JPH07507921A - トランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトヘモグロビンの生産のためのトランスジェニックブタの使用に関す る。本発明のトランスジェニックブタは、ヒトの輸血や他の医学的応用に用いる ことのできる無細胞ヒトヘモグロビンの効率的かつ経済的な供給源として用いる ことができる。

肺を通して吸収された酸素は、輸送赤血球中のヘモグロビンによって体全体の組 織に運ばれる。高酸素圧、例えば、肺付近に見られる酸素圧では、酸素はヘモグ ロビンに結合するが、酸素が必要な低酸素圧部分では放出される。

それぞれのヘモグロビン分子は、２つのαグロビンと２つのβグロビンのサブユ ニットからなる。さらに、それぞれのサブユニットは酸素分子を輸送できる鉄含 有ヘム基に非共有的に結合している。従って、それぞれのヘモグロビン４量体は ４分子の酸素と結合できる。これらのサブユニットは、それぞれ肺と組織におけ る酸素の取り込みと放出を促進する２つのコンフォメーション状態間をスイッチ して共同的に働く。この効果は通常ヘム−ヘム相互作用又は協同作用と呼ばれて いる。

多くの動物のヘモグロビンは酸素の結合と放出をさらに促進できる生物的なエフ ェクター分子との相互作用が可能である。この促進はヘモグロビンの２つのコン フォメーション状態間のアロステリックな平衡に影響を与える変化において明ら かに示されている。例えば、ヒトとブタのヘモグロビンは、４量体の２つのコン フすメーション状態間の平衡に影響を与える２、３ンホスホグリセレート（２， ３ＤＰＧ）に結合することができ、酸素に対する全体的な親和性を組織レベルで 低下させる最終的な効果を有する。その結果、２．３−ＤＰＧは組織への酸素輸 送の効率を高める。

２．２．グロビン遺伝子の発現 ヘモグロビンタンパク質は、赤血球細胞内で組織特異的に発現され、そこでは、 それは全細胞タンパク質の約９０パーセントを占めている。従って、その核を失 いかつ最小数を残して全てのオルガネラを失った赤血球は、効率的に膜に包まれ た、酸素輸送のために働いたヘモグロビンの束になる。

ヒト及び多様な他の種は、胚、胎児、及び成体の発達期間中に異なるタイプのヘ モグロビンを作る。従って、グロビン遺伝子発現に影響を与える因子は、グロビ ン発現の組織特異的制御、量的制御、及び発達的に調節された制御を達成できな ければならない。

ヒトグロビン遺伝子は、αグロビンの染色体１６上とβグロビンの染色体ＩＩ上 のクラスター中に認められる。ヒトβグロビン遺伝子クラスターは、εグロビン をコードする１つの胚遺伝子、γＧとγＡグロビンをコードする２つの胎児遺伝 子、及びδ及びβグロビンをコードする２つの成体遺伝子をこの順序で含む約５ ０ｋｂのＤＮＡからなる（Ｆｒｉｔｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　１り８０．　Ｃｅ１ ｌ　１９：９５０−９７２）。

βグロビン翻訳開始部位の上流と下流の両方のＤＮＡ配列がβグロビン遺伝子発 現の調節に関与していることが発見された（Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：２６３）　。特に、ヒトβグロビン遺伝子の約５０ キロベース上流に位置する一連の４つのＤｎａｓｅｌ超過敏性部超過現性部位調 節領域又はＬＣＲと呼ばれている）は、適当に調節されたβグロビン−座発現を 引き出す際に非常に重要である（Ｔｕａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

８３：１３５９−１３６３　；　ＰＣＴ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ ｎ　ＷＯ８９０１５１７ｂｙＧｒｏｓｖｅｌｄ　；　Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、、１９８９．　５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：９７１−９７３　；Ｅｎｖｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｃｌ、　Ｓ ｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８６：７０３３−７０３７　；　Ｈａｎｓｃｏｍｂｅ 　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　３：１５７２−１５８１ 　；　Ｖａｎ　Ａｓ５ｅｎｄｅｌｆｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．　Ｃｅ１ｌ　 ５６：９６７−９７７　；Ｇｒｏｓｖｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｃ ｅ１ｌ　５１：９７５−９８５）。

２．３．血液代用品の必要性 最近、グロビン遺伝子発現の分子的特徴はさらに大きな興味と遭遇しているが、 これは提供者により作られた血液の危険性を避けれる合成血液を作るために研究 者が遺伝子工学を用いる試みを行っているためである。１９８８年には、３２． ０００．０００〜１４．０００．０００単位の血液が米国だけで用いられ（Ａｎ ｄｒｅｗｓ、　１９９０年２月１８日付けのニューヨークタイムズ）、莫大な量 が不安定なボランティアの血液提供者に依存している。約５パーセントの提供血 液が肝炎ウィルスにより感染されており（同新聞）、ＨＩＶ感染のスクリーニン グ操作は一般的に効果的ではあるものの、輸血関連エイズにかかるかなり恐ろし い可能性が依然として残っていると見込まれている。さらに、輸血血液は輸血を 受ける者の血液型に適合しなければならないが、提供血液の供給では、稀な血液 型を持つ個体に輸血できないかも知れない。対照的に、遺伝子工学により作られ るヘモグロビンは血液型の一致を必要とせず、無ウィルスであり、潜在的に無制 限の量が利用できるであろう。幾つかの研究グループが微生物内でヘモグロビン を発現する可能性を検討している。例えば、ヒトヘモグロビンタンパク質の大腸 菌内での生産を実施例で示しているＨｏｆｆｍａｎとＮａｇａｉによる国際出願 Ｎｏ。

ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１５３４を参照のこと。

２．４．　トランスジェニック動物 トランスジェニック動物は、トランスジーンと呼ばれる少なくとも一つの外来遺 伝子をその遺伝物質中に有している非ヒトの動物である。好ましくは、トランス ジーンは動物の子孫に伝えられるよう動物の生殖系に含まれる。受精卵の前核内 へのトランスジーンのマイクロインジェクション及び胚幹細胞のマニピユレーシ ヨンを含むがこれらに限定されない多くの技術を用いてトランスジーンを動物の 遺伝子物質中に導入することができる（Ｕ、Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４，８７３，１９１　ｂｙ　Ｗａｇｎｅｒ　ａｎｄ　１ ｌｏｐｐｅ；　Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ　ａｎｄＢｒｉｎｓｔｅｒ、　１９８６．　Ａ ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０：４６５−４９９；　１９８７年８月７ 日公告のＦｒｅｎｃｈ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　２５９３８２ ７）。トランスジェニック動物は、すべての細胞中にトランスジーンを有しても よく又は遺伝的にモザイクであってもよい。

はとんどの研究はトランスジェニックマウスにかかわるものであったが、他の種 のトランスジェニック動物、例えばウサギ、ヒツジ、ブタ（Ｈａｍｍｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：６８０−６８３）及びニワト リ（Ｓａｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５７：２ ３６−２４０）も作られてきた。トランスジェニック動物は、有用な薬剤化合物 製造のバイオリアクターとして役立てるために現在開発中である（Ｖａｎ　Ｂｒ ｕｎｔ、　１９８８．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１１４９−１１５ ４；　Ｗｉｌｍｕｔ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８Ｂ、　Ｎｅｗ　５ｃｉｅｎｔｉｓｔ　（７月７日号）　ｐｐ、　５６−５ ９）。

トランスジェニック家畜による組換えタンパク質の発現方法は組換えバクテリア や酵母でのタンパク質の生産よりも重要な理論的利点を有している。即ち、グリ コジル化、リン酸化、サブユニットアセンブリ等を含む翻訳後修飾が分子活性に よって非常に有用である大きくて複雑なタンパク質を生産する能力がある。

しかし、実際はトランスジェニック家畜の作成は問題があることがわかっている 。トランスジェニック胚を作ることが技術的に困難なだけではなく、有意な量の 組換えタンパク質を生産する成熟トランスジェニック動物は生存不能であること がわかっている。

特にブタにおいては、成長ホルモンをコードするトランスジーン（本発明以前に ブタに導入された唯一のトランスジーン）を有するブタは、激しい関節炎、後ろ 足の共同的運動の欠如、ストレス敏感、雄ブタの無発情及び雄ブタの性衝動の欠 如を含む多くの健康的問題を被ったことを経験している（Ｗｉｌｍｕｔ　ｅｔ　 ａｌ、の前記文献）。このことは、健康であるように見える成長ホルモントラン スジーンを有するトランスジェニックマウスとは対照的である（Ｐａｌｍｉｔｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３００：６１１−６１５）　ｏ従って、本 発明以前には（トランスジーンを効率的に発現する）健康なトランスジェニック ブタは作られていない。

２、　５．　トランスジェニック動物内でのグロビン遺伝子の発現ヒトグロビン トランスジーンを有するトランスジェニックマウスは、グロビン遺伝子発現の分 子生物学の研究に用いられてきた。

ハイブリッドマウス／ヒト成体βグロビン遺伝子は１９８５年にＭａｇｒａｍら により記載された（Ｎａｔｕｒｅ　３１３：３３８−３４０）　、次いで、Ｋｏ ｌｌｉａｓらは、トランスジェニックマウス内でのヒトγ−Ａ、β、及びハイブ リッドβ／γグロビン遺伝子の調節された発現を報告した（１９８６．　Ｃｅ１ ｌ　４６：８９−９４）　、ヒト胎児γグロビンを発現するトランスジェニック マウスは、Ｅｎｔｅｒら（１９８９，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８６：７０３３−７０３７）及びＣｏ ｎ５ｔａｎｔｏｕｌａｋｉｓら（１９９１，Ｂｌｏｏｄ　７７：１３２６−１３ ３３）により研究された。トランスジェニックマウス中でスイッチするヒト胚グ ロビン遺伝子の自律的な発達制御はＲａ１ｃｈらにより観察された（１９９０． 　Ｓｃ：ｅｎｃｅ　２５０＋１１４７−１１４９）。

ヘモグロビン又はヘモグロビン発現の多様な障害のトランスジェニックマウスモ デルが開発されており、それには鎌状赤血球病（Ｒｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、１ ９８８．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ、　４２：５８５−５９１　 ；Ｇｒｅａｖｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０．　Ｎａｔｕｒｅ　３４３：１８３ −１８５　；　Ｒｙａｎ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９０、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：５６６−５６８　；　Ｒｕｂｉｎ　ｅｔ　 ａｌ、、１９９１．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、、　８７：６３９−６４７）　；地中海貧血（Ａｎｄｅｒｓｏｎ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５゜Ａｎｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、（ＵＳＡ）　４４５：４４５−４５１　；　５ｏｒｅｎｓｏｎ　ｅｔａｌ、 、　１９９０．　Ｂｌｏｏｄ　７５：１３３３−１３３６）　；及び胎児ヘモグ ロビンの遺伝的持続性（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ。、　１９９０．　Ａｎｎ、 　Ｎｅｗ　Ｙｎｒｋ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）　６１２：１６７−１７８）が含まれる。

ヒトα及びβグロビンの同時発現によってトランスジェニックマウス内でのヒト ヘモグロビンの生産がもたらされた（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９ ８９．　５ｃｉｅｎｃｅ　２４５：９７１−９７３　；　Ｔｏｗｎｅｓ　ｅｔ　 ａｌ。

、Ｈ）８９．　Ｐｒｏｇ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｓ、　３１６Ａ：４ ７−６１　：　Ｈａｎｓｃｏｍｂｅ　ｅＬ　ａｌ、。

１９８９、　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　３：１５７２−１５８１）　、βではなく αをコードするトランスジーンの高コピー数を持つトランスジェニック胎児は激 しい貧血を示し出産前に死ぬことがＨａｎｓｃｏｍｂｅら（上記文献）により観 察された。βグロビン遺伝子の制御下でヒトαグロビン遺伝子及びβグロビン遺 伝子の両方を有する構築物を用いて、低コピー数の生きたマウスが得られた（同 文献）。代謝標識実験では、均衡のとれたマウスグロビンの合成が示されたが、 ヒトグロビンは不均衡に合成され、約０．６のα／β生合成比であった（同文献 ）。

３、発明の要旨 本発明は、ヒトヘモグロビン及び／又はヒトグロビンの生産のためのトランスジ ェニックブタの使用に関する。それは、少なくとも部分的に、それらの赤血球中 でヒトヘモグロビンを発現し、かつ異種のヘモグロビン生産の結果としての有害 な作用を受けずに健康であるトランスジェニックブタを生み出すことができると いう発見に基づいている。

特定の態様においては、本発明はヒトグロビン遺伝子を発現するトランスジェニ ックブタを提供する。かかる動物は、（ｉ）ブタの妊娠と性的成熟の期間が比較 的短いこと；　（ｉｉ）同産児の大きさと数；　（ｉｉｉ）ブタの大きさが比較 的大きく比較的高い収率でヘモグロビンを供給すること；及び（ｉｖ）酸素結合 親和性の調節においてブタヘモグロビンとヒトヘモグロビンの間で機能的に類似 性があり高レベルのヒトヘモグロビンの存在下でトランスジェニックブタが健康 であり続けることが可能である、という観点から特に効率的かつ経済的なヒトヘ モグロビン供給源として用いることができる。

本発明はトランスジェニックブタを生み出すために用いることのできる組換え核 酸構築物も提供する。好ましい態様においては、かかる構築物は、グロビン鎖不 均衡の有害作用及び／又は不適当な細胞型（例えば、未発達な赤血球）における 構成βグロビンプロモーター活性による転写因子の測定を避けるために、同じプ ロモーターの下にヒトのαグロビン遺伝子及びβグロビン遺伝子を配置する。本 発明の他の好ましい態様においては、この構築物は、プロモーター又はブタβグ ロビン遺伝子の３′領域を含むブタ成体βグロビン遺伝子調節領域を含む。

更なる態様においては、本発明はヒトαグロビン及びブタβグロビンを含むハイ ブリッドヘモグロビンを提供する。このハイブリッドヘモグロビンを発現するト ランスジェニックブタからの全血は、天然のヒト又はブタ血液よりも有利に高い Ｐ、。を示すようである。

本発明は、（ｉ）適当な１つのプロモーター又は複数のプロモーターの制御下で ヒトαグロビンとヒトβグロビンの遺伝子をブタの遺伝子物質に導入して、少な くとも幾つかの赤血球中でヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタを作 り；　（ｉｉ）このトランスジェニックブタから赤血球を採集し；　（ｉｉｉ） 採集した赤血球の内容物を放出させ；そして（ｉｖ）赤血球の放出された内容物 を、ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンとに実質的に分離する精製操作に供す ることを含む、ヒトヘモグロビンの製造方法も提供する。本発明の好ましい態様 においては、ヒトヘモグロビンをＤＥＡＥ陰イオン交換カラムクロマトグラフィ ーによりブタヘモグロビンから分離することができる。

４、図面の説明 図１６組換え核酸構築物 Ａ、構築物ααβ（“１１６”構築物）；Ｂ、構築物αｐβ（“１８５”構築物 ）：Ｃ０構築物βｐα（“２９０”構築物）；Ｄ、構築物εｐζβα；Ｅ、構築 物ζｐεαｐβ；Ｆ、β１０８Ａｓｎ−＞Ａｓｐ変異を有する構築物αｐβ（“ ヘモグロビンヨシズカ構築物″）；Ｇ、β１０８Ａｓｎ−＞Ｌｙｓ変異を有する 構築物αｐβ（“ヘモグロビンプレスビテリアン構築物”）；Ｈ，ＬＣＲαと共 にインジェクトされた構築物αｐβ（Δα）（“２８５”構築物）　；　Ｉ、　 ａ　１３４Ｔｈ　ｒ−＞Ｃｙｓ変異を有する構築物αｐβ（“２２７”構築物） ：Ｊ、α１０４ｃｙｓ−＞Ｓｅｒ変異（″２２７″構築物）、β９３Ｃｙｓ−＞ Ａｌａ変異、及びβ１１２Ｃｙｓ−＞Ｖａ　Ｉ変異（“２２８”構築物）を有す る構築物αｐβ；に、構築物αｐδ（“２６３”構築物）；及びＬ−ＬＣＲαと 共にインジェクトされた構築物αｐδ（Δα）（“２７４”構築物）；Ｍ、ＬＣ Ｒεβと共にインジェクトされた構築物ＬＣＲα（“２４０″構築物）；Ｎ、Ｒ ６１Ｌｙ　ｓ−＞Ｍｅ　を変異を有する構築物αｐβ（“ヘモグロビンポロンガ 構築物″）；０．構築物ＬＣＲεαβ（“３１８”構築物）；Ｐ、構築物ＬＣＲ αεβ（“３１９”構築物）；Ｑ、構築物ＬＣＲααεβ（“３２９”構築物） ；Ｒ１構築物ＬＣＲαε（２°“βｐ）β（“３３９”構築物）；Ｓ、α７５Ａ ｓｐ−＞Ｃｙｓ変異を有する構築物αｐβ（“３４０”構築物）；Ｔ、α４２Ｔ ｙｒ−＞Ａｒｇ変異を有する構築物αｐβ（“３４１”構築物）；Ｕ、構築物Ｌ ＣＲεβαα（“３４３”構築物）；Ｖ、構築物ＬＣＲεβα（“３４７”構築 物）；Ｗ、α４２Ｔｙｒ−＞Ｌｙｓ変異を有する構築物αｐβ；Ｘ、　α４２Ｔ ｙｒ−＞Ａｒｇ変異及びＲ９９Ａｓｐ−＞Ｇｌｕ変異を有する構築物αｐβ；Ｙ 、α４２Ｔｙｒ−＞Ｌｙｓ変異及びＲ９９Ａｓ　ｐ−＞Ｇ　Ｉ　ｕ変異を有する 構築物αｐβ 図２．トランスジェニックブク 図３．トランスジェニックブタ内でのヒトヘモグロビン発現の証明。Ａ１等電点 電気泳動ゲル分析。Ｂ、ヒト血液を代表する赤血球の溶血産物のトリトン−酸性 尿素ゲル（レーンｌ）；トランスジェニックブタ１２−１からの血液（レーン２ ）、９−３からの血液（レーン３）、及び６−３からの血液（レーン４）；及び ブタ血液（レーン５）は、トランスジェニック動物内でのヒトαグロビンに比較 したヒトβグロビンの発現不十分を示す。

図４．ヒトヘモグロビンとブタヘモグロビンのＤＥＡＥクロマトグラフィーによ る分離。Ａ、ヒトとブタの赤血球の溶血混合物：Ｂ、トランスジェニックブタ６ −３から採集した赤血球の溶血産物。Ｃ，ヒトとマウスのヘモグロビンはこれら の条件下ではＤＥＡＥクロマトグラフィーにより分離しない。Ｄ、ブタヘモグロ ビンから精製されたヒトヘモグロビンの等電点電気泳動。

図５．再結合したブタヘモグロビンの等電点電気泳動ゲル（レーンｌ）；再結合 したブタ／ヒトヘモグロビン混合物（レーン２とレーン４）；再結合したブタヘ モグロビン（レーン３）；及びトランスジェニックブタヘモグロビン（レーン５ ）。

図６．ヒトヘモグロビンのＱＣＩＰクロマトグラフィーによる分離。

図７．トランスジェニックヘモグロビンの酸素親和性。

図８．プロモーター領域を含むブタ成体βグロビン調節領域のＤＮＡ配列。ブタ βグロビン遺伝子のＡＴＧ開始コドン（ボックス内）の上流８６９塩基対まで伸 びる配列を示す。ｍＲＮＡの開始位置、つまりキャップ部位を矢印で示している 。ＧＡＴＡ転写因子結合部位に相当する配列に下線を付している。

図９．ブタβグロビン調節配列（上方）とヒトβグロビン調節配列（下方）の比 較。これら２つの配列の相違点に星印を付しである。

図１０．ブタとヒトの成体βグロビン遺伝子調節配列間の相同性（％）を描いた グラフ。開始コドンからの塩基対距離を横座標にとった。マウスとヒトの配列の 比較も示す（誤差帯を伴う破線）。

図１１．図８に示したＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐｇｅｍ５／ｐ　ｉ　ｇ ＢＰ　ｒ　（ｋ）の地図。

図１２．トランスジェニックブタ内でのヒトヘモグロビン生産のための３３９及 び３５４カセツトを表す。

図１３．ブタε遺伝子を含有するプラスミドｐＳａｆ／Ｐｉｇε（ｋ）の地図。

図１４．トランスジェニックブタ内でのε２゛１、β１”１”及びαｈｕｍ＋” ヘモグロビンの生産のための４２６及び４２７発現カセットを表す。

図１５．３３９構築物を有するトランスジェニックブタ７ｏ−３により、及び１ １６構築物を有するトランスジェニックブタ６−３により生産されたヘモグロビ ンの等電点電気泳動ゲル。ヒトヘモグロビンをスタンダードとして泳動させてい る。

図１６．ブタβグロビン遺伝子の３°末端を含有するプラスミドｐｉｇ３’βの 地図。

図１７．構築物“３３９”　（図ＩＲを参照のこと）がら得られたトランスジェ ニックブタ。ヒトヘモグロビン発現のレベル及びコピー数を示す。

図１８．構築物“３３９”を用いて得られたトランスジェニックブタ内のヘモグ ロビンレベルの等電点電気泳動ゲル。

図１９．　″１８５″′構築物（又はαｐβ構築物；図ＩＢを参照のこと）を有 する代表的トランスジーン陽性３８−４子孫内でのヘモグロビン発現のレベルを 示す等電点電気泳動ゲル。

図２０．　ハイブリッドヒトα／ブタβ及びヒトα／ヒトβヘモグロビン分子の 分子モデリング。βサブユニットは青色であり、αサブユニットは赤色である。

βヒト（青色）の中央のへリックスの上に緑色で縁取りした切れ目を見ることが できる（矢印のところ）。ハイブリッドではこの切れ間が充填されている。

この相違は、バリンがより大きな疎水性相互作用に貢献しているβ１１２Ｃｙｓ −−−＞Ｖａ　ｌにおける変化のためである。

図２１１位置１１２においてＣｙｓを含有するβグロビン（黄色分子）と位置１ １２においてＶａｌを有するβグロビン（白色分子）間のα１β２界面における 相違を示す分子モデリング。

Ｃｙｓは黄色でＶａｌは白色であり、対立するα界面は赤色である。Ｖａｌは柔 軟である。その枝の１つのアームは、αサブユニット残基に対して殆ど完全に適 合するために容易に動くことができる。黄色のＣｙｓは、僅かに更なる小さな切 れ目の余地を残している（矢印のところ）。バイオシンのスタンダード欠如ファ ンデルワールス間隔（Ｂｉｏｓｙｎ’ｓ　５ｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｆａｕｌｔＶ ａｎ　ｄｅｒ　Ｗａａｌ’ｓ　ｄｉｓｔａｎｃｅ）を用いた。

図２２．トランスジェニックブタ溶血産物からのＨｂブレスビテリアンの精製。

図２３．ヘム部分、ブタαグロビン（“ｐα″）、ヒトβグロビン（“ｈβ″） 、ヒトαグロビン（“ｈα”）及びブタβグロビン（“ｐβ”）の分離を示すＨ ＰＬＣによる精製Ｈｂプレスビテリアンの特徴付け。

図２４．Ｈｂプレスビテリアンについての酸素結合曲線。

図２５．トランスジェニックブタ溶血産物からのＨｂヨシズカの精製。

（本頁以下余白） ５、発明の詳細な記述 本発明は、トランスジェニックブタ（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｉｇ）を利用し たヒトヘモグロビンの製造方法、グロビンをコードする新規核酸構築物、そして ヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタを提供するものである。限 定するためではなく、記述を明確にする目的で、発明の詳細な記述を以下の分節 に分ける：Ｎ）グロビン遺伝子構築物の作製： （ｉｉ）　トランスジェニックブタの作製；（ｉｉｉ）ヒトヘモグロビンの作製 およびブタヘモグロビンからのヒトヘモグロビンの分離； そして （ｉｖ）ヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの作製。

５．１．グロビン遺伝子構築物の作製 本発明は、トランスジェニックブタ内でヒトグロビンおよび／またはヘモグロビ ンを製造する方法を提供する。ここではヒトヘモグロビンを、ヒトグロビン遺伝 子（アルファ、ベータ、デルタ、ガンマ、イプシロンおよびゼータ遺伝子を含む ）によってコードされたグロビン鎖により形成された天然のまたは遺伝子工学の 産物としてのヘモグロビンまたはその変異型として定義する。これらの変異型は 天然のヒトヘモグロビンに対しアミノ酸配列において少なくとも９０％の相同性 を有するものである。好ましい態様において、本発明のヒトヘモグロビンはヒト アルファグロビンおよびヒトベータグロビン鎖を含むものである。本発明のヒト ヘモグロビンは少なくとも２つの異なるグロビン鎖を含むが、２つ以上のグロビ ン鎖を含んでもよく、例えば・１量体分子、８量体分子などを形成する。本発明 の好ましい態様においては、ヒトヘモグロビンは２本のヒトアルファグロビン鎖 および２本のヒトベータグロビン鎖からなっている。以下に述べるように、本発 明はヒトαグロビンとブタβグロビンからなるハイブリッドヘモグロビンをも提 供する。

本発明の特定の態様によれば、ブタの遺伝物質中に、ヒトアルファおよび／また はヒトベータグロビン遺伝子などの、少なくとも１つのヒトグロビン遺伝子を、 適当な１以上のプロモーターの制御下に挿入し、赤血球中の少なくともいくつか にヒトグロビンを保有するトランスジェニックブタを作製する。これには相当す る組み換え核酸配列の作製を必要とする。この発明の好ましい態様において、ヒ トαおよびヒトβ遺伝子の両方が発現される。別の態様では、ヒトαグロビンま たはヒトβグロビンのみが発現される。さらに別の態様では、ヒト胚または胎児 グロビン遺伝子が発現され、またはこれらが成体遺伝子の発生発現調節剤として 使用される。

ヒトアルファ邦よびベータグロビン遺伝子は、例えばＳｗａｎｓｏｎｅｔ　ａｌ 、　、１９９２　、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．１０：５３７−５５９に記載され ているような一般に入手できるクローンから得ることができる。ヒトアルファお よびベータグロビン蛋白質をコードする核酸配列が、１つはヒトアルファグロビ ンをコードし、もう１つはヒトベータグロビンをコードする、２つの異種の組換 え構築物によって、ある動物中に導入される；または、そしてこの方が好ましい が、アルファおよびベータの両方をコードする配列が同じ組換え構築物中に含ま れるものでもよい。ブタイプシロン遺伝子は、ＡＴＣＣに寄託され受託番号第７ ５３７３号を受けているプラスミドｐｓａｒ／ｐｉｇε（ｋ）　（図１３）中に 含まれている。

本発明によれば、好適なプロモーターは、赤血球中でヒトアルファおよび／また はベータグロビン遺伝子の転写を支配し得るプロモーターである。このプロモー ターは赤芽細胞中で選択的に活性であるものが好ましい。これには、ヒトアルフ ァ、ベータ、デルタ、イプシロンまたはゼータプロモーターなどのグロビン遺伝 子プロモーター、あるいは他の種からのグロビンプロモーターが含まれるが、こ れらに限定されるものではない。例えば、ブタグロビンプロモーター配列を使用 するのも有用であろう。実例を上げると、下記第１０節において検討するように 、ＡＴＣＣに寄託され受託番号第７５３７１号を受け、図８に示す配列を有す、 るプラスミドｐｇｅｍ５／ｐｉｇβｐｒ（Ｋ）に含まれているような、内在性ブ タβグロビン遺伝子制御領域の利用が特に効果的に作用することがわかった。

ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子を異なるプロモーターの制御下におい てもよいが、大幅に異なるレベルのグロビン鎖の生成は致命性に関わると考えら れてきているので、ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子は同一のプロモー ター配列の制御下に置くほうが好ましいと思われる。不適正な細胞型中に存在す る構成βグロビンプロモーター活性による鎖不均衡および／または転写因子の測 定を避けるため、ヒトアルファおよびベータグロビン遺伝子が発生中に同時にま た量的に同レベルで同調的に発現されるような構築物を設計することが望ましい 。

本発明の、限定するわけではないが、特定の態様として、ααβ構築物を含む構 築物（”ＩＩ（＋”構築物とも称される；　Ｓｗａｎｓｏｎ　Ｃｔａｔ、　、１ ９９２．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．１０：５５７−５５９；図ＩＡ参照）が利 用され得る。この構築物は、高コピー数のトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ）として存在すると、マウス中で有害な影響を及ぼすことがわかっているにもか かわらず、健康なトランスジェニックブタを製造するのに使用されている（下記 第６節の実施例参照）。

本発明の、限定するわけではない、別の特定の態様として、αｐβ配列を含む構 築物（”１８５”　構築物とも称される；図ＩＢ参照）が使用され得る。この構 築物は、アルファおよびベータグロビンをコードする配列の両方を同じプロモー ター（アルファグロビンプロモーター）の制御下に置くことができるという利点 を有している。

本発明の、限定するわけではない、別の特定の態様として、アルファグロビン２ 量体様のポリペプチドをコードする構築物を導入して、２量体化が減少し半減期 が増加したヒトヘモグロビンを生成するトランスジェニックブタを形成させるこ とができる（ＷＯ特許第９０１３６４５号）。

本発明のさらに別の限定するわけではない特定の態様として、ヒト成体アルファ グロビンおよびイプシロングロビン遺伝子、ブタベータグロビン遺伝子制御領域 およびヒトベータグロビン遺伝子を含む構築物（”３３９”構築物、図ＩＲ参照 ）を使用することができる。

さらにこの構築物にヒトまたはブタイプシロングロビン遺伝子を組み込むことに よって、ヘモグロビンの高レベル生産が助長され得る。ブタイプシロングロビン 遺伝子は成体βグロビン遺伝子の正しい発生調節を行なわせる。導入された成体 アルファ遺伝子（群）の高レベル発現は、トランスジェニックブタの胚の子宮内 発生中（構築物中の成体ベータグロビン遺伝子はまだ発現されないはずであるか ら）、鎖の不均衡化障害をもたらし、そのため胚の生存を危うくすることがある 。発生中に高レベルの胚グロビンを供給することによって、これらの胚の生存度 が改善される。ＡＴＣＣに寄託され受託番号第７５３７３号を受けているプラス ミドｐＳａｆ／Ｐｉｇεに含まれている、ブタイプシロングロビン遺伝子を図１ ３に示す。

さらに特定の態様において、本発明は以下の構築物を提供する＝　（ｉ）ヒトア ルファおよびベータグロビン遺伝子がヒトベータグロビンプロモーターの別々の コピーによって作動される構築物βｐα（図ＩＣ）　；　（ｉｉ）イプシロンプ ロモーターの制御下にヒト胚遺伝子ゼータおよびイプシロンを、そしてベータプ ロモーターの制御下にアルファおよびベータ遺伝子の両方を含むεｐζβｐα構 築物（図ＩＤ）　；　（ｉｉｉ）ゼータプロモーターの制御下にヒト胚遺伝子ゼ ータおよびイプシロンを、そしてアルファプロモーターの制御下にアルファおよ びベータ遺伝子の両方を含むζｐεαｐβ構築物（図Ｉ　Ｅ）　；　（ｉｖ）β グロビンタンパク質のアミノ酸番号１０８が、（アスパラギン残基の代わりに） アスパラギン酸残基に変わった変異を保有し、ヘモグロビン・ヨシズカ（Ｙｏｓ ｈｉｚｕｋａ）を生成するαｐβ構築物（図ＩＦ、構築物”２９４”　）　；　 （Ｖ）βグロビンタンパク質のアミノ酸番号１０８が（アスパラギン残基の代わ りに）リシン残基に変わった変異を保有し、ヘモグロビン・プレスビテリアン（ Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ）を生成するαｐβ構築物（図ＩＧ、構築物″２９３ ”　）　：　（ｖｉ）　ＬＣＲαがともに注入されたもので、ヒトαグロビンプ ロモーターの制御下にヒトβグロビン遺伝子を、そしてそれ自体のプロモーター の制御下にヒトαグロビン遺伝子を含む別個の核酸フラグメントを含むαｐβ（ Δα）構築物（図ＩＨ）　；　（ｖｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号 １３４が（トレオニン残基の代わりに）システィン残基に変わった変異を保有す るαｐβ構築物（図Ｉ　Ｉ）　；　（ｖｉｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ 酸番号１０４が（システィン残基の代わりに）セリン残基に、βグロビンタンパ ク質のアミノ酸番号９３が（システィン残基の代わりに）アラニン残基に、そし てβグロビンタンパク質のアミノ酸番号１１２が、（システィン残基の代わりに ）バリン残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図ＩＪ）；（ｉｘ）ヒト 成体αグロビン遺伝子をそれ自体のプロモーター下に、そしてヒト成体αグロビ ンプロモーターの制御下にヒト成体βグロビン遺伝子を含むαｐδ構築物（図Ｉ Ｋ）；　（ｘ）ＬＣＲαがともに注入されたもので、ヒトαグロビンプロモータ ーの制御下にヒトαグロビン遺伝子を、そしてそれ自体のプロモーターの制御下 にヒトαグロビン遺伝子を含む別個の核酸フラグメントを含む構築物（ＩＩ）δ （Δα）（図ｔ　Ｌ）；　（ｘｉ）ＬＣＲεβがともに注入されたもので、ヒト αグロビン遺伝子をそれ自体のプロモーターの制御下に、ヒト胚εグロビン遺伝 子とヒト成体βグロビン遺伝子をそれら自体のプロモーターの制御下に含む別個 の核酸フラグメントを含む構築物ＬＣＲα（図ＬＭ）　；　（ｘｉｉ）αグロビ ンタンパク質のアミノ酸番号６１が（リシン残基の代わりに）メチオニン残基に 変わった変異を保有するαｐβ構築物（図ＩＮ）；（ｘｉｉｉ）　５°から３° に縦列に連鎖したヒト胚イプシロン遺伝子とヒト成体アルファグロビン遺伝子お よびヒト成体ベータグロビン遺伝子を含むεαβ構築物、（図１０）　；　（ｘ ｉｖ）５’から３′に縦列に連鎖したヒト成体アルファグロビン遺伝子、ヒト胚 イプシロングロビン遺伝子およびヒト成体ベータグロビン遺伝子を含むαεβ構 築物（図Ｉ　Ｐ）　；　（ｘｖ）　５°から３°に縦列に連鎖した、２コピーの ヒト成体アルファグロビン遺伝子、ヒト胚イプシロングロビン遺伝子およびヒト 成体ベータグロビン遺伝子を含むααεβ構築物（図ＩＱ）　；　（ｘｖｉ）す べて５′から３°に縦列に連鎖した、ヒト成体アルファグロビン遺伝子、ヒト胚 イプシロングロビン遺伝子およびヒト成体ベータグロビン遺伝子を内在性ブタ成 体ベータグロビンプロモーターの制御下に含むαε（′１１βｐ）β構築物（図 Ｉ　Ｒ）　；　（ｘｖｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号７５が（アス パラギン酸残基の代わりに）システィン残基に変わった変異を保有するαｐβ構 築物（図Ｉ　Ｓ）　；　（ｘｖｉｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号４ ２が（チロシン残基の代わりに）アルギニン残基に変わった変異を保有するαｐ β構築物　（図ＩＴ）　；　（ｘｉｘ）　５’　から３°に縦列に連鎖した、ヒ ト胚イプシロングロビン遺伝子、ヒト成体ベータグロビン遺伝子および２コピー のヒト成体アルファグロビン遺伝子を含むＬＣＲεβαα構築物（図ＩＵ）；　 （ｘｘ）５’から３°に縦列に連鎖した、ヒト□　胚イプシロングロビン遺伝子 、ヒト成体ベータグロビン遺伝子およびヒト成体アルファグロビン遺伝子を含む ＬＣＲεβα構築物（図Ｉ　Ｖ）　；　（ｘｒｉ）αグロビンタンパク質のアミ ノ酸番号４２が（チロシン残基の代わりに）リシン残基に変わった変異を保有す るαｐβ構築物、（図ＩＷ）　；　（ｘｘｉｉ）αグロビンタンパク質のアミノ 酸番号４２が（チロシン残基の代わりに）アルギニン残基に、そしてβグロビン タンパク質のアミノ酸番号９９が（アスパラギン酸残基の代わりに）グルタミン 酸残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図Ｉ　Ｘ）　；　（ｘｘｉｉｉ ）αグロビンタンパク質のアミノ酸番号４２が（チロシン残基の代わりに）リシ ン残基に、そしてβグロビンタンパク質のアミノ酸番号９９が（アスパラギン酸 残基の代わりに）グルタミン酸残基に変わった変異を保有するαｐβ構築物（図 ＩＹ）：および（ｘｘｉｖ）ブタイプシロングロビン遺伝子およびベータグロビ ン制御領域を含むα２１１ε（１′βｐ）β構築物（構築物４２６および４２７ 、図１４）。

ヒトヘモグロビンを発現するトランスジェニックブタ中には、ブタα／ブタβ、 ヒトα／ヒトβ、そしてヒトα／ブタβハイブリッドの３つのタイプのヘモグロ ビン２量体が検出される。本発明のいくつかの態様において、ハイブリッドヘモ グロビンの量を減少させることが必要なものがある。そのため、分子モデル研究 によって、ハイブリッドヘモグロビンを形成する分子基準が、探索された。これ らの研究から導かれた知見に基づいて、ヒトアルファおよびベータグロビンの構 造をヒトα／ヒトβ２量体レベルを増加させるように改変することができる（第 １１節参照）ので、本発明の別の態様において、αｐβ配列を含む構築物を、ト ランスジェニックブタ中のヒトα／ヒトβヘモグロビン２量体レベルを増加させ るようなアミノ酸変化を有しているαまたはβグロビンタンパク質をコードする ように改変する場合もある。本発明はαグロビン分子中に１またはそれ以上の以 下に示す変異を保有するようなヒトαグロビンおよびヒトβグロビンをコードす る構築物を提供する：　（ｉ）　３０番目のＧｌｕの代わりにＴｈｒ　；　（ｉ ｉ）３６番目のＰｈｅの代わりにＴｙｒ　；　（ｉｉｉ）　１０６番目のしｅｕ の代わりにＰｈｅ　；（ｉｖ）　１０７番目のＣｙｓの代わりにＳｅｒ　；およ び／または（ｖ）　１１１番目のＡｌａの代わりにＣｙｓ　０特定の態様におい て、αｐβ構築物は１以上のこれらの変異を保有している。別の態様において、 本発明はβグロビン分子中に１またはそれ以上の以下に示す変異を保有するよう なヒトαグロビンおよびヒトβグロビンをコードする構築物を提供する：　（ｉ ）　３３番目のＶａｌの代わりにＬｅｕ　；　（ｉｉ）１１２番目のＣｙｓの代 わりにＶａｌまたはＴｉｅ　；　（ｉｉｉ）　１１５番目のＡｌａの代わりにＶ ａｌまたはＬｅｕ　；（ｉｖ）１１９番目のｃｒｙの代わりに旧ｓ　；（ｖ）１ ２５番目のＰｒｏの代わりにＭｅｔ　；　（ｖｉ）　１２８番目のＡｌａの代わ りに１１ｅ；および／または（ｖｉｉ）１３１番目のＧｌｎの代わりにＧｌｕ　 ｏ特定の態様において、αｐβ構築物は１以上のこれらの変異を保有している。

別の態様において、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号第７５３７２号を有するプラ スミドｐｐｉｇ３’β（図１６）中に含まれる、ブタベータグロビンの未翻訳３ ′末端を構築物中に含むものが望ましい場合がある（例えば図１２中の構築物３ ５４および図１４中の構築物４２６および構築物４２７参照）。これらの構築物 もまたブタ赤血球中での非グロビンタンパク質の発現において有用であると考え られる。

別の態様において、図８および９に示すブタベータグロビン制御領域を非グロビ ンタンパク質をコードする構築物中に入れて、トランスジェニックブタまたはそ の他の非ヒト赤血球中でのそのタンパク質の発現のために使用することができる 。

上記の組換え核酸構築物は、例えばＭａｎｉａＬｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９ ゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎ、　Ｙ、に記載されているような、当分野で既知の方法を用いて、増幅のため 、適当なプラスミド、バクテリオファージまたはウィルスベクターのいずれにで も挿入し、そして増殖させることができる。下記の実施例においては、ｐＵＣベ クター（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｇｅｎｅ１０ ３−１１９　）が利用された。

本発明はさらに、プラスミドｐ　ｇｅｍ５　／Ｐｉｇβｐ　ｒ（Ｋ）　（ＡＴＣ Ｃ受託番号第７５３７１号）　、ｐｐｉｇ　３’β（ＡＴＣＣ受託番号第７５３ ７２号）、およびｐ　Ｓａｆ／　ｐｉｇ　ε（ｋ）　（ＡＴＣＣ受託番号第７５ ３７３号）のそれぞれに含まれる、ブタ成体ベータグロビンプロモーター調節領 域、ブタ３°ベータグロビン領域およびブタイプシロングロビン遺伝子を含む核 酸の単離精製物を提供する。

トランスジェニックブタの作製のためには、構築物を直鎖状化することが望まし い。ベクター配列は除去する方が望ましい。

５、　２．　トランスジェニックブタの作製トランスジェニックブタを作製する ために、上記の組換え構築エレクトロポレーション、セルガン、トランスフェク ション、トランスダクション、レトロウィルス感染その他を含む当分野で既知の 方法のいずれによっても使用することができるが、これに限定されるわけではな い。各種構築物は個別にまたは２種またはそれ以上の構築物のグループとして導 入することができる。

本発明の好ましい特定の態様として、下記第６節の実施例で述べる方法によって 、トランスジェニックブタが作製される。簡単に述べると、性的に成熟した若い 未妊娠の雌ブタ（〉７力月令）に、１２から１４日間活性プロゲストーゲン（ア リルトレンボロン　（ａｌｌｙｌ　ｔｒｅｎｂｏｌｏｎｅ）、Ａ　Ｔ　：　１５ ｍｇ／ブタ／日）を経口的に与えることにより、発情期を一致させる。ＡＴ投与 の最終日、８時および１６時に、すべての雌ブタに、プロスタグランジンＦ　Ｉ ｒ（ルタリーゼ（Ｌｕｔａｌｙｓｅ）　：　ＬｏＩｎｇ／　１注射）を筋肉注射 （ＩＭ）する。ＡＴ摂取の最終日の２４時間後、すべてのドナー雌ブタに、妊娠 した雌ウマの血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ　：　１５００ＩＵ）を１回ＩＭ注 射する。ＰＭＳＧ後８０時間目、すべてのドナーにヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ ＨＣＧ　：　７５０１　Ｕ）を投与する。

ＡＴ停止後、ドナーおよびレシピエンド雌ブタを、１日２回成熟雄ブタを使って 、発情のサインをチェックする。ＨＣＧＣ再投与後時間以内に発情を示したドナ ーに、発情の始まりから１２時間目と２４時間目に、（それぞれ）人工および自 然受精によって妊娠させる。

ＨＣＧ投与後５９から６６時間の間に、以下の操作を使用して、妊娠したドナー から手術によって、１および２細胞卵を取り出す。

耳部末梢静脈を通じて、アセプロマシン０．５ｍｇ／体重１ｋｇおよびケタミノ １．３ｍｇ／体重１ｋｇの投与によって全身麻酔を行なう。麻酔に続いて、腹部 中心開腹手術によって、生殖管を露出させる。

引き伸ばしたガラスカニユーレ（外径５ｍｍ、長さ８　ｃｍ）を卵管孔に挿入し 、絹糸１本（２−０）でロート部に固定する。卵管連結部の２ｃｍ前方の卵管の 内腔中に２０ｇ針を挿入することにより、卵を逆方向に流しだす。０．４％ウシ 血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した無菌ダルベツコリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を 卵管内に注入し、ガラスカニユーレの方に流す。内液を１７ｘｌＯＯｎ＋＋ｎ滅 菌ポリスチレン管に集める。流出液を１０ｘ６０＋ｎｍのベトリ皿に移し、ワイ ルド（Ｗｉｌｄ）　Ｍ３立体顕微鏡を使用して、低倍率（５０ｘ）で探索する。

すべての１または２細胞卵を１．５％ＢＳＡを補充したプリンスター（Ｂｒｉｎ ｓｔｅｒ）改変卵培養−３液（ＢＭＯＣ−３）で２回洗浄し、油の下のＢＭＯＣ −３の５０μｌ液滴中に移す。マイクロインジェクションを実施するまで、卵を ３８℃、９０％Ｎ２．５％０２．５％ＣＯ２雰囲気下で保存する。

１または２細胞卵を、１．５％ＢＳＡを補充したＨＥＰＥＳ培養液１ｍｌを含む エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管中に入れ（ｌ管あたり１５卵）、ｌ細 胞卵中の前核および２細胞卵中の核を可視化するため、１４０００ｘ　ｇで６分 間遠心する。さらに、卵をデプレッション（ｄｅｐｒｅｓｓ　１ｏｎ）スライド 上の油上ＨＥＰＥＳ培地５−１０μｍ液滴中に移す。ノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓ ｋｉ）光学系およびライフ（ｌｅｉｔｚ）ミクロマニピュレーターを備えたラボ −ルー（Ｌａｂｏｒｌｕｘ）顕微鏡を使用して、マイクロインジェクションを行 なう。ＤＮＡ構築物（トリス−ＥＤＴＡ緩衝液１μｌあたり約１ｎｇの濃度で直 鎖状化）１０−１７００コピーを１細胞卵中の１つの前核または２細胞卵中の両 方の核中に注入する。

マイクロインジェクションされた卵は、適当なレシピエンドに移される前に、油 上のＢＭＯＣ−３培養液の微小液滴内に戻し、３８℃、９０％Ｎ２．５％ＣＯ２ ，５％０２雰囲気下に保持する。卵は好ましくは摘出後１０時間以内に移入され る。

ドナーと同日または２４時間後に発情を示すレシピエンドのみを胚の移入に使用 することが望ましい。レシピエンドを、前述したように麻酔する。１つの卵管を 外に出した後、注入を受けたｌおよび／または２細胞卵を少なくとも３０個と対 照卵４−６個を、以下の方法によって移入する。２１ｇｘ３／４のバタフライ注 入セットから管をＩｃｅの注射器に接続する。卵と１−２＋ｎｌのＢＭＯＣ−３ 培養液とを管中に吸引する。さらにその管を卵管孔に通し、先端が卵管の下方３ 分の１または狭窄部に達するように入れる。管をゆっくり引抜くとともに、卵が 発射される。

生殖管の露出部分を、無菌の１０％グリセロール−０，９％生理食塩水に浸し、 体腔中に戻す。白線（ｌｉｎｅａ　ａｌｈａ）を取り囲む結合組織、脂肪および 皮膚を３つの層に分けて縫合する。白線を閉じるのに、連続したハルステッド（ Ｈａｌｓｔｅａｄ）縫合法を使用することができる。脂肪および皮膚はそれぞれ 単純な連続Ｕ字縫合によって閉じる。そして切開部位に、局所抗菌剤（例えばフ ラジリドン（Ｆｕｒａｚｏｌｉｄｏｎｅ））を投与する。

レシピエンドはおよそ４つのグループに分け、標準１６％粗タンパク質のコーン −大豆ペレット飼料１．８ｋｇを与える。１８日目（０白目＝発情の開始）から 、成熟雄ブタを使って、すべてのレシピエンドの発情のサインを毎日チェックす る。３５日目に、超音波を使用して妊娠の検査を実施する。妊娠１０７０７日目 レシピエンドを分娩施設に移動させる。分娩時に確実に立合うため、妊娠１１２ １２日目時および１４時にプロスタグランジンＦ２−（１回の注射あたり１０ｍ ｇ）を投与して、分娩を促進する。レシピエンドのすべての場合において、ＰＧ Ｆ２ａの投与後３４時間以内に分娩がおこると予想される。

出生後２４時間目に、すべての子ブタは処置、すなわち耳に切り込みを入れる、 とがった歯を切る、ｌｃｃのデキストラン鉄を投与する、その他の処置を受ける 。尾部の生検および血液も各ブタから採取する。

この方法によって作製したブタは下記第６節の例に述べられ、そして図２に示さ れる。これらのブタは健康であり、貧血ではなく、そして同腹の非トランスジェ ニックブタと同程度の成長をしている。これらのブタはそのトランスジーンをそ の子孫に遺伝させるものと考えられる。

ある特定の性質を有するブタはヒトヘモグロビンの製造に特に有用である；こう したブタの例として本発明の特定の好ましい、しかしこれに限定するわけではな い態様を以下に示す。

本発明の好ましい具体例の１つによれば、トランスジェニックブタは少なくとも ２０コピーのグロビントランスジーンを含む。

２番目の具体例によれば、高度（ａｌ　ｔｉｔｕｄｅ）、酸素濃度、妊娠、ヘモ グロビンの変異型の存在その他の要因を考慮して、本発明のトランスジェニック ブタの全血のＰ、。は、同様の非トランスジェニックブタのＰｓｏよりも、少な くとも１０％増大している。こうして、本発明はヒトグロビントランスジーンを 保有および発現し、そのトランスジェニックブタの全血のＰ　ｓｏは、同高度に おいて、同様の妊娠していない非トランスジェニックブタのＰ、。よりも、少な くとも１０％大きい、非妊娠トランスジェニックブタを提供する。

他の好ましい特定の態様において、本発明は生成されるヒトグロビン量が総ヘモ グロビンに対して、少なくとも２％、より好ましくは少なくとも５％、最も好ま しくは少なくとも１０％であるトランスジェニックブタを提供する。

下記第６節に、本発明の好ましい、しかし限定しない具体例に使用される、トラ ンスジェニックブタについて記載する。

（本頁以下余白） ５．３．ヒトヘモグロビンの調製とブタヘモグロビンからのその分離本発明は、 ヒトアルファグロビンとヒトベータグロビン遺伝子等のヒトヘモグロビンをコー ドする一つのトランスジーンまたは複数のトランスジーンを適当な一つのプロモ ーターまたは複数のプロモーターの調節下にヒトヘモグロビンを少なくとも一部 の血液細胞中に発現するトランスジェニックブタを作るようにブタの遺伝材料材 に導入することからなるヒトヘモグロビンの製造方法を提供する。

本発明は、（ｉ）ヒトアルファグロビンとヒトベータグロビンの遺伝子を適当な 一つのプロモーターまたは複数のプロモーターの調節下にヒトヘモグロビンを少 なくとも一部の赤血球中に発現するトランスジェニックブタを作るようにブタの 遺伝材料に導入し、（ｉｉ）　トランスジェニックブタから赤血球を集め、（ｉ ｉｉ　）集めた赤血球の内容物を放出させて溶解物を形成し、（ｉｖ）その赤血 球溶解物を、ヒトヘモグロビンをブタヘモグロビンから実質的に分離させる精製 法に供し、そして（Ｖ）精製ヒトヘモグロビンを含有するフラクションを集める ことからなるヒトヘモグロビンの製造方法を提供する。そのようなフラクション は等電点電気泳動により適当な標準品と平行させて同定することができる。本発 明の好適な実施態様において、ヒトヘモグロビンはブタヘモグロビンからＤＥＡ Ｒ陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにより分離することができる。

ヒトヘモグロビンを上記トランスジェニックブタから調製するために、赤血球を ブタから公知の方法を用いて得る。次に、蒸留水等の低張液中での溶血などの方 法を用いるか、またはメソッドインエンザイモロジー、７６巻（１９８１年）に 記載の方法および／または接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｗ　ｆｉ ｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて赤血球を溶解する。

ヒトヘモグロビンが特別のトランスジェニックブタにより作られているものかど うかを確認する目的のために、溶血物の小規模の電気泳動による分析、例えば標 準的な技術を用いる等電点電気泳動の実施が有用であろう。

別法として、または大きい規模での精製のために、イオン交換クロマトグラフィ ーを用いてヒトヘモグロビンをブタヘモグロビンから分離してもよい。驚くべき ことに、セクション７ですでに記載したように、ヒトヘモグロビンはイオン交換 クロマトグラフィーを用いてブタヘモグロビンから容易に分離することが観察さ れた一方で、マウスヘモグロビンとヒトヘモグロビンはそのような方法では分離 することはできなかった。当業者に公知のまたは開発されているいかなるイオン 交換樹脂も利用することができ、例えばジエチルアミノエチル、Ｑ−セファロー ス、ＱＣＰＩ　（＋、　Ｂ、　Ｆ、　）、Ｚｅｐｈｙｒ、５ｐｈｅｒｏｄｅｘ、 　ｅｃｔｉｏｌａ、カルボキシメチルセルロース等からなる樹脂を挙げることが できるが、その樹脂がＤＥＡＥ樹脂を用いて達成される分離と匹敵するヒトおよ びブタのヘモグロビンの分離をもたらすのであればこれらに限定されるものでは ない。

限定を目的とするものではない本発明の具体的な実施態様にしたがって、ブタヘ モグロビン（ヒト／ブタヘモグロビンハイブリッドを含む）からヒトヘモグロビ ンを分離して実質的に純粋なヒトヘモグロビンを作るために、上記のように調製 したトランスン工二ソクブタ赤血球の溶血物をｐＨ７，８の０゜２Ｍグリシン緩 衝液で平衡化しておいたＤＥＡＥ陰イオン交換カラムにかけて、これを５　ｍＭ ＮａＣＩを含むｐＨ７，８の０．２Ｍグリシン緩衝液で洗浄し、次に５〜３０ｍ ＭのＮａＣｌ勾配またはそれと同等な溶出液（例えば下記セクション９を参照さ れたい）で溶出してもよい。驚くことに、ヒトとブタのグロビン鎖の約８５パー セントの相同性にもかかわらず、そのような処理の際にヒトヘモグロビンはブタ へモグロビレよりも早く溶出して、ヒトとブタのヘモグロビンは容易に分離する 。溶出を４０５市の吸光度および／または一連のフラクションから取られたアリ コートの電気泳動によりモニターしてもよい。ブタヘモグロビンならびにブタと ヒトのグロビン鎖とで形成されたヘテロダイマーからなる４量体ヘモグロビンは 、この方法によりヒトヘモグロビンから分離できる。トランスジェニックブタで 作られ、この方法でブタヘモグロビンから分離されたヒトヘモグロビンは、天然 のヒトヘモグロビンに似た酸素結合能力を有している。

限定を目的とするものではない本発明のもう一つの具体的な実施態様によれば、 ヒトヘモグロビンはブタヘモグロビン（ヒト／ブタヘモグロビンハイブリッドを 含む）からＱＣＰ　ｌイオン交換樹脂を用いて例えば以下のように分離すること ができる。

トランスジェニックブタの赤血球から調製した約１０　Ｈのヘモグロビンを２０ ｍ１の緩衝液Ａ（緩衝液Ａ＝ｌＯｍＭトリス、２０　ｍＭグリシン、ｐＨ７，５ ）に希釈する。次に、この２０　ｍｌの試料を緩衝液Ａで平衡化しておいたＱＣ Ｐ　Ｉカラム（ｔｏ　ｍｌ）に約５ｍ１／分の流速でかける。次に、このカラム を２体積分の緩衝液Ａで洗浄し、次に２０力ラム体積分の０〜５０　ｍＭのＮａ Ｃｌ勾配（１０カラム体積分の緩衝液Ａ＋１０カラム体積分のｌ０ｍＭ１−リス 、２０ｍＭグリシン、５０　ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，５）で溶出するか、また は６体積分の１０ｍＭトリス、２０　ｍＭグリシン、１５　ｍＭ　ＮａＣｌ、　 ｐＨ７，５で溶出して、０．Ｄ、２．、で吸収を示す物質を各フラクションに集 めることで分離ヘモグロビンを得て、ヒトヘモグロビンを例えば等電点電気泳動 により適当な標準品を用いて同定する。前記ＱＣＰ　ｌカラムは２力ラム分の１ ０ｍ１ｌリス、２０　ｍＭグリシン、Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ、　ｐＨ７，５による溶 出で浄化できる。

ある種の変異ヘモグロビンに関しては、改良型の精製方法を用いるのが望ましい 。よって、ブタ）ｌｂからプレスビテリアンＨｂを分離するためには、後記実施 例のセクション１２．１に記載の方法を用いてもよく、ヨシズカｌ（ｂの分離に は後記実施例のセクション１２．２に記載の方法を用いてもよい。

５．４．ヒト／ブタハイブリッドヘモグロビンの調製さらに、本発明は本質的に 精製され単離されたヒト／ブタハイブリッドヘモグロビン、特にヒトα／ブタβ ハイブリッドヘモグロビンを提供する。ブタα／ヒトβハイブリッドの形成は再 会合実験のインビトロでもトランスジェニックブタのインビボでもこれまで観察 されたことはない。

本発明はハイブリッドヘモグロビンおよび代用血液としてのその利用、ならびに 適当な薬理学的キャリヤー中に本質的に精製され単離されたヒト／ブタヘモグロ ビンハイブリッドを有する医薬組成物を提供する。

ハイブリッドヘモグロビンは、ここに記載するように、トランスジェニックブタ から調製することができ、次にこれをクロマトグラフィー、免疫沈殿または当業 者に知られている他の方法により調製できる。等電点電気泳動を用いるヘモグロ ビン７％イブリッドの分離を図３と図５に示す。

もしくは、ヒトとブタの両方のグロビン配列を有する核酸構築物を用いて、これ を適当な微生物、細胞またはトランスジェニック動物で発現させてハイブリッド ヘモグロビンを調製してもよい。

例えば、適当なプロモーターの調節下にあるヒトαグロビン遺伝子とブタβグロ ビン遺伝子を含む核酸構築物を発現させてハイブリッドヘモグロビンを得てもよ い。一つの具体的な例として、サイトメガロウィルスプロモーターの調節下にあ るヒトαグロビン遺伝子とブタβグロビン遺伝子をＣＯ８細胞等の哺乳類の細胞 に感染させて、ハイブリッドヘモグロビンをそれら細胞から採取してもよい。も しくは、そのような構築物を酵母または細菌で発現させてもよい。

ヘモグロビンハイブリッドを非免疫性とするため、例えばポリエチレングリコー ルに結合させるか、またはヘモグロビンを膜中に、例えばリポソーム中に包接さ せることによりハイブリッドを修飾することも望ましい。

トランスジェニックブタを作るために、１１Ｂ構築物（ααβ構築物）　、１８ ５構築物（αｐβ構築物）　、２６３構築物（αｐδ構築物）　、３３９．２９ ３および２９４構築物をブタの卵にマイクロインジェクトに成熟した雌ブタ（〉 ７力月齢）に経口で活性のあるプロゲストロン（アリルトレンボロン（ａｌｌｙ ｌ　ｔｒｅｎｂｏｌｏｎｅ　（ＡＴ））　：　１５　ｍｇ／−匹／日）を１２〜 １４日間与えることにより発情を同時に誘発させた。ＡＴ給餌の最後の日にすべ ての雌ブタにプロスタグランジンＦ２ａ　（Ｌｕｔａｌｙｓｅ：　１０　ｍｇ／ 注射）を０８００と１６００で筋向注射を行なった。ＡＴ消費の最後の日から２ ４時間後にすべての雌ブタドナーに妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ：　 １５００１Ｕ）を筋肉に１回注射した。ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｌ（ＣＧ ：　７５０１０）をＰＭＳＧ注射の８０時間後にすべてのドナーに投与した。

ＡＴ給餌中止後、ドナーの雌ブタと受容雌ブタを成熟雄ブタを用いて発情の徴候 を毎日２回チェックした。ＨＣＧの投与後３６時間以内に発情を示したドナーを 発情開始の１２時間後と２４時間後にそれぞれ人工および自然の受精を用いて妊 娠させた。

ＨＣＧ投与の５９〜６６時間後に以下の方法を用いて妊娠ドナーからｌ細胞卵と ２細胞卵を外科的に回収した。体重１　ｋｇにつき０．５ｍｇのアセプロマシン と１．３ｍｇのケタミンをそれぞれ耳の末梢血管からの投与により全身麻酔を行 なった。麻酔後、中央腹部の開腹に続いて生殖管を摘出した。引いたガラスのカ ニユーレ（５ｍｍのＣ１Ｄ０．８　ｃｍの長さ）を卵管口に挿入し、これを一本 の絹糸（２−０）を用いて縫合して漏斗管に固定した。子宮管結合部分から２　 ｃｍ前方の卵管の内腔に２０　ｇの注射針を挿入して卵を逆流させて流した。

０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補った無菌のダルベツコのリン酸緩衝 溶液（ＰＢＳ）を卵管に注入してガラスカニユーレに向けて流入させた。その媒 質を無菌の１７Ｘ　１００　ｍｍポリスチレン管に集めた。流入液をＩＯＸ　６ ０　ｍｍのベトリ皿に移し、ＷｉｌｄＭ３立体顕微鏡を用いて低倍率（５０ｘ） で調べた。すべての１細胞卵と２細胞卵を１．５ｘのＢＳＡを補ったＢｒ１ｎｓ ｔｅｒ’　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｏｖａ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ−３培地（ＢＭＯＣ−３ ）中で二回洗浄し、オイル下の５０μ！の小滴のＢＭＯＣ−３培地に移した。マ イクロインジェクションを行なうまで卵を３８℃で９０％Ｎ２．５ＸＯ７，５％ Ｃ０２雰囲気下に保存した。１細胞卵と２細胞卵を１．５％ＢＳ八を補ったｌ　 ｍｌのＨ［！ＰＥＳ媒質を含有するエッペンドルフチューブ（１チユーブあたり １５卵）に入れ、６分間１４００ＱＸｇで遠心し、ｌ細胞中の前核と２細胞卵中 の核を目で見て確認できるようにした。次に押し下げスライド上でオイル下の５ 〜ｌＯμＩのＨＥＰＥＳ媒質の小滴に卵を移した。マイクロインジェクションを Ｎｏｍａｒｓｋ＋光学素子と二つのＬｅｉｔＺマイクロマニピュレーターを有す るＬａｂｏｒｌｕｘ顕微鏡を用いて行なった。ＤＮＡ構築物の１０〜１７００コ ピー（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中１　ｎｇ＃ｚｌ）を１細胞卵中の−っの前核 または２細胞卵中の両方の核に注入した。

マイクロインジェクトした卵をオイル下のＢＭＯＣ−３培地の微小滴に戻し、そ れらを適当なレシピエンドに移植する前に、９０％Ｎ２．５％Ｃ０２，５％０□ 雰囲気下、３８℃で維持した。卵は回収後１０時間内に移植した。

ドナーと同じ日かまたは２４時間遅れて発情を示した受容動物のみを胚の移植の ために利用した。レシピエンドはすでに記載したように麻酔した。一つの卵管を 摘出した後に、少なくとも３０の注入１細胞卵および／または２細胞卵と４〜６ のコントロール卵を以下の方法で移植した。２１　ｇＸ　３／４バタフライ注入 セツトの管をｌ　ｃｃのシリンジにつなげた。それら卵と１〜２ミリリツトルの ＢＭＯＣ−３培地をその管に吸引した。次にその管をその先が卵管の底部１／３ または狭窄部に達するまで卵管の口に挿入した。次にその管をゆっくりとはずし ながら、卵を注入した。

生殖管の露出部分を無菌の１０％グリセロール１０．９％塩溶液に浸し、体腔に 戻した。白質をおおう接続組織、脂肪および皮膚を３つの分離相として縫合した 。とぎれのないｆ（ａｌｓｔｅａｄ縫合糸を用いて白質を閉じた。脂肪と皮膚は 単純で連続的なマツトレスの糸を用いてそれぞれ閉じた。次に、局所的な抗菌剤 （フラジリドン）を切開領域に投与した。

レシピエンドを４つのグループに分けて囲いに入れ、１．８ｋｇの標準１６％粗 製タンパク質コーン大豆ペレット餌を与えた。１８日目（θ日月＝発情の開始） から始めて、すべてのレシピエンドが発情の徴候について成熟雄ブタを用いて毎 日チェックされた。３５日目に妊娠の検出を超音波を用いて行なった。妊娠の１ ０７０７日目シピエンドを分娩室に移した。分娩時の世話を確実とするために、 妊娠の１１２１２日目ｓｏｏと１４００時間で分娩をプロスタグランジンＦｔａ の投与 （１０ｍｇ／１回の注射）により誘導した。すべての場合で、レシピエンドはＰ ＧＦ２．の投与後３４時間以内に分娩した。

生まれて２４時間後に、すべての子ブタについて耳に刻印し、狼歯にクリップし 、ｌ　ｃｃの鉄デキストランの投与等を行なう処置を行なった。尻尾の一部切除 組織と血液も各ブタから得た。

６．２．結果と考察 ３５６６の注入された卵のうち、ヒトヘモグロビンを発現した１３匹のトランス ジェニックブタが生まれ、このうち２匹がトランスジェニックブタであるという こととは全く関係のない通常の繁殖に関連する出来事のために誕生後にすぐに死 んだ（表Ｉ）。残りの１１匹は健康であるように見えた。−匹のトランスジェニ ックブタを図２に示す。作られたブタと「真正」ヒトヘモグロビンと「ハイブリ ッド」ヒトヘモグロビン（”）ＩＢ”）のパーセントの概略を下記の表！■に示 す。全ヘモグロビンは、ヒトαβにヒトαブタβハイブリッドの２分の１を足し た合計として計算された。図３は、これらのうち３匹のブタ（１２−１，９−３ および６−３）により作られたヘモグロビンの等電点電気泳動とトリトン酸尿素 ゲルの結果を示し、これらの動物におけるヒトαとβグロビンの発現が示されて いる。

（本頁以下余白） 表Ｉ ヒトヘモグロビン遺伝子構築物によるトランスジェニックブタの生産の効率 パラメータ　２２回の試行後の合計 集められた全卵　８２７６ 受精合計＃　７１５６ 注入合計１　３５６６ ＃移植された注入弁　３５６６ ＃移植されたコントロール卵　２７９ ＃用いられたレシピエンド　１０４ ＃生まれたブタ（雄、雌）　２０８．３３２＃トランスジエニツク（雄、雌）８ ．５　（０，３６）”＃発現　１３ °トランスジエニツクブタに発達した注入弁の比率（１３トランスジエニツクブ タ／３５６６注入卵）。

表ＩＩ 確認動物 表ＩＩ＋はブタ番号９〜３の子の特徴を示すもので、トランスジェニックブタの Ｆ１世代はヘモグロビンを発現することができることを示している。注意すべき ことはブタ番号９−３の子のどれもがトランスジェニックではないことがわかっ たが、これはおそらくこの動物の生殖組織のトランスジーンの欠如のためであろ う。

表ＩＶは、”１８５″構築物を有するブタ３８−４の子のヘモグロビン発現デー タを示す（′αｐβ”構築物；　図ＩＢを参照）。表■はブタ番号３８−４の子 の特徴の要約を示し、ここで高パーセント（３７，１Ｘ）の子がヒトヘモグロビ ンの発現に陽性であり、トランスジーンの生殖細胞系列伝達を示している。図１ ９は、トランスジーンが陽性である代表的な３８−４の子におけるヘモグロビン 、発現レベルを示す等電点電気泳動の結果を示す。

トランスジェニックブタの誕生体重は、トランスジェニックではない同腹の子の 誕生重量にほぼ等しいものであった。トランスジェニックブタは成熟するにした がって体重は最終的には対照動物の体重に匹敵するものとなった。

精製のために、赤血球をエッペンドルフマイクロ遠心機により５０００　ｒｐｍ で３分間遠心して集め、（元の血液と）等量の０．９ｘＮａＣ１で３回洗浄した 。赤血球を１．５体積分の脱イオンＨ，０で溶血させ、１５．００Ｏｒｐｍで遠 心し、その上清を陰イオン交換クロマトグラフィーで分画した。ＤＥＡＥセルロ ースクロマドグ′ラフイー（ＷｈａｔＩＩａｎ社製造のＤＥ−３Ｅ）をＷ、　Ａ 、　５ｃｈｒｏｅｄｅｒとＴ、　Ｈ，Ｈｕｉｓｍａｎの［ヘモグロビンのり０７ トグラフイー」（Ｔｈｅ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆ　Ｈｅａ＋ｏｇ １ｏｂｉｎ″）　、Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、７４〜７７ページにしたが って行なった。上記の赤血球溶血物０．２５ｍ１をｐＨ７，８の０．２Ｍグリシ ンで平衡化しておいた１　ｃｍＸ　７ｃｍのＤＨ−５２カラムにかけて、５力ラ ム体積分の０．２Ｍグリシン、ｐＨ７，８１５ｍＭ　ＮａＣｌで洗浄した。ヘモ グロビンは２００　ｍｌの０．２Ｍグリシン、ｐＨ７，８１５〜３０　ｍＭ　Ｎ ａＣｌ勾配で溶出した。ブタヘモグロビンの溶出を終わらせるために、さらに５ （１−１００ｍｌの３０　ｍＭ　ＣａＣｌ／グリシン、ｐＨ７，８をカラムに加 えた。

ヘモグロビンの溶出を４１５　ｎｍの吸光度とカラムフラクションのＩＥＦ分析 によりモニターした。

グロビン鎖の再会合は、基本的には、メソッドインエンザイモロジー、７６巻、 １２６〜１３３ページに記載されたように実施した。２５ラムダ量のブタ血液、 ２５ラムダのヒト血液、または１２．５ラムダのヒト血液と１２．５ラムダのブ タ血液の混合物２５ラムダを以下のとおり処理した。それら血液をマイクロ遠心 機に５検体セットして２分間の遠心でペレット化し、次に１００ラムダの０．９ パーセントのＮａＣ１で３回洗浄した。この細胞を５０ラムダの、Ｉ□Ｏで溶解 させ、次に高速度で回転させて溶解を確実にした。次に、５０ラムダの細胞溶解 物を５０ラムダの０．２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５と一緒にして、水中に置 き低温室で一晩インキユベートした。１．９ｍｌの０．１　Ｍ　Ｎａ１（２Ｐ。

１、ｐＨ４，５を添加した後、各試料をセントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）管 中で約０．５＋ｎｌが残されるまで４℃および５にで回転させた。次に、１ｍｌ の０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨｚＰ（Ｌ、ｐｌ＋７．４を添加して約０．２ｍｌ容量が 残されるまで約５にで回転させた。次にヘモグロビンをセントリコン管の壁から 洗って、エツベンドルフアダプターを取り付け、テーブルトップ型マイクロ遠心 機を用いてそのセントリコン管から各試料を除去した。次にそれら試料を等電点 電気泳動で分析した。

ヒトとブタの血液を等量で混合し溶解して得られた溶血物を上記のようにＤＥＡ Ｅクロマトグラフィーに供した。図４Ａに示すように、ブタヘモグロビンはヒト ヘモグロビンから事実上完全に分離した。

この完全な分離はヒトとブタのヘモグロビンの構造的類似性、すなわちブタとヒ トのαグロビン鎖は８４．４パーセントの相同性があり、ブタとヒトのβグロビ ン鎖は８４．９パーセントの相同性があることを鑑みれば驚くべきことである。

このことは、さらに図４Ｃに示されているように、ヒトとマウスの血液を上記セ クション７、ｌ。

■、に示す方法にしたがって混合し、溶血させＤＥＡＩｉカラムにかけて溶出し た場合、マウスとヒトのαグロビン鎖が約８５．５パーセントの相同性があり、 マウスとヒトのβグロビン鎖が約８０．１パーセントの相同性があるにもかかわ らず、ヒトとマウスのヘモグロビンの分離が観察されなかったことから驚くべき ことである。ＤＩ！ＡＨ樹脂によるヒトとブタのヘモグロビンの分離の容易さは 十分でありしかも経済的であるように思える。

興味深いことに、陰イオン交換カラムからのタンパク質の溶出の順序は予想され たとおりではなかった。ＩＥＦゲルから予想されたタンパク質の相対的なｐｌに 基づけば、溶出の予想される順序は最初にハイブリッド（ヒトα／ブタβ）、次 に真正のヒトα／ヒトβとなるはずである。その後に陰イオン交換カラムから溶 出する最後のタンパク質は内在性のブタα／ブタβタンパク質となるはずである 。Ｑかし、今回試みられたすべての条件下では、溶出の順序が変わってヒトヘモ グロビンが最初に溶出した。第二のピークはハイブリッドの富むフラクションで 、次に非常に接近しながらブタヘモグロビンが溶出した。

７、２．２．ヒトとブタのヘモグロビンおよびヒト／ブタの異種ヘモグロビンが トランスジェニックブタから調製された溶血物から分離支九左 トランスジェニックブタ６−３（上記セクション６に記載）の血液を低張ての膨 潤により溶解して得られた溶血物を上記のようにＤＢＡＥクロマトグラフィーに 供した。図４Ｂに示すように、ヒトヘモグロビンは、ブタヘモグロビンから分離 され、かつヒトαグロビン／ブタβグロビン異種ヘモグロビンからも分離された 。図４Ｄに示すように、ヒトヘモグロビンはこの方法により実質的に精製された 。

ブタアルファグロビン鎖とヒトベータグロビン鎖との異種会合はヒトヘモグロビ ンを発現するトランスジェニックブタから得られた溶血物では検出されなかった 。しかし、この観察は比較的低いレベルのヒトβグロビンの発現によるものと説 明することも可能である。もしくは、ブタアルファグロビンとヒトヘモグロビン との会合は化学的に有利ではないとも説明できる。この可能性を調べるために、 ブタおよびヒトのヘモグロビンを混合して、解離させ、次にグロビン鎖を再会合 させる再会合の実験を行なった。

図５に示す等電点電気泳動ゲルに示されているように、ブタα／ブタβ、ヒトα ／ヒトβ、それにヒトα／ブタβの会合が観察されたが、ブタαグロビンとヒト βグロビンとの間の会合は起こらないようであった。したがって、ブタα／ヒト β異種ヘモグロビンは、トランスジェニックブタからのヒトヘモグロビンの精製 に面倒をひきおこすことはないと予想される。

トランスジェニックブタ６−３からの清澄溶血物１３　ｍｇ／ｍｌ　Ｈ緩衝液Ａ （１０ｍＭトリス、２０　ｄグリシン、ｐＨ７，５）　、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ） リス、２０　ｍＭグリシン、１５＋ｎＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，５）；　緩衝液Ｃ （１０ｍＭ）リス、２０　ｍＶグリシン、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，５）　； 　緩衝液Ｄ　（１０ｍＭ）リス、２０　ｍＭグリシン、５０　ｍＭ　ＮａＣ１， ｐＨ７，５）　；緩衝液Ａで平衡化させた１０　ｍｌのＱＣＰ　Ｉカラム；トリ オ精製システム。トランスジェニックブタ６−３から調製した１０　＋ｎｇのヘ モグロビンを２０　ｍｌの緩衝液Ａに希釈した。２０　Ｉｌｌの試料溶液をＱＣ Ｐ　Ｉカラムに５　ｍ１７分の流速でかけて、２体積分の緩衝液Ａで洗浄した。

次に、このカラムを２０体積分の０〜５０　ｍＭのＮａＣＩ勾配で洗浄した。（ １０カラム体積分の緩衝液Ａ＋１０カラム体積分の緩衝液Ｄ）および０、Ｄ、２ ＊。吸収材料を集めた。次にカラムを２力ラム体積分の緩衝液Ｃで浄化し、次に ２力ラム体積分の緩衝液Ａで再平衡化した。

Ｕｖモニターによる分析（勾配体積に対するピーク）（図６）により、ヒトヘモ グロビンが１５　ｍＭ　ＮａＣｌで溶出したことが明らかとなった。それに続く 精製は勾配溶出によらず６体積分の緩衝液Ｂ（１５ｍＭ　ＮａＣ１）のみを用い て上記と同じ方法で実施してヒトヘモグロビンを溶出させた。さらに、この方法 によるクロマトグラフィーではトランスジェニックではないブタの試料は緩衝液 ＢではＱＣＰ　Ｉから溶出しない一方で、天然のヒトヘモグロビンは溶出する。

１５０１ＭのＮａＣＩで溶出したタンパク質を分解等電点電気泳動システムで分 析したところ、実質的に純粋でブタヘモグロビンもハイブリッドヘモグロビンも 夾雑していないことがわかった。

上記の表ＩＩと表Ｉ１１に示されているように、本発明のトランスジェニックブ タはすべて顕著な量のヒトα／ブタβグロビンハイブリッドヘモグロビンを作る ことがわかった（ブタα／ヒトβハイブリッドは観察されなかった）。重要なこ とに、高率のハイブリッドを発現したブタはその全血に関しても増大Ｐ、。値を 示すように思われた（図７）。

１０、実施例：ブタβグロビンの調節配列を用いる増強発現ブタ成体βグロビン 遺伝子プロモーター領域（図８）を含む３３９構築物（図ＩＲと図１２）を用い て、上記セクション６、１．２．に記載の方法にしたがってトランスジェニック ブタを作った。図１５はブタ７０−３により作られたヘモグロビンの等電点電気 泳動ゲル分析を示し、１１６構築物（図ＩＡ）を有するトランスジェニックブタ ６−３からの等量のヘモグロビンと等量のヒトヘモグロビンを比較のために隣接 するレーンで泳動した。（ブタ６−３ヘモグロビンを含有するレーンに比較して ）ヒトヘモグロビンとハイブリッドヘモグロビンに対応する位置においてブタ７ ０−３ヘモグロビン含有レーンで観察される明るいバンドにより示されるように 、ブタ７０−３により作られるヒトヘモグロビンの量はブタ６−３により作られ る量よりも多い。ブタ７０−３により作られた全ヘモグロビンの３８パーセント がヒトヘモグロビンと算出された一方で、ブタ６−３により作られた全ヘモグロ ビンの１０パーセントがヒトヘモグロビンと算出された（データと計算に関して は、上記の表ＩＩとセクション６．２．を参照されたい）。このことは、ブタβ グロビンプロモーター領域は、トランスジェニックブタにおいてヒトβグロビン プロモーターよりも効率的であることを示唆するものである。

別の一連の実験において、ヒトヘモグロビンを発現する２匹以上のトランスジェ ニックブタが”３３９”構築物を用いて得られた（ブタ８０−４とブタ８ｌ−３ ）　（図１７）。これらのトランスジェニックブタにおけるヒトヘモグロビンの 量は等電点電気泳動ゲルとその各バンドのデンシトメータ走査により測定した（ 図１８）。図１７に示されているように、ブタ７０−３とブタ８０−４の両方が 高レベルの真正ヒトヘモグロビンを発現した。トランスジーンのコピー数を得る ために、染色体ＤＮＡ　（その末端から単離したもの）をＥｃｏＲｌで消化し、 サザンプロットを行なった。用いられたプローブは、第一エキソン、第一イント ロンおよび第二エキソンの一部を含むヒトβグロビン遺伝子の４２７　ｂｐ　Ｎ ｃｏｌ／Ｂａａ＋旧断片であった。

ハイブリッドのヒトα／ブタβヘモグロビンの量はヒトヘモグロビンの量をしば しば超えることがわかった。この観察の分子的基礎は分子モデルと分子生物学を 用いて調べられた。ハイブリッド分子のモデル構造はヒトヘモグロビンの公知の 構造とヒトおよびブタのヘモグロビン構造間の構造的相同性に基づいている（Ａ 。

Ｍ、　Ｌｅｓｋ、　１９９１．　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ： 　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ。

０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、　）　、ブタヘ モグロビン構造とハイブリッドヘモグロビン構造は、（１）水素原子をＸ線モデ ルに加えてそれらの位置をエネルギー最小化を用いて変更する。（２）アミノ酸 残基置換を導入して、対象とするブタとハイブリッドの構造をモデル化しく鎖の 整合は必要ではない）　；　（３）これらの修飾残基の側鎖位置をエネルギー的 に最小化させたものとし；　そして（４）その結果を目でみて調べて確かである とわかったというこれら４ステツプを用いてモデル化したものである。

すべての当てはまる接触を詳細に調べることで、いくつかの残基で著しい差異が 示された。例えば、β１１２の位置で、ヒトヘモグロビンはシスティン残基を有 するが、そのハイブリッドはバリン残基を有する。このバリンは反対のサブユニ ットに明らかに近い位置で接触（図２０の矢印）しているため、そのα、β、境 界面の安定化により効果的と思われる（図２１）。

ＨＩＮＴにより予想される疎水および極性の相互作用に対するα１β２境界面で のアミノ酸置換の効果を表Ｖ＋に示す。旧ＮＴは、バージニア州すッチモンドの バージニア医科大学からライセンスされたバーシニアコモンウエルス大学のソフ トウェアであり、実験物理化学測定から知られた親和および反発の相互作用によ り決定された正と負のスコアを分析することができる。表Ｖｌに未修飾のダイマ ーと特定の置換を有するダイマーとの差異を示す。表Ｖ１１は表Ｖｌと同じ形式 を持っているが、次の２点で異なっている＝（１）各置換が加えられるにしたが って、その前のものが保存され、そして（２）報告された差異は現在のダイマー とその前の列で反映されたダイマーとの比較である。変化が続いて起こるにした がって、境界面において予想された親和力が増加する。各欄を合計すれば、未修 飾ダイマーと７つの変化を有するダイマーとの全体の差異が得られる。この合計 は疎水性に関して＋１３４０であり、極性に関して＋６６０である。

表ｖ１ α１β、境界面でのアミノ酸置換の効果を充填したＸＫ　５０／３０カラムにか けた。タンパク質をｔｏ　ｍ１７分の流速で緩衝液Ｂ　（２５０ｍｌ　ＮａＣｌ を含有する緩衝液Ａ）の９〜１６％の直線塩勾配で３０００　ｍｌにわたって溶 出させた。

最初のピークはプレスビテリアンＨｂであると考えられ、その次にハイブリッド ヘモグロビンとブタヘモグロビンが一緒に溶出する（図２０）。最初のピークが プレスビテリアンＨｂであってハイブリッドヘモグロビンではないことを確かめ るために、タンパク質試料を逆相１１ＰＬｃで分析した（図２１）。陰イオン交 換樹脂カラムからの最初のピークはプレスビテリアン）ｌｂであり、通常のヒト α鎖と同時に溶出するα鎖と通常のヒトβ鎖よりもわずかに速く溶出するβ鎖を 有している。これは、ブタヘモグロビンがカラム分画物中に夾雑しているかどう かを決定する優れた方法であることもわかった。この精製方法とＨＰＬＣによる この分析を用いて、トランスジェニックブタ５８−１０に由来する組換えプレス ビテリアンｌｌｂが９５％以上の純度を有することがわかった。

精製プレスビテリアンＨｂを５０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　１００ｍＭ　ＮａＣｌ 、ｐｌ（７，４に対して透析し、酸素平衡曲線をＨｅｍｏｘアナライザー（ＴＣ ３社製造、ペンシルバニア州、サラサンプトン）を用いて決定した。このＨｅｌ ｌ１ｏｘアナライザーは、アナログデータをデジタルデータに変換できるように 一部改良して酸素結合の計算を容易にした。これらの条件下で、プレスビテリア ンＨｂは、ＨｂＡの１３．３　ｍｍ）Ｉｇ　（ヒル係数ｎ＝２．９）に対して２ ５．８　ｍｍ１１ｇ　（ｎ　：２．３）のｐ　ｓｏを有し、プレスビテリアンＨ ｂは天然１１ｂよりも低い親和性で酸素に結合することを示している。ボーア効 果（酸素親和性に対するｐＨの影響）を測定するための予備結果では、プレスビ テリアンＨｂに関して通常のボーア効果が示された（図２２）。

１２、２．　ヨシズカＨｂの精製と特性材はヨシズカＨｂを発現するトランスジ ェニックブタ（６８−３および６Ｂ−２）の採血試料を基本的には上記と同じよ うに処理した。溶血物の最終濃度は約ｔｏｏ　ｍｇ／ｍｌであった。しかし、こ のタンパク質の精製にはいくぶんか異なる方法が必要であった。６８−３からの 溶血試料（約１０　ｍｇ）を２０　ｍＭグリシンを含むｐＨ８，７の１０ｍＭト リス塩酸（緩衝液Ａ）で平衡化させておいたＨＲ１０／３０　Ｂｉｏｒａｄ　Ｍ ａｃｒｏｐｒｅｐ　Ｈｉｇｈ　Ｑ樹脂カラムにかけた。ヘモグロビンは２．５ｍ ｌ／分で緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ　＋２５０　ｍＭ　ＮａＣＩ）の５〜３０％の直線 勾配により５００ｍ１にわたって溶出させた（図２３）。各フラクションを集め てＩＩ！Ｆにより分析して純度を評定したところ約７５　Ｘ以上と測定された。

１３、微生物の寄託 以下のプラスミドをメリーランド２０８５２、ロックビル、１２３０１バークロ ーン・ドライブ所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ Ｃ）に１９９２年１２月２日の日付で寄託した。

プラスミド　含有物　受託番号 ｐｓａｆ／ブタε（ｋ）　ブタεグロビン遺伝子　７５３７１ｐＧｅｍ５ｐ／ブ タβｐｒ（Ｋ）　ブタ成体βグロビンの　７５３７２遺伝子調節領域 ｐブタ３°β　ブタβグロビン遺伝子　７５３７３の３°末端 多様な文献をここで挙げたが、これらは参照によりそれら全文をここに編入する 。

国際出願Ｎｏ：ＰＣＴ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、３４ ＦＩＧ、　３８ 骨　−一１−一一一一一１０００） ＩＣｉ４Ｂ 精製組み換え体 ＦＩＧ、４Ｄ ０２　（ｍｍ　ｏｆ　）ｌａ） ＦｆＧ、　７Ａ ＦＩＧ、　７Ｂ Ｃ１ ＦｆＧ、　１８４ ＦＩＧ、　１８８ ＦＩＧ、　１９ ＦＩＧ、２２ ｐ０２ ＦＩＧ、　２４ ＦＩＧ、　２５ フロン１−ページの続き （５１）　Ｉｎ、ｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号／／　Ａ６１Ｋ　３８ ／１６　ＡＢＺ （３１）優先権主張番号　０３０，８９７（３２）優先口　１９９３年３月１５ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ、ＣＡ。

ＣＺ、ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＯ，Ｎ Ｚ、　ＰＬ、　Ｒ○、ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ （７２）発明者　ホルツマン、ステイーブン　エイチ。

アメリカ合衆国　０８５５０　ニューシャーシー州　プリンストン　ジャンクシ ョン、シェルプルツク　ドライブ　１５番地 （７２）発明者　オドネル、ジェイ、ケヴインアメリカ合衆国　１８９０１　ペ ンシルバニア州　トイレスタウン、ハース　プレイス２８２２番地 ＦＩ （７２）発明者　ビルダー、ステファン　エイチ。

アメリカ合衆国　０８５３６　ニューシャーシー州　プレインズポロー、ラヴエ ンズクレスト　ドライブ　６３−１０番地 （７２）発明者　ピンカート、カール　エイ。

アメリカ合衆国　３５０２３　アラバマ州　ベセマー、レイクモント　ドライブ 　１９９８番地 （７２）発明者　スワンソン、マーク　イー。

アメリカ合衆国　０８５５０　ニューシャーシー州　プリンストン　ジャンクシ ョン、ヒアフオード　ドライブ　１６番地 （７２）発明者　ケラ−、ヒラリー アメリカ合衆国　０８５３６　ニューシャーシー州　プレインズポロー、クエイ ル　リッジ　ドライブ　３６１３番地 （７２）発明者　シャーマ、アジャイ アメリカ合衆国　０８６４８　ニューシャーシー州　ローレンスヴイル、フエイ ラーコート２４番地 フロントページの続き （７２）発明者　パルソンズ、シンシア　ティー。

アメリカ合衆国　０８５３６　ニューシャーシー州　プレインズポロー、グレン ダイクレーン　２６番地 （７２）発明者　クマール、ラメシュ アメリカ合衆国　０８５３６　ニューシャーシー州　ペニントン、ヤード　ロー ド　６０番地 （７２）発明者　ホワイト、ステイーブン　ピー。

アメリカ合衆国　０８５２０　ニューシャーシー州　ハイズタウン、エデイソン 　ドライブ　５６６番地

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．プロモーター要素に機能しうる状態で連結したヒトアルファグロビンおよび ヒトベータグロビンをコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニックブタであ って、ヒトヘモグロビンが該ブタの少なくとも一部の赤血球において発現され、 核酸構築物が図１４に示した４２６構築物である該ブタ。
2. ２．プロモーター要素に機能しうる状態で連結したヒトアルファグロビンおよび ヒトベータグロビンをコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニックブタであ って、ヒトヘモグロビンが該ブタの少なくとも一部の赤血球において発現され、 核酸構築物が図１４に示した４２７構築物である該ブタ。
3. ３．プロモーター要素に機能しうる状態で連結したヒトアルファグロビンおよび ヒトベータグロビンをコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニックブタであ って、ヒトヘモグロビンが該ブタの少なくとも一部の赤血球において発現され、 全ヘモグロビンに対して発現されるヒトグロビンの量が少なくとも２０％である 該ブタ。
4. ４．成体ブタβグロビンをコードしない遺伝子に機能しうる状態で連結したアメ リカンタイプカルチャーコレクションに受託番号７５３７１で寄託されているプ ラスミドｐＧｅｍ５／Ｐｉｇβｐｒ（Ｋ）に含まれる成体ブタβグロビン制御領 域を含むＤＮＡ配列を含むトランスジェニックブタであって、核遺伝子が該ブタ の少なくとも一部の赤血球において発現される該ブタ。
5. ５．該遺伝子がヒトβグロビンをコードする請求項４記載のトランスジェニック ブタ。
6. ６．該遺伝子が非−グロビンタンパクをコードする請求項４記載のトランスジェ ニックブタ。
7. ７．成体ブタβグロビンをコードしない遺伝子に機能しうる状態で連結したアメ リカンタイプカルチャーコレクションに受託番号７５３７２で寄託されているプ ラスミドｐＰｉｇ３′βに含まれる成体ブタβグロビン遺伝子の３′領域を含む ＤＮＡ配列を含むトランスジェニックブタであって、該遺伝子が該ブタの少なく とも一部の赤血球において発現される該ブタ。
8. ８．該遺伝子がヒトβグロビンをコードする請求項７記載のトランスジェニック ブタ。
9. ９．該遺伝子が非−グロビンタンパクをコードする請求項７記載のトランスジェ ニックブタ。
10. １０．アメリカンタイプカルチャーコレクションに受託番号７５３７１で寄託さ れているプラスミドｐＧｅｍ５／Ｐｉｇβｐｒ（Ｋ）に含まれる成体ブタβグロ ビン制御領域を含む単離精製された核酸。
11. １１．アメリカンタイプカルチャーコレクションに受託番号７５３７３で寄託さ れているプラスミドｐＳａｆ／Ｐｉｇε（ｋ）に含まれるブタεグロビン遺伝子 を含む単離精製された核酸。
12. １２．アメリカンタイプカルチャーコレクションに受託番号７５３７２で寄託さ れているプラスミドｐＰｉｇ３′βに含まれる成体ブタβグロビン遺伝子の３′ 領域を含む単離精製された核酸。
13. １３．プロモーター要素に機能しうる状態で連結したヒトアルファグロビンおよ びヒトベータグロビンをコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニックブタで あって、ヒトヘモグロビンが該ブタの少なくとも一部の赤血球において発現され 、ヒトアルファグロビンまたはヒトベータグロビンをコードする核酸がトランス ジェニックブタにおいて真正のヒト／ヒト二量体レベルを増加させる変異を含ん でいる該ブタ。
14. １４．ヒトアルファヘモグロビンにおける変異が、次のアルファ鎖の変異：３０ 番目のＧｌｕに代わってＴｈｒ；３６番目のＰｈｅに代わってＴｙｒ；１０６番 目のＬｅｕに代わってＰｈｅ；１０７番目のＶａｌに代わってＳｅｒまたはＣｙ ｓ；および１１１番目のＡｌａに代わってＣｙｓの群から選ばれる、請求項１３ 記載のトランスジェニックブタ。
15. １５．ヒトベータヘモグロビンにおける変異が、次のベータ鎖の変異：３３番目 のＶａｌに代わってＬｅｕ；１１２番目のＣｙｓに代わってｌｌｅ；１１５番目 のＡｌａに代わってＶａｌまたはＬｅｕ；１１９番目のＧｌｙに代わってＨｉｓ ；１２８番目のＰｒｏに代わってＭｅｔ；および１３１番目のＧｌｎに代わって Ｇｌｕの群から選ばれる、請求項１３記載のトランスジェニックブタ。
16. １６．ヒトベータヘモグロビンにおける変異が、１１２番目のＣｙｓに代わって Ｖａｌである、請求項１５記載のトランスジェニックブタ。
17. １７．プロモーター部位に機能しうる状態で連結したヒトアルファグロビンおよ びヒトベータグロビンをコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニックブタで あって、ヒトヘモグロビンが該ブタの少なくとも一部の赤血球において発現され 、核酸構築物が図１Ｇに示したヘモグロビンプレスビテリアン（Ｈｅｍｏｇｌｏ ｂｉｎＰｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ）構築物である該ブタ。
18. １８．ヒトヘモグロビン、ブタヘモグロビン、およびヒト／ブタハイブリッドヘ モグロビンの混合物からヒトプレスビテリアンヘモグロビン（Ｐｒｅｓｂｙｔｅ ｒｉａｎＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）を精製する方法であって、（ｉ）請求項１７記 載のトランスジェニックブタから赤血球を集め； （ｉｉ）集めた赤血球の内容物を放出させて溶解物をつくり；（ｉｉｉ）段階（ ｉｉ）の溶解物を２０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１および２０ｍＭグリシンにてｐＨ８． １で平衡化したＨｉｇｈＱ樹脂カラムにかけ；（ｉｖ）該カラムを９−１６％塩 濃度直線勾配の１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１、２０ｍＭグリシン、２５０ｍＭＮａＣ ｌを含む緩衝液にてｐＨ８．１で溶出し；そして （ｖ）精製されたプレスビテリアンＨｂ（ＰｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎＨｂ）を含 む画分を回収することから成る方法。
19. １９．プロモータ一部位に機能しうる状態で連結したヒトアルファグロビンおよ びヒトベータグロビンをコードするＤＮＡ配列を含むトランスジェニックブタで あって、ヒトヘモグロビンが該ブタの少なくとも一部の赤血球において発現され 、核酸構築物が図１Ｆに示したヘモグロビンヨシズカ（Ｙｏｓｈｉｚｕｋａ）構 築物である該ブタ。
20. ２０．ヒトヘモグロビン、ブタヘモグロビン、およびヒト／ブタハイブリッドヘ モグロビンの混合物からヒトヨシズカヘモグロビン（ＹｏｓｈｉｚａｗａＨｅｍ ｏｇｌｏｂｉｎ）を精製する方法であって、（ｉ）請求項１９記載のトランスジ ェニックブタから赤血球を集め； （ｉｉ）集めた赤血球の内容物を放出させて溶解物をつくり；（ｉｉｉ）段階（ ｉｉ）の溶解物を１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１および２０ｍＭグリシンにてｐＨ８． ７で平衡化したＨｉｇｈＱ樹脂カラムにかけ；（ｉｖ）該カラムを、５−３０％ の塩濃度直線勾配の１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１、２０ｍＭグリシン、２５０ｍＭＮ ａＣｌを含む緩衝液にてｐＨ８．７で溶出し；そして （ｖ）精製されたヒトヨシズカＨｂ（ＹｏｓｈｉｚａｗａＨＢ）を含む画分を回 収することを含む該方法。