JPH07508977A - インターロイキン−１の阻害による細胞の過剰増殖の処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−１の阻害による細胞の過剰増殖の処置関連出願に対する相互 参照 本願は、１９９１年３月３１日に出願された米国特許出願第０７／７０７．８９ ７号の一部継続出願であり、その米国出願の開示は本願明細書中に、引用により 挿入されている。

発明の背景 本発明は、細胞の過剰増殖の処置方法に関する。これらの方法は、細胞、特に、 上皮細胞及び、さらに好ましくは、ケラチン生成細胞（ケラチノサイト）の過剰 増殖に特徴のある種々の病的状態の処置に有用である。

細胞、特にケラチン生成細胞の過剰増殖に特徴のある状態は、処置が困難である ことが証明されていた。乾酊の様な、これらの状態の幾つかに対する伝統的な処 置は、不十分であった。従って、細胞の過剰増殖を減少又は防ぐことにより、こ れらの状態を処置することができる治療に対する必要性が存在している。

細胞の過剰増殖に特徴がある特定の状態におけるサイトカインのレベルが研究さ れてきた。特に、正常な皮膚及び乾癖の皮膚におけるインターロイキン−１αと インターロイキン−１βのレベルを比較する試みがなされてきた。乾癖の皮膚に おけるインターロイキン−１の活性は、正常な皮膚と比較して減少している報告 された。しかし、正常な皮膚形管におけるインターロイキン−１βのレベルと比 較して、乾縮の皮膚における高分子量インターロイキン−１βのレベルはより本 発明は、イ／ターロイキン−１（ＩＬ−１）活性、又は細胞内インターロイキン −１受容体アンタゴニスト活性を阻害又は減少することによって、細胞、特に上 皮細胞の過剰増殖を防御又は減少する方法を提供する。従って、本発明は、イン ターロイキン−１阻害化合物を過剰増殖阻害量で、細胞に接触することを含も方 法に関する。インターロイキン−１阻害化合物には、インターロイキン−１又は 細胞内インターロイキン−１受容体アンタゴニスト活性を減少させる化合物が含 まれる。１つの方法によれば、インターロイキン−１活性は、その合成を阻害又 は減じるように調節（ダウンレギュレート）することにより阻害される。他の方 法によれば、インターロイキン−１活性は、前駆型から活性型への変換を阻害す ることによって阻害される。この活性型への変換の阻害は、前駆型を活性型へと 変換する変換酵素の発現を防御又は減じることを含むが、それらに制限されない 、幾つかの方法の内の１つによって達成されてもよく、又はその変換酵素自身を 阻害する二とによって、達成されても良い。適切なインターロイキン−１阻害化 合物には、インターロイキノ−１、インターロイキン調節因子又はインターロイ キン−１変換酵素の発現を調節するオリゴマー群（アンチセンスオリゴマー、第 ３鎖オリゴマー又は３重らせんオリゴマー対など）が含まれる。インターロイキ ン−１調節因子には、インターロイキン−１活性を調節する化合物及び、例えば 、細胞内インターロイキン−１受容体アンタゴニストの様な化合物が含まれる。

池のインターロイキン−１阻害化合物は、標的とされた（すなわち、過剰増殖を 行っている）細胞において、インターロイキン−１又は細胞内インターロイキン −１受容体アンタゴニストの活性レベルを減じる化合物の種々のクラスから選択 しても良い。

好ましい方法によると、本発明は、オリゴマー（群）を、過剰増殖を阻害する量 、皮膚又は上皮細胞に接触させることにより、皮膚又は上皮細胞の過剰増殖に特 徴がある病的状態を処置する方法に関する。このオリゴマー（群）は、アンチセ ンスオリゴマー、第３鎖オリゴマー又は３重らせんオリゴマーでも良い。この様 なアンチセンスオリゴマーは、細胞内に存在する標的遺伝子から転写されたＲＮ Ａ配列に相補的な配列を有している。第３鎖オリゴマーは、細胞内に存在する標 的遺伝子の選択された２本鎖核酸配列に相補的な配列を有している。３重らせん オリゴマー対は、標的遺伝子又はその転写産物の１本鎖核酸配列に相補的である 。標的遺伝子は、細胞内増殖を調節するサイトカイン、又はその調節因子（受容 体アンタゴニストなど）、又はそれへの変換酵素をコードする遺伝子から選択さ れる。

その他の好ましい方法によると本発明は、アンチセンスオリゴマー、第３鎖オリ ゴマー又は３重らせんオリゴマー対が含まれるオリゴマーの１つを、過剰増殖を 阻害する量、その細胞に接触させることによる、皮膚又は上皮細胞の過剰増殖を 減少又は防御する方法に関する。、そのオリゴマーは、細胞又は転写物内に存在 する標的遺伝子からの核酸配列に相補的な配列を有している。その標的遺伝子は 、細胞の過剰増殖を仲介するサイトカイン、又はそのようなサイトカインに対す る受容体アンタゴニストの様な調節因子、又は変換酵素、又はそれの機能に重要 なサイトカインの翻訳又は翻訳後の修飾に関与する酵素をコードする遺伝子から 選択される。

好ましい標的遺伝子には、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロ イキン−１α（ＩＬ−１α）、細胞内インターロイキン−１受容体アンタゴニス ト（ｉｃｌＬ−１ｒａ又は細胞内ＩＬ−１ｒａ）又はインターロイキン−１変換 酵素をコードする遺伝子が含まれる。

定義 本明細書では、特に明記しない限り、以下の用語は、次の意味を有する。

「プリン」又は「プリン塩基」なる用語は、天然に存在するアデニン及びグアニ ン塩基のみならず、８−位において置換された塩基又は６−位にて修飾されたグ アニノ類似体又はアデニン類似体、２−アミノプリンの様な、それらの塩基の修 飾物をも含んでいる。

「ヌクレオ７ド」という用語は、ヌクレオ７ド単位を含み、それと交換可能に使 用されるが、５炭糖及び窒素含有塩基を含む核酸のサブユニットを表している。

この用語は、塩基としてＡ、　Ｇ、Ｃ，Ｔ及びＵを有するユニットのみならず、 その塩基の類似体及び修飾型（８−置換プリン群など）をも、さらに含んでいる 。

ＲＮ　Ａにおいては、５炭糖はリポースであり、ＤＮＡにおいては、それは２゛ −デオキ／リボースである。この用語はまた、２°−Ｏ−アルキルリボースの様 な修飾された糖などの、その様なサブユニットの類似体を含む。

「ホスホネート（ｐｈｏｓｐｏｎａｔｅ）　ｊという用語は、式（上記式中、Ｒ はアルキル又はアリール基を表す）で示される基を表す。適当なアルキル又はア リール基には、立体的にホスホネート結合を妨害しない又は互いに相互作用しな い基が含まれる。ホスホネート基は、ｒＲＪ又は「Ｓ」のいずれの配置に存在し ても良い。ホスホネート基は、ヌクレオンジル単位と結合するヌクレオノノル内 リン基の結合（又はリンク）として用いることができる。

「ホスホノエステル」という用語は、式：で示される基を表し、ここで、ホスホ ジエステル基は、ヌクレオンジル単位と結合するヌクレオノジル内リン基の結合 （又はリンク）として用いることができる。

「非−ヌクレオノド　モノマー単位」は、塩基、糖及び／又はリンの基本骨格が 、他の化学的部分と置換されたモノマー単位を表す。

「ヌクレオシド／非−ヌクレオノド　ポリマー」は、ヌクレオノド及び非−ヌク レオノド　モノマー単位を含むポリマーを表す。

「オリコヌクレオシド」又は「オリゴマー」という用語は、通常、約６から約１ ００ヌクレオシドの長さであるが、長さにおいて約１００ヌクレオノド以上でも 良い、ヌクレオ７ド内結合により結合されたヌクレオノド鎖を表す。それは、通 常、ヌクレオシド　モノマーから合成されるが、酵素的方法により得ても良い。

従って、「オリゴマー」という用語は、ヌクレオシド　モノマーを結合するヌク レオノド内結合を有するオリゴヌクレオノドの鎖を表し、従って、オリゴヌクレ オチド、非イオン性オリゴヌクレオノド　アルキル−及びアリール−ホスホネー ト題似体、アルキル−及びアリール−ホスホノチオエート、オリゴヌクレオチド のホスホロチオエート又はホスホロンチオエート類似体、オリゴヌクレオチドの ホスホルアミデート類似体、ホスホトリエステルの様な、中性のリン酸エステル オリゴヌクレオノド類似体及びその他のオリゴヌクレオシド類似体及び修飾オリ ゴヌクレオシドを含み、さらに、ヌクレオ／ド／非−ヌクレオシド　ポリマーも 含んでいる。この用語は、モノマー単位の間のリン基結合の１つ又はそれ以上が 、ホルムアセクール結合、スルファメート結合又はカルバメート結合の様な非− リ／結合によって置換されたヌクレオノド／ヌクレオチド　ポリマーも、また、 含んでいる。それは、また、モルホリノ塩基類似体又はポリアミド塩基類似体の 様に、塘及びリン部分の両方が置換又は修飾されたヌクレオノド／非−ヌクレオ ／ド　ポリマーをも含む。それは、また、非−ヌクレオノドの塩基、糖及びリン 酸の基本骨格が非−ヌクレオシド部分によって置換されるか、又は、非−ヌクレ オノド部分が、ヌクレオノド／非−ヌクレオノド　ポリマー内に挿入されている ヌクレオノド／非−ヌクレオシド　ポリマーをも含む。上記の非−ヌクレオシド 部分は、標的配列と相互作用することがてきるか、又は標的細胞内への取り込み を変えることができる他の小分子と結合させるために、任意に用いても良い。

「アルキル−又はアリール−ホスホネートオリコマ−」という用語は、少な（と も１つのアルキル−又はアリールーホスホネートヌクレオノンル内結合を有して いるオリゴマーを表す。適切なアルキル−又はアリール−ホスホネート基は、ホ スホネート結合を立体的に妨げず、または相互作用しないアルキル−又はアリー ル−基を含む。好ましいアルキル基には、約１から約６までの炭素原子を有する 低級アルキル基が含まれる。適切なアリール基は、共役されたｐｌ電子系を有し ている少なくとも１つの環を有し、炭素環式アリール及び複素環式アリール基を 含み、これらは、置換されていてもよく、約１０炭素原子を有するの力く好まし い。

「メチルホスホネート　オリゴマー」　（又はｒＭＰ−オリゴマー」）という用 語は、少なくとも１つのメチルホスホネートヌクレオシンル内結合を有するオリ ゴマーを表す。

「中性オリゴマー」という用語は、ヌクレオノド　モノマーの間の非イオン性ヌ クレオシド内結合（すなわち、正味の正又は負のイオンの荷電を有していない結 合）を有するオリゴマーを表し、例えば、アルキル−又はアリール−ホスホネー ト結合、アルキル−又はアリール−ホスホノチオエート、ホスホトリエステル結 合の様な中性のリン酸エステル結合、特に中性のエチルトリエステル結合、及び スルホメート、モルホリノ、ホルムアセクール及びカルバメート結合の様な非− リン−を含んでいるヌクレオシド内の結合、の様なヌクレオシド内結合を有して いるオリゴマーを表す。中性オリゴマーは、任意に、オリゴヌクレオノド又はヌ クレオノド／非−ヌクレオ／ド　ポリマーと共役の相手を含む第２の分子との間 に共役を含んでも良い。この様な共役の相手には、インテーカレーク−（挿入剤 ）、アルキル化試薬、細胞表面受容体に対する結合物質、脂肪親和性試薬、ソラ レンの様な光−架橋−結合試薬を含む核酸修飾基及び核酸の標的部位を開裂する 能力のある基などが含まれ得る。その様な共役の相手は、さらに、オリゴマーの 取り込みを促進しても良く、オリゴマーの標的配列との相互作用を修飾しても良 く、オリゴマーの薬動力学的分布を変えても良い。実質的に要求されるのは、オ リゴマー共役体に含まれるオリゴヌクレオノド又はヌクレオシド／非−ヌクレオ ノド　ポリマーが中性てなければならないことである。

「中性のアルキル−又はアリール−ホスホネートオリゴマー」という用語は、少 なくとも１つのアルキル−又はアリール−ホスホネート結合を含む中性のヌクレ オノド内結合を有する中性のオリゴマーを表す。

「中性のメチルホスホネート　オリゴマー」という用語は、少な（とも１つのメ チルホスホネート結合を含むヌクレオノド内結合を有する中性のオリゴマーを表 す。

「タンデム　オリゴヌクレオチド」又は［タンデム　オリゴマー」という用語は 、標的核酸配列の５゛−又は３′−側のいずれかに位置づけられた配列と相補的 てあり、標的配列と相補的な第２のオリゴマーと共に／＼イブリダイズするオリ ゴヌクレオチド又はオリゴマーを表す。タンデム（直列）オリゴマーは、標的核 酸配列の２次構造を縮小させることなどにより、標的配列をその様なオリゴマー に対してより接近できる様に助け、これらのオリゴマーの標的へのノ＼イフリダ イゼー／ヨノを改良させることがてきる。さらに、一対のタンデム　オリゴマー の内の１つのメンバーは、上記の第２のオリゴマー（またはその逆）の５°−又 は３−末端のいずれかにおけるヘリカル構造を促進することによって、第２のタ ンデムオリゴマーの標的核酸配列へのノ＼イブリッド安定性を改良することがで きる。

「短鎖脂肪族アルコール」という用語は、約２から約２０の炭素原子を有し、そ の脂肪（アルキル）鎖は、直鎖ても分枝鎖でも良いアルコールを表し、第１級、 第２級及び第３級のアルコール群、グリコール類及びポリオール類を含む。

７フラ、クス促進剤」という用語は、化合物の経皮フラックス（経皮流動性）を 増加させるために使用される物質を表す。フランクス促進剤は、化合物の経皮フ ラックスを増加するために、化合物と組合せて、皮膚又は粘液膜に適用されるの が典型的である。促進剤は、皮膚又は粘液膜のバリヤーを崩壊することによって 、又は皮膚又は粘液における薬の分配挙動を変化させることによって、機能する と考えられる。

−３重らせんオリコマ一対」という用語は、ＲＮＡ又はＤ　Ｎ　、Ａの様な１本 鎖標的咳酸のセグメ〉トに相補的てあり、かつ水素結合する能力がある第１の及 び第２のす１１コマ−を表し、それゆえ、それらと１本鎖襟的核酸とは、−緒に ３重のへ°ノア・クス構造を形成することができる。

７第３珀オリゴマーｆという用語は、ＤＮＡ２重らせん、ＲＮＡ　２重らせん又 ；：ＤＮＡ−ＲＮＡ２重らせんの様な２零鎖核酸のセグメントとノ）イブリダイ ズするここができ、それらと３重のヘリ・、・クス構造を形成することができる オリゴマー対表す。

一用捕的二という用語は、３重らせんオリコマ一対（又は第１の及び第２のオ・ ＝で−）又は第３鎖オリコマ−に関する場合に：ま、核酸の塩基配’Ｗｌ＋との 水素結合（及び塩基対又はハイブリダイズ）により３重へリックス構造を形成す る塩基配列を有しているオリゴマーを表す。

発明の詳細な説明 本発明によると、細胞、特に、上皮細胞における過剰増殖に特徴がある状態が、 イック−ロイキン−１阻害化合物を、過剰増殖を阻害する量、使用することによ り、処置する。インターロイキン−１阻害化合物には、インターロイキン−１又 は細胞内インターロイキン−１受容体アンタゴニスト活性を減少させる化合物が ある。適切なインターロイキン−１阻害化合物には、インターロイキン−１、細 胞内イノターロイキン−１受容体アンタゴニストの様なインターロイキン−１調 節因子、又はＩＬ−１前駆体を活性型へ変換する酵素（変換酵素）の発現を防御 又は減じる化合物が含まれ、従って、ペプチド類、変換酵素に対する競合的又は 非競合的阻害物質、小分子阻害物質、抗体、タンパク質の活性部位に結合してそ の機能を修飾するオリゴマー、またはアンチセンスオリゴマー、第３鎖オリゴマ ー又は３重らせんオリゴマー対などの様なオリゴマーが含まれる。これらのオリ ゴマーに対して適切なヌクレオチド配列は、標的遺伝子の配列から決定すること ができる。標的領域の好ましい配列は本明細書中にて、後述する。その他のイン ターロイキン−１阻害化合物には、変換酵素を阻害し、それにより、ＩＬ−１前 駆体の活性型への変換を妨げる化合物が含まれる。その他のインターロイキン− １阻害化合物には、細胞内インターロイキン−１受容体アンタゴニストの活性を 減じる化合物が含まれる。

（以下余白） Ａ　好ましいオリゴマー 選択されるオリゴマーは帯電したあるいは帯電していない骨格（バンクボーン） を有するような多数の型のいずれであってもよい。

好ましいオリゴマーは、アルキル−およびアリール−ホスホネートオリゴマーで あり、メチルホスホネートオリゴマーが特に好ましい。その他の好ましいオリゴ マーとしては、ホスホロチオエートオリゴマー、モルホリノ類縁体、ホルムアセ クール頚縁体およびペプチド核酸（ｐＮＡ）順繰体などが挙げられる。また、少 なくとも約８個のヌクレオノド単位を有するオリゴマーが好ましく、約８〜４０ 個のヌクレオノド単位のものが、より好ましい。ヌクレオノド／非ヌクレオノド ポリマーであるオリゴマーも好ましい。好適なオリゴマーとして、混成ＲＮＡ。

Ｄ　Ｎ　Ａ　３縁体であるキメラオリゴヌクレオチドも挙げられる［イノウニ（ Ｉｎｏｕｅ）らのｒＦＥＢｓＬｅｔｔ、ｊ２１１５：３２７　（１９８７年）参 照］。たとえば切断部分または架橋部分が結合しているメチルホスホネートオリ ゴマーなどの中性ノく・ンクポーンを有するオリゴマーは一定の条件では有利で あることが証明できる。このようなオリゴマーは、切断または架橋部分が標的ポ リヌクレオチド配列の不活性化を促進できると同時にその中性構造がヌクレアー ゼ消化速度を減少させるので、インヒポでの半減期が比較的長い。

本発明のひとつの態様において、これらのアンチセンスオリゴマーは、選択され た標的遺伝子から転写されたＲＮＡの一部と相補的な配列を有する。阻害の正確 な分子上のメカニズムは決定的には解明されてはいないが、アンチセンス第１ノ コで−と標的遺伝子から転写されるＲＮＡとの間の２重らせんの形成に起因する ことが示唆されている。このように形成された２重らせんが、ｍＲＮＡ配列の翻 訳、プロセノノグまたは輸送を阻害するかまたは酵素ＲＮアーゼトＩによる消化 を誘導しうるのであろう。

本発明の別の態様においては、二本鎖または一本鎖核酸の標的配列と相補的であ りかつ３重へリソクス複合体を形成するように選択される配列を有する第３鎖オ リコマ−または３重らせんオリゴマーカを用いた３重へリノクス形成によって、 細胞増殖のタウ几ギュレー／ヨノが成し遂げられ、それによって、標的核酸配列 の発現を妨害するかまたは予防することができる。３重へリックス複合体の形成 に基づく二本鎖または一本鎖の標的配列の発現を予防または妨害するための、オ リゴマー（第３鎖オリゴマーおよび３重らせんオリゴマー対を含む）の使用に関 するさらに他の記載が、同時係属中の米国特許出願第０７／３８８０２７号、同 第０７／７５１８１３号および同第０７／７７２０８１号にあり、これらは引用 によって本明細書に包含される。

一般的問題として、使用されるオリゴマーは、標的核酸配列と相補的な配列を有 するだろう。しかし、絶対相補性は必要でない場合がある。一般に、標的核酸配 列と安定な２ｆｆｉらせん（または、場合によっては３重へリソクス複合体）を 形成するのに充分な相補性をもつオリゴマーのいずれもが適していると考えられ る。

安定な２重らせん形成はハイブリダイズするオリゴマーの配列と長さ、およびア ンチセンスオリゴマーと標的配列間の相補性の度合に依存するので、比較的長い オリゴマーを使用する場合は忠実性（相補性）が低くてもよい。これは、３重へ リノクス複合体を形成するオリゴマーにおいてもいえることである。しかし、本 発明方法で使用するのに特に適しているものは、生理的条件下での融解１度が約 ４０’Ｃてあり、かつ２重または３重へリソクス構造を形成するのに充分な相補 性をもつ長さ約８〜４０個のヌクレオノド単位のオリゴマーである。

使用されるオリゴマーの濃度は、処置される過剰増殖状態のタイプ、処置される 組織（すなわち、局所的に投与されるか全身的に投与されるかどうか）、選択さ れる個々のアンチセンスオリゴマーのタイプおよび特異性などの多数の因子にむ して様々てあってよい。本明細書に記載の研究では、５０ＩＩＭレンジの濃度で 使用した試験系にて有意な阻害が観察された、しかし、オリゴマーの１度がそれ よりも高いかまたは低い他の条件下でも、好ましい場合がある。

オリゴマーを桂皮投与する場合は、中性オリゴマーが好ましい。

非経口（注射など）投与には、中性オリゴマーまたはイオン的に荷電したバック 十−７をもつオリゴマー（すなわち、荷電した内部ヌクレオノド単位合を有する もの）のいずれを用いてもよい。

ひとつの好ましい態様においては、これらのオリゴマーは、ポリヌクレオノドま たはヌクレオノド／非ヌクレオノドポリマーと会合パートナ−とのコンツユゲー ト体である。適当な会合パートナ−としては、アクリジンなどの挿入剤、アルキ ル化剤、細胞表面受容体に対する結合物質、親浦性剤、ソラレン（ｐｓｏｒａｌ ｅｎ）ｔ；どの光架橋剤、他の架橋剤、プロキレート、または加水分解剤または 核分解剤（０−フェナントロリン銅またはＥＤＴＡイオンなど）などの核酸の標 的部分を切断しつるような核酸修飾剤が挙げられ、これらのすべてがオリゴマー に取り込まれてよい。

会合パートナ−は、酵素を介した修飾ヌクレアーゼまたはヌクレオチド類縁体の 取り込みによって、あるいはオリゴマーの化学修飾（たとえば、非ヌクレオチド リッカーの使用など）によって、オリゴマーに導入することもできる。

−末鎖または二本鎖核酸配列の機能または発現の予防に用いる場合、これらのオ リゴマーを過半に誘導または修飾して核酸修飾基を取り込み、その結果該核酸と の反応が起こり、不可逆的に核酸の構造が修飾され、それによって該核酸の機能 をなくすることができる。

米国特許出願第５６５２９９号にはソラレン誘導化オリゴマーが記載されている （これは引用例によって本明細書に包含される）。

上述したように、多種多様の核酸修飾基を会合パートナ−として用いて、これら のオリコマ−を誘導することができる。核酸修飾基としては、誘導化オリゴマー が一本鎖また：ま二本鎖核酸セグメントの複合体を形成した後に、核酸セグメン トまた：＝その標的配列Ｅ分に、架橋、アルキル化、切断、分解、またはその他 の７：、活化あるいは破壊を引き起こし、それによってその核酸セグメントの機 能および　または発現を不可逆的に阻害するような基が挙げられる。

第１ｊコマ−由における核酸修飾基の位置は多様であり、使用する特定の核酸修 飾基および標的核酸セグメントによって変化する。したがって、核酸修飾基はオ ”１ニで−の末端に存在するかまたは末端と末端の間の中間に配置することがで きる。複数の核酸修飾基が含まれてよい。

ひとつの好ましい態様において、凛的核酸修飾基は光反応性（たとえば、光の特 定の波長または波長領域によって活性化される）であり、それは光と反応してオ リゴマー及び核酸標的間に反応、即ち架橋を起こす。

架橋を起こすことのできる核酸修飾基の具体例は、アミノメチルトリメチルソラ レン基（Ａ　Ｍ　Ｔ　）などのソラレン類である。ＡＭＴは光反応性であるため 都合がよく、したがって、架橋が達成される前に特定の波長の光を照射すること によって活性化されるに違いない。光反応性であるかまたはそうでない他の架橋 基を用いてこれらのオリゴマーを誘導化してもよい。

別の態様として、核酸修飾基は、核酸セグメントに共有的に結合してそれを不活 性化するアルキル化剤であってもよい。適当なアルキル化剤基が化学業界では公 知であり、アルキルハライド、ハロアセトアミドなどから誘導された基が挙げら れる。ポリヌクレオチドセグメントの切断を起こすことのできるポリヌクレオチ ド修飾基としては、ラジカルを生成させる部分、ならびに核攻撃によって加号、 分解を促進する部分が挙げられる。エチレンノアミン四酢酸塩（ＥＤＴＡ）また はその中性誘導体などの遷移金属キレート錯体は、ラジカルを生成させるのに用 いることができる。ラジカル介在切断を行うために使用される他の基としては、 フニナントロリン、ポルフィリンなどが挙げられる。ＥＤＴＡを用いる場合、切 断ラジカルの生成を助けるには、鉄をオリゴマーにつなぐのが好適である。鉄− ＥＤＴＡは好ましいポリヌクレオチド切断基であるが、その他の窒素含有物質（ アソゴヒ台物またはニトレンなど）または他の遷移金属キレート錯体も有用であ る。

これ以外の切断剤としては、リンー内部ヌクレオチド結合に水の付加を促進する ような核剤および加水分解剤が挙げられる。このような作用剤としては、アミン 、置換グアニノニウム基、イミダゾール基などが挙げられる。

１　好ましい内性オリゴマー製剤 〔ましい出仕オリゴマーとしては、中性アルキル−およびアリール−ホスホネー トオリゴマーおよびモルホリノまたはホスホルイミデート結合をもつ中性オリゴ マーが挙げられる。中性メチルホスホネートオリゴマーが特に好ましい。テープ を剥がした皮膚（表皮角質層が除去されたものであり、粘膜のモデルとして報告 されている）−一どの皮膚に＆Ａする能力という観点において、メチルホスホネ ート内部ヌクレオ／２ル結合のみをもつ中性メチルホスホネートオリゴマーが特 に好ましい。

メチルホスホネートオリゴマーの合成法は本明細書の実施例１およびり−（Ｌｅ ｅＳ、Ｌ、）らのｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ２７　：３１９７〜３２０３　 （１９８８年）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｐ、Ｓ、）らのｒＢｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙＪ２５　＋　５０９２〜５０９７　（１９８６年）（これらの文献 は引用によって本明細書には包含される）に記載されている。

本発明の別の態様において、オリゴマーが細胞に入るまでは中性であることがで き、一旦内部に入ると化学的または生物学的プロセスを介して帯電種に変換され るオリゴマーが好ましい。このような帯電オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ 分解に対してオリゴヌクレオチドを安定化させる他の部分を含んでもよい。２゛ −〇−メチルリボース基などの置換基、種々の塩基修飾、およびホスホロチオエ ートなどのリンバックボーンの類縁体は、ヌクレアーゼに対する耐性を増加する ことができる。さらに、オリゴマーにおけるメチルホスホネートまたは他の中性 内部ヌクレオチド結合の存在は、エキソヌクレアーゼ耐性を与える。

約６〜約４０個のヌクレオノドをもつ中性オリゴマーが好ましく、約１２〜約２ ０個のヌクレオシドがより好ましい。より長い配列に対する相補性を望む場合は 、２０個以上のヌクレオシドをもつ中性オリゴマーを使用してもよいが、比較的 短い中性の直列（タンデム）オリゴマーを用ることによって、ｍＲＮＡなどの標 的核酸の二次構造の発達と競合させながら、皮膚または粘膜への溶解性および浸 透性を最大化するのが望ましい。別法として、各オリゴマーが、同じ遺伝子また は異なる遺伝子の部分である別個の標的配列に対してそれぞれが相補的であるよ うな１個以上の中性オリゴマーの使用が有利である。

中性オリゴマーがアルキル−またはアリール−ホスホネートオリゴマーである場 合、修飾されたリボシル部分をもつヌクレオノドモノマー単位を取り込ませるの が有利である。これらの中性オリゴマーにおいて、２’　−０−アルキル−およ び、特に２°−メチル−リポノル部分をもつヌクレオチド単位を使用することに より、オリゴマーのその相補的標的配列へのハイブリダーゼーンヨンが有利に改 良される。

適当な製剤には、約０．０００１〜約２重量％の中性オリゴマーが含まれる。

一つの好ましい態様において、約２〜約１００％の短鎖脂肪族アルコールを含む 中性オリゴマー製剤を提供する。適当なアルコールとしては、エタノール、イソ プロピルアルコール、プロピレングリコールおよびグリセロールなどが挙げられ る。いくつかの研究において、エタノールを含む中性オリゴマーの製剤は好適な 経皮フラックスを示した。

特に好ましい態様において、これらの中性オリゴマー製剤には、さらにフラック ス促進剤が含まれてよい。適当なフラックス促進剤としては、当業界で公知のも のならびにデ／ルメチルスルホキノド、ツメチルスルホキシドおよびＰＣＴ出願 番号ＰＣＴ／ＵＳ８６１０２５８３　（公開番号Ｗ○８７１０３４７３）に記載 されている環式ケトン、ラクトン、アルデヒドおよびエステルなどが挙げられる 。

フラックス促進剤の中には、オリゴマーの保持性を増し、したがって皮膚内での オリゴマーの濃度を増加する作用をもつものもある。

したかって、皮膚への局所適用などの直接（局所）投与用オリゴマー製剤におい ては、経皮フラックスを最大化するだけでなく、オリゴマーの皮膚内での保持性 を増すようなフラックス促進剤を用いるのが好ましい。さらに、ある環式ケトン およびラクトン促進剤が局所保持性を増加することが報告されており、したがっ て、好ましいクラスのオリゴマー製剤の局所投与用促進剤を含むことができる。

全身処置用オリゴマー製剤においては、オリゴマーの局所保持性の増加が最小で あって、フラックスを最大化するようなフラックス促進剤を用いるのが好ましい 。

２　好ましい標的遺伝子および標的配列好ましい態様において、本発明は、細胞 増殖に影響を及ぼすサイトカインの発現、このようなサイトカインの前駆体から 活性体への変換またはそれらの細胞内受容体アンタゴニストの発現を妨害するオ リゴマーを用いる、細胞の増殖を予防または減少する方法に関するものである。

適当なオリゴマーとしては、アンチセンスオリゴマー、第３鎖オリゴマーおよび ３重らせんオリゴマー対などが挙げられる。

本発明のひとつの態様においては、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、１ｃｌＬ−１ｒａ あるいはＩＬ−１β変換酵素をコードするＤＮＡ上の標的配列またはそれから転 写されるｍ　ＲＮ　、Ａに対して相補的であるオリゴマーを投与することにより 、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−１α（ＩＬ−１ α）またはインターロイキン−１受容体アンタゴニストの細胞内スプライス変異 体（“細胞内イ／ターロイキン−１受容体アンタゴニスト”または１ｃｌＬ−１ ｒａ）あるいはＩＬ−１β変換酵素などのＩＬ−１変換酵素の発現を予防または 妨害することによって細胞の過剰増殖を減少させる方法が提供される。

したがって、本発明は、増殖阻害量のオリゴマー（アンチセンスオリゴマー、第 ３鎖オリゴマーまたは３重らせんオリゴマー対）に細胞を暴ルさせることによっ て、ケラ千ノサイトまたはその他の上皮細胞の過剰増殖を減少させる方法に関す るものである。アンチセンスオリゴマーは標的遺伝子から転写されるＲＮＡの配 列に対して相補的である。第３鎖オリゴマーは、二本鎖核酸の配列と水素結合で き、まｆ：　３　ｆｆｉへリノクス複合体を形成しうるように選択される塩基配 列をもつ。

３重らせんオリゴマー対の第１および第２オリゴマーは、標的−重鎖核酸配列に 対して相補的であり、該配列と水素結合を形成でき、該−重鎮核酸と一緒になっ て３重へυノクス複合体を形成し得るように選択された配列をもつ。

標的遺伝子は、細胞増殖を仲介するサイトカイン、またはその受容体アンタゴニ ストもしくはその変換酵素をコードする遺伝子からなるグループから選択される つ 適当ｒ＝ｔｇ的を剣むサイトカインとしては、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βが挙 げられるｃ　ＩＬ−１βは３１にダルトンの前駆体として合成され、細胞外活住 を得るために、１７５にダルトンと報告されている活性体に変換されることを必 要とするので、ＩＬ−１β変換酵素をコードする遺伝子は別の好ましい標的遺伝 子である。その他の好ましい標的遺伝子としては、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまた はＩＬ−１ｒａの機能（ミリスチル化デ；ど）にとって重大なｒＬ−１フアミ３ ノーの翻訳修飾または翻訳後修飾にも関係する他の酵素をコートする遺伝子力（ 挙げられる。選択された遺伝子の転写産物における、ある領域がオリゴマー対二 対して好ましい標的である。

標的部位にハイブリダイズする場合、上記部位に隣接する部位にするかまたは該 部位の一部または全部をカバーするように、好適な長さのオリゴマー（約８〜約 ４０個のヌクレオチドが好ましく、約１２〜約２０個のヌクレオチドがより好ま しい）を選択する。プレｍＲＮＡにおけるこのような部位としては、スプライス アクセプター、スプライスドナーおよびスプライス分岐点ならびにポリＡ付加領 域が挙げられる。ｍ　ＲＮ　Ａにおける好ましい部位は開始コドンまたはｍＲＮ Ａの５°末端（キャップ部位）などである。オリゴマーの配列は、標的領域の配 列の逆相補記列であろう。

具体例としては、ＩＬ−１βの場合、ヒトＩＬ−１β遺伝子（に６１ｂａｎｋア クセス番号Ｍ１５８４０）のヌクレオチド位置を参照すれば、これらの部位は下 記のとおりである。

スプライスアクセプター、　ヌクレオチド位置　４４５／４４６：９０８／９０ ９；ドナーノヤンク／ヨノ　９７０／９７１；１５３５／１５３６；１５８７／ １５８８：３５７５／３５７６；３７７７／３７７８；４３２２／４３２３：４ ４８７／４４８８：５７２２１５７２３；５８５３１５８５４　；３５６９／６ ５７０ポリＡ付加ノグナル　ヌクレオチド位置　７３６７〜７３７２開始コドン 　ヌクレオチド位置　９２４〜９２６ｍＲＮＡキャップ部位　ヌクレオチド位置 　３７４好ましい部位の具体例としては、ＩＬ−１αの場合、ヒトＴＬ−１α遺 伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ０３８３３）の配列番号を参照すれば、こ れらの部位とヌクレオチド位置は下記のとおりである。

スプライスアクセプター、　ヌクレオチド位置　１４８８／１４８９：２１５２ ／２１５３：ドナー／ヤンク／ヨ／２２０７／２２０８：３１６５／３１６６． ３２１４／３２１５：４１０２／４１０３＋４３２５／４３２６：６２６１／６ ２６２６４３２／６４３３；７８１４／７８１５；７９３９／７９４０：１０２ ８９／１０２９０ポリＡ付加ノグナル　ヌクレオチド位置　１１６１８〜１１６ ２３開始コドン　ヌクレオチド位ｆｆｉ　２１６１〜２１６３ｍＲＮＡキャップ 部位　ヌクレオチド位置　１４３８下記に示す部位は、１ｃｌＬ−１ｒａの好ま しい部位の一例であり、該部位およびヌクレオチド位置は、ヒトＩＬ−１ｒａ遺 伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｍ５５６４６）の細胞内スプライス変異体に 関するものである。

開始コドン　ヌクレオチド位置　１２３〜１２５さらに好ましい標的部位はＩＬ −１ｒａ遺伝子のｍＲＮＡキャップ部位あるいはスプライス／ヤノクノヨノであ る。

好ましい部位の具体例として、ＩＬ−１β変換酵素の場合、ヒトＩＬ−１β遺伝 子変換酵素（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｍ　８７　Ｄ　Ｏ７）の該部位および ヌクレオチド位１は下記のとおりである。

開始コドン　ヌクレオチド位置　１８〜２０ポリＡノグナル　ヌクレオチド位ｆ ｆｉ　１３１６〜１３２１または１３３５〜１３４０ さらに池の好ましい澤的部位はヒトＩＬ−１β変換酵素のｍＲＮＡキャップ部位 またはスプライスを包含する。

このように、本発明の好ましい態様においては、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、１ｃ ｌＬ−１ｒａあるいはＩＬ−１β変換酵素について記載した上記ヌクレオチド位 置て定められるように、標的部位に隣接する部位に迅速にハイブリダイズするか または該部位の一部または全部をカバーするようにハイブリダイズするような配 列をもつように、好適な長さのオリゴマー（約８〜４０個のヌクレオチドが好ま しく、約１２〜２０個のヌクレオメトがより好ましい）を選択する。

アンチセンスオリゴマーを用いる場合、該オリゴマーの配列は標的領域の配列の 逆相浦配列である。

第３鎖オリゴマーを用いる場合、二本鎖核酸標的との間に配列特異的水素結合相 互作用を形成するようにオリゴマーを選択する。

３ｍらせんオリゴマー対を用いる場合、−重鎖核酸との間に配列特異的水素結合 相互作用を形成し、−緒になって３重へリソクス構造を形成するように第１およ び第２オリゴマーを選択する。

（以下余白） ３　好ましい治療上の指示 好ましい治療上の指示は、（ａ）皮膚、良性の過剰増殖：　（ｂ）皮膚、悪性の 過剰増殖、（Ｃ）上皮、良性の過剰増殖、（ｄ）上皮、悪性の過剰増殖；及び（ ｅ）非上皮性の過剰増殖に分類しうる状態に関する。

表皮の過剰増殖が症状に至る皮膚状態として、乾田、魚鱗癖、ひこう疹、ｒｕｂ ｒａ　ｐｉｌａｒｉｓ（ＰＲＰ）、慢性皮膚炎、乾癲形成性皮膚炎、アトピー性 皮膚炎、ウィルレス性軒細胞腫瘍（いぼ）、他の良性増殖物、慢性単純性苔痒、 及びきのこ状フンゲス／５ｅｚａｒｙ症候群などが含まれるがこれらに限定され ない。

表皮ケラチノサイトの悪性の皮膚過剰増殖には、鱗状細胞腫、基底細胞腫、紫外 線角化症、角化軒細胞腫、及び池の皮膚の上皮新生物が含まれる。

上皮の非悪性過剰増殖状すには、口腔粘膜、膣、頚部、食道、肺及び胃ＩＩ過形 成及び形成異常、咽頭乳頭腫及び膀胱嚢腫が含まれる。

上皮の、非表皮性上皮細胞悪性状聾には、鱗状細胞、及び頭及び首、肺樹状構造 、腸、胸、膀胱、頚管、子宮及び膣等の池の上皮細胞腫が含まれる。

非上皮性過剰増殖も応答し得る。これらには、リューマチ様関節炎、多嚢胞性腎 疾を、再発狭窄症、及び種々の臓器の線維症が含まれる。非上皮性癌も標的であ ろう。

また、本発明の方法は、タンノ（り質のＩＬ−１フアミリーの予防的発現力（イ 也のサイトカイン類の放出を２次的に阻害し、その結果、症状が改善されるよう な状態の治療にも使用できる。そのような状態には、リューマチ様関節炎、多発 性硬化症、炎症性腸疾密、ぶどう膵炎、又は乾田内の症が含まれる力（これら１ こ限定さ７要な基本的な事柄は、乾田が免疫学的な異常である力λ、調節されな Ｌｌ（不規凹フ；）ナラチノサイトの増殖に起因するかとも）う二とである。Ｉ Ｌ−１１：広範な細り包型て活性を示し、乾鼾に見られる病理学的作用を及１ボ す。加えて、ＩＬ−１の：Ａ節不全は乾！１１組織で報告されており、疾密状曹 ：：帰結しうる。Ｅクー／（−ら（Ｃｏｏｐｅｒ、に、Ｄ、ｅｔ　ａｔ、）　Ｊ 、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、、　９５．２４５−２６５　（１９９０） ］。乾癖組織は、正常組織に比較して、ＩＬ−１αレベルが低下しく〜１／１０ ）、ＩＬ−１βレベルが増大（〜２ｘ）していることが報告されている［クーパ ーら（Ｃｏｏｐｅｒ。

Ｋ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１４４．４５９３−４６０ ３　（１９９０）］。又、ＩＬ−１受容体アンタゴニストは乾田皮膚において制 圧的なＩＬ−１阻害活性に関与している［キムら（Ｋｉｎ、　Ｎ−Ｉ　ｅｔ　ａ ｌ、　）　”Ｐｓｏｒｉａｔｉｃ　５ｋｉｎ　Ｒｅｖｅａｌｓ　ｔｈｅ　ｉｎ　 ｖｉｖｏ　Ｐｒｅｓｅｎｃｅ@ｏｆ　ｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ＩＬ−Ｉ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ＋　＾ｒｃｈ、ＤｅｒＩＩ Ｉａｔｏｌ、Ｒｅｓ、、１９９１　（ｉｎ　Ｐｒｅｓｓ）コ@が、　■ Ｌ−１受容体アンタゴニストの細胞内型が正常な表皮で発現され、乾田表皮中で 機能的な制圧を行っていることが報告された［ハンマーバーブら（Ｈａｍｍｅｒ ｂｅｒｇ、　Ｃ。

ｅｔ　ａｌ、　）　”Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−Ｉ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｎｔ ａｇｏｎｉｓｔ　ｉｎ　Ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｐｓｏｒｉ≠狽奄メ@Ｅｐｉｄ ｅｒｍｉｓ″Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　１９９２　（ｉｎ　Ｐｒｅ ｓｓ）コ。表皮ては、ＩＬ−１の全メンバーは、放出されつるが、殆んど例外な （細胞内に存在し、分泌されない。サイトカイノ類は、前駆体及び生成物の両者 として存在し得る。しかしながら、正常又は乾揶組織内のＩＬ−１βは、Ｔ−細 胞の活性化に基づいて測定したとき、不活性な形にプロセノノングされる。これ らの結果は、細胞外または細胞内におけるケラ千ノサイトの増殖制御におけるＩ Ｌ−１及び／又はＩＬ−１ｒａの潜在的なオートタリン的役割を示唆している。

さらに、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１ｒａの細胞内濃度は、ケラチノサ イトが増殖サイクに入ると増大し、逆に乾契皮膚に異常なケラ千ノサイト集団が 存在するとＩＬ−１α、ＴＬ−１β及びＩＬ−１ｒａ濃度の急激な低下を伴うＳ フェーズの阻害が起こる［ハンマーバーブら　（ＨａｍＩＩｅｒｂｅｒｇ、Ｃ， ｅｔ　ａｌ、）　Ａｂｓｔｒａｃｔ、Ｊ、１．Ｄ、、　＾ｐｒｉ１．　１９９２ コ　。

ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及び１ｃｌＬ−１ｒａの、ケラチノサイトの増殖におけ る細胞内での役割を評価するための、遺伝子産物の機能的な重要性を調べる数少 ない方法の１つが、アンチセンスオリゴマーによって得られる。遺伝子発現のア ンチセ〉ス限害によって、遺伝子相互のみならず、高度に関連した遺伝子相互を も具体的に区別することができる。２つの異なるケラチノサイト培養物がこれら の研究に用いられた。正常なヒト皮膚から、表皮を分離し、ケラチノサイトを培 養することにより、正常なケラ千ノサイト培養物を得た。［バーズガードら（Ｂ ａａｄｓｇａｒｄ、　０．　ｅｔ　ａｌ、）　Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔ ｏｌ、、　９５：２７５−２８２　（１９９０）コ。他の培養■ はゲラチノサイトの性質を保持しているケラチノサイト細胞系（ｃｅｌｌ　１ｉ ｎｅ）であり、これはヌードマウスに移植したとき、末端分化（ｔｅｒＩＩｉｎ ａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を受け、爪角化症を形成しつる［ブー カンブら（Ｂｏｕｋａｍｐ、ｅｔ、ａｌ、）　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ。

１０６：　７６１−７７１　（１９８８）］。

ｂ、ケラチノサイト増殖の阻害 ＩＬ−１β、ＩＬ−１ａ及びＩＬ−１ｒａの遺伝子発現の阻害は、ＩＬ−１β、 ＩＬ−１α及びＩＬ−１ｒａｍＲＮＡの部分と相補的なオリゴマーを用いて研究 された。２つの異なるケラチノサイト細胞系をこれらの研究に用いた。正常なケ ラチノサイト細胞培養は、表皮を分離し、ケラチノサイト細胞を培養することで 正常なヒト皮膚から誘導した［バーズガードら（Ｂａａｄｓｇａｒｄ　ｅｔ　ａ ｌ、、前掲コ。第２の細胞培養は、ケラチノサイトの性質を保持しているケラチ ノサイト細胞系であり、ヌードマウス（ＨａｃａＴ細胞系）細胞種したとき、末 端分化を受け、爪角化症を形成しつる（Ｂａｒｋａｍｐ、　ｅｔ、　ａｌ、　、 前掲）。

これらの研究に用いたアンチセンスオリゴマー類は、個々の遺伝子標的ｍＲＮＡ 又はスプライスジャ／クノヨンの開始コドンに向けられており、それらを、その 配列の特異性を評価するために用いた池の配列と共に、表１に示す。

轟−± ２　［１４ｚｚ）　ヒトＩＬ−１β　ＣＡＣ−ＣＴＧ−ＭＴ−ＭＡ−ＡＡＧ　Ｘ −１ライＸ１１Ｘ位３　［１２５１］　ヒ　ト　エＬ−１ａ　ＧＣＣ−Ａ’！’ Ｃ−’！ＴＧ−ＡｅＴ−ＴＣＴ　Ｒｉ＆＝＋Ｎン４　［Ｌ４８）ｌ　ｌ：　ト　 ＸＬ−Ｌ　Ｇ（：Ｃ−ＡＴＧ−ＧＧＧ−ＡＧＧ−ＧＣＣ開１ｇコｐン実施例２及 び３で報告された結果を見直すことにより、ＩＬ−１α又はｌ−１βサイトカイ ン類又はＩＬ−１ｒａのケラチノサイト内での発現が、それらの増殖に必須の作 用のように思われる。これらサイトカイン類のケラチノサイトによる構成的な発 現及びそれらの細胞内での位置から、アンチセンスオリゴマーの新規で連続的な 合成がなされているよう思われる。

配列特異的なアンチセンスオリゴマーの使用で、培養中のケラチノサイトの増殖 を制限又は減少することができるということは、これらのオリゴマーが乾田のよ うな疾密におけるケラチノサイトの増殖を制限する上で有用であることを示して いる。ケラチノサイトは、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βに加えて、皮膚炎の炎症性 細胞＆潤を導（多くの他のサイトカイン類をも産生する。乾田におけるケラチノ サイトは、Ｔ−細胞を活性化する残りのサイトカイン類を放出する。［チャン（ Ｃｈａｎｇ、　Ｅ、　Ｙ、　）　”Ｔ−ｃｅｌｌ　Ａｖｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｓ 　Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ　ｂｙ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　qｅ１ｅａｓｅｄ ｂｙ　Ｌｅｓｉｏｎａｌ　Ｐｓｏｒｉａｔｉｃ、Ｂｕｔ　Ｎｏｔ　ＮｏｒｌＩａ ｌ、Ｅｐｉｄｅｒ＋＋ｉｓ、＋人ｒｃｈ、、Ｄｅｒｍａｔｏ戟A、Ｓｕ ｂｍｉｔｔｅｄ、１９９２）］。ケラチノサイトの増殖阻害も、疾患の免疫組成 に影響し得ると予測されるが、この理由は、ＩＬ−１群が乾田においてＴ−細胞 の活性化に関与する幾つかの相乗的なサイトカインの１つであることのみならず 、［、−１β又はＩＬ−１αに対するアンチセンス又は第３鎮オリゴマーを用い ることで細胞内サイトカイン環境を変化させることによっても他のサイトカイン の放出を阻害し得るということにある。

本発明の理解を助けるために、一連の実験の結果を示す以下の実施例を記載する 。勿論、本発明に関連した以下の実施例は、本発明を特に制限するものと考えら れるべきでなく、当業者の予測範囲内である、現在既知の、又は後に開発される 改変は後述する請求の範囲に記載の本発明の範囲内に包含される。

中性のメチルホスホネートオリゴマーは化学的な方法［ミラーら（Ｐ、　Ｓ、　 １ｉｌｌｅｒｅｔ　ａｌ、　）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１ １：　６２２５−６２４２　（１９８３）　；　ジャガー（＾　Ｊａｇｅ秩j 及びエンフェルス（Ｊ、　Ｅｎｇｅｌｓ）　、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅ ｔｔｅｒｓ　２５：　１４３７−１４４０　（１９８４）及びトーマンら（Ｍ、 　Ａ、　Ｄｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ ｅｒｓ　４０°９５−１０２　（１９W ４）：に従い、メチルホスホンアミダイトモノマーを用いて合成した。

固相合成は、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ　Ｍｏｄｅｌ　８８００　ＤＮＡ合成合成音２い て行った。該合成装置に用いたプログラムはＭＴＨＬ　０６　（ｍａｉｎ）及び ＣＰ　Ｌ　、Ａ　Ｗ　１１　（ｃｏａｐｌｉｎｇ）であり、これらは業者から供 給された。

用いた試票混合物は以下の通りである。

】　活性化剤　アセトニトリル９０．４５Ｍテトラゾール２、ＣａｐＡ　アセト ニトリル中４０％無水酢酸３、ＣａｐＢ　ピリノン中０６２５％／メチルアミノ ピリツノ４、脱保護剤　ジクロロメタン中２．５％ジクロロ酢酸５　酸化剤：テ トラヒドロフラン中０．１Ｍ　ｆｔ／２．６−ルチジン（ｌｕｔｉｄｉｎｅ）／ 水（７４，８２／２５１０．１８；　ｖ／ｖ／ｖ）６　洗浄液Ａ・３０ｐＩ）ｆ ｆｌ以下の水を含有するアセトニトリル７　洗浄液Ｂ：３０１）ｐ１１以下の水 を含有するアセトニトリル８、モノマー類：全モノマーはアセトニトリルで００ ８Ｍに希釈９、支持体：オリゴマーは、適当なヌクレオシドで誘導体化されたア クリレートビーズ支持体を用いて合成 粗製の、保護されたメチルホスホネートオリゴマーを、アセトニトリル／エタノ ール／ａ水酸化アンモニウム（４５／４５／１０　；　ｖ／ｖ／ｖ）と、室温で ３０分間撹拌することにより、固体支持体から除去した。次いで、等容量のエチ レンジアミン（高品質）を加え、室温で６時間処理することにより、塩基から保 護基を除去した。得られた溶液を水で１０倍希釈した後、氷酢酸で中和した。

オリゴマーを含有する溶液を、業者の指示通りに調製した５ｅｐ−ＰａｋＴｌｌ Ｃ１８カートリツジ０１ｉ１１ｉｐｏｒｅ／マａｔｅｒｓ　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　 ＭＡ）に通す。カラムを水で洗浄し、オリゴマーを水中５０％アセトニトリルで 溶離する。

メチルホスホネートオリゴマーを、さらに、例えば、以下の逆相ＨＰＬＣクロマ トグラフィーで精製する：　Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｇｏｌｄ　ＨＰＬ Ｃを、Ｗｈａｔ＋ｍａｎ　ＲＡＣＩＩ　０ＤＳ−２カラム（５μ、９ｍｍ　ｉ、 ｄ、　ｘ　１００關長さ）と−緒に用いる。バッフｙＡ＝５０１！Ｍトリエチル アンモニウムアセテ−）　（ｐＨ７）：バッファーＢ＝５０％アセトニトリル１ ５０ｍＭ）リエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７）。１０％アセトニトリル ／水中に溶解した試料を外部ポンプを用いてカラムに負荷する。

次いで、カラムを、［１６ｄ＠ａｎ　ＦＩＰＬＣシステムに装着し、０−２０％ バッファーＢのグラディエンドを５分間、次いで、２０−６０％バッファーＢの グラディエンドを４０分間、流速３．０ｍｌ／分で流す。画分を集め、完全長さ のメチルホスホネートオリゴマーを含有する画分を分取し、減圧蒸留し、５０％ アセトニトリル／水に再懸濁する。

アンチセンスオリゴマーを用いる正常ケラチノサイトの増殖阻害文献［バーズガ ードら（Ｂａａｄｓｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｔ、）　Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒ ｍａｔｏｌ、、　９５：２７５−２８２　（１９９０）］記載の方法で、正常な ヒトケラチノサイトを得、ケラチノサイト増殖培地（Ｃ１ｏｎｅｔｉｃｓ、　Ｓ ａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃ＾）で増殖させた。

５０％アセトニトリル／水中のオリゴマーストックを、特記しない限り、培養培 地で少なくとも１００倍希釈し、１度１００μＭとした。培地中のアセトニトリ ルの最高濃度は０５％であった。

細胞は９６ウエルの細胞培養プレートで、ウェル１個当たり、３ｘｌＯ”細胞を プレートした。細胞を００２インキユベーター内で、３７°Ｃに維持した。増殖 ４日後に、特に指示しない限り、３Ｈ−ｄＴ　（１μＣｉ）を加え、標識を６時 間導入した。酸−沈殿可能な標識を集め、ノンチレー／ヨンカウンターで計数し た。

各処置または対照について６個のウェル（レプリケート）を設定して行った。６ つのレプリケートの内、カウントが最高及び最低であるものを除き、残る４つの 値の平均値及び誤差を計算した。

エノクスビポ（ｅｘ　ｖｉν０）で培養した、新たに得た正常なケラチノサイト の、ＩＬ−１α又はＩＬ−１βに対するメチルホスホネート（ＭＰ）アンチセン スオリゴマーによる処置は、サイトカインが標的である場合、増殖に対する効果 を評価するために、評価の時間を様々に変更して行った。結果は、ＩＬ−１α又 は■Ｌ−１βのいずれかを標的とすることにより、培養中の正常なケラチノサイ トの増殖（表１１）（’Ｈ−チミンンのＤＮＡへの取り込みによって測定）を阻 害し、阻害の程度は処置時間の長さに依存しており、アンチセンスで処理した細 胞の増殖速度の減少が証明された。

表ＩＩ ７　２　、　ＬＳｔ　±　１，４７６　−−−７　６６２±２３１　６９％ ７　８６１±２１ａ　６ｏｔ ４Ｌ、Ｌ４：Ｌ　量１１）　５７を ７　５５２　＊　８１１　７０％ ｌ°　・同日の対照に対する比率 増殖阻害の配列特異性を試験するために、ＩＬ−１βオリゴマー（１２５２）と 同じ塩基組成を有するが、２つのヌクレオチドの分子中の位置が交換されたメチ ルホスホネート（”ＭＰ”）オリゴマー、即ち、該オリゴマーは標的遺伝子に対 する親和性が低いか皆無であると予測されるオリゴマーを合成した。オリゴマー を正常なケラチノサイト培養物と１００μＭで４日間インキュベートした。■Ｌ −１β［オリゴマー１　（１２５２）］　と正確に一致するオリゴマーによる正 常なケラ千ノサイト増殖阻害は５４％であったが、不一致なオリゴマー［オリゴ マーＣＩ　（１４８０）］は増殖を阻害せず、本分析の標準偏差の範囲内での、 取り込みの増大を示した（表ＩＩＩ）。オリゴマー１で見られる正常なケラチノ サイト増殖の阻害は配列特異的てあり、オリゴマー０１は配列内の２ヌクレオチ ドの交換によって、添加されたオリゴマーのあらゆる阻害活性を消失していた。

対　ＰｌＩ　４　ｄａｙｓ　［１，０２Ｂ　１　１，１６９　−−−（オリゴマ ーなし） 連続的な細胞供給源を得るために、ヒトケラチノサイト樹立細胞系ＨａＣａＴを も用いた。ＩＥ抱系はケラチノサイトの性質の幾つかを維持しており、特に注目 すべきは、免疫欠損マウスヌードマウス（ＨａｃａＴ細胞系）細胞種したとき、 床端分化するｎヒカを維持しているこブーカンブら（Ｂｏｕｋａｍｐ、Ｐ、　ｅ ｔ、ａｌ、）　Ｊ、Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、１０６：　７６１−７７１　（１９ｇ！（）コ。

ｔ（ａ　Ｃａ　Ｔ細胞系は１０％つ／胎児血清を含有するＤＳＩＥＭ中に維持し た。

オリ：で−ストノクを保存し、実施例２に記載のごとくに希訳した。細胞をブレ ートし、イノキュベートし、標識し、そして沈殿した標識を実施例２記載のごと くに測定した。

記載のオリゴマー１度における、４日後の、ＩＬＬ−βオリゴマー（オリゴマー １）のＨａＣａＴ細胞阻害の濃度依存性を、不一致オリゴマーであるオリゴマー ＣＩのそれと一緒に表ＩＶに示す。用量依存性の、アンチセンスＩＬＬ−βオリ ゴマー（オリゴマー１）によるＨａＣａＴ細胞阻害が観察されたが、２つのヌク レオチドの不一致を有するオリゴマー０１に関しては増殖の減少が認められなか った。ケラチノサイト細胞系でも、正常なヒトヶラチノサイトで観察されたと同 様、アンチセンスＩＬＩ−β［オリゴマー１（１２２５）］による阻害が観察Ｉ ＬＩ−βに対するＭＰ−才リゴマ−によるＨａＣａＴケラチノサイト細胞系の２ ５　：ＬＳ７，５１３　：　１０．１４２　１９％ｍ２，５　１５０．２０５　 ：　１４４９８　１［１１ｔ６．２　１”Ｊユ、ｓ７３　±　６，５８９　２七 ２５　ＬＥ１９．Ｅｌｉ３工４，６５３　話１２．５　１ｆｉｌｌ、１４ｆ量１ ５．６１８　４ｌｇ、２　ｉ９１，５７コ　±　６．５ＢＢ　ハ実施例４ 実施例３に記載しているようにオリゴマー及びＨａＣａＴ細胞を処理した。

オリゴマー１度０−１００μＭによる４日後のＨａＣａＴ細胞のＩＬ−１αオリ ゴマー［オリゴマー３　（１２５１−３）］処置の濃度依存性を、２ヌクレオチ ドの不一致を有するアンチセンスＩＬ−１αオリゴマー［オリゴマーＣ３（１５ ８８−１）］による処置と共に行った。

二の実験にて観察されるＨａＣａＴセルライン発育阻害におけるＩＬ−１αの役 割は正常なケラチノサイトを使用する実施例２に記載したものよりも明瞭さが低 かった。アンチセンスＩＬ−１αオリゴマー（オリゴマー３）を添加しても、Ｈ ａＣａＴ細胞の発育は有意に減少せず、それは不一致対照オリゴマーＣ３と効果 の面で順似していた。この知見はＨａＣａＴセルラインと培養ヒトケラチノサイ トとの相違を反映するものである。

実施例２及び３に記載のようにしてオリゴマー及び細胞を処理した。

細胞内ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ｉ　ｃ　ＩＬ−１ｒａ）はアンチセンス ＭＰオリコマ−に標的化され、ケラチノサイト増殖におけるその役割が研究され て９９０））。細胞内ＬＬ−１ｒａはそれにとってはユニークであるが、ＩＬ− １ｒａの可溶性形態にとってはユニークでない開始コドン領域を有している。こ の領域は遺伝子産物の細胞内型と可溶性形態とを区別するためのユニークな標的 を与える。１ｃｌＬ−１ｒａに対するアンチセンスＭＰオリゴマーを正常なヒト ケラチノサイトとインキュベートすると、発育が＞９０％で強く阻害された。１ ｃｌＬ−１ｒａとＩＬ−１βとはタンパク貢としてそのアミノ酸配列が強く相同 的であるので、１ｃｌＬ−１ｒａはＩＬ−１βと同様の細胞内機能を有している 可能性があり　［ｋｌａｒｃｈ、　Ｃ，Ｊ、　、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎ ｄ、）　３１５＋６４１　（１９８５）］　、］処ｃ　ＩＬ　１　窒■ は細胞内において受容体アンタゴニストとしての役割を果たさない場合がある。

対照（オリゴマー無し）　２　６．６３０±１．２１８　−−−４　１３．９８ １土２，７２２　−−−４　２　４７９±７８９２％ ［ＩＬ−１ｒａ 細胞内スプライス変異体　４２９３±１８９７％（１４８７−２）］ １）同日対照に対する比較 種々の１度のオリゴマー４（１４８７）をＨａＣａＴ細胞と共に用いて、ケラチ ノサイト培養物における１ｃｌＬ−１ｒａの役割を調査した（表Ｖｌを参照）。

ｉｃ’ＩＬ−１ｒａに対するアンチセンスオリゴマー（オリゴマー４）は最も高 い濃度では、インキュベーション４日後に増殖を６０％阻害した。しかし、オリ ゴマー４の１度を減少させても減少は示されず、１２５及び６．２５μＭオリゴ マーの間にその効能の急激な変化が起こった。最も高い濃度のオリゴマー４にお けるＨａＣａＴ細胞の阻害は正常なケラチノサイト培養物を用いて観察される観 察事項と同様であった（第７表）。オリゴマー４（１４８７）から変換された４ ヌクレオチドを有する不一致オリゴマーのオリゴマーＣ４（１６０７）はケラチ ノサイト増殖を阻害しなかった。表Ｖ及び表Ｖｌは、１ｃｌＬ−１ｒａがケラチ ノサイト増殖を調節するうえて機能的な役割を果すことのできることを示してい 月ｄ酊遵二ビ旦ヨ土明工艶ヱシュ玉ヒ によるＨａＣａＴ細胞の阻害 対照（オリゴマー無し）１０９．２６４±１６３４　１００　４９、５１８±７ ．８４０　６２％［Ｉ　Ｌ−１ｒ　ａ　５０　１２０．０７３±１１．５３７　 ８％細胞内スプライス変異体　２５１０９．８５２±２６．４７２　１６％（＋ ４８７−３）コ　１２．５　９７．３７１　±　３５．１５５　２５　％６．２ 　１６６．９５４±９．９９４　（＋２８％）Ｃ４１００１５３，７１１±３７ ．７４７　（４１８％）［Ｉ　Ｌ−１ｒ　ａ　５０　１５８．４９３±６．７０ ０　（＋２０　％）細胞内スプライス変異体　２５　１７０．４７０土１７．７ ６７　（＋３１％）に対して不一致（１６０７−１）１　１２．５　１３９．９ ９０±３０．９８３　（＋　８％）６．２　１８６．８３６±２６．１０１　（ ４４３％）フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３１／７０　 ＡＣＪ ４８１００　８３１４−４Ｃ Ｃ１２Ｎ　１５１０９ （７２）発明者　ハンメルバーグ、クライグアメリカ合衆国４８１５９ミシガン 、マンチェスター、イングリッシュ・ロード１７２４１番Ｉ （７２）発明者　マックスウェル、カメロン・ダブリューアメリカ合衆国９２０ ６７カリフオルニア、ランチョ・サンタ・フエ、アベニダ・カルマ工１６０３旙 （７２）発明者　ツエン、ペン・ワイ アメリカ合衆国９２１３０カリフォルニア、サン・ディエゴ、キャブストン・ド ライブ１３２５番

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）細胞内に存在する標的遺伝子から転写されるＲＮＡの配列に相補的な 配列を有するアンチセンスオリゴマー、（ｂ）細胞内に存在する標的遺伝子の選 択された２本鎖核酸配列に相補的な配列を有する第３鎖オリゴマー、及び（ｃ） 標的遺伝子又はその転写産物の１本鎖核酸配列に相補的な３重らせんオリゴマー 対、の中から選択されるオリゴマーの過剰増殖阻害量を、ヒフ又は上皮細胞に暴 露することにより細胞の過剰増殖を減少させることを特徴とする、ヒフ又は上皮 細胞の過剰増殖によって特徴付けられる病態を処置する方法であって、該標的遺 伝子が、細胞増殖を媒介するサイトカイン、サイトカインの調節因子、サイトカ インの前駆体を活性なサイトカインに変換する変換酵素又はサイトカインの機能 にとって重要な該サイトカインの翻訳又は翻訳後修飾に関与する酵素をコードす る遺伝子、の中から選択される方法。
2. ２．該標的遺伝子が細胞内メカニズムを介して細胞増殖を調節するものである請 求項１に記載の方法。
3. ３．該標的遺伝子が１Ｌ−１α、１Ｌ−１βもしくはｉｃＩＬ−１ｒａ又はＩＬ −１β変換酵素をコードしている請求項２に記載の方法。
4. ４．該病態がケラチノサイトの良性の過剰増殖を包含する請求項２に記載の方法 。
5. ５．該病態がケラチノサイトの悪性の過剰増殖を包含する請求項２に記載の方法 。
6. ６．該病態が非表皮の上皮細胞の良性の過剰増殖を包含する請求項２に記載の方 法。
7. ７．該病態が非表皮の上皮細胞の悪性の過剰増殖を包含する請求項２に記載の方 法。
8. ８．該病態が乾癬である請求項２に記載の方法。
9. ９．該病態が、１Ｌ−１α、１Ｌ−１β又はｉｃ１Ｌ−１ｒａ産生によって調節 されるサイトカイン放出が永続している慢性炎症性疾患である請求項２に記載の 方法。
10. １０．該慢性性炎症疾患が、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、及び炎症 性眼疾患の中から選ばれる請求項９に記載の方法。
11. １１．該オリゴマーが中性オリゴマーである請求項１に記載の方法。
12. １２．該オリゴマーがアンチセンスオリゴマーである請求項１に記載の方法。
13. １３．該オリゴマーが第３鎖オリゴマー又は３重らせんオリゴマー対である請求 項１に記載の方法。
14. １４．（ａ）細胞内に存在する標的遺伝子から転写されるＲＮＡの配列に相補的 な配列を有するアンチセンスオリゴマー、（ｂ）細胞内に存在する標的遺伝子の 選択された２本鎖核酸配列に相補的な配列を有する第３鎖オリゴマー、及び（ｃ ）標的遺伝子又はその転写産物の１本鎖核酸配列に相補的な３重らせんオリゴマ ー対、の中から選択されるオリゴマーの過剰増殖阻害量をヒフ又は上皮細胞に暴 露することを特徴とする、ヒフ又は上皮細胞の過剰増殖を防止し又は減少させる 方法であって、該標的遺伝子が、細胞増殖を媒介するサイトカイン、サイトカイ ンの調節因子、サイトカインの前駆体を活性なサイトカインに変換する変換酵素 、又はサイトカインの機能にとって重要な該サイトカインの翻訳又は翻訳後修飾 に関与する酵素をコードする遺伝子、の中から選択される方法。
15. １５．該サイトカイン又は受容体アンタゴニストが細胞内メカニズムを介して細 胞増殖を媒介する請求項１４に記載の方法。
16. １６．該オリゴマーが中性オリゴマーである請求項１４に記載の方法。
17. １７．オリゴマーがアンチセンスオリゴマーである請求項１４に記載の方法。
18. １８．該オリゴマーが第３鎖オリゴマーである請求項１４に記載の方法。
19. １９．細胞の過剰増殖を防止し又は減少させる方法であって、インターロイキン −１又は細胞内インターロイキン−１受容体アンタゴニスト活性を減少させるイ ンクーロイキン−１阻害化合物の増殖阻害量に該細胞を接触させることを特徴と する方法。
20. ２０．該細胞が上皮細胞である請求項１９に記載の方法。
21. ２１．該インターロイキン−１阻害化合物が、インターロイキン−１発現を防止 し又は減少させる化合物、又はインターロイキン−１の前駆体の活性型への変換 を阻害し又は減少させる化合物の中から選択される方法。
22. ２２．該インターロイキン−１阻害化合物がインターロイキン−１変換酸素の合 成を阻害又は減少させるか、又はインターロイキン−１変換酵素の活性を阻害す る請求項２１に記載の方法。
23. ２３．該インターロイキン−１阻害化合物が、インターロイキン−１、インター ロイキ−１調節因子又はインターロイキン−１変換酵素の発現を防止し又は減少 させるオリゴマーである請求項１９に記載の方法。
24. ２４．インターロイキン−１阻害化合物が細胞内インターロイキン−１受容体ア ンタゴニスト活性を減少させる化合物の中から選ばれる請求項１９に記載の方法 。
25. ２５．（ａ）細胞内に存在する標的遺伝子から転写されるＲＮＡの配列に相補的 な配列を有するアンチセンスオリゴマー、（ｂ）細胞内に存在する標的遺伝子の 選択された２本鎖核酸配列に相補的な配列を有する第３鎖オリゴマー、及び（ｃ ）標的遺伝子又はその転写産物の１本鎖核酸配列に相補的な３重らせんオリゴマ ー対、の中から選択されるオリゴマーの過剰増殖阻害量、及び製薬的に許容され る担体を含有する医薬組成物であって、該標的遺伝子が、細胞増殖を媒介するサ イトカイン、サイトカインの調節因子、サイトカインの前駆体を活性なサイトカ インに変換する変換酵素、又はサイトカインの機能にとって重要な該サイトカイ ンの翻訳又は翻訳後修飾に関与する酵素をコードする遺伝子、の中から選択され る組成物。
26. ２６．該標的遺伝子が１Ｌ−１α、１Ｌ−１β、ｉｃ１Ｌ−１ｒａ又は１Ｌ−１ β変換酵素をコードしている請求項２５に記載の組成物。
27. ２７．該オリゴマーが中性オリゴマーである請求項２５に記載の組成物。
28. ２８．フラックス促進剤をさらに含有する請求項２７に記載の組成物。
29. ２９．該標的遺伝子が１Ｌ−１α、１Ｌ−１β、ｉｃ１Ｌ−１ｒａ又は１Ｌ−１ β変換酵素をコードしている請求項２７に記載の組成物。
30. ３０．フラックス促進剤をさらに含有する請求項２９に記載の組成物。
31. ３１．インターロイキン−１又は細胞内インターロイキン−１受容体アンタゴニ スト活性を減少させるインターロイキン−１阻害化合物の過剰増殖阻害量及び製 薬的に許容される担体を含有する医薬組成物。
32. ３２．該インターロイキン−１阻害化合物が、インターロイキン−１の発現を防 止し又は減少させる化合物、又はインターロイキン−１前駆体の活性型への変換 を阻害し又は減少させる化合物から選択される請求項３１に記載の組成物。
33. ３３．該インターロイキン−１阻害化合物が、インターロイキン−１変換酵素の 合成を阻害し又は減少させるか、又はイン−ロイキン−１変換酵素の活性を阻害 する請求項３１に記載の組成物。
34. ３４．インターロイキン−１阻害化合物が細胞内１Ｌ−１ｒａ活性を減少させる 化合物の中から選ばれる請求項３１に記載の組成物。
35. ３５．インターロイキン−１阻害化合物がインターロイキン−１、インターロイ キン−１調節因子又はインターロイキン−１変換酵素の発現を防止し又は減少さ せるオリゴマーである請求項３１に記載の組成物。
36. ３６．該オリゴマーが中性オリゴマーである請求項３５に記載の組成物。
37. ３７．フラックス促進剤をさらに含有する請求項３５に記載の組成物。
38. ３８．該インターロイキン−１阻害化合物がオリゴマーである請求項３１に記載 の組成物。
39. ３９．該オリゴマーか中性オリゴマーである請求項３８に記載の組成物。
40. ４０．フラックス促進剤をさらに含有する請求項３９に記載の組成物。