　Ｉｅｎｅｕｖｅ−Ｌａ−Ｇａｒｅｎｎｅ− Ｆｒａｎｃｅの中に与えられている。カルボニルジイミダゾールを用いたぺンダ ント型ヒドロキシ基の活性化に関する特定例はＪ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９ ７９）２５４　：　２５７２およびＪ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ。

（１９８１）２１９　：　３５３−３６１の中に報告されている。水溶性カルボ ジイミドを用いたペンダント型カルボン酸基の活性化はＢｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、（ １９８１）１９９：２９７−４１９の中に記述されている。

Ｎ−ヒドロキシスクシニミドを用いたカルボン酸の活性化はＢｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　（１９７２）１１１：２２９１およびＢｉｏｐｈｙｓ。

Δｃｔａ　（１９８１）６７０：１６３の巾に記述されている。

これらの操作で活性化され得る典型的な水溶性ポリマー類には、ポリメタアクリ ル酸およびアクリル酸ヒドロキシエチル、メチルビニルエーテルコポリマー類、 ポリビニルアルコール類およびコポリマー類、並びに上に記述したポリ両性電解 質が含まれ得る。他の水溶性ポリマー類も使用可能である。

ポリマー架橋 カルボン酸部分が反応性を示す部位であるいくつかの機構を用いて、本発明の分 析物応答ポリマー類の架橋を生じさせることができる。ペンダント型のカルボン 酸基と多官能性アジリジン類とを反応させることによって架橋を生じさせるか、 或はペンダント型のカルボン酸基を多官能性エポキシド類と反応させることを通 してこれらの架橋を生じさせることができる。この反応は、典型的には、開環機 構がアジリジン類の反応のそれと類似している１、４−ブタンジオールジグリン ジルエーテルの架橋で表される。また、数個のカルボン酸基とプロピレンイミン もしくはエチレンイミンとを反応させることによってその分析物応答ポリマー類 の上にペンダント型の第一級アミン基を生じさせることができ、これは、ゼラチ ンの架橋を生じさせる目的で写真システムで通常に用いられている数多くの架橋 剤、例えばアルデヒド類、カルボジイミド類などと反応することによって、これ らのポリマー類の架橋を生じさせる。酸性または第一級アミン官能性のどちらか を通してまた本発明の分析物応答ポリマー類の架橋をも生じさせ得る、ゼラチン の架橋を生じさせる目的で用いられている架橋剤および架橋反応の多くは、Ｐｏ ｕｒａｄｉｅｒおよびＢｕｒｎｅｓｓ著ｒＴｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｐｈｏ ｔｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐｒｏｃｅｓｓｊ、第３版、Ｃ，Ｅ、に、Ｍｅｅｓ編集、 ５４−６０頁（引用することによって本明細書に組み入れられる）の中に記述さ れている。あまり通常には用いられていないが同様に適用可能な方法は、金属イ オン配位およびイオン性原子団の反応によるイオン架橋を伴う方法、並びにアジ リジン類の反応およびオレフィン類のミハエル付加を伴う多様な種類の共有結合 を伴う方法である。本発明の分析物応答ポリマー類では、多官能性アジリジン類 でペンダント型カルボン酸基の架橋を生じさせるのが最も好適である。

増殖用培地 本発明で用いる基本的な増殖用培地には、分析すべき特定型の細胞が発酵作用で 選択する栄養材料を含める。この培地単独を用いた場合、上に記述した種類の特 定の分析物応答ポリマー（ＡＲＰ）はこれに反応性を示さない。任意に、抗生物 質、アミノ酸、ビタミン類、塩類または脂質などの如き増殖調節因子をこの培地 に補充してもよい。ホルモン類などの如き増殖調節因子を個別にか或は組み合わ せて用いることで、特定の細胞型に高い選択性を示すか或は選択性を低くして幅 広いスペクトルの細胞に応答するように、この培地を仕上げることができる。こ の栄養培地の組成により、本発明を柔軟に多様な分析要求に一致させることがで きる。増殖用培地のための成分はとりわけＤｉｒｃｏ　（Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉ ｃｈｉｇａｎ）およびＢＢＬ（Ｃｏｃｌｏｅｙｓｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ）から商業的に入手可能である。本発明を実施するに必要とさ れる増殖用培地に関する詳細な説明はＥｂｅｒｓｏｌｅ他の国際特許出願番号Ｗ Ｏ９１１０１３８１（引用することによって本明細書に組み入れられる）の中に 再考されている。

試験を行う前か或は殺菌を行った後、必要に応じて、細胞培養物の生理学的要求 およびポリマーの伝播安定性に適合した値になるようにこの栄養培地のｐＨを調 整した。

細胞１度測定 Ｐｅｔｒｏｆ　ｆ−１１ａｕｓｅｒ計数チヤンバを用い、一定の実験における細 １１Ｃｑ　ａ　Ｉｆを顕微鏡で見積もった。最初に、０．１冗アジ化ナトリウム 溶液を添加して、細胞培養物の増殖を抑制した。ある場合には、ＣＯｍｐａｑ　 ３８６／２５コンピユーターを装備したオリンパスＱ２画像分析装置を用いて、 Ｐｅｔｒｏｆ　ｆ−Ｈａｕｓｅｒ計数チャンバ内で細胞密度を自動旧敵した。

圧電型バイオセンサー装置およびシステム上に概略を示した条件下で単一の圧電 振動体装置を用いるか、或は温度に関連した不安定さを補う第二水晶結晶に対す る参照を行った圧電振動体装置を用いて、細胞の検出および同定、抗生物質応答 研究および増殖率測定を行うことができる。上記装置はＥｂｅｒｓｏｌｅ他の国 際特許出願番号Ｗ０　９１１０１３８１の中に記述されており、これは引用する ことによって本明細書に組み入れられる。

インピーダンス分析の利用 ＱＣＭの表面とポリマーとの相互作用は現実に機械的であり、これは、インピー ダンス分析で分析可能である。インピーダンス分析では、その水晶結晶を横切る 電流の測定を特定範囲の振動数に渡り一定電圧で行う。

インピーダンスモードで１００１００）１ｚ−４０の振動数範囲に渡って測定実 施が可能なＨａｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　４１９４Ａ　１ｍｐｅｄａｎｃｅ ／Ｇａ１ｎ−Ｐｈａｓｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＨＰＩＢ）を用いてインピーダン ス分析を実施した。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈパソコンに連係させたＩ−Ｉ　Ｐ　Ｉ　 Ｂを用いてデータ集積を行った。インピーダンス分析は本分野の技術者によ（知 られた技術であり、そしてこれの概略は、Ｍｕ　ｒ　ａｍａ　ｔ　ｓ　ｕ他、Ａ ｎａ　１．Ｃｈｅｍ、　、６０　：　２１４２　（１９８８）（引用することに よって本明細書に組み入れられる）の中に示さ音センサーに対する代替検出シス テムは、ポリマーフィルムが示す屈折率変化を検出することができる光学装置で ある。本発明では、表面の上に固定した分析物応答ポリマーが示す実効屈折率（ ｎ−＋υの小さな変化を分析物−レセプタ結合が作り出す。屈折率測定の最も好 適な方法は光学繊維と単一モードマツハ・ツエンダ−干渉計を用いる方法であり 、ここでは、導いた光を分離させて２つの平行なアームの中に入れる。この干渉 計の１つのアームには分析物レセプタがコートされており、もう一方のアームは 保護されていて基準路を与えている。その結果として、この導波管の中に導かれ る光は２つのビームに分離される。分析物結合が生じると、屈折率は、そのレセ プタが被覆されているアームの表面で変化するが、第二ビーム（基準アーム）の 実効屈折率は変化しない。これらの干渉計アーム内の光を再び一緒にすると、構 築的もしくは崩壊的干渉が生じ得る。もしこの干渉計のアームの長さが同じであ るとすると（Ｌ１＝Ｌ２＝Ｌ）、分析物が結合する結果として生じる光伝播の差 （Δφ）は、数学的に方程式２ で記述可能であり、ここで、λは入射光の波長であり、Ｌは路長であり、そして ｎｌおよびｎ２は、それぞれ、基準および試験アームの屈折率である。

この相差は、この導波管レッグ（ｌｅｇｓ）の実効屈折率差（ｎ２−ｎｌ）に正 比例している。この分析物が結合する度合はそのｎ−＋＋”（ｎ２−ｎｌ）に影 響を与えることから、この干渉計の出力強度は、分析物結合が誘発する屈折の結 果として生じる屈折率変化に関係し得る。分析物応答ポリマーフィルムが示す屈 折率変化を測定する装置が得られたならば、分析物が結合する出来事を直接検出 することができると共に酵素が増幅する分析物結合を検出することができる多様 な変換方法を利用することができるようになる。

実施例 以下の非制限的実施例は、本発明の基本的原理およびユニークな利点を説明する ものである。

実施例１ 多官能性アジリジン類を用いたポリ両性電解質の架橋方法およびｐＨ制御染料結 合の実証 ０．１５４規定の（１−１−１）ＡＡ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡポリ両性電解質（ ＩＣ＋で酸性にしてｐＨ＝６．０にした２０％メタノール／水内のｐｌ＝７．０ ）ストック溶液と１．４０５規定のＸａｍａ−７（商標）ストック溶液を混合す ることにより、ポリマー酸対アジリジンの比゛　が１＝１．５：１．１０・１． ５０：１および１００：１であるポリ両性電解質と多官能性アジリジン架橋剤（ Ｘａｍａ−７（商標））の試験溶液を調製した。これらのストック溶液を混合す るに先立って、このアジリジンとポリマー酸とが早期に反応するのを防止する目 的で、このポリマー溶液のｐＨを１１．０以上にシフトさせるに充分な量で水酸 化アンモニウムをこのポリマー溶液に加えた。次に、この混合物を１０００．２ ０００および４０００ｒｐｍのロータースピードでガラスプレートと圧電型結晶 の上にスピンコードした（ｓｐｉｎ　ｃｏａｔｅｄ）。次に、このＦＪｊｉ覆し た材料を１００℃の循環空気オーブンの中に５分間入れることで、アンモニアを 追い出すと共に、この組成物の硬化を行った。

これらのプレートを水の中で洗浄した後、物理的一体性に関する試験を行った。

１：１および５．１混合物から生じさせたコーテイング物は堅（、本質的に膨潤 しなかった。１０：１および５０：１の組成物は、不溶であるが膨潤するゲル状 コーテイング物を与え、これは支持体に良好な接着性を示すと共に、良好な物理 的一体性および強健さを示した。

１００　：　１ゲルの一体性は劣っており、その支持体から容易に剥がれた。

従って、さらなる試験では１０：１および５０：１組成物を選択した。

エリプソメトリ−（ｅｌ　ｉｐｓｏｍｅｔｒｙ）で測定した５０　：　１：ｆｆ −ティング物の厚さは、４０００．２０００および１１０００ｒｐで行ったスピ ンキャスティング物に関してそれぞれ０．２μｍ、０．４μｍおよび０８μｍで あった。被覆した組成吻合々の上に、各々が同じアニオン性青色染料を含んでい る一連の干渉液を置くことにより、各フィルム表面上のチャージ（ｃｈａｒｇｅ ）を実証した。これらの組成物を３０分間装いた後、これらの組成物を中性水で 洗浄することにより、付着していないか或は吸収されていない染料を除去した。

ｐＫ＜７．Ｑを示す緩衝液に相当する全ての染料斑点は容易に検出可能なままで あるが、ｐＫ＞７．０を示す緩ｌｉ液に相当する全ての斑点はそのコーテイング 物から直ちに洗い流された。これは、酸性緩衝液と同じ（塩基性緩衝液もこれら の組成物の膨潤をもたらすといった事実にも拘らず生じた。このことは、このポ リ両性電解質コーテイング物がｐＨ制御染料結合特質を有することを示している 。

上に記述した如（調製した被覆圧電型結晶を微生物および酵素応答に関して試験 し、そしてこれらを、圧電型手段を用いた検出に関する下記の実施例で用いた。

実施例２ ポリマー調製および固定化 Ｆｏｓｓの米国特許第４，７４９，７６２号に概略が示されている操作に従い、 下記の操作を用いて、図３のポリマー（１）を合成した。窒素雰四寛下、乳化剤 溶液（１０００ｍＬの蒸留水、ＬｏｇのＴｒ　ｉ　ｔ。

ｎＱＳ−３０界面活性剤（Ｒｏｈｍ　＆　Ｉｆａａｓ、Ｐｈｉ　１ａｄｅＩ　ｐ ｈ　ｉ　ａ、ＰＡ）および１．０　ｇのＮ、Ｎ−ツメチルアミノエタノール）を ６０℃に加熱した。次に、アクリル酸メチルが５３ｍＬ１メタアクリル酸メチル が５３ｍＬモしてメタアクリル酸Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノエチルが９８ｍＬ入っ ている混合物を４ｍＬ／分で加えた。この溶液が飽和になった時点で（この溶液 が半透明になり始める時点で飽和が明らかになる）、このモノマーの添加を継続 しながら同時に、開始剤溶液（２５０ｍＬの蒸留水の中に５ｇの過硫酸アンモニ ウムが入っている）を０゜７５ｍＬ／分で加えた。この開始剤溶液を加えると直 ちに重合が始まり、これは温度が上昇することで立証された。このモノマーを全 部加えた後、この混合物を更に１５分間撹拌し、そして続いてこれを２Ｌのポリ エチレン製ビーカーの中に注ぎ込んだ。この生成物が凝固するまでアセトンを加 えた。次に、この生成物を濾過で集め、水で洗浄することにより、残存している 乳化剤と他の不純物を除去した。このポリマーを、高ぜん断ブレード撹拌機が備 わっているフラスコに移し、エタノールを８００ｍＬ加えた後、この混合物を８ ０℃にまで加熱した。このポリマーが溶解した後、１００ｍＬの蒸留水の中に３ ２．６５ｇのＫ　ＯＨが入っている溶液を滴下１看で加えることにより、そのメ タアクリル酸メチルの選択的加水分解を起こさせることでアクリル酸塩を生じさ せた。この段階を行っている間にポリマーが沈澱を生じないようにその滴下速度 を調節した。この滴下が終了した後、この混合物を８０℃で更に３０分間撹拌し た。この生成物を等電沈澱で単離し精製した。ポリマーのエタノール溶液を大過 剰の蒸留水の中に移した後、塩酸を等置棚えることでこの溶液のｐＨをそのポリ マーの等電点（ｐｌ）にシフトさせることによって、上記を行った。次に、遠心 分離でこのポリマーを単離し、ｐＩになるように緩衝させた水で洗浄し、そして これを、このｐＩより高いが或は低いｐＨを示す、エタノールが少量入っている 水の中に再び溶解させた。

もしこのｐｌでこのポリマーを単離して乾燥させるとそれの再溶解が遅（なると 共に困難になることから、このような若干酸性か或は塩基性を示す溶液の中でこ のポリマーを貯蔵した。

へＴ−カット水晶結晶の各側面を、厚さが２０００人の金電極で被覆した。接着 の目的で、この水晶結晶の中心部に厚さが５００人のチタン下層を用いた。この 結晶の１つの側面に、架橋用ポリマー溶液を１１００Ｑｒｐで４０秒間スピンコ ードした。このようにして生じる複合体である振動子を空気中で乾燥させた後、 循環空気オーブン中１００℃で１０分間加熱した。

実施例３ ポリ両性電解質架橋 図３に示した操作に従い、多官能性アジリジンを用いてポリ両性電解質（１）の フィルム（図３）の架橋を行った。トリアクリル酸ペンタエリスリトール（２） にエチレンイミンをミハエル例加させることによって、架橋剤であるペンタエリ スリトール−トリス−（Ｂ−アジリジニル）プロピオネート（３）（Ｘａｍａ− ７（商ｔＦ［））の調製を行った。次に、ポリ両性電解質（１）が５．４４％入 っておりそして早期の架橋を防止する目的で水酸化アンモニウムで塩基性にした 組成物（３）が必要量入っている溶液を支持体の上にスピンコードすることによ り、ポリ両性電解質（１）の架橋フィルムを調製した。次に、これらのフィルム を穏やかに１００℃で５分間加熱することにより、これらのフィルムを適切に架 橋させた。一般に（１）：　（３）の当量比を５０：１にすると最良の結果が得 られることが確認された。この加熱段階でＮＩＩ、が除去され、それによって、 このコーテイング物はほどよ（酸性を示すようになり、従って、この架橋剤が有 するアジリジン基とポリ両性電解質（１）が有する一ＣＯ２Ｈ基の数個との間の プロトン補助開環反応を通して、このポリマーは架橋を生じることができた。ス ピンコードの回転速度を用いてこのフィルムの厚さを調節したが、この回転速度 の範囲は１１０００−４０ＱＱｒｐであった。５ｌｏａｎ　Ｄｅｋｔａｔ　ＩＩ Ａスチラスブロフィロメーター（ｓｔｙｌｕｓ　ｐｒｏｆｉｌｏｍｅｔｅｒ）を 用いてフィルム厚を個々に測定した。

実施例４ ｐＨ変化に対する圧電型ＡＲＰ−ポリマー応答この実施例では、試験媒体のｐＨ が変化するとその架橋させたＡＲＰの特性が変化することを示す。その結果とし て生じる変化は、圧電振動体応答の変化によってもたらされるＡＲＰの厚さ、接 触角および粘弾性特性の変化として検出可能である。振動数測定または網目構造 分析とＢｃｃｋｍａｎ　Ｍｏｄｅ　ｌ　０３２ｐＨメーターを用いて同時にｐＩ Ｉの測定を行った。このｐＨメーターのアナログ出力を、ＩＩｒ’ｌ１３に連係 させた１０／Ｔｅｃｈアナログ−デジタルコンバーターに連結することで、ｐＨ の自動測定を可能にした。水滴を１０ｇＬ用い、Ｒａｍｅ−Ｈａ　ｒｔ接触角ゴ ニオメータ−により不動接触角測定（ｓｅｓｓｉｌｅ　ｃ。

ｎｔａｃｔ　ａｎｇｌｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）を実施した。

相測定干渉顕微鏡（ＰＭＩＭ）（Ｚｙｇｏ、Ｉｎｃ、）を用い水溶液内でフィル ム厚を直接測定した。実施例３に記述した操作に従って水晶基質上に蒸着させた 金フィルムの上に架橋フィルムを被覆した後、ガラスカバースリップで保持され いる水の薄フィルム（約１ｍｍ）の下に浸漬した。このサンプルとカバースリッ プとの間の水を、所望ｐＨ値に調整した水で置き換えることで、その溶液のｐ　 Ｉ−１を変化させた。電子ビームで蒸発させている間に水晶結晶微量天秤が示す 振動数シフトで立証した厚さを有する金フィルムを用いて、目盛り付は用の基準 高差を牟備した。

この実施例では、１：ｌ：Ｉ　ＡΔ−ＭＭＡ−ＤＭＡＥＭＡ架橋ＡＲＰを」二に 記述した如く固定した、ＱＣＭを覆っている試験ミリュー（ｍｉｌｅｕ）のｐＨ を、０．００１ＮのＩＩｃＩで酸性にして９．０から３゜０のｐＨ範囲にした。

分析したフィルムの厚さはそれぞれ０．８μｍおよび０．　４μｍであった。こ の振動子に暴露させる溶液のｐＨを変化させると、幅広帯増幅器のフィードバッ クループを用いてこの複合体振動子に関して測定した直列共振振動数（ｆ　ｓ） 　、並びにインピーダンス分析で測定した最大導電率の振動率（ｆｏゆ１．）が 有意に変化することが確認された。（全体を通してこの「Ｓとｆ。、、１．との 間の差は無視できる程であるとみなす）。この媒体のｐＨを次第にｐｏ＝３．０ から上昇させると、ｐＨ＝４．８の所で急激な振動数低下が観察された（図４ａ および４ｂ）。この振動数シフトの大きさはポリマーフィルムの厚みと共に増大 し、厚みが０．８＋＋ｍであるポリマーフィルムの場合例外的に大きくノットし て−６０００１（ｚに近付いた。この共振振動数はｐ　Ｈ＝　５５の所で若干の 上昇を示した後、ｐＨ＞５．１の所で急激に上昇した。

等層領域の中心であるｐＨ＝５．５の所におけるこのような上昇は、より薄いフ ィルム（０，４μｍ）の場合もっと明らかであり、これはまた、振動数変化を基 準にしてより幅広い等層領域を示した。これらのデータにより、その観察された 振動数変化は、このポリマーのイオン形態と等電形聾との間の転移に伴う変化に 関係していることが強力に示された。

加つるに、厚さが０．４１１ｍのフィルムおよび０．８μｍのフィルムに関する 振動数変化は、質量が約２０ａｇ　ｃｍ−”および９０ｕｇ　ｃｍ−”変化した ことに相当しており、これは、これらのフィルムをスピンコードした後の全面質 量（ｔｏｔａｌ　ａｒｅａｌ　ｍａｓｓ）（６ｍ　／　Ａ　）よりも本質的に大 きい。

実施例５ ＡＲＰ−ＯＣＭによるウレアーゼ活性の圧電型測定架橋ポリマー１（図３）で被 覆した振動子を２ｍＬの緩衝溶液の中にｆｆ１ｆｆｉして、尿素のウレアーゼ触 媒加水分解によつて銹発されるｐＩＩ変化に対する応答を測定した。１．０ｍＭ のＮ　ａ　ＯＨを１．４８ｍＬ、０゜２ｍＭのＥＤＴＡを８ｍＬ、そして燐酸で ｐＨを５．５に調整した脱イオン水を１００ｍＬ用いて、上記緩衝溶液を調製し た。０．２５Ｍの尿素（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、　、ＭＯ ）を入れた上記緩衝溶液の中に上記振動子を浸漬しながらこれにウレアーゼ溶液 （１００ｍＬの脱イオン水の中に１ｍｇのウレアーゼ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、　Ｓ　 ｔ。

Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、ＭＯ）が入っている）を既知量で加えることによって、ウレア ーゼ濃度に依存したｐｌ！変化の測定を実施した。それとは逆に、ウレアーゼが ０．ｉｇ／ｍＬ入っている上記緩衝溶液に尿素溶液を既知量で加えることにより 、尿素依存応答を測定した。

ウレアーゼを触媒として用いて尿素の加水分解が生じる結果としてＮ１（３が生 成し、それに相当してその媒体のｐ　ｌ−１が上昇した。従って、ウレアーゼが 入っている燐酸塩緩衝溶液（初期ｐＨ＝４．０）に尿素を添加すると、短期間後 に単調な振動数低下が観察された後、元の振動数に到達するまで単調な上昇が続 く（図５）。両方の枝分かれにおける振動数変化の度合は本質的に同じであった 。この振動数が最小値に到達するまでの時間は、ウレアーゼ１度を低くするにつ れてより高い値にシフトした。このデータは、この複合体振動子の振動数がｐＨ 依存であることに一致している、即ちウレアーゼ触媒加水分解が生じるにつれて その媒体のｐＨが上昇し、その結果として、このポリマー／分析物複合体がそれ の等電形態に変化し、ここで、その振動数が低下する。このｐＨがそのｐｌを越 えると、この振動数は再び上昇した。

実施例６ ＡＲｒ’−ＯＣＭによる微生物代謝測定微生物代謝測定用の水系増殖用培地（ｐ Ｈ＝７．４）には、プロテアーゼペプトンＮｏ、３　（Ｄｉ　ｒｃｏ）が１．０ ％重重量体積、牛肉抽出液（１３ａｃｔｏ）が０１％、ブロモクレゾールパープ ルが０．００２％、モしてＮａＣｌが０５％入っていた。必要に応じてこの基本 培地に炭水化物（１％重重量体ｍ）を補充した後、０．　２１１ｍのＣｏｒｎｉ ｎｇ殺菌膜を通して濾過を行った。Δｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ＣｕＩｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

ＭＤ）から人手した基準味を用いて、圧電型センサーが細菌代謝に対して示す応 答を調査した。最初に、３％トリブチカーゼソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ 　ｓｏｙ　ｂｒｏｔｈ）（ＴＳＩ３）培地内で大腸菌（ＡＴＣＣ取得番号２５９ ２２）を３７℃で一晩増殖させて、密度を１ｍＬ当たり約１０’ｌｉ＋の細胞に した。使用直前に、これらの細胞の希釈を行って、炭水化物が入っていないＤｉ ｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ　Ｐｕｒｐｌｅブロス（ＢＰＢ）２０部中１部から成る最少 培地を生じさせた。光顕微鏡を用い、この細胞密度を血球計数器内で顕微鏡測定 した。次に、この希釈培養物の一部を圧電型センサー実験用の出発接種物として 用いた。

イノシトールが入っているか或は３種の異なる炭水化物補充物の１種が入ってい るＴＳＢ培地に、大腸菌の個別培養物を４つ接種した（１つは対照であり、そし て３つは実験用である）。この対照培養物にイノシトールを入れ（１％重Ｊｌ／ 体積）、そして３つの実験用培養物にラクトース、マンニトールまたはアラビノ ースを１％重員／体積の濃度で入れた。

最初に、このＱＣＭ増殖チャンバから取り出した一定分量に０．１％アジ化ナト リウム溶液を添加することで細胞増殖を抑制することにより、この中の細胞数を 入手した。これらのサンプルを渦巻き撹拌し、そしてＰｅｔｒｏｆｆ　Ｈａｕｓ ｅｒ計数チャンバを用い、目で数を数えた。

ある場合には、Ｃｏｍｐａｑ　３８６／２５コンピユーターを装備したＯｌｙｍ ｐｕｓ　Ｑ２画像分析装置を用いて細胞濃度を自動計数した。

微生物が示す代謝活性によりその増殖培地のｐＨが変化するように見えた。これ は恐らくは、炭水化物が代謝物、例えば乳酸、こはく酸、酢酸または池の酸性分 子に変化する結果として生じたものであろう。複合体振動子の被覆側を炭水化物 が入っている増殖用培地の中に浸漬することで、細胞代謝率の測定を行った。誘 導期間（このポリマーフィルムが示す等電顕域の上方末端であるｐＨにその培地 が到達するに必要である）を置いた後、最初の培地ｐＨ低下が見られた。これは 、等電相が生じることが原因でＱＣＭの振動数が次第に低下することに相当して いた（図６）。次に、この等電顕域を通ってその培地のｐＨが低下するにつれて 、その初期振動数に比較して次第に振動数が上昇することが観察された。

この振動数の最低値に到達する時間は、代謝および増殖率に反比例している。

ポリマーの等電点を通ってｐＩＩがシフトすることに相当する屈折率変化の測定 この実施例の目的は、このポリマーの等電点（ｐＩ）を通ってその回りのｐＨが シフトする時ΔＲ＋’に関して観察される伝播変化に相関関係を示す有意な屈折 率ソフトが生じることを立証することであった。この応答を用いると、ゲルの中 で生じるｐ　ｌ−１に敏感な変化を光学方法、例えば屈折計などで監視すること ができるか、或は並列導波管の間で一過性力、ブリングの変化を監視することが できるか、或はマツハ・ツエンダ−型千渉ｎ１を用いて相シフトを監視すること ができる。

名目上１−１−１のΔＡ−ＭＭＡ−ＤＭΔＥＭΔポリ両性電解質の精製を行うに おいて、このポリマーの等電点のｐｌｌになるようにｐｌｌを調整することによ ってこれを水中で等電沈澱させることにより、これの精製を行った。ｐＨ６、４ に緩衝させた水でその沈澱させたポリマーを洗浄し、遠心分離にかけ、デカンテ ーションを行った後、ｐＨを〈４，０にシフトさせるに充分な量でＨＣＩが入っ ているエタノールの中に再溶解させた。この溶液の固体含有量（Ｓ　Ｐ）は、溶 液１ｇ当たり０．１０７５ｇのポリマーであった（溶液１ｇ当たり０．３２７ｍ ｅｑの酸）。

５　Ｑ　ｍ　Ｌのアセトンの中に０．７１２ｇのＸａｍａ−７（商標）アジリジ ン架橋剤（１４２，３ｇ／ｅｑ）を溶解させることによって、Ｘａｍａ−７（商 標）の０．ＩＮ溶液（ＳＸ）を調製した。

数種のｐｌＴ　（６，Ｏ１６，５，７０，７，５および８０）で一連の１００ｍ Ｍ燐酸塩緩衝溶液を調製したが、このｐＨ範囲は、この両性ポリマーマトリック スが示す等電点をまたぐように選択した（Ｉｌａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ）。

このポリ両性電解質のストック溶液（Ｓ　ｒ’）の１．０ｍＬを、早期の反応を 防止する目的で、州を＞１０にシフトさせるに充分な量のＮＨ４０１１と混合し た後、架橋剤溶液（ＳＸ）を０．０６５３ｍＬ加えることによって、理論架橋密 度がアジリグ２１個当たり５０個の酸単位である架橋性ポリマー溶液（Ｃ）を調 製した。

次に、このポリマー溶液を直接、厚さが１００ミクロンの計量ロッドを用いて、 Ｚｔｅｓｓ　Ａｂｂｙ屈折計のプリズムの上に塗布した後、乾燥させた。この乾 燥厚は名目上１ミクロンであった。ドライダウン（ｄ　ｒｙ−ｄｏｗｎ）後、強 制エアーブロアーを用いてこれらのフィルムを穏やかに５分間加熱した。ドライ ダウンおよび次の加熱を行っている間にアンモニアが排除され、そしてこのポリ マー上に存在しているペンダント型のカルボン酸基とアジリジン単位とが反応す ることによってこのポリマーが若干架橋した。

この乾燥させたポリマーが示す屈折率は１．５０１８であり、これは典型的なア クリル系ポリマーに一致している。上に記述した如く調製した燐酸塩緩衝溶液を このポリマーフィルムに接触させて位置させ、平衡に到達させた。これに続いて 屈折率測定を行った。この測定が終了した時点で、このポリマーゲルを濃水酸化 アンモニウムに浸漬した後、その崩壊したゲルをそのプリズムから拭き取ること で、このポリマーゲルを除去することができた。これにより、新しいポリマーフ ィルムを用いたさらなる測定でこのプリズムを再び用いることができた。次に、 さらなるポリマーをそのプリズムの上に再キャストした。

この得られる組成物の屈折率測定を行うと、通常、２つの帯が存在していること が示された。１つはこのポリマーゲルに相当しており、そしてもう１つは、この ポリマーの上に存在している水系媒体に相当していた。全ての場合において、こ の水界面の屈折率帯は明確であった。しかしながら、このポリマーの帯が明確で あるのは、緩衝液がこのポリマーの等本領域に近付いた時のみであった。ｐＨが ７．５から５．０である等本領域を外れると、このゲルの帯は極めて乱れ、この ｐＨが７．５以上および５．０未満の場合、区別できな（なる地点にまで到達し た。これらの測定で得られる結果を表Ｂに示す。

表Ｂ 試験媒体が示すｐＨに対する、架橋ＡＲＰ組成物に関する屈折率測定ＯＩ衝液ｐ Ｈｎポリマー　ｎ緩衝液　所　見８．０　１．３６５０　１．３３４５　非常に 乱れたゲル帯７．５　１．３６５２　１．３３４８　乱れたゲル帯７．０　１． ３７２８　１．３３３８　シャープで明確な帯６．５　１．３７５８　１．３３ ３６　シャープで明確な帯６．０　１．３７８０　１．３３４８　明確な帯５． ５　＋、３６５０　１．３３４０　非常に乱れたゲル帯５、０　１．３３４０　 極めて乱れたゲル帯４、５　１．３３４０　極めて乱れたゲル帯４、０　１．３ ３３９　ゲル帯の存在なしこの測定により、この両性層が示す屈折率とｐＨ変動 に対する応答との間に直接的な相関関係が存在していることが示された。このポ リマーマトリックスは、それらの等亀頭域内では良好な導波管として働（が、こ の領域以外では極めて劣った導波管になると予測され得る。従って、ｐＨで誘発 される屈折率変化を用いることで、ｐ　Ｈに関連した細胞増殖変化、酵素反応性 、または抗原−抗体応答を光学的に監視することことＡＲＰ−光学センサーによ るウレアーゼ活性の測定以下の実施例では、分析物応答ポリマーの光学センサー が示す屈折率変化を用いることでウレアーゼ活性の測定が可能であることを実証 する。

以下に示す様式で、分析物応答ポリマーで出来ているウレアーゼ用光学センサー の製造を実施した。最初に、名目上１−１−１のＡＡ−ＭＭΔ−ＤＭΔＥＭＡポ リ両性電解質ポリマーの精製を行うにおいて、このポリマーの等電点（ｐ１６． ４）のｐＨになるようにｐＨを調整することによってこれを水中で等電沈澱させ ることにより、これの精製を行った。ｐ）（６，４に緩衝させた水でその沈澱さ せたポリマーを洗浄し、遠心分離にかけ、洗浄液のデカンテーションを行った後 、ｐＨを＜４．０にシフトさせるに充分な量でＩＩＣ＋が入っているエタノール の中にその沈澱させたポリマーを再溶解させた。この溶液の固体含有量は、溶液 １ｇ当たり０．１０７ｇのポリマーであった（溶液１ｇ当たり０．３２７ｍｅｑ の酸ポリマー基）。

５０ｍＬのアセトンの中に０．７１２ｇのＸａｍａ−７（商標）アジリジン架橋 剤（１４２ｇ／アジリジン当量）を溶解させることによって、Ｘａｍａ−７（商 標）のストック溶液（ＳＸ）を調製した。次に、このＸａｍａ−７（商標）スト ック溶液と上記ポリマー溶液とを混合することによって、ポリマー酸当量とアジ リジン当量とが５０：１である混合物を生じさせた。混合を行った後、架橋を抑 制しそして後で使用するまでこのコーティング溶液を安定にする目的で、濃水酸 化アンモニウムを１滴加えた。

次に、カバーシート１個当たり２０μＬのコーティング用溶液を用い、この架橋 用コーティング溶液を、Ｆｉｓｈｅｒ　＃１　２５ｘ２５ｍｍの顕微鏡用ガラス 製カバーシート（カタログ番号１２−５４２Ｃ）の上に塗布した。次に、このポ リマーコーテイング物を室温で空気乾燥させた後、１３０℃の真空オーブン内で ２０分間硬化を行った。次に、これらのカバーソートを使用前に室温にまで冷却 した。この乾燥させたポリマーフィルムコーテイング物の測定を行った結果、乾 燥層の厚さは約０゜２からＱ、（３ｍｍであることが示された。

次に、これらの架橋させたポリマーのカバーシートをＣａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ　Ｍ ｏｄｅｌ　２７６１１屈折計の中に入れ、モノブロモナフタリンのカップリング 液を用いてこの屈折計のプリズムに上記カバーシートを光学的に連結させた。ウ レアーゼ活性の測定では、１００ｍＬの精製水の中にＥＤＴΔを０．２ｍＭ、尿 素を１００ｍｇ、そして０．ＩＮのＮａ０ＩＩを１．４ｍＬ溶解させることで、 尿素で緩衝させた基質溶液を７Ａ製した。使用に先立って、この溶液のｐＨをｐ ｌＩ５．５に調整した。

精製水の中にタイプＣ−３Ｊａｃｋ　Ｂｅａｎ尿素アミドヒドロラーゼ（ＥＣ３ ，５，１，５）　（Ｓｉｇｍａ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が入っているウ レアーゼ酵素ストック溶液（３８０ｕ　ｇ／ｍＬ）を、種々の濃度で上記尿素基 質溶液の１．０ｍＬと混合した。その後直ちに、この反応流体を上記分析物応答 ポリマー光学センサーの表面に付けた後、３０分間に渡り室温で経時的屈折率測 定を手動で行った（図８）。

屈折率測定では、２つの干渉帯が存在していることが示された。１つの帯はポリ マーの界面に相当しており、そしてもう一方は、分析物応答ポリマー表面の上に 存在している水系媒体に相当していた。この水の帯はこの測定全体を通して明確 なままであったが、この分析物応答ポリマーに相当する屈折率帯は、この溶液の ｐＨがこれの等電点に近付くにつれて明らかになってきた。この等電点を越えた 所では（ｐＨ＜５から〉７．５）、このポリマーの屈折率帯は乱れた。

ウレアーゼを触媒として用いて尿素の加水分解が生じると、その結果としてＮ　 Ｈ３の生成がもたらされ、それによってこの反応溶液のｐＨが上昇する。従って 、この光学センサーにウレアーゼ反応混合物を加えると、この溶液のｐＨがその 分析物応答ポリマーの等電点を通る時その屈折率が変化した。ウレアーゼ濃度を 変化させた時の関数として、図８に経時的屈折率変化を示す。更に、表Ｃに示す ように、この反応混合物に加えるウレアーゼの比率に伴って逆に、最大屈折率に 到達するに必要とされる時間が短くなった。

点り ウレアーゼ濃度と最大屈折率に到達する時間との相関関係ウレアーゼ（ｕＬ）　 屈折率−最大時間（分）　屈折率−最大範囲２０　５．８　５．５−６．５ ３０　４．２５　４．０−４．５ ４０　３．７５　３．５−４．０ ５５　３．２５　３．２５−３．５ 実施例９ この実施例の目的は、１）ＡＲＰがポリスチレンプレートに付着すること、２） 抗体がこのＡＲＰに付着すること、モして３）抗原−抗体アッセイでＡＲＰを使 用することができることを実証することであった。

バートＡ）　最小ポリマーコーティング重量の測定実施例１に示すように、活性 酸基とアジリジン架橋剤基との最適比は２０：１から５０−１であると決定した 。この比率の範囲は、このポリ両性電解質が示す分子量、並びにポリマー鎖１個 当たりに架橋を少なくとも１つ与えなくてはならないことを反映している。この 一連の実験では、以下に示す試薬溶液を調製し、そして標準として２０：１の比 率を選択した。

試験溶液式　−１：１の酸／アジリジン濃縮物８０　：　２０のメタノール／水 の中に入っている０、ＩＮのポリ両性電解′Ｒ溶ｆ＆（等電沈澱で精製した１− １−Ｉ　ＡＡ−ＭＭ八−ＤＭＡＥＭ八が０．０３２８ｇ／ｍＬ入っている）の２ ８０ＩＩＬに、アセトン中１゜４０５ＮのＸａｍａ−７（商標）を２０ａＬそし て濃Ｎ１１．ＯＨを２０ａＬ加えた。（このポリマー上の酸基とアジリジンとが 早期の反応を生じるのを抑制するに充分な量で水酸化アンモニウムを加えた）。

試験溶液Ｂ　−２０：１のコーティング用溶液濃縮物」二で用いたＯ、ＩＮのポ リ両性電解質溶液の１．９ｍＬに、試験溶液Ａを０．１ｍＬ加えた。この濃縮物 の固体含有量は０．０３２８ｇ／ｍＬであった。

表りに従って溶液を調製した。９６個のウェルが備わっているプレートを用い、 横１列当たり９個のウェルの中に２０ＩＩＬづつピペットで入れた。

各横列に異なる溶液を入れ、そして対照として横列Ｇをブランクにした。縦列１ ０．１１および１２もブランクにした。

サンプルを室温で３０分間強制空気乾燥させた後、３５℃の真空オーブンの中に 一装置いた。

表Ｄ コーティング用溶液 １　１　０　０．０２　１．０　０．０３２８２　５　５　０．０２　０．５　 ０．０１６４３　２　８　０．０２　０．２　０．００６５６４　１　９　０、 Ｑ２　０．１　０．０３２８５　１　１９　０．０２　０．０５　０．００１６ ４６　１（Ｎ４）　９　０．０２　０、Ｏｆ　０．０００３２８結合試験 青色、赤色または緑色のアニオン系染料を入れた緩衝液（ｐＨ＝　４　）をウェ ルの中に入れた。これらの両性ポリマー類で媒染性を示し得るものであり、イオ ン化し得る酸性基、例えば−〇〇ＯＨまたは一８ＯｓＨなどを少な（とも１個有 している、水溶性染料から、染料を選択する。

このような染料は、例えばＭ　ｉ　ｙ　ａ　ｚ　ａ　ｋ　ｏの米国特許第３．　 ７９５゜５１９号および米国特許第５．１０７，０６３号などの中に記述されて いるように本技術でよく知られている。上記染料には、例えば酸性を示すモノ− 、トリーおよびペンタメチンオキソノール類、カルボ−およびジカルボシアニン 類、メロ７アニン類、インドレニウム類、アゾ類、トリフェニルメタン類、テト ラジン類およびバルビッル酸類などが含まれる。その例には、０ｘｏｎｏｌ　Ｙ ｅｌｌｏ、０ｘｏｎｏｌ　Ｒｅｄ５３６、ＴａｒｔｒａｚｉｎｅおよびＡｃ１ｄ 　Ｖｉｏｌｅｔ　５２０Ｔなどが含まれる。本分野の技術者によく知られている ように、補助層で用いるには、その吸収させるべき放射線に相当する吸収を示す 染料を選択する。縦列１．２および３に緩衝液と青色染料を加えた。縦列４．５ および６に緩１７液と赤色染料を加え、そして縦列７．８および９に緩衝液と緑 色染料を加えた。この染料／緩衝液溶液の４０ａＬに上記ポリマー表面を３０分 間ｆｆ１ｆｉした後、水道水を用いて室温で洗浄した。このポリマー層の中に吸 収された染料が存在していることによって、そのウェルにポリマーが接着したこ ととそれの濃度を示す。ポリマー濃度を高くすればするほど、より高い染料応答 が得られた。全ての場合において、１００：ｌの希釈率およびそれ以下の希釈率 のウェルで良好な染料付着が観察された。２０：１の希釈率の時、全ての染料で 強い応答が得られ、明らかに最も良好な被覆を与えていた。従って、このコーテ ィング組成物を選択して抗体結合試験を行った。

パートＢ）　抗体付着 この実験では、希釈率が２０・１である酸とアジリジンが２０＝１の組成物を選 択した（０．００１６４ｇ／ｍＬ、０．００５Ｎ）。下記の如くこれらの標準溶 液を調製した。

抗体ストック溶液： ヤギ抗ラビットＩｇＧ（分子全体）をＳ　ｉ　ｇｍａ　（Ｓ　ｔ、Ｌｏｕ　ｉ　 ｓ。

Ｎ１０）から購入した。小びん１本の内容物全体（１ｍｇ）を９．５ｍＬの精製 水に溶解させることによって、この抗体のストック溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を調製 した。これにより、１５ｍＭの塩化ナトリウムが入っているｐＨ７，２１０ｍＭ の燐酸ナトリウム緩衝液の中に２ｍｇ／ｍＬの量で含まれているストック抗体溶 液が得られた。これを以下に示すポリ両性電解質ポリマー類および架橋剤と組み 合わせて用いることで、下記のコーティング剤を調製した。

溶液Ａ　−１：１超濃縮物 ８０　：　２０のメタノール／水の中に入っている０８１Ｎの１−１−ＩＡＡ− ＭＭｌ−１−ＩＡＡ−ポリ両性電解質の２８０ａＬを、Ｎ　Ｈ４０１１の２０ａ Ｌそしてアセトン中１．４０５ＮのＸａｍａ−７（商標）トリアシリジンの２０ μＬと一緒にした。

溶液Ｂ　−２０：１コーテイング用濃縮物８０・２０のメタノール／水の中に入 っている０、ＩＮの１−１−１人へ−ＭＭΔ−ＤＭ八ＥＭΔポリ両性電解質の１ ．９ｍＬを、Ｎ）１４０１１の２０μＬそして１：１溶液Ａ（超濃縮物）の１１ ｍＬと一緒にした。

溶液Ｃ−２０＋１−２０＋１コーテイング用溶液上記２０：１コーテイング用溶 液（溶液Ｂ）の０．１ｍＬ　（１００ａＬ）を、Ｎ１（４０Ｈが２０ｐＬ入って いるメタノールの１．９ｍＬで希釈した。

溶液Ｄ　−０，１４ＮのＸａｍａ−７（商標）溶液上記１．４０５ＮのＸａｍａ −７（商標）ストック溶液の０．　１ｍＬを０．９ｍＬのアセトンの中に溶解さ せた。

溶液Ｅ　−抗体溶液＃１ ５００ｕＬのＡｂストック溶液を２０ｕＬのＸａｍａ−７（商標）溶液りと一緒 にした。

溶液Ｆ　−抗体溶液＃２ １０００ＩＩＬのＡｂストック溶液を２０１１ＬのＸａｍａ−７（商標）溶液り と一緒にした。

コーティング操作 ９６個のウェルが備わっているプレート２枚の各々に備わっている縦列を１列置 きに、２０＋Ｌのコーティング用溶液Ｃで塗布した。次に、強制エアーブロアー を用いてこれらのプレートを３０分間空気乾燥させた後、５０℃の真空オーブン 内で３０分間焼いた。コーティング用溶液Ｃの代わりにコーティング用溶液濃縮 物Ｂを２０ｕＬ用いる以外は同様にして３番目のプレートの塗布を行い、従って ここでは、各ウェルの中に２０倍過剰量でポリマーを入れた。以下の表ＥＳＦお よびＧに示すように、各プレートを抗体溶液で処理した。処理後、これらのプレ ートを燐酸塩緩衝液で洗浄した後、ラビットＩｇＧ比色アッセイでこれらの試験 を行ツタ。サーモマックＸＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｃｏｒｐ、自 動比色計（Ｐａｌｏ　ＡｌｔｏＳＣＡ）を用いて色変化を監視した。アッセイ試 薬を添加して１０分および２０分間、色応答を監視した。

プレート＃１ 縦列１．３．５．７．９および１１に溶液Ｃを塗布して乾燥させた。

以下の表Ｅに示すように各横列に石油エーテルを入れ、そして各ウェルにＡｂ抗 体ストックを１０μＬ加えた。

表Ｅ 縦列１．３．５．７．９および１１に溶液Ｃを塗布して乾燥させた。

以下の表Ｆに示すウェルの中に抗体溶液を直接式れた。石油エーテルは使用しな かった。この抗体溶液には、抗体およびポリマー界面との同時反応を可能にする アジリジンを含有させた。

抗体活性に関するアッセイ ラビットＩ　ｇＧ　（ｒ　ｒ　ｇＧ）試験抗原およびヤギ抗ｒＩｇＧアルカリ性 ホスファターゼ接合体酵素レポーター試薬を用いたサンドイッチイムノアッセイ を実施することによって、上に記述した試験ウェル内の抗体活性を測定した。こ のアッセイのための試薬には下記が含まれる。

接合体ストック試薬 ５ｍＬのトリスサンプル緩衝液の中にＳ　ｉ　ｇｍａ接合体を５ＩＬ溶解させる ことによって、ヤギ抗ｒ１ｇＧ（分子全体）アルカリ性ホスファターゼ接合体（ Ｓ　ｉｇｍａＳＡ−８０２５）を調製した。

精製したラビットＩｇＧ　（Ｓ　ｉｇｍａＳＮ、１−５００６）の０．５ｍｇを ５ｍＬのＰＢＳに溶解させることによって、精製ラビットＩｇＧのストック溶液 （１００ｕｇ／ｍＬ）を調製した。各ウェルでこのストックの２０μＬを用いた 。

トリスサンプル緩衝液 トリス緩衝液（５０ｍＭＳｐＨ７，５）　、塩化ナトリウム（７５ｍＭ）、０． １％の５Ｌ−１８洗剤、０．１％のＵＳＡおよびアジド（０，０２％）を調製し て４℃で貯蔵した。上記接合体溶液のための希釈剤および洗浄流体の両方として これを用いた。

アッセイ操作 以下の如く、試験ウェル内の活性として抗体を評価した。

１）トリスサンプル緩衝液を用いたウェルの洗浄。各ウェルを満たした！＆直ち に吸い出した。この過程を３回繰り返した。

２）次に、上記ラビット■ｇＧ抗原ストック溶液を２０ｕＬ加えた後、この試験 溶液を室温で３０分間インキュベートした。吸い出すことでそのラビツトＩｇＧ を除去した。

３）次に、各試験ウェルをサンプル緩衝液で３回洗浄した。

４）次に、各試験ウェルを２０μＬの上記抗ｒ１ｇＧ接合体ストック溶液と一緒 に室温で１時間インキュベートした。次に、この接合体試薬を除去した後、各ウ ェルをトリスサンプル緩衝液で４回洗浄した。

５）次に、各ウェルにＢＣＩＰ（商標）ホスファターゼ基質溶液（ＳｔｇｍａＳ Ｓ　ｔ、Ｌｏｕ　ｉ　ｓ、ＭＯ）（２０μＬ）を加えた後、室温で３０分間イン キュベートした。次に、これらの試験ウェル内の色を読み取った。

紅 縦列１．３．５．７．９および１１に溶液Ｂを塗布して乾燥させた。

以下の表Ｇに示すウェルの中に抗体溶液を直接式れた。石油エーテルは使用しな かった。この抗体溶液にアジリジンを含有させることで、抗体およびポリマー界 面との同時反応を可能にした。

表Ｅ、ＦおよびＧに示した実験結果は明らかに、アジリジンで架橋させたポリマ ーはそのポリスチレンプレートの表面にしっかりと接着することを示している。

１）最初にこのポリマーをアジリジンで処理することでその抗体に対して反応性 を示す表面を生じさせるか、或は２）最初にその抗体をアジリジンと反応させた 後この複合体をそのポリマー被覆表面と反応させることのどちらかで、この抗体 はアジリジン接着を通してそのポリマーに付着することができる。どちらの場合 も、この抗体は、架橋を生じる抗原結合活性を保有しているが、活性化された抗 体は、最初にポリマーで処理しなかった表面には接着しない。

ＦＩＧ、１ 酸性　中性　塩基性 ／（／″ｒ′″　７ Ｃ）（３ゝｃＨ３１，Ｉ３へ〕 段階１１ エッ７．ノ３ッ　ま２．（よ溶液　ＣＨ３１壮）ｒ電＼ く 〈 ＦＩＧ、６ ｆ（ｓｅｃ） −一一一一アラビノース 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成７年１月１３日

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ．５．０から８．０のｐＨを示す、アクリル酸、メタアクリル酸アルキル およびメタアクリル酸Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノエチルの両性コーもしくはター ポリマー類から成る群から選択される、ポリマ−１分子当たり１から２０個の架 橋を有する変換用ポリマ−を含んでおり、ここで、この両性コーもしくはターポ リマーが表面に固定されている組成物。
2. ２．分析物レセプタ剤を更に含んでいる請求の範囲１の組成物。
3. ３．ａ．５．０から８．０のｐＨを示す、アクリル酸、メタアクリル酸アルキル およびメタアクリル酸Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノエチルの両性コーもしくはター ポリマー類から成る群から選択される変換用ポリマーと架橋剤の溶液を混合し、 ｂ．段階ａの溶液を表面に塗布した後、ｃ．変換用ポリマー１分子当たりの架橋 の割合が１から２０になるようにこのポリマーの硬化を行う、ことを含む、表面 に固定されている分析物応答ポリマーの製造方法。
4. ４．請求の範囲３の方法の生成物。
5. ５．液状媒体内の分析物を検出する音響方法において、ａ．音響検出システムを 分析物に接触させ、ここで、この検出システムに含まれている分析物応答ポリマ ーがこの分析物に応答し、ｂ．段階ａの後、該検出システム内の伝播変化を測定 し、そして ｃ．段階ｂで測定した伝播変化と該分析物の存在、濃度、産生率または消費とを 相互に関係付ける、ことを含む方法。
6. ６．液状媒体内の分析物を検出する光学方法において、ａ．光学検出システムを 分析物に接触させ、ここで、この検出システムに含まれている分析物応答ポリマ ーがこの分析物に応答し、ｂ．この分析物応答ポリマーが示す光伝播の変化を検 出する手段に段階ａのシステムを連係させ、 ｃ．段階ａの後、該検出システム内の伝播変化を測定し、そして ｄ．段階ｂで測定した伝播変化と該分析物の存在、濃度、産生率または消費とを 相互に関係付ける、ことを含む方法。
7. ７．該分析物がＨ＋を含んでいる請求の範囲５または６の方法。
8. ８．該分祈物応答ポリマーが分析物レセプタ剤を含んでいる請求の範囲５または ６の方法。